診斷、預(yù)后、治療和篩選方案的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 優(yōu)先權(quán)要求
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年11月8日提交的澳大利亞臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第2012904887號(hào)的 優(yōu)先權(quán)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用包括在本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本說(shuō)明書(shū)一般涉及與免疫激活，特別是黏膜免疫激活相關(guān)聯(lián)的傳染原或其它病癥 的診斷，預(yù)后和治療方案領(lǐng)域。更具體而言，本說(shuō)明書(shū)涉及作為生物標(biāo)記的抗體在免疫激活 和/或與免疫激活相關(guān)聯(lián)的病患的診斷、預(yù)后和治療中的用途。提出的本方案正準(zhǔn)備引進(jìn) 到實(shí)驗(yàn)室和床邊自測(cè)模式中以滿(mǎn)足全世界的目標(biāo)人群。
【背景技術(shù)】
[0004] 本說(shuō)明書(shū)中提及的參考書(shū)目細(xì)節(jié)列在說(shuō)明書(shū)的最后。
[0005] 提到的任何現(xiàn)有技術(shù)不是且不應(yīng)被視為承認(rèn)或任何形式的啟示該現(xiàn)有技術(shù)組成 任何國(guó)家中的公知常識(shí)的一部分。
[0006] 特異性抗體（免疫球蛋白（Ig))類(lèi)的檢測(cè)被認(rèn)為是人類(lèi)和動(dòng)物疾病的診斷和研宄 方法的重要步驟。例如，抗原-特異性IgM類(lèi)抗體的檢測(cè)廣泛地用作感染有病毒如甲型肝 炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼羅病毒、登革病毒、麻瘆病毒；和感染有細(xì)菌如梅毒（梅毒螺旋 體）的診斷測(cè)試，因?yàn)镮gM類(lèi)抗體通常在感染的急性期期間產(chǎn)生于受感染的宿主體內(nèi)，并僅 在幾個(gè)月是可檢測(cè)的。
[0007] 相反地，IgG類(lèi)抗體通常終身存留并可以指示特定病原體的現(xiàn)癥或既往感染。存 在于人體中，用特異性藥物可表明當(dāng)前或過(guò)去的感染情況。對(duì)于如人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV) 的慢性感染而言，患者不能自發(fā)地清除病毒，IgG類(lèi)抗體的檢測(cè)用于感染的診斷，而對(duì)于如 丙型肝炎病毒（HCV)等其它的感染，一部分患者可以自發(fā)地或在治療后清除病毒，抗原-特 異性IgG的檢測(cè)不用于當(dāng)前或持續(xù)感染的診斷。IgG類(lèi)抗體還主要負(fù)責(zé)機(jī)體血漿部分抗 體-介導(dǎo)的免疫。
[0008]IgA類(lèi)抗體也已經(jīng)被用于幫助感染的診斷，包括戊型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、和 登革病毒，以及感染的疫苗和免疫的研宄。IgA用于診斷目的是有吸引力的，因?yàn)樗诩毙?感染期期間顯著地產(chǎn)生，需要或不需要IgM的同時(shí)檢測(cè)，高水平的抗原-特異性IgA可以提 供當(dāng)前感染的標(biāo)記。另外，因?yàn)镮gA是分泌在黏膜上皮表面的主要抗體種類(lèi)，它的存在被認(rèn) 為是黏膜免疫的標(biāo)記。作為感染的生物標(biāo)記的不同IgA結(jié)構(gòu)形式的作用未被理解，如特別 是dlgA。SIgA在感染中的作用和使SIgA產(chǎn)生應(yīng)答的抗原尚未被研宄，設(shè)計(jì)為用于快速地 且便捷地評(píng)估患者血清中的這些應(yīng)答的診斷和預(yù)后的方案也未被開(kāi)發(fā)。
[0009] 大多數(shù)動(dòng)物中，IgA幾乎完全以二聚體或更高多聚體的形式合成，本文將其統(tǒng) 一描述為dlgA，其能夠與多聚Ig受體（plgR)相互作用。這種相互作用導(dǎo)致大量分泌型 IgA(SIgA)分泌進(jìn)入上皮組織的內(nèi)腔（參見(jiàn)圖1和2)。然而，在人類(lèi)和高等靈長(zhǎng)類(lèi)中，dlgA 僅僅是總IgA的很少部分，單體IgA(mlgA)代表約90 %的總IgA，且二聚體或較高聚合體形 式的IgA代表約10%的總IgA。
