專利名稱：含水飛薊賓和三七總苷的保肝制劑及其制備與質(zhì)控方法
專利說明含水飛薊賓和三七總苷的保肝制劑 及其制備與質(zhì)控方法 本發(fā)明涉及一種具有保肝作用，治療多種肝臟損傷疾病的注射用藥物及其制備方法和質(zhì)量控制方法。該藥物由中藥水飛薊中提取的黃酮類成分水飛薊賓的水溶性衍生物水飛薊賓葡甲胺和傳統(tǒng)名貴中藥三七中提取的有效組分三七總皂苷制成。肝臟是人體重要的代謝器官，結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜，易受多種病原體、毒物及免疫病理累及。病毒、化學(xué)物質(zhì)、藥物、酒精及自體免疫等都可能造成肝損傷的發(fā)生。尤其是病毒性肝炎，分布于世界各地，由于難以根治和危害面廣，而與癌癥、艾滋病并稱“世紀(jì)三大頑癥”；我國(guó)是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，僅乙型肝炎病毒攜帶者就達(dá)1.3億。隨著制藥業(yè)的迅速發(fā)展，藥物性肝炎日益成為一個(gè)世界性的大問題，長(zhǎng)期用藥或重癥時(shí)大量用藥，可引起肝細(xì)胞損害，可導(dǎo)致急性肝衰竭、急性肝炎、慢性肝炎、生化異常、膽汁淤積性肝炎、脂肪肝、脂質(zhì)過氧化、肉芽腫、血管損傷等，即“藥物性肝炎”發(fā)生；研究表明女性和年齡40歲以上的人群更容易患藥物性肝損傷。近年來，我國(guó)酒精性肝病(Alcoholic，liver disease，ALD)的發(fā)病率亦呈逐年增加的趨勢(shì)，在一些地區(qū)已成為第二大肝??；我國(guó)現(xiàn)有酒民3億多，酒精性肝病的發(fā)病率約為20％左右。各種原因所致的肝損傷如果得不到及時(shí)、有效的治療和保護(hù)，就會(huì)進(jìn)一步惡化為肝纖維化、肝硬化。
臨床上采用對(duì)癥進(jìn)行抗肝損傷治療，保肝降酶是抗肝損傷的基本治療法則。臨床研究報(bào)道中藥保肝降酶沒有明顯副作用，從而具有抗肝損傷治療優(yōu)勢(shì)。因此，具有保肝降酶活性的中藥成為目前的研究熱點(diǎn)。
近年來，水飛薊被公認(rèn)為治療肝炎的5大有效植物藥物之一，其制劑已廣泛用于治療急慢性肝炎及肝硬化等[睢大.保肝藥水飛薊素的藥理研究進(jìn)展.時(shí)珍國(guó)藥研究，1993，4(4)41]。
水飛薊藥用有效組分以水飛薊素為主，藥用有效成分以水飛薊賓為主。水飛薊成分以直接清除活性氧、保護(hù)肝細(xì)胞膜為特點(diǎn)，同時(shí)具有抑制5-脂氧合酶，促進(jìn)被損傷肝細(xì)胞合成DNA及結(jié)構(gòu)蛋白，免疫調(diào)節(jié)和抗肝纖維化等藥理學(xué)作用，現(xiàn)主要制劑是德國(guó)公司生產(chǎn)的利肝隆片、國(guó)內(nèi)研制的“益肝靈”(水飛薊素制劑)及水飛薊賓葡甲胺片(主要含水飛薊素中的水飛薊賓)。臨床研究顯示，該類藥物具有上述廣泛的藥理學(xué)效應(yīng)，且不良反應(yīng)少、病人耐受力好，是各型病毒性肝炎、肝纖維化、酒精性肝損害以及其它中毒代謝性肝損害等的一種良好治療藥物。
但水飛薊賓極難溶于水，且傳統(tǒng)制劑都為口服制劑，生物利用度很低。有人將水飛薊賓制成葡甲胺單獨(dú)用于臨床，但是不穩(wěn)定，較易出現(xiàn)絮狀物，且在水中的溶解度仍不高。
水飛薊在治療肝損傷方面的主要藥理作用①抗氧化、對(duì)肝細(xì)胞膜的保護(hù)作用水飛薊成分具有強(qiáng)抗氧化活性，在歐洲和亞洲都被作為抗肝毒制劑在臨床上廣泛應(yīng)用[Lahiri-Chatterjee M，Katiyar SK，Mohan RR，AgarwalR.Aflavonoidant ioxidant，silymarin，affords exceptionally high protection agaist tumor promotionin the SENCAR mouse skin tumorigenesis model.Cancer Research，1999，59(3)622]?；钚匝?ROS)包括超氧陰離子O2-，經(jīng)自由基(OH·)，次氯酸陰離子(HOCl-)，過氧化氫(H2O2)等，具有高度的反應(yīng)性，可與不飽和脂肪酸作用引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷細(xì)胞膜，水飛薊素可通過抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性、保護(hù)肝細(xì)胞膜，還能阻斷損害肝細(xì)胞成分與肝細(xì)胞膜上特異受體的結(jié)合，抑制其對(duì)肝細(xì)胞膜的攻擊及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，中斷其肝腸循環(huán)，因此，水飛薊素可以增強(qiáng)肝細(xì)胞膜對(duì)多種損害因素的抵抗力[于樂成，顧長(zhǎng)海.利加隆及其藥理學(xué)效應(yīng)研究進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)藥—合成藥生化藥制劑分冊(cè)，2000，21(4)201～203]。
②促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)、再生水飛薊素進(jìn)入肝細(xì)胞后可與雌二醇受體結(jié)合并使之激活，活化的受體則可增強(qiáng)肝細(xì)胞核內(nèi)RNA聚合酶I的活性，使核糖體RNA(r RNA)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，胞漿內(nèi)核糖體數(shù)目增多，促進(jìn)酶及結(jié)構(gòu)蛋白等的合成，并間接促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成，有利于肝細(xì)胞的修復(fù)、再生。這種作用可見于受損傷的肝細(xì)胞及肝部分切除術(shù)后剩余的肝細(xì)胞，而未見于正常肝細(xì)胞及多種惡性腫瘤細(xì)胞[Leng Peschlow E，Strenge-Hesse A.The milk thistle(silybum marianum)and sily-marin as hepatic therapeutic agents[J].Phytotherapie，1991，12(1)162]。
③抗炎作用細(xì)胞膜磷脂在磷脂酶A2的作用下代謝為花生四烯酸，后者通過5-脂氧合酶轉(zhuǎn)變?yōu)榘兹?LTs)，研究顯示水飛薊素優(yōu)先抑制脂氧合酶，顯著減少LTs的生成，減少其毒性損害[Demlow C，Murawski N，de Groot H，et al.Scavenging ofreactive oxygen species andinhibition of arachidonic acid metabolism by silibum in human cells[J].Life Science，1996，58(18)1591.]；研究表明水飛薊素能抑制白三烯的產(chǎn)生，具有抗炎和抗纖維化作用[徐諾摘譯.國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè).1998，20(1)37]。
三七總皂苷(簡(jiǎn)稱PNS)是三七中的一類主要化學(xué)成分，以改善肝臟微循環(huán)促進(jìn)肝代謝、抗肝纖維化活性為特色，同時(shí)具有抗肝脂質(zhì)過氧化、保護(hù)肝細(xì)胞、抗炎等藥理作用，因此具有良好的抗肝損傷作用。但單獨(dú)使用三七總皂苷易出現(xiàn)溶血作用引起的不良反應(yīng)。
三七總皂苷在治療肝損傷方面的主要藥理作用①改善肝臟微循環(huán)李哲等用造成大鼠離體灌流肝損傷模型，并觀察了PNS對(duì)該模型的影響，表明PNS能明顯增加血管流量，改善肝臟微循環(huán)，減輕肝損傷[李哲.三七總皂苷對(duì)大鼠離體灌流苷的影響[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，16(2)11]。巫善明對(duì)13例慢性肝炎患者在用參三七注射治療前后進(jìn)行血液流變學(xué)觀察，治療3個(gè)月后，全血黏度、血沉、血沉方程K值，紅細(xì)胞電泳率和纖維蛋白原含量明顯降低，認(rèn)為三七能解除血液的濃、黏、聚、凝狀態(tài)，改善肝臟循環(huán)，增加血流量[巫善明.三七注射液治療13例慢性肝炎血液流變血觀察[J].上海中醫(yī)藥雜志，1983，5(8)12]。
