專利名稱：一種抑制基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用能產(chǎn)生小干擾RNA(siRNA)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)進(jìn)行的基因特異性抑制。構(gòu)建的dsRNA的數(shù)量和序列的選擇依據(jù)本發(fā)明所闡述的標(biāo)準(zhǔn)。此外，選擇的能產(chǎn)生siRNA的dsRNA的特定導(dǎo)入方法將可能解決目前在預(yù)防和治療SARS和HIV感染中存在的困難。
背景技術(shù)：
近年來，RNA的干涉作用在生物學(xué)領(lǐng)域帶來了很多驚喜。早在1990年，生物學(xué)家Rich Jorgensen在試圖使紫色牽?；ㄗ兊酶蠒r(shí)，就首次觀察到了這種干涉作用。他插入了另一拷貝的限速酶基因，但結(jié)果牽牛花不是變紫，反而變白了。他稱這種反常作用為“共抑制”，但在當(dāng)時(shí)，沒有人知道為什么在加入了更多促使特定顏色顯現(xiàn)的基因后反而會(huì)使該基因關(guān)閉。5年后，實(shí)驗(yàn)研究表明，使用單鏈的對照“有義”鏈RNA與“反義”鏈一樣能抑制靶基因。1998年，Andrew Fire和Craig Mello通過證實(shí)雙鏈RNA是真正的沉默物質(zhì)而揭露了其中的奧秘。他們稱之為“RNA干涉”，并由此誕生了一個(gè)新的領(lǐng)域(Blocker B.RNA interference dazzles researchcommunity.Journal of the National Cancer InstitueVol.95，No.7，April2，2003)。Tuschl小組將該技術(shù)延伸至哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并產(chǎn)生了RNA干涉或現(xiàn)稱的RNAi(Elbashir S.M.，Harborth J.，Weber K.，Tuschl T.Analysis ofgent function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs.Academic PressMethods 26(2002)199-213)。
在哺乳動(dòng)物中，雙鏈RNA或dsRNA主要是通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制靶向降解mRNA發(fā)生作用，同時(shí)已知這種序列特異性靶向識(shí)別的介質(zhì)是由大約21個(gè)核苷酸組成的小干涉RNA(siRNA)。這些小的siRNA通常是由一種較長的dsRNA在天然狀態(tài)下與Dicer RNA酶III發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生，當(dāng)這種siRNAs形成后，它們又與另一種稱為RNA-誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)結(jié)合。
發(fā)明概要如上文所述，所述的RISC siRNA復(fù)合體還未明確定義。選擇用作起始dsRNA或siRNAp模板的正確序列的工作目前還未標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)際上，可以有許多的序列組合都適合19-23個(gè)核苷酸(nt)dsRNA或siRNAp的標(biāo)準(zhǔn)，即使可能，決心從中選擇出正確的一個(gè)序列仍將十分困難。
為了試圖構(gòu)建更好的siRNAp或dsRNA，本發(fā)明將其與核糖核酸酶蛋白結(jié)合，該RISC蛋白最終使siRNA展開形成單鏈，這將引導(dǎo)RISC復(fù)合體使細(xì)胞質(zhì)靶mRNA發(fā)生降解(Hannon GJ.RNA interference.NatureVol.418，July 11，2002)。在某些物種中，siRNA RISC復(fù)合體也可以通過染色質(zhì)或其它能有效地改變基因遺傳表達(dá)的位點(diǎn)插入到序列特異性DNA中。如果這些siRNA與其它相同或不同靶向的RNA互補(bǔ)，則能產(chǎn)生可轉(zhuǎn)移RNAi。在一些有機(jī)體中，以靶mRNA為模板，RNA依賴或指導(dǎo)的RNA聚合酶(RdRP)也能啟動(dòng)siRNA的合成，然后通過非RISC的Dicer RNA裂解作用使靶mRNA失活。有時(shí)，即使在微量的dsRNA的引發(fā)下，siRNA使靶mRNA沉默的一些效果也能擴(kuò)大并擴(kuò)散至整個(gè)機(jī)體。然而，迄今為止，這種效果并沒有在哺乳動(dòng)物中觀察到。
