專利名稱：一種具有治療肝病功能的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥用組合物領(lǐng)域，更具體的說，涉及一種具有治療肝病功能的組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的傳染性肝病。全世界已有20多億人口被感染，約3.5億人成為慢性HBV感染者。慢性攜帶者易于發(fā)生肝硬化與肝癌，全世界每年有100余萬患者死于肝病，其中1/3在中國。另外，HBV攜帶者的母親可以通過垂直傳播給嬰兒，嬰兒時(shí)期感染HBV者，90％以上受染成為慢性HBsAg攜帶者，影響下一代的健康，危害極大。
1989年，李求是博士受中國科協(xié)委托承擔(dān)“新型免疫調(diào)節(jié)劑研制”的課題，根據(jù)天人合一的思想和擬態(tài)理論，參考了大量中醫(yī)藥古籍及現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)文獻(xiàn)，在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)理論指導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代免疫藥理學(xué)篩選方法，尋找兼具保肝、抗炎、抗乙型肝炎病毒和免疫調(diào)節(jié)活性的藥物。研究結(jié)果證明，Y與L經(jīng)過適當(dāng)工藝處理，并合理配比，臨床效果滿意，終形成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種組合物，它含有Y的乙醇提取物和L的水提取物。
本發(fā)明還提供了上述組合物的制備方法，它包括下述步驟(1)選取合格的藥材Y和L，壓碎成Y粉和L粉；(2)用乙醇提取Y粉，得Y的乙醇提取液，將其制成干粉I；(3)用水提取L粉，得L的水提取液，將其制成干粉II；(4)將干粉I與干粉II混合均勻，按照常規(guī)工藝制成藥物制劑。
在上述的組合物的制備方法中，步驟(2)中的Y粉與步驟(3)中的L粉的重量比范圍優(yōu)選為1∶10～10∶1。
本發(fā)明還提供了上述組合物在制備治療肝病的藥物中的應(yīng)用，所述的肝病優(yōu)選為慢性乙型肝炎、脂肪肝或肝硬化。
本發(fā)明還提供了Y和L在制備治療肝病的藥物中的應(yīng)用，所述的肝病優(yōu)選為慢性乙型肝炎、脂肪肝或肝硬化。
本發(fā)明的組合物的功能主治為清熱解毒，化濕利肝，保肝降酶，抑制乙肝病毒。用于治療慢性乙型肝炎，熱毒內(nèi)蘊(yùn)，濕濁互阻者。
本發(fā)明的組合物中Y性甘寒、無毒、歸肺、胃、心經(jīng)，具有清熱解毒，涼散風(fēng)熱作用。Y含綠原酸及異綠原酸，它有廣泛的抗微生物作用，對(duì)多種細(xì)菌、病毒有抑制作用，同時(shí)又具有加強(qiáng)防衛(wèi)機(jī)能的功效，Y的煎劑稀釋至1∶1280，仍能促進(jìn)白細(xì)胞的吞唾功能，近代研究表明，Y對(duì)免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用。L性甘寒、無毒、歸心、胃經(jīng)，它具有清熱解毒作用。L中含有多糖，多糖具有抗炎、增強(qiáng)免疫、護(hù)肝等作用，所以綠原酸及L多糖為本發(fā)明的組合物中的活性成分。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋，但是這些實(shí)施例不以任何方式限制本實(shí)施例1 提取工藝藥材的粉碎Y(藥材應(yīng)檢驗(yàn)合格)稱量后經(jīng)80℃烘烤1h，乘熱壓碎成粗粉，得率約95％。L(藥材應(yīng)檢驗(yàn)合格)用碾壓機(jī)壓碎成粗粉，篩去100目以下的細(xì)粉，得率約95％。
Y粗粉，加10倍量75％乙醇，浸泡20min，回流2h，濾過，瀝干，得醇提液I與藥渣，藥渣加8倍75％乙醇，回流0.5h，濾過，瀝干，得醇提液II與藥渣，棄藥渣合并醇提液I、II，減壓回收乙醇成相對(duì)密度約為1.08(70℃)的濃液，過濾，噴霧干燥，得干粉I(Y提取物)。
L粗粉，加水10倍，攪拌15min，室溫浸泡3h，吸取上清液，將清液在60℃下減壓濃縮成相對(duì)密度約為1.02～1.03(60℃)的濃液，過濾，噴霧干燥，得干粉II(L提取物)。
將干粉I與干粉II混合均勻，干法制粒(過10目篩)，顆粒裝膠囊(0號(hào)空心膠囊)，鋁塑包裝，得成品。
實(shí)施例2 有效組分的確立與鑒定有效組分的確立(1)綠原酸在對(duì)藥材性質(zhì)的文獻(xiàn)查閱和對(duì)組合物全面分析后，確立了Y中的綠原酸為活性成分中的指標(biāo)成分，其理由有以下幾點(diǎn)a、綠原酸具有廣泛的生物活性，例如抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等，與本制劑功能主治的作用相吻合。
b、綠原酸在Y中含量較高，一般在2-3％左右。
c、綠原酸用高效液相法檢測(cè)，方法成熟，被藥典收載，且藥典附有對(duì)照品，經(jīng)預(yù)試，L的提取成分與綠原酸無干擾。
d、綠原酸易溶于乙醇，提取容易。
(2)多糖L的主要成分為碳水化合物，約占59％，其次為蛋白質(zhì)，約占22％，其中氨基酸較全面，有17種以上。L中脂肪很少，僅占0.8％，此外，還有少量的無機(jī)元素，需要特別指出的是，經(jīng)預(yù)試，L中含有3-4％的多糖，該多糖是一類活性物質(zhì)，近代研究表明，多糖不但能夠治療因機(jī)體免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷所致的腫瘤，還能治療因多種免疫缺損所致的慢性病，例如慢性肝炎等。
有效組分的鑒別(1)綠原酸的定性鑒別方法2000版藥典中Y中“鑒別”項(xiàng)(藥典法)供試品的制備取Y提取液的噴粉5g，溶于50ml甲醇中，必要時(shí)過濾即得。
結(jié)果與對(duì)照品相同位置處(Rf＝0.49)顯示蘭色熒光斑點(diǎn)。
結(jié)論提取物中綠原酸呈陽性反應(yīng)。
(2)多糖的鑒別與測(cè)定由于多糖為一類無定形粉末，結(jié)構(gòu)多變，無標(biāo)準(zhǔn)品可對(duì)照。因此，采用水浸液與費(fèi)林試劑及碘液、碘化鉀一碘試液等來鑒別L中的多糖。結(jié)果顯示，L中含有多糖。
多糖的含量測(cè)定方法參照2000版藥典(一)中“玉竹”的含量測(cè)定，該法中由于加入硫酸后溶液溫度超過40℃，故改為在100℃水浴中保溫30min。
實(shí)施例3 LY的急性毒性試驗(yàn)在預(yù)備試驗(yàn)中，小鼠灌服大劑量LY亦不致死，不能測(cè)出半數(shù)致死量，故采用最大給藥量試驗(yàn)。
1.受試藥物L(fēng)Y，由北京萬賽生物醫(yī)藥技術(shù)發(fā)展有限公司提供。批號(hào)030313。實(shí)驗(yàn)用膠囊內(nèi)容物為淡褐色粉未，臨用前加蒸餾水，配制成0.2g/ml的混懸液，供灌胃用。
劑量取LY內(nèi)容物，配制成0.2g/ml濃度的溶液供小鼠灌胃，一日內(nèi)分三次給藥，間隔4h，每次灌胃0.3ml/10g，總量0.9ml/10g，即18g/kg，人臨床擬用量為0.1g/kg。此劑量為臨床人擬用量的180倍。
2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠20只，18～21g，雌雄各半，由中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證SCXK(蘇)2002-0011號(hào)。
3.試驗(yàn)方法與結(jié)果小鼠空腹12h稱重，每鼠igLY顆粒18/kg體重(0.2g/ml～0.9ml/10g)，一日內(nèi)分3次ig給完，間隔4h，觀察7日。
小鼠給藥當(dāng)日，行動(dòng)緩慢，進(jìn)食減少。次日恢復(fù)食量，活動(dòng)、大便均正常。觀察7日未見死亡。第8日空腹12h稱重，體重變化見表1。
表1 小鼠急性毒性試驗(yàn)體重變化給藥前體重 第8日體重性別鼠數(shù)增長率(％)(g，X±SD) (g，X±SD)♂ 1020.9±1.10 26.1±1.60*** 25.17♀ 1020.3±1.49 22.8±1.23*** 12.71t檢驗(yàn)，與給藥前比，***P＜0.01由表1可見，小鼠灌服LY內(nèi)容物，體重正常增長。
4.小結(jié)在小鼠急性毒性試驗(yàn)中，采用最大給藥量法，igLY內(nèi)容物18g/kg體重，為臨床人用量的180倍。給藥后觀察7日，未出現(xiàn)死亡及明顯中毒反應(yīng)，體重正常增長。
實(shí)施例4 LY的長期毒性試驗(yàn)1.受試藥物L(fēng)Y由北京萬賽生物醫(yī)藥技術(shù)發(fā)展有限公司提供，批號(hào)030314、030315。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用膠囊內(nèi)容物，為淡褐色粉未，臨用前加適量蒸餾水，配制成0.125g/ml、0.25g/ml濃度的溶液供灌胃用，灌胃體積為低劑量組ig 0.125g/ml的溶液2ml/100g、中劑量組ig 0.25g/ml的溶液2ml/100g，由于藥物濃度增加后，ig困難，因此高劑量組ig 0.25g/ml的溶液3ml/100g。每三天配一次，配好后冰箱保存。
劑量LY臨床擬用量為每日0.1g/kg。按動(dòng)物與人等效劑量折算，大鼠治療量約為0.8g/kg體重，長毒試驗(yàn)用高、中、低劑量設(shè)置為7.5g/kg體重、5.0g/kg體重和2.5g/kg體重，高劑量相當(dāng)于臨床人用量的約75倍，低劑量約為藥效高劑量的2倍。
2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠160只，雌雄各半，雌鼠體重70～86g，雄鼠70～86g，由中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(蘇)2002-0011號(hào)。稱重后隨機(jī)分為4組對(duì)照組及高、中、低劑量給藥組。每組40只，雌雄各20只，分籠喂養(yǎng)，每籠5只。飼養(yǎng)室溫度20±2℃，相對(duì)濕度70±5％。具有排風(fēng)、通氣、恒溫設(shè)備，自然光照。飼料用全價(jià)顆粒飼料，飲水用清潔自來水，放飲水瓶內(nèi)自由飲用，每日更換。
3.試驗(yàn)方法3.1給藥均口服給藥，容積低、中劑量為2ml/100g，高劑量組為3ml/100g，對(duì)照組ig清潔自來水2ml/100g，3個(gè)劑量給藥組分別灌服LY內(nèi)容物2.5g/kg、5.0g/kg、7.5g/kg，此劑量相當(dāng)于生藥量為23.1g/kg、46.2g/kg、69.3g/kg。連續(xù)給藥六個(gè)月，上午8:00～10:00給藥，給藥結(jié)束后投放飼料。每周稱重1次，按體重變化調(diào)整給藥量。上述給藥方案的依據(jù)是(1)給藥途徑灌胃給藥，與臨床口服用藥一致。
(2)劑量高劑量相當(dāng)于擬用臨床劑量的約75倍。
(3)給藥周期6個(gè)月。根據(jù)《中藥新藥藥理毒理研究的技術(shù)要求》的規(guī)定，動(dòng)物給藥周期為臨床用藥周期的3～4倍，符合長毒試驗(yàn)給藥周期的規(guī)定。
3.2觀察與檢測(cè)給藥期間，每日觀察動(dòng)物一般狀況，每周稱重1次，記錄體重變化。給藥3個(gè)月后，各組取雌雄各5只大鼠，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，包括稱重，取血供血液學(xué)檢驗(yàn)和血清生化檢驗(yàn)，摘取主要臟器，作臟器系數(shù)測(cè)定和病理學(xué)檢驗(yàn)。各組余下雌雄各15只大鼠，繼續(xù)給藥，給藥6個(gè)月后，再次每組取雌雄各10只大鼠，同上法檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。余下每組雌雄各5只，作恢復(fù)期觀察四周?；謴?fù)期觀察結(jié)束后，同上法檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。
4.試驗(yàn)結(jié)果按檢測(cè)指標(biāo)，分別統(tǒng)計(jì)，報(bào)告于下。
4.1體重及一般狀況(1)給藥期間及恢復(fù)期，各組動(dòng)物均無死亡。
