專利名稱：診斷和治療的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及對受試者或來自所述受試者的生物樣品檢測異常細(xì)胞、更特別是編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法，和用于這個目的的試劑。異常細(xì)胞或異常細(xì)胞組的存在提供了發(fā)生疾病或病癥的特定疾病或病癥或傾向的指征。更具體地，本發(fā)明涉及通過檢測胞核外胞核分子，特別是La的存在，或者胞核外胞核分子水平的相對增加來檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供通過篩選細(xì)胞或細(xì)胞組中胞核外胞核分子水平的增量調(diào)節(jié)而診斷或監(jiān)測受試者或來自所述受試者的生物樣品中以異常的、不期望的或者另外不適當(dāng)?shù)募?xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征的癥狀的方法。本發(fā)明提供用于檢測這些分子的診斷試劑。這樣的診斷試劑包括免疫活性分子，例如抗體。
本發(fā)明還涉及體外或體內(nèi)治療性定向的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供與受試者分子上存在的表位特異性相互作用的抗體，特別是單克隆抗體。定向編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的能力是有用的，特別是在以編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞存在為特征的診斷、免疫治療和免疫預(yù)防處理的范圍內(nèi)。
背景技術(shù)：
作者在該說明書中指的公開物書目詳述按字母順序收錄在說明書最后。
本說明書中對現(xiàn)有技術(shù)的參考不是并且不應(yīng)該認(rèn)為是澳大利亞公知常識現(xiàn)有技術(shù)形式部分的知識或任何形式的提示。
以不受控制的方式生長的惡性腫瘤或癌癥侵害正常組織，并且經(jīng)常在遠(yuǎn)離原發(fā)組織的地方轉(zhuǎn)移并生長。一般情況下，癌癥從經(jīng)歷稱作惡性轉(zhuǎn)化的沒有完全確知其過程的一個或只有幾個正常細(xì)胞產(chǎn)生。癌癥幾乎能從身體內(nèi)任何組織產(chǎn)生。從上皮細(xì)胞產(chǎn)生的稱作癌的那些是最常見的癌癥種類。肉瘤是從象成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和脂肪細(xì)胞這樣的細(xì)胞產(chǎn)生的間質(zhì)組織的惡性腫瘤。淋巴樣組織的實體惡性腫瘤稱作淋巴組織瘤，淋巴細(xì)胞和其他造血細(xì)胞的骨髓和產(chǎn)生血液的惡性腫瘤稱作白血病。
在工業(yè)化國家，癌癥是死亡的三大致因之一。由于傳染病的治療和心血管疾病的防治不斷提高，并且估計壽命延長，癌癥可能變成這些國家最常見的致命疾病。因此，需要成功地治療癌癥，去除或破壞所有的惡性細(xì)胞，而不使患者死亡。實現(xiàn)這個目的的一條理想途徑是誘導(dǎo)抗腫瘤的免疫應(yīng)答，區(qū)別對待腫瘤細(xì)胞和它們相應(yīng)的正常細(xì)胞。然而，超過一個世紀(jì)的治療癌癥的免疫方法的嘗試都是未能證實的。
因此，目前治療癌癥的方法繼續(xù)使用外科切除(如果可能的話)，如果需要，接著進(jìn)行放療和/或化療這一長期使用的方法。這種十分不成熟的治療形式的成功率變動性十分大，并且通常因為腫瘤進(jìn)一步發(fā)展和轉(zhuǎn)移而使成功率大大降低。此外，這些治療與嚴(yán)重的副作用有關(guān)，包括損形和手術(shù)形成的瘢痕(例如乳房切除術(shù)或截肢術(shù))，嚴(yán)重惡心和嘔吐，化學(xué)療法，并且最明顯的，對正常組織的損傷，例如對發(fā)囊，內(nèi)臟和骨髓，這是作為大多數(shù)癌癥治療部分的有毒藥物的相對非特異性定向機理結(jié)果引發(fā)的。
此外，大多數(shù)抗癌治療包括細(xì)胞毒性化療藥物、信號傳導(dǎo)抑制劑、放療、單克隆抗體和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞通過編程性細(xì)胞死亡殺死癌癥。雖然腫瘤可以包含一定比例的編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞，甚至抗癌癥治療之前發(fā)生一定面積的壞死，響應(yīng)抗癌癥治療，腫瘤中提前出現(xiàn)增加的編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞數(shù)目和更大面積的壞死。然而，當(dāng)細(xì)胞毒性化學(xué)治療物質(zhì)用于治療晚期癌癥時，經(jīng)常難以評價細(xì)胞殺死的程度以及腫瘤對第一次治療的響應(yīng)。照慣例，在臨床和放射評價腫瘤響應(yīng)之前患者至少接受了三周期化療。通常，少數(shù)晚期癌癥患者對細(xì)胞毒性藥物有反應(yīng)，這樣患者會經(jīng)歷沒有獲得益處的治療副作用。因此，對于在預(yù)計有治療反應(yīng)的第一周期治療之后能快速、方便和可靠地檢測腫瘤殺傷(其經(jīng)常接著預(yù)計存活率)的診斷方法有著沒有滿足的醫(yī)療需要。例如，對手術(shù)前接受化療放療的食管腺癌患者使用氟代-脫氧葡萄糖(FDG-PET)正電子發(fā)射X線體層照相術(shù)，以＞90％靈敏性和特異性區(qū)別治療響應(yīng)者和不響應(yīng)者，易于預(yù)測那些人隨后經(jīng)歷其腫瘤的有效切除術(shù)。得知腫瘤是否早期響應(yīng)會使大多數(shù)患者不用進(jìn)行無效和可能有毒性的治療。然后，對不響應(yīng)患者進(jìn)行第二周期治療或所研究的藥物的臨床試驗。
因此，對于開發(fā)以定向方式診斷和治療癌癥的新的方法有著迫切和不斷的需求。迄今為止，有效定向殺傷惡性細(xì)胞的想法還沒有實現(xiàn)。
在實施本發(fā)明的工作中，令人驚奇地測得，使用相互作用分子，例如免疫活性分子，事實上能可靠地和可檢測地篩選胞核分子，并且進(jìn)一步提供體外和體內(nèi)以高度特異性方式精確而可靠地檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法。特別地，對腫瘤和轉(zhuǎn)移的診斷和監(jiān)測經(jīng)常以一定比例編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的存在為特征，現(xiàn)在得以推進(jìn)。進(jìn)一步地，現(xiàn)在確定使用本發(fā)明的相互作用分子有利于在高度定向和特異性進(jìn)行抗腫瘤治療。
發(fā)明概述本發(fā)明的一方面涉及對受試者或來自所述受試者的生物樣品檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法，所述方法包括用針對胞核分子或者其抗原部分的相互作用分子接觸所述受試者或來自所述受試者生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物并且篩選相互作用分子-胞核分子復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的指征。
本發(fā)明的另一方面涉及對受試者或來自所述受試者的生物樣品檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法，所述方法包括用針對胞核分子或者其抗原部分的免疫活性分子接觸所述受試者或來自所述受試者生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物并且篩選免疫活性分子-胞核分子復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的指征。
本發(fā)明的另一方面提供對受試者或來自所述受試者的生物樣品檢測編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括用針對La或者其抗原部分的免疫活性分子接觸所述受試者或來自所述受試者生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物并且篩選免疫活性分子-La復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞的指征。
本發(fā)明的另一方面提供對受試者或來自所述受試者的生物樣品檢測編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括用針對La或者其抗原部分的抗體接觸所述受試者或來自所述受試者生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物并且篩選抗體-La復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞的指征。
本發(fā)明的另一方面涉及對受試者診斷或監(jiān)測以異常的不期望的或者另外不適當(dāng)?shù)募?xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征的癥狀的方法，所述方法包括用針對所述胞核分子或者其抗原決定簇或表位的胞核分子-結(jié)合有效量的相互作用分子接觸所述受試者或來自所述受試者生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物，并且定性或定量測定胞核分子-免疫活性分子復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的指征。
本發(fā)明的另一方面涉及對受試者診斷或監(jiān)測腫瘤病癥的方法，所述方法包括用針對所述La或者其抗原決定簇或表位的La-結(jié)合有效量的免疫活性分子接觸所述受試者或來自所述受試者生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物，并且定性或定量測定La-免疫活性分子復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的指征，并且所述細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡是所述腫瘤病癥的指征。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及檢測生物樣品中編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的分析方法，所述方法包括下面的步驟-(1)使針對胞核分子或者其抗原決定簇的相互作用分子與懷疑含有所述胞核分子的生物樣品接觸；和(2)對步驟(1)中形成的復(fù)合體進(jìn)行信號檢測步驟，其中檢測非胞核相互作用分子-胞核分子復(fù)合體形成是編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的指征。
本發(fā)明的另一方面涉及對人檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法，所述方法包括向所述患者引入用報道分子標(biāo)記的針對胞核分子或者其抗原決定簇的相互作用分子，使標(biāo)記的相互作用分子通過循環(huán)系統(tǒng)或者向所述患者引入針對循環(huán)系統(tǒng)選擇部分的相互作用分子傳播，然后對所述患者進(jìn)行報道分子檢測手段檢測以確定相互作用分子位置。
本發(fā)明的另一方面提供對樣品檢測La或其片段、變體或衍生物的方法，包括使樣品接觸抗體或其片段或衍生物并且檢測包括所述抗體和La或其片段、變體或衍生物的復(fù)合體的形成，其中La非胞核定位是編程性細(xì)胞死亡的指征。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及針對胞核分子的相互作用分子用于制備檢測來自患者的生物樣品中編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的定量或半定量診斷試劑盒的用途，所述試劑盒可以帶有使用說明并且可以是自動或半自動的或者是與自動機械或軟件相匹配的形式。
本發(fā)明的另一方面涉及對受試者治療性和/或預(yù)防性治療以細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征的病癥的方法，所述方法包括在足以治療所述病癥的時間和條件下，對所述受試者施用有效量的針對胞核分子或其抗原部分的相互作用分子，所述相互作用分子與效應(yīng)子結(jié)構(gòu)連接、鍵合或締合。
本發(fā)明更特別提供對受試者治療性和/或預(yù)防性治療腫瘤病癥的方法，所述方法包括在足以抑制、減小或另外減量調(diào)節(jié)腫瘤生長的時間和條件下，對所述受試者施用有效量的針對La或其抗原部分的免疫活性分子，所述免疫活性分子與效應(yīng)子結(jié)構(gòu)連接、鍵合或締合。
另一方面提供對患者治療性治療轉(zhuǎn)移癌的方法，所述方法包括在足以抑制、減小或另外減量調(diào)節(jié)所述轉(zhuǎn)移癌生長的時間和條件下，對所述受試者施用有效量的針對La或其抗原部分的免疫活性分子，所述免疫活性分子與效應(yīng)子結(jié)構(gòu)連接、鍵合或締合。
本發(fā)明的另一方面涉及與效應(yīng)子結(jié)構(gòu)偶聯(lián)的抗-胞核分子相互作用分子用于制備治療患者病癥的藥物的用途，所述病癥以細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征，其中所述效應(yīng)子結(jié)構(gòu)治療所述病癥。
另一方面，本發(fā)明涉及含有上面定義的調(diào)節(jié)劑和一種或幾種藥學(xué)可接受載體和/或稀釋劑的藥物組合物。所述調(diào)節(jié)劑稱作活性成分。
本發(fā)明的另一方面涉及在本發(fā)明的方法中使用時的上面定義的藥劑。
附圖簡述

圖1是在將細(xì)胞從組織培養(yǎng)瓶中刮出用于流式細(xì)胞儀分析之前有或沒有血清培養(yǎng)24小時的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP的圖解表示。細(xì)胞用碘化丙錠(PI)染色，并且(A)膜聯(lián)蛋白V-FITC，(B)正常人血清(NHS)或親和純化的人La自身抗體(hLa)和小鼠抗-人IgG-FITC，(C)鼠同種型對照物或鼠抗-hLa mAb克隆SW3和抗-小鼠IgG-FITC，(D)鼠同種型對照物或鼠抗-hLa mAb克隆3B9和抗-小鼠IgG-FITC。直方圖顯示分選(gated)作為PI中間體的細(xì)胞(即晚編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞)。藍(lán)色線，NHS或鼠同種型對照物；黑色線，對血清中生長的LNCaP細(xì)胞染色的膜聯(lián)蛋白V或抗-La；紅色線，對沒有血清生長的LNCaP細(xì)胞染色的膜聯(lián)蛋白V或抗-La。
圖2是抗-La功能的圖解表示。一旦抗-La抗體診斷化療誘導(dǎo)的癌細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡(圖2A)，它們可以接著遞送癌治療的其他藥征，其與死亡細(xì)胞附近保留的那些存活癌細(xì)胞有作用的非交叉抗性機理(圖2B)。圖2A所示的是第一次化療之后，抗-La抗體(黃色)檢測編程性細(xì)胞死亡癌細(xì)胞(暗灰色)，其接近存活癌細(xì)胞生長(淺灰色)。圖2B所示的是抗-La抗體(紫色)，它帶有非交叉抗性抗癌治療，遞送對于保留活癌細(xì)胞的殺傷(bystander killing)(紅色)。
圖3是描述編程性細(xì)胞死亡體體外逐漸形成并且結(jié)合抗-La抗體的圖解表示。使用0.5μM星形孢菌素(STS)對Jurkat人T細(xì)胞白血病細(xì)胞系誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。用FITC標(biāo)記的3B9和胞核非滲透性(impermeant)核酸結(jié)合染料碘化丙錠(PI)對細(xì)胞染色。箭頭表示編程性細(xì)胞死亡體隨著時間逐漸形成。象限游標(biāo)設(shè)置為用同種型對照物Sal5＜3％染色。
圖4是描述與編程性細(xì)胞死亡Jurkat細(xì)胞結(jié)合的抗-La抗體與漸增膜滲透性相關(guān)的圖解表示。使用0.5μM STS對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。用FITC-標(biāo)記的Sal5(同種型對照物)或FITC-標(biāo)記的3B9(抗-La抗體)或FITC-標(biāo)記的抗-β-微管蛋白mAb(微管蛋白)和PI對細(xì)胞染色。
圖5是與編程性細(xì)胞死亡Jurkat細(xì)胞結(jié)合的抗-La抗體的時間過程的圖解表示。使用0.5μM STS對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。用FITC-標(biāo)記的Sal5(同種型對照物)或FITC-標(biāo)記的3B9(抗-La抗體)或FITC-標(biāo)記的抗-β-微管蛋白mAb(微管蛋白)臺盼藍(lán)對細(xì)胞染色?？v軸所示的是對用每一種指示劑染色呈陽性的各個時間點總的細(xì)胞百分比。數(shù)據(jù)以單線作圖(A)或者用Prism v3.0使用最小方差方法作成曲線(B)。
圖6是描述編程性細(xì)胞死亡體和與編程性細(xì)胞死亡體結(jié)合的抗-La抗體體外是穩(wěn)定的之圖解表示。使用0.5μM STS對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。用FITC-標(biāo)記的3B9和碘化丙錠(PI)(上排)對細(xì)胞染色。分別使用前向散點圖(FSC)和側(cè)面散點圖(SSC)(下排)證實編程性細(xì)胞死亡體的大小和內(nèi)部復(fù)雜性。
圖7是描述膜聯(lián)蛋白V，7AAD和抗-La抗體與編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞結(jié)合在體外編程性細(xì)胞死亡過程中與時間相關(guān)并且隨著時間改變的圖解表示。使用0.5μM STS對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。用FITC-標(biāo)記的人膜聯(lián)蛋白V(annV-FITC)，R-藻紅蛋白-標(biāo)記的3B9(PE-3B9)和7AAD對細(xì)胞染色。
圖8是描述體外編程性細(xì)胞死亡期間膜聯(lián)蛋白V，7AAD和抗-La抗體與編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的時間依賴性結(jié)合是相關(guān)的之圖解表示。使用0.5μM STS對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。用FITC-標(biāo)記的人膜聯(lián)蛋白V(annV-FITC)，R-藻紅蛋白-標(biāo)記的3B9(3B9)和7AAD對細(xì)胞染色。對R1-3區(qū)中的事件(event)(左手一組)分析大小(前向散點圖或FSC)和內(nèi)部復(fù)雜性(側(cè)面散點圖或SSC)(中間一組)并且用7AAD和3B9染色(右手一組)。
圖9包括描述抗-La抗體與壞死Jurkat細(xì)胞結(jié)合的圖像和圖解表示。通過在56℃下加熱1小時對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)壞死。A.用Alexa488-標(biāo)記的3B9(抗-La抗體)(綠色)和胞核非滲透性DNA-結(jié)合染料，7-氨基-放線菌素D(7AAD)(紅色)對細(xì)胞染色，或B.用Alexa488-標(biāo)記的3B9(抗-La抗體)(綠色)和R-藻紅蛋白-標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(紅色)對細(xì)胞染色，并且通過激光掃描同焦點顯微鏡顯像。C.用FITC-標(biāo)記的Sal5(同種型對照物)或FITC-標(biāo)記的3B9(抗-La抗體)和PI對細(xì)胞染色并且通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