來源于雙鏈或其它前體的SiRNA復(fù)合體，目前被廣泛地用于使培養(yǎng)細(xì)胞中的哺乳動(dòng)物基因沉默。這些功能性siRNAs的導(dǎo)入和形成目前可以采用不同方法來實(shí)現(xiàn)，如轉(zhuǎn)染，電穿孔，以及基于質(zhì)粒和基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。
迄今為止，將siRNAs直接導(dǎo)入動(dòng)物局限于僅有的幾例。當(dāng)注射到動(dòng)物的尾部靜脈或腦紋狀體區(qū)域時(shí)，在CMV啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)siRNAs的重組腺病毒降低了小鼠肝臟或大腦中的靶基因表達(dá)。迄今為止，只有Lieberman實(shí)現(xiàn)了真正的疾病預(yù)防他們將相當(dāng)于動(dòng)物血液總體積一半的3倍高壓注射液注射給小鼠，從而迫使siRNA指導(dǎo)Fas基因定向進(jìn)入肝臟(Couzin J.RNAi to the liver’s rescueScience NOW-Couzin 2003(210)1)，大約有80％至90％的肝細(xì)胞整合了該RNA分子。第二天，給予動(dòng)物一種抗體而使Fas過量，導(dǎo)致肝臟壞死。結(jié)果顯示，絕大多數(shù)的對照組小鼠死亡，然而82％的受治療小鼠存活。
該動(dòng)物研究的首次成功毫無疑問會(huì)引導(dǎo)進(jìn)一步研究而將該項(xiàng)技術(shù)用于治療人類疾病。
定義靶基因中的上述序列。
向某種疾病的普通的目的白細(xì)胞或者特別的淋巴細(xì)胞中導(dǎo)入siRNA也是困難的。在本發(fā)明中，向呼吸系統(tǒng)和體外干細(xì)胞中直接導(dǎo)入這些特別設(shè)計(jì)的siRNAs將有助于繞開治療SARS和HIV病毒感染中存在的一些困難。
發(fā)明的詳細(xì)描述選擇dsRNA或siRNAp正確序列的方法基于幾種已知的標(biāo)準(zhǔn)從基因序列中選擇候選目標(biāo)區(qū)域。我們查找了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的至少50bp，確定符合AA(n19)TT模式的區(qū)域，其中n可以為任何堿基。但是如果不存在這種模式，則選擇其它的次優(yōu)選序列(如nA(n19)Tn、nA(n19)nn)，它們必須具有大約50％的GC比率，且不含長串的核苷重復(fù)。雖然該選擇得到一種21-nt的dsRNA寡核苷酸，但該項(xiàng)技術(shù)還可用于獲得任何長度的寡核苷酸。
然后針對能產(chǎn)生天然發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它mRNA二級折疊的上游或下游同源區(qū)篩選這些siRNA候選區(qū)域(AA(n19)TT區(qū)域)。按3’-5’的方向閱讀包含(表1)或不包含(表2)第一個(gè)和最后兩個(gè)堿基的上述候選區(qū)域的5’端10個(gè)堿基或3’端的10個(gè)堿基，并確定位于同一mRNA上的任何這些區(qū)域的互補(bǔ)區(qū)域?；谙掠螇A基對的配對數(shù)量，對起始候選區(qū)域打分，并選出最互補(bǔ)同源序列(表1-3)。
構(gòu)建互補(bǔ)dsRNA寡核苷酸，使反義鏈互補(bǔ)于其19bp的中心區(qū)域。每一鏈都具有3’dTdT的突出，其全部或僅僅是其中的5’dT互補(bǔ)于靶序列(mRNA上外顯子序列，人們試圖對其序列翻譯進(jìn)行抑制)相應(yīng)的5’端區(qū)域。對候選序列進(jìn)行篩選并用相關(guān)的BLAST數(shù)據(jù)庫(htttp//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行配對以系統(tǒng)地檢測非特異性同源部分，排除那些同源性超過75％的序列。通過商業(yè)的寡核苷酸合成公司(Proligo)或其它可用的生產(chǎn)方式對siRNA寡核苷酸進(jìn)行測序和合成。


表1以人端粒酶RNA(hTR)的23-nt區(qū)域?yàn)榘械臐撛趕iRNA。除3’dTdT突出的配對堿基外，最終的區(qū)域基于19-nt識(shí)別序列。除其它標(biāo)準(zhǔn)外，最終siRNA的選擇是基于同源配對數(shù)量。下游互補(bǔ)同系物從其堿基計(jì)數(shù)起點(diǎn)開始計(jì)數(shù)。

表2以人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶亞基基因(hTERT)為靶區(qū)域的潛在siRNA。僅在19nt內(nèi)部識(shí)別序列的基礎(chǔ)上選擇區(qū)域。除其它標(biāo)準(zhǔn)外，最終siRNA的選擇是基于同源配對數(shù)量?；パa(bǔ)同系物從其堿基計(jì)數(shù)起點(diǎn)開始計(jì)數(shù)。