②抗肝纖維化活性作用熊磊等觀察了PNS及三七對(duì)成纖維細(xì)胞增殖及I型膠原合成與分泌的影響，結(jié)果表明三七及PNS可抑制NIH/3T3細(xì)胞增殖及I型膠原生成與分泌，可能有抗肝纖維化活性而PNS則是三七抗肝纖維化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[熊磊，劉平.三七總皂苷抗肝纖維化活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，1999，6(5)317]。熊磊等還對(duì)三七及PNS對(duì)NIH/3T3細(xì)胞增殖抑制作用進(jìn)行了比較，結(jié)果表明二者均能抑制NIH/3T3細(xì)胞增殖，并呈一定濃度依賴性。與同濃度組三七比較，PNS效果更顯著，說明三七抗肝纖維化活性的主要化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)可能是PNS[熊磊，劉成海.三七及三七總皂苷對(duì)NIT/3T3細(xì)胞增殖抑制作用比較[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，22(2)1]。熊磊等進(jìn)一步探討肝纖維化作用機(jī)制結(jié)果證明PNS抗肝纖維化作用可能是通過抑制肝星狀細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)外I型膠原生成來實(shí)現(xiàn)的[熊磊，劉平.三七皂苷對(duì)肝星狀細(xì)胞及膠原生成的影響[J].中西醫(yī)肝病雜志，1999，9(3)19]。張榮華等探討三七對(duì)四氯化碳中毒性肝纖維化的防治作用，結(jié)果三七治療后肝細(xì)胞損害，肝臟脂肪變性，炎細(xì)胞浸潤(rùn)的程度均較輕，成纖維細(xì)胞和膠原纖維增生亦較少。說明三七對(duì)肝細(xì)胞損害有一定保護(hù)作用，并可明顯抑制肝組織中成纖維細(xì)胞及膠原纖維增生，是較理想的抗肝損傷、防治肝纖維化的藥物[張榮華，周子龍三七抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22(4)307]。
③抗炎活性用PNS、電針(EA)對(duì)炎癥動(dòng)物進(jìn)行治療，并用納絡(luò)酮阻斷兩者作用，用組織化學(xué)的方法對(duì)PNS和EA的效應(yīng)進(jìn)行比較，兩者均有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)整作用[王一菱，陳迪，吳景蘭.三七總甙抗炎和鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)理探討.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志.1994，14(1)35]。
目前國(guó)內(nèi)肝損傷病群多，治療用藥市場(chǎng)大，特別是在注射液用藥上，藥物奇缺，主要是甘草酸類的注射液在大量臨床應(yīng)用，但其療效有限，因此我國(guó)尚沒有好的治療肝損傷的特效藥，也沒有三七與水飛薊配伍的研究報(bào)道及相關(guān)研究信息。我們以水飛薊賓與三七總皂苷配合制成注射液主要優(yōu)點(diǎn)為水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷有配伍增效、互補(bǔ)作用，使抗肝損傷作用比單一藥物作用更強(qiáng)。三七總皂苷能顯著提高水飛薊賓葡甲胺在水中的溶解度及穩(wěn)定性，從而提高其粉針溶化性及質(zhì)量，而水飛薊賓能降低三七總皂苷的溶血作用，從而提高其安全性。本制劑具有顯著的抗肝損傷作用，用于保護(hù)肝臟、治療各型病毒性肝炎、酒精性肝損害、藥物及其它中毒代謝性肝損害、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病。本發(fā)明的目的之一在于提供一種由水飛薊中提取的黃酮類成分水飛薊賓的水溶性衍生物水飛薊賓葡甲胺和三七中提取的有效組分三七總皂苷組成的注射用復(fù)方制劑，可有效保護(hù)受損肝臟，用于各類肝臟疾病的治療。經(jīng)藥理活性篩選和拆方研究，我們將水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷進(jìn)行了配伍研究，發(fā)現(xiàn)本處方二藥合在一起配用，與單獨(dú)使用其中任何一種相比，藥效明顯增強(qiáng)，毒副作用降低；藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，本復(fù)方制劑用于多種肝臟疾病療效顯著；該注射用復(fù)方藥物經(jīng)毒理實(shí)驗(yàn)表明，毒性極小。
由于水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷的口服吸收差，將其開發(fā)成注射給藥的粉針劑后，有效成分可直接進(jìn)入人體內(nèi)，療效高，充分發(fā)揮配伍優(yōu)勢(shì)，旨在開發(fā)出新一代保肝、抗肝損傷特效藥物。本發(fā)明另一目的在于提供上述注射用復(fù)方制劑的制備方法及質(zhì)控方法，其中質(zhì)控方法包括水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷的薄層鑒別、含量測(cè)定及指紋圖譜的制定。
本中藥為有效部位復(fù)方制劑，原料重量配比為水飛薊賓葡甲胺1份三七總皂苷0.2-2份。
本中藥為有效部位復(fù)方制劑，較優(yōu)的原料重量配比為水飛薊賓葡甲胺1份三七總皂苷1份其中水飛薊賓葡甲胺(含水飛薊賓50-65％)為原料藥，來源于盤錦格林恩生物資源開發(fā)有限公司。
三七總皂苷(含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1總和60-80％)為原料藥，來源于云南植物藥業(yè)有限公司。
水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷的用量比不受本文的限制，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷的用量比還可以變化，而使用效果不發(fā)生顯著的變化。
本注射用復(fù)方制劑劑型包括注射液、粉針。
本注射用復(fù)方制劑的配伍使用，主要優(yōu)點(diǎn)為1.水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷有配伍增效作用，使本制劑起效快，療效高；2.三七總皂苷有助溶作用，能顯著提高水飛薊賓葡甲胺在水中的溶解度及穩(wěn)定性，從而提高其生物利用度；3.水飛薊賓葡甲胺的加入，能降低三七總皂苷的溶血作用，從而提高其安全性。
本發(fā)明還提出了上述組合物的制備方法，其注射劑的制備步驟如下
取1重量份水飛薊賓葡甲胺，用適量注射用水?dāng)嚢?，溶解，離心，上清液加入0.2-2重量份三七總皂苷，再加入配液總體積10-20％(V/V)的助溶劑，該助溶劑為聚乙二醇或丙二醇的任一種，使溶解，用適量的注射用水定容至一定體積，混勻，過濾，濾液經(jīng)通量為50000～100000分子量的超濾膜超濾，超濾液灌封成注射液，消毒，即得注射液。
上述組合物制備粉針劑，按如下步驟取1重量份水飛薊賓葡甲胺，用適量注射用水?dāng)嚢瑁芙?，離心，上清液加入0.2-2重量份三七總皂苷，再加入配液總體積2-8％(W/V)的成型劑，該成型劑為甘露醇或葡萄糖中的至少一種，使溶解，用適量的注射用水定容至一定體積，混勻，過濾，濾液經(jīng)通量為50000～100000分子量的超濾膜超濾，無菌超濾液分裝，每瓶4-5ml，凍干，壓蓋，即得粉針。超濾液也可以直接冷凍干燥，無菌分裝，壓蓋，得粉針。
本發(fā)明復(fù)方藥物凍干粉的鑒別方法，具體步驟是(1)水飛薊賓葡甲胺的鑒別取本品1瓶，用甲醇分次少量超聲溶解，溶液濃縮至1ml，離心，取上清液作為供試品溶液。取水飛薊賓對(duì)照品適量，加甲醇制成1mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2000版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10ul，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-丙酮-甲酸(9∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(254nm)下觀察。在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
(2)三七總皂苷的鑒別供試品溶液的制備同上。另取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對(duì)照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各10ul，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸乙酯-水(4∶1∶5)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與混合對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)。
本發(fā)明復(fù)方藥物凍干粉的含量測(cè)定方法，具體是(1)水飛薊賓葡甲胺的含量測(cè)定HPLC測(cè)定水飛薊賓的含量取本品1瓶，用甲醇分次少量超聲使溶解，完全轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，用甲醇定容，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，為供試品液；以甲醇配制的水飛薊賓液為對(duì)照；Agilent 1100高效液相色譜儀，QuatPump泵，VWD紫外-可見檢測(cè)器。
色譜柱淮陰漢邦科技公司，反相C18柱Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)；淮陰漢邦科技公司，反相C18柱Lichrospher C18(4.6×250mm，5μm)。結(jié)果顯示，Lichrospher C18色譜柱分離效果不及Kromasil C18色譜柱，故選用Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)。