(2)動(dòng)物進(jìn)食、飲水、大、小便均正常，外觀、行為、體征亦無異常表現(xiàn)。
(3)各組動(dòng)物體重均持續(xù)、穩(wěn)定增長，并以給藥組與空白對(duì)照組比較，作顯著性檢驗(yàn)(t檢驗(yàn))。結(jié)果見表2、表3。
表2 雄性大鼠長期毒性試驗(yàn)體重變化(X±SD)時(shí)間空白對(duì)照高劑量 中劑量 低劑量給藥后 N＝205.1983.1±4.04 82.2±2.68 81.8±2.76 81.2±2.765.26100.9±3.46 95.6±5.89** 95.0±6.04**96.4±4.89**6.2 153.9±6.60 140.8±10.84** 137.8±15.28** 137.6±12.75**6.9 204.2±9.42 180.9±13.70** 182.1±16.13** 176.2±19.50**6.16245.4±18.18221.3±15.35** 223.5±20.31** 218.9±23.46**6.23262.9±17.54256.1±19.69 253.0±26.16250.9±28.696.30290.9±25.02288.9±18.42 283.1±31.27285.2±32.667.7 314.8±19.84316.0±21.23 307.7±35.77324.6±34.477.14343.6±19.50349.8±21.55 343.7±44.64355.5±38.197.21368.9±17.30370.7±22.00 362.8±47.99372.8±40.087.28398.6±16.24411.0±18.64*395.5±53.91401.2±41.68.4 414.6±20.74434.5±20.34** 416.7±55.10412.8±43.19三個(gè)月 N＝15后8.11 446.3±27.00 467.2±27.26*460.9±56.09448.9±55.288.18 469.7±32.08 489.5±30.00 476.5±60.32466.0±56.368.25 486.9±36.57 502.1±37.18 494.8±64.30485.2±54.119.1502.0±40.10 514.7±41.30 506.8±70.25496.1±52.829.8510.2±43.07 524.7±41.12 514.3±67.82507.2±53.12
9.15 520.1±46.50536.4±39.57524.8±65.70520.7±54.559.22 536.8±45.00553.3±35.47538.7±67.36533.6±53.909.29 561.3±44.69575.0±45.88558.2±74.36549.1±56.1110.6 576.2±44.62583.9±45.17578.2±72.38560.5±55.2810.13580.8±46.25596.3±54.33585.4±72.87564.3±62.6210.20599.5±49.31610.3±56.44599.0±76.23579.7±61.2410.27599.1±46.93593.2±58.87601.4±77.84586.9±64.0411.3 600.4±47.28596.8±58.31600.6±78.39590.1±61.1511.10609.7±51.41620.1±57.40605.4±82.74602.1±64.30恢復(fù)期 N＝511.17595.0±69.22581.4±26.73573.2±82.07573.4±55.9911.24603.8±68.21595.0±26.31584.8±85.37578.2±57.0412.1 624.8±73.56609.8±28.95603.6±92.62583.6±56.6312.8 647.6±82.76643.2±31.66618.0±74.08591.0±55.99t檢驗(yàn)(下同)，與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**p＜0.01表3 雌性大鼠長期毒性試驗(yàn)體重變化(X±SD)時(shí)間 空白對(duì)照高劑量 中劑量 低劑量給藥后 N＝205.19 83.8±3.79 84.1±3.58 81.6±2.64* 86.0±6.645.26 98.5±4.89 99.4±8.68 92.2±4.25** 97.7±8.496.2 143.6±9.77 135.9±10.92* 132.3±8.36**136.1±13.656.9 176.9±11.79167.3±10.00** 169.7±11.02 180.3±35.786.16 195.1±9.97 188.2±12.19193.4±12.74 196.1±11.756.23 205.4±12.93208.2±10.56216.8±14.33*212.2±12.076.30 225.2±12.69230.1±10.62240.4±15.07** 231.5±16.897.7 240.8±12.58245.0±12.77259.3±19.13** 247.6±20.567.14 251.4±11.82266.4±12.08** 276.6±22.45** 266.0±21.64*7.21 261.3±15.32273.4±13.60* 287.7±25.30** 276.4±23.92*7.28 273.9±20.35286.6±14.50* 299.1±28.17** 290.6±22.21*8.4 280.2±20.49291.0±23.85304.7±29.26** 298.0±19.65*三個(gè)月 N＝15后8.11 292.3±26.51297.2±25.81308.1±34.73 306.9±23.498.18 296.7±26.61300.8±26.66313.7±37.38 314.0±24.578.25 302.1±28.24305.9±27.89319.2±38.88 320.3±23.299.1 308.9±29.37313.3±29.89323.7±40.46 328.5±25.819.8 316.5±29.11320.6±29.99334.0±42.96 337.1±26.259.15 323.8±30.42329.5±30.88342.7±44.62 344.9±26.919.22 331.4±28.45339.3±29.84352.5±44.66 353.6±29.42*9.29 345.3±29.74350.5±29.56367.7±42.41 361.5±34.0710.6 356.7±31.19360.7±23.59379.1±41.19 375.1±40.0210.13360.5±31.89365.6±20.84389.6±57.41 388.1±47.8610.20363.6±32.73370.2±20.56385.1±46.39 384.2±39.4710.27364.1±33.66371.0±22.22383.0±39.23 383.0±41.7411.3 367.7±33.41376.6±22.64388.9±39.20 388.9±41.2411.10364.5±32.90371.3±22.88384.0±41.13 385.7±44.29
恢復(fù)期 N＝511.17 363.2±39.52358.2±26.56376.2±48.28343.4±39.6111.24 366.4±42.88363.2±28.89379.0±49.84349.0±38.9112.1369.4±44.81371.8±30.95383.6±51.38358.8±37.0112.8372.6±45.76378.8±31.23392.8±58.41365.6±37.48t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**p＜0.01由表2、表3可見，給藥組與對(duì)照組動(dòng)物體重均明顯增長，給藥組雄性動(dòng)物在給藥后第2、第3、第4和第5周體重與空白對(duì)照組比較有顯著差異；雌性動(dòng)物高劑量組第3、第4和中劑量組第1、第2、第3周與空白對(duì)照組有顯著差異，分析原因可能是由于給藥容積過大，使動(dòng)物的正常攝食量減少所致。但基本在5周后即恢復(fù)正常，而且雌性動(dòng)物在6周后還顯示出體重增長顯著大于空白對(duì)照組。三個(gè)月后動(dòng)物體重增長速度給藥組與空白組基本一致。以上結(jié)果表明，LY長期口服對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重變化無明顯影響。
4.2血液學(xué)檢驗(yàn)大鼠股動(dòng)脈取血，以玻片法作凝血時(shí)間(CT)測(cè)定。以Coulter-T450自動(dòng)血液檢測(cè)儀(美國產(chǎn))及其配套試劑作血液白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血小板(PLT)計(jì)數(shù)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、淋巴細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)(LY％)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(LY#)的測(cè)定。結(jié)果見表4～表9。
表4 雄性大鼠長毒試驗(yàn)給藥三個(gè)月后血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(X±SD)組 n 劑量 WBC RBC HGB HCT PLT LY％ LY# CT別 (g/kg(109/ (1012/ (g/L)(％)(109/ (％) (109/L (s))L) L) L) )對(duì) 510.307.48± 14.9040.64 888.60 71.48 7.30± 29.00照 ±2.20 0.27 ±0.75 ±1.61 ± ±3.74 1.13 ±7.4869.98L 5 7.5 9.94±8.09± 14.0043.34 1003.0 67.78 7.55± 34.60Y4.16 0.54 ±1.91 ±2.40 ± ±16.4 3.98 ±6.47205.25 5.0 12.287.64± 14.0640.60 855.40 82.26 10.1± 29.60±4.83 0.54 ±0.98 ±2.26 ± ± 4.01 ±5.0394.913.36**5 2.5 7.70±7.78± 14.6442.40 819.80 79.10 6.20± 26.803.10 0.38 ±1.49 ±0.98 ± ± 2.82 ±5.8178.555.66*t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01
表5 雌性大鼠長毒試驗(yàn)給藥三個(gè)月后血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(X±SD)組 n劑量WBC RBC HGB HCT PLT LY％LY#CT別 (g/kg (109/(1012/ (g/L)(％) (109/ (％)(109/L(s)) L)L) L) )對(duì) 56.36± 7.78± 15.4441.58845.80 81.30 5.14± 29.80照 1.39 0.35 ±0.85 ±1.90 ±±2.49 1.12 ±4.8260.26LY 57.5 10.60 6.86± 13.7638.82986.60 82.18 8.74± 36.60± 0.13**±±± ±2.66 2.29* ±10.062.59* 0.57** 1.33*89.37*55.0 9.34± 6.90± 14.1037.44750.686.10 8.04±27.002.12* 0.43**±±± ± 1.77* ±2.350.59*2.09*104.52.99*52.5 5.90± 7.66± 16.0842.62857.40 83.18 4.92± 33.800.85 0.29 ±0.94 ±1.52 ± ±6.91 0.88 ±8.0497.93t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01表6 雄性大鼠長毒試驗(yàn)給藥六個(gè)月后血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(X±SD)組別 n劑量 WBC RBC HGB HCT PLT LY％ LY# CT(g/k (109(1012(g/L)(％)(109(％) (109/(s)g) /L) /L) /L)L)對(duì)照 10 14.38 7.58 14.2840.26797.1 64.76 9.31 77.40± ±± ±0±± ± ±3.450.47 0.74 1.83 107.1 6.56 2.34 31.87LY107.5 13.48 7.19 13.4939.16716.7 72.60 9.82 110.9± ±± ±0±± ± 0±5.880.56 0.77*2.15 131.1 10.10 4.70 40.78105.0 14.12 7.56 14.1839.74823.3 65.33 9.35 54.20± ±± ±0±± ± ±4.440.96 1.46 4.29 133.5 6.85 3.60 28.57102.5 16.91 7.07 13.0737.79785.3 64.05 10.95 86.80± ±± ±0±± ± ±4.560.24*1.57*2.29*152.9 9.08 3.62 24.30*t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01表7 雌性大鼠長毒試驗(yàn)給藥六個(gè)月后血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(X±SD)組 n 劑量 WBC RBCHGB HCT PLT LY％ LY# CT別 (g/kg)(109/L (1012/ (g/L) (％) (109/L (％) (109/L)(s)) L))對(duì) 10 11.52 6.96± 14.06 39.98774.20 70.70 8.31± 65.30照 ±4.030.42 ±6.48 ±1.58 ±±7.04 3.63±105.9 33.01
