專(zhuān)利名稱(chēng)：金屬離子螯合劑及其醫(yī)療用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠螯合金屬離子的化合物。特別地，本發(fā)明涉及能夠螯合包括鐵離子在內(nèi)的金屬離子的(硫代)縮氨基脲化合物和(硫代)腙化合物。本發(fā)明還涉及該化合物和/或其金屬離子絡(luò)合物的醫(yī)療用途，包括治療與細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病的方法。
背景技術(shù)：
鐵(Fe)主要參與許多重要的細(xì)胞過(guò)程。例如，含鐵蛋白能催化能量代謝、呼吸作用和DNA合成中所涉及的關(guān)鍵反應(yīng)。細(xì)胞鐵缺失會(huì)導(dǎo)致G1/S停滯和凋亡1，2。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵缺失更敏感，這可能是由于其增加的增殖速率導(dǎo)致的。腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵需求的增加反映在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1的表達(dá)增加，該受體結(jié)合血清鐵運(yùn)輸?shù)鞍?轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)。贅生性細(xì)胞也表達(dá)出較高水平的含鐵酶核糖核酸還原酶，其是DNA合成中關(guān)鍵的限速步驟。因此，細(xì)胞鐵庫(kù)代表了一種重要的治療靶點(diǎn)，能夠螯合鐵的化合物可能是治療與鐵相關(guān)的疾病和紊亂的有用治療劑，也是潛在的抗腫瘤劑。
去鐵胺(DFO)是目前用于治療鐵過(guò)載疾病的鐵螯合劑。然而，DFO作為抗癌劑的應(yīng)用受其中性的抗增殖活性的限制。
目前存在著對(duì)醫(yī)療上可以接受的包括鐵螯合劑在內(nèi)的金屬離子螯合劑的需求，這些螯合劑能夠透過(guò)細(xì)胞膜并與細(xì)胞內(nèi)鐵螯合。目前也需要臨床上有用的具有抗增殖活性的鐵螯合劑。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面是提供一種具有通式1的化合物
通式1其中，E是O或S；A是 其中，Z′、Y′、X′和W′獨(dú)立地選自CR4、NR8、S、O，其中A中的雜原子的總數(shù)量為1、2或3，m是0或1，B是 其中，Z、Y、X、W和V獨(dú)立地選自CR4、NR8、S、O；其中B中的雜原子的總數(shù)量為0、1、2或3；q是0或1；每一R4獨(dú)立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基；每一R8獨(dú)立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基和-C(O)-烯基、芐基、氨基甲酸芐酯；R′為氫或不阻礙金屬離子螯合的基團(tuán)；-G為NR2R3或CR2R3R5，其中C和R5之間的鍵可以是單鍵、雙鍵或三鍵；其中當(dāng)C和R5之間的鍵是雙鍵時(shí)，R2和R3中的一個(gè)不存在，當(dāng)C和R5之間的鍵是三鍵時(shí)，R2和R3都不存在；R5選自氫、鹵素、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基、非必要取代的氨基、非必要取代的雜芳基、非必要取代的雙環(huán)基或非必要取代的芳基；R2和R3可以相同或不同，分別選自氫、鹵素、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基、非必要取代的氨基、非必要取代的雜芳基、非必要取代的雙環(huán)基或非必要取代的芳基；或-G是非必要取代的雜芳基、非必要取代的雙環(huán)基、或非必要取代的芳基、非必要取代的烷基；非必要取代的環(huán)烷基或非必要取代的雜環(huán)烷基；其限制條件是(i)當(dāng)E是O，且A和B每一個(gè)是 則-G不是-NH2、-CH2Cl、 且(ii)當(dāng)E是S，而A和B每一個(gè)是 則-G不是-NH2、
關(guān)于本發(fā)明的第一方面，A和B可以相同或不同。在一個(gè)實(shí)施方案中，A和B相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，A和B不同。
在一些實(shí)施方案中，A可以選自非必要取代的吡啶基、非必要取代的嘧啶基、非必要取代的三嗪基、非必要取代的噁唑基或非必要取代的吡咯基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，B可以選自非必要取代的5-或6-元芳環(huán)或非必要取代的5-或6-元雜芳環(huán)。例如，B可以選自非必要取代的苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、三嗪基、噁唑基、吡咯基或呋喃基。非必要的取代基可以包括吸電子基和供電子基。非必要的取代基的例子包括烷基、烯基、炔基、C6-10芳基、鹵素、氨基、羥基、O-烷基、S-烷基、硝基、氰基、C(O)-烷基、C(O)-O-烷基、C(O)-NH(烷基)、和C(O)-N(烷基)2。
在一個(gè)實(shí)施方案中，R′是氫。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)E是O時(shí)，-G選自非必要取代的-C1-8烷基、-C1-8烯基、芳基、雜芳基、-CH2(芳基)、或-CH(芳基)2。在另一個(gè)施實(shí)方案中，當(dāng)E是S時(shí)，-G選自非必要取代的-C1-8烷基、-C1-8烯基、-CH2(芳基)、-CH(芳基)2、芳基或雜芳基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)E是S時(shí)，-G選自非必要取代的-NH(C1-6-烯基)或-N(芳基)2。
本發(fā)明的第二方面是提供具有通式2的化合物 通式2其中A選自 和 其中每一R4獨(dú)立地選自鹵素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，n是0、1、2、3或4；和其中B、E和G如通式1所定義，包括限制條件(i)和(ii)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，A是 其中每一R4獨(dú)立地選自鹵素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，n是0、1、2、3或4。
在一個(gè)實(shí)施方案中，B選自 和 其中每一R4獨(dú)立地選自鹵素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，和p是0-7的一個(gè)整數(shù)，其中A、E和G如通式1所定義，包括限制條件(i)和(ii)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，p為0、1、2、3或4。
在一個(gè)實(shí)施方案中，B是 本發(fā)明的第三方面是提供具有通式3的化合物 通式3其中E是O或S；n是0、1、2、3或4，p是0、1、2、3或4，和每一R4獨(dú)立地選自鹵素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，和-G如通式1所定義，包括限制條件(i)和(ii)。
本發(fā)明的第四方面是提供具有通式4的化合物 通式4其中E是O或S；和
-G如通式1所定義，包括限制條件(i)和(ii)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)E是O時(shí)，具有通式4的化合物為二-2-吡啶基酮4，4-二苯基縮氨基脲(縮寫(xiě)為PK44pH)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)E是O時(shí)，具有通式4的化合物為二-2-吡啶基酮辛酸基腙(縮寫(xiě)為PKoctH)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)E是S時(shí)，具有通式4的化合物為二-2-吡啶基酮4-乙基-3-硫代縮氨基脲(縮寫(xiě)為Dp4eH)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)E是S時(shí)，具有通式4的化合物為二-2-吡啶基酮4-烯丙基-3-硫代縮氨基脲(縮寫(xiě)為Dp4aT)。
具有通式1、2、3或4的化合物能夠螯合金屬離子。因此，本發(fā)明的另一方面是提供在本發(fā)明的第一至第四方面中的任一個(gè)所定義的具有通式1、2、3或4的化合物的金屬離子絡(luò)合物，包括或不包括限制條件(i)和(ii)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，具有通式1、2、3或4的化合物的金屬離子絡(luò)合物可以是過(guò)渡金屬離子絡(luò)合物，例如銅、鐵、鋅、鈀、鉑、或鎵離子絡(luò)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬離子是鐵(II)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，金屬離子是鐵(III)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，具有通式1、2、3或4的化合物可以用作三齒配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有通式1、2、3或4的兩個(gè)化合物可以與金屬離子如鐵(II)或鐵(III)形成六配位絡(luò)合物。
本發(fā)明的第五方面是提供藥物組合物，其包含藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或載體和至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)、具有此處定義的通式1、2、3或4的化合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物至少包含一種根據(jù)本發(fā)明的第一至第四方面任一所述的具有通式1、2、3或4的化合物，包括限制條件(i)和(ii)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，藥物組合物可以包含一種或多種具有通式1、2、3或4的化合物的金屬離子絡(luò)合物。合適的金屬離子包括過(guò)渡金屬離子。例如，金屬離子可以是鐵(II)、鐵(III)、銅(II)、鋅(II)、鈀(II)、鉑(II)或鎵(III)。
帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3和4的化合物及其組合物可以用于體外或體內(nèi)金屬離子螯合。在一個(gè)實(shí)施方案中，帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3和4的化合物及其組合物可以用于鐵螯合。因此，帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3和4的化合物及其組合物可以適用于鐵螯合治療或治療鐵過(guò)載失調(diào)。帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3和4的化合物及其組合物也可以通過(guò)螯合包括鐵在內(nèi)的細(xì)胞金屬離子來(lái)修飾細(xì)胞功能。例如，帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3和4的化合物及其組合物可以用于抑制細(xì)胞增殖和/或誘發(fā)凋亡。帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3和4的化合物及其組合物也可以用于修飾對(duì)鐵濃度敏感的基因表達(dá)。此類(lèi)基因的例子包括WAF1、GADD45和Ndrg1。
可以將本發(fā)明的藥物組合物配制成用于皮下或靜脈注射、口服給藥、吸入、經(jīng)皮膚施用或直腸給藥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將組合物配制成用于靜脈給藥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將組合物配制成用于口服給藥。
本發(fā)明的第六方面是提供在哺乳動(dòng)物中的鐵螯合治療方法，所述方法包括將至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物，或包含至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物的藥學(xué)組合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑以治療有效量給藥到所述哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的第七方面是提供至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物在制備用于鐵螯合治療的藥劑中的用途。
本發(fā)明的第八方面是提供治療哺乳動(dòng)物鐵過(guò)載紊亂的方法，所述方法包括將至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物，或包含至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物的藥物組合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑以有效治療量給藥到所述哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的第九方面是提供至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物在制備用于鐵過(guò)載失調(diào)的藥劑中的用途。
關(guān)于本發(fā)明的第八和第九方面，在一個(gè)實(shí)施方案中，鐵過(guò)載失調(diào)是β-地中海貧血。
本發(fā)明的第十方面是提供抑制細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括將細(xì)胞暴露在有效量的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物中，或暴露在至少包含一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物與藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥、或賦形劑的藥物組合物中。
關(guān)于本發(fā)明的第十方面，在一個(gè)實(shí)施方案中，具有通式1、2、3和4的化合物、其金屬離子絡(luò)合物或包含所述化合物或金屬離子絡(luò)合物的組合物可以用于體外抑制細(xì)胞增殖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有通式1、2、3和4的化合物、其金屬離子絡(luò)合物或包含所述化合物或金屬離子絡(luò)合物的組合物可以用于體內(nèi)抑制細(xì)胞增殖，例如哺乳動(dòng)物的細(xì)胞增殖。
本發(fā)明的第十一方面是提供治療哺乳動(dòng)物增殖性紊亂的方法，所述方法包括將至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物，或含有至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物與藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物以治療有效量給藥到所述哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的第十二方面是提供至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物在制備用于抑制細(xì)胞增殖的藥劑中的用途。
本發(fā)明的第十三方面是提供至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物、或其金屬離子絡(luò)合物在制備用于治療增殖性紊亂的藥劑中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的第十一或十三方面，所述增殖性紊亂可以選自血管形成依賴(lài)性疾病、細(xì)胞增殖性疾病(例如牛皮癬、IBD、惡性腫瘤、再狹窄)、發(fā)炎性紊亂、自動(dòng)免疫性疾病、血管疾病、血栓癥、癌癥。增殖性疾病可以是關(guān)節(jié)炎。癌癥可以是惡性腫瘤或良性腫瘤。惡性腫瘤可以是轉(zhuǎn)移性的。癌癥可以是固體腫瘤或非固體腫瘤。例如，癌癥可以是白血病或淋巴瘤。
在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的化合物或組合物作為唯一的活性劑給藥時(shí)，哺乳動(dòng)物中生成的白細(xì)胞數(shù)量發(fā)生變化，特別是在施用化合物或組合物后數(shù)量減少了不超過(guò)1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％。相似地，在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的化合物或組合物作為唯一的活性劑給藥后，哺乳動(dòng)物中生成的紅細(xì)胞數(shù)量發(fā)生變化，特別是在施用化合物或組合物后數(shù)量減少了不超過(guò)1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％。
本發(fā)明的第十四方面是提供在細(xì)胞中誘發(fā)凋亡的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞與有效量的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物，或包含帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物接觸。
本發(fā)明的第十五方面是提供抑制細(xì)胞增殖和在細(xì)胞中誘發(fā)凋亡的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞與有效量的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物接觸，或與包含帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物接觸。
本發(fā)明的第十六方面是提供在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)凋亡的方法，所述方法包括將至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物，或含有至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物、或其金屬離子絡(luò)合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物以治療有效量給藥到所述哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的第十七方面是提供在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)凋亡和抑制細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括將至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物，或含有至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物以治療有效量給藥到所述哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的第十八方面是提供至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物在制備用于誘發(fā)凋亡的藥劑中的用途。
本發(fā)明的第十九方面是提供至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物、或其金屬離子絡(luò)合物在制備用于誘發(fā)凋亡和抑制細(xì)胞增殖的藥劑中的用途。