圖10是描述抗-La抗體優(yōu)先與晚編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞和編程性細(xì)胞死亡體結(jié)合的圖解表示。使用0.5μM STS對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。用FITC-標(biāo)記的3B9和PI對細(xì)胞染色。編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)后20小時或48小時，對用PI差別染色(左手欄中的1和2)的3B9+亞群進(jìn)行分選用于散點特征分析。散點分析(右手分析)表明隨時間積累的3B9+PI中間體作用較小(根據(jù)前向散點圖[FSC]測定的較低大小)并且顆粒較小(根據(jù)前向散點圖[SSC]測定的減小的內(nèi)部復(fù)雜性)(下面右手組)。象限游標(biāo)設(shè)置在同種型對照物Sal5染色＜3％。
圖11是描述抗-La抗體結(jié)合是半胱天冬酶(caspase)3依賴性的并且與編程性細(xì)胞死亡體形成相關(guān)的圖解表示。用表達(dá)增強的單獨的綠色熒光蛋白質(zhì)(EGFP)或原半胱天冬酶3和EGFP的質(zhì)粒DNA載體瞬時轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。使用0.5μM STS對瞬時轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡，并且用FITC-標(biāo)記的3B9和7AAD對細(xì)胞染色。散點圖中顯示的細(xì)胞(左手圖)在綠色熒光上分選處理。接著，各個散射圖中象限1和2中的事件(左手圖)被分選處理用于散射特征分析。散射分析(右手組)表明3B9結(jié)合是半胱天冬酶3依賴性的，因此與編程性細(xì)胞死亡體形成有關(guān)，因為編程性細(xì)胞死亡體較小(根據(jù)前向散點圖[FSC]測定的較低大小)和較小顆粒(根據(jù)前向散點圖[SSC]測定的降低的內(nèi)部復(fù)雜性)(下面右手組)。象限游標(biāo)設(shè)置在同種型對照物Sal5染色＜3％。
圖12包括描述抗-La抗體結(jié)合是半胱天冬酶3依賴性的并且與編程性細(xì)胞死亡體形成相關(guān)的成像和圖解表示。用載體對照物(B)或表達(dá)原半胱天冬酶3(C和C′)的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。用1μMSTS處理24小時對MCF-7轉(zhuǎn)染子執(zhí)行編程性細(xì)胞死亡。A.對于流式細(xì)胞儀分析，用Alexa488-標(biāo)記的3B9和碘化丙錠(PI)對細(xì)胞染色。B，C和C′。對于熒光顯微鏡分析，用Alexa488-標(biāo)記的3B9(綠色)和胞核染料DAPI(藍(lán)色)對細(xì)胞染色。指明編程性細(xì)胞死亡體(箭頭)。
圖13是抗-La抗體死亡細(xì)胞胞質(zhì)載量的圖像。用0.5μM STS處理24小時對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。用胞核非永久性染料TOPRO3(藍(lán)色)，Alexa488-標(biāo)記的3B9或抗-La抗體，同種型對照物Sal5或抗-PARP mAb(綠色)和R-藻紅蛋白(PE)-標(biāo)記的人膜聯(lián)蛋白V(紅色)對細(xì)胞染色并且使用同焦點激光掃描顯微鏡觀察。A.Alexa488-標(biāo)記的3B9染色觀察到下面的A′.較高放大率；對于使用Sal5的抗-La抗體染色觀察到陰性同種型對照；C.抗-PARP染色。
圖14是描述抗其他胞核和核糖胞核抗原的其他單克隆抗體也結(jié)合編程性細(xì)胞死亡體的圖像。用0.5μM STS處理24小時對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。用Alexa488-標(biāo)記的抗-α-胞襯蛋白mAb(綠色)和7AAD(紅色)對細(xì)胞染色并且通過激光掃描同焦點顯微鏡觀察。
圖15是描述與編程性細(xì)胞死亡初期T細(xì)胞相比較，惡性Jurkat T細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡之后，La/SS-B表達(dá)增量調(diào)節(jié)的圖解表示。聚蔗糖-純化的外周血單核細(xì)胞(PBMC)在有10％胎牛血清的RPMI-1640中培養(yǎng)4天，然后在培養(yǎng)的最后24小時用1μM STS處理。類似地，在培養(yǎng)的最后24小時用1μM STS誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡之前用T細(xì)胞促細(xì)胞分裂劑conconavalin A(PBMC-ConA)10微克/毫升m將PBMC活化4天。用0.5μM STS處理24小時對Jurkat細(xì)胞(Jurkat)誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。象限游標(biāo)設(shè)置在同種型對照物Sal5染色＜3％。
圖16是描述抗其他胞核和核糖胞核抗原的其他單克隆抗體也結(jié)合編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的圖解表示。用0.5μM STS對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。用PI和各種FITC-標(biāo)記的mAb對細(xì)胞染色同種型對照物，Sal5，對于抗-La/SS-B克隆3B9(抗-La抗體)，抗-β-微管蛋白克隆TUB2.1 FITC偶聯(lián)物(Sigma F 2043)，增殖細(xì)胞胞核抗原(PCNA)克隆PC10(Oncogene Cat #NA03)，小鼠抗-α-胞襯蛋白(非紅色抗-血影蛋白)Chemicon MAB1622，抗-lamen B克隆101-B7(致癌基因cat#NA12)和抗-PARP克隆C2-10(致癌基因cat #AM30)。象限游標(biāo)設(shè)置在相應(yīng)同種型對照物抗體染色＜3％。
圖17是描述抗其他胞核和核糖胞核抗原的其他單克隆抗體也結(jié)合編程性細(xì)胞死亡體的圖解表示。用單獨表達(dá)EGFP或-原半胱天冬酶3和EGFP的質(zhì)粒DNA載體瞬時轉(zhuǎn)染EGFP MCF-7細(xì)胞。用0.5μM STS對瞬時轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡，并且用7AAD和FITC-標(biāo)記的同種型mAb，Sal5，和抗La/SS-B mAb(3B9)，核纖層蛋白B和增殖細(xì)胞胞核抗原(PCNA)對細(xì)胞染色。上面一組表示沒有轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞(分選為EGFP-陽性)。沒有轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞的外觀與用單獨表達(dá)EGFP的DNA載體轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞(沒有給出數(shù)據(jù))幾乎相同。
圖18是描述通過人抗-La自身抗體檢測編程性細(xì)胞死亡人細(xì)胞的圖解表示。通過用0.5μM STS使Jurkat細(xì)胞發(fā)生編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞用經(jīng)La-親和純化的人抗-La自身抗體(上面一組)或抗人La的鼠mAb 3B9(下面一組)染色。PI+細(xì)胞分選并且數(shù)據(jù)以編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)之后各個時間點的直方圖表示。陰性對照，人IgG(粗線)；人抗-hLa抗體和3B9(細(xì)線)。
圖19是描述另一種抗-人La/SS-B單克隆抗體也檢測編程性細(xì)胞死亡人細(xì)胞的圖解表示。對于Jurkat細(xì)胞，或者在體外培養(yǎng)中沒有處理(未處理)或者用0.5μM STS處理17小時誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡(處理)。細(xì)胞用PI和FITC-標(biāo)記的抗-鼠二抗或mAb克隆SW3或mAb克隆3B9染色。
圖20是描述抗-La抗體與來自嚙齒類物種的初期編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞結(jié)合的圖解表示。沒有補充(A，D)，或者加入1μM地塞米松(B，E)或0.5μM STS(C，F(xiàn))下，體外將鼠(A-C)或大鼠(D-F)胸腺細(xì)胞培養(yǎng)21-24小時。細(xì)胞用FITC-標(biāo)記的同種型mAb，Sal5(對照)或FITC-標(biāo)記的3B9(抗-La抗體)和碘化丙錠(PI)染色。
圖21是描述抗-La抗體與來自嚙齒類物種的編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞結(jié)合的圖解表示。鼠胸腺成淋巴細(xì)胞細(xì)胞系，EL-4(A-E)和大鼠前列腺癌細(xì)胞系，AT-3.1(F)與0.5μM STS(A，F(xiàn))，依托泊苷(B)或依托泊苷和環(huán)磷酰胺(C)，體外培養(yǎng)(A-C，F(xiàn))24小時，或者從沒有處理的(D)或者體內(nèi)用環(huán)磷酰胺和依托泊苷處理48小時誘導(dǎo)腫瘤編程性細(xì)胞死亡(E)的同源C57BL/6小鼠的皮下植入物回收EL-4腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞用FITC-標(biāo)記的同種型mAb，Sal5(對照)或者FITC-標(biāo)記的3B9(抗-La抗體)和碘化丙錠(PI)染色。
圖22是描述抗-La抗體與多種編程性細(xì)胞死亡人和猴子腫瘤細(xì)胞系結(jié)合的圖解表示。細(xì)胞系用0.5-1μM STS處理24小時，誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡A.Jurkat T細(xì)胞白血?。籅.U2OS骨肉瘤細(xì)胞；C.HeLa子宮頸癌細(xì)胞；D.MG63骨肉瘤細(xì)胞；E.COS-7猴子腎成纖維細(xì)胞。細(xì)胞用FITC-標(biāo)記的同種型mAb，Sal(對照)或者FITC-標(biāo)記的3B9(抗-La抗體)和碘化丙錠(PI)染色。
圖23是通過各種體外階段的編程性細(xì)胞死亡進(jìn)程的圖示描述。編程性細(xì)胞死亡刺激之后，編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞收縮并且片段化成膜結(jié)合部分，已知是編程性細(xì)胞死亡體，其隨著時間逐漸泄漏或再次壞死。最后，編程性細(xì)胞死亡體分解成寡核小體，進(jìn)而分解為自由DNA。
圖24是按慣例通過用膜聯(lián)蛋白V和胞核永久性染料例如7AAD染色定義的編程性細(xì)胞死亡階段的圖示描述。用0.5μM星形孢菌素處理16小時，對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡，并且用膜聯(lián)蛋白V(AV)和7-氨基-放線菌素D(7AAD)染色。1，活細(xì)胞(AV-，7AAD-)；2，早期編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞(AV+，7AAD-)；3，晚期編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞(AV+，7AAD+)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明是部分根據(jù)下面令人驚奇的發(fā)現(xiàn)提出的使用免疫活性分子對胞核外胞核分子表達(dá)進(jìn)行篩選，提供體外或體內(nèi)檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的存在的高度特異性和可靠的方法。這個發(fā)現(xiàn)特別重要，因為以前朝著篩選與編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞相關(guān)的抗原的試驗工作(從而鑒定抗原)都沒有鑒定胞核分子，特別是La，為候選抗原。確實，其他不相關(guān)的抗原，例如磷脂?；z氨酸已經(jīng)被反復(fù)鑒定了。令人遺憾的是，這些不相關(guān)的分子表現(xiàn)出顯著缺陷，特別是由于非編程性細(xì)胞死亡事件，例如細(xì)胞機械或其他破碎，能發(fā)生瞬時胞外表達(dá)。還有，以前以認(rèn)為細(xì)胞染色是一些編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞對抗體-抗原的細(xì)胞表面復(fù)合體的內(nèi)在化活性進(jìn)程的結(jié)果為基礎(chǔ)分析的胞核分子、例如La已經(jīng)被排除作為編程性細(xì)胞死亡本身的標(biāo)記。也就是，排除了膜滲透性作為抗體進(jìn)入細(xì)胞的一個途徑。因此，還沒有開發(fā)出鑒定編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞本身的方法。然而，現(xiàn)在開發(fā)出使用抗-胞核免疫活性分子、特別是抗-La/SS-B免疫活性分子體外和體內(nèi)檢測晚期編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞和編程性細(xì)胞死亡體的方法。所述方法涉及但不要求附加步驟，如證明結(jié)合的滲透作用，這在本發(fā)明出現(xiàn)之前是需要的。以前已知抗-胞核抗體結(jié)合與編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)沒有關(guān)系，它取決于細(xì)胞的滲透作用，結(jié)合是表面膜相關(guān)的并且取決于結(jié)合機理而不是被動進(jìn)入并且與編程性細(xì)胞死亡體中包含的抗原特異性結(jié)合。
胞核分子例如La令人驚奇地鑒定為編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的高特異性、可檢測和排它標(biāo)記，現(xiàn)在允許開發(fā)涉及診斷和監(jiān)測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞群、特別是腫瘤和它們的轉(zhuǎn)移的一系列的試劑和方法。此外，確定使用針對這些胞核分子的免疫活性分子提供針對以編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的存在為特征的病癥的定向治療性和/或預(yù)防性治療的高特異性方法。特別是，腫瘤治療特定內(nèi)容的重要性在于發(fā)現(xiàn)使抗-La免疫活性分子定向于例如腫瘤中的編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞能成功地用來提供例如通過遞送有毒分子而實現(xiàn)旁觀(bystander)非編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞殺傷的方法。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及對受試者或來自所述受試者的生物樣品檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法，所述方法包括用針對胞核分子或者其抗原部分的相互作用分子接觸所述受試者或所述生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物并且篩選相互作用分子-胞核分子復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的指征。
更具體地，本發(fā)明涉及對受試者或來自所述受試者的生物樣品檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法，所述方法包括用針對胞核分子或者其抗原部分的免疫活性分子接觸所述受試者或所述生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物并且篩選免疫活性分子-胞核分子復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的指征。
涉及的″胞核分子″應(yīng)該理解是指編程性細(xì)胞死亡之前永久性或瞬時存在于變成編程性細(xì)胞死亡主體的細(xì)胞的胞核中的任何蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子。優(yōu)選地，所述胞核分子是Ro52，Ro60，La/SS-B，凝溶膠蛋白，α-胞襯蛋白，核仁纖維蛋白，U1小核核糖核蛋白質(zhì)(U1 snRNP)，異核核糖核蛋白質(zhì)(hnRNP)，核纖層蛋白B，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，SC-35剪接因子，Smith(Sm)抗原。更優(yōu)選地，所述胞核分子是La。
不在任何方面限制本發(fā)明，抗-La抗體特異性檢測編程性細(xì)胞死亡。先前理解的La的非胞核定位及其隨后的在編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞外部表面檢測是根據(jù)編程性細(xì)胞死亡特異性結(jié)果半胱天冬酶(caspase)激活提出的。然而，雖然在晚期編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞中檢測不到半胱天冬酶活性(P.Smolewski等，J Immunol Methods2002)，但是已經(jīng)確定胞核分子例如La仍然能被檢測出來。通過其他診斷方法不容易檢測晚期編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞。
關(guān)于″非胞核定位″應(yīng)該理解是指位于細(xì)胞任何區(qū)或者其部分而不是在完整細(xì)胞核之內(nèi)的受試者胞核分子。優(yōu)選地，受試者非胞核定位如此，使得La暴露于胞外環(huán)境，這里稱作″胞外定位″，發(fā)生時，例如，在那里胞核分子易位到編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的胞質(zhì)中，所述細(xì)胞膜變成可滲透性或者在那里在編程性細(xì)胞死亡體中表達(dá)該分子，其中編程性細(xì)胞死亡體在編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞中形成并且最后在編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞完全分解時分散到胞外環(huán)境中。
關(guān)于″編程性細(xì)胞死亡″細(xì)胞應(yīng)該理解是指正在經(jīng)歷或者已經(jīng)經(jīng)歷編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞。本發(fā)明不受任何一種理論或作用方式限制，編程性細(xì)胞死亡是需要垂死細(xì)胞代謝活性的激活過程。經(jīng)常地，編程性細(xì)胞死亡的特征在于細(xì)胞的收縮，DNA裂解成片段(在凝膠上給出″階梯模式″)并且在于染色質(zhì)的縮合和著邊。很多情況下發(fā)生細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡。因此，La的非胞核定位的鑒定、例如和表達(dá)該分子的細(xì)胞的性質(zhì)和位置一起提供了監(jiān)測和/或診斷很多種病癥的方法，包括心肌梗塞(心臟病發(fā)作)或腦(中風(fēng))，或者自身免疫和其他炎癥疾病，或者病毒疾病，例如AIDS，或神經(jīng)退化疾病，例如早老性癡呆或帕金森病，或者急性實體器官或骨髓移植排異，或者化療或放療引起的組織損傷(′粘膜炎′)或腫瘤。在一個優(yōu)選實施方案中，受試者編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞是編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞。
