專利名稱：元胡多糖、生產(chǎn)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從中藥材中提取的多糖化合物，特別是涉及從生藥元胡中提取的元胡多糖YhPS、其生產(chǎn)方法和用途。
背景技術(shù)：
元胡是一種傳統(tǒng)的中藥材，為著名的“浙八味”之一，具有“活血化瘀，理氣止痛”之功效。
文獻(xiàn)報(bào)道，[朱大元等，化學(xué)學(xué)報(bào)，(39)，280(1981)]，[傅小勇等，藥學(xué)學(xué)報(bào)，21(6)，447(1986)]，[傅小勇等，藥物分析雜志，6(2)，66(1986)]，其化學(xué)成分主要含有20多種生物堿，另含有少量的粘液質(zhì)、樹脂、揮發(fā)油、中性物質(zhì)及無機(jī)元素等，而有關(guān)元胡中糖類的研究尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供一種元胡多糖及其生產(chǎn)方法和用途。
本發(fā)明提供了一種從生藥元胡中提取獲得的多糖，其重復(fù)結(jié)構(gòu)單元為 其中n＝1～20，Glcp為吡喃型葡萄糖，其主鏈為→4)-α-Glcp(1→，即1，4連接的葡萄糖，每一個(gè)重復(fù)單元由12個(gè)單糖組成，結(jié)構(gòu)中有一條支鏈，連接在→4，6)-α-Glcp(1→，即1，4，6連接的葡萄糖上，支鏈中有→6)-α-Glcp(1→為1，6連接的葡萄糖和α-Glcp(1→非還原末端葡萄糖。
本發(fā)明的元胡多糖的制備方法是將經(jīng)生藥用水浸泡，采用有機(jī)溶劑沉淀，透析或膜分離，濃縮干燥獲得總多糖。元胡總多糖經(jīng)離子交換柱和凝膠柱層析純化得元胡多糖YhPS。
該多糖經(jīng)完全酸水解、還原、乙?；虶C分析，結(jié)果表明它主要由葡萄糖組成，另含有痕量的半乳糖和阿拉伯糖。由HPLC分析測(cè)得其分子量范圍為1600～35000。其NMR譜圖數(shù)據(jù)如下面所述δ(ppm)1H-NMR5.44為→4)α-Glcp(1→、5.40為→4，6)α-Glcp(1→、5.38為→6)α-Glcp(1→、5.01為α-Glcp(1→。13C-NMR101.955為→4)α-Glcp(1→，102.119為→6)α-Glcp(1→，102.274為→4，6)α-Glcp(1→，100.998為α-Glcp(1→。
從YhPS經(jīng)甲基化、還原、乙?；苌锏腉C-MS圖譜分析得知，YhPS含有碎片→4)α-Glcp(1→、→6)α-Glcp(1→、→4，6)α-Glcp(1→和α-Glcp(1→，其摩爾比為9∶1∶1∶1。根據(jù)甲基化、NMR等分析，可以推斷YhPS具有以下的重復(fù)單元結(jié)構(gòu) 其中n＝1～20本發(fā)明提供的制備方法包括將生藥元胡干燥后，用水浸泡，采用有機(jī)溶劑沉淀，透析或膜分離，濃縮干燥獲得元胡總多糖。元胡總多糖經(jīng)離子交換柱和凝膠柱層析純化可得元胡多糖純品YhPS。
具體來說，將干燥后的生藥元胡粉碎或切片，用水浸泡，其中元胡與水浸泡的重量比推薦是元胡∶水＝1∶10～15，尤其推薦用10～12倍重量的水，浸泡24～36小時(shí)。所述水推薦為無離子水。浸泡液的pH值推薦保持在6.0～7.0。
過濾，濾液經(jīng)或不經(jīng)濃縮，用有機(jī)溶劑沉淀后離心。離心所得沉淀用水溶解，推薦用1～5倍重量的水溶解。
離心，上清液透析或膜分離，透析時(shí)間推薦為24～72小時(shí)，透析用透析膜、透析袋，其孔徑推薦截留分子量在1000以下，尤其推薦截留分子量為500。
濃縮干燥獲得總多糖，其中干燥或減壓濃縮溫度推薦低于60℃進(jìn)行，最好采用低溫真空濃縮或冷凍干燥，例如在30～60℃干燥或濃縮，壓強(qiáng)推薦控制在0.08～0.1MPa。
所述元胡總多糖加水溶解，其中推薦1～5倍重量的水溶解。然后經(jīng)DEAE-Cellulose柱層析，用無離子水洗脫后收集，純度可達(dá)到80～90％。再經(jīng)凝膠柱層析作進(jìn)一步純化，用水或稀鹽溶液洗脫，收集糖峰，然后經(jīng)過SephadexG-10脫鹽后冷凍干燥獲得元胡多糖純品YhPS，純度可達(dá)97％以上。凝膠柱層析所采用的凝膠為Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，選用的分離范圍為1×103-5×104道爾頓。推薦凝膠用SephadexG75，去離子水洗脫。