本發(fā)明的第二十方面是提供用于抑制細(xì)胞增殖、治療增殖性紊亂、治療癌癥、誘發(fā)凋亡、鐵螯合治療或治療鐵過(guò)載失調(diào)中的一種或多種疾病的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物，或包含帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明的第二十一方面是提供一種治療或抑制下列疾病的方法細(xì)胞增殖性紊亂、癌癥、哺乳動(dòng)物中的鐵過(guò)載失調(diào)、或在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)凋亡、或在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)凋亡和抑制細(xì)胞增殖，所述方法包括將至少一種帶有或不帶有限制條件(i)或(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其鐵絡(luò)合物，或包含所述化合物或絡(luò)合物和藥學(xué)上可以接受的輔藥、稀釋劑或賦形劑的組合物以治療有效量給藥到所述哺乳動(dòng)物，其中哺乳動(dòng)物中生成的白和/或紅細(xì)胞數(shù)量發(fā)生變化，特別是在對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥化合物或組合物后數(shù)量分布分別減少了不超過(guò)1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％。
關(guān)于本發(fā)明的第五、第十至第二十一方面的任何一個(gè)，金屬離子可以是過(guò)渡金屬離子。例如，金屬離子可以選自鐵、銅、鋅、鈀、鉑或鎵離子。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬離子是鐵(II)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，金屬離子是鐵(III)。
關(guān)于本發(fā)明的第六、八、十、十一、十六、十七和二十一方面中的任何一個(gè)，哺乳動(dòng)物可以是人類(lèi)、非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、鼠科動(dòng)物、牛科動(dòng)物、綿羊科動(dòng)物、馬科動(dòng)物、山羊類(lèi)動(dòng)物、野兔、鳥(niǎo)類(lèi)、貓科動(dòng)物、豬或犬科動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人類(lèi)。
本發(fā)明的第二十二方面是提供用于識(shí)別抗增殖性化合物的方法，所述方法包括將具有為一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞周期抑制因子編碼的基因的細(xì)胞或細(xì)胞提取物與能夠螯合鐵的化合物接觸，測(cè)定所述基因的表達(dá)水平，測(cè)定所述基因的表達(dá)水平是否不同于不存在所述化合物時(shí)所述基因的表達(dá)；從而測(cè)定所述化合物是否具有抗增殖活性。
本發(fā)明的第二十三方面是提供通過(guò)篩選多種化合物來(lái)識(shí)別一種或多種抗增殖化合物的方法，所述方法包括將具有為一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞周期抑制因子編碼的基因的細(xì)胞或細(xì)胞提取物與多種能夠螯合鐵的化合物接觸，測(cè)定所述化合物中的任何一個(gè)是否能修飾所述核酸的表達(dá)水平，如果其能修飾，分別對(duì)每一化合物測(cè)定所述基因的表達(dá)水平，測(cè)定所述表達(dá)水平是否不同于該化合物不存在時(shí)的表達(dá)水平；從而測(cè)定每一所述化合物是否具有抗增殖活性。
關(guān)于本發(fā)明的第二十二和二十三方面，在一個(gè)實(shí)施方案中，基因的表達(dá)為向上調(diào)節(jié)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因的表達(dá)為向下調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)細(xì)胞周期抑制因子的基因可以是WAF1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)細(xì)胞周期抑制因子的基因可以是GADD45。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該基因是Ndrg1。
關(guān)于本發(fā)明的第二十二和二十三方面，不存在所述化合物時(shí)的基因表達(dá)(例如mRNA、蛋白)的測(cè)定可以分別在測(cè)定存在所述化合物時(shí)的所述基因的表達(dá)之前或之后進(jìn)行。
關(guān)于本發(fā)明的第二十二和二十三方面，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)化合物或多個(gè)化合物能夠螯合金屬離子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)化合物或多個(gè)化合物能夠螯合鐵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物為具有此處所定義的通式1、2、3或4的化合物，包括或不包括限制條件(i)和(ii)。
根據(jù)本發(fā)明的第一至第二十三方面的任何一個(gè)，在一個(gè)實(shí)施方案中，具有通式1、2、3或4的任一所述化合物為包括限制條件(i)和(ii)的本發(fā)明的第一至第四方面中的任何一個(gè)所定義的化合物。
本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括具有通式1、2、3或4的化合物的所有異構(gòu)形式，及它們的金屬離子絡(luò)合物。例如，如果適當(dāng)，本發(fā)明包括化合物所有可能的對(duì)映體、非對(duì)映異構(gòu)體、外消旋物、順式異構(gòu)體、反式異構(gòu)體、(R)、(S)、(+)、(-)、Δ和Λ異構(gòu)體和/或它們的金屬絡(luò)合物。定義下列的一些定義可能有助于理解本發(fā)明的描述。該定義為一般定義，決不能將本發(fā)明的范圍僅僅限制在這些術(shù)語(yǔ)中，它們是為了更好的理解下述描述。
除非本文另有要求或?qū)ｉT(mén)作有相反聲明，本發(fā)明此處所引用的作為單數(shù)的整數(shù)、步驟和元素很明顯地包括所引用的整數(shù)、步驟和元素的單數(shù)和復(fù)數(shù)形式。
除非另有要求，在本說(shuō)明書(shū)中的單詞“包含”或其變體例如“包括”或“含有”應(yīng)理解為暗示著還包括聲明的步驟、元素或整數(shù)或多個(gè)步驟、元素或整數(shù)，而不是排除任何其他的步驟、元素或整數(shù)或多個(gè)步驟、元素或整數(shù)。因此，在本說(shuō)明書(shū)的文本中，術(shù)語(yǔ)“包含”意思是“主要包括，但不是必要的唯一”。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解，除了專(zhuān)門(mén)描述的那些，對(duì)此處所描述的本發(fā)明的變化和修改是可以接受的。同樣可以理解的是本發(fā)明包括所有的變化和修改。本發(fā)明還包括本說(shuō)明書(shū)所涉及或說(shuō)明的所有步驟、特征、組合物和化合物，單獨(dú)的或共同的，以及包括任何一個(gè)和所有的結(jié)合或包括任何兩個(gè)或多個(gè)所述步驟或特征。
本申請(qǐng)所有引用的參考通過(guò)參考在此作為整體專(zhuān)門(mén)引入。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“烷基”在它的含義內(nèi)包括具有1到10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和脂肪族基團(tuán)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)碳原子，或具有3到8個(gè)碳原子的環(huán)狀飽和脂肪族基團(tuán)，例如3、4、5、6、7或8個(gè)碳原子，或具有7、8、9或10個(gè)碳原子的雙環(huán)飽和脂肪族基團(tuán)。例如，術(shù)語(yǔ)烷基包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、異丙基、1-丁基、2-丁基、叔-丁基、戊基、1，2-二甲基丙基、1，1-二甲基丙基、戊烷基、異戊烷基、己基、4-甲基戊烷基、1-甲基戊烷基、2-甲基戊烷基、3-甲基戊烷基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、1，2，2-三甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、2-乙基戍基、3-乙基戍基、庚基、1-甲基己基、2，2-二甲基戊烷基、3，3-二甲基戊烷基、4，4-二甲基戊烷基、1，2-二甲基戊烷基、1，3-二甲基戊烷基、1，4-二甲基戊烷基、1，2，3-三甲基丁基、1，1，2-三甲基丁基、1，1，3-三甲基丁基、5-甲基庚基、1-甲基庚基、辛基、壬基、癸基、環(huán)丙基、2-甲基環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊烷基、2-甲基環(huán)戊烷基、3-甲基環(huán)戊烷基、環(huán)己基等。
術(shù)語(yǔ)“烯基”在其含義內(nèi)包括具有2到8個(gè)碳原子的直鏈或支鏈不飽和脂肪族烴基基團(tuán)，例如2、3、4、5、6、7或8個(gè)碳原子，或具有3到8個(gè)碳原子的環(huán)狀不飽和脂肪族烴基基團(tuán)，例如3、4、5、6、7或8個(gè)碳原子，或它們的結(jié)合，這些基團(tuán)中具有至少一個(gè)雙鍵，立體化學(xué)E或Z中任何一個(gè)都是適用的。烯基的例子包括但不限于次乙基(ethenyl)、乙烯基(vinyl)、烯丙基、1-甲基乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1，3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1，3-戊二烯基、2，4-戊二烯基、1，4-戊二烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1，3-己二烯基、1，4-己二烯基、2-甲基戊烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基等。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“炔基”在其含義內(nèi)包括具有2到8個(gè)碳原子的直鏈或支鏈不飽和脂肪族烴基基團(tuán)，例如2、3、4、5、6、7或8個(gè)碳原子，且其具有至少一個(gè)三鍵。炔基的例子包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丁炔基、1-甲基-2-丁炔基、3-甲基-1-丁炔基、1-戊炔基、1-己炔基、甲基戊炔基、1-庚炔基、2-庚炔基、1-辛炔基、2-辛炔基等。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“雜原子”指的是除碳或氫以外的任何原子，包括例如氧、氮和硫。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“鹵化物”或“鹵素原子”指的是氟、氯、溴和碘。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“氨基基團(tuán)”或其變體、例如“氨基”指的是形式為-NR6R7的基團(tuán)，其中R6和R7分別選自但不限于氫、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基或非必要取代的芳基。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“芳族基團(tuán)”或其變體如“芳基”指的是具有6到14個(gè)碳原子的芳烴的單個(gè)、多環(huán)、共軛和稠環(huán)殘基，例如6、7、8、9、10、11、12、13或14個(gè)碳原子。這樣基團(tuán)的例子包括苯基、甲苯基、二苯基、萘基、菲基等。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“雜芳族基團(tuán)”或其變體、例如“雜芳基”在其含義內(nèi)包括任何具有1、2、3或4個(gè)雜原子的5-16元、例如5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、或16-元單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)芳族基團(tuán)。例子包括但不限于吡咯基、吡啶基、菲基、喹啉基、異喹啉基、咪唑基、苯硫基、呋喃基、嘌呤基、吲哚基、異吲哚基、菲啶基、嘧啶基、噠嗪基、吡嗪基、吡唑基、惡唑基、異惡唑基、噻唑基、苯并呋喃基等。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)烷基基團(tuán)”的意思包括任何具有1、2或3個(gè)雜原子的3-10元飽和或非飽和、單環(huán)或雙環(huán)環(huán)狀系統(tǒng)。例子包括但不限于哌啶基、吡咯烷基、四氫呋喃基、四氫吡咯基、嗎啉基、四氫噻吩基等。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“非必要取代”指的是本術(shù)語(yǔ)所指的基團(tuán)可以是非取代的、或被一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下列的基團(tuán)取代鹵素、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、氰基、氰酸酯、異氰酸酯、-O-烷基、-S-烷基、硝基、氨基、-C(O)NH2、-C(O)NH(烷基)、-C(O)N(烷基)2、和-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基。
術(shù)語(yǔ)“治療有效量”在其含義內(nèi)旨在包括無(wú)毒但足夠量的本發(fā)明的化合物或組合物以提供所期望的治療效果。確切的該化合物或組合物治療有效量根據(jù)如下因素如動(dòng)物病的類(lèi)型、年齡、性別和動(dòng)物體重、給藥方式、以及細(xì)胞中化合物或組合物滲透細(xì)胞膜的能力和金屬離子如鐵的鰲和的能力而變化。可以調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳治療反應(yīng)。例如每日可以以數(shù)個(gè)分開(kāi)的劑量形式給藥，或劑量可以根據(jù)治療的緊急情況成比例減少。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“治療”指的是以任何方式治療疾病狀態(tài)或癥狀、防止疾病生成、或防止、阻礙、延遲或逆轉(zhuǎn)疾病惡化或其他不希望的癥狀的任何和所有應(yīng)用。
縮寫(xiě)DFO—去鐵胺EDTA—乙二胺四乙酸MTT—[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑]Tf—轉(zhuǎn)鐵蛋白“311”—2-羥基-1-萘基醛異煙酰腙“311m”2-羥基-1-萘基醛煙酰腙DPT—二-2-吡啶基酮-3-縮氨基硫脲Dp2mT—二-2-吡啶基酮-2-甲基-3-縮氨基硫脲Dp4mT—二-2-吡啶基酮-4-甲基-3-縮氨基硫脲Dp44mT—二-2-吡啶基酮-4，4-二甲基3-縮氨基硫脲Dp4eT—二-2-吡啶基酮-4-乙基-3-縮氨基硫脲Dp4aT—二-2-吡啶基酮-4-烷基-3-縮氨基硫脲Dp4pT—二-2-吡啶基酮-4-苯基-3-縮氨基硫脲PCBH—2-吡啶基酮苯甲酰腙P(guān)CBBH—2-吡啶基酮3-溴苯甲酰腙P(guān)CAH—2-吡啶基酮4-氨基苯甲酰腙P(guān)CHH—2-吡啶基酮4-羥基苯甲酰腙P(guān)CIH—2-吡啶基酮異煙酰腙P(guān)CTH—2-吡啶基酮2-噻吩羧基醛腙P(guān)KIH—二-2-吡啶基酮異煙酰腙P(guān)KBH—二-2-吡啶基酮苯甲酰腙P(guān)KHH—二-2-吡啶基酮4-羥基苯甲酰腙P(guān)KBBH—二-2-吡啶基酮3-溴苯甲酰腙P(guān)KAH—二-2-吡啶基酮4-氨基苯甲酰腙P(guān)KTH—二-2-吡啶基酮2-噻吩羧基醛腙P(guān)K44pH—二-2-吡啶基酮4，4-二苯基羧基醛縮氨基硫脲PKoctH—二-2-吡啶基酮辛酸基腙QCIH—2-喹啉羧基醛異煙酰腙
QCTH—2-喹啉羧基醛2-噻吩羥基醛腙QCBH—2-喹啉羧基醛苯甲酰腙QCBBH—2-喹啉羧基醛3-溴苯甲酰腙QCAH—2-喹啉羧基醛4-氨基苯甲酰腙QCHH—2-喹啉羧基醛4-羥基苯甲酰腙附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1.(A)用以顯示所用編號(hào)體系的一般化合物結(jié)構(gòu)。(B)DFO、311和Triapine的結(jié)構(gòu)；(C)對(duì)比用化合物PCIH和QCIH的一般結(jié)構(gòu)。
圖2.(A)代表性DpT類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)，包括DpT、Dp2mT、Dp4mT、Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT。(B)代表性PKIH類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)，包括PKIH、PKTH、PKPH、PKAH、PKHH、PKBH、PK44pH和PKoctH。
圖3.螯合劑對(duì)59Fe從預(yù)標(biāo)記的SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)移的影響的柱狀圖。(A)PKIH和PCIH類(lèi)似物的對(duì)比；(B)QCIH和PCIH類(lèi)似物的對(duì)比。結(jié)果表示為進(jìn)行的2個(gè)實(shí)驗(yàn)中的典型實(shí)驗(yàn)的3次重復(fù)結(jié)果的平均值±SD。
圖4.螯合劑對(duì)由SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞從59Fe-轉(zhuǎn)鐵蛋白(59Fe-Tf)中進(jìn)行59Fe吸收的影響的柱狀圖。(A)PKIH和PCIH類(lèi)似物的對(duì)比；(B)QCIH和PCIH類(lèi)似物的對(duì)比。結(jié)果表示為進(jìn)行的2個(gè)實(shí)驗(yàn)中的典型實(shí)驗(yàn)的3次重復(fù)結(jié)果的平均值±SD。
圖5.與PCTH相比，PKIH類(lèi)似物的濃度對(duì)下列影響的線(xiàn)圖(A)細(xì)胞59Fe轉(zhuǎn)移和(B)從59Fe-轉(zhuǎn)鐵蛋白(59Fe-Tf)中的內(nèi)在59Fe吸收。結(jié)果表示為進(jìn)行的2個(gè)實(shí)驗(yàn)中的典型實(shí)驗(yàn)的3次重復(fù)結(jié)果的平均值±SD。
圖6.與MRC-5纖維原細(xì)胞(F)相比，代表性的PKIH類(lèi)似物、去鐵胺(DFO)和2-羥基-1-萘基醛異煙酰腙(311)對(duì)SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞(N)增殖的影響的線(xiàn)圖。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表實(shí)驗(yàn)中3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)采用雙重測(cè)定。
圖7.鐵螯合劑的PKIH系列的成員能顯著地提高SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞中WAF1和GADD43mRNA的表達(dá)。PKIH類(lèi)似物的影響與DFO、311和PCIH系列的一些螯合劑相比較。(A)(i)被溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠；(ii)GADD45；(iii)WAF1和(iv)β-肌動(dòng)蛋白mRNA水平；(B)標(biāo)準(zhǔn)化為β-肌動(dòng)蛋白負(fù)載對(duì)照的(A)中結(jié)果的密度分析。在37℃，只用介質(zhì)(對(duì)照)或含有DFO(100μM)或其他螯合劑(25μM)的介質(zhì)培育20小時(shí)后將全部RNA從細(xì)胞中提取出。RNA印跡用標(biāo)準(zhǔn)方法完成(參見(jiàn)實(shí)施例6)。圖所說(shuō)明的結(jié)果為來(lái)自進(jìn)行的三個(gè)實(shí)驗(yàn)中的典型實(shí)驗(yàn)。
圖8.PKIH類(lèi)似物提高了SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞中鐵-調(diào)節(jié)蛋白(IRP)-RNA-結(jié)合活性。(A)有效的IRP-RNA-結(jié)合活性；(B)(A)中結(jié)果的密度分析。與作為內(nèi)部對(duì)照的數(shù)個(gè)螯合劑(即DFO、311、PCBBH和PCAH)和Fe供體檸檬酸鐵銨(FAC)相比較，PKIH類(lèi)似物的影響。細(xì)胞用DFO(100μM)、FAC(100μg/ml)和其他螯合劑(25μM)在37℃培育20小時(shí)。然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)凝膠-延遲分析來(lái)評(píng)估(IRP)-RNA-結(jié)合活性。圖所說(shuō)明的結(jié)果為來(lái)自進(jìn)行的三個(gè)實(shí)驗(yàn)中的典型實(shí)驗(yàn)。