表3以SARS復(fù)制酶(pol)編碼區(qū)的為靶區(qū)域的潛在siRNA。在21bp內(nèi)部同源序列(每一突出端的第一個(gè)堿基)的基礎(chǔ)上選擇區(qū)域。除其它標(biāo)準(zhǔn)外，最終siRNA的選擇是基于同源配對數(shù)量。互補(bǔ)同系物從其堿基計(jì)數(shù)起點(diǎn)開始計(jì)數(shù)。
計(jì)算機(jī)輔助序列選擇采用能識(shí)別這些特定、簡單標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算機(jī)軟件可以迅速的識(shí)別siRNA-靶區(qū)域。目前可用的軟件如Primer Express(Applied Biosystems)，BLAST(National Centre for Biotechnology Information)，Gene-ToolLite(Bio Tools Inc.)能實(shí)現(xiàn)非常簡單的功能，但是我們需要尋找一種能搜索短的下游反向互補(bǔ)序列的軟件工具。據(jù)預(yù)測這種軟件工具在不久的將來就會(huì)問世。
如果不止一個(gè)區(qū)域具有相似的配對序列和下文計(jì)算公式部分定義的RNA偏好指數(shù)(RPI)，則可以通過序列比較和本領(lǐng)域公知的排列算法(參見Gribskov and Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991)和采用各種算法和軟件包(例如Gene Tool lite)計(jì)算在不同程度同源性下的可能的結(jié)合結(jié)果來進(jìn)行進(jìn)一步的區(qū)域性篩選。
發(fā)明所用的計(jì)算公式除了其它確定的優(yōu)點(diǎn)以外，本發(fā)明既提高了結(jié)果siRNA的效果又提高了其特異性。至今還沒有在任何一種有機(jī)體中精確地展現(xiàn)RNA干涉和基因沉默的確切性質(zhì)，在哺乳動(dòng)物中則更沒有。RISC蛋白的結(jié)構(gòu)和功能以及所采用的有義或反義RNA的特定鏈都仍在研究中。本發(fā)明的目的是從成百上千的可用于所給目的的組合中篩選出最可能的序列組合。
對上游或下游互補(bǔ)區(qū)域或?qū)ρ?’-3’或3’-5’方向(也可以為5’-5’，3’-3’)具有盡可能多的與siRNA核苷酸堿基理想配對的區(qū)域進(jìn)行選擇，然后通過標(biāo)準(zhǔn)比較和排列算法對其余的區(qū)域進(jìn)行選擇，這能實(shí)現(xiàn)多種理論上的重要意圖。
最初的想法是選擇出盡可能多的互補(bǔ)核酸堿基。理想情況是19nt全部都配對，如果該情況不可能，則盡最大可能地選擇一種具有最多核苷酸堿基配對的情況。例如，對一組19nt dsRNA(也可為其它長度的核苷酸)進(jìn)行選擇將獲得具有最多核苷酸配對數(shù)量的一組。理論上，具有8個(gè)核苷酸配對的組將比只有6個(gè)或7個(gè)配對的更好。雖然不是絕對必要條件，但配對的核苷酸應(yīng)從該鏈的第一個(gè)或第三個(gè)核苷酸開始?？蛇x擇地，可以在一個(gè)區(qū)域中存在多個(gè)配對片段，例如，配對可以是1-12，或2-7和9-14等等。
第二種想法是假如存在互補(bǔ)區(qū)域，則從同一組核苷酸序列中盡可能多地選擇出這種互補(bǔ)區(qū)域。例如，可以發(fā)現(xiàn)存在有3組19nt的dsRNA，且其都存在6nt的配對。其中的一組有一個(gè)還與上游或下游配對的額外6nt區(qū)域，而剩下的兩組僅有1個(gè)6nt區(qū)域。因此，從邏輯上應(yīng)選擇具有多于一個(gè)6nt配對區(qū)域的第一組。這種想法通常會(huì)獲得多個(gè)區(qū)域配對的組。這種區(qū)域越多越好。
有時(shí)，從一組具有更多的配對堿基和另一組具有更多的配對區(qū)域的兩組中進(jìn)行選擇可能是困難的。目前，我們優(yōu)先選擇那些至少有4-5個(gè)核苷酸配對且具有最多配對區(qū)域的一組。這種選擇背后的原因可能是因?yàn)镽ISC蛋白可以操縱由至少4-5個(gè)核苷酸的單鏈RNA組成的無缺口片斷以引導(dǎo)其進(jìn)入基因沉默模式。在這種情況下，配對區(qū)域越多，則基因沉默的機(jī)會(huì)越大。然而，后來證實(shí)RISC蛋白操縱一更長鏈的RNA作為引導(dǎo)。因此相對于更多的配對區(qū)域，更多的核苷酸配對將為最優(yōu)選的選擇。在任何情況下，采用本發(fā)明的決定主要集中于siRNA功能更多的奧秘是如何開始揭示的。