前述的用有機(jī)溶劑沉淀，所述有機(jī)溶劑推薦與水互溶的有機(jī)溶劑，可以是低碳鏈的醇或酮，例如C1～C6的醇或酮等。
本發(fā)明提供的元胡多糖及其總多糖可用于制備具有腦缺血保護(hù)作用的藥物或保健品。
本發(fā)明首次從元胡中提取元胡多糖YhPS及其總多糖。本發(fā)明的提取分離方法簡(jiǎn)便，產(chǎn)率高和適于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1是元胡多糖YhPS的HPLC圖。分析柱為BIOSEP-S4000，洗脫液雙蒸水，流速1mL/min，檢測(cè)器RI，分析得到單一對(duì)稱峰，主峰含量98.643％。
圖2是HPLC法測(cè)定多糖分子量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(Sigma)的lgMw與Rt標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，線性方程為lgMw＝8.52526-0.33215Rt(r＝-0.9993)。由圖1可知，YhPS的Rt為13.410min，通過線性方程計(jì)算表明YhPS的平均分子量為11779，分子量范圍為2000～39000。
圖3是標(biāo)準(zhǔn)單糖分析的GC圖。分析柱OV-17毛細(xì)管柱(0.32mm×30m)，溫度200℃(2min)1.5℃/min260℃。其各標(biāo)準(zhǔn)單糖的峰分布如下峰號(hào) 1 2 3 4 5 6
Rt(min) 18.026 19.031 20.053 30.454 30.999 31.484標(biāo)準(zhǔn)單糖Rha Ara Xyl Man Glc Gal注Rha為鼠李糖；Ara為阿拉伯糖；Xyl為木糖；Man為甘露糖；Glc為葡萄糖；Gal為半乳糖。
圖4是元胡多糖YhPS的GC圖。分析柱OV-17毛細(xì)管柱(0.32mm×30m)，溫度200℃(2min)1.5℃/min260℃。其元胡多糖YhPS的單糖組成如下峰號(hào) 1 2 3 4Rt(min)12.061 18.934 31.072 31.369單糖組成 雜質(zhì)峰 AraGlc Gal注Rha為鼠李糖；Ara為阿拉伯糖；Glc為葡萄糖；Gal為半乳糖。
圖5是元胡多糖YhPS的紅外光譜圖。主要特征吸收峰為929cm-1為D-葡萄吡喃環(huán)糖的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，764cm-1為D-葡萄吡喃環(huán)糖的對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，853cm-1為α-端基差向異構(gòu)的C-H變角振動(dòng)吸收峰，1079cm-1、1024cm-1為吡喃環(huán)上C-O鍵的特征吸收。
圖6是元胡多糖YhPS的1H-核磁共振(NMR)圖譜。1H-NMR5.44為→4)-α-Glcp(1→、5.40為→4，6)-α-Glcp(1→、5.38為→6)-α-Glcp(1→、5.01為α-Glcp(1→。
圖7是元胡多糖YhPS的13C-核磁共振(NMR)圖譜。13C-NMR100.998為α-Glcp(1→，101.955為→4)-α-Glcp(1→，102.119為→6)-α-Glcp(1→，102.274為→4，6)-α-Glcp(1→。
圖8是元胡多糖YhPS的GC-MS圖譜中的GC圖譜。其表明有6個(gè)碎片峰，峰1(15.905min)、2(17.419min)、3(19.761min)和4(23.296min)為糖峰，5(24.336min)和6(27.564min)為非糖峰。
圖9為Rt＝15.905min的碎片質(zhì)譜圖，說明含有α-Glcp(1→。
圖10為Rt＝17.419min的碎片質(zhì)譜圖，說明含有→6)α-Glcp(1→。
圖11為Rt＝19.761min的碎片質(zhì)譜圖，說明含有→4)α-Glcp(1→。
圖12為Rt＝23.296min的碎片質(zhì)譜圖，說明含有→4，6)α-Glcp(1→。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將生藥元胡100g，用1升無離子水室溫浸泡36小時(shí)，過濾。濾液50℃減壓濃縮至200～300毫升。然后用95％的乙醇沉淀，乙醇終濃度為85％，沉淀24小時(shí)。離心，沉淀用200～300毫升水溶解，離心，無離子水透析48～72小時(shí)。50℃減壓濃縮后冷凍干燥，即獲得元胡總多糖YhPS-T 5.77g，用硫酸苯酚法測(cè)得多糖含量為65.1％。