根據(jù)這個優(yōu)選的實施方案，提供對受試者或來自所述受試者的生物樣品檢測編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括用指向La或者其抗原部分的免疫活性分子接觸所述受試者或所述生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物并且篩選免疫活性分子-La復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞的指征。
優(yōu)選地，所述非胞核定位發(fā)生在編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)或編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞形成的編程性細(xì)胞死亡體之內(nèi)。
關(guān)于″瘤細(xì)胞″應(yīng)該理解是指表現(xiàn)異常死亡的細(xì)胞。術(shù)語″生長″應(yīng)該以其廣義理解并且包括指增殖。以這個觀點，異常細(xì)胞生長的例子是細(xì)胞的不受控制的增殖。瘤細(xì)胞可以是良性細(xì)胞或惡性細(xì)胞。受試者瘤細(xì)胞可以是任何細(xì)胞類型，例如上皮細(xì)胞或非上皮細(xì)胞。
術(shù)語“瘤形成”常見的醫(yī)療意義指″新細(xì)胞生長″，其作為對正常生長控制、例如對腫瘤細(xì)胞生長響應(yīng)能力的喪失的結(jié)果。
″增殖″指經(jīng)歷異常高生長速度的細(xì)胞。然而，根據(jù)這里使用的，術(shù)語″瘤形成″和″增生″能互換使用，一般指經(jīng)歷異常細(xì)胞生長速度的細(xì)胞。瘤形成和增生包括″腫塊″，其可以是良性的，惡性之前的或惡性的。術(shù)語″瘤″應(yīng)該理解是身體上的損傷、腫瘤或者其他包圍的或沒有包圍的物質(zhì)塊或者其他生長形式，包括腫瘤細(xì)胞。
根據(jù)這里使用的，術(shù)語″超增殖的″和″瘤形成″互換使用并且指異常狀態(tài)或者以快速增殖或新生物為特征的病癥中的那些細(xì)胞。術(shù)語意思是包括所有類型的癌生長或致癌基因病變、轉(zhuǎn)移組織或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，而不考慮病理組織學(xué)類型或侵入狀態(tài)?！宀±硇猿鲋车摹寮?xì)胞在以惡性腫瘤生長為特征的疾病狀態(tài)中存在。
本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)術(shù)語″癌″并且指上皮或內(nèi)分泌組織的惡性腫瘤，包括呼吸系統(tǒng)癌，腸胃系統(tǒng)癌，泌尿生殖系統(tǒng)癌，睪丸癌，乳腺癌，前列腺癌，內(nèi)分泌系統(tǒng)癌和黑素瘤。例舉的癌包括從乳房組織形成的那些。該術(shù)語還包括癌肉瘤，例如包括癌和肉瘤組織構(gòu)成的惡性腫瘤?！逑侔逯赶俳M織產(chǎn)生的癌或者其中腫瘤細(xì)胞生成可識別的腺結(jié)構(gòu)。
這里使用的術(shù)語″瘤″包括前面三段中討論的所有術(shù)語。
本發(fā)明的瘤和瘤形成細(xì)胞的例子包括但不限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤和其他兒科瘤，頭頸癌(例如鱗狀細(xì)胞癌)，乳房和前列腺癌，肺癌(小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)，腎癌(例如腎細(xì)胞腺癌)，食管胃癌，肝細(xì)胞癌，胰管膽汁瘤形成(例如腺癌胰腺內(nèi)分泌瘤)，結(jié)腸直腸癌，宮頸癌和肛門癌，子宮和其他生殖道癌，尿道癌(例如輸尿管和膀胱癌)，胚細(xì)胞腫瘤(例如睪丸胚細(xì)胞腫瘤或卵巢胚細(xì)胞腫瘤)，卵巢癌(例如卵巢上皮癌)，未知的原發(fā)癌，人免疫缺陷相關(guān)惡性腫瘤(例如Kaposi′s肉瘤)，淋巴瘤，白血病，惡性黑素瘤，肉瘤，內(nèi)分泌瘤(例如甲狀腺瘤)，間皮瘤和其他胸膜腫瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和癌樣腫瘤。
這里關(guān)于″La″包括指La的所有形式，或者其同系物、或同源物或衍生物。關(guān)于″La″應(yīng)該理解是包括指從La的La mRNA或變體或多形變體交替剪接產(chǎn)生的任何同種型。還應(yīng)該理解″La″是替代的術(shù)語SS-B的分子。
″相互作用分子″是對La或者其抗原部分或者其同系物或衍生物具有特異性(不必須是排它特異性，但是排它特異性是優(yōu)選的)和結(jié)合親和性的任何分子。相互作用分子的例子包括免疫性活性分子和肽模擬物質(zhì)。雖然優(yōu)選的免疫活性分子是一種免疫球蛋白分子，本發(fā)明延伸到其他免疫活性分子，例如抗體片段，單鏈抗體，去免疫抗體包括人源化抗體和T-細(xì)胞相關(guān)抗原-結(jié)合分子(TABMs)。最優(yōu)選地，免疫活性分子是一種抗體，例如多克隆抗體或單克隆抗體。應(yīng)該理解主體免疫活性分子可以與任何其他蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子或細(xì)胞連接、鍵合或另外締合。最優(yōu)選地，抗體是單克隆抗體。
相互作用分子是″針對″胞核分子，例如La，或者，到相互作用分子是免疫活性分子的程度。應(yīng)該理解分子不必須是排它特異性的，但是排它特異性是優(yōu)選的。例如，已知抗體有時和其他抗原交叉反應(yīng)?？乖瓫Q定簇或表位包括能產(chǎn)生免疫反應(yīng)的分子的部分?？乖瓫Q定簇或表位可以是B-細(xì)胞表位或者適合T-細(xì)胞受體結(jié)合分子的部位。術(shù)語″抗原部分″包括抗原決定簇或表位。
優(yōu)選地，主體免疫活性分子是抗體。
更優(yōu)選地，所述抗體是單克隆抗體。
根據(jù)這個優(yōu)選的實施方案，提供對受試者或來自所述受試者的生物樣品檢測編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括用針對La或者其抗原部分的抗體接觸所述受試者或所述生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物并且篩選抗體-La復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的指征。
優(yōu)選地，所述非胞核定位發(fā)生在編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的胞質(zhì)中或者編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞形成的編程性細(xì)胞死亡體中。
關(guān)于″生物樣品″應(yīng)該理解是指來自個體的任何生物材料樣品，例如但不限于，粘液、糞便、尿液、血液、血清、細(xì)胞提取物、活組織檢查標(biāo)本和導(dǎo)入個體身體并且隨后除去的液體，例如肺灌洗之后從肺提取的鹽溶液或者從灌腸法洗液回收的溶液。根據(jù)本發(fā)明的方法分析的生物樣品可以直接被分析或者在分析之前可能需要某些形式的處理。例如，活組織檢查樣品在分子之前需要勻漿化或切片。
根據(jù)本發(fā)明，建議編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞、包括編程性細(xì)胞死亡惡性或非惡性瘤細(xì)胞胞外表達(dá)La。因此，胞外La定性或定量水平檢測提供細(xì)胞是編程性細(xì)胞死亡和與以細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征的病癥相關(guān)的指征。
因此本發(fā)明提供一種診斷或監(jiān)測以異常的不期望的或者另外不適當(dāng)?shù)募?xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征的病癥的方法。所謂″異常的不期望的或者另外不適當(dāng)?shù)摹逡馑际鞘茉囌呔幊绦约?xì)胞死亡可能是過量水平，不適當(dāng)水平或正常水平，但是這個水平是不適當(dāng)?shù)幕虿黄谕摹８鶕?jù)這里的詳細(xì)描述，有很多以存在一定程度的細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征的病癥，例如，心肌或腦組織梗塞，或者自身免疫和其他炎癥疾病，或者病毒疾病，例如AIDS，或神經(jīng)退化疾病，例如早老性癡呆或帕金森病，或者急性實體器官或骨髓移植排異，或者化療或放療引起的組織損傷(′粘膜炎′)或瘤，如腫瘤。
雖然本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及篩選編程性細(xì)胞死亡的存在，這是特定疾病病癥啟動的指征，還可能發(fā)生其中對其篩選細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡水平的降低或不存在編程性細(xì)胞死亡的臨床情形。后一種情形在例如對個體監(jiān)測醫(yī)療性治療方案進(jìn)程和編程性細(xì)胞死亡水平指示接受治療的疾病向減輕狀態(tài)發(fā)展時存在。還應(yīng)該理解在某些情況下細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡事件不存在是疾病病癥發(fā)生的指征。例如，在正常胸腺細(xì)胞發(fā)育過程中，在陽性和陰性選擇作用過程中經(jīng)歷編程性細(xì)胞死亡的胸腺中存在大部分胸腺細(xì)胞，為了發(fā)生自身/非自身辨別力這是必需的。因此，青少年胸腺中不存在正常水平的細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡事件是孩子傾向于發(fā)生自身免疫病癥的指征。因此應(yīng)該理解，雖然本發(fā)明可能在為了能診斷疾病病癥的篩選特定細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡事件的存在中大量地應(yīng)用，然而本發(fā)明方法能應(yīng)用于篩選缺乏編程性細(xì)胞死亡事件，這種情況指示發(fā)生某些疾病病癥的發(fā)生或傾向。本發(fā)明的方法還可以用于篩選在監(jiān)測疾病病癥或治療性或預(yù)防性治療方案中細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的水平的變化。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及對受試者診斷或監(jiān)測以異常的不期望的或者另外不適當(dāng)?shù)募?xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征的病癥的方法，所述方法包括用針對所述胞核分子或者其抗原決定簇或表位的胞核分子-結(jié)合有效量的相互作用分子接觸所述受試者或來自所述受試者生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物，并且定性或定量測定胞核分子-免疫活性分子復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的指征。
優(yōu)選地，所述胞核分子是La。
優(yōu)選地，所述相互作用分子是免疫活性分子，更優(yōu)選地是抗-La抗體，例如抗-La單克隆抗體。
最優(yōu)選地，所述非胞核定位是胞外定位，并且更優(yōu)選地，在編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的胞質(zhì)中或者編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞形成的編程性細(xì)胞死亡體中。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述病癥是心肌或腦組織梗塞，或者自身免疫和其他炎癥疾病，病毒疾病，例如AIDS，或神經(jīng)退化疾病，例如早老性癡呆或帕金森病，急性實體器官或骨髓移植排異，化療或放療引起的組織損傷(′粘膜炎′)或瘤，如腫瘤。
在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及對受試者診斷或監(jiān)測腫瘤癥狀的方法，所述方法包括用指向所述La或者其抗原決定簇或表位的La-結(jié)合有效量的免疫活性分子接觸所述受試者或來自所述受試者生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物，并且定性或定量測定La-免疫活性分子復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的指征，并且所述細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡是所述腫瘤病癥的指征。
優(yōu)選地，所述腫瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤和其他兒科瘤，頭頸癌(例如鱗狀細(xì)胞癌)，乳房和前列腺癌，肺癌(小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)，腎癌(例如腎細(xì)胞腺癌)，食管胃癌，肝細(xì)胞癌，胰管膽汁瘤形成(例如腺癌胰腺內(nèi)分泌瘤)，結(jié)腸直腸癌，宮頸癌和肛門癌，子宮和其他生殖道癌，尿道癌(例如輸尿管和膀胱癌)，胚細(xì)胞腫瘤(例如睪丸胚細(xì)胞腫瘤或卵巢胚細(xì)胞腫瘤)，卵巢癌(例如卵巢上皮癌)，未知的原發(fā)癌，人免疫缺陷相關(guān)惡性腫瘤(例如Kaposi′s肉瘤)，淋巴瘤，白血病，惡性黑素瘤，肉瘤，內(nèi)分泌瘤(例如甲狀腺瘤)，間皮瘤和其他胸膜腫瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和癌樣腫瘤。
最優(yōu)選地，所述免疫活性分子是抗體，更優(yōu)選是單克隆抗體。
這里關(guān)于″受試者″應(yīng)該理解包括人，靈長類，家畜動物(例如綿羊，豬，牛，馬，驢)，實驗室試驗動物(例如小鼠，兔子，大鼠，豚鼠)，陪伴動物(例如狗，貓)和圈養(yǎng)的野生動物(例如狐貍，袋鼠，鹿)。優(yōu)選地，哺乳動物是人。
應(yīng)用抗體特別是單克隆抗體、例如上文提到的那些檢測胞核分子例如La是本發(fā)明優(yōu)選的方法?？贵w可以通過任何方法制備。例如，對于檢測人La，人-人單克隆抗體可以來自B細(xì)胞，已經(jīng)從產(chǎn)生抗-La自身抗體的患者獲得這種物質(zhì)，因為它們患有系統(tǒng)自身免疫疾病，例如全身紅斑狼瘡(SLE)或Sjogren′s綜合征(Ravirajan等Lupus 1(3)157-165，1992)?？贵w一般得自非人哺乳動物，但是不是必須的，例如靈長類動物，家畜動物(例如綿羊，豬，牛，山羊，馬)，實驗室試驗動物(例如小鼠，大鼠，兔子，豚鼠)，和陪伴動物(例如狗，貓)。一般情況下，體外對細(xì)胞或活組織檢查組織進(jìn)行以抗體為基礎(chǔ)的測定。然而，如果抗體被適當(dāng)?shù)厝ッ庖?，在人?yīng)用、人源化情況下，則用例如胞核標(biāo)記對抗體標(biāo)記對患者施用，并且通過放射學(xué)技術(shù)測定胞核標(biāo)記物聚積的位點。因此認(rèn)為La抗體是細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡定向試劑。因此，本發(fā)明延伸至用于人和非人患者細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡成像的抗體的去免疫形式。下面對此作進(jìn)一步描述。
因此，本發(fā)明提供用于體內(nèi)對La或者對細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡成像的免疫測定的抗體，特別是單克隆抗體。目前可獲得的抗體包括SW3和3B9。
關(guān)于抗體La抗體的產(chǎn)生，需要從生物樣品提取這種分子，不管是從動物包括人組織還是從通過重組方法制備的細(xì)胞培養(yǎng)物。通過任何合適的方法能從生物樣品分離La。例如，分離可以獲得下面的一項或多項好處La表面電荷性質(zhì)，大小，密度，生物學(xué)活性及其對另一個個體的親和性(例如與之結(jié)合或者另外締合的另一種蛋白質(zhì)或化合物)。如此，例如，通過下面一種或幾種技術(shù)可以實現(xiàn)從生物液體分離La超離心，離子交換色譜法(例如陰離子交換色譜法，陽離子交換色譜法)，電泳(例如聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電聚焦)，大小分離(例如，凝膠過濾，超濾)和親和性介導(dǎo)的分離(例如免疫親和分離，包括但不限于，磁珠分離，例如DynabeadTM分離，免疫色譜法，免疫沉淀)。根據(jù)研究的La或者獲得La的組織的生物活性或物理性質(zhì)，可以選擇使用的分離技術(shù)。
優(yōu)選地，從生物液體分離的La保留了蛋白質(zhì)上構(gòu)象表位，因此，適當(dāng)避免引起酶變性的技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到保持或盡可能近地模擬La特有生理條件的重要性(例如獲得La的生物液體)，以確保暴露給動物的La上的抗原決定簇或活性位點結(jié)構(gòu)與天然蛋白質(zhì)的相同。這保證在免疫動物體內(nèi)產(chǎn)生識別天然蛋白質(zhì)的合適的抗體。在優(yōu)選的實施方案中，利用親和分離，凝膠過濾和超濾中的一種或幾種從生物液體分離La。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法能進(jìn)行免疫接種和接著的單克隆抗體的產(chǎn)生，例如Kohler和Milstein，Nature 256495-499，1975；Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6(7)511-519，1976；Coligan等，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，1991-1997，或Toyama等，″Monoclonal Antibody，ExperimentManual″，Kodansha Scientific，1987出版所描述的。本質(zhì)上，通過標(biāo)準(zhǔn)方法用含有La的生物液體對動物免疫，制備產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，特別是產(chǎn)生抗體的體細(xì)胞(例如B淋巴細(xì)胞)。然后從免疫的動物取出這些用于無限繁殖。
使用La的片段產(chǎn)生抗體的情況下，需要首先將其與載體偶聯(lián)。所謂″載體″意思是非免疫原性或免疫原性不好的免疫原性物質(zhì)(例如半抗原)天然或人工地與之連接以增強其免疫原性的一般高分子量的任何物質(zhì)。
利用本領(lǐng)域公知的方法可以進(jìn)行產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的無限繁殖。例如，通過使用Epstein-Barr病毒(EBV)的方法可以實現(xiàn)無限繁殖(Kozbor等，Methods in Enzymology 121140，1986)。在優(yōu)選的實施方案中，利用細(xì)胞融合方法使產(chǎn)生抗體的細(xì)胞無限繁殖。(描述于Coligan等，1991-1997，上文)。這項技術(shù)廣泛用于單克隆抗體的制備。在該方法中，有效產(chǎn)生抗體的產(chǎn)生體抗體(somatic antibody)的細(xì)胞、特別是B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合。這些體細(xì)胞可以來自有循環(huán)La-反應(yīng)性抗體的人和原始動物優(yōu)選嚙齒類動物、例如小鼠和大鼠的淋巴結(jié)、脾和外周血。小鼠脾細(xì)胞是特別有用的。然而使用大鼠、兔子、綿羊或山羊細(xì)胞或者來自其他動物物種的細(xì)胞代替也是可能的。