流動(dòng)相若用乙腈-0.05％三氟乙酸水系統(tǒng)，水飛薊賓的兩個(gè)異構(gòu)體峰很難分離；使用甲醇-0.05％三氟乙酸水系統(tǒng)，水飛薊賓的其中一個(gè)異構(gòu)體峰與雜質(zhì)峰難以分離。故采用乙腈-甲醇-0.05％三氟乙酸水系統(tǒng)洗脫，甲醇∶乙腈∶0.05％三氟乙酸水＝17.5∶17.5∶65(V/V)為流動(dòng)相，可使兩個(gè)異構(gòu)體峰和雜質(zhì)峰達(dá)到很好的分離。
測(cè)定波長(zhǎng)據(jù)水飛薊賓的紫外光譜，其最大吸收波長(zhǎng)為288nm，故將其測(cè)定波長(zhǎng)確定在288nm。柱溫35℃。流速1.0ml/min。
(2)三七總皂苷的高效液相法含量測(cè)定取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，用水定容，搖勻，精密量取2ml置分液漏斗中，加入正丁醇飽合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水飽合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇飽合的水液分次洗滌至中性，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)?5％乙腈(V/V)溶解，轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，定容，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，即得，為供試品液；以流動(dòng)相A配制的三七皂苷R1和人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液；儀器、色譜柱同上。
測(cè)定波長(zhǎng)據(jù)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的紫外光譜，其最大吸收波長(zhǎng)為203nm、203nm、205nm，故將其測(cè)定波長(zhǎng)確定在203nm。柱溫30℃。流速1.0ml/min。
流動(dòng)相為A溶劑系統(tǒng)25體積％的乙腈和B溶劑乙腈；梯度洗脫條件經(jīng)過多次試驗(yàn)，只有梯度洗脫條件下才能使三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1與其它各峰達(dá)到很好的分離。流動(dòng)相線性梯度條件如下
不直接用乙腈和水進(jìn)行梯度混合，而采用25％乙腈(A)和乙腈(B)進(jìn)行梯度洗脫，是為了防止乙腈與水混合時(shí)產(chǎn)生了氣泡，在末端吸收處測(cè)定時(shí)基線不穩(wěn)。
(3)三七總皂苷的比色法含量測(cè)定UV-754紫外分光光度儀。
供試品溶液的制備取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，用水定容，搖勻，精密量取2ml，置分液漏斗中，加入正丁醇飽合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水飽合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇飽合的水液分次洗滌至中性，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，定容，搖勻，即得溶液，精密量取該溶液1ml，置5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
對(duì)照品溶液的制備精密稱取經(jīng)60℃真空干燥2小時(shí)的人參皂苷Rg1對(duì)照品約1.84mg，置5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成每1ml中含人參皂苷Rg10.368mg的溶液。
樣品測(cè)定精密量取樣品及對(duì)照品溶液各0.2ml于試管中，同時(shí)做一空白管，在烘箱里蒸干，冷至室溫，加5％香莢蘭醛冰醋酸溶液0.2ml，加1.2ml高氯酸，在70℃熱水浴中顯色50分鐘，放冷，加冰醋酸4.6ml，搖勻，在546nm波長(zhǎng)測(cè)定吸收度。計(jì)算，即得。
(4)三七總皂苷的薄層掃描法含量測(cè)定樣品溶液的制備取本品2瓶，用甲醇分次少量使溶解，并完全轉(zhuǎn)移置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
對(duì)照品溶液的制備精密稱定經(jīng)60℃真空干燥2h的對(duì)照品人參皂苷Rg13mg、Rb12mg、三七皂苷R12mg，置于同一10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，此混合液作為對(duì)照溶液。
掃描條件測(cè)定波長(zhǎng)λs＝535nm，參比波長(zhǎng)λR＝460nm。
薄層條件正丁醇-醋酸乙酯-水(4∶1∶5)上層溶液為展開劑，硅膠G預(yù)制板，展距8cm。
測(cè)定將點(diǎn)好樣的硅膠G預(yù)制板展開，取出晾干，噴以27％硫酸無水乙醇溶液，于105℃烘干5min，取出放冷至室溫，測(cè)定。計(jì)算，即得。
本發(fā)明復(fù)方藥物凍干粉的指紋圖譜測(cè)定方法，具體是(1)飛薊賓葡甲胺的指紋圖譜測(cè)定指紋圖譜的測(cè)定色譜條件同飛薊賓葡甲胺的含量測(cè)定條件。如果采用(乙腈∶甲醇)∶0.05％三氟乙酸水的酸性的梯度洗脫條件，基線不穩(wěn)定，故采用恒度洗脫。
甲醇∶乙腈∶0.05％三氟乙酸水＝17.5∶17.5∶65(V/V)為流動(dòng)相；計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間及主峰的相對(duì)比值，即得。
(2)三七總皂苷的指紋圖譜測(cè)定為使各峰(主峰和指紋峰)均能在規(guī)定時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)并達(dá)到良好分離，對(duì)三七總皂苷含量測(cè)定的流動(dòng)相條件進(jìn)行調(diào)整如下，其余條件同三七總皂苷含量測(cè)定。
表格表示的梯度如下在前8分鐘內(nèi)，流動(dòng)相從純A溶劑線性逐漸改變至A溶劑∶B溶劑比例為95.3∶4.7(V/V，下同)；再在隨后的2分鐘內(nèi)，95.3∶4.7的A、B混合流動(dòng)相又線性逐漸改變至89.3∶10.7；10分鐘至27分鐘，流動(dòng)相保持89.3∶10.7；從27分鐘至40分鐘，流動(dòng)相從89.3∶10.7線性逐漸改變至73∶27；至色譜峰60分鐘結(jié)束，流動(dòng)相保持73∶27。
計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間及主峰的相對(duì)比值，即得。
根據(jù)本發(fā)明所述的中藥有效部位復(fù)方注射制劑，用于保護(hù)肝臟、治療各型肝損傷，包括病毒性肝炎、酒精性肝損害、其它中毒代謝性肝損害、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病。
實(shí)施例一保肝注射液的制備取100g水飛薊賓葡甲胺，加5L注射用水?dāng)嚢?，溶解，離心，上清液加入100g三七總皂苷，再加入3L助溶劑，該助溶劑為聚乙二醇或丙二醇的任一種，使溶解，用適量的注射用水稀釋至20L，混勻，過濾，濾藥液經(jīng)通量為50000分子量的超濾膜超濾，灌封，10ml/支，即得注射液。
實(shí)施例二復(fù)方藥物凍干粉針的制備取125g水飛薊賓葡甲胺，加4L注射用水?dāng)嚢瑁芙?，離心，上清液加入125g三七總皂苷和成型劑750g，該成型劑為甘露醇或葡萄糖中的至少一種，使溶解，用適量的注射用水稀釋至10L，混勻，過濾，濾藥液經(jīng)通量為100000分子量的超濾膜超濾，無菌干燥，分裝共2500瓶，每瓶4ml，凍干，壓蓋，標(biāo)簽，即得粉針。
實(shí)施例三復(fù)方藥物凍干粉與三七總皂苷溶液的兔紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)比較參照藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，自家兔心臟取血20ml，置清潔干燥燒杯中，用竹簽攪拌除去纖維蛋白，然后將血移入離心管內(nèi)，加入生理鹽水，混勻后離心5分鐘(2500r/min)，棄去上清液，再加生理鹽水混勻離心，反復(fù)洗至上清液呈無色透明，再將所得紅細(xì)胞按其容積用生理鹽水稀釋成2％的混懸液。取試管12支，分為兩組，均1-6編號(hào)置于試管架上，均1-6編號(hào)置于試管架上，1-6管分別加入生理鹽水2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、2.5ml，每管再加入2.5ml的2％的血球混懸液溶液，然后一組1-5號(hào)分別加入三七總皂苷溶液(劑量與復(fù)方藥物凍干粉中三七總皂苷量相等，且制備方法一致)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，另一組1-5號(hào)分別加入復(fù)方藥物凍干粉溶液(每瓶?jī)龈煞塾?ml注射用水溶解，下同)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml。