簡單計(jì)算公式如下1.首先優(yōu)選尋找最高的序列互補(bǔ)指數(shù)(Sc)，其定義如下Sc＝M/Risc其中Sc為序列互補(bǔ)指數(shù)M為配對的序列片段的核苷酸總數(shù)，其中該片斷超過了作為RISC蛋白的引導(dǎo)單鏈RNA的操縱序列所要求的最低長度。例如，如一選定區(qū)域具有3個(gè)配對片斷，其中的2個(gè)超過了5個(gè)連續(xù)的核苷酸，如1-6，8-15，而另一片段只有連續(xù)的4個(gè)核苷酸，如17-20；而RISC蛋白要求的最低鏈長度為5，因此，僅最初的2個(gè)片段符合計(jì)算要求。
M＝(1-6)+(8-15)M＝6+8M＝14
Risc為在特定系統(tǒng)中操縱的最小的有效核苷酸長度。在不同的物種或不同系統(tǒng)中，如在RdRP中其可能有變化。在上述情況下其設(shè)定為5。
Sc＝14/5Sc＝2.82.第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是選擇那些含有至少一個(gè)片段的區(qū)域數(shù)量，其中該片斷的序列超過了RISC蛋白要求的最小操縱單鏈長度。
N＝含有至少一個(gè)片段的區(qū)域數(shù)量，其中該片斷的配對情況超過Risc的要求3.該工作公式的最終結(jié)果為RPI＝Sc×NRPI為RNA偏好指數(shù)，用于選擇dsRNA或siRNAp，其中指數(shù)越高，則選擇更優(yōu)化。
4.如果不同RNA組具有相同或非常相似的RPI，則選擇具有最優(yōu)比較和排列算法結(jié)果的組。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明確，上述公式只是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明眾多方式中的一種。選擇更多特定靶目標(biāo)和更多互補(bǔ)區(qū)域的重要標(biāo)準(zhǔn)，平衡選擇的siRNA系統(tǒng)的工作限制，將促使本領(lǐng)域技術(shù)人員最大程度上的運(yùn)用本發(fā)明。
發(fā)明所涉理論的簡要說明基于本發(fā)明的選擇的優(yōu)點(diǎn)是多方面的。由于RISC蛋白最終將使dsRNA展開為單鏈形式，并可能修飾該鏈上一定數(shù)量的核苷酸，因此，使引導(dǎo)RISC蛋白到達(dá)靶基因的特定核苷酸暴露于盡可能多的靶將十分重要。如果在靶基因上存在多個(gè)這種配對核苷酸，則在存在可能阻止該過程的其它細(xì)胞內(nèi)因子的宿主中將增加這種基因沉默的可能性。另一方面，那些通常無功能的RISC蛋白的有義核苷酸鏈可以與選擇的配對區(qū)域互補(bǔ)，因此，特定選擇的siRNA的效果至少為以前隨機(jī)選擇方法的兩倍。除了siRNA分子和靶目標(biāo)的效果增加了2倍或更多倍的事實(shí)外，本發(fā)明得出一個(gè)推論，即哺乳動(dòng)物系統(tǒng)實(shí)際上是一個(gè)更復(fù)雜的系統(tǒng)，在沉默明確前當(dāng)然地需要更多的確認(rèn)信息，不能象閱讀理想系統(tǒng)那樣閱讀由帶有RISC蛋白的單鏈siRNA片段產(chǎn)生的單鏈靶區(qū)域。例如，如果用通過本發(fā)明的方法獲得的兩個(gè)或多個(gè)區(qū)域使靶RNA沉默，那么就可以確定這種靶沉默信號(hào)。在RNA干涉在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生長期效果或永久地轉(zhuǎn)移至其它細(xì)胞系統(tǒng)前，這種更明確的確認(rèn)系統(tǒng)可能會(huì)十分重要。對于預(yù)防和治療疾病，轉(zhuǎn)染或?qū)雜iRNA的能力十分重要，該siRNA能長期抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞遺傳表達(dá)且產(chǎn)生獲得上述沉默效果的系統(tǒng)細(xì)胞。為什么會(huì)這樣？在觀察中發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象，即在RNA沉默中發(fā)現(xiàn)天然的環(huán)狀RNA。該環(huán)狀RNA呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生dsRNA，由Dicer酶剪切成小片段，然后由RISC蛋白重新裝配形成單鏈引導(dǎo)siRNA。研究表明，dicer和RISC蛋白的RNA鏈的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)化存在相似性(Hammond S.M.，Boettcher S.，Caudy A.A.，Kobayashi R.