從淋巴細(xì)胞瘤制備特定的骨髓瘤細(xì)胞系用于制備雜交瘤的融合方法(Kohler和Milstein，1976，上文；Shulman等，Nature 276269-270，1978；Volket等，J.Virol.42(1J220-227，1982)。培養(yǎng)這些細(xì)胞系有至少三個原因。第一是有利于從沒有融合的和類似地?zé)o限自身繁殖的骨髓瘤細(xì)胞選擇融合的雜交瘤。通常，這通過使用帶有酶缺陷的骨髓瘤來實現(xiàn)，所述酶缺陷使得它們不能在支持雜交瘤生長的某些選擇性培養(yǎng)基中生長。第二個原因是由淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生它們自身抗體的固有能力產(chǎn)生的。為了減少雜交瘤產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞抗體，使用不能產(chǎn)生內(nèi)源輕或重免疫球蛋白鏈的骨髓瘤細(xì)胞系。選擇這些細(xì)胞系的第三個原因是它們對于融合的適應(yīng)性和效率。
很多雜交瘤細(xì)胞系可以用于融合細(xì)胞雜合體的產(chǎn)生，包括，例如P3X63-Ag8，P3X63-AG8.653，P3/NS1-Ag4-1(NS-1)，Sp2/0-Ag14和S194/5.XXO.Bu.1。Khler和Milstein(1976，上文)描述了P3X63-Ag8和NS-1細(xì)胞系。Shulman等(1978，上文)開發(fā)了Sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞系。Trowbridge，J.Exp.Med.148(1).313-323，1978報道了S194/5.XXO.Bu.1細(xì)胞系。
產(chǎn)生抗體的脾或淋巴結(jié)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備方法通常涉及在促進(jìn)細(xì)胞膜融合的物質(zhì)(化合物，病毒或電)的存在下以10∶1的比例分別混合體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(但是該比例也可以從大約20∶1至大約1∶1變化)。融合方法已有描述(Kohler和Milstein，1975，上文；1976，上文；Gefter等，Somatic Cell Genet.3.231-236，1977；Volk等，1982，上文)。那些研究人員使用的促進(jìn)融合的試劑是Sendai病毒和聚乙二醇(PEG)。
因為融合方法以非常低的頻率產(chǎn)生成活的雜合體(例如當(dāng)脾用作體細(xì)胞源時，從粗略的每1×105脾細(xì)胞只獲得一個雜合體)，優(yōu)選具有從保留的沒有融合的細(xì)胞，特別是沒有融合的骨髓瘤細(xì)胞選擇融合細(xì)胞雜合體的方法。從其他產(chǎn)生的融合細(xì)胞雜合體檢測期望的產(chǎn)生抗體的雜交瘤的方法也是必需的。一般情況下，通過在支持雜交瘤生長但是阻止正常情況下持續(xù)無限分裂的未融合骨髓瘤細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，實現(xiàn)融合細(xì)胞雜合體的選擇。融合中使用的體細(xì)胞不保留在體外培養(yǎng)物中長期生存力，因此沒有造成問題。在本發(fā)明的實施例中，使用沒有次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的骨髓瘤細(xì)胞(HPRT-陰性)。在次黃嘌呤/氨基喋呤/胸苷(HAT)培養(yǎng)基，一種其中融合細(xì)胞雜合體由于脾細(xì)胞的HPRT-陽性基因型而存活的培養(yǎng)基中進(jìn)行針對這些細(xì)胞的選擇。使用能針對支持基因型有效雜合體生長的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇的具有不同基因缺陷(藥物靈敏性等)的骨髓瘤也是可能的。
選擇性培養(yǎng)融合細(xì)胞雜合體需要幾周。在這個時期早期，需要鑒定產(chǎn)生期望的抗體的那些雜合體，使得可以接著將它們克隆和繁殖。一般情況下，獲得的10％左右的雜合體產(chǎn)生期望的抗體，而大約1至大約30％的范圍是不常見的。通過幾種標(biāo)準(zhǔn)分析方法中的任何一種能實現(xiàn)產(chǎn)生抗體的雜合體的檢測，包括酶聯(lián)免疫測試法和放射免疫分析技術(shù)，例如，描述于Kennet等(編著)Monoclonal Antibodies andHybridomasA New Dimension in Biological Analyses，pp.376-384，Plenum Press，New York，1980，以及通過FACS分析。
一旦選擇了期望的融合細(xì)胞雜合體并且克隆到各個產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系中，可以以兩種標(biāo)準(zhǔn)方法的任一種繁殖各個細(xì)胞系。能將雜交瘤細(xì)胞的懸浮液注射給組織相容動物。接受注射的動物然后產(chǎn)生腫瘤，其分泌融合細(xì)胞雜合體產(chǎn)生的特異單克隆抗體。抽出動物的體液，例如血清或腹水液，提供高濃度單克隆抗體?；蛘?，可以在試驗培養(yǎng)容器中體外繁殖各個細(xì)胞系。通過傾析、過濾或離心以及隨后的純化能收獲含有高濃度單一特異性單克隆抗體的培養(yǎng)物。
通過任何合適的免疫檢測方法對細(xì)胞系分析它們檢測La的特異性。例如，將細(xì)胞系按等份分到數(shù)個孔中并且保溫并且通過酶聯(lián)免疫測試法(ELISA)，間接熒光抗體技術(shù)，等等，分析各個孔中的上清液。鑒定產(chǎn)生能識別靶物L(fēng)a但是不識別非靶物表位的單克隆抗體的細(xì)胞系，然后直接體外培養(yǎng)或者注射給組織相容性動物，形成腫瘤并且產(chǎn)生，收集和純化需要的抗體。
這些抗體是La特異性的。這意味著，抗體能從其他分子區(qū)分La。可以使用更廣譜的抗體，條件是它們與正常細(xì)胞中的分子不交叉反應(yīng)。
在優(yōu)選的實施方案中，主體抗體是抗-人La單克隆抗體，8G3和9A5(Bachmann等，Proc Natl Acad Sci USA 83(20)7770-7774，1986)，抗-人La單克隆抗體(mAb)，LalB5(Mamula等，J Immunol 143(9)2923-2928，1989)，抗-人La單克隆抗體(Carmo-Fonseca等，ExpCell Res 185(1)73-85，1989)，抗-人和抗-牛La單克隆抗體，SW1，SW3和SW5(Pruijn等，Eur J Biochem 232(2)611-619，1995)，抗-人和抗-嚙齒動物L(fēng)a mAb，La4B6(Troster等，J Autoimmunity 8(6)825-842，1995)或抗-人和抗-鼠La mAb，3B9(Tran等，ArthritisRheum 46(1)202-208，2002)或者其衍生物、同系物、類似物、化學(xué)等價物、突變體或模擬物。
還應(yīng)該理解，本發(fā)明延伸至免疫活性分子和表達(dá)主體免疫活性分子的細(xì)胞系，特別是表達(dá)單克隆抗體的雜交瘤。
單克隆抗體預(yù)計用于體內(nèi)成像或治療時，需要對已經(jīng)導(dǎo)入的宿主(例如人)去免疫。去免疫方法可以采用多種形式中的任何一種，包括與根據(jù)本發(fā)明制備的單克隆抗體具有相同或相似特異性的嵌合抗體的制備。嵌合抗體是典型地通過基因工程從屬于不同物種的免疫球蛋白可變區(qū)和恒定區(qū)基因構(gòu)建其輕鏈和重鏈基因的抗體。因此，根據(jù)本發(fā)明，一旦獲得產(chǎn)生期望的單克隆抗體的雜交瘤，則利用技術(shù)產(chǎn)生種間(interspecific)單克隆抗體，其中一個物種的結(jié)合區(qū)與另一種物種的抗體的非結(jié)合區(qū)結(jié)合(Liu等，Proc Nalt Acad Sci USA843439-3443，1987)。例如，來自非人(例如鼠)單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDRs)能被接枝到人抗體上，從而將鼠抗體人源化(歐洲專利公開No.0239400；Jones等，Nature 321522-525，1986；Verhoeyen等，Science2391534-1536，1988；Richmann等，Nature332323-327，1988)。在這種情況下，去免疫方法對于人是特異性的。更特別地，CDRs能被接枝到有或沒有人恒定區(qū)的人抗體可變區(qū)上。提供CDRs的非人抗體一般稱作“供體”，提供構(gòu)架的人抗體一般稱作“受者”。不需要存在恒定區(qū)，但是如果存在，它們必須與人免疫球蛋白恒定區(qū)基本上相同，即至少大約85-90％、優(yōu)選大約95％或更多同一性。因此，除了可能的CDRs，人源化抗體的所有部分與天然人免疫球蛋白序列相應(yīng)部分基本上相同。因此，″人源化抗體″是包含人源化輕鏈和人源化重鏈的抗體。認(rèn)為供體抗體通過“人源化作用”過程而被“人源化”，因為預(yù)期得到的人源化抗體與抗原結(jié)合，其與提供CDRs的供體抗體是一樣的。這里所指“人源化”包括指對特定宿主去免疫的抗體，在這種情況下，是人宿主。
應(yīng)該理解去免疫抗體可以具有另外的保守氨基酸取代作用，這種取代對抗原結(jié)合或其他免疫球蛋白功能基本上沒有影響?？梢愿鶕?jù)表1進(jìn)行舉例的保守性取代。
表1
可以用來制備根據(jù)本發(fā)明的去免疫抗體的舉例的方法描述于，例如，參考文獻(xiàn)Richmann等，1988，上文；歐洲專利公開No.0 239 400；Chou等(美國專利No.6,056,957)；Queen等(美國專利No.6,180,370)；Morgan等(美國專利No.6,180,377)。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有對于被抗La單克隆抗體識別的表位有特異性的去免疫抗體分子，其中所述去免疫抗體的可變區(qū)的一個CDRs來自抗La所述單克隆抗體，并且去免疫抗體分子保留的免疫球蛋白衍生部分來自抗體被去免疫化的宿主的免疫球蛋白或者其類似物。
本發(fā)明的這個方面涉及非人抗體構(gòu)架區(qū)的操作。
本發(fā)明延伸至仍保留對La的特異性的主體抗體的突變體、類似物和衍生物。
術(shù)語″突變體″或″衍生物″包括一個或幾個氨基酸取代，加入和/或缺失。
根據(jù)這里使用的，術(shù)語″CDR″包括覆蓋分子的結(jié)合部分上存在的橋的抗體構(gòu)架區(qū)的可變部分中的三個輕鏈和三個重鏈區(qū)的CDR結(jié)構(gòu)環(huán)。這些環(huán)具有特征性典型結(jié)構(gòu)(Chothia等，J Mol.Biol.196901，1987；Chothia等，J.Mol.Biol.227799，1992)。
所謂″構(gòu)架區(qū)″意思是免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區(qū)，其中插入三個高變區(qū)，也稱作CDRs。已經(jīng)精確確定構(gòu)架區(qū)和CDRs的區(qū)域(參見，例如，Kabat等，″Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest″，U.S.Department of Health and Human Services，1983)。不同輕鏈或重鏈的構(gòu)架區(qū)序列在一種物種中是相對保守的。根據(jù)這里使用的，″人構(gòu)架區(qū)″是與天然存在的人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)基本上相同的構(gòu)架區(qū)(大約85％或更高，通常90-95％或更高)?？贵w構(gòu)架區(qū)是構(gòu)成輕鏈和重鏈的聯(lián)合構(gòu)架區(qū)，用來決定和排列CDRs。CDRs主要負(fù)責(zé)與La表位結(jié)合。
根據(jù)這里使用的，術(shù)語″重鏈可變區(qū)″意思是長度有大約110至125個氨基酸殘基的多肽，其氨基酸序列相應(yīng)于從重鏈的氨基末端(N-末端)氨基酸殘基起始的本發(fā)明的單克隆抗體的重鏈的氨基酸序列。同樣，術(shù)語″輕鏈可變區(qū)″意思是長度有大約95至130個氨基酸殘基的多肽，其氨基酸序列相應(yīng)于從輕鏈的氨基末端(N-末端)氨基酸殘基起始的本發(fā)明的單克隆抗體的輕鏈的氨基酸序列。NH2-末端(大約110個氨基酸)的可變區(qū)基因和COOH-末端的κ或λ恒定區(qū)基因編碼全長免疫球蛋白″輕鏈″(大約25Kd或214個氨基酸)。類似地，可變區(qū)基因(大約116個氨基酸)和其他上述恒定區(qū)基因中的一個，例如γ(編碼大約330個氨基酸)編碼全長免疫球蛋白″重鏈″(大約50Kd或446個氨基酸)。
術(shù)語″免疫球蛋白″或″抗體″在這里用來指由實質(zhì)上由免疫球蛋白基因編碼的一個或幾個多肽構(gòu)成的蛋白質(zhì)。識別的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，ε和μ恒定區(qū)基因，以及無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。免疫球蛋白的一種形式構(gòu)成抗體的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)單位。這個形式是四聚體，并且由兩個相同的免疫球蛋白鏈對構(gòu)成，每一對具有一個輕鏈和一個重鏈。在每一對中，輕鏈和重鏈可變區(qū)一起負(fù)責(zé)結(jié)合抗原，恒定區(qū)負(fù)責(zé)抗體效應(yīng)子功能。除了抗體之外，免疫球蛋白可以以各種其他形式存在，包括，例如，F(xiàn)v，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′和(Fab′)2。
本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法制備的單克隆抗體的片段的應(yīng)用和產(chǎn)生，包括，例如，F(xiàn)v，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′和F(ab′)2片段。這樣的片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法，例如Coligan等(1991-1997，上文)描述的方法，來制備。
本發(fā)明還涉及具有和本發(fā)明的單克隆抗體相同或相似特異性的合成的或重組的抗原-結(jié)合分子。這種類型的抗原-結(jié)合分子可以包含合成穩(wěn)定化的Fv片段。這種類型的例示的片段包括單鏈Fv片段(sFv，常常稱作scFv)，其中使用肽接頭使VH結(jié)構(gòu)域的N末端或C末端分別與VL結(jié)構(gòu)域的C末端或N末端橋接。ScFv沒有全抗體的所有的恒定部分，并且不能激活補體。用于連接VH和VL結(jié)構(gòu)域的合適的肽接頭是使得VH和VL結(jié)構(gòu)域折疊成具有與衍生出Fv片段的全抗體的抗原結(jié)合位點相似的三維結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合位點的多肽單鏈。通過美國專利No4,946,778公開的方法可以獲得具有期望性質(zhì)的接頭。然而，在某些情況下不存在接頭，例如，根據(jù)Krebber等(Krebber等，J.Immunol.Methods 201(1).35-55，1997)公開的方法可以制備ScFvs?；蛘撸梢酝ㄟ^美國專利No 5,091,513，歐洲專利No 239,400或者Winter和Milstein(Winter和Milstein，Nature 349293，1991)和Plckthun等(Plckthun等，In Antibody engineering.Apractical approach 203-252，1996)的文章描述的方法制備它們。
或者，合成的穩(wěn)定的Fv片段包含二硫化物穩(wěn)定的Fv(dsFv)，其中半胱氨酸殘基導(dǎo)入VH和VL結(jié)構(gòu)域，使得在全折疊Fv分子中，兩個殘基之間形成二硫鍵。例如(Glockshuber等，Biochem.291363-1367，1990；Reiter等，Biochem.335451-5459，1994；Reiter等，Cancer Res.542714-2718，1994；Reiter等，J.Biol.Chem.26918327-18331，1994；Webber等，Mol.Immunol.32.249-258，1995)中描述了制備dsFv的合適方法。
還涉及的合成或重組抗原-結(jié)合分子是單一可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(稱作dAbs)，例如，公開于(Ward等，Nature 341.544-546，1989；Hamers-Casterman等，Nature 363.-446-448，1993；Davies &Riechmann，F(xiàn)EBS Lett.339.285-290，1994)。
或者，合成或重組抗原-結(jié)合分子可以包括″小體(minibody)″。在這一點上，小體是全抗體的小變型，它編碼全抗體的單鏈基本元件。適當(dāng)?shù)兀贵w由與免疫球蛋白分子的絞合區(qū)和CH3結(jié)構(gòu)域融合的天然抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，例如，如美國專利No 5,837,821中公開的。
在另一個實施方案中，合成或重組抗原-結(jié)合分子可以包括非免疫球蛋白衍生的蛋白質(zhì)構(gòu)架。例如，可以參考(Ku & Schutz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92.6552-6556，1995)，該文獻(xiàn)公開了具有兩個隨機產(chǎn)生CDR s選用于抗原結(jié)合的環(huán)的四螺旋束蛋白質(zhì)細(xì)胞色素b562。
合成或重組抗原-結(jié)合分子可以是多價的(即具有多于一個的抗原結(jié)合位點)。這樣的多價分子可以對于一個或幾個抗原是特異性的。通過兩個抗體片段通過含有半胱氨酸的肽二聚體化可以制備這種類型的多價分子，例如，公開于(Adams等，Cancer Res.534026-4034，1993；Cumber等，J.Immunol.149120-126，1992)?；蛘撸ㄟ^使抗體片段與天然存在的二聚體兩親性螺旋融合(Plunckthun，Biochem.311579-1584，1992)或者通過使用優(yōu)先雜二聚化的(Kostelny等，J.Immunol.1481547-1553，1992)結(jié)構(gòu)域(例如亮氨酸拉鏈jun和fos)可以促進(jìn)異二聚體化。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及主體抗體中氨基酸的化學(xué)類似物。例如如果需要對受試者施藥，氨基酸的化學(xué)類似物的應(yīng)用對于穩(wěn)定分子是特別有用的。這里涉及的氨基酸的類似物包括但不限于，側(cè)鏈的修飾，肽，多肽或蛋白質(zhì)合成中非天然氨基酸和/或它們的衍生物的插入，以及交聯(lián)劑和對蛋白質(zhì)分子或它們的類似物強加構(gòu)象約束的其他方法的使用。
本發(fā)明涉及的側(cè)鏈修飾的例子包括例如通過與醛反應(yīng)接著用NaBH4還原的還原性烷基化作用對氨基的修飾；用甲基乙酰亞胺的脒化作用；使用乙酸酐的乙酰化作用；使用氰酸鹽對氨基的氨基甲?；饔茫皇褂?，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)對氨基的三硝基芐基化作用；使用琥珀酸酐和四氫化鄰苯二甲酸酐對氨基的酰化作用；和使用吡哆醛-5-磷酸酯對賴氨酸的吡哆化(pyridoxylation)作用后接著用NaBH4還原。
