專利名稱：一種Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備II型糖尿病動(dòng)物模型的方法。具體涉及一種用于分析II型糖尿病病理及進(jìn)行II型糖尿病藥物篩選的動(dòng)物模型的制備方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是世界上患病率最高的疾病之一，屬于內(nèi)分泌代謝性的慢性終身性疾病，其患病率僅次于腫瘤和心血管疾病，居第三位。II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)是危害人類健康的常見疾病，多見于40歲以上的成年人，糖尿病患者中90％以上為II型糖尿病患者。糖尿病所造成的經(jīng)濟(jì)影響巨大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)展中國(guó)家用于糖尿病及其并發(fā)癥上的費(fèi)用超過了衛(wèi)生方面的預(yù)算的10％。在美國(guó)，1994年花費(fèi)在糖尿病方面的費(fèi)用高達(dá)204億美元，最近統(tǒng)計(jì)更是高達(dá)1000億美元。
II型糖尿病的病理特征包括外周組織胰島素抵抗以及胰腺β細(xì)胞分泌胰島素的損傷，其表型包括高空腹血糖、高胰島素血癥、糖耐量低減、肝糖原合成不足及糖異生途徑異?；钴S等?，F(xiàn)在一般認(rèn)為，II型糖尿病的發(fā)病除了遺傳因素外，也與環(huán)境因素的誘導(dǎo)密切相關(guān)。缺乏運(yùn)動(dòng)及長(zhǎng)期攝取高脂飲食，造成血漿中游離脂肪酸和甘油三酯水平上升，脂肪細(xì)胞肥大，進(jìn)而分泌IL-2、TNF-α等炎癥因子，從而誘發(fā)機(jī)體胰島素抵抗，對(duì)葡萄糖利用效率低下；血漿中高水平的游離脂肪酸進(jìn)一步造成肝臟脂肪變性，引起肝糖原合成障礙和糖異生途徑增強(qiáng)，惡化了高血糖的癥狀。胰腺β細(xì)胞代償性分泌胰島素以補(bǔ)償機(jī)體利用胰島素的低效率，從而造成高胰島素血癥以及胰腺β細(xì)胞的損傷，胰島素分泌產(chǎn)生障礙，最終形成II型糖尿病。目前對(duì)II型糖尿病的機(jī)理還有很多不明之處，有待進(jìn)一步研究。
現(xiàn)有的II型糖尿病動(dòng)物模型如ob/ob、db/db、T-KK、Yellow-KK、NZO小鼠以及ObeseZucker、GK、OLETE大鼠等多為遺傳性自發(fā)性動(dòng)物模型，大多需從國(guó)外引進(jìn)，價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)條件要求高，并且不能很好地模擬人體II型糖尿病的發(fā)病過程，不適用于進(jìn)行大量的化合物篩選和機(jī)理研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建II型糖尿病動(dòng)物模型的制備方法，該方法模擬人類II型糖尿病的發(fā)病過程，所制備的動(dòng)物模型出現(xiàn)高空腹血糖、高胰島素血癥、糖耐量低減、胰島素抵抗等II型糖尿病的典型癥狀，能適合于II型糖尿病機(jī)理研究和進(jìn)行大量的藥物篩選。
本發(fā)明方法的特點(diǎn)為先用高脂高糖飼料誘導(dǎo)動(dòng)物升高血脂血糖，進(jìn)而引發(fā)肝臟和外周組織中的胰島素抵抗，此時(shí)動(dòng)物呈肥胖趨勢(shì)，出現(xiàn)高胰島素血癥。在此基礎(chǔ)上，利用腹腔注射中劑量的鏈脲佐菌素(STZ)破壞胰腺β細(xì)胞分泌胰島素的功能，從而制備得到II型糖尿病動(dòng)物模型。應(yīng)用本發(fā)明方法制備的動(dòng)物模型具有與人類II型糖尿病發(fā)病相似的過程，出現(xiàn)飲水量升高，空腹血糖水平高于正常、高胰島素血癥、糖耐量低減以及胰島素耐量減低等II型糖尿病特征，因而是研究II型糖尿病發(fā)病機(jī)理和進(jìn)行治療II型糖尿病藥物篩選的理想模型。
本發(fā)明方法包括以下步驟1、通過自由攝食的方式，用高脂高糖飼料持續(xù)喂養(yǎng)3-4周齡的雄性動(dòng)物4-6周，誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生胰島素抵抗。
2、喂養(yǎng)結(jié)束后禁食6-8小時(shí)后，以150mg/kg體重的劑量向動(dòng)物腹腔一次性注射STZ，得到動(dòng)物模型。
本發(fā)明方法中，高脂高糖飼料由普通的商品飼料添加糖、油脂、膽固醇等配制而成，其脂肪含量(以重量計(jì))應(yīng)為13％～28％，碳水化合物含量(以重量計(jì))應(yīng)為5％～7％；動(dòng)物可采用小鼠或大鼠或豚鼠。
本發(fā)明中優(yōu)選的高脂高糖飼料由葡萄糖、膽固醇、玉米油和基礎(chǔ)飼料組成，其中葡萄糖的含量為1-5％(以重量計(jì))，膽固醇的含量為0.1-0.5％(以重量計(jì))，玉米油的含量為10-25％(以重量計(jì))，余量為基礎(chǔ)飼料?；A(chǔ)飼料可選用市售的符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的商品飼料，即市售的大小鼠及豚鼠飼料，如上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司生產(chǎn)的大小鼠及豚鼠飼料。
上述方法所得到的動(dòng)物模型的驗(yàn)證方法包括測(cè)定飲水量、體重、空腹血糖水平和血清胰島素水平等II型糖尿病病癥指標(biāo)；通過口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)和胰島素耐量試驗(yàn)(insulin tolerance test，ITT)測(cè)量動(dòng)物模型對(duì)II型糖尿病的表現(xiàn)程度。