實(shí)施例2將生藥元胡100g，用1升無離子水室溫浸泡36小時(shí)，過濾。濾液50℃減壓濃縮至200～300毫升。然后用丙酮沉淀，丙酮終濃度為85％，沉淀24小時(shí)。離心，沉淀用200～300毫升水溶解，離心，無離子水透析48～72小時(shí)。50℃減壓濃縮后冷凍干燥，即獲得元胡總多糖YhPS-T 5.68g，用硫酸苯酚法測(cè)得多糖含量為67.0％。
實(shí)施例3YhPS-T經(jīng)DEAE-Cellulose柱層析精制，YhPS的純度可達(dá)90％以上。具體的分離方法先將玻璃柱(2.8cm×20cm)用0.05mol/LNaHCO3平衡24小時(shí)，再稱取YhPS-T 150mg，溶于3～5mL蒸餾水中，離心(4500r/min，10min)。取上清液上玻璃柱，用無離子水洗脫，流速為8mL/10min，每管收集8mL，大約8～24管為吸收峰。收集后經(jīng)無離子水透析48小時(shí)，減壓濃縮，冷凍干燥后獲得52mg元胡多糖YhPS，純度可達(dá)到93.1％。若需進(jìn)一步提高純度，可采用Sephadex凝膠柱做進(jìn)一步純化。
實(shí)施例4YhPS-T經(jīng)DEAE-Cellulose柱層析精制，YhPS純度可達(dá)90％以上。具體的分離方法先將玻璃柱(2.8cm×20cm)用0.05mol/LNaHCO3平衡24小時(shí)，再稱取YhPS-T 303mg，溶于3～5mL蒸餾水中，離心(4500r/min，10min)。取上清液上玻璃柱，用無離子水洗脫，流速為8mL/10min，每管收集8mL，大約8～25管為吸收峰。收集后經(jīng)無離子水透析48小時(shí)，減壓濃縮，冷凍干燥后獲得86.1mg元胡多糖YhPS，純度可達(dá)到95.8％。若需進(jìn)一步提高純度，可采用Sephadex凝膠柱做進(jìn)一步純化。
實(shí)施例5生物活性研究我們對(duì)不同劑量的元胡總多糖YhPS-T送檢生物活性測(cè)定，其結(jié)果如下1.YhPS-T樣品對(duì)大鼠局灶性腦缺血的保護(hù)作用取Wister大鼠50只，體重190～220g，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為5組。假手術(shù)對(duì)照組、模型對(duì)照組、樣品高(80mg/kg)、中(40mg/kg)、低(20mg/kg)劑量組，按1ml/100g體積灌胃給藥。藥后1小時(shí)，所有大鼠以水合氯醛麻醉后(10mg/kg，ip)，仰臥固定，頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈及其頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈的分支枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈終末支，分離頸內(nèi)動(dòng)脈顱外分支翼突腭動(dòng)脈，用絲線結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈。
缺血模型對(duì)照組、藥物高劑量組、藥物中劑量組和藥物低劑量組的大鼠均自頸外動(dòng)脈插入魚線(0.3mm)，仔細(xì)導(dǎo)入頸內(nèi)動(dòng)脈后，魚線繼續(xù)插入其顱內(nèi)段，當(dāng)感到有明顯阻力時(shí)，插入的魚線長(zhǎng)約19mm，手術(shù)局部用溫生理鹽水紗布覆蓋。假手術(shù)對(duì)照組的大鼠不插入魚線，其余操作相同。
魚線插入術(shù)后1小時(shí)，小心抽出魚線，復(fù)灌，逐層縫合局部組織、肌肉、皮下筋膜及皮膚；假手術(shù)組分離術(shù)后1小時(shí)，逐層縫合局部組織、肌肉、皮下筋膜及皮膚。
a.動(dòng)物的行為學(xué)評(píng)分手術(shù)結(jié)束動(dòng)物完全清醒后，立即進(jìn)行第1次行為學(xué)評(píng)分，手術(shù)24小時(shí)候再評(píng)分1次，按照文獻(xiàn)報(bào)道的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，見表1，分別進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果進(jìn)行Ridit分析，見表2。并對(duì)其行為學(xué)積分進(jìn)行組間t檢驗(yàn)處理，見表3。