將各管溶血輕輕搖勻，置37℃恒溫水浴中，觀察并記錄0.5、1、2、3hr的結(jié)果。判斷指標(biāo)為全溶血溶液呈明紅色，管底無細(xì)胞殘留；部分溶血溶液呈明紅色或棕色，管底有少量紅細(xì)胞殘留；無溶血紅細(xì)胞全部下沉，上層液體無色澄明；凝集雖不溶血但出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集，振搖后不能分散。凡一小時(shí)后，第三管或第三管以前各管出現(xiàn)溶血、部分溶血或凝集反應(yīng)的為溶血反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表1。
表1復(fù)方藥物凍干粉兔紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)結(jié)果
“-”表示無溶血現(xiàn)象，“+”表示溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，6號(hào)管為對(duì)照管，3小時(shí)內(nèi)未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。三七總皂苷溶液在1、2、3管3小時(shí)均未出現(xiàn)溶血，4管在2小時(shí)出現(xiàn)溶血，5管在1小時(shí)即出現(xiàn)溶血；而復(fù)方藥物凍干粉1、2、3、4、5管3小時(shí)內(nèi)均未出現(xiàn)溶血。提示復(fù)方藥物凍干粉由于水飛薊賓葡甲胺的加入而降低了三七總皂苷本身的溶血作用，使制劑的副作用降低。
實(shí)施例四三七總皂苷對(duì)水飛薊賓葡甲胺的助溶作用取水飛薊賓葡甲胺，稱取8份，每份100mg，緩緩加入各類型溶劑，邊加邊攪拌，置燒杯中，逐漸增加溶劑量，至密閉加熱時(shí)呈澄清溶液，記錄所加溶劑的體積，并連續(xù)三個(gè)月觀察溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。
表2三七總皂苷對(duì)水飛薊賓葡甲胺溶解度的影響
由上表可見水飛薊賓葡甲胺在水中的溶解度最低，穩(wěn)定性最差，但在2％皂苷溶液+15％丙二醇中溶解度最高，比其在水中的溶解度提高了2.4倍，且溶液穩(wěn)定；15％甘油、15％丙二醇和15％聚乙二醇均較顯著地提高了水飛薊賓葡甲胺的溶解度，且以15％丙二醇效果最好；單獨(dú)2％皂苷溶液也可提高水飛薊賓葡甲胺的溶解度，但效果不十分理想，而在2％皂苷溶液中加入15％甘油、15％丙二醇或15％聚乙二醇后，三七總皂苷對(duì)水飛薊賓葡甲胺的助溶作用大大提高。綜上所述，在注射液的制備中，在三七總皂苷液中加入15％的丙二醇或15％聚乙二醇，可顯著提高水飛薊賓葡甲胺的溶解度和藥液的穩(wěn)定性，效果比單獨(dú)使用15％丙二醇或2％皂苷溶液好。
實(shí)施例五不同組方在肝纖維化模型中抗氧化的實(shí)驗(yàn)研究水飛薊水飛薊賓葡甲胺；三七三七總皂苷；復(fù)方藥物各組水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷復(fù)方。
雄性普通級(jí)Wistar大鼠80只，體重201士10g，隨機(jī)均分為8組，每組10只正常組、模型組、陽性藥組(馬洛替酯，川成醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司公司，生產(chǎn)批號(hào)030911)、復(fù)方藥物組、水飛薊組和三七組。肝纖維化模型的建立大鼠第一次后腿皮下注射40％四氯化碳花生油溶液0.5ml/100g，以后改為0.3ml/100g，每周兩次，共6周。前兩周給動(dòng)物飼以高脂飲食(79.5％五米粉+20％豬油+0.5％膽固醇)，后4周飼以單純玉米面(混以0.5％膽固醇)。動(dòng)物于造模結(jié)束1周前腹腔注射給藥，給藥1周。復(fù)方藥物組、水飛薊組和三七組腹腔注射相應(yīng)濃度藥物，每日1次，每次2ml；陽性藥對(duì)照組按60mg/kg給予馬洛替酯；正常組和模型組給于等量生理鹽水，末次給藥后，頸動(dòng)脈取血，得血清，處理后按試劑盒方法測(cè)MDA、SOD、NO。指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見下表表3不同組方在肝纖維化模型中抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究(X±S)(n＝10)
與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001試驗(yàn)結(jié)果表明正常組與模型組比較，***P＜0.001，表明肝纖維化模型造模成功；水飛薊組、三七組和復(fù)方藥物各組均有明顯的抗氧化作用，與模型組相比，呈顯著性差異(*P＜0.05，**P＜0.01，且復(fù)方藥物各組的抗氧化檢測(cè)指標(biāo)值均優(yōu)于水飛薊組和三七組，表明復(fù)方藥物凍干粉的抗氧化作用強(qiáng)于水飛薊賓葡甲胺、三七總皂苷，提示水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷的配伍具有互補(bǔ)性，增強(qiáng)了抗氧化效應(yīng)；此外，在復(fù)方藥物各組中，配伍比例為1∶1的復(fù)方藥物組，抗氧化作用比比例為1∶0.5、1∶2的復(fù)方藥物組強(qiáng)，提示處方中兩者比例為1∶1時(shí)，抗氧化作用較佳。
實(shí)施例六 不同組方抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究肝纖維化模型的建立每只大鼠首次后腿皮下注射純四氯化碳0.05ml/kg，以后注射40％四氯化碳橄欖油0.03ml/kg(V/V)，每周2次，共9周。
水飛薊水飛薊賓葡甲胺；三七三七總皂苷；復(fù)方藥物各組水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷復(fù)方。
雄性普通級(jí)Wistar大鼠80只，體重198士10g，隨機(jī)均分為8組，每組10只。①空白對(duì)照組，大鼠接受橄欖油后腿皮下注射，首次0.05ml/kg，以后0.03ml/kg，每周2次，同時(shí)予0.5％羧甲基纖維素鈉溶液經(jīng)口灌胃，5ml/kg，1/d。②肝纖維化模型組，在造模的同時(shí)予0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃5ml/kg，1/d。③陽性組(秋水仙堿，廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司公司，批號(hào)為040116)，在造模的同時(shí)予秋水仙堿腹腔注射50μg/kg，1/d。④三七組。⑤水飛薊組。⑥復(fù)方藥物各組。④、⑤、⑥在造模的同時(shí)，腹腔注射予以相應(yīng)濃度的藥物(同實(shí)施例五)，1/d。各組于第9周末處死大鼠。用3％戊巴比妥鈉腹腔注射0.02ml/kg，麻醉后，經(jīng)股動(dòng)脈放血，分離血清，-20℃保存。留取肝組織標(biāo)本。
表4抗肝纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究(X±S)(n＝10)
與模型組比，**P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001根據(jù)表4正常組與模型組比較，***＜0.001，表明肝纖維化模型造模成功；從各檢測(cè)指標(biāo)的結(jié)果來看，水飛薊組、三七組和復(fù)方藥物各組具有不同程度的抗纖維化作用，與模型組相比，呈顯著性差異(*P＜0.05，**P＜0.01，但復(fù)方藥物各組的抗纖維化作用要強(qiáng)于水飛薊組和三七組，提示水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷的配伍具有互補(bǔ)性，增強(qiáng)了抗肝纖維化作用，而這一點(diǎn)也與兩者均有抗肝損傷的作用有關(guān)一方面水飛薊通過抗氧化作用使氧自由基不能攻擊生物膜中的不飽合脂肪酸，起到抗脂質(zhì)過氧化作用，從而防止肝細(xì)胞受損，進(jìn)而防止肝纖維化的發(fā)生，另一方面根據(jù)中醫(yī)辨證，結(jié)締組織增生性疾病(包括肝纖維化和肝硬化)與血瘀證相關(guān)，活血化瘀藥物對(duì)此類疾病有獨(dú)特的功效，而三七是經(jīng)典的止血活血良藥；在復(fù)方藥物各組中，水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷配伍比例為1∶1時(shí)，抗肝纖維化作用比比例為1∶0.5、1∶2的復(fù)方藥物組強(qiáng)，提示處方中兩者比例為1∶1時(shí)，抗肝纖維化作用較佳。
實(shí)施例七對(duì)醋氨酚所致小鼠肝毒性的保護(hù)作用90只小鼠，雌雄兼用，隨機(jī)分成6組，每組15只。水飛薊組給予水飛薊賓葡甲胺溶液；三七組給予三七總皂苷溶液；復(fù)方藥物組給予復(fù)方藥物凍干粉溶液；正常組和模型組給予等量注射用水；陽性組給予甘利欣(連云港正大天晴制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H10940190號(hào))(50mg/kg)。上述各組每天給藥1次，連續(xù)3天。于第3天給藥后，除正常組，各組腹腔注射2％醋氨酚500mg/kg，觀察其48h死亡率，結(jié)果見下表表5對(duì)醋氨酚致小鼠肝毒性的保護(hù)作用