使用象2，3-丁二酮，苯乙二醛和乙二醛這樣的試劑通過形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物可以修飾精氨酸殘基的胍基。
通過經(jīng)O-?；愲逍纬傻奶蓟啺坊罨蠼又M(jìn)行衍生化作用例如形成相應(yīng)的酰胺可以修飾羧基。通過例如下面的方法可以修飾Sulphydryl基團(tuán)使用碘代乙酸或碘代乙酰胺的羧甲基化作用；氧化過甲酸至磺基丙氨酸；與其他硫醇化合物形成混合二硫物；與馬來酰亞胺、馬來酸酐或其他取代的馬來酰亞胺反應(yīng)；使用4-氯正汞基苯甲酸酯、4-氯正汞基苯磺酸、苯基汞氯化物、2-氯正汞基-4-硝基苯酚和其他汞制劑形成汞衍生物；在堿性pH下用氰酸鹽的氨基甲?；饔?。
通過，例如，用N-溴琥珀酰亞胺的氧化作用或用2-羥基-5-硝基芐基溴或sulphenyl halide對吲哚環(huán)的烷基化作用可以修飾色氨酸殘基。另一方面，可以通過用四硝基甲烷的硝基化作用形成3-硝基酪氨酸衍生物來修飾酪氨酸殘基。
通過用碘乙酸衍生物進(jìn)行烷基化作用或用焦碳酸二乙基酯進(jìn)行N-乙酯基化作用可以實現(xiàn)對組氨酸殘基咪唑環(huán)的修飾。
在肽合成中插入非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于，使用正亮氨酸，4-氨基丁酸，4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸，6-氨基己酸，叔丁基甘氨酸，正纈氨酸，苯基甘氨酸，鳥氨酸，肌氨酸，4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-異構(gòu)體。表2給出這里涉及的非天然氨基酸的目錄。
表2
交聯(lián)劑可以用來，例如，穩(wěn)定3D構(gòu)象，使用同型雙功能交聯(lián)劑，例如具有其中n＝1至n＝6(CH2)n間隔基團(tuán)的雙功能亞氨酯，戊二醛，N-羥基琥珀酰亞胺酯和異型雙功能試劑，所述試劑通常包含氨基反應(yīng)部分，例如N-羥基琥珀酰亞胺和其他基團(tuán)特異性反應(yīng)部分，例如馬來酰亞胺基或二硫基部分(SH)或碳化二亞胺(COOH)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及對生物樣品檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的分析法，所述分析法包括下面的步驟-(3)使針對胞核分子或者其抗原決定簇的反應(yīng)活性分子接觸懷疑含有所述胞核分子的生物樣品；和(4)對步驟(1)中形成的復(fù)合體進(jìn)行信號檢測步驟，其中檢測非胞核相互作用分子-胞核分子復(fù)合體形成是編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的指征。
優(yōu)選地，所述胞核分子是La。
更優(yōu)選地，所述相互作用分子是免疫活性分子，更優(yōu)選是抗-La抗體，例如單克隆抗體SW3或3B9。
最優(yōu)選地，所述非-胞核定位是胞外定位，更優(yōu)選地，定位在編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的胞質(zhì)中或者編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞形成的編程性細(xì)胞死亡體中。
信號檢測步驟包括ELISA或者任何其他報道分子為基礎(chǔ)的分析法。作為該檢測步驟的一部分，首先需要將信號擴(kuò)大。應(yīng)該理解這個分析法可以體內(nèi)或體外進(jìn)行。
為了使編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞接觸旁觀者-細(xì)胞生長阻礙或旁觀者-細(xì)胞殺傷試劑，即細(xì)胞抑制劑或殺細(xì)胞試劑，本發(fā)明的去免疫單克隆抗體A也可以用于體內(nèi)編程性細(xì)胞死亡成像以及用于定向編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞。
抗-La抗體優(yōu)于目前已知的產(chǎn)物，例如ApomateTM(North AmericanScientific，Inc.)，用于體內(nèi)檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞。ApomateTM使用放射標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V來結(jié)合編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞，特別是查明癌對化療的強烈反應(yīng)。膜聯(lián)蛋白V結(jié)合磷脂酰絲氨酸，其在編程性細(xì)胞死亡早期′flip-flops′至外原生質(zhì)膜小葉。然而，通過ApomateTM對化療引起的腫瘤細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的檢測是易變的，因為給藥時間選擇是決定性的(Blankenberg等，Clin Cancer Res 2002)。時間選擇與使用抗-La抗體相比重要性較小，因為抗體使得編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞定向于在癌部位積聚的巨噬細(xì)胞。此外，膜聯(lián)蛋白V抑制體外編程性細(xì)胞死亡胸腺細(xì)胞的巨噬細(xì)胞-介導(dǎo)的吞噬作用，通過抗體結(jié)合的紅細(xì)胞的Fc受體介導(dǎo)的攝入包圍它，它有表面-暴露的磷脂酰絲氨酸(Callahan等，Cell Death Different 7(7)645-653，2000；Krahlung等Cell Death Different 6(2)183-189，1999)。因此，抗-La抗體調(diào)理編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞并且有利于巨噬細(xì)胞對它們進(jìn)行吞噬作用。特別地，使得巨噬細(xì)胞定向于診斷和/或治療目的，如下文更詳細(xì)描述的。因此，相對例如以檢測膜聯(lián)蛋白V為基礎(chǔ)的那些目前已知的診斷方法而言，使用抗-La抗體的優(yōu)勢之一是巨噬細(xì)胞對編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的調(diào)理和攝入導(dǎo)致抗體在編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞部位的巨噬細(xì)胞中抗體的積累，從而有助于成像。
關(guān)于成像，報道分子與去免疫單克隆抗體連在一起，然后導(dǎo)入宿主，例如人。通過檢測報道分子，能看得見細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡簇，例如與腫瘤相關(guān)的那些。一種特別有用的報道分子形式是胞核標(biāo)記。某些放射性同位素允許通過正電子發(fā)射X線斷層攝影術(shù)(PET)成像，一些配體有利于通過磁共振成像(MRI)檢測目標(biāo)結(jié)合。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及對人檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法，所述方法包括向所述患者引入用報道分子標(biāo)記的針對胞核分子或者其抗原決定簇的相互作用分子，使通過標(biāo)記的相互作用分子通過循環(huán)系統(tǒng)或者循環(huán)系統(tǒng)的選擇部分散播，然后對所述患者施用報道分子檢測方法以鑒定相互作用分子的定位。
優(yōu)選地，所述胞核分子是La。
更優(yōu)選地，所述相互作用分子是免疫活性分子，更優(yōu)選是抗-La抗體。
最優(yōu)選地，所述非-胞核定位是胞外定位，優(yōu)選地，定位在編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的胞質(zhì)中或者編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞形成的編程性細(xì)胞死亡體中。
優(yōu)選地，所述編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞是腫瘤特征。
優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤和其他兒科瘤，頭頸癌(例如鱗狀細(xì)胞癌)，乳房和前列腺癌，肺癌(小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)，腎癌(例如腎細(xì)胞腺癌)，食管胃癌，肝細(xì)胞癌，胰管膽汁瘤形成(例如腺癌胰腺內(nèi)分泌瘤)，結(jié)腸直腸癌，宮頸癌和肛門癌，子宮和其他生殖道癌，尿道癌(例如輸尿管和膀胱癌)，胚細(xì)胞腫瘤(例如睪丸胚細(xì)胞腫瘤或卵巢胚細(xì)胞腫瘤)，卵巢癌(例如卵巢上皮癌)，未知的原發(fā)癌，人免疫缺陷相關(guān)惡性腫瘤(例如Kaposi′s肉瘤)，淋巴瘤，白血病，惡性黑素瘤，肉瘤，內(nèi)分泌瘤(例如甲狀腺瘤)，間皮瘤和其他胸膜腫瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和癌樣腫瘤特征之一。
免疫基礎(chǔ)La檢測方法可以用各種各樣的形式。例如，每一個針對特定抗原或癌細(xì)胞包括La具有不同特異性的多種抗體在陣列中固定。然后使來自活組織檢查的細(xì)胞接觸抗體陣列并且以固定細(xì)胞為基礎(chǔ)診斷出腫瘤類型。
也可以進(jìn)行其他更常見的分析法，例如通過ELISA，蛋白質(zhì)印跡分析，免疫沉淀分析，免疫熒光分析，免疫化學(xué)分析或FACS分析。
因此，本發(fā)明提供對樣品檢測La或者其片段、變體或衍生物的方法，包括使樣品接觸抗體或其片段或衍生物，并且檢測包含所述抗體和La或其片段、變體或衍生物的復(fù)合體，其中La的非胞核定位是編程性細(xì)胞死亡的指征。
優(yōu)選地，所述非胞核定位是胞外定位，優(yōu)選地，定位在編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的胞質(zhì)中或者編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞形成的編程性細(xì)胞死亡體中。
如上所討論的，可以使用測定復(fù)合體形成的任何合適的技術(shù)。例如，可以在免疫分析中使用與報道分子締合的本發(fā)明的抗體。這樣的免疫分析包括但不限于放射免疫分析法(RIAs)，酶聯(lián)免疫吸附測試法(ELISAs)和免疫色譜技術(shù)(ICTs)，蛋白質(zhì)印跡，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，可以參考″Current Protocols in Immunology″，1994，它公開了可以根據(jù)本發(fā)明的使用的各種免疫分析法。免疫分析包括競爭測試法。應(yīng)該理解本發(fā)明包括定性和定量免疫分析法。
例如美國專利Nos.4,016,043，4,424,279和4,018,653中描述了合適的免疫測試技術(shù)。這些包括非競爭型單位點和兩-位點測試，以及傳統(tǒng)競爭結(jié)合測試法。這些測試法還包括指導(dǎo)標(biāo)記的抗原-結(jié)合分子與靶抗原結(jié)合，在這種情況下所述抗原是La或其片段。
兩-位點測試法在本發(fā)明的使用是特別有益的。有各種各樣的測試法，這些都包括在本發(fā)明內(nèi)。簡要地說，在典型的早期測試法中，沒有標(biāo)記的抗原-結(jié)合分子例如沒有標(biāo)記的抗體固定在固體底物上，并且將分析的樣品接觸結(jié)合的分子。保溫合適時間之后，讓抗體-抗原復(fù)合體形成足夠一段時間，然后加入另一種抗原-結(jié)合分子，是用能產(chǎn)生可檢測信號的報道分子標(biāo)記的對抗原特異性的合適的二抗。將沒有反應(yīng)的材料全部清洗掉，并且通過觀察報道分子產(chǎn)生的信號來測定抗原的存在。通過簡單觀察可視信號獲得定性結(jié)果，或者通過與含有已知量的抗原的對照樣品相比較獲得定量結(jié)果。先前測試法的改變包括同時測試法，其中向結(jié)合的抗體同時加入樣品和標(biāo)記的抗體。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括容易顯現(xiàn)的小的改變。
在典型的早期測試中，對抗原或者其抗原部分有特異性的一抗與固體表面共價或被動結(jié)合。所述固體表面典型地是玻璃或聚合物，最常使用的聚合物是纖維素，聚丙烯酰胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。固體載體可以是管、小球、微片，或者適合進(jìn)行免疫分析法的任何其他表面。結(jié)合方法是本領(lǐng)域公知的，并且一般包括交聯(lián)共價結(jié)合或物理吸附，在用于分析樣品的制劑中洗滌聚合物-抗體復(fù)合體。然后向固相復(fù)合體加入要分析的樣品等份并且溫育足夠一段時間，讓存在的抗原與抗體結(jié)合。溫育一段時間之后，洗滌抗原-抗體復(fù)合體并且干燥并且與對于抗原的一部分具有特異性的二抗溫育。二抗一般已經(jīng)與報道分子締合用來指示二抗與抗原的結(jié)合。根據(jù)締合的報道分子測定的，結(jié)合的標(biāo)記的抗體的量和與固定化一抗結(jié)合的抗原的量呈正比。
另一種方法涉及在生物樣品中固定抗原，然后讓固定的抗原接觸特異性抗體，所述抗體可以是用報道分子標(biāo)記的或沒有標(biāo)記的。根據(jù)靶物的量和報道分子信號強度，通過用抗體直接標(biāo)記可以檢測結(jié)合的抗原?；蛘?，讓對一抗特異性的標(biāo)記的二抗接觸靶物-一抗復(fù)合體，形成靶物-一抗-二抗三元復(fù)合體。通過報道分子發(fā)射的信號檢測復(fù)合體。
如上所述，可以理解與抗原-結(jié)合分子締合的報道分子可以包括下面的(a)報道分子與抗體直接連接；(b)報道分子與抗體間接連接；即，報道分子與另一種分析試劑連接，其接著與抗體結(jié)合；和(c)與抗體的隨后反應(yīng)產(chǎn)物連接。
報道分子可以從包括下面物質(zhì)的組中選擇色原體，催化劑，酶，熒光染料，化學(xué)發(fā)光分子，順磁離子，鑭系離子例如銪(Eu34)，放射性同位素，包括其他胞核標(biāo)簽，半導(dǎo)體量子點(Wu等，NatureBiotechnol 2002)和直接目測標(biāo)記。通過與配對物例如增強綠色熒光蛋白(EGFP)融合可以制備重組抗體-樣分子。
在直接目測標(biāo)記情況下，可以使用膠態(tài)金屬或非金屬顆粒，染料顆粒，酶或底物，有機聚合物，膠乳顆粒，脂質(zhì)體，或者其他含有產(chǎn)生信號的物質(zhì)等的囊泡。
美國專利Nos.U.S.4,366,241，U.S.4,843,000，和U.S.4,849,338描述了大量適合用作報道分子的酶。本發(fā)明中使用的合適的酶包括堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，熒光素酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，溶菌酶，蘋果酸脫氫酶等等。酶可以單獨使用或者與溶液中第二種酶聯(lián)合使用。
合適的熒光染料包括但不限于，熒光素異硫氰酸酯(FITC)，四甲基若丹明異硫氰酸酯(TRITC)，R-藻紅蛋白(RPE)和Texas紅。
其他舉例的熒光染料包括下面文獻(xiàn)討論的那些Dower等，國際公開No.WO 93/06121。也可以參考Singer等美國專利No.5,573,909，和Brinkley等美國專利No.5,326,692描述的熒光染料?；蛘撸梢詤⒖济绹鴮＠鸑os.5,227,487，5,274,113，5,405,975，5,433,896，5,442,045，5,451,663，5,453,517，5,459,276，5,516,864，5,648,270和5,723,218描述的熒光染料。
在酶免疫測試法情況下，酶與二抗偶聯(lián)，一般利用戊二醛或高碘酸鹽。然而，容易理解，有本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲取的各種各樣的不同偶聯(lián)技術(shù)。要使用的帶有特異性酶的底物一般被選來通過相應(yīng)的酶水解時產(chǎn)生可檢測的顏色變化。合適的酶的例子包括上文描述的那些。還可以使用熒光基質(zhì)，得到除了上面提到的產(chǎn)色底物的熒光產(chǎn)物。在所有的情況下，酶-標(biāo)記抗體加給一抗-抗原復(fù)合體，使結(jié)合，然后洗滌過量的試劑。然后將含有合適底物的溶液加給抗體-抗原-抗體復(fù)合體。底物和與二抗連接的酶反應(yīng)，給出定性可視信號，其可以進(jìn)一步定量化，通常是分光光度分析法，給出樣品中存在的抗原的量的指示。
或者，熒光化合物，例如熒光素，若丹明和鑭系，銪(EU)，可以與抗體化學(xué)偶聯(lián)而不改變它們的結(jié)合能力。當(dāng)通過特定波長光照明激活時，熒光染料-標(biāo)記的抗體吸附光能，誘發(fā)分子應(yīng)激狀態(tài)，接著發(fā)出用光學(xué)顯微鏡可目測檢測的特征顏色的光。讓熒光-標(biāo)記抗體結(jié)合一抗-抗原復(fù)合體。洗掉沒有結(jié)合的試劑之后，然后將殘留的三元復(fù)合體暴露給合適波長的光。觀察到的熒光指示感興趣的抗原的存在。免疫熒光測定法(IFMA)在本領(lǐng)域是確定的并且特別用于本發(fā)明方法。然而，也可以使用其他報道分子，例如放射性同位素，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或生物發(fā)光分子。
本發(fā)明的方法用作認(rèn)為有發(fā)生以細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征的發(fā)展或病癥(例如腫瘤)危險的那些個體的一個結(jié)束試驗或者作為發(fā)展的監(jiān)測器，或者作為針對抑制或者另外減緩這樣一種病癥進(jìn)程的治療性或預(yù)防性治療功效的監(jiān)測器。在這些情況下，將一類或幾類生物樣品中La水平的調(diào)節(jié)作圖，是個體狀態(tài)或目前使用的治療性或預(yù)防性治療功效的有價值的指標(biāo)。因此，應(yīng)該理解本發(fā)明的方法延伸至個體相對于它們正常水平(如上文定義的)或者相對于從所述個體的生物樣品測定的一個或多個較早標(biāo)記物水平的標(biāo)記物水平升高或降低的監(jiān)測。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及針對胞核分子的相互作用分子在制備檢測來自患者的生物樣品中編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的定量或半定量診斷試劑盒的用途。試劑盒可以帶有使用說明書，并且可以是自動或半自動的或者是與自動機器或軟件相匹配的形式。
優(yōu)選地，所述胞核分子是La。
優(yōu)選地，所述編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞是編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞。
不在任何方面限制試劑盒的應(yīng)用，用于在診斷和研究應(yīng)用中檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞。目前，市場上有很多體外檢測編程性細(xì)胞死亡的試劑，包括膜聯(lián)蛋白V，線粒體滲透性染料，APO2.7(僅在編程性細(xì)胞死亡期間識別線粒體蛋白質(zhì)的單克隆抗體)，DNA結(jié)合熒光染料，例如碘化丙錠和7-氨基放線菌素D(7-AAD)，和熒光半胱天冬酶抑制劑。然而，這些試劑不能區(qū)別編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞(H.Lecoeur等，J Immunol Methods 2002)，并且需要一種以上來特異性鑒定晚編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞(P.Smolewski等，J.Immunol Methods2002；Hamel等，Cytometry25(2)173-181，1996)。