表1.神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別 分值神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)I級(jí) 0分 行為完全正常II級(jí) 1分 左側(cè)前爪不能完全展開III級(jí)2分 前行時(shí)向左面劃圈IV級(jí) 3分 向左側(cè)傾倒V級(jí) 4分 不能正常行走表2.YhPS-T樣品對(duì)腦缺血模型大鼠不同時(shí)間的神經(jīng)行為學(xué)分級(jí)與Ridit分析

注與假手術(shù)對(duì)照組比#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；與模型對(duì)照組比*P＜005，**P＜0.01.
表3.YhPS-T樣品對(duì)腦缺血模型大鼠行為學(xué)評(píng)分的影響(X±S，n＝10)組別 清醒即刻行為學(xué)評(píng)分手術(shù)24小時(shí)行為學(xué)評(píng)分假手術(shù)對(duì)照組 0.20±0.420.10±0.32模型對(duì)照組3.80±0.42 ###3.50±0.71 ###高劑量組 3.30±1.06 ###1.70±1.16 ###***中劑量組 3.60±0.70 ###2.00±0.94 ###***低劑量組 3.70±0.67 ###2.10±0.99 ###**注與假手術(shù)對(duì)照組比###P＜0.001；與模型對(duì)照組比**P＜0.01，***P＜0.001.
b.凝血時(shí)間測(cè)定分別于給藥前、手術(shù)時(shí)和手術(shù)后24小時(shí)分別測(cè)定凝血時(shí)間，
數(shù)據(jù)進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果見表4。
表4YhPS-T樣品對(duì)腦缺血模型大鼠不同時(shí)間的凝血時(shí)間的影響(X±S，n＝10)組別 給藥前凝血時(shí)間手術(shù)中凝血時(shí)間手術(shù)后24小時(shí)凝血(S) (S) 時(shí)間(S)假手術(shù)對(duì)照組 250.50±143.23219.30±52.61 307.30±164.52模型對(duì)照組238.20±73.21 156.10±58.27# 176.00±95.19#高劑量組 262.90±67.15 217.70±104.07 297.50±144.52中劑量組 233.60±66.41 221.80±96.02 286.40±121.15低劑量組 255.10±80.85 267.40±96.74**261.90±110.86注與假手術(shù)對(duì)照組比#P＜0.05；與模型對(duì)照組比*P＜005，**P＜0.01。
2.YhPS-T樣品對(duì)體內(nèi)血栓形成時(shí)間的影響取Wister大鼠40只，體重190～220g，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為4組。正常對(duì)照組、樣品高、中、低劑量組，按1ml/100g體積灌胃給藥，藥后1小時(shí)，大鼠以戊巴比妥鈉麻醉后(40mg/kg，ip)仰臥固定正中切口分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，采用BT-87-3型實(shí)驗(yàn)體內(nèi)血栓形成測(cè)定儀，在其近段刺激電極，遠(yuǎn)程置測(cè)溫器，以2.0Ma直流電刺激30秒后，記錄其血栓形成時(shí)間，計(jì)算其延長(zhǎng)率。結(jié)果進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，見表5。
表5YhPS-T樣品對(duì)體內(nèi)血栓形成時(shí)間的影響(X±S，n＝10)組別 劑量(mg/kg)血栓形成時(shí)間(S) 延長(zhǎng)率(％)正常對(duì)照組——189.90±160.70 0.00±0.00高劑量組 80276.60±203.78* 303.65±350.07中劑量組 40248.20±213.76 151.03±149.91低劑量組 20224.90±112.87 91.52±106.83注與正常對(duì)照組比*P＜005.
