專利名稱：人參皂苷次級(jí)苷脂肪酸酯類化合物，其制備方法和以該化合物為活性成分的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人參皂苷次級(jí)苷(簡(jiǎn)稱M1)脂肪酸酯類化合物(簡(jiǎn)稱FM1)，并公開(kāi)了該化合物的分子結(jié)構(gòu)、合成方法及其以該化合物為活性成分的藥物組合物，屬于中藥有效成分半合成技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明所涉及的人參皂苷次級(jí)苷(簡(jiǎn)稱M1)是人參皂苷經(jīng)腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)生的次級(jí)苷，M1可以通過(guò)酶解或發(fā)酵方法獲得。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，M1具有很強(qiáng)的抗癌活性。M1在肝中與脂肪酸形成脂肪酸酯(簡(jiǎn)稱EM1)，它比M1在肝中的積累時(shí)間要長(zhǎng)。而且通過(guò)M1、EM1的藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，M1脂肪酸酯化形成的M1脂肪酸酯(簡(jiǎn)稱EM1)提高了其體內(nèi)抗腫瘤活性，并且降低了細(xì)胞毒性。因此，人參的抗癌活性源于口服人參后經(jīng)腸內(nèi)菌代謝形成的代謝物M1和肝內(nèi)脂肪酸酯化形成的EM1，腸內(nèi)菌代謝物M1可以直接發(fā)揮抗癌作用。
在本人從事本研究前，經(jīng)檢索未見(jiàn)上述人工合成產(chǎn)物的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類具有藥用價(jià)值的人參皂苷次級(jí)苷脂肪酸酯(簡(jiǎn)稱FM1)化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了人參皂苷次級(jí)苷脂肪酸酯(簡(jiǎn)稱FM1)化合物的合成和分離方法，適于工業(yè)化大批量生產(chǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供了一種以該化合物為活性成分的用于治療癌癥的藥物組合物。
本發(fā)明另一目的是上述化合物和組合物在制備治療癌癥的藥物方面的用途。
本發(fā)明用M1與C8~C16脂肪酰氯合成的酯類化合物，經(jīng)過(guò)藥理活性篩選，對(duì)于多種癌癥有效。
本發(fā)明化合物具有下述結(jié)構(gòu)通式(I)
其中R為C8~C16脂肪?；?，該化合物簡(jiǎn)稱為FM1。
上述C8~C16脂肪?；蔷哂?-16個(gè)碳原子的直鏈或支鏈羧酸的?；?，其中的脂肪羧酸包括天然存在的飽和或者不飽和直鏈脂肪酸、及人工合成的飽和或者不飽和支鏈脂肪酸。本發(fā)明優(yōu)選的化合物是其中R為C8~C16直鏈脂肪酰基的式(I)化合物；優(yōu)選的是其中R為C8~C16飽和直鏈脂肪?；氖?I)化合物；特別優(yōu)選的是其中R為C8~C16飽和直鏈偶數(shù)碳脂肪酰基的式(I)化合物；最優(yōu)選的是其中R為C16飽和直鏈脂肪酰基的式(I)化合物。
其中R為C16飽和直鏈脂肪?；氖?I)化合物制備方法包括以下步驟a.將人參經(jīng)微生物發(fā)酵或酶解制備的人參皂苷次級(jí)苷，通過(guò)ODS反相柱，或硅膠柱層析分離，以甲醇溶液洗脫；b.收集富含人參皂苷次級(jí)苷洗脫液部分，回收甲醇，濃縮至干，得人參皂苷次級(jí)苷，簡(jiǎn)稱M1；c.取M1溶于乙酸乙酯中，在攪拌器攪拌的情況下加入飽和碳酸氫鈉水溶液，在冰水浴條件下加入摩爾數(shù)2-20倍的飽和直鏈?zhǔn)减Ｂ龋覝叵聰嚢柽^(guò)夜。然后用分液漏斗將乙酸乙酯層和水層分離，并用乙酸乙酯反復(fù)萃取水層，將乙酸乙酯合并，離心，上清液用水反復(fù)沖洗，乙酸乙酯在0-20℃低溫條件下減壓回收，產(chǎn)物用甲醇溶解、過(guò)濾，甲醇液減壓濃縮得干物質(zhì)；d.將所得干物質(zhì)經(jīng)HPLC、C-18柱、100％甲醇洗脫，得到20-(S)-原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-十六碳酸酯[20-O-β-D-glucopyranosyl(6-O-palmitoyl)-20(S)-protopanaxadi]，簡(jiǎn)稱PM1；收率以M1計(jì)為35-60％。
所得單體化合物用乙酸乙酯重結(jié)晶可得本發(fā)明產(chǎn)品的純品。
R為其它C8~C16脂肪?；氖?I)化合物，可以用相應(yīng)碳原子的酰氯，按照上述制備方法制得。而且本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明方法，利用C8~C16脂肪?；氖?I)化合物的收率，明顯高于其他更高碳脂肪?；氖?I)化合物的收率，如R為C18飽和或者不飽和直鏈脂肪?；氖?I)化合物的收率只有5-20％。