LY 10 7.5 9.45± 6.67± 13.2537.58724.6070.576.67± 88.802.080.84 ±1.04 ±± ±6.101.59±2.99*185.7 35.6210 5.0 9.48± 6.09± 12.5834.83693.0067.806.58± 72.503.080.48**±±± ±7.092.87±0.92** 2.95** 130.5 40.0710 2.5 9.29± 7.04± 14.0740.12752.6062.635.92± 96.001.960.58 ±0.96 ±2.82 ± ± 1.71±165.2 11.5043.00t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01表8 雄性大鼠長毒試驗(yàn)恢復(fù)期結(jié)束血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(X±SD)組 n 劑量WBCRBCHGB HCT PLT LY％LY#CT別 (g/kg) (109/L) (1012/L) (g/L) (％)(109/L) (％)(109/L) (s)對(duì) 5 13.92± 7.98±14.5838.28 576.80± 61.94 8.60±34.80照 2.01 0.73 ±± 70.22 ± 1.69 ±0.21 2.09 8.30 4.44LY 5 7.5 14.58± 7.93±15.1840.06 508.40± 65.94 9.18±34.203.29 0.38 ±± 64.17 ± 2.61 ±0.45 1.09 3.85 1.305 5.0 14.24± 7.11±12.9634.48 573.00± 67.42 9.48±34.605.49 2.00 ±± 204.89± 3.56 ±3.59 9.90 2.00 5.035 2.5 16.66± 7.98±14.9039.32 615.20± 72.30 12.28± 31.604.93 0.66 ±± 94.60 ± 4.80 ±0.95 3.20 7.68 5.37t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比，未標(biāo)記者P＞0.05表9 雌性大鼠長毒試驗(yàn)恢復(fù)期結(jié)束血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(X±SD)組 n 劑量WBCRBCHGB HCT PLTLY％ LY#CT別 (g/kg) (109/L) (1012/L) (g/L) (％) (109/L) (％) (109/L) (s)對(duì) 5 11.24± 6.62± 13.6634.68570.80±68.65 7.68± 34.00照 2.83 0.60 ±± 92.28 ± 2.31 ±0.85 2.329.35 2.55LY 5 7.5 9.34±6.70± 13.6434.98397.40±74.60 6.96± 32.601.75 1.25 ±± 39.85**± 1.55 ±2.20 6.413.99 2.705 5.0 11.36± 7.40± 14.5038.86498.80±72.32 8.38± 32.804.62 0.56 ±± 85.69 ± 4.12 ±0.63 2.40* 7.63 3.495 2.5 9.26±7.04± 13.8836.00566.80± 70.24 6.46±32.002.59 0.43 ±± 93.57 ± 1.87 ±0.65 2.622.07 3.46t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05，**p＜0.01
由表4～表9可見，給藥三個(gè)月后，雄性動(dòng)物的中、低劑量組的LY％出現(xiàn)顯著增加(分別增加15.08％和10.66％)；雌性大鼠的高、中劑量組白細(xì)胞顯著增加、紅細(xì)胞、血紅蛋白出現(xiàn)降低，但上述變化值均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，所以無臨床意義。給藥組的其他各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組相比均未見明顯差異。給藥六個(gè)月后雄性動(dòng)物低劑量及雌性動(dòng)物中劑量組紅細(xì)胞、血紅蛋白出現(xiàn)降低，但其他兩個(gè)劑量組未見明顯改變，其他指標(biāo)與對(duì)照組相比未見明顯差異，并且所有變化值均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)[3]。停藥后恢復(fù)期檢測(cè)結(jié)果中，雄性動(dòng)物各項(xiàng)指標(biāo)給藥組與空白組均無顯著差異，雌性動(dòng)物高劑量組PLT顯著降低，中劑量組HCT有明顯升高，這些變化都屬散在的個(gè)別的變化。其他各項(xiàng)指標(biāo)與空白對(duì)照組相比，均未有顯著性差異。
4.3血液生化檢驗(yàn)大鼠股動(dòng)脈取血，37℃水浴放置30min，3000rpm離心10min，分離血清，以RA-XT全自動(dòng)生化儀，測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)化酶(ALT)，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)化酶(AST)，堿性磷酸酶(ALP)，尿素氮(BUN)，總蛋白(TP)，白蛋白(ALB)，血糖(GLU)，總膽紅素(TB)，肌酐(CR)和總膽固醇(TCHO)。結(jié)果見表10～表15。
BUN批準(zhǔn)文號(hào)URUV-0400，試劑批號(hào)01-1428，法國醫(yī)杰公司；Cr批準(zhǔn)文號(hào)國藥準(zhǔn)字(1999)D-58號(hào)，試劑批號(hào)320361，中生北控；GLU批準(zhǔn)文號(hào)(93)衛(wèi)藥準(zhǔn)字D-25-11號(hào)，試劑批號(hào)240491，中生北控；AST批準(zhǔn)文號(hào)(95)衛(wèi)藥準(zhǔn)字D-20(2)號(hào)，試劑批號(hào)020171，中生北控；ALT批準(zhǔn)文號(hào)(93)衛(wèi)藥準(zhǔn)字D-37-4號(hào)，試劑批號(hào)011151，中生北控；TP批準(zhǔn)文號(hào)(93)衛(wèi)藥準(zhǔn)字D-41號(hào)，試劑批號(hào)260041，中生北控；ALB批準(zhǔn)文號(hào)(93)衛(wèi)藥準(zhǔn)字D-53-5號(hào)，試劑批號(hào)250201，中生北控；ALP批準(zhǔn)文號(hào)國藥準(zhǔn)字(1999)D-27(1)號(hào)，國藥準(zhǔn)字(1999)D-27(2)號(hào)，試劑批號(hào)27091，浙江東甌；CHO試劑批號(hào)040206，上海名典T-BIL批準(zhǔn)文號(hào)BILI-0600，試劑批號(hào)145136，法國醫(yī)杰公司。
表10 雄性大鼠長毒試驗(yàn)給藥三個(gè)月后血液生化測(cè)定(X±SD)
劑量 TPALBTB ALT AST組別 n(g/kg)(g/L) (g/L) (umol/L) (u/L) (u/L)對(duì)照 556.02± 31.64±1.48±152.20± 201.60±4.31 2.23 0.60 76.68 77.53LY5 7.5 63.86± 33.20±0.82±192.00± 232.00±5.27* 2.47 0.53 63.45 39.015 5.0 60.88± 33.24±1.52±137.00± 223.20±4.08 2.11 0.69 74.38 65.955 2.5 62.06± 32.58±0.58±177.40± 255.00±3.10* 1.50 0.45 89.17 43.15劑量 ALPGLU BUN CRCHO組別 n(g/kg) (u/L) (nmol/L) (nmol/L) (umol/L) (nmol/L)對(duì)照 5101.80±3.36± 8.42±59.68±3.25±15.72 1.37 1.09 20.96 0.73LY5 7.5 103.40±3.30± 9.59±78.12±3.83±24.35 0.48 0.72 21.23 0.435 5.0 98.00± 3.68± 8.80±54.64±3.57±22.67 1.60 2.72 13.99 0.745 2.5 102.00±2.94± 8.49±109.50± 3.52±19.60 0.59 0.81 27.25*1.08t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05表11 雌性大鼠長毒試驗(yàn)給藥三個(gè)月后血液生化測(cè)定(X±SD)劑量 TP ALBTB ALTAST組別 n(g/kg)(g/L) (g/L) (umol/L)(u/L) (u/L)對(duì)照 5 60.02± 33.06± 0.66± 202.20±206.40±2.04 1.29 0.4361.95 25.46LY 57.5 59.76± 33.28± 1.62± 182.80±176.80±1.84 0.80 0.5059.57 21.0455.0 61.16± 33.10± 1.28± 211.20±222.80±3.65 2.00 1.1266.61 31.8052.5 61.38± 31.90± 17.02±182.40±202.20±2.62* 3.23 36.33 49.37 39.39劑量 ALPGLUBUN CR CHO組別 n(g/kg) (u/L) (nmol/L) (nmol/L)(umol/L) (nmol/L)對(duì)照 5 110.20± 3.96± 8.61± 66.00± 3.31±16.18 1.24 0.7817.14 0.49LY 57.5 101.40± 3.59± 9.67± 81.52± 3.51±20.66 0.98 2.2336.10 0.375 5.0 113.40± 3.37± 10.01±77.32± 3.23±26.90 0.91 0.5626.25 0.185 2.5 86.20± 2.99± 7.98± 95.94± 3.27±16.96 0.35 2.1648.71 0.97
