專利名稱：子宮內膜異位癥模型及模型建立方法
技術領域：
本發(fā)明涉及子宮內膜異位癥模型及模型的建立方法
背景技術：
子宮內膜異位癥是育齡婦女的常見病和多發(fā)病，發(fā)病率呈明顯上升趨勢，目前可達10-15％，占普通婦科手述的30％以上。子宮內膜異位癥所引起的痛經、下腹痛和性交痛等，嚴重影響婦女的健康和生活質量，也是不育癥的主要病因之一。子宮內膜異位癥病變廣泛，形態(tài)多樣，且有浸潤、轉移和復發(fā)的惡性生物學行為，成為難治之癥。關于其確切病因和病理生理機制尚不明確，需依靠腹腔鏡檢查或手術病理組織學檢查確診，且藥物治療和術后復發(fā)率較高。
子宮內膜異位癥自發(fā)性的發(fā)生發(fā)展需要周期性的內膜脫落，狒狒可以自發(fā)性發(fā)生子宮內膜異位癥，但發(fā)病率很低、代價高昂、實驗動物缺乏，限制了其在子宮內膜異位癥模型中的應用。動情動物的子宮內膜不發(fā)生脫落，不能自發(fā)性發(fā)生子宮內膜異位癥。有些動物可以接受腹腔內自體同源內膜的異位移植，包括家兔、獼猴和大鼠，但由于這些動物的內膜和人的內膜存在系統(tǒng)發(fā)生和生化特征的巨大差異，這類模型也有諸多局限。
上述原因的存在，極大地限制了對于該疾病的研究。
發(fā)明內容
本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術所存在的不足，提供一種NOD-SCID鼠子宮內膜異位癥模型及模型建立方法，為研究子宮內膜異位癥的發(fā)病機制、治療及預防策略提供基礎。
本發(fā)明解決技術問題所采用的技術方案是本發(fā)明NOD-SCID鼠子宮內膜異位癥模型，其特點是將早孕人蛻膜組織種植在NOD-SCID鼠腹部皮下建立子宮內膜異位癥模型。
本發(fā)明所述模型的建立方法的特點是按如下步驟操作a、取材蛻膜取自行人工流產術的婦女，妊娠40-50天，婦檢證實無先兆流產征象，術后見明顯絨毛，蛻膜組織新鮮；所取蛻膜置入培養(yǎng)液無菌瓶中，隨即置于冰盒并送入實驗室接種；b、接種前處理用2-6℃的無菌磷酸緩沖鹽溶液洗去血塊和黏液，于無菌培養(yǎng)皿內剪成小塊，分裝在盛有培養(yǎng)液的無菌管內為備用標本；c、種植腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后固定于操作板上，腹部消毒備皮，并做小口，將已備標本種植于皮下，無菌絲線縫合即成。
子宮內膜就組織學觀察可以分為3期其一為增生期，內膜細胞增生，內膜逐漸生長變厚；其二為分泌期，子宮內膜繼續(xù)增厚，內膜細胞分泌糖原；其三為月經期，內膜組織變性、壞死、出血。受精卵著床后，子宮內膜迅速發(fā)生蛻膜變，此時子宮內膜稱蛻膜。本發(fā)明模形因選取早孕人蛻膜組織建立NOD-SCID鼠子宮內膜異位癥動物模型，因而具備如下優(yōu)點1、蛻膜比增生期內膜厚，易刮取，獲取組織較多，可以一次種植多只NOD-SCID鼠。
2、人工流產是避孕失敗的有效補救措施，蛻膜取自人工流產婦女，其來源豐富。
3、蛻膜組織屬于正常生理妊娠的一部分，穩(wěn)定可靠，不受其他疾病因素的影響。
4、采用妊娠40-50天的蛻膜組織，不受子宮內膜周期性變化的影響。
5、機體免疫系統(tǒng)對蛻膜呈現(xiàn)免疫豁免狀態(tài)，由此導致子宮內膜容易異位種植，為造模提供了更好的理論依據。
本發(fā)明中采用的NOD-SCID小鼠即非肥胖性糖尿病嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠，為先天性T、B淋巴細胞聯(lián)合免疫缺陷動物，可以克服異種間的免疫排斥反應，接受人類疾病的病理變化。NOD-SCID小鼠遺傳背景明確，體內微生物可控制，模型性狀顯著且穩(wěn)定，質量和規(guī)格可選擇，價格適中，來源豐富。本發(fā)明模型建立成功率高、移植后的組織仍保持子宮內膜的組織形態(tài)，模型性狀顯著且穩(wěn)定，觀察周期短，實驗結果的具有較大的臨床參考意義。
圖1為本發(fā)明移植物HE染色×200。
圖2為本發(fā)明移植物角蛋白染色×200。
圖3為本發(fā)明移植物Ki-67染色×200。
圖4為本發(fā)明移植物波形蛋白染色×200。