本發(fā)明研究表明M1的脂肪酸酯明顯增強(qiáng)了M1的抗癌活性，尤其是FM1，特別是PM1。通過(guò)M1、PM1的藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，M1脂肪酸酯化形成FM1，特別是PM1，提高了其體內(nèi)抗腫瘤活性。在小鼠接種肝腫瘤細(xì)胞的同時(shí)給藥M1或PM1，M1處理組抑制率為23％，但與對(duì)照組比較差異不明顯；而用相同劑量的PM1處理則明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，與對(duì)照組比較差異極顯著，與M1處理組比較差異也顯著。M1給藥后不久選擇性的進(jìn)入肝臟，在10分鐘內(nèi)達(dá)到最高峰，并且迅速的從肝臟中排出；而PM1迅速地在肝臟中積累，雖然PM1隨著時(shí)間的推移也逐漸減少，但超過(guò)劑量25％的PM1(濕組織μg/g)可以在肝臟中存留24小時(shí)。這與脂肪酸酯化后的阿糖胞苷治療血液惡性腫瘤比阿糖胞苷本身更有效具有相同的道理。因此，PM1抗腫瘤活性的增強(qiáng)可能與它在肝中的停留時(shí)間延長(zhǎng)有關(guān)。
發(fā)明人經(jīng)過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選還發(fā)現(xiàn)，雖然本發(fā)明化合物FM1與R為C18飽和或者不飽和直鏈脂肪?；氖?I)化合物(SM1或者OM1)都具有抗癌生理活性，對(duì)各種癌癥具有抑制、緩解和治療作用，但顯然本發(fā)明化合物FM1的抗癌生理活性更強(qiáng)，對(duì)各種癌癥的抑制、緩解和治療效果更好，特別是FM1中的PM1，抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力明顯強(qiáng)于SM1、OM1，而且毒性更低。
本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效劑量的上述通式(I)化合物FM1為活性成分，以及含有一種或者多種藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的化合物和藥物組成物可用于制備治療各種癌癥的藥物。
上述所述的藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括稀釋劑、賦形劑如水等；填充劑如淀粉、蔗糖等；黏合劑如纖維素及衍生物、明膠；潤(rùn)濕劑如甘油；崩解劑如碳酸氫鈉、碳酸鈣等；吸收促進(jìn)劑如季銨鹽；表面活性劑如高碳脂肪醇；吸附載體如高嶺土、皂黏土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣及聚己二醇等；還可以在組合物中加入其它輔劑如甜味劑、香味劑等。
本發(fā)明化合物可以以組合物的形式通過(guò)口服、直腸、靜脈、肌肉或胃腸外給藥方式施用于癌癥患者的治療。也可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法，如使其活性成分與一種或多種載體或藥物混合，制備各種劑型如片劑、沖劑、膠囊、栓劑、噴霧劑等，優(yōu)選的形式是片劑、沖劑、膠囊、栓劑、噴霧劑、緩釋劑和注射劑；特別優(yōu)選的是在病灶部位直接給藥的制劑。本發(fā)明的藥物組合物含有重量比為1％-99.5％的活性成分FM1，優(yōu)選含有重量比為45％-99.5％的活性成分FM1，最好含有重量比為90％-99.5％的活性成分FM1。
本發(fā)明的施藥量可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、疾病類型和嚴(yán)重程度等變化，日劑量為0.01-10mg/kg體重，優(yōu)選0.1-8mg/kg體重?？梢砸淮位蚨啻问褂谩?br> 具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可以幫助本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1.20-(S)-原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-十六碳酸酯[20-O-β-D-glucopyranosyl(6-O-palmitoyl)-20(S)-protopanaxadi](簡(jiǎn)稱PM1)制備將人參經(jīng)葡萄糖酶發(fā)酵制備的M1，通過(guò)ODS反相柱，或硅膠柱層析分離，以甲醇溶液洗脫后，收集富含M1洗脫液部分，回收甲醇，濃縮至干，得純度為98％的M1；取M1 50g溶于1000ml乙酸乙酯中，在攪拌器攪拌的情況下加入1000ml水飽和碳酸氫鈉，在冰水浴條件下分別加入飽和直鏈?zhǔn)减Ｂ?20g，室溫下攪拌過(guò)夜。