圖9.通過(guò)X-射線(xiàn)結(jié)晶法測(cè)定的PKAH的晶體結(jié)構(gòu)，顯示為30％的熱橢圓體和水溶劑化。
圖10.與會(huì)死亡的MRC-5纖維原細(xì)胞(F)相比，DpT和311(內(nèi)部對(duì)照)顯示出對(duì)無(wú)限生長(zhǎng)分化的SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞(S)的選擇性抗增殖活性。細(xì)胞在存在或不存在化合物(0-25μM)下在37℃培育20小時(shí)。培育期后，用MTT分析測(cè)量細(xì)胞密度。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表至少進(jìn)行3-5實(shí)驗(yàn)中的典型實(shí)驗(yàn)的2次重復(fù)測(cè)定的平均值。
圖11.與DFO和311相比，DpT類(lèi)似物對(duì)59Fe轉(zhuǎn)移和在SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞和M109細(xì)胞中從59Fe-轉(zhuǎn)鐵蛋白(59Fe-Tf)中細(xì)胞59Fe的吸收的影響。(A)螯合劑對(duì)從預(yù)標(biāo)記的SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞中的59Fe轉(zhuǎn)移的影響。(B)螯合劑對(duì)防止從預(yù)標(biāo)記的SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞中的59Fe吸收的影響。(C)作為螯合劑濃度的函數(shù)，螯合劑對(duì)從預(yù)標(biāo)記的M109細(xì)胞中的59Fe轉(zhuǎn)移的影響。(D)作為螯合劑濃度的函數(shù)，螯合劑對(duì)防止由預(yù)標(biāo)記的M109細(xì)胞對(duì)59Fe-Tf中的59Fe吸收的影響。結(jié)果表示為進(jìn)行的3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的典型實(shí)驗(yàn)的3次重復(fù)結(jié)果的平均值±SD。
圖12.(A)5天的治療方案后，Dp44mT和在更大程度上，Triapine顯著降低了小鼠中M109肺癌的生長(zhǎng)，(B)注射(i)賦形劑對(duì)照或(ii)Dp44mT后在腫瘤中所誘導(dǎo)的凋亡，由TUNEL試驗(yàn)判定。
圖13.作為(A)螯合劑濃度和(B)培育時(shí)間的函數(shù)，Dp44mT對(duì)M109細(xì)胞凋亡或壞死/晚期凋亡的影響。(A)M109細(xì)胞用0-250μM的Dp44mT在37℃培育24小時(shí)。分別用Annexin V-FITC和PI染色測(cè)量細(xì)胞凋亡或壞死/晚期凋亡(具體參見(jiàn)Materials and Methods)。(B)在不同培育時(shí)間(0-48小時(shí))下，M109細(xì)胞用Dp44mT(1μM)處理。細(xì)胞凋亡和壞死/完全凋亡如(A)中所述進(jìn)行測(cè)量。數(shù)據(jù)點(diǎn)為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。
圖14.Dp44mT(1μM)對(duì)(A，B)活性胱冬酶(caspase)-3、-8和-9的蛋白水平和(C，D)在不存在(C)和存在(D)細(xì)胞可滲透胱冬酶抑制因子下對(duì)培養(yǎng)的M109細(xì)胞中胱冬酶-3、-8和-9的活性的影響。(A)Dp44mT處理后在指定時(shí)間時(shí)胱冬酶-3、-8和-9的水平，由蛋白印跡雜交(western blotting)測(cè)定(上部板)。(B)作為時(shí)間的函數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)化為β-肌動(dòng)蛋白的胱冬酶-3、-8和-9的表達(dá)的密度分析。(C)由Dp44mT(1μM)在0-48小時(shí)誘發(fā)的胱冬酶活性，表示為零時(shí)數(shù)值的百分?jǐn)?shù)。(D)當(dāng)用Dp44mT(1μM)培育48小時(shí)后，1μM胱冬酶-3、-8和-9的細(xì)胞可滲透抑制因子防止了這些酶的活化。結(jié)果為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。
圖15.在培養(yǎng)的M109細(xì)胞中Dp44mT(1μM)對(duì)下列的影響(A)在胞質(zhì)部分和基質(zhì)線(xiàn)粒體膜(SMM)部分中的全細(xì)胞色素c(h-cytc)的水平；(B)Bcl-2和Bax的線(xiàn)粒體蛋白水平；(C)細(xì)胞內(nèi)ROS繁殖。
圖16.在25μM測(cè)定時(shí)，只有具有高抗增殖活性和鐵螯合效力的細(xì)胞膜可滲透的螯合劑311和Dp44mT提高了Ndrg1的蛋白表達(dá)。MCF-7細(xì)胞用25μM的DFO、311、青霉胺、dp44mT、dp2mT、二吡啶基、L1或EDTA在37℃培育24小時(shí)。Ndrg1的表達(dá)和β-肌動(dòng)蛋白的蛋白水平用蛋白印跡雜交測(cè)定。結(jié)果為進(jìn)行的3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的典型實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳述本發(fā)明涉及能夠螯合金屬離子的化合物。特別地，本發(fā)明涉及具有通式1、2、3和4的(硫代)縮氨基脲和(硫代)腙化合物 通式1 通式2 通式3和 通式4其中，E、A、Z、Y、X、W、V、Z′、Y′、X′、W′、m、n、p、q和G如上定義，包括限制條件(i)和(ii)。
本發(fā)明還涉及包括或不包括限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3和4的化合物的用途。因此，本發(fā)明包括具有如下通式1a、2a、3a和4a的化合物的用途 通式1a其中E是O或S；
A是 其中Z′、Y′、X′和W′獨(dú)立地選自CR4、NR8、S或O，其中A中的雜原子的總數(shù)為1、2或3。
m是0或1。
B是 其中Z、Y、X、W和V獨(dú)立地選自CR4、NR8、S或O，其中B中的雜原子的總數(shù)為0、1、2或3。
q是0或1。
每一R4獨(dú)立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基；每一R8獨(dú)立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、芐基、氨基甲酸芐酯；R′是H或不會(huì)阻礙金屬離子螯合的基團(tuán)；-G是NR2R3或CR2R3R5，其中C和R5之間的鍵可以是單鍵、雙鍵或三鍵；其中當(dāng)C和R5之間的鍵是雙鍵時(shí)，R2和R3中的一個(gè)不存在，當(dāng)C和R5之間的鍵是三鍵時(shí)，R2和R3都不存在；R5選自氫、鹵素、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基、非必要取代的氨基、非必要取代的雜芳基、非必要取代的雙環(huán)基或非必要取代的芳基；R2和R3可以相同或不同，分別選自氫、鹵素、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基、非必要取代的氨基、非必要取代的雜芳基、非必要取代的雙環(huán)基或非必要取代的芳基；或-G是非必要取代的雜芳基、非必要取代的雙環(huán)基、非必要取代的芳基、非必要取代的烷基；非必要取代的環(huán)烷基、或非必要取代的雜環(huán)烷基； 通式2a其中A選自 和 其中每一R4獨(dú)立地選自鹵素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基；n是0、1、2、3或4；和其中B、E和G如通式1a中定義； 通式3a其中E是O或S；n是0、1、2、3或4，p是0、1、2、3或4，和每一R4獨(dú)立地選自鹵素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基；-G如上述通式1a中所定義；和
通式4其中E是O或S；和-G如上述通式1a中所定義；相應(yīng)地，“帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3和/或4的化合物”和“包括或不包括限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3和/或4的化合物”的表達(dá)應(yīng)理解為包括具有通式1、2、3和4的化合物，也包括具有通式1a、2a、3a和4a的化合物。
如此處所用，專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)“(硫代)縮氨基脲”在其范圍內(nèi)包括縮氨基脲、縮氨基硫脲及其衍生物或相關(guān)類(lèi)似物。相似地，如此處所用，專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)“(硫代)腙”在其范圍內(nèi)包括腙、硫代腙及其衍生物或相關(guān)類(lèi)似物。
關(guān)于通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a，當(dāng)E是O時(shí)，此處的化合物有時(shí)稱(chēng)為“PKIH類(lèi)似物”或“PKIH系列”；當(dāng)E是S時(shí)，此處的化合物有時(shí)稱(chēng)為“DpT類(lèi)似物”或“DpT系列”。
具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物可以螯合金屬離子以形成金屬離子絡(luò)合物。能夠與具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物形成金屬離子絡(luò)合物的金屬離子的例子包括過(guò)渡金屬離子如鐵、銅、鋅、鈀、鉑、或鎵離子。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬離子是鐵(III)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，金屬離子是鐵(II)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，金屬離子是鋅(II)。
本發(fā)明還包括藥物制劑，其包含至少一種包括限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3和/或4的化合物和/或每一所述化合物的金屬離子絡(luò)合物。本發(fā)明還涉及包括或不包括限制條件(i)和(ii)的具有此處所定義的通式1、2、3和4的化合物或包含該化合物和/或其金屬離子絡(luò)合物的組合物的醫(yī)療用途。
具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物包含(硫代)縮氨基脲或(硫代)腙骨架。A和B基團(tuán)中至少一個(gè)包含能夠參與金屬離子螯合的雜原子。在一個(gè)實(shí)施方案中，通式1、2、3和4的化合物用作三齒配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，A和B中至少一個(gè)是2-吡啶基團(tuán)，其中吡啶基氮、亞氨基(C＝N)氮和羰基(C＝O)或硫代羰基(C＝S)基團(tuán)每一個(gè)可以作為供體原子與合適的金屬離子配位。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解當(dāng)A和B不同時(shí)，C＝N雙鍵可以會(huì)有順/反立體異構(gòu)現(xiàn)象。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)A和B是不同的非必要取代的雜芳環(huán)時(shí)，具有通式1的化合物可以能夠通過(guò)環(huán)A或環(huán)B的雜原子形成金屬離子絡(luò)合物，這取決于順/反立體化學(xué)。如下圖解所示，其中M是合適的金屬離子 順式 反式具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物可以用作三齒配體，兩個(gè)該化合物可以與合適的金屬離子如能夠形成八面絡(luò)合物的金屬離子形成六配位金屬離子絡(luò)合物。
合成具有通式1、2、3和4的化合物的合適的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，其中一些在例如J.March，Advanced Organic Chemistry，4thEdition(John Wiley & Sons，New York，1992)；和Vogel’s Textbook ofPractical Organic Chemistry，5thEdition(John Wiley & Sons，New York，1989)中有所描述。
根據(jù)本發(fā)明的具有通式1、2、3和4的化合物可以通過(guò)希夫堿(Schiffbase)縮合反應(yīng)來(lái)制備，其中，酮或醛與選擇的酸式酰肼或酸式氨基硫脲縮合以制備相應(yīng)的具有預(yù)期取代模式的具有通式1、2、3或4的(硫代)縮氨基脲或(硫代)腙化合物。
例如，(硫代)縮氨基脲和(硫代)腙化合物合適的合成方法己由Bacchi等人(1996)描述過(guò)。制備具有通式1、2、3和4的PKIH類(lèi)似物的一般合成路線(xiàn)的典型例子如以下反應(yīng)圖解所示
如下圖解所示為制備具有通式4的PKIH類(lèi)似物的合成路線(xiàn)的例子，通過(guò)合成化合物PK44pH和PKoctH來(lái)說(shuō)明 合適的制備DpT類(lèi)似物的方法已由例如Johnson等人(1982)描述過(guò)。制備具有通式1、2、3和4的DpT類(lèi)似物的一般合成路線(xiàn)的例子如以下反應(yīng)圖解所示 制備具有此處所定義的通式4的DpT類(lèi)似物的合成路線(xiàn)的例子通過(guò)合成化合物Dp4eT和Dp4aT來(lái)說(shuō)明
上述所代表的縮合反應(yīng)可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員已公知的條件下進(jìn)行。例如，合適的溶劑系統(tǒng)包括乙醇、甲醇、乙醇/水、甲醇/水或其他常用有機(jī)溶劑如丙酮、苯、甲苯等。具有通式1、2、3和4的化合物可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化，包括從合適的溶劑中重結(jié)晶和柱層析。
在另一個(gè)合成方法中，硫代縮氨基脲和硫代腙可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法，分別從相應(yīng)的縮氨基脲和腙化合物制備。例如，在標(biāo)準(zhǔn)條件下可以使用Lawesson’s試劑將C＝O鍵轉(zhuǎn)化成C＝S鍵。例如，通式1、2、3或4的縮氨基脲或腙化合物可以與拉韋松(Lawesson’s)試劑在合適的溶劑如甲苯或苯中回流加熱以制備相應(yīng)的硫代化合物。制備具有通式4的化合物如下面一般方案所示 本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解在合成根據(jù)本發(fā)明的化合物中，使用保護(hù)基是必要或適當(dāng)?shù)?。合適的保護(hù)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。例如，常用的N-保護(hù)基包括芐基和氨基甲酸酯，例如氨基甲酸叔-丁酯、氨基甲酸芐酯。保護(hù)性基團(tuán)已在Protective Groups in Organic Synthesis，Theodora W.Greene & Peter G.M.Wuts，Second Ed.，John Wiley & Sons，Inc.(1991)中描述，在此引入其內(nèi)容作為參考。
根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)用的(硫代)縮氨基脲和(硫代)腙的衍生物的例如包括二-2-吡啶基酮異煙酰腙(“PKIH”)；二-2-吡啶基酮苯甲酰腙(“PKBH”)；二-2-吡啶基酮4-羥基苯甲酰腙(“PKHH”)；二-2-吡啶基酮3-溴苯甲酰腙(“PBBH”)；二-2-吡啶基酮4-氨基苯甲酰腙(“PKAH”)；二-2-吡啶基酮2-噻吩羧基醛腙(“PKTH”)；二-2-吡啶基酮4，4-二苯基羧基醛縮氨基硫脲(“PK44pH”)；二-2-吡啶基酮辛酸基腙(“PKoctH”)；二-2-吡啶基酮-4-甲基-3-縮氨基硫脲(“Dp4mT”)；二-2-吡啶基酮-4，4-二甲基3-縮氨基硫脲(“Dp44mT”)；二-2-吡啶基酮-4-乙基-3-縮氨基硫脲(“Dp4eT”)；二-2-吡啶基酮-4-烷基-3-縮氨基硫脲(“Dp4aT”)；二-2-吡啶基酮-4-苯基-3-縮氨基硫脲(“Dp4pT”)。
此處還公開(kāi)了結(jié)構(gòu)與PKIH類(lèi)似物相對(duì)應(yīng)的硫代腙，但其具有C＝S鍵而不是C＝O鍵。這種化合物包括二-2-吡啶基酮異煙酰硫代腙(“PKITH”)；二-2-吡啶基酮苯甲酰硫代腙(“PKBTH”)；二-2-吡啶基酮4-羥基苯甲酰硫代腙(“PKHTH”)；二-2-吡啶基酮3-溴苯甲酰硫代腙(“PBBTH”)；二-2-吡啶基酮4-氨基苯甲酰硫代腙(“PKATH”)；二-2-吡啶基酮2-噻吩羧基醛硫代腙(“PKTTH”)；二-2-吡啶基酮4，4-二苯基羧基醛硫代縮氨基硫脲(“PK44Pth”)；二-2-吡啶基酮辛酸基硫代腙(“PKoctTH”)。
本發(fā)明的鐵絡(luò)合物包括Fe[PKIH]2、Fe[PKBH]2、Fe[PKHH]2、Fe[PBBH]2、Fe[PKAH]2、Fe[PKTH]2、Fe[PK44pH]2和Fe[PKoctH]2、Fe[Dp4mT]2、Fe[Dp44mT]2、Fe[Dp4eT]2、Fe[Dp4aT]2和Fe[Dp4pT]2。鐵離子可以Fe(II)或Fe(III)。
根據(jù)本發(fā)明的具有通式1、2、3和4的PKIH和DpT類(lèi)似物的金屬離子絡(luò)合物可以很容易通過(guò)使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)和試劑進(jìn)行制備。例如，合適的金屬離子鹽包括但不限于金屬鹵化物、硝酸鹽、硫酸鹽、高氯酸鹽、乙酸鹽和三氟甲磺酸鹽(triflates)。形成鐵絡(luò)合物的合適的鐵鹽包括但不限于FeCl3、Fe(NO3)3、FeSO4、Fe(OAc)3和Fe2(ClO4)33。
在通式1中的定義中，R′基團(tuán)定義為“氫或不會(huì)防止化合物螯合金屬離子的基團(tuán)”。當(dāng)R′是甲基時(shí)，F(xiàn)e螯合受到阻礙。
與1位置不存在兩個(gè)有機(jī)基團(tuán)的相應(yīng)化合物相比，具有通式1、2、3和4的化合物的位置1兩個(gè)有機(jī)基團(tuán)(即芳族和/或雜原子基團(tuán)A和B)的存在通常能提高化合物的親脂性。具有通式1、2、3和4的PKIH和DpT類(lèi)似物能夠滲透過(guò)細(xì)胞膜。
PCIH、QCIH(圖1C)、PKIH和DpT系列的化合物的構(gòu)效關(guān)系表明即使這些種類(lèi)的化合物看起來(lái)具有相似的金屬鍵結(jié)位置，但各個(gè)種類(lèi)的親脂性、與金屬離子螯合的效率和抗增殖性能也可能有相當(dāng)大的不同。
根據(jù)本發(fā)明的具有通式1、2、3和4的(硫代)縮氨基脲和(硫代)腙化合物可以用作能夠形成金屬離子絡(luò)合物三齒配體。對(duì)于具有通式1的化合物，鐵絡(luò)合物的一般例子如下所示。
其中E是O或S。
作為另一個(gè)例子，配體為PKAH的鐵絡(luò)合物如下所示。
還例如配體為Dp4mT的鐵絡(luò)合物如下所示。
根據(jù)本發(fā)明，DpT或PKIH配體的金屬離子絡(luò)合物可以是中性或帶有電荷的。
此處還公開(kāi)了識(shí)別抗增殖用化合物的方法，其中，該方法包括將具有編碼一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞周期抑制因子的基因的細(xì)胞或細(xì)胞提取物暴露(例如接觸或培育)在能夠螯合鐵的化合物中，測(cè)定基因的表達(dá)水平，測(cè)定基因的表達(dá)水平是否與不存在所述化合物時(shí)基因的表達(dá)不同；從而測(cè)定所述化合物是否具有抗增殖活性。