t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05表12 雄性大鼠長毒試驗(yàn)給藥六個(gè)月后血液生化測(cè)定(X±SD)劑量TPALBTB ALTAST組別 n(g/kg) (g/L) (g/L) (umol/L)(u/L) (u/L)對(duì)照 10 64.94±33.08± 1.04± 202.50±249.60±6.54 2.28 0.4458.66 58.48LY 10 7.5 65.76±35.54± 0.81± 189.70±259.50±2.76 1.37 0.5680.12 61.1810 5.0 62.56±34.20± 1.60± 226.70±244.50±6.48 2.09 1.8950.38 50.9210 2.5 60.60±34.05± 0.92± 155.30±229.10±8.27 2.36 0.5842.54 48.32劑量ALP GLUBUN CR CHO組別 n(g/kg) (u/L) (nmol/L) (nmol/L)(umol/L) (nmol/L)對(duì)照 10 116.40± 2.54± 8.41± 74.90± 3.79±19.76 0.66 1.4333.89 0.51LY10 7.5 118.70± 2.94± 9.87± 66.17± 3.79±32.34 0.98 1.53* 23.97 0.5910 5.0 104.00± 3.20± 9.24± 77.56± 3.58±17.80 1.16 1.8611.66 0.5210 2.5 118.40± 3.12± 9.03± 70.83± 3.66±24.86 1.08 1.2012.88 0.56t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05表13 雌性大鼠長毒試驗(yàn)給藥六個(gè)月后血液生化測(cè)定(X±SD)劑量 TPALB TB ALT AST組別 n(g/kg) (g/L) (g/L) (umo l/L)(u/L) (u/L)對(duì)照 1063.03± 33.27±0.98±179.10± 239.60±5.21 2.070.44 52.58 64.90LY 10 7.5 66.19± 34.56±22.05± 180.40± 208.60±3.05 2.4965.3559.53 58.7210 5.0 63.01± 33.87±1.18±178.80± 231.50±3.49 1.680.91 47.21 49.4010 2.5 58.68± 32.18±1.15±190.70± 190.80±3.16 1.140.66 68.94 46.02劑量 ALP GLU BUN CR CHO(g/kg) (u/L) (nmol/L)(nmol/L) (umol/L)(nmol/L)組別 n對(duì)照 10109.00± 2.23± 8.83±92.90±3.44±17.78 0.791.68 26.06 0.52LY 10 7.5 107.10± 3.14± 9.62±79.03±3.78±
38.450.63* 1.17 26.64 0.4310 5.0 114.50± 1.62± 9.73± 68.01± 3.52±16.340.65 1.76 16.08 0.5210 2.5 109.70± 3.86± 8.58± 68.60± 3.64±29.891.08* 1.68 20.35 0.98t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05表14 雄性大鼠長毒試驗(yàn)恢復(fù)期末血液生化測(cè)定(X±SD)劑量 TPALBTB ALT AST組別 n(g/kg)(g/L) (g/L) (umol/L) (u/L) (u/L)56.76±31.82± 0.96±223.40± 301.00±對(duì)照 52.10 0.68 0.61 27.13 218.547.5 60.42±33.16± 0.84±214.60± 222.40±LY 52.29* 1.94 0.62 85.16 60.785.0 61.94±33.80± 0.90±193.20± 302.80±52.15**1.64 0.41 52.12 68.722.5 60.12±33.38± 0.98±205.60± 202.80±53.68 1.57 0.54 61.00 56.86劑量 ALP GLUBUN CR CHO組別 n(g/kg)(u/L) (nmol/L) (nmol/L) (umol/L)(nmol/L)86.20±4.19± 8.17±64.10±3.12±對(duì)照 530.19 1.10 0.91 26.65 0.417.5 97.60±3.08± 8.81±63.58±3.47±LY 519.62 1.20 0.61 14.98 0.825.0 151.20± 3.02± 9.56±78.58± 3.33±531.25*0.86 1.27 29.07 0.482.5 109.40± 3.11± 8.95±77.98± 3.18±521.29 1.00 1.39 10.94 0.52t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01表15 雌性大鼠長毒試驗(yàn)恢復(fù)期末血液生化測(cè)定(X±SD)劑量TP ALB TB ALT AST組別 n(g/kg) (g/L) (g/L) (umol/L)(u/L) (u/L)57.96± 33.80±1.30± 171.60± 200.00±對(duì)照 510.05 0.940.6162.14 25.857.5 57.26± 31.28±1.38± 176.60± 189.80±LY54.46 2.25* 0.6146.11 25.045.0 61.92± 33.16±1.32± 165.80± 217.20±53.58 1.900.5345.54 39.612.5 59.10± 32.88±1.24± 180.60± 193.00±52.79 1.410.9559.36 25.62
劑量 ALP GLUBUNCR CHO組別 n(g/kg)(u/L) (nmol/L) (nmol/L) (umol/L)(nmol/L)96.40±3.23± 8.18±83.52±3.70±對(duì)照 515.49 1.61 0.95 15.93 0.507.5 132.40± 2.94± 8.37±82.50±3.17±LY525.26* 0.77 2.64 36.16 0.235.0 91.00±3.09± 7.99±84.56±3.38±516.57 0.20 0.55 37.00 0.622.5 100.20± 3.82± 8.27±81.22±3.42±514.13 0.73 1.25 25.58 0.57t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05由表10～表15可見，在給藥三個(gè)月的中期檢測(cè)中，雄性動(dòng)物高、低劑量組的總蛋白有顯著升高(空白對(duì)照組為56.02±4.31，高劑量組為63.86±5.27，p＜0.05；低劑量組為62.06±3.10，p＜0.05)，雌性動(dòng)物低劑量組的總蛋白也表現(xiàn)顯著升高(空白對(duì)照組為60.02±2.04，低劑量組為61.38±2.62，p＜0.05)，但其他劑量組均未見顯著改變。其余指標(biāo)與空白對(duì)照組比較，統(tǒng)計(jì)均無顯著差異。
給藥六個(gè)月后雄性動(dòng)物的高劑量組的尿素氮指標(biāo)有顯著升高(空白對(duì)照組為8.41±1.43，高劑量組為9.78±1.53，p＜0.05)，雌性動(dòng)物的高、低劑量組血糖值與空白對(duì)照組比較有顯著升高(空白對(duì)照組為2.23±0.79，高劑量為3.14±0.63，p＜0.05；低劑量為3.86±1.08，p＜0.01)，其余指標(biāo)與空白對(duì)照組比較均未見顯著差異。
恢復(fù)期的檢測(cè)中雄性動(dòng)物高、中劑量組總蛋白有顯著升高(空白對(duì)照組為56.76±2.10，高劑量組為60.42±2.29，p＜0.05；中劑量組為61.94±2.15，p＜0.01)，雌性動(dòng)物高劑量組白蛋白與空白對(duì)照組比較有顯著下降(空白對(duì)照組為33.80±0.94，高劑量組為31.28±2.25，p＜0.05)，另外，雌性高劑量和雄性中劑量的堿性磷酸酶與空白對(duì)照組比較也有顯著升高(雌性空白組為96.40±15.49，雌性高劑量組為132.40±25.26，p＜0.05；雄性空白組為86.20±30.19，雄性中劑量為151.2±31.25，p＜0.05)，其余指標(biāo)均未見顯著改變。
但以上這些變化值均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，且無劑量相關(guān)性，故無臨床意義。
4.4主要臟器系數(shù)測(cè)定大鼠處死后，立即分離摘取主要臟器，電子天平稱重，計(jì)算臟器重量系數(shù)
臟器系數(shù)(g/kg)＝臟器重量(g)/體重(kg)。結(jié)果見表16～表21。
表16 雄性大鼠長毒試驗(yàn)給藥三個(gè)月后臟器系數(shù)測(cè)定(mg/g，X±SD)劑量組別 n 腦心肝 脾肺(g/kg)4.34± 2.77± 23.01± 3.61± 4.62±對(duì)照 50.31 0.27 1.67 0.45 0.457.5 4.28± 2.95± 24.01± 3.31± 5.92±LY50.31 0.38 3.42 0.21 2.305.0 3.98± 2.66± 21.65± 3.44± 6.17±50.30 0.31 3.09 1.12 2.262.5 4.21± 2.72± 20.97± 2.69± 4.41±50.16 0.21 2.24 0.91 0.79劑量組別 n 腎腎上腺 甲狀腺 胸腺 睪丸 前列腺(g/kg)5.86± 0.145± 0.060±1.421± 11.63± 1.56±對(duì)照 50.19 0.029 0.020 0.534 1.22 0.527.5 5.53± 0.161± 0.071±1.007± 10.33± 1.35±LY50.57 0.025 0.018 0.226 3.30 0.335.0 5.79± 0.150± 0.065±1.104± 7.73± 1.10±50.42 0.016 0.017 0.538 3.16* 0.332.5 5.55± 0.188± 0.061±1.135± 9.92± 1.10±50.34 0.024 0.023 0.353 2.06 0.28t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05表17 雌性大鼠長毒試驗(yàn)給藥三個(gè)月后臟器系數(shù)測(cè)定(mg/g，X±SD)劑量組別 n 腦 心 肝 脾肺(g/kg)3.95±1.98± 16.36±2.82± 3.72±對(duì)照 50.29 0.17 2.500.81 0.467.5 4.03±2.34± 19.63±2.85± 4.46±LY50.26 0.20 1.990.93 0.315.0 3.90±2.24± 16.90±2.72± 3.80±50.24 0.22 1.350.84 0.442.5 3.86±2.12± 15.98±2.31± 3.19±50.35 0.14 0.730.42 0.74劑量組別 n 腎 腎上腺 甲狀腺 胸腺 卵巢 子宮(g/kg)4.14±0.237± 0.066± 1.015± 0.333± 1.18±對(duì)照 50.50 0.082 0.029 0.108 0.048 0.35LY5 7.5 4.22±0.217± 0.071± 1.275± 0.442± 1.60±