飲水量、體重、空腹血糖水平和血清胰島素水平采用常規(guī)方法測(cè)定。OGTT的試驗(yàn)方法為分別將模型組和正常對(duì)照組動(dòng)物禁食18-24小時(shí)，測(cè)量空腹血糖值，以20％的葡萄糖溶液進(jìn)行灌胃，葡萄糖溶液的用量為2g/kg體重，分別在15分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘測(cè)定各組動(dòng)物的血糖值。以各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值做糖耐量曲線，以模型組和正常對(duì)照組各點(diǎn)進(jìn)行t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。ITT的試驗(yàn)方法為分別將模型組和正常對(duì)照組動(dòng)物禁食4-8小時(shí)，測(cè)量空腹血糖值，腹腔注射胰島素，注射劑量為0.75U/kg體重，分別在5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘和180分鐘測(cè)定各組動(dòng)物的血糖值。以空腹血糖值作為基準(zhǔn)，以血糖值的百分?jǐn)?shù)對(duì)時(shí)間點(diǎn)做胰島素耐量曲線，以模型組和正常對(duì)照組各點(diǎn)進(jìn)行t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組動(dòng)物空腹血糖水平顯著高于正常，出現(xiàn)高胰島素血癥，糖耐量和胰島素耐量試驗(yàn)中與正常組動(dòng)物存在差異或顯著差異。從而驗(yàn)證了本發(fā)明以試驗(yàn)手段在動(dòng)物上建立了II型糖尿病動(dòng)物模型。


圖1為動(dòng)物飲水量變化趨勢(shì)圖，其中-◆-表示模型組，-■-表示正常對(duì)照組；圖2為糖耐量試驗(yàn)曲線圖，其中-◆-表示模型組，-■-表示正常對(duì)照組；圖3為胰島素耐量試驗(yàn)曲線下面積圖，其中1表示正常對(duì)照組，2表示模型組，■表示曲線下面積(AUC)。
有益效果1、本發(fā)明方法制備動(dòng)物模型時(shí)間短，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物損傷少。
2、本發(fā)明采用先用高脂高糖飼料誘導(dǎo)胰島素抵抗，出現(xiàn)高胰島素血癥后腹腔注射中劑量的STZ的方法，致死率低，增加了II型糖尿病的出現(xiàn)概率而不會(huì)增加I型糖尿病的出現(xiàn)概率，從而解決了造模成功率不高，STZ使動(dòng)物致死以及易于造成I型糖尿病的問題。
3、本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用較低，所制備的動(dòng)物模型具有與人類II型糖尿病發(fā)病相似的過程，具有典型的II型糖尿病癥狀，因而是研究II型糖尿病發(fā)病機(jī)理及進(jìn)行治療II型糖尿病藥物篩選的理想模型，具有普遍應(yīng)用的潛力。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例11、試驗(yàn)材料1.1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)C57BL/6J小鼠，雄性，三至四周齡，從中科院上海試驗(yàn)動(dòng)物中心購得。動(dòng)物隨機(jī)分為模型組和正常對(duì)照組，其中模型組30只，正常對(duì)照組10只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用分籠飼養(yǎng)，每籠5只。
1.2、基礎(chǔ)飼料大小鼠飼料(上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)1.3、高脂高糖飼料由80.9％基礎(chǔ)飼料、4％葡萄糖、0.1％膽固醇以及15％玉米油配制而成。其碳水化合物含量為6.4％，脂肪含量為18.2％，蛋白質(zhì)含量為21％，其制備方法為將基礎(chǔ)飼料粉碎，按上述配方比例，稱取各配料，加入適量水后攪拌均勻，壓實(shí)并分成小塊后于80℃烘干。
1.4、試劑與儀器
STZ購自sigma公司；0.1M檸檬酸緩沖液(0.1mol/L檸檬酸鈉56ml，0.1mol/L檸檬酸44ml)胰島素放射免疫分析試劑盒購自上海放射免疫分析技術(shù)有限公司；ONE TOUCH II微量血糖測(cè)定儀(美國(guó)lifescan公司)。
2、試驗(yàn)方法模型組和正常對(duì)照組小鼠以基礎(chǔ)飼料預(yù)養(yǎng)三天后，采用自由攝食的方式飼喂高脂高糖飼料四周，飼養(yǎng)期間自由飲水，并確保清潔的飼養(yǎng)環(huán)境。四周后，各實(shí)驗(yàn)組小鼠禁食6小時(shí)，以150mg/kg體重的劑量腹腔注射STZ(溶于0.1M檸檬酸緩沖液，pH 4.4)，小鼠開始單籠飼養(yǎng)，在第3、4、7、9天測(cè)定飲水量，每周檢測(cè)體重，同時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，按試劑盒說明書的方法測(cè)定血清胰島素；用微量血糖測(cè)定儀測(cè)定空腹血糖。對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)。口服葡萄糖耐量試驗(yàn)的方法為小鼠禁食22小時(shí)，測(cè)量空腹血糖值，以2g/kg體重的劑量灌胃20％的葡萄糖溶液(去離子水配制)，分別測(cè)定15分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘時(shí)的血糖值。以各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值做糖耐量曲線，以模型組和正常對(duì)照組組各點(diǎn)進(jìn)行t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；胰島素耐量試驗(yàn)的方法為小鼠禁食5小時(shí)，測(cè)量空腹血糖值，腹腔注射胰島素0.75U/kg體重，分別測(cè)定5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘和180分鐘時(shí)的血糖值。以血糖值對(duì)時(shí)間點(diǎn)做胰島素耐量曲線，計(jì)算曲線下面積，以模型組和正常組各點(diǎn)進(jìn)行t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