可以使用相似的方法評(píng)估多個(gè)化合物以識(shí)別一個(gè)或多個(gè)抗增殖性化合物，該方法包括將具有編碼一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞周期抑制因子的基因的細(xì)胞或細(xì)胞提取物暴露(例如接觸或培育)在能夠螯合鐵的多個(gè)化合物中，測(cè)定所述化合物中的任何一個(gè)是否能修飾所述基因的表達(dá)水平，如果其能修飾，分別測(cè)定每一化合物對(duì)所述基因的表達(dá)水平，測(cè)定所述表達(dá)水平是否與不存在該化合物時(shí)的基團(tuán)表達(dá)水平不同；從而測(cè)定每一化合物是否具有抗增殖活性。
基因可能對(duì)細(xì)胞鐵濃度敏感。相應(yīng)于鐵缺失，基因的表達(dá)可以向上調(diào)節(jié)或向下調(diào)節(jié)?；虻睦影╓AF1、GADD45和Ndrg1。對(duì)不存在所評(píng)估的化合物時(shí)的基因的表達(dá)(例如mRNA、蛋白)的測(cè)定可以分別在測(cè)定存在所述化合物時(shí)的所述基因的表達(dá)之前或之后進(jìn)行。細(xì)胞功能的修飾能夠螯合細(xì)胞鐵的化合物可以修飾細(xì)胞功能，例如通過(guò)酶抑制、基因表達(dá)的修飾(包括基因的向上調(diào)節(jié)和向下調(diào)節(jié))、轉(zhuǎn)錄抑制(例如蛋白，包括p21)、活性氧(ROS)的產(chǎn)生等，其也治療性用于抑制細(xì)胞增殖和/或誘發(fā)凋亡。例如，細(xì)胞鐵缺失可能修飾鐵依賴(lài)性酶如核糖核酸還原酶的活性。鐵缺失也能誘發(fā)G1-S細(xì)胞抑制和凋亡。
基因WAF1和GADD45編碼細(xì)胞周期抑制因子，其對(duì)G1-S抑制是必不可少的(包括周期依賴(lài)性激酶抑制因子，例如p21CIP/WAF1)30。例如，通過(guò)鐵缺失向上調(diào)節(jié)這些基因就可能誘發(fā)細(xì)胞周期抑制。基因Ndrg1(N-myc向下調(diào)節(jié)的基因1)對(duì)細(xì)胞鐵濃度敏感。例如對(duì)應(yīng)于細(xì)胞鐵缺失的Ndrg1的過(guò)度表達(dá)可能造成G1-S細(xì)胞抑制。Ndrg1的過(guò)度表達(dá)也已顯示出能減緩腫瘤生長(zhǎng)和抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。4-7根據(jù)本發(fā)明的具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物能夠螯合包括鐵離子在內(nèi)的細(xì)胞金屬離子。因此，具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物能夠通過(guò)抑制核糖核酸還原酶來(lái)抑制DNA的合成。核糖核酸還原酶是DNA合成中的限速步驟，與正常細(xì)胞相比，其在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平更高。具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物可能也會(huì)造成鐵敏感性基因的過(guò)度表達(dá)，例如WAF1、GADD45和Ndrg1，因此其可用于抑制細(xì)胞增殖。鐵敏感性基因如WAF1、GADD45和Ndrg1的過(guò)度表達(dá)可能在mRNA水平發(fā)生。監(jiān)測(cè)WAF1、GADD45和Ndrg1的表達(dá)可提供對(duì)具有抗增殖潛力的化合物的有用的指示劑，該化合物可螯合包括鐵在內(nèi)的金屬離子。
凋亡或預(yù)定性細(xì)胞死亡在細(xì)胞更新中起著不可缺少的作用。細(xì)胞鐵缺失時(shí)可誘發(fā)凋亡。胱冬酶是常用的凋亡執(zhí)行者。8，9己描述了調(diào)節(jié)凋亡的兩個(gè)胱冬酶-活化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中一個(gè)通過(guò)死亡受體(例如CD95)發(fā)動(dòng)，而另一個(gè)由線(xiàn)粒體的完整性的變化引發(fā)。8，10在前者中，由其配體(例如CD95L)嚙合的死亡受體能導(dǎo)致死亡誘發(fā)的信號(hào)絡(luò)合物的形成8。激活的死亡受體使胱冬酶-8復(fù)原和活化，胱冬酶-8能誘發(fā)“執(zhí)行者”胱冬酶，包括胱冬酶-3。在線(xiàn)粒體依賴(lài)性的凋亡中，全細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞溶質(zhì)中會(huì)導(dǎo)致含有全細(xì)胞色素c、Apaf-1和前-胱冬酶-9(pro-caspase)的“凋亡體”的形成。8，9在凋亡體中，前胱冬酶-9活化并激發(fā)執(zhí)行者—胱冬酶，該胱冬酶能夠引發(fā)與死亡受體途徑誘導(dǎo)的執(zhí)行者相重疊的晚期事件8，9。凋亡的線(xiàn)粒體途徑的主要調(diào)節(jié)子包括Bcl-2/Bax基因族8，11，12。Bcl-2蛋白群在線(xiàn)粒體的外膜中找到，對(duì)其穩(wěn)定性起作用8，11。相反，Bax蛋白是細(xì)胞溶質(zhì)分子，其一接收到凋亡信號(hào)后就遷移至線(xiàn)粒體中，在那里結(jié)合到滲透性轉(zhuǎn)換孔8，12。Bcl-2和Bax之間的失調(diào)誘導(dǎo)造成全細(xì)胞色素c釋放選擇性離子滲透性的損失，從而引發(fā)了導(dǎo)致凋亡的胱冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)8，12。細(xì)胞金屬離子例如鐵和可能是鋅，與具有通式1、2、3和4的化合物的螯合可能會(huì)引發(fā)誘導(dǎo)凋亡的胱冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
包括細(xì)胞鐵的缺失在內(nèi)的細(xì)胞金屬離子缺失可能導(dǎo)致凋亡。相應(yīng)于氧化應(yīng)激也可能誘發(fā)凋亡，氧化應(yīng)激能導(dǎo)致全細(xì)胞色素c從線(xiàn)粒體中釋放和Bcl-2/Bax表達(dá)失調(diào)。金屬離子絡(luò)合物，包括具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物的鐵絡(luò)合物可通過(guò)產(chǎn)生活性氧來(lái)誘發(fā)凋亡。因此，具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物，以及具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物的金屬離子絡(luò)合物(包括鐵絡(luò)合物)可能具有治療性用途，例如作為抗腫瘤劑。
疾病的治療和/或預(yù)防此處所公開(kāi)的具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物中的DpT和PKIH可以用于治療脊椎動(dòng)物的各種失調(diào)和疾病。失調(diào)和疾病的例子可以分成幾大類(lèi)，包括如下血管形成依賴(lài)性疾病、細(xì)胞增殖性疾病(例如牛皮癬、IBD、惡性腫瘤、器官再狹窄)和癌癥。
癌癥可以選自但不限于致癌性腫瘤、上皮起源的腫瘤如結(jié)腸、直腸癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、腦癌、膀胱癌、前列腺癌和尿道/生殖道癌；間葉細(xì)胞腫瘤如肉瘤；和造血腫瘤，例如B細(xì)胞淋巴瘤。例如，癌癥可以是血液病學(xué)腫瘤、固體腫瘤和非固體腫瘤(例如白血病、淋巴瘤)。
此處所公開(kāi)的具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的DpT和PKIH類(lèi)似物可以與其他已知的療法如外科手術(shù)和/或治療劑結(jié)合使用，包括化學(xué)療法和放射療法。例如，當(dāng)用于治療固體腫瘤時(shí)，本發(fā)明的化合物可以與例如以下的化療藥物一起給藥阿霉素、紫杉醇、氟脲嘧啶、左旋溶肉瘤素、順氯氨鉑、α-干擾素、COMP(環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、甲氨蝶呤和波尼松)、依托泊甙、mBACOD(甲氨蝶呤、博來(lái)霉素、鏈霉菌、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿和地塞米松)、PROMACE/MOPP(波尼松、甲氨蝶呤(w/leucovin rescue)、鏈霉菌、環(huán)磷酰胺、紫杉醇、依托泊甙/二氯甲基二乙胺、長(zhǎng)春新堿、波尼松和甲基芐肼)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、血管抑制素(angioinhibin)、TNP-470、戊聚醣聚硫酸酯、血小板因子4、血管阻斷素(Angiostatin)、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、撒利多胺劑或SP-PG等。其它化學(xué)治療劑包括烷烴化劑如包括二氯甲基二乙胺、左旋溶肉瘤素、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺的氮芥；包括卡莫斯汀、洛莫司汀、司莫司汀、鏈佐星的亞硝基脲；包括白消安的烷基磺酸鹽；包括decarbazine的三嗪；包括硫替派和六甲基三聚氰胺的乙基烯亞胺(ethyenimine)；包括甲氨蝶呤的葉酸類(lèi)似物；包括5-氟尿嘧啶、胞核嘧啶阿拉伯糖苷的嘧啶類(lèi)似物；包括6-頸基嘌呤和6-硫鳥(niǎo)嘌呤的嘌呤類(lèi)似物；包括抗霉素D的抗腫瘤抗生素；包括鏈霉菌、博來(lái)霉素、絲裂霉素C和methramycin的蒽環(huán)類(lèi)藥；包括它莫西芬和cortiosteroids的激素和激素拮抗藥、以及包括順氯氨鉑和布喹那的其他試劑。
可以在給藥具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的一個(gè)或多個(gè)化合物之前，將根據(jù)本發(fā)明待治療的生理系統(tǒng)(例如肝系統(tǒng)、胰腺系統(tǒng))通過(guò)外科手術(shù)或在外科手術(shù)期間隔離出來(lái)。
藥物和/或治療性制劑根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)用于治療疾病時(shí)，具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物可以單獨(dú)給藥。另外，該化合物可以作為藥物制劑給藥，該藥物制劑包含至少一種具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物和/或其金屬離子絡(luò)合物。具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物還可以以藥學(xué)上可以接受的鹽的形式存在。
在合理的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)，藥學(xué)上可以接受的鹽是指適用于與人類(lèi)和低級(jí)動(dòng)物的組織接觸而沒(méi)有不適當(dāng)?shù)亩拘?、過(guò)敏、變態(tài)反應(yīng)等，且與合理的益處/風(fēng)險(xiǎn)比相稱(chēng)的鹽。藥學(xué)上可以接受的鹽為本領(lǐng)域所公知。
例如，根據(jù)本發(fā)明的PKIH和DpT類(lèi)似物的合適的藥學(xué)上可以接受的鹽可以通過(guò)將藥學(xué)上可以接受的酸如鹽酸、硫酸、甲磺酸、琥珀酸、富馬酸、馬來(lái)酸、苯甲酸、硫酸、乙酸、草酸、碳酸、酒石酸或檸檬酸與本發(fā)明的化合物接觸來(lái)制備。因此，本發(fā)明化合物的合適的藥學(xué)上可以接受的鹽包括酸加成鹽。
例如，S.M.Berge等在J.Pharmaceutical Science，1977，661-19中詳細(xì)描述了藥學(xué)上可以接受的鹽。該鹽可以在本發(fā)明化合物的最后分離和純化中原位制備，或通過(guò)自由堿官能與合適的有機(jī)酸反應(yīng)。代表性的酸加成鹽包括乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽(aspirate)、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦鹽(camphorate)、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙基磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚糖酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙基磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、十二烷基硫酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、馬來(lái)酸鹽、丙二酸鹽、甲基磺酸鹽、2-萘基磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、pamoate、果膠酯酸鹽、過(guò)二硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、三甲基乙酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一酸鹽、戊酸鹽等。代表性的堿或堿土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂等、以及非毒性銨、季銨、和胺陽(yáng)離子，其包括但不限于銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。
方便的給藥模式包括注射(皮下、靜脈等)、口服給藥、吸入、經(jīng)皮膚施用或直腸給藥。取決于給藥路徑，類(lèi)似物可以用物質(zhì)涂敷以保護(hù)類(lèi)似物不受可能破壞類(lèi)似物治療活性的酶、酸和其他中性條件的作用?；衔镞€可以非腸道或腹膜內(nèi)給藥。
具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物的分散體還可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油類(lèi)中制備。在普通的儲(chǔ)存和應(yīng)用條件下，藥物制劑可以含有防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。
適用于注射的藥物組合物包括用于無(wú)菌可注射溶液或分散液臨時(shí)制備的無(wú)菌水溶液(其中水可溶)或分散液和無(wú)菌粉末。理想地，該組合物在制造和儲(chǔ)存條件下保持穩(wěn)定，同時(shí)也可以包括防腐劑以穩(wěn)定組合物不受微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。
例如，在一個(gè)優(yōu)選的方案中，化合物與惰性稀釋劑或可吸收的食用載體一起口服給藥?；衔锖推渌煞挚梢苑馊胗不蜍洑さ哪z膠囊中、壓制成片或直接加入個(gè)人飲食中。對(duì)于口服治療給藥，類(lèi)似物可以與賦形劑結(jié)合，以可吸收藥片、口腔藥片、片劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、餅狀等的形式應(yīng)用。適合地，這種組合物和制劑可以含有至少1wt％的活性化合物。藥物組合物和制劑中具有通式1、1a、2、2a、3、3a、4和4a的化合物的PKIH或DpT類(lèi)似物的比例當(dāng)然可以變化，例如，可以很方便地在劑量單位重量的約2％-約90％、約5％-約80％、約10％-約75％、約15％-約65％、約20％-約60％、約25％-約50％、約30％-約45％或約35％-約45％的范圍內(nèi)變化。
術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可以接受的載體”旨在包括溶劑、分散介質(zhì)、涂敷層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等張和吸收緩釋劑等。這種藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的應(yīng)用是本領(lǐng)域所公知的。除了與類(lèi)似物不相容的任何常規(guī)介質(zhì)活試劑外，己考慮在治療組合物和治療方法中使用它們。輔助性活性化合物也可以引入本發(fā)明的組合物中。為便于給藥和劑量的一致，特別有利的是配制劑量單位形式的注射用組合物。此處所用的劑量單位形式指的是用于待治療個(gè)體的、適用于單一劑量的物質(zhì)上單個(gè)的單位；結(jié)合所需要的藥物載體，并計(jì)算含有預(yù)計(jì)數(shù)量的類(lèi)似物的每一單位以獲得所期望的治療效果。本發(fā)明的新型劑量單位形式的規(guī)格直接取決于(a)類(lèi)似物的獨(dú)特的性質(zhì)和要取得的特定治療效果，和(b)現(xiàn)有技術(shù)中所固有的化合這種用于治療個(gè)人增殖性疾病、與鐵相關(guān)的生理情況或鐵過(guò)載失調(diào)的類(lèi)似物的限制。以能與合適的藥學(xué)上可以接受的載體一起，以有效量便利和有效地給藥為目的化合主要的類(lèi)似物。對(duì)于含有輔助性活性成份的組合物，給藥劑量通過(guò)參考所述成份的常用劑量和給藥方式進(jìn)行確定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是口服給藥的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體適用于靜脈給藥。
藥物組合物的一個(gè)合適的形式是配制為適用于口服給藥的腸溶顆粒、片劑，或膠囊的劑量形式。
對(duì)于可注射溶液，載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)，及它們合適的混合物和植物油。例如，可以通過(guò)例如使用例如卵磷脂的涂敷層，及通過(guò)保持分散液中所要求的粒徑和使用表面活性劑來(lái)維持合適的流動(dòng)性。可以通過(guò)加入各種抗細(xì)菌和/或抗真菌劑來(lái)防止微生物的作用。合適的試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，包括例如苯甲酸酯類(lèi)(parabens)、氯代丁醇、苯酚、苯甲醇、抗壞血酸、乙汞硫代水楊酸鈉等。在許多情況下，其優(yōu)選在組合物中包括等張?jiān)噭?，例如糖、多元醇包括甘露醇，山梨糖醇、氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長(zhǎng)吸收可以通過(guò)在組合物中加入延緩吸收的試劑如單硬脂酸鋁和凝膠來(lái)實(shí)現(xiàn)。
無(wú)菌可注射溶液可以通過(guò)將所需量的類(lèi)似物加到帶有上述列舉的成份中的一個(gè)或其組合的合適溶劑中，然后過(guò)濾殺菌來(lái)制備。通常，分散液是通過(guò)將類(lèi)似物加到含有基本分散介質(zhì)和其他上述所列舉的所需要的成份的無(wú)菌賦形劑中來(lái)制備。
藥片、片劑、丸藥、膠囊等還可以含有下列物質(zhì)粘合劑如樹(shù)膠gragacanth、阿拉伯樹(shù)膠、玉米淀粉或凝膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、褐藻酸等的；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精；調(diào)味劑如薄荷油、冬青油或櫻桃調(diào)味料。當(dāng)劑量單元形式是膠囊時(shí)，除了上述類(lèi)型的物質(zhì)，其可含有液體載體。其他各種材料可以作為涂敷層形式存在或來(lái)改變劑量單位的物理形式。例如，藥片、藥丸或膠囊可以用蟲(chóng)膠、糖或兩者共同涂敷。糖漿或?yàn)┛珊蓄?lèi)似物、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的甲基和丙基苯甲酸酯類(lèi)、染料和例如櫻桃或橙味的調(diào)味劑。當(dāng)然，用于制備任何劑量單位形式的任何材料應(yīng)該是藥學(xué)上純凈的，或其所使用的量上應(yīng)該是基本無(wú)毒的。另外，具有通式1、2、3和4的化合物可以引入到持續(xù)釋放的制品或制劑中。
藥物組合物還可以包括合適的緩沖液以使得酸水解最小化。合適的緩沖試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，包括但不限于磷酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽和其混合物。
可以對(duì)根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)行單次或多次給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定根據(jù)本發(fā)明的化合物和/或組合物的有效的無(wú)毒性劑量水平以及該化合物和組合物用于治療失調(diào)或疾病的合適的給藥模式。