，Hammon G.J.Argonaute2，a link between geneticand biochemical analyses of RNAi.ScienceMAG-Hammond etal.293(5532)1146)。該理論表明，系統(tǒng)是通過必須具有特異性的小鏈發(fā)生作用。由于其在天然情況下產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此天然形式的靶基因中必須存在互補(bǔ)區(qū)域。如果系統(tǒng)是按照“小片段鏈”理論發(fā)生作用的，則最好的確認(rèn)是能有2個(gè)或更多的區(qū)域沉默以確定發(fā)生這種特異性行為的受影響細(xì)胞。如果這種確認(rèn)強(qiáng)烈，則信號(hào)應(yīng)該會(huì)一直存在并會(huì)傳遞至機(jī)體的其它細(xì)胞。盡管這只是一種假設(shè)，但自然界中存在許多例子都能證實(shí)該理論。例如，基因是由僅有的兩組互補(bǔ)的核苷酸組成的，而不是由更多的不同核苷酸組成。因此，很可能是為了天然識(shí)別一種明確重要的行為如發(fā)生的，或在較長一段時(shí)間內(nèi)發(fā)生的或在整個(gè)機(jī)體中發(fā)生的基因沉默，確認(rèn)必須通過2個(gè)或更多(雖然較短)組的指令同時(shí)傳達(dá)，而不是僅通過一組較長的指令(雖然更特異和復(fù)雜)。本發(fā)明因此是基于上述理論的。
轉(zhuǎn)染，電穿孔的方法或載體表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)入siRNA介導(dǎo)的基因沉默的不同方法包括但不僅限于導(dǎo)入裸露的雙鏈siRNA；導(dǎo)入單鏈RNA以形成雙鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；導(dǎo)入一種含有合適啟動(dòng)序列的DNA質(zhì)粒以誘導(dǎo)合成RNA的2條互補(bǔ)鏈，該鏈在轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)或其它位點(diǎn)雜交而形成一雙鏈RNA結(jié)構(gòu)；導(dǎo)入構(gòu)建的重組病毒以轉(zhuǎn)錄得到2條互補(bǔ)RNA鏈，轉(zhuǎn)錄后該鏈雜交而形成一雙鏈RNA結(jié)構(gòu)；導(dǎo)入含有遺傳元件的重組細(xì)菌，其中的遺傳元件在轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)或其它位點(diǎn)能產(chǎn)生互補(bǔ)的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)以及任何上述系統(tǒng)，于是產(chǎn)生合適序列的單鏈RNA，從而形成影響轉(zhuǎn)錄的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它雙鏈結(jié)構(gòu)。
根據(jù)上述設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)，采用選擇的siRNA在體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞系或其它細(xì)胞(干細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等)。用于各種目的的細(xì)胞詳述于美國專利申請20020114784，20020173478，20030056235和20020132788。
為了進(jìn)行細(xì)胞系轉(zhuǎn)染，向24孔板中的每孔中加入總量為60pM的siRNA(3μl的20μM的溶液)。對于每孔，將siRNA加到50μl的Opti-MEM還原血清培養(yǎng)基中(Invitrogen)，輕輕混合。在一單獨(dú)試管中，將3μl的Oligofectamine轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)與12μl的Opti-MEM輕輕混合，隨后室溫溫育5分鐘?；旌瞎苤械膬?nèi)容物并在室溫下并溫育20分鐘使之能形成siRNA-Oligofectamine復(fù)合體。向每孔中加入68μl。根據(jù)其最終用途，在37℃下溫育24孔板不同時(shí)間。如果需要進(jìn)一步的轉(zhuǎn)染，可以進(jìn)行細(xì)胞傳代，并在72小時(shí)或更長的時(shí)間后進(jìn)行再轉(zhuǎn)染。
向特定疾病導(dǎo)入的方法將這種的特別設(shè)計(jì)的dsRNA或siRNAp導(dǎo)入的方法包括本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員公知的所有常用方法。