0.20 0.037 0.019 0.363 0.075 0.585.04.69± 0.197± 0.069± 1.085± 0.456± 1.47±50.37 0.026 0.026 0.066 0.106 0.582.54.20± 0.196± 0.057± 0.994± 0.326± 1.18±50.22 0.042 0.020 0.125 0.063 0.24t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05表18 雄性大鼠長毒試驗(yàn)給藥六個(gè)月后臟器系數(shù)測(cè)定(mg/g，X±SD)劑量組別 n 腦 心 肝 脾 肺(g/kg)3.53±3.02± 21.99± 2.53±5.70±對(duì)照 100.30 0.33 3.10 0.80 0.597.5 3.43±2.72± 22.01± 2.67±5.33±LY 100.31 0.52 1.53 0.72 1.465.0 3.27±3.21± 21.80± 2.50±5.90±100.50 0.34 1.90 0.59 1.782.5 3.39±3.24± 22.13± 2.41±5.54±100.39 0.28 1.40 0.39 0.66劑量組別 n腎 腎上腺 甲狀腺 胸腺 睪丸 前列腺(g/kg)5.58±0.148± 0.070± 0.626± 9.99± 1.62±對(duì)照 100.48 0.037 0.016 0.186 1.92 0.347.5 5.51±0.125± 0.074± 0.586± 10.09± 1.38±LY100.50 0.026 0.019 0.290 1.38 0.355.0 5.69±0.132± 0.066± 0.653± 10.58± 1.44±100.33 0.025 0.020 0.265 1.45 0.382.5 5.83±0.177± 0.078± 0.576± 10.73± 1.55±100.49 0.034 0.022 0.172 0.84 0.14t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05表19 雌性大鼠長毒試驗(yàn)給藥六個(gè)月后臟器系數(shù)測(cè)定(mg/g，X±SD)劑量組別 n 腦心肝 脾肺(g/kg)5.23± 3.07± 24.96± 2.46± 7.88±對(duì)照 100.89 0.44 2.85 0.47 1.987.55.18± 3.04± 23.65± 3.13± 6.76±LY100.43 0.21 1.97 0.97 2.525.04.95± 3.13± 24.63± 2.93± 6.51±100.47 0.27 1.49 0.53 0.912.54.86± 3.27± 23.86± 2.75± 6.94±100.40 0.38 2.75 0.73 1.65
劑量組別 n腎腎上腺 甲狀腺 胸腺 卵巢 子宮(g/kg) 5.80± 0.309± 0.120±1.046± 0.550± 3.43±對(duì)照 100.46 0.062 0.043 0.291 0.059 1.627.5 6.07± 0.265± 0.089±0.974± 0.587± 2.78±LY100.52 0.046 0.022 0.180 0.135 1.405.0 6.04± 0.294± 0.092±0.997± 0.476± 2.31±100.44 0.053 0.013 0.324 0.101 0.802.5 6.15± 0.307± 0.090±0.841± 0.526± 2.35±100.42 0.065 0.019 0.294 0.127 0.56t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05表20 雄性大鼠長毒試驗(yàn)恢復(fù)期末臟器系數(shù)測(cè)定(mg/g，X±SD)劑量組別 n腦心肝 脾肺(g/kg)3.20± 3.38± 21.96± 1.91± 5.06±對(duì)照 50.70 0.53 0.58 0.58 0.697.5 3.39± 2.84± 23.41± 2.47± 4.84±LY50.28 0.54 1.23* 0.53 0.605.0 3.15± 2.92± 23.02± 2.51± 5.32±50.49 0.69 6.37 0.36 1.082.5 3.57± 3.05± 21.60± 2.46± 5.88±50.47 0.24 3.40 0.56 0.86劑量組別 n 腎腎上腺 甲狀腺 胸腺 睪丸 前列腺(g/kg)6.00± 0.124± 0.067± 0.465± 9.78± 1.82±對(duì)照 50.64 0.019 0.022 0.154 1.56 0.657.55.82± 0.187± 0.072± 0.621± 9.98± 1.84±LY 50.76 0.117 0.014 0.278 0.88 0.555.05.77± 0.144± 0.070± 0.775± 10.88± 1.44±51.63 0.065 0.043 0.330 1.07 0.452.55.87± 0.131± 0.072± 0.579± 9.73± 1.13±50.73 0.008 0.048 0.307 3.59 0.28t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05，*P＜0.05表21 雌性大鼠長毒試驗(yàn)恢復(fù)期末臟器系數(shù)測(cè)定(mg/g，X±SD)劑量組別 n 腦心肝 脾肺(g/kg)5.11± 3.20± 23.70± 2.67± 6.96±對(duì)照 50.54 0.39 2.35 0.63 1.637.55.21± 3.02± 23.62± 2.93± 6.19±LY50.47 0.28 2.47 0.83 0.86
5.0 4.82± 3.07±23.53± 2.44± 7.72±50.55 0.14 1.89 0.44 3.482.5 5.41± 3.23±21.93± 2.32± 6.55±50.71 0.45 1.84 0.50 0.67劑量組別 n 腎腎上腺 甲狀腺 胸腺 卵巢 子宮(g/kg)6.82± 0.266± 0.121±0.897±0.553± 2.23±對(duì)照 50.84 0.043 0.051 0.207 0.173 0.577.56.11± 0.275± 0.085±1.048±0.525± 2.62±LY50.73 0.060 0.021 0.318 0.112 1.035.06.21± 0.260± 0.097±1.224±0.511± 2.23±50.39 0.054 0.005 0.445 0.050 0.252.56.03± 0.296± 0.085±0.870±0.590± 3.13±50.73 0.046 0.039 0.270 0.068 0.81t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，未標(biāo)記者P＞0.05由表16～表21可見，各給藥組動(dòng)物的臟器系數(shù)與正常動(dòng)物相近，與空白對(duì)照比較，均無顯著差異。
4.5主要臟器的病理檢驗(yàn)大鼠處死后，立即分離主要器官，包括心、肝、脾、肺、腎、腦、甲狀腺、淋巴結(jié)、胸腺、腎上腺、胃、十二指腸、膀胱、睪丸、附睪、前列腺或卵巢、子宮，肉眼觀察均無明顯病變，以福爾馬林固定，送病理組織學(xué)檢查。病理報(bào)告表明，給藥組各鼠的內(nèi)臟組織學(xué)與對(duì)照組相比較，檢查結(jié)果基本相同，未見明顯毒性所致的病理學(xué)改變。
5.結(jié)語本實(shí)驗(yàn)是在LY原料藥的藥效學(xué)試驗(yàn)和小鼠急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行大鼠長期毒性試驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)用SD大鼠160只，3個(gè)給藥組ig LY內(nèi)容物2.5g/kg、5.0g/kg、7.5g/kg，相當(dāng)于生藥量為116g/kg、232g/kg、348g/kg。連續(xù)六個(gè)月。動(dòng)物來源、數(shù)量、給藥途徑、劑量、周期等均符合新藥長期毒性試驗(yàn)的規(guī)定。
給藥期間，各組大鼠均未死亡，體重正常增長，給藥中期、給藥結(jié)束及恢復(fù)期末經(jīng)血液學(xué)檢驗(yàn)、生化檢驗(yàn)、臟器系數(shù)測(cè)定及病理組織學(xué)檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)基本正常。以上結(jié)果表明，LY長期口服，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)。
實(shí)施例5 LY的藥效學(xué)試驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠、SD大鼠，由中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證SCXK(蘇)2002-0011號(hào)。
麻鴨采用重慶麻鴨產(chǎn)的蛋孵化的1日齡雛鴨(購于重慶市沙坪壩區(qū)虎溪鎮(zhèn)大田堡村牌坊合作社孵化場(chǎng))經(jīng)腹腔接種0.1mlDHBV DNA陽性病毒血清。接種1周后，分別頸外靜脈抽血，用地高辛標(biāo)記的DHBV DNA探針經(jīng)斑點(diǎn)雜交檢測(cè)篩選出感染陽性鴨，飼養(yǎng)至3周齡作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
1.2藥物及試劑LY，由北京萬賽生物醫(yī)藥技術(shù)發(fā)展有限公司提供。批號(hào)030313。實(shí)驗(yàn)用膠囊內(nèi)容物，為淡褐色粉未，臨用前以蒸餾水配制成濃度為25mg(膠囊內(nèi)容物)/ml、50mg/ml、100mg/ml的溶液供小鼠ig用，ig量為0.2ml/10g體重。
垂盆草沖劑(保肝陽性藥)，主要成分為垂盆草，功能清利濕熱，有降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用，臨床用于急性肝炎、遷移性肝炎及慢性肝炎的治療。巢湖正大藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，ZZ-3168-皖藥準(zhǔn)字(2001)第Z000925號(hào)，批號(hào)021010。臨床人用量一次10g，一日2～3次，按成人體重60g/kg計(jì)算，人用量即0.5g/kg，小鼠用量取5g/kg，大鼠用量取4g/kg。臨用前以蒸餾水配制成濃度為0.25g/ml的溶液供小鼠ig用，大鼠ig配制成0.20g/ml溶液，ig量均為0.2ml/10g體重。
抗乙肝陽性對(duì)照藥物拉米夫定(批號(hào)B038238，葛蘭素威康英國行動(dòng)有限公司生產(chǎn))壓碎后自制成5mg/粒的膠囊。
蕓芝多糖膠囊，功能主治增強(qiáng)免疫功能，用于慢性乙型肝炎、肝癌及老年免疫功能低下者。江蘇晨牌藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，蘇衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1994)第361204號(hào)。臨床人用量一日3～6粒，每粒0.5g，即成人劑量為40mg/kg，小鼠用量為400mg/kg，臨用前以蒸餾水配制成2mg/ml的溶液供小鼠ig用。
阿斯匹林，阿斯特拉(無錫)制藥有限公司，蘇衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1985)第343401號(hào)，批號(hào)200201021號(hào)。
二甲苯，南京化學(xué)試劑廠，批號(hào)990305。營養(yǎng)瓊脂，江蘇省衛(wèi)生防疫站微生物試劑廠，批號(hào)020425。
丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒，批號(hào)20030106。測(cè)試原理為ALT在37℃及pH7.4條件下，作用于丙氨酸及α-酮戊二酸組成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸，反應(yīng)30min后加入2，4-二硝基苯肼鹽酸溶液，即中止反應(yīng)，同時(shí)2，4-二硝基苯肼與酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙。苯腙在堿性條件下呈紅棕色，于505nm處測(cè)吸光度，計(jì)算酶活力。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒，批號(hào)20030106。測(cè)試原理為天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶能使α-酮戊二酸和天門冬氨酸轉(zhuǎn)移氨基和酮基，生成谷氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸在反應(yīng)過程中可自行脫羧成丙酮酸。丙酮酸和2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成2，4-二硝基苯腙，在堿性溶液中顯紅棕色，比色后求得酶的活力單位。白蛋白測(cè)試盒(溴甲酚綠比色法)，批號(hào)20030718，利用白蛋白具有與陰離子染料結(jié)合的特性，在酸性溶液中溴甲酚綠與白蛋白結(jié)合后，由黃色變成綠色，綠色的深淺與白蛋白的深度成正比。總蛋白測(cè)試盒(雙縮脲法)，批號(hào)20030630，利用蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性酮溶液作用，形成紫色復(fù)合物，于波長540nm處測(cè)吸光度，計(jì)算總蛋白含量。羥脯氨酸測(cè)試盒，批號(hào)20030910。均購自南京建成生物工程研究所。