[0010] IgA、IgM、IgG和其它抗體種類(lèi)或同種型的檢測(cè)通常使用其它物種中制備的抗體試 劑來(lái)進(jìn)行，比如對(duì)人類(lèi)IgM特異的兔抗體，或?qū)θ祟?lèi)IgA特異的小鼠單克隆抗體，或?qū)Ω鱾€(gè) 抗體亞類(lèi)如IgAl、IgA2或]^61、]^623、]^6213、]^63、]^64特異的單克隆抗體?；诳贵w的 捕獲測(cè)定與通過(guò)最優(yōu)化方案最小化的非特異性結(jié)合的水平有關(guān)。
[0011] 需要改善用于監(jiān)測(cè)與受試者的黏膜表面和黏膜免疫反應(yīng)有關(guān)的感染的血清學(xué)手 段，以及需要可以用于評(píng)估二聚或多聚抗體的產(chǎn)生和/或用于二聚或多聚抗體純化的試 劑。
[0012] 實(shí)施方案概述
[0013] 因此一個(gè)實(shí)施方案中，本說(shuō)明書(shū)提供了抗體捕獲方法，其包括（i)獲得包含抗體 的生物樣品，（ii)使生物樣品與重組plgR或dlgA-結(jié)合變體接觸，其中所述plgR或變體 結(jié)合dlgA并形成plgR-dlgA復(fù)合物。一旦所述復(fù)合物形成，所述復(fù)合物可被定量。一些實(shí) 施方案中，dlgA可以從所述plgR中釋放并進(jìn)一步加工。一個(gè)實(shí)施方案中，采用所述方法用 于dlgA抗體的純化，作為采用木菠蘿素（jacalin)瓊脂糖的現(xiàn)有方法的替代方案。復(fù)合物 的檢測(cè)使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法和已知的試劑，如ELISA或其它基于免疫測(cè)定的方法。
[0014] -個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括（iii)直接地或間接地評(píng)估所述plgR-sIgA復(fù) 合物的水平或plgR-sIgA和感興趣的抗原間形成的復(fù)合物的水平。
[0015] -個(gè)實(shí)施方案中，所述plgR或dlgA-結(jié)合變體結(jié)合dlgA并且基本上不結(jié)合IgM， 或其中所述plgR或變體結(jié)合dlgA和IgM。用于檢測(cè)抗原特異性IgM和dlgA的方法可與用 于總IgA、IgG和其它個(gè)別同種型、亞型和結(jié)構(gòu)形式以及它們中兩種或更多種的組合的測(cè)試 聯(lián)用。
[0016] 一個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品為血液或血清樣品?？蛇x擇的生物樣品包括包含表達(dá) dlgA的細(xì)胞的樣品。因此，一些實(shí)施方案中，所述方法可用來(lái)在永生化B細(xì)胞的篩選或分離 中檢測(cè)表達(dá)dlgA的個(gè)別B-細(xì)胞。
[0017] 另一個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品從受試者中獲得。在一些實(shí)施方案中，受試者為人類(lèi) 或靈長(zhǎng)類(lèi)，以及在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者為除靈長(zhǎng)類(lèi)或人類(lèi)物種外的哺乳動(dòng)物或禽類(lèi) 動(dòng)物物種?；诟信d趣的靶抗體和抗體來(lái)源的物種選擇不同形式的重組PlgR。
[0018] 如在一個(gè)實(shí)施方案中所闡明的，plgR為重組HpIgA或RpIgR。便利地，在一個(gè)實(shí)施 方案中，重組plgR或dlgA-結(jié)合變體的跨膜結(jié)構(gòu)域和/或胞漿結(jié)構(gòu)域缺失。在其它實(shí)施方 案中，重組plgR包含異源檢測(cè)或結(jié)合域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組plgR或IgA-結(jié)合變 體在多糖缺陷細(xì)胞中重組產(chǎn)生，如CH0細(xì)胞。
[0019] 在上述方法的示例性實(shí)施方案中，重組plgR結(jié)合到固體支持物上。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將生物樣品在用于所述方法之前耗盡IgM或dlgA抗體，這就 允許結(jié)合IgM和dlgA的plgR在測(cè)定中被利用以特異性地檢測(cè)dlgA。同樣地，dlgA的耗竭 (例如使用R/HpIgR)有利于在測(cè)定中利用HpIgR以特異性地檢測(cè)IgM。一些實(shí)施方案中， 為了減少與dlgA的競(jìng)爭(zhēng)，樣品使用之前被耗竭IgG。然而，當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性抗體在本申請(qǐng)抗體/同 種型捕獲模式中被洗掉時(shí)，此類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)的缺乏是上述方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)。