而且，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，可通過(guò)使用常規(guī)的治療測(cè)定實(shí)驗(yàn)方案來(lái)確定最佳治療方案，例如對(duì)于給定天數(shù)每天使用的本發(fā)明的化合物或組合物的劑量數(shù)，這一點(diǎn)是很顯然的。
通常，每24小時(shí)的有效劑量可以在每千克體重約0.0001mg-1000mg的范圍內(nèi)；合適地，每千克體重約0.001mg-750mg；每千克體重約0.01mg-500mg；每千克體重約0.1mg-500mg；每千克體重約0.1mg-250mg；或每千克體重約1.0mg-250mg。仍合適地，每24小時(shí)的有效劑量可以在每千克體重約1.0mg-200mg的范圍內(nèi)；每千克體重約1.0mg-100mg；每千克體重約1.0mg-50mg；每千克體重約1.0mg-25mg；每千克體重約5.0mg-50mg；每千克體重約5.0mg-20mg；或每千克體重約5.0mg-15mg。
或者，有效劑量最高可達(dá)約500mg/m2。通常，有效劑量可以在約25-約500mg/m2的范圍內(nèi)，約25-約350mg/m2，約25-約300mg/m2，約25-約250mg/m2，約50-約250mg/m2或約75-約150mg/m2。
根據(jù)示例，根據(jù)本發(fā)明的合適的劑量形式包括如下藥片具有通式1、2、3和4的化合物0.01-20mg，通常為0.1-10mg淀粉 10-20mg乳糖 100-250mg凝膠 0-5mg硬脂酸鎂 0-5mg
可注射溶液具有通式1、2、3和4的化合物0.01-20mg，通常為0.1-10mg氯化鈉8.5mg氯化鉀3mg氯化鈣4.8mg用于注射的水，加入到 10ml本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解可以對(duì)所展示的特定實(shí)施方案進(jìn)行眾多改變和/或修改，而不偏離的本發(fā)明所廣泛描述的精神或范圍。因此從各個(gè)所有方面來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有的實(shí)施方案應(yīng)理解為示例性的而非限制性的描述。
現(xiàn)將根據(jù)特定實(shí)施例來(lái)更具體地描述本發(fā)明，這決不能理解為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1—化合物的合成對(duì)比性2-吡啶基-和喹啉基-芳?；觐?lèi)似物，此處指的是“PCIH”和“QCIH”類(lèi)似物，分別通過(guò)2-吡啶基羧基醛或2-喹啉基羧基醛與合適的酸酰肼進(jìn)行希夫堿縮合合成。
對(duì)比性化合物吡哆醛異煙酰腙(PIH)和2-羥基-1-萘基醛異煙酰腙(311)通過(guò)理查森&伯恩哈特(Richardson & Bernhardt)(1999)方法合成。3PCIH、QCIH芳酰基腙系列的化合物和“311”的代表性結(jié)構(gòu)在圖1B和1C中提供。
實(shí)施例1a-PKIH類(lèi)似物的合成代表性PKIH類(lèi)似物通過(guò)2-二-吡啶基酮與合適的酸酰肼按照Bacchi等人(1996)的方法縮合進(jìn)行合成13。合適的溶劑包括乙醇、甲醇、乙醇/水、甲醇/水、丙酮、苯、甲苯。代表性PKIH類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)如圖2B所示。
PKAH的X-射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)如圖9所示。X-射線(xiàn)結(jié)晶數(shù)據(jù)如下所示。
晶體數(shù)據(jù)采集CAD-4軟件(Enraf-Nonius，1989)；單元細(xì)化(cell refinement)CAD-4軟件中SET4；數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化Xtal(Hall等人；1992)；用于解決結(jié)構(gòu)的程序SHELX86(Sheldrick，1990)；用于細(xì)化結(jié)構(gòu)的程序SHELX97(Sheldrick，1997)；分子圖解PLATON(Spek，1990)；用于創(chuàng)建結(jié)晶數(shù)據(jù)的軟件SHELXL97。
在與D.R.Richardson，E.Becker和P.V.Bernhardt.(1999)所描述的相同的常規(guī)條件下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。
結(jié)構(gòu)測(cè)定的晶體數(shù)據(jù)和詳情PKAH(C18H16N5O)P-1(2)Z＝2晶體數(shù)據(jù)分子式C18H16N5O，O分子量334.36晶體系統(tǒng)三斜晶系空間群P-1(No.2)a，b，c[埃] 8.667(2)9.977(2)11.197(2)α，β，γ[deg] 91.010(10)109.20(2)109.63(2)V[Ang**3]852.2(3)Z 2D(calc)[g/cm**3] 1.303F(000)350Mu(MoKa)[/mm] 0.1對(duì)于PKAH(C18H16N5O)P-1(2)Z＝2的最終結(jié)構(gòu)因子計(jì)算1.s.參數(shù)的總數(shù)目＝240最大矢量長(zhǎng)度＝511所要求的存儲(chǔ)＝2380/22995wR2＝0.1767對(duì)于2985數(shù)據(jù)和0/240參數(shù)在周期21前GooF＝S＝0.987；對(duì)于0抑制，抑制的GooF＝0.987重量＝1/[δ^2(Fo^2)+(0.10000*P)^2+0.00*P]其中P＝(Max(Fo^2)+2*Fc^2)/3對(duì)1497Fo＞4sig(Fo)R1＝0.0503對(duì)所有2985數(shù)據(jù)為0.1265wR2＝0.1767，GooF＝S＝0.987，對(duì)于所有數(shù)據(jù)抑制的GooF＝0.987
C1-距離 鍵角N1 1.3378(0.0036)C2 1.3775(0.0042) 122.49(0.27)C6 1.4967(0.0038) 116.20(0.26)121.26(0.27)C1- N1 C2C2-距離 鍵角C3 1.3738(0.0042)C1 1.3775(0.0041) 119.20(0.31)C2- C3C3-距離 鍵角C4 1.3623(0.0049)C2 1.3738(0.0042) 118.91(0.33)C3- C4C1-距離 鍵角C3 1.3623(0.0049)C5 1.3668(0.0047) 118.81(0.31)C4- C3距離 鍵角N1 1.3420(0.0038)C4 1.3668(0.0047) 123.65(0.32)C5- N1C6-距離 鍵角N3 1.2972(0.0033)C7 1.4777(0.0039) 128.71(0.25)C1 1.4967(0.0038) 111.31(0.24)119.98(0.24)C6- N3 C7C7-距離 鍵角N2 1.3265(0.0037)C8 1.3871(0.0040) 121.37(0.28)C6 1.4777(0.0039) 117.66(025)120.96(0.27)C7- N2 C8CS-距離 鍵角C9 1.3698(0.0044)C7 1.3871(0.0040) 119.81(0.31)C8- C9
C9-距離 鍵角C101.3489(0.0050)C8 1.3698(0.0044) 119.27(0.33)C9- C10C10- 距離 鍵角C9 1.3489(0.0050)C111.3641(0.0052) 117.97(0.35)C10- C9C11- 距離 鍵角N2 1.3423(0.0041)C101.3641(0.0052) 124.54(0.36)C11- N2C12- 距離 鍵角O1 1.2202(0.0032)N4 1.3690(0.0034) 120.54(0.27)C131.4649(0.0039) 122.80(0.26)116.56(0.25)C12- 01 N4C13- 距離 鍵角C141.3913(0.0038)C181.3927(0.0038) 116.65(0.26)C121.4649(0.0039) 124.91(0.25)118.42(0.26)C13- C14 C18C14- 距離 鍵角C151.3794(0.0039)C131.3913(0.0038) 121.52(0.26)C14- C15C15- 距離 鍵角C141.3794(0.0039)C161.3878(0.0040) 120.80(0.28)C15- C14C16- 距離 鍵角N5 1.3677(0.0035)C151.3878(0.0040) 121.49(0.28)C171.3939(0.0040) 120.60(0.27)117.90(0.27)C16- N5 C15C17- 距離 鍵角C181.3592(0.0040)C161.3939(0.0040) 120.71(0.27)C17- C18C18- 距離 鍵角C171.3592(0.0040)C131.3927(0.0038) 122.40(0.27)C18- C17
N1- 距離鍵角C11.3378(0.0036)C51.3420(0.0038) 116.87(0.28)N1- C1N2- 距離鍵角C71.265(0.0037)C11 1.3423(0.0042) 117.02(0.28)N2- C7N3- 距離鍵角C61.2972(0.0033)N41.3639(0.0030) 119.64(0.23)N3- C6N4- 距離鍵角N31.3639(0.0030)C12 1.3690(0.0034) 118.10(0.23)N4- N3N5- 距離鍵角C16 1.3677(0.0035)N5-O1- 距離鍵角C12 1.2202(0.0032)O1-非氫原子的最終配位和相當(dāng)?shù)母飨蛲晕灰茀?shù)PKAH(C18H16N5O)P-1(2)Z＝2原子xy z C(cq)[Ang^2]---- --- ------------------O11.047850.751270.333470.0701N10.495280.32443 -0.063960.0535N20.583970.301480.328300.0725N30.809110.499270.213550.0479N40.844960.542220.339160.0501N51.032850.904640.881110.0752C10.659000.354660.017700.0462C20.797350.370320.002257 0.0553C30.768800.36059 -0.151130.0668C40.603650.33400 -023528 0.0672C50.471530.31568 -0.188900.0628
C60.686020.377020.156700.0462C70.576700.266720.211160.0511C80.473170.130760.142860.0639C90.374510.029950.196070.0772C10 0.382490.063720.315680.0877C11 0.487700.199000.377910.0969C12 0.964660.677140.393120.0484C13 0.978350.728800.520830.0444C14 0.886210.648560.592430.0544C15 0.903290.705900.711130.0582C16 1.012580.846890.762760.0541C17 1.104770.927900.691230.0615C18 1.087990.869700.574890.0577O20.853770.765040.058420.0756U(eq)＝正交U張量線(xiàn)跡的1/3實(shí)施例1b-DpT類(lèi)似物的制備使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Johnson等人，1982)，DpT類(lèi)似物通過(guò)2-二-吡啶基酮分別和硫代氨基脲或酸酰肼14經(jīng)希夫堿縮合來(lái)合成。用于該反應(yīng)的合適的溶劑包括乙醇、甲醇、乙醇/水、甲醇/水、丙酮、苯、甲苯。
代表性DpT類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)如圖2A所示。
實(shí)施例1c—鐵絡(luò)合物的制備PKIH類(lèi)似物的鐵絡(luò)合物使用由理查森&伯恩哈特，19993描述的技術(shù)制備。通常，1摩爾當(dāng)量的Fe(III)鹽與2摩爾當(dāng)量的PKIH類(lèi)似物在熱乙醇中回流1小時(shí)。形成暗綠色/黑色絡(luò)合物固體，通過(guò)減壓過(guò)濾將其從母液中分離出。然后用乙醇洗滌絡(luò)合物，空氣干燥。
DpT類(lèi)似物的鐵絡(luò)合物用類(lèi)似的方法制備。
實(shí)施例2-PCIH、QCIH和PKIH類(lèi)似物的親脂性和活性比較對(duì)所有的螯合劑，親脂性以平均log P的值(正辛醇-水分配系數(shù))進(jìn)行測(cè)量。根據(jù)Broto’s方法(Broto等人，1984)15、Crippen’s碎裂方法(Ghose & Crippen，1987)16或使用Chem Draw Pro.(v.4.5，CambridgeSoftware，1997)的Viswanadhan’s碎裂方法(Viswanadhan等人，1987)17估算log P的值(表1)。然后將這些數(shù)值的平均值(平均計(jì)算的log P的值；表1)對(duì)IC50值或螯合劑誘發(fā)59Fe轉(zhuǎn)移或防止59Fe吸收的能力作圖。這些點(diǎn)線(xiàn)圖表明在測(cè)試的化合物的親脂性和抗增殖活性或Fe螯合效力之間沒(méi)有較強(qiáng)的相關(guān)性(所有的相關(guān)性r＜0.52)(未顯示數(shù)據(jù))。
表1計(jì)算的正-辛醇分配系數(shù)(log Pcalc)
*不能根據(jù)Broto’s方法計(jì)算**不能計(jì)算log Pcalc值使用Chem Draw Pro V4.5程序進(jìn)行計(jì)算。
由于單個(gè)喹啉環(huán)的存在，對(duì)比性QCIH類(lèi)似物是研究的化合物中親脂性最強(qiáng)的(表1)。然而，QCIH系列的鐵螯合效力和抗增殖活性很低(參見(jiàn)實(shí)施例3a、3b和4a)。
體外和體內(nèi)研究對(duì)實(shí)施例3-10通用方法學(xué)DFO從Novartis(Basel，Switzerland)購(gòu)得。
311根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備3。
Triapine(3-氨基吡啶-2-羧基醛硫代縮氨基脲；圖1B)為VionPharmaceuticals，NJ，USA.的贈(zèng)品。
化合物的展示所有的化合物在即將開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前溶解在二甲基亞砜(DMSO)中作為10mM的儲(chǔ)備液，然后在10％胎牛血清(FCS；CommonwealthSerum Laboratories，Melbourne，Australia)中稀釋?zhuān)沟米罱KDMSO的濃度等于或小于0.5％(v/v)。
細(xì)菌培養(yǎng)液的制備人類(lèi)SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞株、SK-Mel-28黑素瘤細(xì)胞和MCF-7乳癌細(xì)胞從American Type Collection(ATCC)，Rockville，MD，USA購(gòu)得。正常的細(xì)胞類(lèi)型MRC-纖維原細(xì)胞和L8大鼠骨骼肌細(xì)胞也從American Type Collection(ATCC)，Rockville，MD，USA購(gòu)得。細(xì)胞在Eagle’s改良的最低必需培養(yǎng)基(MEM；Gibco BRL，Sydney，Australia)中生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基含有10％FCS(Commonwealth Serum Laboratories，Melbourne，Australia)、1％(v/v)非必需氨基酸(Gibco)、2mM L-谷氨酸(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)、100μg/ml鏈霉素(Gibco)、100U/ml青霉素(Gibco)和0.28μg/ml兩性霉素B(SquibbPharmaceuticals，Montreal，Canada)。該生長(zhǎng)介質(zhì)隨后稱(chēng)之為“完全培養(yǎng)基”。細(xì)胞在孵育器(Forma Scientific，OH，USA)中在37℃下在5％CO2/95％空氣的潮濕空氣中生長(zhǎng)和次培養(yǎng)。使用相控制顯微鏡和臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)仔細(xì)評(píng)估細(xì)胞的生長(zhǎng)和活力。
MTT細(xì)胞增殖分析通過(guò)與前述基本相同的方法18，使用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑)分析來(lái)檢查細(xì)胞增殖。細(xì)胞以15,000個(gè)細(xì)胞/孔接種到96-孔微滴定板中，該滴定板在0.1mL含有上述2.2部分所描述的所有補(bǔ)充物(完全培養(yǎng)基)和1.25μM人類(lèi)二鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的MEM培養(yǎng)基中。該接種密度造成了分析期間細(xì)胞的指數(shù)式生長(zhǎng)。將細(xì)胞過(guò)夜生長(zhǎng)，然后將待測(cè)試化合物加入0.1mL含有1.25μM二鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的完全培養(yǎng)基中?；衔锏淖罱K濃度為0.39-50μM。對(duì)照樣品含有完全培養(yǎng)基和1.25μM二鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白。細(xì)胞與化合物在37℃下在含有95％空氣和5％CO2的潮濕氣氛中培育90小時(shí)。培育后，向每個(gè)孔中加入0.01mL的MTT，將板在37℃培育2小時(shí)。然后通過(guò)加入在0.01M HCl中的0.1mL的10％SDS-50％異丁醇溶解細(xì)胞，然后將板在掃描多孔分光光度計(jì)(Titertek Multiscan；Beckman Instruments Inc.，California)570nm下讀數(shù)。MTT的顏色形成與存活細(xì)胞的數(shù)目直接成比例。MTT分析的結(jié)果表示為對(duì)照值的百分?jǐn)?shù)。
統(tǒng)計(jì)使用Student′s配對(duì)t檢驗(yàn)來(lái)比較實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。當(dāng)p＜0.05時(shí)，認(rèn)為結(jié)果是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。結(jié)果表示為2-5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。
實(shí)施例3—鐵轉(zhuǎn)移/吸收實(shí)驗(yàn)用59Fe標(biāo)記轉(zhuǎn)鐵蛋白使用Richardson & Baker，1992所描述的標(biāo)準(zhǔn)步驟用59Fe(為0.1MHCl中的氯化鐵，Dupong NEN，MA，USA)制備和標(biāo)記脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA)，進(jìn)而制得59Fe-轉(zhuǎn)鐵蛋白(59Fe-Tf)。
實(shí)施例3a—PCIH、QCIH和PKIH類(lèi)似物對(duì)從預(yù)標(biāo)記的SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞中的Fe轉(zhuǎn)移的影響的比較方法學(xué)鐵轉(zhuǎn)移分析使用標(biāo)準(zhǔn)步驟來(lái)研究螯合劑對(duì)從預(yù)標(biāo)記的細(xì)胞中59Fe釋放的影響18。細(xì)胞用59Fe-轉(zhuǎn)鐵蛋白(0.75μM)在37℃預(yù)標(biāo)記3小時(shí)。然后將細(xì)胞置于冰上，并用冷卻的BSS洗滌4次，然后在只存在培養(yǎng)基(對(duì)照)或者在含有DFO(100μM)或其他化合物(50μM)的培養(yǎng)基中在37℃再培育3小時(shí)。移出上層培養(yǎng)基，并將其置于γ-計(jì)數(shù)管中。將細(xì)胞用塑料刮鏟從1ml BSS中的皮氏培養(yǎng)皿中移出，轉(zhuǎn)移到單獨(dú)一套γ-計(jì)數(shù)管中。