然后用分液漏斗將乙酸乙酯層和水層分離，并用乙酸乙酯反復(fù)萃取水層，將乙酸乙酯合并，離心(3000rpm)，上清液用水反復(fù)沖洗，乙酸乙酯在低溫下(20℃)條件下減壓回收，產(chǎn)物用甲醇溶解、過(guò)濾，甲醇液減壓濃縮得干物質(zhì)。將所得干物質(zhì)經(jīng)HPLC、C-18柱、100％甲醇洗脫，得到40g 20-(S)-原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-十六碳酸酯(PM1)，收率以M1計(jì)為58.1％。
產(chǎn)品為無(wú)色透明油狀物，溶于氯仿、甲醇。
Liebermann——Burchard反應(yīng)呈陽(yáng)性，TOF-MS譜中，m/z[M+H]+861.6，其分子量為860。
1H-NMR(500MHz，py-d5)δ5.32(1H，t，J＝6.5Hz，H-24)，5.11(1H，d，J＝7.5Hz，glc-H-1)，5.02(1H，d，J＝11.0Hz，glc-Ha-6)，4.63(1H，dd，J＝7.0，11.0Hz，glc-Hb-6)，4.18(1H，t，J＝8.5Hz，glc-H-4)，4.16(1H，t，J＝8.5Hz，glc-H-4)，3.98(1H，t，J＝9.5Hz，H-12α)，3.95(1H，t，J＝8.0Hz，glc-H-2)，3.92(1H，t，J＝9.0Hz，glc-H-5)，3.39(1H，dd，J＝5.0，11.0Hz，H-3α)，2.59(1H，m，H-17α)，2.55(1H，m，Hb-23)，2.43(1H，m，Hb-22)，2.31(1H，m，Ha-23)，2.02(1H，m，Hb-11)，2.00(1H，m，H-13)，1.88(1H，m，Hb-2)，1.85(1H，m，Hb-16)，1.82(1H，m，Ha-22)，1.80(1H，m，Ha-2)，
1.69(1H，m，Hb-1)，1.67(3H，s，Meα)，1.64(3H，s，Me-26)，1.62(3H，s，Me-27)，1.59(1H，m，Hb-6)，1.55(1H，m，Ha-1)，1.53(1H，m，Hb-15)，1.50(1H，m，Hb-7)，1.45(1H，m，Ha-6)，1.42(1H，m，H-9α)，1.39(1H，Ha-10)，1.31(1H，Ha-7)，1.20(3H，s，Me-28α)，1.03(1H，m，Ha-15)，1.02(3H，s，Me-29β)，0.98(3H，s，19β)，0.94(3H，s，Me-30α)，0.89(1H，m，Ha-1)，0.87(3H，s，Me-18β)0.85(3H，t，J＝7.5Hz，脂肪酸末端Me)，0.79(1H，d，J＝11.0Hz，H-5)。
13C-NMR(125MHz，py-d5)δ其歸屬詳見(jiàn)表1，它的碳?xì)w屬與M1比較，在13C-NMR波譜上，葡萄糖殘基的C6信號(hào)由δ62.7向低場(chǎng)位移到δ64.7(Δ2.0)；在1H-NMR波譜上，葡萄糖殘基的-CH2OH信號(hào)由δ4.44(1H，d，J＝11.0Hz，glc-Ha-6)和4.27(1H，m，glc-Hb-6)分別向低場(chǎng)位移到δ5.02(1H，d，J＝11.0Hz，glc-Ha-6)和4.63(1H，d，J＝7.0，11.0Hz，glc-Hb-6)。而C3信號(hào)(δ78.0)和H-3α信號(hào)[δ3.39(1H，dd，J＝5.0，11.0Hz)]完全一致。因此，脂肪酸殘基與葡萄糖殘基的CH2OH脫水縮合。由于M1的分子量為622，十六碳酸的分子量為256(C16H32O2)，兩者的縮合產(chǎn)物分子量為860，此與所測(cè)分子量吻合。確定該化合物為M1十六碳酸酸酯，即20-(S)-原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-棕櫚酸酯，簡(jiǎn)稱為PM1。
表1.化合物PM1和M1的13C-NMR數(shù)據(jù)


實(shí)施例2.20-(S)-原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-十二碳酸酯(簡(jiǎn)稱DM1)的制備如實(shí)施例1制備M1；取M1 50g溶于1000ml乙酸乙酯中，在攪拌器攪拌的情況下加入1000ml水飽和碳酸氫鈉，在冰水浴條件下分別加入飽和直鏈?zhǔn)减Ｂ?0g，室溫下攪拌過(guò)夜。然后用分液漏斗將乙酸乙酯層和水層分離，并用乙酸乙酯反復(fù)萃取水層，將乙酸乙酯合并，離心(3000rpm)，上清液用水反復(fù)沖洗，乙酸乙酯在低溫下(20℃)條件下減壓回收，產(chǎn)物用甲醇溶解、過(guò)濾，甲醇液減壓濃縮得干物質(zhì)。將所得干物質(zhì)經(jīng)HPLC、C-18柱、100％甲醇洗脫，得到23g 20-(S)-原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-十二碳酸酯(DM1)，收率以M1計(jì)為35.7％。產(chǎn)品為無(wú)色透明油狀物，溶于氯仿、甲醇。