[0021] 可采用任何感興趣的抗原，以及在非限制性實(shí)施方案中，所述感興趣的抗原是傳 染原的抗原或與侵襲黏膜表面或相關(guān)組織的受試者病癥相關(guān)的抗原。例如，傳染原包括 HIV、麻風(fēng)病、梅毒、肝炎、登革病毒、麻瘆和風(fēng)瘆。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，上述方法還包括使生物樣品與抗-SC結(jié)合劑或抗-SC抗體接 觸，其中所述抗-SC結(jié)合劑或抗-SC抗體結(jié)合SIgA并形成SIgA-結(jié)合劑/抗體復(fù)合物。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括使包含所述plgR-dlgA復(fù)合物的樣品與變性溶液接 觸，去除來(lái)自復(fù)合物的任何SIgA并測(cè)定生物樣品中SIgA和dlgA的比值。
[0023] 另一方面，本說(shuō)明書(shū)實(shí)現(xiàn)了用于確定測(cè)試受試者的腸壁完整性的抗體捕獲方法， 所述方法包括：（i)獲得包含來(lái)自測(cè)試受試者的抗體的生物樣品，（ii)使所述生物樣品和 重組plgR或dlgA-結(jié)合變體接觸，其中所述plgR或變體結(jié)合dlgA并形成plgR-dlgA復(fù)合 物，和（iii)使所述生物樣品與特異性抗-SIgA結(jié)合劑或抗-SC結(jié)合劑/抗體接觸，其中 抗-SIgA結(jié)合劑或抗-SC結(jié)合劑/抗體結(jié)合SIgA并形成SIgA-結(jié)合劑/抗體復(fù)合物，以及 (iv)測(cè)定和比較（ii)中形成的復(fù)合物的水平與（iii)中形成的復(fù)合物的水平，其中SIgA 與dlgA的比值與來(lái)自對(duì)照受試者的相應(yīng)水平或比值相比較，并提供腸道完整/滲漏的測(cè) 定。
[0024] 在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，確定了SIgA2/dIgA2和/或SlgAl/dlgAl的水平 或比值。
[0025] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體捕獲方法包括（i)獲得包含抗體的生物樣品， (ii)使所述生物樣品與重組PIgR或dlgA或IgM-結(jié)合變體接觸，其中，所述pIgR或變體結(jié) 合IgM和/或IgA并形成plgR-IgM和/或plgR-dlgA復(fù)合物。
[0026] 可選地，所述抗體捕獲方法可以包括（i)獲得包含抗體的生物樣品，（ii)使所述 生物樣品與重組plgR接觸，其中所述plgR或變體結(jié)合IgM并形成plgR-IgM復(fù)合物。
[0027] 在另一個(gè)說(shuō)明性的實(shí)施方案中，實(shí)現(xiàn)了用于檢測(cè)受試者抗原-特異性dlgA的存在 的方法，所述方法包括（i)獲得來(lái)自受試者的包含抗體的生物樣品，（ii)使所述樣品與R/ HpIgR和抗原接觸，以及（iii)測(cè)定抗原-特異性dlgA的水平。
[0028] 另一個(gè)實(shí)施方案中，描述了用于檢測(cè)受試者抗原-特異性IgM存在的方法，所述方 法包括（i)獲得來(lái)自受試者的包含抗體的生物樣品，（ii)使所述樣品與HpIgR和抗原接觸， 以及（iii)測(cè)定抗原-特異性IgM的水平。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法用于檢測(cè)受試者抗原-特異IgM和dlgA的存在，所 述方法包括（i)獲得來(lái)自受試者的包含抗體的生物樣品，（ii)使所述樣品與HpIgR和R/ HpIgR和抗原接觸，以及（iii)測(cè)定抗原-特異性IgM和抗原-特異性dlgA的水平。
[0030] 再一方面，本說(shuō)明書(shū)提供了用于評(píng)估受試者免疫狀態(tài)的試劑盒，所述試劑盒包含， a)免疫圖形設(shè)備，其包含可操作地連接到樣品部分、測(cè)試部分和任選地對(duì)照部分的多孔膜； 以及還包含吸管部分、包含重組plgR分子或其dlgA-結(jié)合變體的部分、包含感興趣的抗原 部分和任選的偶聯(lián)部分；以及b)使用免疫圖形設(shè)備檢測(cè)從受試者中獲得的生物樣品中抗 原特異性dlgA抗體存在的說(shuō)明書(shū)。