3、試驗(yàn)結(jié)果3.1、模型組小鼠的平均體重為22.1±1.83g，正常對(duì)照組小鼠的平均體重為20.5±1.22g。
3.2、如表1和圖1所示，模型組小鼠在腹腔注射STZ后，其飲水量呈遞增趨勢(shì)，而正常對(duì)照組小鼠的飲水量則保持穩(wěn)定。
表1高脂高糖飼料喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠注射STZ后飲水量變化趨勢(shì)

3.3、模型組小鼠的平均空腹血糖值可達(dá)17.6±3.27mmol/L，平均胰島素值為36.0±17.8μIU/ml。而正常對(duì)照組小鼠的平均空腹血糖值為6.2±0.42mmol/L，平均胰島素值為19.0±6.2μIU/ml。
3.4、如表2和圖2所示，口服葡萄糖耐量試驗(yàn)中，模型組與正常對(duì)照組相比，其空腹血糖及15分鐘、120分鐘血糖值差異極顯著(P＜0.001)；60分鐘血糖值差異顯著(P＜0.01)；30分鐘血糖值存在差異(P＜0.05)。
表2口服糖尿病試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)結(jié)果

注表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SE*表示P＜0.05，與正常組相比有差異；**表示P＜0.01，與正常組相比有顯著差異；***表示P＜0.001，與正常組相比有極顯著差異。
3.5、如表3如表3和圖3所示，胰島素耐量試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組相對(duì)于正常對(duì)照組組，曲線下面積存在差異(P＜0.05)。
表3胰島素耐量試驗(yàn)(insulin tolerance test.ITT)

注表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SE*P＜0.05，與正常對(duì)照組相比有差異；
權(quán)利要求
1.一種II型糖尿病動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于先用高脂高糖飼料誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生胰島素抵抗，然后腹腔注射中劑量的鏈脲佐菌素破壞胰腺β細(xì)胞分泌胰島素的功能，得到II型糖尿病動(dòng)物模型，其中高脂高糖飼料中脂肪和含量為13％～28％(以重量計(jì))，碳水化合物含量為5％～7％(以重量計(jì))。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的II型糖尿病動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)通過自由攝食的方式，用高脂高糖飼料持續(xù)喂養(yǎng)3-4周齡的雄性動(dòng)物4-6周，誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生胰島素抵抗；(2)喂養(yǎng)結(jié)束后禁食6-8小時(shí)后，以150mg/kg體重的劑量向動(dòng)物腹腔一次性注射鏈脲佐菌素，得到動(dòng)物模型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的II型糖尿病動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于所述的高脂高糖飼料的組成為(以重量計(jì))葡萄糖1-5％膽固醇0.1-0.5％玉米油10-25％基礎(chǔ)飼料 余量其中基礎(chǔ)飼料為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的商品飼料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的II型糖尿病動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于所述的動(dòng)物是小鼠或大鼠或豚鼠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種II型糖尿病動(dòng)物模型的制備方法。具體指利用高脂高糖飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生胰島素抵抗，用鏈脲佐菌素(STZ)破壞動(dòng)物胰腺β細(xì)胞。利用本發(fā)明方法制備的動(dòng)物模型具有與人類II型糖尿病發(fā)病相似的過程，出現(xiàn)高空腹血糖、高胰島素血癥、糖耐量低減、胰島素抵抗等II型糖尿病的典型癥狀，可用于分析II型糖尿病發(fā)病機(jī)理及進(jìn)行治療II型糖尿病藥物篩選。
文檔編號(hào)A61K49/00GK1785433SQ200410089318
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月9日
發(fā)明者龔邦強(qiáng), 相幼青, 連霽虹 申請(qǐng)人:上海凱曼生物科技有限公司