根據(jù)本發(fā)明，抗La抗體的產(chǎn)生是針對活性或非活性形式分子的。
除了本發(fā)明方法的毫無疑問的診斷效益外，精確靶向編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的能力現(xiàn)在提供以定位和高度定向方式的送遞治療性和/或預(yù)防性治療方法。迄今為止，這樣的治療(經(jīng)常稱作″魔力彈″)還是不可能的。特別地，就腫瘤治療來說，由于不可能鑒定抗體所針對的合適的腫瘤特異性抗原的事實，定向治療概念還是不可能的。然而，本發(fā)明通過定向?qū)Πㄊ茉囌吣[瘤的編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞實施治療性或預(yù)防性治療，克服了這些缺點。通過選擇能與抗-La免疫活性分子偶聯(lián)、但是對位于接近編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的非編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞發(fā)揮功能的治療性或預(yù)防性效應(yīng)子機理，能實現(xiàn)腫瘤的有效殺傷。受試者效應(yīng)子機理可以采取任何合適形式，但是優(yōu)選送遞毒性分子或另外殺死鄰近位置的非編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞。
此外，象人IgGI和IgG3這樣的抗體有利于已經(jīng)用抗-La抗體調(diào)理過的編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的吞噬作用。不將本發(fā)明局限于任何一種理論或作用方式，抗-La抗體變得體內(nèi)瞄向并且聚積在巨噬細(xì)胞或其他有吞噬作用的細(xì)胞中。經(jīng)歷編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞首先分成膜-結(jié)合部分或編程性細(xì)胞死亡體，其接著被周圍的細(xì)胞，特別是被已知是巨噬細(xì)胞的專業(yè)清除劑細(xì)胞處理?？?La抗體體外和體內(nèi)特異性識別編程性細(xì)胞死亡過程中特定階段的編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞。此外，抗-La抗體優(yōu)先體內(nèi)位于巨噬細(xì)胞，它吞噬編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞。巨噬細(xì)胞對心臟病發(fā)作，中風(fēng)和器官移植排異中發(fā)生的組織損傷的愈合有貢獻(xiàn)。癌有高含量的已知為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，其可以延遲或促進(jìn)癌的生長。因此，抗-La抗體作為對用于送遞治療活性技術(shù)的載體。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及對受試者治療性和/或預(yù)防性治療以細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征的病癥的方法，所述方法包括在足以治療所述病癥的時間和條件下，對所述受試者施用有效量的針對胞核分子或者其抗原片段的相互作用分子，所述相互作用分子與治療性或預(yù)防性效應(yīng)子結(jié)構(gòu)連接、鍵合或另外締合。
優(yōu)選地，所述胞核分子是La。
更優(yōu)選地，所述相互作用分子是免疫活性分子，更優(yōu)選是抗-La抗體。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述病癥是心肌或腦組織梗塞，自身免疫和其他炎癥疾病，病毒疾病，例如AIDS，神經(jīng)退化疾病，例如早老性癡呆或帕金森病，急性實體器官或骨髓移植排異，化療或放療引起的組織損傷(′粘膜炎′)或瘤，如腫瘤。
本發(fā)明所涉及的腫瘤和腫瘤細(xì)胞包括但不限于，中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤和其他兒科瘤，頭頸癌(例如鱗狀細(xì)胞癌)，乳房和前列腺癌，肺癌(小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)，腎癌(例如腎細(xì)胞腺癌)，食管胃癌，肝細(xì)胞癌，胰管膽汁瘤形成(例如腺癌胰腺內(nèi)分泌瘤)，結(jié)腸直腸癌，宮頸癌和肛門癌，子宮和其他生殖道癌，尿道癌(例如輸尿管和膀胱癌)，胚細(xì)胞腫瘤(例如睪丸胚細(xì)胞腫瘤或卵巢胚細(xì)胞腫瘤)，卵巢癌(例如卵巢上皮癌)，未知的原發(fā)癌，人免疫缺陷相關(guān)惡性腫瘤(例如Kaposi′s肉瘤)，淋巴瘤，白血病，惡性黑素瘤，肉瘤，內(nèi)分泌瘤(例如甲狀腺瘤)，間皮瘤和其他胸膜腫瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和癌樣腫瘤。
關(guān)于″胞核分子″，″La″，″免疫活性分子″，″受試者″和″編程性細(xì)胞死亡″應(yīng)該理解具有和上面提到的相同的意義。
本發(fā)明更特別提供對受試者治療性和/或預(yù)防性治療腫瘤病癥的方法，所述方法包括在足以抑制、減小或另外減量調(diào)節(jié)腫瘤生長的時間和條件下，對所述受試者施用有效量的針對La或者其抗原部分的免疫活性分子，所述免疫活性分子與治療性或預(yù)防性效應(yīng)子結(jié)構(gòu)連接、鍵合或另外締合。
優(yōu)選地，所述腫瘤病癥是惡性腫瘤。
關(guān)于″效應(yīng)子結(jié)構(gòu)″應(yīng)該理解為是指當(dāng)位于編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞位點時直接或間接治療組織中的病癥、例如減量調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長的任何合適的結(jié)構(gòu)。在這個優(yōu)選的實施方案中，效應(yīng)子結(jié)構(gòu)最可能是實現(xiàn)這個結(jié)果的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子或者分子的基團(tuán)。適合在本發(fā)明方法中使用的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)的例子包括但不限于(i)已經(jīng)與細(xì)胞因子、趨化因子或發(fā)揮誘導(dǎo)或增強免疫應(yīng)答的一個或幾個方面的其他因子，例如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和/或T細(xì)胞激活劑連接，從而增加旁觀者殺傷的抗體的應(yīng)用。例如，趨化性肽，N-甲?；?甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)(Morikawa等，CancerImmunol Immunother 27(1)1-6，1988)和新的細(xì)菌脂肽，JBT 2002(Shinohara等，J Immunother 23(3)321-331，2000)是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的兩種激活劑。
(ii)與毒素偶聯(lián)的抗體的應(yīng)用。
關(guān)于″毒素″應(yīng)該理解是指實現(xiàn)提供減小、防止或另外抑制受試者細(xì)胞增殖、分化或維持(這里稱作所述細(xì)胞的“減量調(diào)節(jié)生長”)的信號的目的的任何合適的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子。所述毒素可以通過各種各樣的方法起作用，包括通過與受試者細(xì)胞直接接觸提供信號或者發(fā)射分子或粒子，例如在放射性同位素毒素情況下放射，對受試者細(xì)胞提供信號。優(yōu)選地，毒素是放射性同位素，更優(yōu)選是在短時間內(nèi)高度毒性并且有短的半衰期，從而使對周圍鄰近的非靶物細(xì)胞非故意毒性的發(fā)生最小化的放射性同位素。最特別地，所述放射性同位素是發(fā)射放射性同位素的α粒子。然而，應(yīng)該理解，放射性同位素不局限于發(fā)射放射性同位素的α粒子，而根據(jù)臨床情況可以包括β-和γ-發(fā)射放射性同位素。適合在本發(fā)明方法中使用的α-發(fā)射放射性同位素的例子包括但不限于，Tb-149或Bi-213。應(yīng)該理解在本發(fā)明方法中使用的毒素可以是純化、部分純化或沒有純化的形式。它還形成較大分子的一個成分。毒素可以是天然存在的或者可以合成或重組制備。
應(yīng)該理解落在“毒素”范圍內(nèi)的分子的其他例子包括蓖麻毒素，colicheamicin，前體藥物(如抗體-定向前體藥物轉(zhuǎn)化酶療法[ADEPT])和新的生物治療物質(zhì)，例如催化抗體。
應(yīng)該理解本發(fā)明的方法可以體內(nèi)或體外進(jìn)行。體外應(yīng)用的例子包括但不限于，含有腫瘤細(xì)胞的生物樣品的體外清除。例如，從患者取出骨髓和/或血液，根據(jù)本發(fā)明的方法清除并殺死腫瘤細(xì)胞，然后輸回給患者。目前使用這種方法，但是以較不明顯的定向方式，避免與MHC不相容骨髓移植相關(guān)的大的風(fēng)險。
關(guān)于與抗-La，例如抗體或其他免疫活性分子“連接、鍵合或另外締合”的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)應(yīng)該理解是指實現(xiàn)兩個分子連接的共價或非共價相互作用機理。這包括但不限于使用肽鍵，離子鍵，氫鍵，范德華力或任何其他相互作用鍵合機理。
關(guān)于細(xì)胞或腫瘤的″生長″應(yīng)該理解是指受試者細(xì)胞的增殖、分化和/或存活維持，而細(xì)胞或腫瘤的″減量調(diào)節(jié)生長″是指細(xì)胞衰老過程或者指減少、防止或抑制受試者細(xì)胞的增殖、分化和/或存活維持。在優(yōu)選的實施方案中，受試者生長是增殖而受試者減量調(diào)節(jié)是殺死。在這點上，通過對細(xì)胞送遞致命打擊或者對細(xì)胞送遞誘導(dǎo)細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡信號可以實現(xiàn)殺死細(xì)胞。
關(guān)于″治療性″或″預(yù)防性″″治療″認(rèn)為是其廣義意義。術(shù)語″治療″不一定暗示受試者得以治療完全恢復(fù)。類似地，″預(yù)防性″不必然指受試者最后不感染疾病。因此，治療和預(yù)防包括特定病癥征兆的減輕或者防止或另外減小產(chǎn)生特定病癥的危險。術(shù)語″預(yù)防″可以認(rèn)為是減小特定病癥的嚴(yán)重度或起始?！逯委煛逡部梢詼p小已經(jīng)存在的病癥的嚴(yán)重程度。
不將本發(fā)明局限于任何理論或作用模式，抗癌治療通常通過編程性細(xì)胞死亡殺死，但是在很多晚期癌癥情況下，一些癌細(xì)胞抵抗可以通過特定抗癌治療誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡。這些編程性細(xì)胞死亡-抗性細(xì)胞是疾病臨床復(fù)發(fā)的根源，最后殺死晚期癌癥的大部分患者和很大一部分早期癌癥患者。那些晚期癌癥患者表現(xiàn)出相應(yīng)治療的最初藥征，因為證明體內(nèi)腫瘤細(xì)胞殺傷，如果還使用了另一種非交叉抗性治療藥征，則可以另外贏得存活和生活質(zhì)量。因此，正如詳細(xì)描述的，使用本發(fā)明方法對有應(yīng)答的癌癥患者進(jìn)行診斷，能鑒定從用治療性偶聯(lián)物或雜合融合蛋白補充治療獲益的那些患者。
在輔助臨床情形下使用抗-La抗體也是有益的。雖然早期乳房和結(jié)腸癌通過手術(shù)能治愈，但是有明顯并且不能治愈的全身復(fù)發(fā)的風(fēng)險，因為，原發(fā)腫瘤具有某些高風(fēng)險特征和/或局部淋巴結(jié)包含轉(zhuǎn)移的那些患者，可能已經(jīng)存在了沒有檢測出的全身微轉(zhuǎn)移。這樣，輔助化療和/或輔助激素治療(在乳房癌情況下)治愈另外一小部分的這些患者，大概因為成功清除了全身微轉(zhuǎn)移。
此外，雖然因為沒有血液供應(yīng)休眠腫瘤保持小的狀態(tài)，但是損害中的腫瘤細(xì)胞快速更新，其細(xì)胞分裂速度與編程性細(xì)胞死亡速度平衡。因此，甚至休眠腫瘤也是本發(fā)明技術(shù)的合適的靶物。在臨床明顯轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移這兩種情況下，編程性細(xì)胞死亡-抗性癌細(xì)胞能與易受影響的癌細(xì)胞混合。如果對通過第一次治療使得編程性細(xì)胞死亡的附近癌細(xì)胞送遞腫瘤殺傷的非交叉抗性和/或協(xié)同方法，則能發(fā)生這些存活癌細(xì)胞補充殺傷。以旁觀殺傷潛力幫助這項技術(shù)的另外的技術(shù)能改進(jìn)它的治療效果。
因此，本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案涉及轉(zhuǎn)移癌的治療。
根據(jù)這個優(yōu)選實施方案，提供對受試者治療性治療轉(zhuǎn)移癌的方法，所述方法包括在足以抑制、減小或另外減量調(diào)節(jié)所述轉(zhuǎn)移癌生長的時間和條件下，對所述受試者施用有效量的針對La或者其抗原部分的免疫活性分子，所述免疫活性分子與治療性效應(yīng)子結(jié)構(gòu)連接、鍵合或另外締合。
如上文詳細(xì)描述的，本發(fā)明還應(yīng)該理解延伸至體外環(huán)境下腫瘤細(xì)胞生長的減量調(diào)節(jié)。例如，可以從骨髓或外周血肝細(xì)胞的培養(yǎng)液清除腫瘤細(xì)胞，然后自身移植。
″有效量″意思是至少部分獲得期望響應(yīng)，或者推遲發(fā)生或抑制進(jìn)程或者兩者均停滯所治療的特定病癥的發(fā)生或發(fā)展所必需的量。這個量根據(jù)下面的因素而變化待治療的個體的健康和身體狀況，待治療的個體的分類組，期望的保護(hù)程度，組合物制劑，醫(yī)學(xué)情形評價，和其他相關(guān)因素。預(yù)期這個量落在能通過常規(guī)試驗確定的相對寬的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及聯(lián)合治療，例如在癌癥治療中施用本發(fā)明抗體的同時，使哺乳動物接受循環(huán)細(xì)胞毒性藥物或放療。
通過任何方便的方法可以實施藥物組合物形式的相互作用分子(這里稱作″調(diào)節(jié)劑″)的給藥。當(dāng)以根據(jù)特定情況的量給藥時，藥物組合物的調(diào)節(jié)劑表現(xiàn)出治療活性。變化取決于例如人或動物和調(diào)節(jié)劑的選擇。可以使用寬范圍劑量?？紤]到患者，對于每千克體重每天可以施用例如大約0.1mg至大約1mg的調(diào)節(jié)劑?？梢哉{(diào)節(jié)給藥方案，提供最佳治療反應(yīng)。例如，可以連續(xù)、每天、每周、每月或者其他合適的時間間隔以幾個分開的劑量給藥，或者根據(jù)其情形的緊急狀況按比例減小劑量。
可以以適當(dāng)方式施用調(diào)節(jié)劑，例如通過口服，靜脈內(nèi)(水溶性情況下)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，真皮內(nèi)或栓劑途徑或埋入(例如使用緩釋分子)?？梢砸运帉W(xué)可接受無毒鹽形式施用調(diào)節(jié)劑，例如酸加成鹽或金屬絡(luò)合物，例如與鋅、鐵等的鹽或金屬絡(luò)合物(其認(rèn)為是為了本申請目的的鹽)。這樣的酸加成鹽的例證是鹽酸鹽，氫溴酸鹽，硫酸鹽，磷酸鹽，馬來酸鹽，乙酸鹽，檸檬酸鹽，苯甲酸鹽，琥珀酸鹽，蘋果酸鹽，抗壞血酸鹽，酒石酸鹽等等。如果要施用的活性成分是片劑形式，片劑可以含有粘合劑，例如黃蓍膠，玉米淀粉或明膠；崩解劑，例如藻酸；和潤滑劑，例如硬脂酸鎂。
給藥途徑包括但不限于，呼吸，氣管內(nèi)，鼻咽，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，顱內(nèi)，真皮內(nèi)，肌內(nèi)，眼內(nèi)，大腦內(nèi)，鼻內(nèi)，輸入，口服，直腸給藥，通過IV滴注、貼劑和植入物。
根據(jù)這些方法，根據(jù)本發(fā)明限定的藥物可以和一種或幾種其他化合物或分子共同給藥。所謂″共同給藥″意思是在相同的制劑中或者以兩個分開的制劑，通過相同或不同途徑同時給藥，或者通過相同或不同途徑依次給藥。例如，為了增強效果，本發(fā)明藥物可以與激動劑一起給藥。所謂″依次″給藥意思是施用兩種類型分子之間間隔數(shù)秒、數(shù)分鐘、數(shù)小時或者數(shù)天時間間隔。這些分子可以以任何順序給藥。
本發(fā)明另一方面涉及與效應(yīng)子結(jié)構(gòu)偶聯(lián)的抗-胞核分子相互作用分子用于制備對受試者治療病癥的藥物的用途，所述病癥以細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征，其中所述效應(yīng)子結(jié)構(gòu)治療所述病癥。
優(yōu)選地，所述胞核分子是La。
優(yōu)選地，所述相互作用分子是免疫活性分子，更優(yōu)選抗-La抗體，例如單克隆抗體。
最優(yōu)選地，所述胞核定位是胞外定位，如上面所定義的。
在另一個優(yōu)選實施方案中，所述病癥是心肌或腦組織梗塞，自身免疫和其他炎癥疾病，病毒疾病，例如AIDS，神經(jīng)退化疾病，例如早老性癡呆或帕金森病，急性實體器官或骨髓移植排異，化療或放療引起的組織損傷(′粘膜炎′)或瘤，如腫瘤。
本發(fā)明涉及的腫瘤和腫瘤細(xì)胞的例子包括但不限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤和其他兒科瘤，頭頸癌(例如鱗狀細(xì)胞癌)，乳房和前列腺癌，肺癌(小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)，腎癌(例如腎細(xì)胞腺癌)，食管胃癌，肝細(xì)胞癌，胰管膽汁瘤形成(例如腺癌胰腺內(nèi)分泌瘤)，結(jié)腸直腸癌，宮頸癌和肛門癌，子宮和其他生殖道癌，尿道癌(例如輸尿管和膀胱癌)，胚細(xì)胞腫瘤(例如睪丸胚細(xì)胞腫瘤或卵巢胚細(xì)胞腫瘤)，卵巢癌(例如卵巢上皮癌)，未知的原發(fā)癌，人免疫缺陷相關(guān)惡性腫瘤(例如Kaposi′s肉瘤)，淋巴瘤，白血病，惡性黑素瘤，肉瘤，內(nèi)分泌瘤(例如甲狀腺瘤)，間皮瘤和其他胸膜腫瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和癌樣腫瘤。
另一方面，本發(fā)明涉及含有上文定義的調(diào)節(jié)劑和一種或幾種藥學(xué)可接受載體和/或稀釋劑的藥物組合物。所述調(diào)節(jié)劑指活性成分。
適合注射使用的藥物形式包括用于無菌注射液或分散體的臨時制劑的無菌水溶液(水溶性情況下)或分散體和無菌粉末劑，或者可以是乳膏形式或者適局部施用的任何形式。它在制備和儲存條件下必須是穩(wěn)定的并且必須保留抗微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是含有，例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液體聚乙二醇等)，其合適的混合物，以及植物油。通過使用包衣例如卵磷脂，在分散體情況下通過保持所需要的粒度以及通過使用表面活性劑可保持合適的流動性。通過各種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚、山梨酸、硫柳汞等可防止微生物作用。在很多情況下，優(yōu)選包括等張劑，例如，糖或氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠可實現(xiàn)可注射組合物的延長吸收。