[0031] 如本文結(jié)合所述方法所描述的，在試劑盒的一些實(shí)施方案中，pIgR為HpIgR和/或 R/HpIgR。一些實(shí)施方案中，重組plgR或dlgA-結(jié)合變體的跨膜結(jié)構(gòu)域和/或胞漿結(jié)構(gòu)域 缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組PlgR包含異源檢測(cè)或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 重組PlgR或IgA-結(jié)合變體在多糖缺陷細(xì)胞中重組產(chǎn)生。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方案中，重組plgR結(jié)合到固體支持物上。
[0033] -個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品在用于上述方法之前耗盡IgM或dlgA抗體，本發(fā)明的 試劑盒以及其中所含試劑供體外使用。
[0034] 可采用任何抗原，然而在一個(gè)實(shí)施方案中，感興趣的抗原是傳染原抗原或與受試 者侵襲黏膜表面或相關(guān)組織的的病癥相關(guān)的抗原。示例性的傳染原選自HIV、麻風(fēng)病、梅毒、 肝炎、登革病毒、麻瘆和風(fēng)瘆。使用重組plgR檢測(cè)到相對(duì)于對(duì)照水平抗原特異性dlgA的升 高水平便于診斷、篩選和治療選擇。在一些實(shí)施方案中，考慮以下治療方法：其包括要求抗 原-特異性dlgA水平的測(cè)試，并且如果對(duì)于感染或病癥而言所述測(cè)試是陽(yáng)性的，那么將治 療施用于所述診斷受試者。
[0035] 另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還包括抗-SIgA結(jié)合劑/抗體或抗-SC抗體，其中所述 抗-SIgA結(jié)合劑/抗體或抗-SC抗體結(jié)合SIgA并形成SIgA-結(jié)合劑/抗體復(fù)合物。
[0036] 另一方面，提供了重組plgR，其適合用于捕獲或檢測(cè)dlgA和/或IgM。示例性的重 組plgRs包括R/HpIgR或HpIgR或者R/HpIgR或HpIgR的dlgA和/或IgM結(jié)合變體。示 例性氨基酸和核苷酸序列如SEQIDN0:1-20所列，需要記住的是這些序列的一部分編碼或 提供完全任選的CD4胞漿結(jié)構(gòu)域，其可以被刪除、修飾、補(bǔ)充或用本領(lǐng)域已知的其它結(jié)合或 檢測(cè)分子代替。一旦考慮到本發(fā)明，有用的重組PlgR的變體對(duì)技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的并很 容易被制備和測(cè)試。
[0037] 支持和描述本申請(qǐng)方法和試劑盒的附圖的詳細(xì)說(shuō)明
[0038] 如果附圖包含彩色圖示或?qū)嶓w，附圖的彩色版本經(jīng)請(qǐng)求可從專(zhuān)利權(quán)人或從有關(guān)專(zhuān) 利局得到，如果從專(zhuān)利局獲得，可能需要繳納費(fèi)用。
[0039] 圖1提供了dlgA的產(chǎn)生以及在黏膜表面作為SIgA分泌的示意圖。在黏膜下組織 產(chǎn)生的大多數(shù)dlgA隨后結(jié)合到plgR上并經(jīng)胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)到黏膜表面，在那里plgR被裂解以產(chǎn) 生SIgA(或游離的SC)，SIgA組成抵抗病原體的第一防御層。plgR的結(jié)合依賴(lài)于聚合Ig中 J-鏈的存在，并且結(jié)合發(fā)生于人類(lèi)的IgM和dlgA兩者。
[0040] 圖2提供了dlgAl的結(jié)構(gòu)以及其與plgR相互作用的圖示，相互作用后的plgR隨 后被裂解以產(chǎn)生SIgAl。plgR相關(guān)的分泌組分部分與兩個(gè)單獨(dú)的IgA分子的J-鏈和Fc區(qū) 兩者都相互作用。
[0041] 圖3提供了相對(duì)于人類(lèi)（HpIgR)的嵌合R/HpIgR，以及所述R/HpIgR在其C-端融 合人類(lèi)CD4胞漿結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)的圖示。所述R/HpIgR和其它形式在293T細(xì)胞中高水平表 達(dá)和分泌，如通過(guò)利用對(duì)來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的粗上清液（SN)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠的考馬斯 亮藍(lán)染色來(lái)檢測(cè)R/HpIgR所示。通過(guò)利用針對(duì)所述CD4胞漿結(jié)構(gòu)域（純的）的單克隆抗體 4B4的固定基質(zhì)的親和層析法很容易純化到均質(zhì)、高濃度的R/HpIgR-cyto。純的plgR或粗 SN可以被優(yōu)先用在dlgA的檢測(cè)和結(jié)合中。