實(shí)施例3.20-(S)-原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-辛酸酯(簡(jiǎn)稱OM1)的制備如實(shí)施例1制備M1；取M1 50g溶于1000ml乙酸乙酯中，在攪拌器攪拌的情況下加入1000ml水飽和碳酸氫鈉，在冰水浴條件下分別加入飽和直鏈辛酰氯156g，室溫下攪拌過(guò)夜。然后用分液漏斗將乙酸乙酯層和水層分離，并用乙酸乙酯反復(fù)萃取水層，將乙酸乙酯合并，離心(3000rpm)，上清液用水反復(fù)沖洗，乙酸乙酯在低溫下(20℃)條件下減壓回收，產(chǎn)物用甲醇溶解、過(guò)濾，甲醇液減壓濃縮得干物質(zhì)。將所得干物質(zhì)經(jīng)HPLC、C-18柱、100％甲醇洗脫，得到34.7g 20-(S)-原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-辛酸酯(OM1)，收率以M1計(jì)為58％。產(chǎn)品為無(wú)色透明油狀物，溶于氯仿、甲醇。
下述的藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本發(fā)明化合物的抗癌藥理活性。
實(shí)驗(yàn)例4.十六碳酸酯(PM1)對(duì)肝腫瘤、胃腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用1.實(shí)驗(yàn)材料化學(xué)藥品及供試樣品PM1由本實(shí)驗(yàn)合成，純度97％，吐溫購(gòu)自上海華聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)020803，環(huán)磷酰胺購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)20001110。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠，♀♂各半，體重18～22g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在頂部為鐵線柵欄的塑料籠子里，底部鋪有鋸末，12小時(shí)黑白循環(huán)，隨時(shí)供應(yīng)食物和水。
2.實(shí)驗(yàn)方法采用動(dòng)物移植瘤模型，以生理鹽水組、陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺組作對(duì)照，對(duì)PM1抗癌活性進(jìn)行篩選評(píng)價(jià)，以具體操作如下A.PM1對(duì)小鼠肝癌腹水型(HepA)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用將小鼠腹腔內(nèi)傳代7天的瘤細(xì)胞(HepA)在無(wú)菌條件下取出，用生理鹽水洗滌2次，用生理鹽水稀釋，記數(shù)每毫升中瘤細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1？07·ml-1，給受體小鼠作腹腔注射，每只小鼠右腋窩皮下接種0.2ml瘤液。小鼠成活率100％，對(duì)宿主的影響類似，個(gè)體間差異很小。選取小鼠30只，隨機(jī)分為3組，(注射生理鹽水組、陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺組、PM1給藥組)，次日腹腔給藥，陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺組小鼠給藥劑量30mg/kg間日給藥、PM1給藥組小鼠給藥劑量20mg/kg/day。連續(xù)10天，停藥后24小時(shí)脫頸處死小鼠，剝離出腫瘤電子稱稱重，計(jì)算腫瘤抑制百分率。
B.PM1對(duì)小鼠胃癌(MFC)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用將小鼠腹腔內(nèi)傳代7天的瘤細(xì)胞(MFC)在無(wú)菌條件下取出，用生理鹽水洗滌2次，用生理鹽水稀釋，記數(shù)每毫升中瘤細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107·ml-1，給受體小鼠作腹腔注射，每只小鼠右腋窩皮下接種0.2ml瘤液。小鼠成活率100％，對(duì)宿主的影響類似，個(gè)體間差異很小。選取小鼠30只，隨機(jī)分為3組，(注射生理鹽水組、陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺組、PM1給藥組)，次日腹腔給藥，陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺組小鼠給藥劑量30mg/kg間日給藥、PM1給藥組小鼠給藥劑量20mg/kg/day。連續(xù)10天，停藥后24小時(shí)脫頸處死小鼠，剝離出腫瘤電子稱稱重，計(jì)算腫瘤抑制百分率。