通過(guò)比較其對(duì)DFO和相應(yīng)的PCIH類(lèi)似物的活性來(lái)分析QCIH和PKIH類(lèi)似物的鐵螯合效力。在3小時(shí)的標(biāo)記期后，化合物從SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)移59Fe的能力用59Fe-Tf(0.75μM)在37℃進(jìn)行分析。然后將細(xì)胞洗滌，在存在和不存在內(nèi)標(biāo)DFO(100μM)或其他50μM螯合劑下，在37℃再培育3小時(shí)(圖3和圖4)。由于DFO從細(xì)胞中轉(zhuǎn)移59Fe和防止從59Fe-Tf吸收鐵的效力低，所以使用濃度為100μM的DFO。
通常，與相應(yīng)的PCIH對(duì)照化合物相比，PKIH系列顯示出相似或更強(qiáng)的從預(yù)標(biāo)記細(xì)胞中轉(zhuǎn)移59Fe的能力(圖3A)。PKIH和PCIH組之間活性的最大差別是在比較這些系列(參見(jiàn)表1)即PCAH和PKAH或PCHH和PKHH之間更具親水性化合物時(shí)發(fā)現(xiàn)的。
通常，對(duì)比QCIH類(lèi)似物的行為與PCIH或PKIH類(lèi)似物的方式不相似，前者在誘發(fā)59Fe轉(zhuǎn)移方面顯示出低活性(圖3B)。QCIH系列的最有效的螯合劑是母體化合物QCIH，其顯示出與PCIH相當(dāng)?shù)募?xì)胞59Fe轉(zhuǎn)移(圖3B)。
分析這三組化合物的59Fe轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)表明PKIH系列的二吡啶基取代基能賦予螯合劑高的鐵螯合活性，而與酰肼取代基無(wú)關(guān)(圖3A)。相反，在化合物的對(duì)比QCIH系列中單個(gè)喹啉環(huán)的存在導(dǎo)致低的鐵螯合活性(圖3B)。
實(shí)施例3b—PCIH、OCIH和PKIH螯合劑對(duì)從59Fe標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白中進(jìn)行細(xì)胞鐵吸收的影響的比較方法學(xué)鐵吸收分析使用標(biāo)準(zhǔn)步驟18來(lái)研究PKIH類(lèi)似物抑制細(xì)胞從59Fe-Tf中吸收59Fe的能力。SK-N-MC細(xì)胞在含有59Fe-Tf(0.75μM)和或者為DFO(100Mm)或者為PCIH、QCIH或PKIH系列(50μM)的化合物的培養(yǎng)液中在37℃培育3小時(shí)。然后將細(xì)胞置于冰上，用冰冷漢克斯平衡鹽溶液(BSS)洗滌四次以除去非特異性結(jié)合的59Fe-Tf。然后在4℃下將細(xì)胞與常用的蛋白酶、鏈霉蛋白酶(1mg/ml)培育30分鐘以除去膜結(jié)合的59Fe和Tf。
所有的PKIH類(lèi)似物在抑制從59Fe-Tf中吸收59Fe方面都非常有效(圖4A)。特別地，PKAH和PKHH配體顯示出顯著的活性，而相應(yīng)的對(duì)照PCIH類(lèi)似物、PCAH和PCHH顯示出很小的影響(圖4A)。通常，QCIH配體與PCIH和PKIH類(lèi)似物相比，在防止從59Fe-Tf中吸收59Fe方面效果較差。
實(shí)施例3c-PKIH濃度對(duì)細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)移和從轉(zhuǎn)鐵蛋白中進(jìn)行鐵吸收的影響方法學(xué)鐵轉(zhuǎn)移分析將PKIH類(lèi)似物對(duì)59Fe轉(zhuǎn)移的效力作為化合物濃度的函數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)(圖5A)。細(xì)胞用59Fe-Tf(0.75μM)在37℃預(yù)標(biāo)記3小時(shí)、洗滌、然后用一定濃度范圍內(nèi)(0.5-50μM)的PKIH化合物在37℃培育3小時(shí)。
類(lèi)似地，通過(guò)將PKIH類(lèi)似物(0.5-50μM)與59Fe-Tf(0.75μM)在37℃培育3小時(shí)、然后洗滌細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)螯合劑濃度對(duì)從59Fe-Tf中進(jìn)行59Fe吸收的效力(圖5B)。PCTH作為內(nèi)對(duì)照物使用。
在濃度小于10μM時(shí)，PKIH、PKTH和PKBH比PCTH在轉(zhuǎn)移細(xì)胞59Fe方面更有效(圖5A)。例如，在濃度為1μM時(shí)，PKTH釋放了26％的細(xì)胞59Fe，而PCTH只釋放了10％(圖5A)。類(lèi)似地，PKIH、PKBH和PKTH比對(duì)照的PCTH在防止從59Fe-Tf中吸收59Fe方面有更高的效力(圖5B)。更親水性的配體PKAH和PKHH(表1)在59Fe吸收和59Fe轉(zhuǎn)移分析中顯示出較低的效力。
實(shí)施例3d-DpT類(lèi)似物對(duì)從預(yù)標(biāo)記的SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞中鐵轉(zhuǎn)移的影響方法鐵轉(zhuǎn)移分析使用標(biāo)準(zhǔn)步驟用59Fe(Dupong-NEN，MA，USA)標(biāo)記脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(δ)以制備59Fe轉(zhuǎn)鐵蛋白(59Fe-Tf)18。細(xì)胞用59Fe-Tf(0.75μM)在37℃預(yù)標(biāo)記3小時(shí)、洗滌、然后與螯合劑(25μM；圖11A)在37℃培育3小時(shí)。DFO和311作為內(nèi)標(biāo)物使用。
分析了DpT類(lèi)似物從SK-N-MC細(xì)胞中直接轉(zhuǎn)移59Fe的能力(圖11A)。DpT和Dp2mT造成全部細(xì)胞59Fe 6-7％的流出，而只用培養(yǎng)液再培育的對(duì)照細(xì)胞釋放了59Fe的5％(圖11A)。由于在硫代縮氨基脲的2-位置存在的甲基基團(tuán)阻礙了鐵的螯合，化合物Dp2mT起陰性對(duì)照的作用。DFO只造成11％細(xì)胞59Fe的轉(zhuǎn)移(圖11A)。其他所研究的DpT化合物比DFO在轉(zhuǎn)移59Fe方面顯著增強(qiáng)(p＜0.0001)，會(huì)導(dǎo)致37-47％細(xì)胞59Fe的釋放(圖11)。Dp44mT是最有效的，會(huì)導(dǎo)致47％59Fe的釋放(圖11)。DpT類(lèi)似物在誘發(fā)59Fe流出的效力與其抗腫瘤的活性充分相關(guān)(實(shí)施例4d，表3)。
實(shí)施例3e-DpT類(lèi)似物對(duì)由SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞從59Fe標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白中進(jìn)行細(xì)胞鐵吸收的影響方法學(xué)鐵吸收分析使用標(biāo)準(zhǔn)步驟研究了DpT類(lèi)似物在抑制從59Fe-Tf中細(xì)胞吸收59Fe的能力18。通過(guò)與常用的蛋白酶、鏈霉蛋白酶(1mg/ml)在4℃培育30分鐘，再除去膜結(jié)合的59Fe和Tf來(lái)測(cè)定被細(xì)胞內(nèi)在化的59Fe的量。
在不存在或存在一定范圍的DpT類(lèi)似物(25μM)下、在3個(gè)小時(shí)內(nèi)和在37℃下研究DpT類(lèi)似物抑制SK-N-MC細(xì)胞從59Fe-Tf(0.75μM)中吸收59Fe的能力(圖11B)。與其轉(zhuǎn)移59Fe的低能力一致，DpT和D2mT在防止59Fe吸收方面影響很小。研究的最有效的化合物，包括311和Dp44mT，限制59Fe吸收為對(duì)照的5-9％，它們的活性遠(yuǎn)大于(p＜0.0001)DFO(圖11B)。這些結(jié)果與這些配體轉(zhuǎn)移細(xì)胞59Fe的能力一致(圖11A)。測(cè)試的所有DpT類(lèi)似物(除了DpT和Dp2mT)在防止細(xì)胞從59Fe-Tf中吸收59Fe方面顯示出比DFO大的多的效力。
已表明，DpT類(lèi)似物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力(表3)與其誘發(fā)59Fe釋放(圖11A)和防止59Fe吸收(圖11B)的效力相關(guān)。Dp44mT、Dp4mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT的Fe螯合活性遠(yuǎn)大于DFO調(diào)節(jié)的Fe螯和活性。
實(shí)施例3f-Dp44mT對(duì)從Tf中進(jìn)行吸收鐵和從M109細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)移鐵的影響評(píng)價(jià)了化合物Dp44mT抑制小鼠中M109肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。使用培育的M109肺癌細(xì)胞來(lái)開(kāi)展研究，確定Dp44mT對(duì)從這些細(xì)胞中轉(zhuǎn)移59Fe(圖11C)和抑制從59Fe-Tf中吸收59Fe(圖11D)的影響。作為內(nèi)對(duì)照，用DFO和311來(lái)培育細(xì)胞。通過(guò)在37℃用59Fe-Tf(0.75μM)標(biāo)記細(xì)胞3小時(shí)、隨后分別用化合物(0.2-25μM)洗滌、在37℃再培育3小時(shí)來(lái)研究化合物濃度對(duì)提高從M109細(xì)胞中的59Fe轉(zhuǎn)移的影響(圖11C)。DFO是所研究的化合物中效力最差的，在25μM時(shí)僅從細(xì)胞中釋放出12±1％的59Fe，而對(duì)照介質(zhì)釋放了8±1％(圖11C)。相反，5μM311將細(xì)胞59Fe的釋放從8±1％(對(duì)照介質(zhì))提高到60±1％(圖11C)。對(duì)于Dp44mT，59Fe的釋放在2μM時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，會(huì)導(dǎo)致48±2％的59Fe的流出(圖11C)。
在抑制M109細(xì)胞從59Fe-Tf(0.75μM)中細(xì)胞進(jìn)行59Fe的吸收方面，化合物311是研究的化合物中最具有活性的(圖11D)。在1μM時(shí)，311將59Fe的吸收減少到對(duì)照的40±4％。相反，DFO幾乎沒(méi)有影響。Dp44mT在濃度為5μM時(shí)具有與311類(lèi)似的活性，這時(shí)其將59Fe的吸收減少到對(duì)照的30±1％(圖11D)。
實(shí)施例4—體外細(xì)胞增殖的抑制實(shí)施例4a-PKIH類(lèi)似物對(duì)SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞增殖的影響方法學(xué)細(xì)胞增殖分析研究了化合物PCIH、QCIH和PKIH系列對(duì)SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞系的增殖的影響(表2)。使用MTT分析(如上所述)研究了化合物對(duì)SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞的增殖的影響。MTT顏色形成與臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)量的存活細(xì)胞的量直接成比例。在所有的實(shí)驗(yàn)中，使用化合物311和DFO作為相關(guān)的內(nèi)對(duì)照。
表2使用MTT分析，F(xiàn)e螯合劑化合物PCIH、QCIH和PKIH系列對(duì)SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞的增殖的影響
數(shù)據(jù)表示為4次實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
細(xì)胞的形態(tài)外觀(guān)和細(xì)胞數(shù)量的明顯降低表明PKIH類(lèi)似物的細(xì)胞毒性是的很明顯。PKIH類(lèi)似物即使在非常低的螯合劑濃度時(shí)也顯示出很高的抗增殖活性(表2)?；衔颬KIH、PKTH、PKBH和PKBBH顯示出與311非常相似的抗增殖活性(表2)。
與PKIH類(lèi)似物形成對(duì)比，對(duì)比的PCIH和QCIH類(lèi)似物對(duì)細(xì)胞增殖影響很小(表2)。PCIH和QCIH系列的所有化合物的IC50值為40μM至大于50μM。這些結(jié)果與通過(guò)相襯顯微鏡方法和臺(tái)盼藍(lán)染色方法所得到的細(xì)胞形態(tài)高度一致，表明PCIH和QCIH系列的化合物顯示出很小的細(xì)胞毒活性。
實(shí)施例4b—PKIH類(lèi)似物的Fe(III)絡(luò)合物對(duì)SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定當(dāng)與Fe(III)絡(luò)合時(shí)PKIH類(lèi)似物在抑制SK-N-MC細(xì)胞增殖方面是否有效。螯合劑與Fe的摩爾比為1∶1和2∶1時(shí)，所有的PKIH-Fe絡(luò)合物顯示出與自由配體相似的抗增殖活性水平(數(shù)據(jù)未顯示)。作為同一個(gè)研究中的相關(guān)對(duì)照，也制備和分析了311對(duì)Fe絡(luò)合物比為1∶1和2∶1的化合物。311的Fe絡(luò)合物在濃度高達(dá)50μM時(shí)對(duì)增殖沒(méi)有顯著的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例4C—PKIH類(lèi)似物對(duì)纖維原細(xì)胞和SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞增殖的影響的比較研究了PKIH、PKTH、PKBH和PKBBH對(duì)SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞和MRC-5纖維原細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響(圖6)。MRC-5細(xì)胞類(lèi)型是正常的人類(lèi)肺部纖維原細(xì)胞株，其會(huì)凋亡并在數(shù)次體外傳代后開(kāi)始衰老。SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞類(lèi)型是無(wú)限生長(zhǎng)分化的。PKIH類(lèi)似物抑制增殖的影響在SK-N-MC細(xì)胞中比在纖維原細(xì)胞中增加了。例如，當(dāng)PKIH類(lèi)似物在SK-N-MC細(xì)胞中的IC50值為1-3μM時(shí)(表2)，PKBBH、PKBH、PKTH和PKIH的IC50值在纖維原細(xì)胞中分別為8、11、16和＞25μM。
實(shí)施例4d—DpT類(lèi)似物對(duì)SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞增殖的影響評(píng)價(jià)了DpT類(lèi)似物(圖2A)抑制SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞增殖的能力(圖10)。將化合物(0-25μM)與細(xì)胞培育72小時(shí)，在培育期末時(shí)，通過(guò)MTT分析來(lái)測(cè)定細(xì)胞密度，如上所述。Dp2mT作為陰性對(duì)照。通過(guò)使用MTT分析獲得的數(shù)據(jù)與通過(guò)光顯微鏡估計(jì)的細(xì)胞數(shù)量直接相關(guān)。
Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT顯示出非常高的抗增殖活性(IC50＝0.03-0.06μM；表3)。這些DpT類(lèi)似物的活性比DFO(IC50＝5μM)大的多(p＜0.0001)，也比其它Fe螯合劑如311具有更大的效力(IC50＝0.3μM；表3)。與已有的在SK-N-MC細(xì)胞中的細(xì)胞毒性劑-鏈霉菌的抗增殖活性(IC50＝0.02μM；表3)相比，Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT具有相似的效力。鐵螯合劑Triapine(圖1B)比上述的DpT類(lèi)似物的活性低(IC50＝0.26μM；表3)。Dp4mT也顯示出對(duì)SK-N-MC細(xì)胞的相當(dāng)?shù)幕钚?，與Triapine相當(dāng)，其IC50值為0.19μM(表3)。
表3Fe螯合劑對(duì)瘤形成細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞增殖的影響
結(jié)果為平均值±SD(至少5次實(shí)驗(yàn))。
*沒(méi)有獲得數(shù)據(jù)也評(píng)價(jià)了DpT類(lèi)似物對(duì)SK-Mel-28黑素瘤和MCF-7乳癌細(xì)胞系的抑制(表3)。由于2-位置的甲基基團(tuán)阻礙Fe-螯合，將Dp2mT作為陰性對(duì)照?；衔顳p4mT、Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT中的每一個(gè)在抑制SK-Mel-28黑素瘤和MCF-7乳癌細(xì)胞的增殖方面比DFO更具有活性(p＜0.0001)(表3)。在對(duì)抗這些細(xì)胞系方面，Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT的活性最高(IC50＝0.06-0.10μM；表3)，當(dāng)評(píng)價(jià)所有的瘤形成細(xì)胞類(lèi)型時(shí)，Dp44mT是最有效的抗增殖劑?？傊?，活性DpT類(lèi)似物的效力比311和Triapine的效力強(qiáng)，也比針對(duì)阿霉菌的好(表3)。顯著地，與Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT和Dp4pT對(duì)無(wú)限生長(zhǎng)分化的瘤形成細(xì)胞的明顯的抗增殖活性相比，這些化合物對(duì)會(huì)凋亡的MRC-5纖維原細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出令人驚訝的低效力(IC50值＞25μM)(圖10和表3)。
實(shí)施例4e—對(duì)一系列細(xì)胞類(lèi)型的增殖抑制的比較化合物311、DFO、DOX、PKIH、PKTH、Dp44mT、Dp4eT和Dp4pT(0-50μM)與細(xì)胞培育72小時(shí)。在培育期結(jié)束時(shí)，通過(guò)MTT分析來(lái)測(cè)定細(xì)胞密度(如上所述)。結(jié)果如表4所示。
表4— Fe螯合劑對(duì)一系列瘤形成細(xì)胞如H69AR肺癌、IMR-32神經(jīng)上皮瘤、HEP G2肝細(xì)胞瘤、DU145前列腺癌和NCI h2452間皮瘤細(xì)胞系細(xì)胞增殖的影響
^1次實(shí)驗(yàn)；*2次實(shí)驗(yàn)的平均值±SD；#3次實(shí)驗(yàn)的平均值±SD分析了更有效的化合物對(duì)一系列腫瘤細(xì)胞系的抗增殖活性，該腫瘤細(xì)胞系衍生自多個(gè)迅速蔓延的癌癥。在這些實(shí)驗(yàn)中，DFO和311用作適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)。另外，這些研究包括了細(xì)胞毒性劑鏈霉菌(DOX)，其在目前的臨床應(yīng)用中是最有效的抗腫瘤劑之一。研究的效力最差的螯合劑是內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)DFO，其是目前臨床應(yīng)用中用于治療鐵過(guò)載疾病的藥物。研究的最有效的化合物包括3個(gè)DpT類(lèi)似物，即Dp44mT、Dp4eT和Dp4pT。明顯地，這些DpT類(lèi)似物在一些癌細(xì)胞系中的活性比DOX的活性更明顯。例如，在肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2中，Dp4eT的IC50為0.02μM，其比DOX的相應(yīng)值(2.61μM)少10倍多。PKIH類(lèi)似物PKIH和PKTH的活性也很明顯，與311相類(lèi)似，比DOX的效力稍差。重要的是，DpT和PKIH類(lèi)似物的作用機(jī)理和DOX的差別很大，因此可以用于對(duì)抗耐DOX的癌細(xì)胞類(lèi)型。