四氯化碳(CCl4)，分析純，南京化學(xué)試劑一廠。魯花牌純正花生油，萊陽魯花濃香花生油有限公司。配制臨用前配制成一定濃度的花生油溶液，置于密封瓶內(nèi)，攪拌6小時(shí)以上。
D-半乳糖胺(D-GalN)，分析純，重慶醫(yī)科大學(xué)，生產(chǎn)批號(hào)030215。配制臨用前以注射用生理鹽水配制成0.8％的溶液，冷藏備用。
注射用環(huán)磷酰胺(CY)，滬衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1995)第012034號(hào)，上海華聯(lián)制藥公司。印度墨汁，北京市西中化工廠，批號(hào)0030619，臨用前以生理鹽水稀釋成1∶4的溶液靜脈注射用。
羊血，購自江寧縣衛(wèi)生防疫站，臨用時(shí)用生理鹽水洗滌三次，每次2000rpm離心5min，棄去上清液，用生理鹽水以3∶5(V/V)稀釋。
都氏液，自配，碳酸氫鈉1.0g，氰化鉀0.05g，高鐵氫化鉀0.2g，蒸餾水配至1000ml。
2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果2.1 LY對(duì)CCl4所致小鼠急性肝損傷的影響取健康小鼠60只，雄性，體重18～22g，隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽性藥組，LY低、中、高劑量組。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組動(dòng)物每天ig等容積蒸餾水，陽性藥組給以5g/kg垂盆草沖劑，LY低、中、高劑量分別給予0.5、1.0、2.0g/kg劑量的藥物，ig體積均為0.2ml/10g，連續(xù)給藥一周，未次給藥后除正常對(duì)照組動(dòng)物以外，其余每組動(dòng)物均ip 0.1％CCl4花生油溶液0.1ml/10g體重，ip后禁食16h，小鼠摘眼球取血，分離血清，以試劑盒所示方法測(cè)定血清中AST、ALT含量。取血完畢后，摘取全部肝臟，福爾馬林固定，取肝小葉部位肝組織作病理檢查。AST、ALT以x±SD表示，組間差異采用Student’s t-test檢驗(yàn)。結(jié)果見表22。
表22 LY對(duì)CCl4所致小鼠急性肝損傷的影響(x±SD)組別劑量(g/kg) N AST(U) ALT(U)正常對(duì)照 10 13.07±6.69*** 11.92±9.98***模型對(duì)照 10 79.20±35.2684.45±39.80垂盆草 510 45.64±24.98** 34.11±24.98***LY低劑 0.5 10 51.60±12.06** 49.57±41.51*LY中劑量1.0 10 47.14±12.35** 27.24±15.41***LY高劑量2.0 10 35.16±18.84*** 28.70±8.51***與模型對(duì)照組比較，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01由表22可見， LY三個(gè)劑量組均能顯著降低CCl4所致小鼠急性肝損傷血清中的AST的含量，中、高劑量組能顯著降低ALT的含量。表明LY能減輕CCl4對(duì)小鼠肝臟的損傷，對(duì)肝臟有保護(hù)作用。
病理組織檢查結(jié)果表明CCl4能引起小鼠的肝細(xì)胞呈不同程度的細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤。LY給藥組與模型對(duì)照組相比，肝細(xì)胞的破壞程度明顯減輕，偶見有少量脂肪變性及局灶性的炎性浸潤。結(jié)果見表23。
表23 LY對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)觀察動(dòng)物數(shù) 炎性浸潤 細(xì)胞壞死組別無局灶彌漫 無 點(diǎn)狀 灶狀正常對(duì)照10 100 0 10 00模型對(duì) 10 6 3 1 244垂盆草 10 8 2 0 334LY低劑量10 9 1 0 343LY中劑量10 8 2 0 811LY高劑量10 10 0 0 622
2.2 LY對(duì)D-半乳糖胺所致小鼠急性肝損傷的影響取健康小鼠60只，雄性，18～22g，隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽性藥組，LY低、中、高劑量組。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組動(dòng)物每天ig等容積蒸餾水，陽性藥組給以5g/kg垂盆草沖劑，LY低、中、高劑量分別給予0.5、1.0、2.0g/kg劑量的藥物，ig體積均為0.2ml/10g，連續(xù)給藥一周，未次給藥后除正常對(duì)照組動(dòng)物以外，其余每組動(dòng)物均ip D-半乳糖胺800mg/kg體重，ip后禁食16h，小鼠摘眼球取血，分離血清，以試劑盒所示方法測(cè)定血清中AST、ALT含量。取血完畢后，摘取全部肝臟，福爾馬林固定，取肝小葉部位肝組織作病理檢查。結(jié)果見表24。
表24 LY對(duì)D-半乳糖胺所致小鼠急性肝損傷的影響(x±SD)組別 劑量(g/kg)N AST(U) ALT(U)正常對(duì)照 1051.21±42.91*** 20.15±9.52***模型對(duì)照 10121.38±28.58 150.76±69.84垂盆草 5 1060.60±1.49*** 98.38±35.03*LY低劑量 0.5 1089.21±9.32** 99.52±59.64*LY中劑量 1.0 1049.19±9.52*** 70.15±26.09***LY高劑量 2.0 1045.80±32.55** 42.39±34.90***與模型對(duì)照組比較，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01由表24可見，LY三個(gè)劑量組均能顯著降低D-半乳糖胺所致小鼠急性肝損傷血清中的AST的含量，中、高劑量組能顯著降低ALT的含量。
病理組織檢查表明，D-半乳糖胺引起小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝組織呈不同程度的壞死，有局灶性或彌漫性的炎性浸潤，匯管區(qū)增大，肝細(xì)胞有明顯的脂肪變性。給藥組與模型組相比，肝組織的破壞呈不同程度的減輕，脂肪變減輕。表明LY可保護(hù)肝細(xì)胞，減輕D-半乳糖胺對(duì)肝臟的破壞。結(jié)果見表25。
表25 LY對(duì)D-半乳糖胺所致急性肝損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)觀察動(dòng)物數(shù) 炎性浸潤 細(xì)胞壞死組別無 局灶彌漫 無 點(diǎn)狀 灶狀正常對(duì)照10 10 0010 00模型對(duì)照10 073226垂盆草 10 010 0334LY低劑量10 172037LY中劑量10 073217LY高劑量10 6313432.3 LY對(duì)CCl4所致大鼠慢性肝損傷的影響慢性肝損傷模型的制備及分組取健康雄性大鼠，180～220g，測(cè)定造模前各項(xiàng)生化指標(biāo)，除6只大鼠作為正常對(duì)照組外，其余64只大鼠ig 50％CCl4花生油溶液10ml/kg，每周二次，連續(xù)10周。造型6周時(shí)，眼眶取血，分離血清，測(cè)定血清AST、ALT的含量，按血清ALT含量，將大鼠分為5組模型對(duì)照組(16只)、垂盆草顆粒組(12只)，LY低(12只)、中(12只)、高劑量組(12只)，按表中劑量給藥，每天1次，連續(xù)給藥4周后，末次給藥后24h，摘眼球取血，3000rpm離心10min，分離血清，測(cè)定AST、ALT、總蛋白、白蛋白的含量。另取受試大鼠的肝臟，稱重，計(jì)算肝臟系數(shù)，稱取肝小葉部位的肝臟1g，按試劑盒所示方法，測(cè)定肝組織中羥脯氨酸含量。
病理學(xué)檢查取肝左葉固定，石蠟包埋，包埋肝組織切成5μm的石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織學(xué)變化，并將肝纖維化分為0～4級(jí)，0級(jí)無纖維化；I級(jí)纖維結(jié)締組織僅局限于匯管區(qū)或匯管區(qū)擴(kuò)大，有向小葉發(fā)展的傾向；II級(jí)纖維結(jié)締組織增生進(jìn)入肝小葉2/3并有I級(jí)同樣的改變；III級(jí)纖維結(jié)締組織進(jìn)入肝小葉達(dá)中央靜脈周圍；IV級(jí)纖維結(jié)締組織在全小葉多處彌漫性增生，假小葉形成，并有III級(jí)同樣的改變。
表26 LY對(duì)CCl4所致大鼠慢性肝損傷的影響表26.1 慢性肝損傷大鼠造模型前各項(xiàng)生化指標(biāo)(x±SD)組別 劑量 動(dòng)物數(shù) ALT AST 總蛋白 白蛋白 A/G(g/kg)(U) (U) (g/L) (g/L)試驗(yàn)前 試驗(yàn)后正常對(duì)照 6 6 59.78± 98.94± 65.32±30.13±0.87±26.52 29.654.912.160.11模型空白 16 1454.10± 92.40± 64.07±30.30±0.92±20.03 21.325.052.080.17垂盆草組 4 12 8 54.36± 85.74± 65.88±31.36±0.94±9.18 14.855.372.360.20LY低劑量 0.3 12 8 59.98± 97.86± 64.98±29.76±0.87±17.14 17.925.532.590.18LY中劑量 0.6 12 1153.71± 91.33± 64.15±30.76±0.94±14.85 19.273.211.790.18LY高劑量 1.2 12 1052.19± 83.04± 63.91±32.73±1.07±14.73 14.254.061.040.17t檢驗(yàn)，與正常對(duì)照組比較，均無顯著性差異表26.2 慢性肝損傷大鼠造模六周后各項(xiàng)生化指標(biāo)的變化(x±SD)組別 劑量 動(dòng)物數(shù) ALTAST 總蛋白 白蛋白 A/G(g/kg)試驗(yàn) 試驗(yàn) (U)(U) (g/L) (g/L)前 后正常對(duì)照6 646.35± 102.80± 75.57±32.85±0.77±8.51 8.96 3.452.960.12
模型空白 16 14 205.85± 217.82± 77.04±36.16±0.89±54.32***25.05***3.55* 3.28** 0.13**垂盆草組 4 12 8 196.08± 218.96± 77.84±37.37±0.94±45.21***16.77***3.00*△ 3.95**△0.21*△△ △LY低劑量 0.3 12 8 212.81± 215.12± 76.41±35.96±0.90±65.12***51.97***2.96*△ 3.67*△ 0.17*△△ △LY中劑量 0.6 12 11 222.76± 228.18± 79.33±37.32±0.90±51.50***28.99***4.69*△ 5.33**△0.18*△△ △LY高劑量 1.2 12 10 226.13±224.53± 78.96±37.57±0.94±22.11***10.52***5.71*△ 3.45**△0.23*△△ △t檢驗(yàn)，與正常對(duì)照組比較，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01；與模型對(duì)照組比較，△p＞0.05表26.3 LY對(duì)CCl4所致慢性肝損傷的大鼠生化指標(biāo)的影響(x±SD)組別 劑量動(dòng)物數(shù) ALT AST 總蛋白 白蛋白 A/G(g/kg) 試驗(yàn) 試驗(yàn) (U) (U) (g/L)(g/L)前后正常對(duì)照 6 640.38± 104.16± 72.04±23.69± 0.50±17.40***28.75***5.17* 4.81* 0.13*模型空白 16 14323.08± 301.00± 73.20±23.73± 0.50±154.40 104.11 7.715.70 0.16垂盆草組 4 12 8 47.59±101.50± 76.44±27.61± 0.57±10.90***19.35***3.15* 2.72* 0.10*LY低劑量 0.3 12 8 38.60±80.55± 77.42±29.38± 0.61±11.30***18.54***7.89* 4.83** 0.09*LY中劑量 0.6 12 1150.93±96.46± 76.36±25.42± 0.53±8.53*** 28.03***7.07* 4.67* 0.13*LY高劑量 1.2 12 1055.38±93.52± 79.37±24.75± 0.46±23.38***36.32***5.10** 4.95* 0.13*t檢驗(yàn)，與模型空白組比較，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01表26.4 LY對(duì)CCl4所致慢性肝損傷大鼠肝羥脯氨酸含量及肝臟系數(shù)的影響(x±SD)組別 劑量動(dòng)物數(shù) 肝臟系數(shù) 羥脯氨酸(g/kg) 試驗(yàn)前 試驗(yàn)后正常對(duì)照 6 6 39.22±3.52***1.899±1.51*模型空白 16 1446.98±5.45 4.056±3.69垂盆草組 4 12 8 43.89±5.73* 1.696±1.14*LY低劑量 0.3 12 8 44.60±3.78* 3.469±4.58*LY中劑量 0.6 12 1144.37±6.23* 1.101±0.26**LY高劑量 1.2 12 1046.33±7.19* 1.045±0.40**t檢驗(yàn)，與模型空白組比較，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01