3.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)采用t-檢驗(yàn)法；結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。
腫瘤抑制率(％)＝(1-T/C)×100％T實(shí)驗(yàn)組平均瘤重 C對(duì)照組平均瘤重4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論A.PM1對(duì)小鼠肝癌(HepA)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用PM1給藥組瘤重明顯低于生理鹽水處理的對(duì)照組，與對(duì)照組比較差異極顯著(p＜0.001)，說(shuō)明PM1顯著抑制了小鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，PM1給藥組與陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺組比較作用不及環(huán)磷酰胺，PM1給藥組腫瘤抑制率為53.66％，陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺組腫瘤抑制率為73.15％。如表2。
表2.不同處理對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞(HepA)的影響

***P＜0.001 表中數(shù)據(jù)為3次試驗(yàn)均值。
B.PM1對(duì)小鼠胃癌(MFC)生長(zhǎng)的抑制作用PM1給藥組瘤重明顯低于生理鹽水處理的對(duì)照組，與對(duì)照組比較差異顯著(p＜0.05)，說(shuō)明PM1顯著抑制了小鼠體內(nèi)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，PM1給藥組與陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺組比較作用不及環(huán)磷酰胺，PM1給藥組腫瘤抑制率為54％，陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺組腫瘤抑制率為72.11％。如表3。
表3.不同處理對(duì)小鼠胃癌細(xì)胞(MFC)生長(zhǎng)的影響

**P＜0.01 ***P＜0.001 表中數(shù)據(jù)為3次試驗(yàn)均值。
實(shí)驗(yàn)例5.PM1對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)的抑制作用1.肝臟移植黑色素瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠，♀♂各半，體重18～22g，12-16周齡，選取小鼠30只，隨機(jī)分為3組，12小時(shí)黑白循環(huán)，隨時(shí)供應(yīng)食物和水。
2.實(shí)驗(yàn)方法將小鼠腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉，以肝內(nèi)注射接種B16F-10腫瘤細(xì)胞(2×105個(gè)細(xì)胞)作為對(duì)照；小鼠肝內(nèi)同時(shí)注射B16F-10腫瘤細(xì)胞(2×105個(gè)細(xì)胞)和M1(5mg/kg)；小鼠肝內(nèi)同時(shí)注射B16F-10腫瘤細(xì)胞(2×105個(gè)細(xì)胞)和PM1(5mg/kg)分別作為處理。10天后，宰殺小鼠摘除肝臟，稱量癌腫瘤重量。
3.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)采用t-檢驗(yàn)法；結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論計(jì)算10只鼠腫瘤重量的平均值(EM±SD)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如表4。
研究結(jié)果表明，M1形成脂肪酸酯PM1以后，抗癌活性明顯增強(qiáng)。
表4.PM1對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)的抑制作用

#，p＜0.002與對(duì)照比較；*，p＜0.02與M1比較。