根據(jù)需要，通過向合適溶劑中加入必需量的活性化合物和上面例舉的各種其他成分，接著滅菌過濾來制備無菌可注射液。一般情況下，通過向含有基本分散介質(zhì)和上面例舉的那些必需的其他成分的無菌賦形劑中加入各種無菌活性成分來制備分散體。在用于制備無菌注射液的無菌粉末劑情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干技術(shù)，得到活性成分加來自其事先無菌過濾的溶液的另外期望的成分的粉末劑。
當(dāng)活性成分被適當(dāng)保護(hù)時，它們可以例如用惰性稀釋劑或用可同化食用載體口服給藥，或者密封在硬或軟殼體明膠膠囊，或者可以壓制成片，或者可以直接與食品混合。對于口服治療性給藥，活性化合物可以與賦形劑混合并且以可吸收片劑、口腔片劑、錠劑、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿、紙囊劑等形式使用。這樣的組合物和制劑應(yīng)該含有至少1％重量的活性化合物。當(dāng)然，組合物和制劑的百分比可以變化，并且適宜地在大約5％至大約80％重量單位之間。這樣的治療用組合物中活性化合物的量為獲得合適的劑量。制備根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的組合物或制劑，使得口服劑量單位形式含有大約0.1微克至2000mg之間的活性化合物。
片劑、錠劑、膠囊等還可以含有下面列出的成分可以加入粘合劑，例如樹膠，阿拉伯膠，玉米淀粉或明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉，馬鈴薯淀粉，藻酸等等；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；和甜味劑，例如蔗糖，乳糖或糖精，或者矯味劑，例如薄荷，冬綠樹油，或櫻桃調(diào)味料。當(dāng)劑量單位形式是膠囊，其除了上面類型材料之外可以含有液體載體?？梢源嬖诟鞣N其他材料，如包衣或者另外改變劑量單位的物理形式。例如，片劑，丸劑或膠囊可以用蟲膠糖或者兩者來包衣。糖漿或酏劑可以含有活性化合物，作為甜味劑的蔗糖，作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯，染料和矯味劑，例如櫻桃或橙子調(diào)味料。當(dāng)然，在制備單位劑量形式中使用的任何材料應(yīng)該是藥學(xué)純的并且在使用量時基本上是無毒的。另外，活性化合物可以加入到緩釋制品和制劑中。
還有，本發(fā)明的另一方面涉及上文定義的當(dāng)在本發(fā)明方法中使用的藥物。
通過下面非限制性實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實施例1這里使用的抗-La抗體是小鼠單克隆抗體雜交瘤3B9，它識別小核糖核蛋白抗原La/SS-B的人和小鼠形式?？贵w來源于Tom Gordon教授，F(xiàn)linders Medical Centre，Adelaide，South Australia，他是從Oklahoma Medical Research Foundation，Oklahoma City，Oklahoma，USA的M.Bachmann博士那里獲得的。Dr.Gordon的工作組公開了3B9(Tran等2002a)。相應(yīng)的同種型對照抗體雜交瘤是Sal5。
對六只野生型(ST)C57BL/6雄性小鼠(七周齡)或兩只六月齡小鼠前列腺轉(zhuǎn)基因腺癌(TRAMP)小鼠(第1欄)每天兩次給予400微升正常人血清(NHS)或含有La-反應(yīng)自身抗體的人血清(La血清)靜脈內(nèi)注射。在第一次注射這一天保持小鼠完整或者手術(shù)閹割(第2欄)。第二次注射兩天之后將小鼠殺死用于分析。對注射了La血清的所有小鼠通過ELISA測定與小鼠La交叉反應(yīng)的hIgG的高水平。用NHS的負(fù)對照顯示和沒有注射正常小鼠血清(NMS)一樣的低的結(jié)合背景水平(第3欄)。ELISA中使用雞蛋溶菌酶(HEL)作為陰性對照(第4欄)。通過定量ELISA直接測定hIgG的血清水平，并且發(fā)現(xiàn)比以前敘述的實驗高得多(Tran等，2002b)。對懷孕BALB/c小鼠注射La血清并且血清hIgG范圍是0.01至0.4g/L，其產(chǎn)生好的胎兒編程性細(xì)胞死亡心肌細(xì)胞的調(diào)理作用(第5欄)。通過TUNEL測定法測定前列腺上皮編程性細(xì)胞死亡程度。表中指示的數(shù)字代表在整個切片上可獲得的前列腺上皮層中檢測的TUNEL+核。對幾乎所有動物的前列腺腔中檢測到的眾多TUNEL+粒子不計數(shù)。與完整小鼠相比，閹割小鼠有增加編程性細(xì)胞死亡的傾向(第6欄)。對閹割并且給與La血清注射的三只小鼠中的一只檢測hIgG與編程性細(xì)胞死亡前列腺上皮細(xì)胞的結(jié)合(第7欄)。在這種情況下，在前列腺腔檢測到明亮顆粒hIgG包被的眾多TUNEL+細(xì)胞。在上皮及其表面也見到hIgG與TUNEL+細(xì)胞的結(jié)合。連續(xù)(毗連)切片的免疫標(biāo)記提示這些免疫復(fù)合體的附近存在MHC-II+和F4/80+細(xì)胞(沒有給出數(shù)據(jù))。明顯地，對注射NHS的動物或者注射La血清但是沒有閹割的動物沒有檢測到hIgG的結(jié)合。作為另外的對照，對用La血清或NHS注射的所有動物測定充足背景空隙和血管內(nèi)hIgG(前列腺，脾，肝，唾液腺)，保持hIgG可檢測血清水平。正如所預(yù)期的，測定脾和胸腺中眾多的編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞，特別地，脾顯示明顯的hIgG散斑染色(血液組織屏障在這種組織中低)沒有相關(guān)的TUNEL染色。閹割之后在唾液腺中幾乎檢測不到編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞，與腺上皮中閹割導(dǎo)致的編程性細(xì)胞死亡是前列腺特異性的想法相吻合。
表3.實驗結(jié)果的制表和敘述性概述
實施例2抗-LA抗體結(jié)合編程性細(xì)胞死亡和壞死細(xì)胞體外誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡并發(fā)展，編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞逐漸變得遺漏，因為喪失了膜的完整性，其表現(xiàn)出漸增的分別對于核酸和DNA結(jié)合染料，碘化丙錠(PI)和7-氨基-放線菌素D(7AAD)的親合力。與PI結(jié)合相比，抗La-抗體與編程性細(xì)胞死亡的結(jié)合具有更慢的時間。然而，觀察到的抗La-抗體染色的熒光強度表明，它以類似的親和性與編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞結(jié)合，而不管PI染色是否是高或中等強度(圖3)。如下所示，PI中間值亞群包括編程性細(xì)胞死亡體。中間染色不是中止人為現(xiàn)象的結(jié)果，因為無論PI濃度的改變它均存在。
因此，抗-La抗體與編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞結(jié)合是作為體外編程性細(xì)胞死亡進(jìn)程的膜完整性損失的函數(shù)。然而，抗-La抗體與編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞結(jié)合不是簡單的mAb的被動結(jié)合事件，因為用同種型對照mAb Sal5染色的熒光強度比3B9(抗-單克隆抗體)熒光強度低一個log-fold，這表明3B9與它的靶抗原人La/SS-B特異性結(jié)合(畫面上組和中組，圖4)。識別細(xì)胞支架成分的抗-微管蛋白mAb也證明與編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞結(jié)合的高水平，它比3B9結(jié)合較少的PI中間值編程性細(xì)胞死亡體(畫面下組，圖2)(總PI+事件的46％，參考69％)。
圖示說明圖4中所示的一些數(shù)據(jù)，并且在各個時間點比較沒有臺盼藍(lán)的細(xì)胞的百分比，其是細(xì)胞存活力喪失的另一個指征(圖5)。毫無疑問，抗-La抗體與編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞結(jié)合的動力學(xué)與細(xì)胞滲透性(微管蛋白)的已知標(biāo)記物和細(xì)胞存活力喪失(臺盼藍(lán))相比較，這支持與編程性細(xì)胞死亡相關(guān)的膜完整性喪失允許抗-La抗體結(jié)合的想法。
如圖6闡明的，來自編程性細(xì)胞死亡Jurkat細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡體大小是穩(wěn)定的(畫面下組，圖6)，幾乎持續(xù)四天的時間，可與3B9染色強度(畫面上組，圖6)相比。
使用膜聯(lián)蛋白V探測外質(zhì)膜上暴露的磷脂酰絲氨酸進(jìn)行抗-La抗體與編程性細(xì)胞死亡Jurkat細(xì)胞結(jié)合的進(jìn)一步動力學(xué)分析，外質(zhì)膜上暴露的磷脂酰絲氨酸是編程性細(xì)胞死亡的早期特征，并且7AAD結(jié)合遺漏細(xì)胞的DNA，它是晚期編程性細(xì)胞死亡特征。這個分析再次表明抗-La抗體結(jié)合是與7AAD結(jié)合等同的，但是比膜聯(lián)蛋白V結(jié)合晚發(fā)生(圖7)。這個概念在圖8中以另一種方式展示。當(dāng)細(xì)胞是膜聯(lián)蛋白V-陽性而7AAD-陰性時，抗-La抗體結(jié)合在早期編程性細(xì)胞死亡期間不明顯(畫面左手組中R3，圖8)，但是一旦細(xì)胞變得對于7AAD可滲透，則抗-La抗體結(jié)合增加至高水平(畫面左手組中R1，圖8)。
為了強調(diào)抗-La抗體結(jié)合必需細(xì)胞膜完整性喪失，初級壞死細(xì)胞也證實對于抗-La抗體的急切的結(jié)合(圖9)。注意抗-La抗體染色與暴露在壞死細(xì)胞膜(圖9B)上的DNA或磷脂酰絲氨酸不共同定位(圖9A)。
實施例3抗-La抗體與編程性細(xì)胞死亡體的結(jié)合是半胱天冬酶3依賴性的如實施例2提到的，更詳細(xì)的流式細(xì)胞儀分析指示抗-La抗體結(jié)合編程性細(xì)胞死亡體，其特征在于它們較小的大小和減小的內(nèi)部復(fù)雜性，因為它們含有不同比例的膜結(jié)合的胞核成分和細(xì)胞器殘留物(圖10)。此外，證明編程性細(xì)胞死亡體形成對于抗-La抗體結(jié)合是必需的。MCF-7是沒有原半胱天冬酶3基因的人乳房癌細(xì)胞系。
原半胱天冬酶3是決定性的executioner半胱天冬酶3的酶原形式，它催化死亡細(xì)胞中很多功能和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的裂解。這些蛋白質(zhì)的半胱天冬酶3-介導(dǎo)的裂解對編程性細(xì)胞死亡體形成的形態(tài)外觀有貢獻(xiàn)，它將編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞分裂為幾種(或更多)已知是編程性細(xì)胞死亡體的較小的膜結(jié)合部分。雖然MCF-7細(xì)胞不能證明細(xì)胞死亡期間編程性細(xì)胞死亡體形成，通過將原半胱天冬酶3的基因轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中能挽救這種表型。
如圖10說明的，用原半胱天冬酶3的基因瞬時轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，產(chǎn)生編程性細(xì)胞死亡體并且接著結(jié)合抗-La抗體。因此，抗-La抗體與編程性細(xì)胞死亡體結(jié)合是半胱天冬酶3依賴性的。這些編程性細(xì)胞死亡體不用7AAD染色，其優(yōu)先染色DNA而不是RNA(畫面左下手組，圖10)。此外，當(dāng)通過散射標(biāo)準(zhǔn)評價時，編程性細(xì)胞死亡體大小更小(畫面右下手組，圖10)。
進(jìn)一步，研究用原半胱天冬酶3的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7。如圖11所示，使包含對照載體或原半胱天冬酶3基因的MCF-7細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡，并且用已經(jīng)用綠色熒光染料標(biāo)記的3B9、Alexa488和碘化丙錠染色(圖11A)。再一次證明抗-La抗體與編程性細(xì)胞死亡體結(jié)合需要半胱天冬酶3活性。這些細(xì)胞的熒光顯微鏡證明表達(dá)MCF-7轉(zhuǎn)染子的原半胱天冬酶3萌芽并且明顯分隔3B9+編程性細(xì)胞死亡體(圖11C)。另一方面，載體對照MCF-7細(xì)胞證明3B9染色較少分散模式(圖11C)，這與對載體對照MCF-7細(xì)胞的流式細(xì)胞儀觀察到的3B9染色廣泛分布相吻合(畫面右上手組，圖11A)。相反，如在圖10中，半胱天冬酶3活性帶來3B9染色的受限模式(畫面右下手組，圖11A)，這提示半胱天冬酶3活性導(dǎo)致編程性細(xì)胞死亡體中La/SS-B抗原的均勻分隔。
如圖12所示，利用編程性細(xì)胞死亡Jurkat細(xì)胞的同焦點激光掃描顯微鏡證明抗-La抗體染色既不與轉(zhuǎn)化磷脂酰絲氨酸的編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞膜染色重疊(根據(jù)膜聯(lián)蛋白V檢測的)，也不對DNA染色(根據(jù)TOPRO3檢測的)(圖13A)。此外，一連串垂直切片證實貫穿死亡細(xì)胞的胞質(zhì)區(qū)發(fā)生抗-La抗體染色。用3B9染色是特異性的，因為使用同種型對照物mAb，Sal5，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)任何染色(圖13B)。PARP，其是豐富的胞核抗原(包括大約2％的胞核蛋白質(zhì))并且在編程性細(xì)胞死亡期間半胱天冬酶3還將其裂解，當(dāng)用特異性mAb檢測時，采用相似于3B9的染色模式(圖12C)。這些數(shù)據(jù)一起提示抗-La抗體′加載′死亡細(xì)胞的胞質(zhì)(圖13)。
對胞核抗原例如胞襯蛋白特異性的其他mAb，其也被半胱天冬酶3裂解，因此對編程性細(xì)胞死亡體形成有貢獻(xiàn)，用與3B9展示的類似的染色模式對編程性細(xì)胞死亡Jurkat細(xì)胞染色(圖14)。對于對PCNA和核纖層蛋白B特異性的mAb也觀察到類似的染色模式。這些mAb證明根據(jù)7AAD檢測的不與DNA共同定位。事實上，7AAD傾向于限于外周編程性細(xì)胞死亡皰。相反，用抗-β微管蛋白mAb染色是一定程度上與7AAD染色一起定位的貫穿編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的證據(jù)。
抗-La抗體還結(jié)合編程性細(xì)胞死亡初級T細(xì)胞，包括大多數(shù)外周血單核細(xì)胞(PMBC)。然而，與初級T細(xì)胞結(jié)合的抗-La抗體的熒光強度比對惡性Jurkat T細(xì)胞觀察到的小大約一半對數(shù)倍(one half-logfold)，甚至事先用T細(xì)胞促細(xì)胞分裂劑，conconavalin A激活PBMC(圖15)。
實施例4抗其他胞核和核糖核抗原的其他單克隆抗體也結(jié)合編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞根據(jù)在同焦點激光掃描顯微鏡研究中觀察到的，流式細(xì)胞計證明多種mAb結(jié)合相似的動力學(xué)和模式?？?微管蛋白mAb作為可滲透編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞中胞質(zhì)結(jié)合的對照物(圖16)。類似地，這些mAb中的一些特異性結(jié)合用原半胱天冬酶3基因轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞之后形成的編程性細(xì)胞死亡體(圖17)。
實施例5抗人LA/SS-B的其他抗體也檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞研究了人抗-La自身抗體(圖18)和對人La/SS-B具有特異性的另一種mAb，克隆SW3對編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的結(jié)合(圖19)。
實施例6抗-LA抗體結(jié)合來自人和嚙齒動物物種的初級和惡性編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞除了結(jié)合編程性細(xì)胞死亡初級人細(xì)胞之外(圖15)，抗-La抗體還結(jié)合其中用地塞米松或staurosporine體外誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡死亡小鼠和大鼠胸腺的編程性細(xì)胞死亡初級細(xì)胞。抗-La抗體響應(yīng)任一種刺激物誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡而特異性結(jié)合PI+胸腺細(xì)胞(圖20)。使用抗增殖細(xì)胞胞核抗原(PCNA)的mAb觀察到相似結(jié)合模式?？?La抗體還結(jié)合來自嚙齒動物物種的編程性細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞(圖21)，包括響應(yīng)細(xì)胞毒性藥物體內(nèi)經(jīng)歷編程性細(xì)胞死亡的腫瘤細(xì)胞，以及多種編程性細(xì)胞死亡人和猴子腫瘤細(xì)胞系(圖22)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員明白這里描述的本發(fā)明除了具體描述的之外還容易進(jìn)行改變和修飾。理解本發(fā)明包括所有這樣的改變和修飾。本發(fā)明還包括該說明書單個地或概括地指出或指明的所有步驟和特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征的兩個或幾個的任何和所有的組合。
參考文獻(xiàn)Adams等，Cancer Res.534026-4034，1993。
Bachmann等，Proc Natl Acad Sci USA 83(20)7770-7774，1986。
Blankenberg等，Clin Cancer Res 2002。
Brinkley等，美國專利No.5,326,692。
Callahan等，Cell Death Different 7(7)645-653，2000。
Carmo-Fonseca等，ExpCell Res 185(1)73-85，1989。
Chothia等，J.Mol.Biol.196901，1987。
Chothia等，J.Mol.Biol.227799，1992。
Chou等(美國專利No.6,056,957)。
Coligan等，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，1991-1997。
Cumber等，J Immunol 149120-126，1992。
Davies & Riechmann，F(xiàn)EBS Lett.339285-290，1994。
Gefter等，Somatic Cell Genet.3.231-236，1977。
Glockshuber等，Biochem.291363-1367，1990。
H.Lecoeur等，J Immunol Methods 2002。
Hamel等Cytometry 25(2)173-181，1996。
Hamers-Casterman等，Nature 363446-448，1993。
Jones等，Nature 321.522-525，1986。
Kabat等，″Sequences of Proteins of Immunological Interest″，U.S.Department of Health and Human Services，1983。
Kennet等(編著)，Monoclonal Antibodies and HybridomasA NewDimension in Biological Analyses，pp.376-384，Plenum Press，New York，1980。
Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6(7)511-519，1976。
Kohler和Milstein，Nature 256495-499，1975。
Kostelny等，J.Immunol.1481547-1553，1992。
Kozbor等，Methods in Enzymology121140，1986。
Krahlung等Cell Death Different 6(2)183-189，1999。
Krebber等，J.Immunol.Methods 201(1)35-55，1997。
Ku & Schutz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926552-6556，1995。
Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443，1987。
Mamula等，J Immunol 143(9)2923-2928，1989。
Morgan等(美國專利No.6,180,377)。
Morikawa等，Cancer Immunol Immunother 27(1)1-6，1988。
P.Smolewski等，J Immunol Methods 2002。
Plunckthun等，In Antibody engineeringA practical approach203-252，1996。
Plunckthun，Biochem.311579-1584，1992。
Pruijn等，Eur J Biochem 232(2)611-619，1995。
Queen等(美國專利No.6,180,370)。
Ravirajan等，Lupus 1(3)157-165，1992。
Reiter等，Biochem.335451-5459，1994。
Reiter等，Cancer Res.542714-2718，1994。
Reiter等，J.Biol.Chem.26918327-18331，1994。
Richmann等，Nature 332323-327，1988。
Shinohara等，J Immunother 23(3)321-331，2000。
Shulman等，Nature276269-270，1978。
Singer等，美國專利No.5,573,909。
Toyama等，″Monoclonal Antibody，Experiment Manual″，KodanshaScientific，1987出版。
Tran等，Arthritis Rheum 46(1)202-208，2002。
Troster等，J Autoimmunity 8(6)825-842，1995。
Trowbridge，J.Exp.Med.148(1)313-323，1978。
Verhoeyen等，Science 239.1534-1536，1988。
Volk等，J.Virol.42(1)220-227，1982。
Ward等，Nature 341544-546，1989。
Webber等，Mol.Immunol.32249-258，1995。
Winter和Milstein，Nature 349293，1991。
Wu等，Nature Biotechnol 2002。
權(quán)利要求
1.對受試者或來自所述受試者的生物樣品檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法，所述方法包括用針對胞核分子或者其抗原部分的相互作用分子接觸所述受試者或所述生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物并且篩選相互作用分子-胞核分子復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的指征。
2.檢測生物樣品中編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的分析方法，所述方法包括下面的步驟(1)使針對胞核分子或者其抗原決定簇的相互作用分子與懷疑含有表達(dá)所述胞核分子的細(xì)胞的生物樣品接觸；和(2)對步驟(1)中形成的復(fù)合體進(jìn)行信號檢測步驟，其中檢測非胞核相互作用分子-胞核分子復(fù)合體形成是編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的指征。
3.對受試者檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法，所述方法包括向所述患者引入用報道分子標(biāo)記的針對胞核分子或者其抗原決定簇的相互作用分子，使標(biāo)記的分子通過循環(huán)系統(tǒng)或者向所述患者輸入針對循環(huán)系統(tǒng)選擇部分的相互作用分子傳播，然后對所述患者進(jìn)行報道分子檢測手段檢測以確定相互作用分子位置。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述胞核分子是Ro52，Ro60，La/SS-B，凝溶膠蛋白，α-胞襯蛋白，核仁纖維蛋白，U1小核核糖核蛋白質(zhì)(U1 snRNP)，異核核糖核蛋白質(zhì)(hnRNP)，核纖層蛋白B，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，SC-35剪接因子，Smith(Sm)抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述胞核分子是La。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中所述非胞核定位是胞質(zhì)的或者與編程性細(xì)胞死亡體有關(guān)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6任一項的方法，其中所述相互作用分子是免疫相互作用分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述免疫相互作用分子是抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中所述編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞是編程性細(xì)胞死亡心臟細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中所述編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤和其他兒科瘤，頭頸癌，乳房和前列腺癌，肺癌，腎癌，食管胃癌，肝細(xì)胞癌，胰管膽汁瘤形成，結(jié)腸直腸癌，宮頸癌和肛門癌，子宮和其他生殖道癌，尿道癌，胚細(xì)胞腫瘤，卵巢癌，未知的原發(fā)癌，人免疫缺陷相關(guān)惡性腫瘤，淋巴瘤，白血病，惡性黑素瘤，肉瘤，內(nèi)分泌瘤，間皮瘤和其他胸膜腫瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和癌樣腫瘤。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述頭頸癌是鱗狀細(xì)胞癌，所述肺癌是小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，所述腎癌是腎細(xì)胞腺癌，所述胰臟瘤是腺癌胰島細(xì)胞瘤，所述胚細(xì)胞腫瘤是睪丸癌或卵巢癌，所述卵巢癌是卵巢上皮癌，并且所述人免疫缺陷相關(guān)惡性腫瘤是Kaposis肉瘤，所述內(nèi)分泌瘤是甲狀腺瘤。
14.對受試者診斷或監(jiān)測以異常的不期望的或者另外不適當(dāng)?shù)募?xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征的病癥的方法，所述方法包括用針對所述胞核分子或者其抗原決定簇或表位的胞核分子-結(jié)合有效量的相互作用分子接觸所述受試者或來自所述受試者生物樣品的細(xì)胞或細(xì)胞提取物，并且定性或定量測定胞核分子-免疫相互作用分子復(fù)合體形成，其中所述復(fù)合體的非胞核定位是細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的指征。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述胞核分子是Ro52，Ro60，La/SS-B，凝溶膠蛋白，α-胞襯蛋白，核仁纖維蛋白，U1小核核糖核蛋白質(zhì)(U1 snRNP)，異核核糖核蛋白質(zhì)(hnRNP)，核纖層蛋白B，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，SC-35剪接因子，Smith(Sm)抗原。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述胞核分子是La。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16任一項的方法，其中所述非胞核定位是胞質(zhì)的或者與編程性細(xì)胞死亡體有關(guān)。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17任一項的方法，其中所述相互作用分子是免疫相互作用分子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述免疫相互作用分子是抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求14-20任一項的方法，其中所述編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞是編程性細(xì)胞死亡心臟細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求14-20任一項的方法，其中所述病癥是心肌或腦組織梗塞，自身免疫和其他炎癥疾病，病毒疾病，例如AIDS，神經(jīng)退化疾病，例如早老性癡呆或帕金森病，急性實體器官或骨髓移植排異，化療或放療引起的組織損傷(′粘膜炎′)或瘤，象腫瘤。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述病癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤或其他兒科瘤，頭頸癌，乳房和前列腺癌，肺癌，腎癌，食管胃癌，肝細(xì)胞癌，胰管膽汁瘤形成，結(jié)腸直腸癌，宮頸癌和肛門癌，子宮和其他生殖道癌，尿道癌，胚細(xì)胞腫瘤，卵巢癌，未知的原發(fā)癌，人免疫缺陷相關(guān)惡性腫瘤，淋巴瘤，白血病，惡性黑素瘤，肉瘤，內(nèi)分泌瘤，間皮瘤和其他胸膜腫瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和癌樣腫瘤。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述頭頸癌是鱗狀細(xì)胞癌，所述肺癌是小細(xì)胞肺癌或非小細(xì)胞肺癌，所述腎癌是腎細(xì)胞腺癌，所述胰臟瘤是腺癌胰島細(xì)胞瘤，所述胚細(xì)胞腫瘤是睪丸癌或卵巢癌，所述卵巢癌是卵巢上皮癌，所述人免疫缺陷相關(guān)惡性腫瘤是Kaposis肉瘤，并且所述內(nèi)分泌瘤是甲狀腺瘤。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-24任一項的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述哺乳動物是人。
27.針對胞核分子的相互作用分子用于制備檢測來自患者的生物樣品編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的定量、半定量或定性診斷試劑盒的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述胞核分子是Ro52，Ro60，La/SS-B，凝溶膠蛋白，α-胞襯蛋白，核仁纖維蛋白，U1小核核糖核蛋白質(zhì)(U1 snRNP)，異核核糖核蛋白質(zhì)(hnRNP)，核纖層蛋白B，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，SC-35剪接因子，Smith(Sm)抗原。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述胞核分子是La。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29的用途，其中所述相互作用分子是抗體。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的用途，其中所述抗體是單克隆抗體。
32.對受試者治療性和/或預(yù)防性治療以細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征的病癥的方法，所述方法包括在足以治療所述病癥的時間和條件下，對所述受試者施用有效量的針對胞核分子或其抗原部分的相互作用分子，所述相互作用分子與治療性或預(yù)防性效應(yīng)子結(jié)構(gòu)連接、鍵合或締合。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述胞核分子是Ro52，Ro60，La/SS-B，凝溶膠蛋白，α-胞襯蛋白，核仁纖維蛋白，U1小核核糖核蛋白質(zhì)(U1 snRNP)，異核核糖核蛋白質(zhì)(hnRNP)，核纖層蛋白B，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，SC-35剪接因子，Smith(Sm)抗原。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述胞核分子是La。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34的方法，其中所述相互作用分子是免疫相互作用分子。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述免疫相互作用分子是抗體。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
38.根據(jù)權(quán)利要求32-37任一項的方法，其中所述編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞是編程性細(xì)胞死亡心臟細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞。
39.根據(jù)權(quán)利要求32-37任一項的方法，其中所述病癥是心肌或腦組織梗塞，自身免疫和其他炎癥疾病，病毒疾病，例如AIDS，神經(jīng)退化疾病，例如早老性癡呆或帕金森病，急性實體器官或骨髓移植排異，化療或放療引起的組織損傷(′粘膜炎′)或瘤，象腫瘤。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述病癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤或其他兒科瘤，頭頸癌，乳房和前列腺癌，肺癌，腎癌，食管胃癌，肝細(xì)胞癌，胰管膽汁瘤形成，結(jié)腸直腸癌，宮頸癌和肛門癌，子宮和其他生殖道癌，尿道癌，胚細(xì)胞腫瘤，卵巢癌，未知的原發(fā)癌，人免疫缺陷相關(guān)惡性腫瘤，淋巴瘤，白血病，惡性黑素瘤，肉瘤，內(nèi)分泌瘤，間皮瘤和其他胸膜腫瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤或癌樣腫瘤，并且所述的治療是減量調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述頭頸癌是鱗狀細(xì)胞癌，所述肺癌是小細(xì)胞肺癌或非小細(xì)胞肺癌，所述腎癌是腎細(xì)胞腺癌，所述胰臟瘤是腺癌胰島細(xì)胞瘤，所述胚細(xì)胞腫瘤是睪丸癌或卵巢癌，所述卵巢癌是卵巢上皮癌，所述人免疫缺陷相關(guān)惡性腫瘤是Kaposis肉瘤，并且所述內(nèi)分泌瘤是甲狀腺瘤。
42.根據(jù)權(quán)利要求40或41任一項的方法，其中所述腫瘤是轉(zhuǎn)移癌，并且所述治療是減量調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長。
43.根據(jù)權(quán)利要求32-42任一項的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述哺乳動物是人。
45.根據(jù)權(quán)利要求32-44任一項的方法，其中所述效應(yīng)子結(jié)構(gòu)選自-細(xì)胞因子-趨化因子-巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或T細(xì)胞激活劑；或者-毒素。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述巨噬細(xì)胞激活劑是N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸或者細(xì)菌脂肽。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述細(xì)菌脂肽是JBT2002或者其衍生物或類似物。
48.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述毒素是放射性同位素。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述放射性同位素是α-粒子發(fā)射體，β-粒子發(fā)射體或γ-粒子發(fā)射體。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述α-粒子發(fā)射體是Tb-149或Bi-213。
51.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述毒素是蓖麻毒素，前體藥物或生物治療劑。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述前體藥物是抗體-定向的前體藥物轉(zhuǎn)化酶。
53.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述生物治療劑是催化抗體。
54.與效應(yīng)子結(jié)構(gòu)偶聯(lián)的胞核分子相互作用分子用于制備治療受試者病癥的藥物的用途，所述病癥以細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征，其中所述效應(yīng)子結(jié)構(gòu)治療所述病癥。
55.含有調(diào)節(jié)劑和一種或幾種藥學(xué)可接受載體和/或稀釋劑的藥物組合物，所述調(diào)節(jié)劑稱作活性成分。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及對受試者或來自所述受試者的生物樣品檢測異常細(xì)胞，更特別是編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法，和用于這個目的的試劑。異常細(xì)胞或異常細(xì)胞組的存在提供了發(fā)生疾病或病癥的特定疾病或病癥或傾向的指征。更具體地，本發(fā)明涉及通過檢測胞核外胞核分子、特別是La的存在，或者胞核外胞核分子水平的相對增加來檢測編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供通過篩選細(xì)胞或細(xì)胞組中胞核外胞核分子水平的增量調(diào)節(jié)而診斷或監(jiān)測受試者或來自所述受試者的生物樣品中以異常的、不期望的或者另外不適當(dāng)?shù)募?xì)胞編程性細(xì)胞死亡為特征的癥狀的方法。本發(fā)明提供用于檢測這些分子的診斷試劑。這樣的診斷試劑包括免疫活性分子，例如抗體。
文檔編號A61K39/44GK1761484SQ200480007259
公開日2006年4月19日 申請日期2004年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月21日
發(fā)明者M·P·布朗 申請人:梅德維特科學(xué)股份有限公司