由表5看出，三七總皂苷抗肝毒性的作用不如水飛薊賓葡甲胺，這與水飛薊能捕獲肝細(xì)胞產(chǎn)生的毒性自由基、穩(wěn)定細(xì)胞膜、對(duì)多種肝毒性物質(zhì)(包括醋氨酚)造成的肝損害均有抑制作用，以及三七抗肝毒性的作用未見相關(guān)報(bào)道、三七本身具有一定的溶血作用相符，但水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷合用后，對(duì)醋氨酚所致的小鼠肝毒性有較好的保護(hù)作用，死亡率比單獨(dú)使用水飛薊賓葡甲胺或三七總皂苷有所降低，提示經(jīng)配伍后的復(fù)方藥物凍干粉具有減毒作用。
實(shí)施例八對(duì)醋氨酚所致小鼠肝臟還原型谷胱甘肽耗竭的保護(hù)作用水飛薊水飛薊賓葡甲胺；三七三七總皂苷；復(fù)方藥物各組水飛薊賓葡甲胺與三七總皂苷復(fù)方。
90只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成6組，每組15只。水飛薊組、三七組、復(fù)方藥物組分別給予相應(yīng)濃度的藥物，正常組和模型組給予等量注射用水，陽性組給予甘利欣(50mg/kg)，每天給藥1次，連續(xù)3天。于第3天給藥后，水飛薊組、三七組、復(fù)方藥物組、陽性組和模型組腹腔注射0.8％醋氨酚200mg/kg，正常組給予等量注射用水。45min后，解剖肝臟，測(cè)定其還原型谷胱甘肽(GSH)含量，結(jié)果見下表表6對(duì)醋氨酚所致小鼠肝臟還原型谷胱甘肽耗竭的保護(hù)作用
與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001試驗(yàn)結(jié)果表明，水飛薊組、復(fù)方藥物組對(duì)醋氨酚所致小鼠肝臟還原型谷胱甘肽耗竭有明顯的保護(hù)作用，與模型組相比，具有顯著性差異(*P＜0.05，**P＜0.01，且復(fù)方藥物組抗肝GSH耗竭作用要高于水飛薊組、三七組，提示了復(fù)方藥物凍干粉的配伍增效作用。
實(shí)施例九復(fù)方藥物凍干粉針對(duì)四氯化碳致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用取SD雄性大鼠60只，體重180～220g，隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、陽性藥物組、復(fù)方藥物凍干粉針低、中、高3個(gè)劑量組。各組動(dòng)物每天iv給藥1次，連續(xù)5天。末次給藥12小時(shí)后，除正常組外，各組動(dòng)物ip CCl4溶液1.0ml/kg，注射CCl412小時(shí)后，各動(dòng)物眼眶取血，以3000r/min離心10min常規(guī)制備血清，應(yīng)用谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒及谷草轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒，在754-型紫外可見分光光度計(jì)505nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算ALT含量、AST含量，并采用組間t檢驗(yàn)法與模型組進(jìn)行顯著性測(cè)定比較。
表7復(fù)方藥物凍干粉針對(duì)四氯化碳致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，iv保肝粉針可明顯降低CCl4致急性肝損傷大鼠的血清ALT、AST含量，證明其對(duì)CCl4所致的大鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用。
實(shí)施例十復(fù)方藥物凍干粉針對(duì)氨基半乳糖致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用取SD雄性大鼠60只，體重180～220g，隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、陽性藥物組、復(fù)方藥物凍干粉針低、中、高3個(gè)劑量組。各組動(dòng)物每天iv給藥1次，連續(xù)5天。末次給藥12小時(shí)后，除正常組外，各組動(dòng)物ip GaLN溶液600mg/kg，注射GaLN 36小時(shí)后，各動(dòng)物眼眶取血，以3000r/min離心10min常規(guī)制備血清，應(yīng)用谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒及谷草轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒，在754-型紫外可見分光光度計(jì)505nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算ALT含量、AST含量；應(yīng)用堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒，在754-型紫外可見分光光度計(jì)520nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算AKP含量，并采用組間t檢驗(yàn)法與模型組進(jìn)行顯著性測(cè)定比較。
表8復(fù)方藥物凍干粉針對(duì)氨基半乳糖致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，iv保肝粉針可明顯降低GaLN致急性肝損傷大鼠的血清ALT、AST、AKP含量，證明其對(duì)GaLN所致的大鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用。
實(shí)施例十一復(fù)方藥物凍干粉針的犬一般藥理作用試驗(yàn)選用健康犬24只，體重8～12kg，，♀♂兼用。隨機(jī)分為對(duì)照組(靜脈推注對(duì)照溶媒，即等濃度成型劑的生理鹽水溶液)，復(fù)方藥物凍干粉針高、中、低3個(gè)劑量組(分別靜脈推注復(fù)方藥物凍干粉針40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg)，給藥容積為2ml/kg，靜脈推注給藥速度為10ml/分鐘。動(dòng)物稱重后在3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉下，仰臥位固定，分離并暴露右下肢股動(dòng)脈，插管連接血壓換能器，記錄血壓。分離左下肢股靜脈以備給藥。接呼吸換能器，記錄呼吸；肢體II導(dǎo)聯(lián)測(cè)定心電圖。上述準(zhǔn)備工作結(jié)束，動(dòng)物穩(wěn)定半小時(shí)后測(cè)定并記錄血壓、呼吸和心電圖，作為給藥前正常指標(biāo)(血壓、呼吸和心電圖有異常者剔去不用)。然后從股靜脈推注給藥，分別于給藥后1、5、10、15、30、45、60、90和120分鐘同步測(cè)定記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖P、R、T、P-R和Q-T、血壓和呼吸，并與對(duì)照組比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
結(jié)果表明復(fù)方藥物凍干粉針40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg經(jīng)靜脈推注給藥后2小時(shí)內(nèi)，對(duì)犬呼吸頻率無明顯影響；對(duì)犬心血管系統(tǒng)除高劑量40mg/kg組可使犬血壓在給藥后1min內(nèi)出現(xiàn)明顯下降外，其他指標(biāo)如血壓、心率、心律、P、R、T、P-R和Q-T等，均未見明顯改變，與對(duì)照組相比，無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，犬靜脈推注復(fù)方藥物凍干粉針40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg，除高劑量組犬的血壓出現(xiàn)短暫波動(dòng)，可能具有一過性的擴(kuò)張血管作用外，對(duì)犬呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)其他指標(biāo)均無明顯影響。
實(shí)施例十二復(fù)方藥物凍干粉針的急性毒性試驗(yàn)小鼠1次靜脈注射復(fù)方藥物凍干粉針(30mg/ml)0.5ml/20g(750mg/kg/d)及小鼠1次腹腔注射復(fù)方藥物凍干粉針(30mg/ml)0.8ml/20g(1200mg/kg/d)，給藥后7天內(nèi)均未見動(dòng)物死亡或出現(xiàn)異常，無法測(cè)出復(fù)方藥物凍干粉針尾靜脈注射及腹腔注射給藥的LD50。
結(jié)果提示復(fù)方藥物凍干粉針小鼠尾靜脈注射最大給藥量為750mg/kg；復(fù)方藥物凍干粉針腹腔注射的最大給藥量為1200mg/kg。
復(fù)方藥物凍干粉針建議臨床用量是成人每日給藥量200mg。成人體重按60kg計(jì)，復(fù)方藥物凍干粉針臨床成人用藥量約為生藥量3.33mg/kg。復(fù)方藥物凍干粉針小鼠靜脈注射最大給藥量750mg/kg/d，約為臨床成人用藥量的225倍，復(fù)方藥物凍干粉針小鼠腹腔注射最大給藥量1200mg/kg/d，約為臨床成人用藥量的360倍。