實(shí)驗(yàn)例6 PM1處理的脾淋巴細(xì)胞對(duì)B16-F10細(xì)胞毒性作用1.實(shí)驗(yàn)材料與方法淋巴細(xì)胞的制備肝臟或脾通過(guò)不銹鋼篩網(wǎng)懸浮在紅細(xì)胞溶解液
中，100xg室溫離心6分鐘。細(xì)胞顆粒用全介質(zhì)洗2次，肝臟培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞和20μM 2-巰基乙醇加到全介質(zhì)中。
2.癌細(xì)胞毒性作用測(cè)定癌細(xì)胞(1×106/孔)同肝臟或脾淋巴細(xì)胞(1-3×106/孔)在全介質(zhì)中培養(yǎng)，并且PM1(0.1-10μM)存在或不存在的條件下，5％CO2氣中，37℃培養(yǎng)。3天以后，用胰蛋白酶收集粘連細(xì)胞并在顯微鏡下觀察測(cè)定癌細(xì)胞數(shù)。另一組脾淋巴細(xì)胞(1×106)事先用PM1(0-240μM)處理。2天以后，脾淋巴細(xì)胞被分成粘連細(xì)胞和非粘連細(xì)胞并且立即分別與B16-F10細(xì)胞(2×104)培養(yǎng)。平行實(shí)驗(yàn)癌細(xì)胞與PM1單獨(dú)培養(yǎng)。1天以后，用胰蛋白酶收集粘連細(xì)胞并測(cè)定癌細(xì)胞數(shù)。淋巴細(xì)胞溶解癌細(xì)胞的能力應(yīng)用下述公式計(jì)算溶解力(％)＝(1-試驗(yàn)組/對(duì)照組)×100，其中試驗(yàn)組＝癌細(xì)胞同淋巴細(xì)胞在PM1存在或不存在的條件下，培養(yǎng)的癌細(xì)胞數(shù)；對(duì)照組＝?jīng)]有淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的癌細(xì)胞數(shù)。
用PM1預(yù)處理2天的脾淋巴細(xì)胞分成兩組粘連細(xì)胞和非粘連細(xì)胞并且分別與B16-F10細(xì)103胞培養(yǎng)。平行實(shí)驗(yàn)癌細(xì)胞與PM1單獨(dú)培養(yǎng)。1天以后，用胰蛋白酶獲得粘連細(xì)胞并測(cè)定癌細(xì)胞數(shù)。
3.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)采用t-檢驗(yàn)法；結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論測(cè)定PM1不同濃度下的癌細(xì)胞數(shù)，取PM1各濃度下3個(gè)盤平均數(shù)(EM±SD)計(jì)算癌細(xì)胞的生長(zhǎng)率。結(jié)果如表5。
表5.PM1處理的脾淋巴細(xì)胞對(duì)B16-F10細(xì)胞毒性作用

結(jié)果表明癌細(xì)胞與預(yù)先用PM1處理的非粘連細(xì)胞培養(yǎng)，隨著濃度的變化，癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加。而粘連細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用。單獨(dú)M1也沒(méi)有作用。這些結(jié)果表明PM1對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用，可能是與非粘連細(xì)胞對(duì)破壞的癌細(xì)胞狀態(tài)的刺激和活化有關(guān)。
實(shí)施例7.DM1、PM1、SM1、OM1抗腫瘤活性的比較研究1.實(shí)驗(yàn)材料Lewis肺腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠，♀♂各半，體重19～23g，12-16周齡，選取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，12小時(shí)黑白循環(huán)，隨時(shí)供應(yīng)食物和水。
2.實(shí)驗(yàn)方法將小鼠腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉，靜脈接種癌細(xì)胞后，以3mg/Kg的劑量分別對(duì)不同處理組口服給藥，對(duì)照組給以相應(yīng)的混懸劑，10天后，宰殺小鼠取出肺臟稱重。
3.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表6。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)采用t-檢驗(yàn)法；結(jié)果以(X±SD)表示。
表6.DM1、PM1、SM1、OM1口服給藥對(duì)Lewis肺癌自發(fā)性廢轉(zhuǎn)移的療效