由表26.2可見，CCl4造型后，大鼠血清中ALT、AST含量顯著增加，用藥后由表26.3和26.4可見，LY對(duì)CCl4所致大鼠慢性肝損傷血清ALT、AST的含量，與模型組比較存在顯著性差異(p＜0.01)。對(duì)血清TP、ALB、A/G的影響不大。中、高劑量能顯著降低CCl4慢性肝損傷大鼠肝臟羥脯氨酸(P＜0.05)，而低劑量組則無顯著性差異(P＞0.05)。
病理組織檢查結(jié)果表明模型組大鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞，并有較明顯的纖維隔形成，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞明顯腫脹變性，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維結(jié)締組織增生，假小葉形成。中央靜脈周圍有少量壞死的肝細(xì)胞，并伴有中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。匯管區(qū)由于結(jié)締組織增生而變寬。LY組與模型組相比，肝細(xì)胞變性程度明顯減輕，纖維結(jié)締組織明顯減少，未見明顯假小葉形成，匯管區(qū)結(jié)締組織增生不明顯。結(jié)果見表26.5。
表26.5 LY對(duì)CCl4所致慢性肝損傷大鼠肝臟病理組織學(xué)觀察組別 N炎性浸潤 脂肪變性 壞死纖維化無 局彌無輕中重 無 點(diǎn) 灶 片 橋 0III III灶漫 度度度狀 狀 狀 接 級(jí) 級(jí) 級(jí) 級(jí)正常對(duì)照 66 0 0 6 0 0 0600060000模型空白 14 3 110 3 2 7 211 20102390垂盆草組 80 8 0 2 5 1 0700102510LY低劑量 80 8 0 0 8 0 0800000800LY中劑量 11 4 7 0 1 7 3 010 00107400LY高劑量 10 1 8 1 1 7 2 08002073002.4 LY對(duì)瓊脂所致大鼠肉芽腫的影響健康SD雄性大鼠61只，230～270g，隨機(jī)分為6組，陽性對(duì)照組除垂盆草外，增設(shè)一組西藥對(duì)照阿斯匹林組。按表中所示劑量給藥，給藥前每只大鼠背部皮下注射2％滅菌瓊脂2ml/只，隨后給藥，每天一次，連續(xù)10天，第11天處死大鼠，剝離出瓊脂肉芽腫塊，電子天平稱取濕重，稱重后將肉芽腫在60℃下烘干6h，取出稱取干重。結(jié)果見表27。
表27 LY對(duì)瓊脂所致大鼠肉芽腫的影響(x±SD)組別劑量(g/kg)N肉芽腫濕重(mg) 肉芽腫干重(mg)空白對(duì)照 11 895.6±216.3 132.6±44.6阿斯匹林0.04 10 471.9±81.2*** 62.4±14.2***垂盆草 5 10 756.2±247.1* 131.3±64.8*LY低劑量0.3 10 747.8±122.9* 104.2±29.7*LY中劑量0.6 10 756.4±375.8* 101.0±57.4*LY高劑量1.2 10 594.6±172.8***54.0±25.9***
與空白對(duì)照組比較，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01由表27可見，LY三個(gè)劑量組對(duì)瓊脂所引起的肉芽腫重量均有減輕，高劑量組統(tǒng)計(jì)有顯著意義。
2.5對(duì)鴨乙型肝炎病毒作用2.5.1實(shí)驗(yàn)方法將感染陽性鴨77只隨機(jī)分為5組(1)病毒對(duì)照組(16只)用淀粉膠囊，每日口腔灌喂1次，劑量為500mg/只。
(2)陽性藥物對(duì)照組(15只)用拉米夫定膠囊，每日口腔灌喂1次，劑量為50mg/kg.d。
(3)LY小劑量組(16只)每日口腔灌喂1次，劑量為80mg/kg.d。
(4)LY中劑量組(14只)每日口腔灌喂1次，劑量為300mg/kg.d。
(5)LY大劑量組(16只)每日口腔灌喂1次，劑量為600mg/kg.d。
實(shí)驗(yàn)用藥時(shí)間為28天，停藥觀察7天。觀察指標(biāo)如下(1)血清DHBV DNA改變情況于用藥前、用藥7天、14天、21天、28天、停藥7天分別頸外靜脈抽血，分離血清于-20℃保存待檢。采用斑點(diǎn)雜交法[5]，用羅氏(Roche)公司的地高辛標(biāo)記試劑盒(Cat.No.1745832)制備DHBV DNA探針統(tǒng)一檢測(cè)，用Vuego Scan(Brisa-620ST)掃描儀進(jìn)行膜片掃描；用the Discovery SeriesQuantity One軟件對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行定量分析，斑點(diǎn)值為volume(volume＝intensity×mm2)。統(tǒng)計(jì)學(xué)采用SPSS10.0配對(duì)t檢驗(yàn)法(F檢驗(yàn))處理。
(2)血清DHBsAg改變情況于用藥前、用藥7天、14天、21天、28天、停藥7天分別頸外靜脈抽血，分離血清于-20℃保存待檢。將用藥前后的血清統(tǒng)一對(duì)比檢測(cè)，采用ELISA快速法[7]、酶標(biāo)閱讀儀(Bio-TEK公司)490nm讀取0.D值。統(tǒng)計(jì)學(xué)采用SPSS軟件，配對(duì)t檢驗(yàn)。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)束各組肝臟病理(HE染色)檢測(cè)于停藥7天分別剖殺各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，各取肝右葉邊緣小塊肝組織固定于10％甲醛溶液，石臘切片，用HE染色，病理檢查。
2.5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)LY對(duì)乙肝鴨血清中DHBV DNA滴度的影響
表28 LY對(duì)乙肝鴨血清中DHBV DNA滴度的影響表28.1 各組別DHBV DNA差值情況比較(X±S)組別 用藥7d 用藥14d 用藥21d 用藥28d 停藥7d-2.837± 239.187± 394.2352± 221.3484± 169.2754±淀粉膠襄154.2299306.7377 371.3968 317.8262 588.2919-246.6639±-131.9997± -142.5544± -224.6403±39.3333±拉米夫定106.08* 139.2033*91.6785* 154.6765* 279.4168-74.7257± 70.6732± 40.4474±-110.7338±-157.80623LY大劑量202.848 320.8429 184.8002* 157.2606* ±249.7785-46.4791± 96.9446± 65.5759±-134.5066±-100.2533±LY中劑量193.9633252.6191 294.2348* 219.7854* 248.872546.9233± 225.1608±159.677±-92.7258± -46.9878±LY小劑量126.4668191.1758 212.2943* 166.7057* 194.0589與淀粉膠襄組比較，*P＜0.05，(SPSS10.0 F檢驗(yàn))表28.2 各組別DHBV DNA差率情況(X±S)組別 用藥7d 用藥14d 用藥21d 用藥28d 停藥7d-0.0123± 0.1375± 0.2266± 0.1298± 0.0968±淀粉膠襄0.0859 0.17350.21270.18510.3484-0.1296± -0.0700±-0.0740± -0.1141±0.03484±拉米夫定0.05392* 0.07187* 0.04725* 0.0709* 0.1569-0.0401± 0.03381± 0.01899±-0.0563±-0.0729±LY大劑量0.1029 0.17150.1024* 0.08316* 0.1136-0.0177± 0.05554± 0.04449±-0.0614±-0.0434±LY中劑量0.09655 0.12450.1515* 0.1049* 0.11420.02355± 0.1115± 0.07923± -0.0429±-0.0203±LY小劑量0.06201 0.09875 0.1063* 0.08468* 0.09601與淀粉膠襄組比較，*P＜0.05，(SPSS10.0 F檢驗(yàn))由表28.1、表28.2可知a.拉米夫定組用藥7天后開始出現(xiàn)血清DHBV DNA滴度降低，與淀粉膠囊組比較有顯著性差異；b.LY大、中、小劑量組分別于21天開始出現(xiàn)血清DHBV DNA滴度降低，與淀粉膠囊組比較有顯著性差異；c.LY大、中、小劑量組與拉米夫定組用藥期間均有血清DHBV DNA滴度降低，但LY組較拉米夫定組起效時(shí)間晚。
表28.3 對(duì)乙肝鴨血清中DHBV DNA反跳的影響-差值、差率比較(X±S)差值 差率組別用藥28d 停藥7d 用藥28d 停約7d221.3484± 169.2754±淀粉膠襄 0.1298±0.18510.0968±0.3484317.8262 588.2919
-224.6403± 39.3333±0.03484±拉米夫定-0.1141±0.0709154.6765 279.4168* 0.1569*-110.7338± -157.80623± -0.0563±LY大劑量 -0.0729±0.1136157.2606 249.77850.08316-134.5066± -100.2533±LY中劑量-0.0614±0.1049 -0.0434±0.1142219.7854 248.8725-92.7258±-46.9878± -0.0429±-0.0203±LY小劑量166.7057 194.05890.08468 0.09601各組自身用藥、停藥前后比較，*P＜0.05，(SPSS10.0 F檢驗(yàn))由表28.3可知a.拉米夫定組停藥7天后，開始出現(xiàn)血清DHBV DNA滴度反跳，與停藥前比較有顯著性差異；b.LY大、中、小劑量組停藥7天后，未出現(xiàn)血清DHBV DNA滴度反跳，與停藥前比較無顯著性差異；c.LY大、中、小劑量組較拉米夫定組停藥7天，血清DHBV DNA滴度變化不明顯，未見明顯反跳。
(2)LY對(duì)乙肝鴨血清DHBsAgO.D的影響病毒對(duì)照組(淀粉膠囊)、陽性藥物對(duì)照組(拉米夫定)及LY各劑量組用藥后28天，血清DHBsAgO.D值均無明顯降低。見表29。