RNA可以直接導(dǎo)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)。它還可以導(dǎo)入組織的腔中，如呼吸系統(tǒng)，胸膜腔或組織間隙。它還可以通過不同的注射形式，如靜脈注射，動(dòng)脈內(nèi)注射或肌肉內(nèi)注射的方式導(dǎo)入到機(jī)體的循環(huán)系統(tǒng)。血管或血管外循環(huán)系統(tǒng)，血液或淋巴系統(tǒng)，根部，以及腦脊髓液均為這種特別設(shè)計(jì)的RNA的導(dǎo)入位點(diǎn)?？梢圆捎每诜?qū)C(jī)體直接浸浴的方式將其導(dǎo)入。也可以將其噴灑于植物。它可以通過主要的或目標(biāo)的有機(jī)體的遺傳修飾來表達(dá)，或通過導(dǎo)入經(jīng)過遺傳修飾而使該RNA表達(dá)到主要或目標(biāo)有機(jī)體中的另一有機(jī)體或載體來表達(dá)?？梢酝ㄟ^向來源于合適有機(jī)體的受精卵、胚胎干細(xì)胞或其它多能干細(xì)胞中導(dǎo)入一種重組構(gòu)建體，從而產(chǎn)生一種由這種構(gòu)建體表達(dá)上述特定設(shè)計(jì)的RNA的轉(zhuǎn)基因有機(jī)體。
導(dǎo)入這種特定設(shè)計(jì)的RNA的物理方法包括注射含有RNA的溶液，或用覆蓋有或含有RNA的小顆粒來轟擊，將細(xì)胞或有機(jī)體浸泡在含有RNA的溶液中或在RNA存在的條件下電穿孔細(xì)胞膜。其它本領(lǐng)域常用的方法還包括采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的載體運(yùn)輸和化學(xué)物質(zhì)介導(dǎo)的運(yùn)輸系統(tǒng)。假如導(dǎo)入到有機(jī)體的細(xì)胞中，可以將病毒構(gòu)建體包裝成為病毒粒子而實(shí)現(xiàn)表達(dá)構(gòu)建體的有效導(dǎo)入，該構(gòu)建體引導(dǎo)上述特定設(shè)計(jì)的RNA。這些特定設(shè)計(jì)的RNA還可以與其它這些組分一起導(dǎo)入增強(qiáng)細(xì)胞對RNA的吸收的組分，促進(jìn)雙鏈變性的組分，使鏈穩(wěn)定以及增強(qiáng)靶基因抑制的組分。
本發(fā)明還包括一種導(dǎo)入方法，該方法可用于治療肺部感染，如SARS病毒或其它感染的疫苗。采用常用技術(shù)例如霧化器可以將所述的RNA導(dǎo)入人體的上和下呼吸系統(tǒng)。將這種RNA產(chǎn)生的遺傳抑制導(dǎo)入到呼吸系統(tǒng)細(xì)胞和該系統(tǒng)中存在的免疫細(xì)胞中能預(yù)防特定的傳染性疾病，因而形成疫苗。
本發(fā)明還包括一種導(dǎo)入方法，該方法將RNA體外導(dǎo)入到干細(xì)胞或免疫功能性細(xì)胞中。在導(dǎo)入產(chǎn)生遺傳抑制的RNA后，所述的細(xì)胞被重新導(dǎo)回到有機(jī)體或人體以預(yù)防和治療疾病。雖然很可能在機(jī)體中擴(kuò)增和分化，但該細(xì)胞決不會(huì)改變所述有機(jī)體的遺傳表達(dá)。如何應(yīng)用上述導(dǎo)入方法的一個(gè)主要實(shí)施例是治療HIV感染。
使用領(lǐng)域本發(fā)明以及用于遺傳抑制的選擇的特定RNA可以用于治療和預(yù)防疾病。例如，如果此siRNA是用來治療原癌基因Kras，那么原癌基因引發(fā)的癌癥，如結(jié)腸癌，可以通過siRNA特異性的抗Kras而得以預(yù)防。一個(gè)實(shí)施例是采用這種RNA并將其導(dǎo)入癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中，從而抑制啟動(dòng)或保持所述癌癥表型的基因的遺傳表達(dá)。這還可應(yīng)用于預(yù)防癌癥，其通過選擇性抑制致癌基因或使起始表型轉(zhuǎn)化為癌癥表型所必須的基因來實(shí)現(xiàn)。這種治療可以應(yīng)用于幾乎所有類型的癌癥，其本身或與其它治療方式，例如化學(xué)治療，放射治療和手術(shù)治療等一起聯(lián)合使用。
本發(fā)明還可以以來源于任何病原體的基因?yàn)榘?。例如，該基因可直接?dǎo)致宿主免疫抑制或?qū)Σ≡w的復(fù)制、感染的傳播和擴(kuò)散十分重要。另外，可以將所述RNA導(dǎo)入到潛在感染細(xì)胞，如離體的免疫細(xì)胞和干細(xì)胞，并隨后將其重新導(dǎo)回宿主從而預(yù)防或治療疾病?？蛇x擇地，RNA可以采用不同的方法導(dǎo)入至危險(xiǎn)細(xì)胞，例如通過霧化器導(dǎo)入到SARS病人的呼吸系統(tǒng)。仍有活力的呼吸細(xì)胞對SARS病毒基因組的抑制將能預(yù)防病毒的進(jìn)一步的擴(kuò)散，從而達(dá)到治療的目的。