*P＜0.05 **P＜0.01，表中數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)均值。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果DM1、PM1、SM1、OM1口服給藥對(duì)Lewis肺癌自發(fā)性廢轉(zhuǎn)移的療效，DM1、PM1、SM1、OM1口服給藥組瘤重明顯低于對(duì)照處理組，與對(duì)照組比較差異極顯著(p＜0.01)，說(shuō)明DM1、PM1、SM1、OM1顯著抑制了小鼠體內(nèi)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移，DM1、PM1給藥組與SM1、OM1給藥組比較作用明顯強(qiáng)于后者，DM1、PM1給藥組腫瘤抑制率分別為77.48％、77.63％，而SM1給藥組腫瘤抑制率為39.42％，OM1給藥組腫瘤抑制率為43.42％。結(jié)果表明DM1、PM1抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力明顯強(qiáng)于SM1、OM1。
實(shí)施例8.抗癌片劑的制備取實(shí)施例1制備的化合物10g，加入賦形劑藥用環(huán)糊精30g，混合均勻，造粒壓片，制得片劑，每片含PM1 10mg。
實(shí)施例9.抗癌膠囊的制備取實(shí)施例1制備的化合物10g，加入賦形劑藥用環(huán)糊精10g，混合均勻，造粒，裝入膠囊，每粒含PM1 10mg。
實(shí)施例10.抗癌注射劑的制備取實(shí)施例3制備的化合物10g，加入藥用丙二醇200ml，注射用水800ml，溶解，膜過(guò)濾；膜過(guò)濾(0.2μm)，分裝，每瓶2ml，含PM1 20mg。所有操作均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
實(shí)施例11.抗癌膠囊的制備取實(shí)施例2制備的化合物10g，加入賦形劑藥用環(huán)糊精10g，混合均勻，造粒，裝入膠囊，每粒含PM1 10mg。
權(quán)利要求
1.具有抗癌作用的人參皂苷次級(jí)苷脂肪酸酯類化合物，其特征為具有以下結(jié)構(gòu) 其中R為C8~C16脂肪?；?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其特征為R為C8~C16直鏈脂肪?；?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其特征為R為C8~C16飽和直鏈脂肪?；?。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其特征為C8~C16飽和直鏈偶數(shù)碳脂肪?；?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其特征為R為C16飽和直鏈脂肪?；?。
6.權(quán)利要求5的化合物的制備方法，其特征為包括以下步驟a.將人參經(jīng)微生物發(fā)酵或酶解制備的人參皂苷次級(jí)苷，通過(guò)ODS反相柱，或硅膠柱層析分離，以甲醇溶液洗脫；b.收集富含人參皂苷次級(jí)苷洗脫液部分，回收甲醇，濃縮至干，得人參皂苷次級(jí)苷，簡(jiǎn)稱M1；c.取M1溶于乙酸乙酯中，在攪拌器攪拌的情況下加入飽和碳酸氫鈉水溶液，在冰水浴條件下加入摩爾數(shù)2-20倍數(shù)的飽和直鏈?zhǔn)减Ｂ龋覝叵聰嚢柽^(guò)夜；然后用分液漏斗將乙酸乙酯層和水層分離，并用乙酸乙酯反復(fù)萃取水層，將乙酸乙酯合并，離心，上清液用水反復(fù)沖洗，乙酸乙酯在0-20℃低溫條件下減壓回收，產(chǎn)物用甲醇溶解、過(guò)濾，甲醇液減壓濃縮得干物質(zhì)；d.將所得干物質(zhì)經(jīng)HPLC、C-18柱甲醇洗脫，得到20-(S)-原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-十六碳酸酯，簡(jiǎn)稱PM1。
7.權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的化合物在制備治療癌癥的藥物中應(yīng)用。
8.用于治療癌癥的藥物組合物，其特征為其中含有治療有效量的權(quán)利要求1的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式為(I)的新化合物人參皂苷次級(jí)苷脂肪酸酯，其中R為C
文檔編號(hào)A61K31/7028GK1651452SQ20041015549
公開(kāi)日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2004年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月1日
發(fā)明者弓曉杰, 鄭毅男 申請(qǐng)人:大連大學(xué)