[0042] 圖4提供了相對(duì)于重組形式的R/HpIgR-cyto(底部），全長(zhǎng)（天然的）plgR(頂部） 結(jié)構(gòu)的示意圖，其中所述plgR的跨膜結(jié)構(gòu)域（TM)和胞漿結(jié)構(gòu)域（cyto)已經(jīng)被人CD4的胞 漿結(jié)構(gòu)域替代。由于所述TM結(jié)構(gòu)域的缺失，產(chǎn)物從細(xì)胞中分泌出來(lái)而不是保留在細(xì)胞表 面。
[0043] 圖5提供了相對(duì)于重組形式的R/pIgR-cyto(底部），全長(zhǎng)（天然的）兔plgR(頂 部）結(jié)構(gòu)的示意圖，其中兔plgR的跨膜結(jié)構(gòu)域（TM)和胞漿結(jié)構(gòu)域（cyto)已經(jīng)被人CD4的 胞漿結(jié)構(gòu)域替代。由于TM結(jié)構(gòu)域的缺失，產(chǎn)物從細(xì)胞中分泌出來(lái)而不是保留在細(xì)胞表面。
[0044] 圖 6 提供了HpIgRcyto、RpIgR-cyto和嵌合R/HpIgR-cyto結(jié)構(gòu)的示意圖。plgR 的這些形式顯示了通過(guò)所述CD4胞漿結(jié)構(gòu)域與塑料或其它固體表面的相互作用，與諸如聚 苯乙稀ELISA板（NuncImmulon或類(lèi)似的）的固體表面的高效結(jié)合。
[0045] 圖7提供了RpIgR和嵌合R/HpIgR結(jié)構(gòu)的示意圖。在⑶4胞漿結(jié)構(gòu)域缺乏時(shí)，通 過(guò)與針對(duì)兔plgR的抗體反應(yīng)能檢測(cè)到所述RpIgR，并且通過(guò)與針對(duì)兔（結(jié)構(gòu)域1)和/或人 (結(jié)構(gòu)域2-5)plgR的抗體反應(yīng)能檢測(cè)到嵌合R/HpIgR。優(yōu)選的抗體必須能夠與結(jié)合到dlgA 的PlgR相互作用，而不僅僅與游離的PlgR相互作用。
[0046] 圖8提供了比較HpIgR和R/HpIgR與人IgM和dlgA結(jié)合的ELISA結(jié)果。HpIgR或 R/HpIgR固定在96孔NuncImmulon板上于4°C過(guò)夜，將純化的人IgM或dlgA在PBS中的稀 釋液結(jié)合到被固定的PlgR形式上過(guò)夜。洗滌后，使用偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶（HRP)的抗-IgM 或抗-IgA以及比色底物TMB檢測(cè)所述捕獲的IgM或dlgA。結(jié)果證明HpIgR顯示優(yōu)先的與 IgM(品紅色）的結(jié)合以及與dlgA(綠色）的結(jié)合，然而R/HpIgR顯示與IgM的結(jié)合大大減 少（黃色），但是保留了與dlgA強(qiáng)的結(jié)合（藍(lán)色）。
[0047] 圖9提供了比較使用R/HpIgR檢測(cè)固定的dlgA的ELISA結(jié)果。純化的dlgA或沒(méi) 有dlgA(空白（mock))的稀釋液固定在預(yù)先包被有抗-IgA的96孔NuncImmulon板上， 以便dlgA通過(guò)抗原-抗體的相互作用而不是被動(dòng)吸附結(jié)合到板上。使用R/HpIgR( "無(wú)尾 的"）或沒(méi)有PlgR( "空白"）、抗-分泌組分和抗-鼠HRP以及TMB底物檢測(cè)dlgA。結(jié)果表 明R/HpIgR能夠檢測(cè)最低測(cè)試濃度（31ng/mL)的dlgA，ELISA中有強(qiáng)的信號(hào)，背景可忽略。
[0048] 圖10為用于檢測(cè)諸如人血清或血漿的樣品中抗原-特異性dlgA存在的一個(gè)優(yōu)選 實(shí)驗(yàn)方法的示意圖。將重組R/HpIgR-cyto固定在ELISA板上，并與血清或其它樣品孵育。 二聚體IgA被捕獲在固相上，并且經(jīng)洗滌后去掉其它樣品組分（如未被捕獲的IgA和IgG， 左），抗原-特異性dlgA的存在通過(guò)連續(xù)的抗原加入以及鏈霉親和素-HRP來(lái)檢測(cè)，所述抗 原是生物素化的，或與針對(duì)所述抗原的生物素化的單克隆抗體起反應(yīng)的。通過(guò)這種方式，通 過(guò)與抗原-特異性dlgA的反應(yīng)固定的任何抗原將通過(guò)所述生物素-親和素相互作用顯示 信號(hào)。
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