實(shí)施例十三復(fù)方藥物凍干粉針的大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)取7周齡左右SD大鼠，在本實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)1周后，選出80只大鼠供實(shí)驗(yàn)用。三個(gè)給藥組和對(duì)照組每組各20只，雌雄各半。雌雄分開，每籠5只，掛牌飼養(yǎng)。每天1次，上午8～10時(shí)左右，腹腔注射給藥。各組給藥容積均為10ml/kg。分別給藥(1)低劑量組0.75％復(fù)方藥物凍干粉針溶液(75mg/kg/d)。(2)中劑量組1.5％復(fù)方藥物凍干粉針溶液(150mg/kg/d)。(3)高劑量組3％復(fù)方藥物凍干粉針溶液(300mg/kg/d)。(4)對(duì)照溶媒，即等濃度成型劑的水溶液。每周根據(jù)動(dòng)物體重情況調(diào)整給藥量。連續(xù)給藥13周。連續(xù)給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束停藥觀察3周(恢復(fù)期)。
實(shí)驗(yàn)過程中各組動(dòng)物的外觀體征、行為活動(dòng)和糞便性狀等均未見異常。連續(xù)給藥13周后，給藥組與對(duì)照組動(dòng)物的體重均明顯增加，給藥組動(dòng)物體重增長(zhǎng)與對(duì)照組相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理基本無明顯差異。實(shí)驗(yàn)過程中給藥組動(dòng)物攝食量與對(duì)照組相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理基本無明顯差異。
血液學(xué)檢查在連續(xù)用藥13周給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組動(dòng)物的凝血時(shí)間、血紅蛋白、血小板、紅細(xì)胞總數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)和分類均在正常范圍內(nèi)，給藥組與對(duì)照組相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無明顯差異；在連續(xù)給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束停藥觀察3周(恢復(fù)期)后，各組動(dòng)物的凝血時(shí)間、血紅蛋白、血小板、紅細(xì)胞總數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)和分類均在正常范圍內(nèi)，給藥組與對(duì)照組相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無明顯差異。
血液生化檢查在連續(xù)給藥13周給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組動(dòng)物的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(T-BIL)、血糖(GLU)、肌酐(Crea)、總膽固醇(T-CHO)值均基本在正常范圍內(nèi)，給藥組與對(duì)照組相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，基本無明顯差異；連續(xù)給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束停藥觀察3周(恢復(fù)期)后，各組動(dòng)物的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(T-BIL)、血糖(GLU)、肌酐(Crea)、總膽固醇(T-CHO)值均基本在正常范圍內(nèi)，給藥組與對(duì)照組相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，基本無明顯差異。
病理檢查在連續(xù)給藥13周給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組均取10只大鼠，雌雄各半；在連續(xù)給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束停藥觀察3周(恢復(fù)期)后，各組再取10只大鼠，雌雄各半，剖殺取心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、甲狀腺、前列腺、睪丸(帶附睪)、卵巢、子宮等臟器和腺體，肉眼觀察未見異常。各臟器稱重，計(jì)算主要臟器重量系數(shù)。各組動(dòng)物主要臟器重量系數(shù)均在正常范圍內(nèi)，給藥組與對(duì)照組相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無明顯差異。
重要臟器切片鏡檢在連續(xù)給藥13周給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，高劑量組和對(duì)照組均取10只大鼠，雌雄各半；在連續(xù)給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束停藥觀察3周(恢復(fù)期)后，高劑量組和對(duì)照組再取10只大鼠，雌雄各半，取心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、甲狀腺、垂體、胸腺、前列腺、睪丸(連附睪)、卵巢、子宮、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、胰腺、膀胱、淋巴結(jié)、脊髓、胸骨(骨和骨髓)、視神經(jīng)等24個(gè)臟器和腺體，10％福爾馬林固定，石臘包埋，常規(guī)切片，HE染色，作組織學(xué)鏡檢。結(jié)果基本無組織學(xué)影響。
實(shí)施例十四復(fù)方藥物凍干粉針熱原檢查試驗(yàn)選取健康家兔按中國(guó)藥典附錄XIIIA法檢驗(yàn)，用MC-3B電腦數(shù)字式體溫計(jì)測(cè)量各兔肛門體溫，結(jié)果如表9表9熱原檢查的試驗(yàn)結(jié)果
由表9可見，家兔注射經(jīng)超濾的凍干粉，體溫升高不明顯；而注射未經(jīng)超濾的凍干粉，體溫略有升高；結(jié)果表明，溶液經(jīng)過超濾可以除去熱原，保證制劑的安全性。
上述藥效學(xué)資料顯示根據(jù)本發(fā)明所述的中藥有效部位復(fù)方注射制劑，用于保護(hù)肝臟、治療各型病毒性肝炎、酒精性肝損害、其它中毒代謝性肝損害、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病，而不被本發(fā)明的具體文字所限定。
實(shí)施例十五復(fù)方藥物凍干粉針中水飛薊賓葡甲胺的薄層鑒別取本品1瓶，用甲醇分次少量超聲溶解，溶液濃縮至1ml，離心，取上清液作為供試品溶液。取水飛薊賓對(duì)照品適量，加甲醇制成1mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2000版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10ul，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-丙酮-甲酸(9∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(254nm)下觀察。在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
實(shí)施例十六復(fù)方藥物凍干粉針中三七總皂苷的薄層鑒別供試品溶液的制備同上。另取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對(duì)照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各10ul，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇—醋酸乙酯-水(4∶1∶5)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與混合對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
實(shí)施例十七復(fù)方藥物凍干粉針中水飛薊賓葡甲胺的含量測(cè)定本制劑根據(jù)高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2000版一部附錄VID)測(cè)定。
色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)使用Agilent 1100高效液相色譜儀，QuatPump泵，VWD紫外-可見檢測(cè)器；(甲醇-乙腈＝1∶1)-0.05％三氟乙酸水＝35∶65(均為V/V)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為288nm；流速1.0ml/min；柱溫為35℃。理論板數(shù)按水飛薊賓峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。