權(quán)利要求
1.一種元胡多糖YhPS，其重復(fù)結(jié)構(gòu)單元為 其中n＝1～20
2.如權(quán)利要求1所述的元胡多糖，其特征是分子量范圍為2000～39000。
3.如權(quán)利要求1所述的元胡多糖，其特征是主要由葡萄糖組成，還含有痕量的半乳糖和阿拉伯糖。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的元胡多糖的生產(chǎn)方法，其特征是包括將干燥過的生藥元胡用水浸泡，用有機(jī)溶劑沉淀，沉淀用水溶解，上清液經(jīng)透析或膜分離后，濃縮、經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥獲得總多糖，元胡總多糖加水溶解后，經(jīng)離子交換柱以及凝膠柱純化可得元胡多糖純品YhPS。
5.如權(quán)利要求4所述的元胡多糖的生產(chǎn)方法，其特征是生藥元胡與水浸泡的重量比元胡∶水＝1∶10～15，水浸泡時(shí)間24～36小時(shí)，浸泡液的pH＝6.0～7.0。
6.如權(quán)利要求4所述的元胡多糖的生產(chǎn)方法，其特征是所述的有機(jī)溶劑是與水互溶的有機(jī)溶劑。
7.如權(quán)利要求4所述的元胡多糖的生產(chǎn)方法，其特征是所述的離子交換柱層析所采用的離子交換劑為DEAE-Cellulose、DEAE-Sephacel、CM-Sephadex或Bio-Gel A型；所述的凝膠柱層析所采用的凝膠為Sephadex G型、SephacrylS型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，選用的分離范圍為1×103-5×104道爾頓。
8.如權(quán)利要求4所述的元胡多糖的生產(chǎn)方法，其特征是透析或膜分離采用的膜，其孔徑控制在截留分子量500～1000。
9.如權(quán)利要求1所述的元胡多糖的用途，其特征在于所述的元胡多糖可用于制備具有腦缺血保護(hù)作用的藥物或保健品。
10.一種元胡多糖的總多糖，其特征是由如下方法制備包括將干燥過的生藥元胡用水浸泡，用有機(jī)溶劑沉淀，沉淀用水溶解，上清液經(jīng)透析或膜分離后，濃縮、經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥獲得總多糖。
11.如權(quán)利要求10所述的元胡多糖的總多糖的生產(chǎn)方法，其特征是包括將干燥過的生藥元胡用水浸泡，用有機(jī)溶劑沉淀，沉淀用水溶解，上清液經(jīng)透析或膜分離后，濃縮、經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥獲得總多糖。
12.如權(quán)利要求10所述的元胡多糖的總多糖的用途，其特征在于所述的元胡多糖的總多糖可用于制備具有腦缺血保護(hù)作用的藥物或保健品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從中藥元胡中提取的多糖、其生產(chǎn)方法和用途。本發(fā)明采用水浸泡獲得元胡水提液，有機(jī)溶劑沉淀、沉淀用水溶解，上清液經(jīng)透析或膜分離，濃縮干燥獲得總多糖，元胡總多糖經(jīng)柱層析純化獲得元胡多糖YhPS，其重復(fù)結(jié)構(gòu)單元為，其中n＝1～20。本發(fā)明方法工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)藥效學(xué)試驗(yàn)表明，元胡總多糖YhPS－T具有腦缺血保護(hù)作用，可用于制備腦缺血保護(hù)作用的藥物或保健品。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1660914SQ20041008908
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月3日
發(fā)明者田庚元, 陶移文 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 浙江京新藥業(yè)股份有限公司