圖5為本發(fā)明移植物無雌、孕激素受體表達×200。
具體實施例方式本實施例中NOD-SCID鼠子宮內膜異位癥模型是將早孕人蛻膜組織種植在NOD-SCID鼠腹部皮下建立子的宮內膜異位癥模型。
模型的建立按如下步驟操作取材蛻膜取自行人工流產術的婦女，妊娠40-50天，婦檢證實無先兆流產征象，術后見明顯絨毛，蛻膜組織新鮮；NOD-SCID鼠，取6-8周齡、性成熟、雌性、體重20-25g。
運送蛻膜置入5ml的RPMI-1640培養(yǎng)液無菌瓶，隨即置于冰盒并送入實驗室接種。RPMI-1640培養(yǎng)液中含有100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素。
漂洗用2-6℃的無菌磷酸緩沖鹽溶液PBS洗去血塊和黏液。
剪碎于無菌培養(yǎng)皿內剪成1×2mm小塊，分裝在盛有培養(yǎng)液的無菌管內，準備接種。
種植氯胺酮100mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后固定于操作板上，腹部酒精消毒備皮，并做一0.5cm長的小口，將已備標本種植于皮下，無菌絲線縫合。
分組隨機將種植了蛻膜的NOD-SCID鼠分為2周組、4周組、6周組、8周組，每組4只。
病理檢查于第2、4、6、8周從小鼠的腹部皮下取出種植物，10％福爾馬林固定，乙醇逐級脫水，常規(guī)石蠟包埋，分別做HE及免疫組織化學染色。
結果A、16只小鼠全部成活。
B、于2周、4周、6周、8周從小鼠的腹部皮下取出的移植物經HE染色，有15只小鼠鏡檢見到子宮內膜腺體和間質，成功率為93.75％。隨著種植時間延長，內膜腺體和間質的結構無明顯改變，各組間形態(tài)學無明顯差異(圖1所示)。說明移植后蛻膜的形態(tài)結構沒有發(fā)生改變。
C、移植物中腺上皮細胞角蛋白及ki-67陽性，基質細胞陰性(圖2、3所示)，基質細胞波形蛋白陽性，腺上皮陰性(圖4所示)，腺上皮和基質細胞無雌、孕激素受體的表達(圖5所示)。K-i67陽性說明移植后的蛻膜細胞仍具有增殖能力。角蛋白、波形蛋白陽性說明移植后蛻膜細胞的生化特性沒有改變。
權利要求
1.一種子宮內膜異位癥模型，其特征是將早孕人蛻膜組織種植在NOD-SCID鼠腹部皮下建立子宮內膜異位癥模型。
2.一種權利要求1所述模型的建立方法，其特征是按如下步驟操作a、取材蛻膜取自行人工流產術的婦女，妊娠40-50天，婦檢證實無先兆流產征象，術后見明顯絨毛，蛻膜組織新鮮；所取蛻膜置入培養(yǎng)液(RPMI-1640)無菌瓶中，隨即置于冰盒并送入實驗室接種；b、接種前處理用2-6℃的無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗去血塊和黏液，于無菌培養(yǎng)皿內剪成小塊，分裝在盛有培養(yǎng)液(RPMI-1640)的無菌管內為備用標本；c、種植腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后固定于操作板上，腹部消毒備皮，并做小口，將已備標本種植于皮下，無菌絲線縫合即成。
3.根據權利要求2所述的模型的建立方法，其特征是所述步驟b中的培養(yǎng)液(RPMI-1640)中含有100U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素。
全文摘要
子宮內膜異位癥模型及模型建立方法，其模型的特征是將早孕人蛻膜組織種植在NOD－SCID鼠腹部皮下建立子宮內膜異位癥模型。建膜方法的特征是蛻膜取自行人工流產術的婦女，婦檢證實無先兆流產征象，術后見明顯絨毛，蛻膜組織新鮮；所取蛻膜接種在小鼠腹部皮下，無菌絲線縫合即成。本發(fā)明模型建立成功率高、移植后的組織仍保持子宮內膜的組織形態(tài)，模型性狀顯著且穩(wěn)定，觀察周期短，實驗結果具有較大的臨床參考意義。
文檔編號A61K49/00GK1660445SQ20041006589
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權日2004年12月24日
發(fā)明者凌斌, 王群華, 趙衛(wèi)東, 祝懷平, 陳崢崢, 陳綱, 周穎, 沈國棟, 朱園園, 陳敏, 許恬怡, 姚鳳球 申請人:安徽省立醫(yī)院