標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱取于70℃干燥至恒重的水飛薊賓對(duì)照品適量，用甲醇制成每1ml含0.140mg水飛薊賓的溶液，即得；供試品溶液的制備取本品1瓶，用甲醇分次少量超聲使溶解，并完全轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得；測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算，即得，本品每瓶含水飛薊賓葡甲胺以水飛薊賓計(jì)為25～31mg。
實(shí)施例十八復(fù)方藥物凍干粉針中三七皂苷的含量測(cè)定[一]本制劑根據(jù)高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2000版一部附錄VID)測(cè)定。
色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)使用Agilent 1100高效液相色譜儀，QuatPump泵，VWD紫外-可見檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm；流速1.0ml/min；柱溫為30℃。理論板數(shù)按三七皂苷R1、人參皂苷Rb1峰計(jì)算均應(yīng)不低于3000。流動(dòng)相見下表
表10線性梯度洗脫表
對(duì)照品溶液的制備精密稱取于70℃干燥至恒重的三七皂苷R1、人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，分別用25％乙腈制成每1ml含0.284mg的三七皂苷R1溶液和每1ml含0.296mg的人參皂苷Rb1溶液，即得；供試品溶液的制備取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，用水定容，搖勻，精密量取2ml置分液漏斗中，加入正丁醇飽合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水飽合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇飽合的水液分次洗滌至中性，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)?5％乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，定容，搖勻，即得；測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算，即得。
本品每瓶含三七總皂苷以三七皂苷R1和人參皂苷Rb1總和計(jì)為15～20mg。
實(shí)施例十九復(fù)方藥物凍干粉針中三七總皂苷的含量測(cè)定[二]UV-754紫外分光光度儀。
供試品溶液的制備取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，用水定容，搖勻，精密量取2ml，置分液漏斗中，加入正丁醇飽合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水飽合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇飽合的水液分次洗滌至中性，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，定容，搖勻，即得溶液，精密量取該溶液1ml，置5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
對(duì)照品溶液的制備精密稱取經(jīng)60℃真空干燥2小時(shí)的人參皂苷Rg1對(duì)照品約1.84mg，置5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成每1ml中含人參皂苷Rg10.368mg的溶液。
樣品測(cè)定精密量取樣品及對(duì)照品溶液各0.2ml于試管中，同時(shí)做一空白管，在烘箱里蒸干，冷至室溫，加5％香莢蘭醛冰醋酸溶液0.2ml，加1.2ml高氯酸，在70℃熱水浴中顯色50分鐘，放冷，加冰醋酸4.6ml，搖勻，在546nm波長(zhǎng)測(cè)定吸收度。計(jì)算，即得。
本品每瓶含三七總皂甙應(yīng)為45～55mg。
實(shí)施例二十復(fù)方藥物凍干粉針中三七總皂苷的含量測(cè)定[三]樣品溶液的制備取本品2瓶，用甲醇分次少量使溶解，并完全轉(zhuǎn)移置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
對(duì)照品溶液的制備精密稱定經(jīng)60℃真空干燥2h的對(duì)照品人參皂苷Rg13mg、Rb12mg、三七皂苷R12mg，置于同一10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，此混合液作為對(duì)照溶液。
掃描條件測(cè)定波長(zhǎng)λs＝535nm，參比波長(zhǎng)λR＝460nm。
薄層條件正丁醇-醋酸乙酯-水(4∶1∶5)上層溶液為展開劑，硅膠G預(yù)制板，展距8cm。
測(cè)定將點(diǎn)好樣的硅膠G預(yù)制板展開，取出晾干，噴以27％硫酸無水乙醇溶液，于105℃烘干約5min，取出放冷至室溫，測(cè)定。
本品每瓶含三七總皂苷以三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1計(jì)應(yīng)為32～40mg。
實(shí)施例二十一復(fù)方藥物凍干粉針中水飛薊賓葡甲胺的指紋圖譜研究測(cè)定條件同實(shí)施例十七，符合下列指紋圖譜特征表11制劑的水飛薊賓葡甲胺標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜
實(shí)施例二十二復(fù)方藥物凍干粉針中三七總皂苷的指紋圖譜研究流動(dòng)相見下表外，其余測(cè)定方法同實(shí)施例十八，符合下列指紋圖譜特征。
表12線性梯度洗脫表
表13制劑的三七總皂苷標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜


圖1三七皂苷R1HPLC圖，圖2人參皂苷Rg1HPLC圖，圖3人參皂苷Rb1HPLC圖，圖4復(fù)方藥物凍干粉含量測(cè)定HPLC圖(三七總皂苷)，圖5復(fù)方藥物凍干粉HPLC指紋圖(三七總皂苷)，圖6缺三七總皂苷陰性樣品HPLC圖，圖7復(fù)方藥物凍干粉含量測(cè)定HPLC圖(水飛薊賓葡甲胺)，圖8復(fù)方藥物凍干粉HPLC指紋圖(水飛薊賓葡甲胺)，圖9缺水飛薊賓葡甲胺陰性樣品HPLC圖。
權(quán)利要求
1.一種用于保護(hù)肝臟、治療肝病的中藥有效部位的復(fù)方制劑，其特征在于由水飛薊賓葡甲胺和三七總皂苷制成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥有效部位的復(fù)方制劑，其特征是制成注射液或注射用粉針。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的中藥有效部位的復(fù)方制劑，其特征在于原料組分的重量配比為水飛薊賓葡甲胺 1份三七總皂苷 0.2～2份。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中藥有效部位的復(fù)方制劑，其特征在于原料組分重量配比為水飛薊賓葡甲胺 1份三七總皂苷 1份。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中藥有效部位的復(fù)方制劑，其特征在于制備方法如下取1重量份水飛薊賓葡甲胺，用適量注射用水?dāng)嚢?，溶解，藥液加?.2-2重量份三七總皂苷，再加入配液總體積10-20％(V/V)的助溶劑，該助溶劑為聚乙二醇或丙二醇的至少一種，使溶解，用適量的注射用水稀釋至一定體積，混勻，過濾，濾液經(jīng)50000～100000分子量的超濾膜超濾，超濾液灌封成注射液，消毒，即得注射液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中藥有效部位的復(fù)方制劑，其特征在于制備方法如下取1重量份水飛薊賓葡甲胺，用適量注射用水?dāng)嚢?，溶解，藥液加?.2-2重量份三七總皂苷，再加入配液總體積2-8％(W/V)的成型劑，該成型劑為甘露醇或葡萄糖中的至少一種，使溶解，用適量的注射用水稀釋至一定體積，混勻，過濾，濾液經(jīng)50000～100000分子量的超濾膜超濾，超濾液分裝，每瓶4-5ml，冷凍干燥，壓蓋，即得粉針。