本發(fā)明不局限于任何類型的靶基因或核酸序列。出于說明目的，如下列出可能的靶基因類別發(fā)育基因，致癌基因，腫瘤抑制基因，酶基因等。
本發(fā)明還可用作方法學(xué)以生產(chǎn)對氣候損傷、昆蟲侵?jǐn)_、病原體感染和成熟特性具有較小敏感性的植物。事實(shí)上，任何在農(nóng)業(yè)中有用的基因都可能是這種特定選擇的RNA的潛在靶。
本發(fā)明還可用于確定有機(jī)體的基因功能，包括采用RNA抑制以前未知其功能的靶基因的活性。反過來，本發(fā)明還可用于研究敲除(knock down)某一已知功能的基因?qū)τ袡C(jī)體的影響。本發(fā)明可用于鑒定藥物形成的潛在靶和確定發(fā)育與衰老等的信號(hào)傳遞途徑?？梢灶A(yù)計(jì)本發(fā)明的方法可以用于形成預(yù)防和治療各種疾病，包括感染和癌癥的方法。
本發(fā)明的方法還可用于不同診斷方法和基因作圖研究。它可用于高通量的篩選。它可作為試劑盒的組分。該試劑盒還可以包括指導(dǎo)試劑盒的使用者實(shí)施本發(fā)明的說明。
雖然本發(fā)明采用標(biāo)準(zhǔn)的和可實(shí)施的方法和實(shí)施方案來描述，但應(yīng)當(dāng)理解為本發(fā)明并不局限于或限制于這些已公開的內(nèi)容。相反地，本發(fā)明涵蓋了在所附權(quán)利要求的主旨和范圍內(nèi)的不同改進(jìn)和類似的處理和方法。
應(yīng)當(dāng)明確，沒有偏離本發(fā)明的新穎性概念的所描述發(fā)明的改進(jìn)對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，且這種改變被認(rèn)為包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抑制細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法，包括向細(xì)胞中導(dǎo)入能產(chǎn)生小干涉核糖核酸(siRNA)的dsRNA或siRNA前體，其中dsRNA或siRNA前體具有與靶基因的靶向被選擇區(qū)域序列一致或接近一致的雙鏈結(jié)構(gòu)或單鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該靶向被選擇區(qū)域?yàn)樵诎谢蛲绘溨芯哂辛硪换パa(bǔ)或接近互補(bǔ)區(qū)域而使該鏈形成雙鏈的天然發(fā)夾結(jié)構(gòu)或多種相同或不同發(fā)夾dsRNA的區(qū)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中靶向被選擇區(qū)域在靶基因同一鏈中具有另一個(gè)或數(shù)個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，該互補(bǔ)區(qū)域與其具有19-23個(gè)核苷酸的最佳配對，該核苷酸具有siRNA功能選擇性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中靶向被選擇區(qū)域在同一靶基因中具有另一個(gè)或數(shù)個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，該互補(bǔ)區(qū)域與其具有少于全長19-23個(gè)核苷酸的任何數(shù)目的配對，該核苷酸具有siRNA功能選擇性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中靶向被選擇區(qū)域在靶基因同一鏈中具有另一個(gè)或數(shù)個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，該互補(bǔ)區(qū)域與其具有從第一個(gè)核苷酸開始的配對。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中靶向被選擇區(qū)域在靶基因同一鏈中具有另一個(gè)或數(shù)個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，該互補(bǔ)區(qū)域與其具有從任何位點(diǎn)開始的配對。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中靶向被選擇區(qū)域在靶基因同一鏈中具有另一個(gè)或數(shù)個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，該互補(bǔ)區(qū)域具有多個(gè)與其配對的片段，該片斷具有9-23個(gè)核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中靶向被選擇區(qū)域在同一靶基因中只有一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中靶向被選擇區(qū)域在同一靶基因中具有多個(gè)互補(bǔ)區(qū)域。