實(shí)施例5—M109肺癌生產(chǎn)的體內(nèi)劑量依賴(lài)型抑制一般方法學(xué)測(cè)定CD2F1雜交小鼠中的最大可容忍劑量BALB/c和DBA/2小鼠從Animal Resources Centre(Universit ofNew South Wales(UNSW)，Sydney，Australia)獲得，雜交獲得CD2F1動(dòng)物(使用的所有步驟由Animal Ethics Committee，UNSW批準(zhǔn))。隨意給每組8只雌性CD2F1小鼠(8-10周大)的多個(gè)組喂食和飲水，并通過(guò)尾靜脈注射所研究化合物0.9％無(wú)菌生理鹽水的30％丙二醇溶液，每天兩次，每次間隔6小時(shí)，每周5天，注射兩周。最大可容忍劑量定義為使30％的實(shí)驗(yàn)小鼠死亡或者使體重減小超過(guò)10％的劑量。19通過(guò)體內(nèi)鐵螯合劑抑制M109肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)8-10周大的雌性CD2F1小鼠用1×105M109細(xì)胞進(jìn)行sc植入。通過(guò)將腫瘤制成糊、并通過(guò)sc注射使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入CD2F1小鼠中20。Dp44mT溶解在生理鹽水的30％(v/v)丙二醇中，在腫瘤植入4天后靜脈注射，每天2次，注射5天，隨后是不對(duì)動(dòng)物進(jìn)行注射的為期2天的“休息期”。腫瘤植入后的第12天，用甲氧氟烷和進(jìn)行心臟穿刺將小鼠處死。使用西森美康血球計(jì)數(shù)器(Sysmex Blood Couner)(Prince ofWales Hospital，Sydney，Australia)測(cè)量血液指數(shù)和紅血球指數(shù)。記錄在處理期間小鼠體重的變化。稱(chēng)重并固定腫瘤以進(jìn)行組織學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)組由8只小鼠組成用于對(duì)照和每次處理(表5)。
圖12A顯示了在從第4天起每天2次靜脈注射連續(xù)5天后0.15、0.3和0.4mg/kg Dp44mT(MTD＝0.4mg/kg)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。作為相關(guān)的正對(duì)照，給動(dòng)物施用MTD(6mg/kg)的Triapine。在腫瘤細(xì)胞植入后的第12天測(cè)量腫瘤的重量。
表5.只用賦形劑(對(duì)照)、Dp44mT(0.15、0.3和0.4mg/kg)或Triapine(6mg/kg)處理的小鼠體重減輕和血液指數(shù)
結(jié)果為平均值±SEM(3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn))。實(shí)驗(yàn)組由8只小鼠組成用于對(duì)照和每次處理。
以劑量依賴(lài)型的方式給藥Dp44mT抑制了腫瘤的生長(zhǎng)(圖12A)，在0.4mg/kg時(shí)將腫瘤重量減至對(duì)照值的47％(p＜0.01)。與用Dp44mT處理的動(dòng)物相比，對(duì)照組的小鼠體重減輕或白細(xì)胞數(shù)沒(méi)有明顯的差別(表5)。然而，與對(duì)照相比，在用Dp44mT處理的動(dòng)物中在其MTD(0.4mg/kg)時(shí)觀(guān)察到血紅蛋白、血球容積、白細(xì)胞和血小板數(shù)量的輕微(p＜0.05)降低，但更低劑量時(shí)沒(méi)有觀(guān)察到(表5)。給藥0.15和0.3mg/kg的Dp44mT提高了血小板數(shù)(表5)。Triapine比Dp44mT更有效，將腫瘤的重量明顯地(p＜0.001)減至對(duì)照的10％(圖12A)。然而，與Dp44mT相反，在其MTD(6mg/kg)時(shí)的Triapine明顯和顯著地(p＜0.0001)減輕了動(dòng)物體重、血紅蛋白濃度、血球容積、紅血球和白血球數(shù)(表5)，表明在該條件下，Triapine是全身毒性的。實(shí)施例6—PKIH類(lèi)似物對(duì)3H-胸腺嘧啶脫氧核苷、3H-亮氨酸和3H-尿苷結(jié)合的影響方法學(xué)3H-胸腺嘧啶脫氧核苷、3H-亮氨酸和3H-尿苷結(jié)合分析SK-N-MC細(xì)胞用選擇的類(lèi)似物培育20小時(shí)后，在37℃加入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷嘧啶脫氧核苷、3H-亮氨酸或3H-尿苷2小時(shí)。用1mM在Ca(II)/Mg(II)-free PBS中的EDTA將細(xì)胞從96孔板中分離出，使用細(xì)胞收集器(Tomtec Harvester96，Linbrook，Queensland，Australia)收集并洗滌。在β-閃爍計(jì)數(shù)器(LKB Wallace，Turku，F(xiàn)inland)上測(cè)量放射性。
實(shí)施例6a—PCIH、QCIH和PKIH系列化合物對(duì)3H-胸腺嘧啶脫氧核苷結(jié)合的影響PKIH系列化合物對(duì)3H-胸腺嘧啶脫氧核苷結(jié)合的影響與相應(yīng)的PCIH和QCIH、以及作為相關(guān)對(duì)照的DFO和311對(duì)3H-胸腺嘧啶脫氧核苷結(jié)合的影響進(jìn)行比較(表6)。
表6PCIH、QCIH和PKIH系列化合物對(duì)SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷結(jié)合的影響
數(shù)據(jù)表示為4次實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
根據(jù)其抑制3H-胸腺嘧啶脫氧核苷結(jié)合的能力，PKIH、PKTH、PKBH和PKBBH是最有效的化合物，顯示出與核糖核酸還原酶抑制因子311相類(lèi)似或略強(qiáng)的活性(表6)。實(shí)際上，在用PKIH類(lèi)似物處理的細(xì)胞中，3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的水平幾乎觀(guān)察不到。例如，PKBBH將3H-胸腺嘧啶脫氧核苷結(jié)合減少至對(duì)照的0.02％(表6)。數(shù)個(gè)更親水性的PKIH類(lèi)似物，即PKAH和PKHH(表1)顯示出顯著低的(p＜0.0001)活性，抑制3H-胸腺嘧啶脫氧核苷結(jié)合分別至對(duì)照的23％和25％(表6)。然而，這些后述化合物的相對(duì)較低的抑制3H-胸腺嘧啶脫氧核苷結(jié)合的效力不能僅僅歸因于其親水性，因?yàn)樵撓盗械拇蠖鄶?shù)親水性類(lèi)似物(PKIH；表1)具有非常高的活性(表6)。
與311和PKIH類(lèi)似物相比，QCIH類(lèi)似物在抑制3H-胸腺嘧啶脫氧核苷結(jié)合方面顯示了相當(dāng)?shù)偷幕钚裕鋵⒔Y(jié)合減小為對(duì)照的41-83％。
實(shí)施例6b—PCIH和PKIH系列化合物對(duì)3H-亮氨酸和3H-尿苷結(jié)合的影響的比較考慮到PKIH系列類(lèi)似物對(duì)3H-胸腺嘧啶脫氧核苷結(jié)合的顯著影響，也分析了這些化合物對(duì)3H-亮氨酸(表7)和3H-尿苷(表8)結(jié)合的影響。獲得的結(jié)果與PCIH系列的類(lèi)似物進(jìn)行比較，其顯示出較高的Fe螯合活性，但是較低的抗增殖影響。
表7PCIH和PKIH配體對(duì)SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞的3H-亮氨酸結(jié)合的影響
數(shù)據(jù)表示為4次實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
表8PCIH和PKIH配體對(duì)SK-N-MC神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞的3H-尿苷結(jié)合的影響
數(shù)據(jù)表示為4次實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
抑制3H-胸腺嘧啶脫氧核苷結(jié)合的最有效的PKIH類(lèi)似物，即PKIH、PKTH、PKBH和PKBBH，在防止3H-亮氨酸和3H-尿苷分別與蛋白質(zhì)和RNA結(jié)合方面具有顯著低(p＜0.0001)的效力(表7和表8)。而且，這些PKIH類(lèi)似物具有比311顯著低的(p＜0.001)對(duì)3H-亮氨酸結(jié)合的影響(表7)。通常，PKIH類(lèi)似物比PCIH類(lèi)似物在防止3H-亮氨酸或3H-賧苷結(jié)合方面更有效(表7和8)。PKBBH在抑制3H-亮氨酸或3H-尿苷結(jié)合方面具有最強(qiáng)的活性。
實(shí)施例7—PKIH類(lèi)似物對(duì)WAF1和GADD45mRNA表達(dá)的影響方法學(xué)RNA印跡分析(Northern Blot Analysis)通過(guò)使用總RNA分離試劑(Advanced Biotechnologies Ltd，Surrey，United Kingdom)將總RNA分離出來(lái)進(jìn)行RNA印跡分析。膜與人類(lèi)WAF1、GADD45和β-肌動(dòng)蛋白特異性探針雜交。WAF1探針由來(lái)自pSXV的1kb片斷組成。GADD45探針由來(lái)自克隆入pHu145B2的人類(lèi)GADD45cDNA(由National Cancer Institute，NIH，Maryland的Dr.AlbertFomace友情供應(yīng))的760bp片斷組成。β-肌動(dòng)蛋白探針由來(lái)自克隆入pBluescript SK-的人類(lèi)β-肌動(dòng)蛋白cDNA的1.4kb片斷組成(ATCC；Cat.No.37997)。
分析了PKIH類(lèi)似物對(duì)基因WAF1和GADD45的表達(dá)的影響，該基因編碼對(duì)G1-S停滯必需的細(xì)胞循環(huán)抑制因子。內(nèi)在對(duì)照DFO、PCBBH和311造成GADD45和WAF1mRNA表達(dá)的向上調(diào)節(jié)，而PCBH和PCIH顯示出很小的效果(圖7)。與其明顯的抗增殖活性具有良好的相關(guān)性，PKIH、PKTH、PKBH和PKBBH具有明確的影響，與對(duì)照相比，顯著地(p＜0.0001)提高了GADD45和WAF1mRNA的水平。PKIH類(lèi)似物在誘發(fā)WAF1和GADD45mRNA表達(dá)方面比311具有顯著(p＜0.01)強(qiáng)的效力(圖7)。
實(shí)施例8—Ndrg1mRNA表達(dá)的誘發(fā)MCF-7細(xì)胞與一系列金屬離子螯合劑培育24小時(shí)。不能透過(guò)細(xì)胞膜的螯合劑EDTA(250μM)沒(méi)有顯示出抗增殖影響(IC50＞250μM)，并與更多的分別顯示出低和高抗增殖活性的可滲透金屬螯合化合物相比較。在MCF-7細(xì)胞中具有低抗增殖活性的化合物包括DFO(IC50＝20μM)、L1(去鐵酮，IC50＝180μM)和二吡啶基(IC50＞250μM)，在25和250μM時(shí)分析了這些化合物。化合物311和dp44mT顯示出對(duì)MCF-7細(xì)胞的高抗腫瘤效力(分別地，IC50＝0.6μM和0.1μM)，在25μM時(shí)對(duì)其進(jìn)行了分析(圖16)。青霉胺是一種公知的銅螯合劑，分析其用于比較。Dp2mT用作陰性對(duì)照。
在濃度為25μM時(shí)，DFO、青霉胺(PEN)、dp2mT、EDTA、二吡啶基和L1在向上調(diào)節(jié)Ndrg1方面沒(méi)有影響(圖16)。相反，311和dp44mT明顯地提高了Ndrg1的水平(圖16)。
實(shí)施例9—PKIH類(lèi)似物對(duì)鐵調(diào)節(jié)蛋白R(shí)NA-結(jié)合活性的影響方法學(xué)凝膠阻滯檢測(cè)法使用已有技術(shù)用凝膠阻滯檢測(cè)法來(lái)測(cè)量鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRP)和鐵效應(yīng)組件件(IRE)的相互作用。細(xì)胞與DFO(100μM)、FAC(100μg/ml)和PKIH類(lèi)似物(25μM)在37℃培育20小時(shí)，制備了細(xì)胞溶解產(chǎn)物。然后用凝膠阻滯檢測(cè)法檢測(cè)IRP-RNA結(jié)合活性。數(shù)份含有2μg蛋白的細(xì)胞溶解產(chǎn)物與0.1ng(大約1×105cpm)的32P-標(biāo)記的核糖在室溫培育30分鐘。使用該方案，加入的RNA水平達(dá)到飽和。通過(guò)與1U的RNAseT1在室溫下培育10分鐘來(lái)降解未保護(hù)的探針。然后加入肝素(5mg/ml)10分鐘以除去非特異性結(jié)合。在6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠上分析IRE-蛋白絡(luò)合物。在平行實(shí)驗(yàn)中，在加入IRE探針之前用氰鐵酸鹽(FeCN，5mM)和0.5％的β-巰基乙醇(β-ME)處理樣品。該過(guò)程導(dǎo)致IRP1自發(fā)或非自發(fā)的轉(zhuǎn)化成活性IRE-結(jié)合形式。22IRP-IRE機(jī)理是對(duì)應(yīng)于Fe螯合的細(xì)胞鐵體內(nèi)平衡的重要調(diào)節(jié)劑。因此，測(cè)定了PKIH類(lèi)似物對(duì)IRP-RNA-結(jié)合活性的影響(圖8)。SK-N-MC細(xì)胞與螯合劑(25μM)在37℃培育20小時(shí)。在所有實(shí)驗(yàn)中，鐵螯合劑DFO(100μM)、311(25μM)或鐵供體檸檬酸鐵銨(FAC；100μg/ml)用作相應(yīng)的對(duì)照3，23。由于己知其能減少I(mǎi)RP-IRE的結(jié)合活性，因此PCAH用作進(jìn)一步的對(duì)照。24在用DFO和311培育的細(xì)胞中出現(xiàn)了IRP-RNA結(jié)合的顯著(p＜0.005)提高，而FAC和PCAH顯著(p＜0.001)降低了RNA結(jié)合(圖8)。與對(duì)照相比，細(xì)胞用PKIH系列處理后IRP-RNA結(jié)合活性顯著(p＜0.01)提高(圖8)，反應(yīng)了其結(jié)合細(xì)胞鐵庫(kù)的能力。將β-巰基乙醇和FeCN加入到細(xì)胞溶解產(chǎn)物中顯示與所有的螯合劑培育后IRP-RNA結(jié)合活性的總量沒(méi)有變化(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例10—凋亡的誘發(fā)實(shí)施例10a—小鼠的Dp44mT處理的腫瘤樣品中增加的凋亡細(xì)胞和與Dp44mT培育后的培養(yǎng)的M109細(xì)胞中的凋亡研究使用流式細(xì)胞分析進(jìn)行凋亡分析使用結(jié)合到易位血漿膜磷脂酰絲氨酸(PS)上的熒光素異硫氰酸鹽(FITC)標(biāo)記的Annexin V，通過(guò)流式細(xì)胞分析(FACSCalibur，BectonDickinson，CA，USA)來(lái)檢測(cè)凋亡的細(xì)胞25。加入碘化丙啶(PI)來(lái)識(shí)別細(xì)胞膜完整性的損失，其可指示壞死的細(xì)胞。
通過(guò)終端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)化酶介導(dǎo)的dUTP切口端標(biāo)記(TUNEL)反應(yīng)來(lái)分析DNA裂解26。使用原位TUNEL分析，用Dp44mT(0.4mg/kg)處理的動(dòng)物腫瘤樣品(圖12B(ii))，與賦形劑處理的對(duì)照(圖12B(i))相比，顯示出凋亡細(xì)胞死亡增加的明顯證據(jù)。為進(jìn)一步研究Dp44mT誘發(fā)的凋亡途徑，將培養(yǎng)的M109細(xì)胞用Dp44mT培育24小時(shí)，使用Annexin V-FITC和PI染色分別分析其凋亡和死亡。用Dp44mT處理后，在凋亡和死亡的細(xì)胞百分比上存在著劑量依賴(lài)型提高(圖13A)。將細(xì)胞暴露在1μM的Dp44mT下會(huì)造成凋亡和死亡細(xì)胞的顯著(p＜0.05)增加。該增加在Dp44mT的濃度為100μM時(shí)達(dá)到頂峰，此時(shí)產(chǎn)生由40±7％的凋亡細(xì)胞和27±3％的死亡細(xì)胞組成的群(圖13A)。在與250μM的Dp44mT培育后，凋亡細(xì)胞數(shù)量減少至20±2％，死亡細(xì)胞群增加至42±6％，表明劑量依賴(lài)型細(xì)胞毒性。
由Dp44mT(1μM)誘發(fā)凋亡也是時(shí)間依賴(lài)型的(圖13B)。用1μM的Dp44mT培育12小時(shí)后，檢測(cè)到凋亡細(xì)胞(12±2％)的顯著(p＜0.001)增加。因此，1μM Dp44mT顯著促進(jìn)了59Fe的釋放(圖11A，C)，抑制了59Fe的吸收(圖11B，D)，并誘發(fā)了凋亡細(xì)胞的死亡(圖13B)。
實(shí)施例10b—與Dp44mT培育后M109細(xì)胞中胱冬酶-3，8和9的蛋白水平和活性一般方法學(xué)抗體兔抗活性胱冬酶-3抗體、兔抗活性胱冬酶-8抗體和Annexin V熒光素異硫氰酸鹽購(gòu)自BD PharMingen(San Diego，CA，USA)?？?全細(xì)胞色素c MoAb購(gòu)自R&D Systems(Minneapolis，MN，USA)。兔抗活性胱冬酶-9抗體、小鼠抗-Bcl-2和小鼠抗-Bax抗體購(gòu)自Santa Cruz(SantaCruz，CA，USA)。小鼠抗鼠β-肌動(dòng)蛋白抗體、辣根過(guò)氧化物酶共軛的抗兔和抗鼠IgG購(gòu)自Sigma Chemical(St.Louis，MO，USA)。
胱冬酶活化和活性分析培養(yǎng)的M109細(xì)胞用或不用Dp44mT(1μM)在37℃處理0-48小時(shí)。將細(xì)胞溶解27，胱冬酶活性用BD ApolertTM胱冬酶分析板(BDBiosciences，San Diego，CA，USA)測(cè)定。細(xì)胞可滲透的pancaspase-3、-8和-9抑制因子(BD Biosciences)用作抑制對(duì)照。
為確定胱冬酶活化在M109細(xì)胞中的Dp44mT誘發(fā)的凋亡中的作用，測(cè)定了活性胱冬酶-3，8和9的蛋白水平及其酶活性(圖14C，D)。用Dp44mT(1μM)的2小時(shí)的短時(shí)間培育將胱冬酶-3和9的蛋白水平分別提高至對(duì)照的168和171％，而胱冬酶8沒(méi)有提高。
M109細(xì)胞與Dp44mT(1μM)培育6小時(shí)會(huì)明顯地將胱冬酶-3提高至對(duì)照的400％，而胱冬酶9和8的提高沒(méi)有這么明顯，分別提高至對(duì)照的280％和150％(圖14A，B)。用Dp44mT培育12小時(shí)將胱冬酶8的蛋白水平提高至對(duì)照的400％，而胱冬酶-3和9的蛋白水平與培育6小時(shí)時(shí)的基本相同(即，分別為對(duì)照的380％和280％)。以Dp44mT培育24小時(shí)將所有胱冬酶的蛋白水平提高至對(duì)照細(xì)胞的大約4倍，而48小時(shí)后，胱冬酶-3，8和9的水平是對(duì)照細(xì)胞的5.5倍、3.4倍和超過(guò)10倍(圖14A，B)。
胱冬酶-3的活性在6小時(shí)后提高最顯著，這以時(shí)間依賴(lài)型的方式出現(xiàn)，48小時(shí)后為對(duì)照的29倍(圖14C)。胱冬酶-8和9的活性用Dp44mT培育12小時(shí)后提高的程度低的多，分別是對(duì)照的299％和354％(圖14C)。后述酶的活性在24小時(shí)后穩(wěn)定在對(duì)照的大約400-600％(圖14C)。每一胱冬酶的膜可滲透的抑制因子當(dāng)與Dp44Mt(1μM)培育后逆轉(zhuǎn)其活性，表明觀(guān)察到的活性的特異性(圖14D)。
這些結(jié)果表明Dp44mT在2小時(shí)內(nèi)提高了胱冬酶-3和9的蛋白水平，而胱冬酶-8的蛋白水平即使在4小時(shí)或6小時(shí)后也只是略微地提高(圖14A，B)。在胱冬酶-3中觀(guān)察到酶活性的最顯著增加，與對(duì)照相比，其在與Dp44mT培育48小時(shí)后提高了300倍(圖14C)。
實(shí)施例10c—與Dp44mT培育后全細(xì)胞色素c從線(xiàn)粒體進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)的釋放由于全細(xì)胞色素c從線(xiàn)粒體的釋放在凋亡誘發(fā)中的重要性8，進(jìn)一步研究了Dp44mT對(duì)該過(guò)程的影響(圖15A)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備細(xì)胞溶質(zhì)和線(xiàn)粒體部分，進(jìn)行蛋白印跡試驗(yàn)27。對(duì)照M109細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)部分中具有很少的全細(xì)胞色素c表達(dá)(即在0小時(shí)時(shí))，而在該時(shí)間在線(xiàn)粒體中發(fā)現(xiàn)了最大數(shù)量的全細(xì)胞色素c(圖15A)。然而，暴露在Dp44Mt(1μM)2小時(shí)之后，在M109細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)部分中發(fā)現(xiàn)了全細(xì)胞色素c，而且全細(xì)胞色素c的線(xiàn)粒體水平同時(shí)下降(圖15A)。全細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞溶質(zhì)在以Dp44mT培育4小時(shí)后達(dá)到穩(wěn)定，然后降低至在24和48小時(shí)時(shí)在對(duì)照細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的水平。細(xì)胞溶質(zhì)的全細(xì)胞色素c的提高與線(xiàn)粒體的損失相關(guān)聯(lián)(圖15A)。在24和48小時(shí)后全細(xì)胞色素c從細(xì)胞溶質(zhì)中近乎完全的消失可能是由于其從細(xì)胞中釋放或其發(fā)生降解28(圖15A)。