7.根劇權(quán)利要求6的中藥有效部位的復(fù)方制劑的制備方法，其特征在于濾液經(jīng)50000～100000分子量的超濾膜超濾，藥液無菌冷凍干燥，凍干粉分裝于滅菌西林瓶中，得粉針劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6、7所述的中藥有效部位的復(fù)方制劑的薄層鑒別方法a.水飛薊賓葡甲胺的鑒別取本品1瓶，用甲醇分次少量超聲溶解，溶液濃縮至1ml，離心，取上清液作為供試品溶液，取水飛薊賓對(duì)照品適量，加甲醇制成1mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液，吸取上述兩種溶液各10ul，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以體積比為9∶2∶1的氯仿-丙酮-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm紫外燈下觀察，在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；b.三七總皂苷的鑒別供試品溶液的制備同a，取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對(duì)照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液，吸取上述兩種溶液各10ul，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以體積比為4∶1∶5的正丁醇-醋酸乙酯-水的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點(diǎn)清晰，供試品色譜中，在與混合對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6、7所述的中藥有效部位的復(fù)方制劑的含量測(cè)定方法a.HPLC測(cè)定水飛薊賓葡甲胺的含量取本品1瓶，用甲醇分次少量超聲使溶解，完全轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，用甲醇定容，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，為供試品液；以甲醇配制的水飛薊賓液為對(duì)照；使用Agilent 1100高效液相色譜儀，QuatPump泵，VWD紫外-可見檢測(cè)器；色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測(cè)波長(zhǎng)為288nm；流速1.0ml/min，柱35℃；流動(dòng)相為A溶劑系統(tǒng)甲醇17.5體積乙腈17.5體積和B溶劑0.05％三氟乙酸水65體積；b.HPLC測(cè)定三七總皂苷的含量取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，用水定容，搖勻，精密量取2ml置分液漏斗中，加入正丁醇飽合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水飽合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇飽合的水液分次洗滌至中性，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)?5％乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，定容，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，即得，為供試品液；以流動(dòng)相A配制的三七皂苷R1和流動(dòng)相A配制的人參皂苷Rb1對(duì)照；使用Agilent 1100高效液相色譜儀，QuatPump泵，VWD紫外-可見檢測(cè)器；色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm；流速1.0ml/min，柱溫30℃；流動(dòng)相為A溶劑系統(tǒng)25體積％的乙腈和B溶劑乙腈；洗脫梯度是
b.比色法測(cè)定三七總皂苷的含量供試品溶液的制備取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，用水定容，搖勻，精密量取2ml，置分液漏斗中，加入正丁醇飽合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水飽合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇飽合的水液分次洗滌至中性，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，定容，搖勻，即得溶液，精密量取該溶液1ml，置5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。對(duì)照品溶液的制備精密稱取經(jīng)60℃真空干燥2小時(shí)的人參皂苷Rg1對(duì)照品約1.84mg，置5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成每1ml中含人參皂苷Rg10.368mg的溶液。樣品測(cè)定精密量取樣品及對(duì)照品溶液各0.2ml于試管中，同時(shí)做一空白管，在烘箱里蒸干，冷至室溫，加5％香莢蘭醛冰醋酸溶液0.2ml，加1.2ml高氯酸，在70℃熱水浴中顯色50分鐘，放冷，加冰醋酸4.6ml，搖勻，在546nm波長(zhǎng)測(cè)定吸收度。計(jì)算，即得。d.薄層掃描法測(cè)定三七總皂苷的含量取本品2瓶，用甲醇分次少量使溶解，并完全轉(zhuǎn)移置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品液；以甲醇配制的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的混合液為對(duì)照；測(cè)定波長(zhǎng)λs＝535nm，參比波長(zhǎng)λR＝460nm；體積比為4∶1∶5的正丁醇-醋酸乙酯-水的上層溶液為展開劑，硅膠G預(yù)制板，展距8cm；以27％硫酸無水乙醇溶液為顯色劑，于105℃烘干5min。
10.根據(jù)權(quán)利要求6、7所述的中藥有效部位的復(fù)方制劑的指紋圖譜測(cè)定方法a.水飛薊賓葡甲胺的指紋圖譜的測(cè)定取本品1瓶，用甲醇分次少量超聲使溶解，并完全轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得，為供試品液；以甲醇配制的水飛薊賓液為對(duì)照；使用Agilent 1100高效液相色譜儀，QuatPump泵，VWD紫外-可見檢測(cè)器；色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測(cè)波長(zhǎng)為288nm；流速1.0ml/min，柱溫35℃；流動(dòng)相為A溶劑系統(tǒng)甲醇 17.5體積乙腈 17.5體積和B溶劑0.05％三氟乙酸水 65體積；制劑中水飛薊賓葡甲胺的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜
b.三七總皂苷的指紋圖譜的測(cè)定取本品1瓶，用水分次少量使溶解，并完全轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，用水定容，搖勻，精密量取2ml置分液漏斗中，加入正丁醇飽合的1％NaOH水溶液10ml，再加入水飽合的正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇飽合的水液分次洗滌至中性，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)?5％乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，定容，搖勻，即得，為供試品液；以流動(dòng)相A配制的三七皂苷R1和流動(dòng)相A配制的人參皂苷Rb1對(duì)照；使用Agilent 1100高效液相色譜儀，QuatPump泵，VWD紫外-可見檢測(cè)器；色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm；流速1.0ml/min，柱溫30℃；流動(dòng)相A溶劑系統(tǒng)25體積％乙腈水和B溶劑乙腈洗脫梯度是
制劑中三七總皂苷的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜
11.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的中藥有效部位的復(fù)方藥物注射制劑，其特征在于用于保護(hù)肝臟、治療各型肝損傷，包括病毒性肝炎、酒精性肝損害、其它中毒代謝性肝損害、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病。
全文摘要
本發(fā)明為一種用于保護(hù)肝臟、治療多種肝臟疾病的中藥有效部位復(fù)方制劑及其制備方法和質(zhì)控方法。該復(fù)方制劑由中藥水飛薊中提取的黃酮類成分水飛薊賓的水溶性衍生物水飛薊賓葡甲胺和三七的有效組分三七總皂苷按1∶0.2－2重量分配比組合制成，經(jīng)溶解、加入聚乙二醇或丙二醇助溶劑、過濾、超濾、灌封制成注射液；或經(jīng)溶解、加入甘露醇或葡萄糖成型劑、過濾、超濾、凍干制成粉針劑。用HPLC法測(cè)定了其水飛薊賓與三七總皂苷的含量與指紋圖譜。本發(fā)明的復(fù)方注射制劑的療效顯著提高于組方中的任一單味藥制成注射用制劑。本發(fā)明的復(fù)方注射用藥物具有療效高，安全性好的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1771976SQ20041006565
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2004年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月9日
發(fā)明者彭國(guó)平, 阮鳴, 李紅陽 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)