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中靶向被選擇區(qū)域在多個(gè)基因中具有互補(bǔ)區(qū)域，因而能使多個(gè)靶基因沉默。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中產(chǎn)生siRNA的dsRNA和siRNA前體的長度不超過23個(gè)核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中產(chǎn)生RNAi的dsRNA和siRNA前體含有24個(gè)或更多的核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的靶基因?yàn)榧?xì)胞基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的靶基因?yàn)閮?nèi)源基因
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的靶基因?yàn)樘烊粊碓椿蛉斯碓吹牟《净颉?br> 16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的細(xì)胞來源于人。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的細(xì)胞來源于任何其他的動(dòng)物。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的細(xì)胞來源于植物。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的siRNA前體或dsRNA含有一條自身互補(bǔ)的鏈。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的siRNA前體或dsRNA含有兩條獨(dú)立的互補(bǔ)鏈。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中向細(xì)胞中導(dǎo)入是將dsRNA或siRNA前體導(dǎo)入到從有機(jī)體分離出的細(xì)胞中從而在體外完成目的抑制，然后將該細(xì)胞導(dǎo)回到同一或不同的有機(jī)體中從而實(shí)現(xiàn)基因抑制。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的細(xì)胞存在于第一有機(jī)體中，所述向細(xì)胞中導(dǎo)入是通過將含dsRNA或siRNA前體的第二有機(jī)體導(dǎo)入到第一有機(jī)體中來實(shí)現(xiàn)對第一機(jī)體的導(dǎo)入。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中向細(xì)胞中導(dǎo)入是導(dǎo)入含有siRNA前體或dsRNA的表達(dá)構(gòu)建體。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的細(xì)胞選自良性或惡性的腫瘤細(xì)胞和在有機(jī)體中具有預(yù)防和治療作用的腫瘤細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法，包括將從目標(biāo)基因中特定選擇的序列用于設(shè)計(jì)能產(chǎn)生本發(fā)明小干涉RNA(siRNA)的雙鏈或其它形式RNA(siRNA前體或siRNAp)，導(dǎo)入該RNA，從而抑制細(xì)胞基因的表達(dá)。采用這種方法可以預(yù)防和治療疾病，例如嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)和人類免疫缺陷病毒(HIV)感染。該方法可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行。雖然生產(chǎn)的小干涉RNA通常為長23個(gè)核苷酸或更短的序列，但是，本發(fā)明的從目標(biāo)基因中選擇序列的方法可適用于任何長度的雙鏈RNA。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1721530SQ20041006907
公開日2006年1月18日 申請日期2004年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月16日
發(fā)明者楊華顯 申請人:楊華顯