用Dp44mT僅培育2小時(shí)導(dǎo)致全細(xì)胞色素c從線(xiàn)粒體中的釋放(圖15A)，這發(fā)生在與胱冬酶-3、8和9的活化相同的時(shí)間或之前(圖14A-C)。盡管傾向于限制在一個(gè)特定的行為機(jī)理，該觀(guān)察結(jié)果與Dp44mT誘導(dǎo)凋亡的線(xiàn)粒體途徑和與至少部分的胱冬酶明顯的活化數(shù)量相一致。
實(shí)施例10d-由Dp44mT培育后M109細(xì)胞中Bcl-2和Bax的表達(dá)考慮到Bcl-2和Bax在凋亡的線(xiàn)粒體途徑中的作用和其在全細(xì)胞色素c釋放中的作用8，11，12，分析了Dp44mT(1μM)對(duì)這些分子的蛋白水平的影響(圖15B)。由Dp44mT(1μM)培育后，抗凋亡分子Bcl-2作為時(shí)間的函數(shù)逐漸降低，在2和48小時(shí)的培育后，分別降低至0點(diǎn)時(shí)的69％和37％(圖15B)。相反地，Bax表達(dá)僅在以Dp44mT培育48小時(shí)后明顯地提高，達(dá)到0點(diǎn)時(shí)的500％(圖15B)。
在2小時(shí)內(nèi)觀(guān)察到的全細(xì)胞色素c釋放(圖15A)與線(xiàn)粒體的Bcl-2表達(dá)的降低一致(圖15B)，這關(guān)系到防止全細(xì)胞色素c從線(xiàn)粒體中的釋放8。然而，在全細(xì)胞色素c釋放和胱冬酶活化8中發(fā)揮作用的Bax表達(dá)的顯著提高僅在48小時(shí)后觀(guān)察到(圖15B)8。Bcl-2和Bax之間的失調(diào)可能己造成在其它條件下發(fā)現(xiàn)的線(xiàn)粒體的全細(xì)胞色素c釋放8?？紤]到全細(xì)胞色素c從線(xiàn)粒體中的流出，以前的研究己表明氧化應(yīng)激是其釋放、Bcl-2的向下調(diào)節(jié)和凋亡前蛋白(如Bax)的向上調(diào)節(jié)、以及胱冬酶的活化的潛在的誘發(fā)劑27。
實(shí)施例10e—用Dp44mT培育后細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的增加細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)(ROS)分析使用細(xì)胞可滲透的染料2’，7’-二氯熒光素-二乙酸酯(DCF-DA)(Sigma)來(lái)分析細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。DCF-DA很容易地?cái)U(kuò)散到細(xì)胞中，在被O2-、H2O2或OH-氧化后發(fā)出很高的熒光。細(xì)胞熒光素強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS的水平直接成比例29。M109細(xì)胞(1×105細(xì)胞/孔)用或不用1μMDp44mT培育0-48小時(shí)，或用50μM H2O2(正對(duì)照)在37℃培育10分鐘。然后將細(xì)胞以DCF-DA(5μM)在37℃培育20分鐘，洗滌兩次，然后從培養(yǎng)板中分離出。使用流式細(xì)胞分析測(cè)量細(xì)胞中氧化的DCF的熒光素29。
為測(cè)試全細(xì)胞色素c從線(xiàn)粒體的釋放的誘發(fā)(圖15A)和Bcl-2/Bax表達(dá)的失調(diào)是否是由于ROS的存在，通過(guò)流式細(xì)胞分析使用DCFH-DA探針測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的ROS，DCFH-DA被O2-、H2O2或OH-氧化后發(fā)出熒光。M109細(xì)胞與Dp44mT(1μM)培育作為時(shí)間函數(shù)提高了氧化探針的水平。2小時(shí)后，與0點(diǎn)時(shí)相比，發(fā)現(xiàn)氧化的DCFH-DAD熒光增加了25±10％，其在48小時(shí)后增加了486±96％(圖15C)。作為比較，H2O2(50μM)由正對(duì)照培育10分鐘時(shí)熒光增加至0點(diǎn)時(shí)的1312±46％(圖15C)。
在該研究中，在用Dp44mT培育2小時(shí)后探測(cè)到ROS的增加(圖15C)，這與全細(xì)胞色素c的釋放一致(圖15A)。這些觀(guān)察結(jié)果與ROS在誘發(fā)全細(xì)胞色素c釋放的作用一致，然而也不能排除其它機(jī)理。
參考文獻(xiàn)1.Blatt J，Stitely S.Cancer Res.1978；47；1749-1750；2.Chaston TB，Lovejoy DB，Watts RN，Richardson DR.Clin Cancer Res.2003；9402-414.
3.Richardson，D.R.&Bernhardt，P.(1999)J.Biol.Inorg.Chem.，4，266-273.
4.Salnikow，K.，Su，W.，Blagosklonny，M.B.and Costa，M.(2000).Cancer Res.60，3375-3378.
5.Kurdistani，S.K.，Arizti，P.，Reimer，C.L.，Sugrue，M.M.，Aaronson，S.A.，and Lee，S.W.(1998).Cancer Res.58，4439-4444.
6.Bandyopadhyay S，Pai SK，Gross SC，Hirota S，Hosobe S，Miura K，Saito K，Commes T，Hayashi S，Watabe M，Watabe K.Cancer Res.2003；63.1731-6.
7.Shimono，A.，Okuda，T.，Kondho H.(1999).Mech Devel.83，39-52.
8.Lim MLR，Lum M-G，Hansen TM，Roucou X，Nagley P.J Biomed Sci.2002；9488-506.
9.Cohen GM.Biochem J.1997；3261-16
10.Budihardjo I，Oliver H，Lutter M，Luo X，Wang X.Annu Rev Cell DevBiol.1999；15269-290.
11.Kluck RM，Bossy-Wetzel E，Green DR，Newmeyer DD.Science.1997；2751132-1136.
12.Jurgensmeier JM，Xie Z，Deveraux Q，Ellerby L，Bredesen D，Reed JC.Proc Natl Acad Sci USA.1998；954997-5002.
13.Bacchi，A.，Carcelli，M.，Costa，M.，Pelagatti，P.，Pelizzi，C.&Pellizzi，G.(1996).J.Chem.Soc.Dalton Trans.，22，4239-4244.
14.Johnson，D.K，Murphy，T.B，Rose NJ，Goodwin WH，Pichart L.InorgActa.1982；67159-162.
15.Broto，P.，Moreau，G.&Vandycke，C.(1984).Eur.J.Med.Chem.Chim.Theor.，19，71-78.
16.Ghose，A.K.&Crippen，G.M.(1987).J.Chem.Inf，Comput.Sci.，27，21-35.
17.Viswanadhan，V.N.，Chose，A.K.，Revankar，G.R.&Robins，R.K.(1987)J.Chem.Inf.Comput.Sci.，29，163-172.
18.Richardson，D.R.，Tran，E.&Ponka，P.(1995).Blood，86，4295-4306.
19.Selig RA，White L，Gramacho C，Sterlinglevis K，F(xiàn)raser IW，Naidoo D.Cancer Res.1998；58473-478.
20.Finch RA，Liu M-C，Grill SP，et al.Biochem Pharmacol.2000；59983-991.
21.Müllner，E.W.，Neupert，.&Kühn，L.C.(1989).Cell，58，373-382.
22.Abboud，S.&Haile，D.J.(2000).J.Biol，Chem.275，199906-19912.
23.Darnell，G.&Richardson，D.R.(1999).J.Blood，94，78-792.
24.Becher，E.&Richardson，D.R.(1999).J.Lab.Clin.Med.，134，510-521.
25.Vermes I，Haanen C，Steffens-Nakken H，Reutelingsperger C.JImmunol Methods.1995；18439-51.
26.Gavrieli Y，Sherman Y，Ben-Sasson SA.J Cell Biol，1992；119493-501.
27.Yuan J，Murrell GA，Trichett A，Wang MX.Biochim Biophys Acta.2003；164135-41.
28.Jemmerson R，Laplante B，Treerul A.Cell Death Differ.200；9538-548.
29.Wang M，Wei AQ，Yuan J，Trichett A，Knoops B，Murrell GAC.FEBSLett.2002；532359-362.
30.El-Deiry，W.S.，Tokino，Tl，Velculescu，V.E.，Levy，D.B.，Parsons，R.，Trent，J.M.，Lin，D.，Mercer，W.E.，Kinzler，K.W.，&Vogelstein，B.(1993).Cell，75，817-825.
權(quán)利要求
1.一種具有通式1的化合物 通式1其中，E是O或S；A是 其中，Z’、Y’、X’和W’獨(dú)立地選自CR4、NR8、S、O，其中A中的雜原子的總數(shù)為1、2或3，m是0或1，B是 其中，Z、Y、X、W和V獨(dú)立地選自CR4、NR8、S、O；其中B中的雜原子的總數(shù)為0、1、2或3；q是0或1；每一R4獨(dú)立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基；每一R8獨(dú)立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、芐基、氨基甲酸芐酯；R’為氫、或不阻礙金屬離子螯合的基團(tuán)；-G為NR2R3或CR2R3R5，其中C和R5之間的鍵可以是單鍵、雙鍵或三鍵；其中當(dāng)C和R5之間的鍵是雙鍵時(shí)，R2和R3中的一個(gè)不存在，當(dāng)C和R5之間的鍵是三鍵時(shí)，R2和R3都不存在；R5選自氫、鹵素、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基、非必要取代的氨基、非必要取代的雜芳基、非必要取代的雙環(huán)基或非必要取代的芳基；R2和R3可以相同或不同，分別選自氫、鹵素、非必要取代的烷基、非必要取代的烯基、非必要取代的炔基、非必要取代的氨基、非必要取代的雜芳基、非必要取代的雙環(huán)基或非必要取代的芳基；或-G是非必要取代的雜芳基、非必要取代的雙環(huán)基、非必要取代的芳基、非必要取代的烷基；非必要取代的環(huán)烷基、或非必要取代的雜環(huán)烷基；其限制條件是(i)當(dāng)E是O、而A和B每一個(gè)是 則-G不是-NH2、-CH2Cl、 且(ii)當(dāng)E是S、而A和B每一個(gè)是則-G不是-NH2、 或者
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R’是氫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中A和B相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中A和B不同。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中A選自非必要取代的吡啶基、非必要取代的嘧啶基、非必要取代的三嗪基、非必要取代的噁唑基、或非必要取代的吡咯基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中B選自非必要取代的5-或6-元芳環(huán)或非必要取代的5-或6-元雜芳環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其中B選自非必要取代的苯基、非必要取代的萘基、非必要取代的吡啶基、非必要取代的嘧啶基、非必要取代的三嗪基、非必要取代的噁唑基、非必要取代的吡咯基或非必要取代的呋喃基。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的化合物，其中每一所述的非必要的取代基獨(dú)立地選自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、鹵素、氨基、羥基、O-烷基、S-烷基、硝基、氰基、C(O)-烷基、C(O)-O-烷基、C(O)NH(烷基)、或C(O)N(烷基)2。
9.一種具有通式2的化合物 通式2其中A選自 和 其中每一R4獨(dú)立地選自鹵素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，n是0、1、2、3或4；和其中B、E和G如通式1所定義，包括限制條件(i)和(ii)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的化合物，其中A為 其中R4和n如權(quán)利要求9中所定義。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中B選自 和 其中每一R4獨(dú)立地選自鹵素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，p是0-7的整數(shù)，和其中A、E和G如通式1所定義，包括限制條件(i)和(ii)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的化合物，其中p為0、1、2、3或4。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的化合物，其中B是 其中R4如權(quán)利要求11中所定義，p為0、1、2、3或4。
14.一種具有通式3的化合物 通式3其中E是O或S；n是0、1、2、3或4，p是0、1、2、3或4，和每一R4獨(dú)立地選自鹵素、烷基、烯基、非必要取代的氨基、羥基、-O-烷基、-S-烷基、-C(O)-烷基、-C(O)-烯基、-C(O)-O-烷基、硝基或氰基，以及-G如權(quán)利要求1中的通式1所定義，包括限制條件(i)和(ii)。
15.一種具有通式4的化合物 通式4其中E是O或S；和-G如權(quán)利要求1中的通式1所定義，包括限制條件(i)和(ii)。
16.一種選自下列的化合物 和
17.一種選自下列的化合物 和
18.一種藥物組合物，其包含藥學(xué)上可以接受的稀釋劑或載體和至少一種根據(jù)權(quán)利要求1、9、14、15、16和17中的所述的任一化合物，或其金屬離子絡(luò)合物。
19.一種藥物組合物，其包含藥學(xué)上可以接受的稀釋劑或載體和至少一種根據(jù)權(quán)利要求1、9、14、15、16和17中所述的任一化合物的金屬離子絡(luò)合物，其中所述金屬離子選自鐵(II)、鐵(III)、銅(II)、鋅(II)、鈀(II)、鉑(II)、或鎵(III)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述金屬離子選自鐵(II)或鐵(III)。
21.一種在哺乳動(dòng)物中鐵螯合治療的方法，其包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物，或包含至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物。
22.一種治療哺乳動(dòng)物鐵過(guò)載失調(diào)的方法，其包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物，或包含至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述鐵過(guò)載失調(diào)是β-地中海貧血。
24.一種抑制細(xì)胞增殖的方法，其包括使細(xì)胞與有效量的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物、或其金屬離子絡(luò)合物接觸，或與包含至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物、或其金屬離子絡(luò)合物以及藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥、或賦形劑的藥物組合物接觸。
25.一種抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖的方法，其包括使哺乳動(dòng)物的細(xì)胞與有效量的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物接觸，或與包含至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物以及藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥、或賦形劑的藥物組合物接觸。
26.一種治療哺乳動(dòng)物增殖性失調(diào)的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物，或施用含有至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述增殖性失調(diào)選自血管形成依賴(lài)性疾病、細(xì)胞增殖性疾病或癌癥。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述癌癥是惡性腫瘤或良性腫瘤。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述癌癥是固體腫瘤或非固體腫瘤。
30.一種在細(xì)胞中誘發(fā)凋亡的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物接觸，或與包含至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物接觸。
31.一種抑制細(xì)胞增殖和在細(xì)胞中誘發(fā)凋亡的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物接觸，或與包含至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物接觸。
32.一種在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)凋亡的方法，所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物，或施用含有至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物。
33.一種在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)凋亡和抑制細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物，或施用含有至少一種帶有或不帶有限制條件(i)和(ii)的具有通式1、2、3或4的化合物或其金屬離子絡(luò)合物和藥學(xué)上可以接受的稀釋劑、輔藥或賦形劑的藥物組合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求24-33任一所述的方法，其中所述金屬離子是選自鐵、銅、鋅、鈀、鉑或鎵的過(guò)渡金屬離子。
35.根據(jù)權(quán)利要求24-33任一所述的方法，其中金屬離子選自鐵(II)或鐵(III)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠螯合金屬離子的化合物。特別地，本發(fā)明涉及能夠螯合包括鐵離子在內(nèi)的金屬離子的(硫代)縮氨基脲化合物和(硫代)腙化合物。本發(fā)明還公開(kāi)了該化合物和/或其金屬離子絡(luò)合物的醫(yī)療用途，包括治療與細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K31/444GK1764644SQ200480008002
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2004年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月5日
發(fā)明者D·R·里查森, D·B·洛夫喬伊 申請(qǐng)人:新南創(chuàng)新私人有限公司