表29 LY對(duì)乙肝鴨血清DHBsAgO.D的影響(x±SD)組別用藥前 用藥7天用藥14天 用藥21天 用藥28天 停藥7天0.273±0.265± 0.414± 0.377± 0.273± 0.226±淀粉膠囊組0.097 0.088 0.1360.1350.0790.1030.324±0.295± 0.362± 0.302± 0.287± 0.262±拉米夫定組0.114 0.156 0.1410.1170.1100.1490.264±0.238± 0.336± 0.338± 0.297± 0.219±LY大劑量0.169 0.172 0.2320.2450.2040.1200.229±0.246± 0.333± 0.330± 0.257± 0.212±LY中劑量0.064 0.073 0.1170.1200.0860.0810.222±0.237± 0.377± 0.391± 0.243± 0.214±LY小劑量0.091 0.110 0.1510.1960.0810.177注上表所列為各組DHBsAgO.D值平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計(jì)學(xué)采用配對(duì)t檢驗(yàn)，為各組不同時(shí)間DHBsAgO.D值與同組用藥前DHBsAgO.D值的比較。
(3)肝臟HE染色病理檢查結(jié)果
各組肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，均有較輕程度肝細(xì)胞濁腫變性；嗜酸變性少；部分組織有肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死現(xiàn)象，這些病理表現(xiàn)用藥組與對(duì)照組無明顯差異；匯管區(qū)、小葉間隔有輕～中度炎癥細(xì)胞浸潤，淀粉膠囊組炎癥細(xì)胞浸潤程度(中度)較其余各組(輕度)略重。
2.6 LY對(duì)小鼠免疫功能的影響2.6.1 LY對(duì)正常小鼠免疫功能的影響[3]2.6.1.1對(duì)正常小鼠免疫器官的影響取健康小鼠50只，雌性，體重12～16g，隨機(jī)分為五組，分別為空白對(duì)照組，蕓芝多糖0.4g/kg對(duì)照組，LY0.5g/kg、1.0g/kg和2.0g/kg劑量組，連續(xù)給藥7天，末次給藥后，動(dòng)物處死，摘取胸腺、脾臟，稱重，并計(jì)算臟器系數(shù)(臟器重量(mg)與體重(g)之比)。結(jié)果見表30。
表30 LY對(duì)正常小鼠免疫器官重量的影響(x±SD)組別 劑量(g/kg) N胸腺指數(shù) 脾指數(shù)空白對(duì)照 10 4.503±0.826 5.526±0.946蕓芝多糖 0.410 4.485±1.203* 5.672±1.360*LY 0.510 4.656±0.817* 5.031±1.417*LY 1.010 4.443±0.619* 5.283±1.382*LY 2.010 4.350±1.026* 6.882±4.040*與空白對(duì)照組比較，*p＞0.05。
由表30可見，LY對(duì)正常小鼠免疫器官的重量未見明顯影響。
2.6.1.2對(duì)非特異性免疫功能的影響——碳粒廓清法[3]雄性小鼠50只，體重18～22g，分組，給藥同上，未次給藥后各鼠尾靜脈注射經(jīng)稀釋后的印度墨汁0.1ml/10g，于2min(t1)、10min(t2)眼球靜脈叢取血20μl，加入到0.1％Na2CO3溶液2ml中，搖勻，于640nm波長下比色，測(cè)定t1和t2時(shí)的吸光度，分別為OD1、OD2。取血完后，將小鼠放血處死，摘取肝、脾，稱重，按下列公式計(jì)算廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α。結(jié)果見表31。
K＝(lgOD1-lgOD2)/(T1-T2)α＝W*K1/3/(WLS)公式中OD為血中各時(shí)間點(diǎn)的吸光度，T為時(shí)間，W為體重，WLS為肝脾合重。
表31 LY對(duì)正常小鼠碳粒廓清速率的影響(x±SD)組別 劑量(mg/kg)N K α
空白對(duì)照 10 0.0393±0.0236 5.027±1.098蕓芝多糖0.410 0.0450±0.0180*5.667±0.785*LY 0.510 0.0360±0.0196*5.349±1.027*LY 1.010 0.0310±0.0080*4.836±0.714*LY 2.010 0.0365±0.0129*5.276±0.995*與空白對(duì)照組比較，*p＞0.05。
由表31可見，LY對(duì)正常小鼠碳粒廓清速率未見明顯影響。
2.6.1.3對(duì)特異性體液免疫功能的影響——血清溶血素測(cè)定法[3]雌性小鼠50只，體重18～22g，分組，給藥同上，連續(xù)給藥7天，給藥第三天，每鼠腹腔注射3∶5(V/V)的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)0.2ml/只進(jìn)行免疫，給藥結(jié)束后小鼠眼靜脈叢取血，分離血清，將血清以生理鹽水500倍稀釋供測(cè)定。反應(yīng)管內(nèi)加入1ml血清，10％SRBC 0.5ml，10％補(bǔ)體1ml，置37℃恒溫水浴中保溫30min，然后移至冰浴中終止反應(yīng)，離心后取上清液1ml，加都氏液3ml，搖勻，放置10min，于540nm波長處比色讀取吸光度。測(cè)定SRBC半數(shù)溶血值取10％SRBC 0.25ml加都氏試劑至4ml，比色讀取吸光度值。計(jì)算血清HC50＝樣品的吸光度值/SRBC半數(shù)溶血值×稀釋倍數(shù)。結(jié)果見表32。
表32 LY對(duì)小鼠溶血素生成的影響(x±SD)組別 劑量(mg/kg) NHC50空白對(duì)照 10 480.8±94.04蕓芝多糖 0.4 10 627.6±146.7**LY 0.5 10 496.7±116.8*LY 1.0 10 489.9±121.6*LY 2.0 10 494.9±134.8*與空白對(duì)照組比較，*p＞0.05，**p＜0.05由表32可見，LY對(duì)正常小鼠的溶血素水平無明顯影響。
2.6.2對(duì)免疫低下小鼠免疫功能的影響2.6.2.1對(duì)CY所造成免疫低下小鼠免疫器官的影響[4]小鼠68只，雌性，體重18～22g，隨機(jī)分為六組，分別為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽性藥組，LY高、中、低三個(gè)劑量組，連續(xù)給藥7天。采用CY造成免疫低下模型，除空白對(duì)照組外，其余每組小鼠從第五天開始每天ip CY 50mg/kg體重，連續(xù)三天造模。第八天，動(dòng)物處死，摘取胸腺、脾臟、稱重，并計(jì)算臟器系數(shù)。結(jié)果見表33。
表33 LY對(duì)免疫低下小鼠免疫器官重量的影響(x±SD)
組別劑量(g/kg) N 胸腺指數(shù) 脾指數(shù)空白對(duì)照184.11±0.93***4.58±1.14***模型對(duì)照(CY)0.05102.58±1.06 2.77±0.72蕓芝多糖+CY 0.4+0.05103.45±0.66** 2.68±0.55*LY+CY 0.5+0.05102.45±0.45* 2.84±0.55*LY+CY 1.0+0.05103.32±0.35** 3.28±0.86*LY+CY 2.0+0.05103.05±0.80* 3.04±0.75*與CY對(duì)照組比較，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01。
由表33可見，LY使免疫低下小鼠的免疫器官的降低有所減輕，中劑量組對(duì)胸腺指數(shù)的降低的保護(hù)作用統(tǒng)計(jì)有顯著意義。
2.6.2.2對(duì)非特異性免疫功能的影響——碳粒廓清法[4]小鼠67只，雄性，體重18～22g，按表8所示進(jìn)行分組給藥、免疫低下造模同上，第八天各鼠尾靜脈注射經(jīng)稀釋后的印度墨汁0.1ml/10g，于2min(t1)、10min(t2)眼球靜脈叢取血20l，加入到0.1％Na2CO3溶液2ml中，搖勻，于640nm波長下比色，測(cè)定t1和t2時(shí)的吸光度，分別為OD1、OD2。取血完后，將小鼠放血處死，摘取肝、脾，稱重，計(jì)算廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α。結(jié)果見表34。
表34 LY對(duì)免疫低下小鼠碳粒廓清速率的影響(x±SD)組別 劑量(g/kg) N K α空白對(duì)照 170.02836±0.0098*4.786±0.586**模型對(duì)照(CY) 0.05100.02577±0.0064 4.221±0.736蕓芝多糖+CY0.4+0.05100.03529±0.0122** 5.264±0.898**LY+CY 0.5+0.05100.02250±0.0045*4.406±0.534*LY+CY 1.0+0.05100.03274±0.0096*4.898±0.831*LY+CY 2.0+0.05100.02950±0.0093*5.288±0.737**與CY對(duì)照組比較，*p＞0.05，**p＜0.05。
由表34可見，LY高劑量組能顯著增加免疫低下模型小鼠的吞噬指數(shù)。
2.6.2.3對(duì)特異性體液免疫功能的影響——血清溶血素測(cè)定法[3，4]小鼠65只，雌性，體重18～22g，按表14所示進(jìn)行分組給藥，給藥第五天起，第天腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg，1次/d，連續(xù)三天，造成免疫低下模型，給藥第三天，每鼠腹腔注射3∶5的SRBC 0.2ml/只進(jìn)行免疫，連續(xù)給藥7天，第八天小鼠眼靜脈叢取血，分離血清，將血清以生理鹽水500倍稀釋供測(cè)定。反應(yīng)管內(nèi)加入1ml血清，10％SRBC 0.5ml，10％補(bǔ)體1ml，置37恒溫水浴中保溫30min，然后移至冰浴中終止反應(yīng)，離心后取上清液1ml，加都氏液3ml，搖勻，放置10min，于540nm波長處比色讀取吸光度。測(cè)定SRBC半數(shù)溶血值取10％SRBC 0.25ml加都氏試劑至4ml，比色讀取吸光度值。計(jì)算血清HC50＝樣品的吸光度值/SRBC半數(shù)溶血值×稀釋倍數(shù)。結(jié)果見表35。
表35 LY對(duì)免疫低下小鼠溶血素生成的影響(x±SD)組別 劑量(g/kg) N HC50空白對(duì)照 15345.4±64.8***模型對(duì)照(CY) 0.0510212.3±53.2蕓芝多糖+CY 0.4+0.0510324.7±77.9***LY+CY0.5+0.0510286.9±82.7**LY+CY1.0+0.0510317.7±102.2***LY+CY2.0+0.0510322.6±96.7***與CY對(duì)照組比較，***p＜0.01，**p＜0.05由表35可見，LY三個(gè)劑量組均可提高免疫低下小鼠的血清溶血素水平。
3.結(jié)論受試藥物L(fēng)Y能顯著降低CCl4和D-半乳糖胺所引起的小鼠血清ALT、AST含量的增高；LY能明顯抑制CCl4所引起的慢性肝損傷大鼠血清ALT、AST含量的增高，能降低肝損傷大鼠肝臟中羥脯氨酸的含量；LY對(duì)正常小鼠的免疫功能無明顯影響，對(duì)CY所造成的免疫低下小鼠的體液免疫功能有一定的增強(qiáng)作用，對(duì)免疫低下小鼠的免疫器官系數(shù)的降低也有減輕作用；高劑量LY對(duì)瓊脂引起的大鼠肉芽腫的抑制作用有顯著的統(tǒng)計(jì)意義。
用DHBV感染鴨作為乙型肝炎動(dòng)物模型來研究人類乙型肝炎發(fā)病機(jī)理、病毒復(fù)制過程及篩選有效的治療藥物，已為國內(nèi)外學(xué)者所應(yīng)用[9]。1-3日齡雛鴨感染DHBV可維持長期病毒血癥而無明顯的自然轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象[10]，因此，應(yīng)用1日齡雛鴨經(jīng)腹腔感染DHBV的方法來建立鴨乙型肝炎動(dòng)物模型進(jìn)行LY抗病毒療效的考核，期望篩選出有抗乙型肝炎病毒作用的藥物。并用對(duì)乙型肝炎病毒有明顯抑制作用的核苷酸類似物拉米夫定作為陽性藥物對(duì)照。
本次動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明LY大、中、小劑量組和陽性藥物對(duì)照拉米夫定組用藥28天，鴨血清中的DHBV DNA滴度降低有顯著意義，其中拉米夫定組在停藥7天后鴨血清中DHBV DNA有明顯反跳，而LY大、中、小劑量組在停藥7天后鴨血清中的DHBVDNA未出現(xiàn)反跳，說明LY具有抑制鴨乙型肝炎病毒作用且停藥后無反跳。此外，各試驗(yàn)組血清中DHBsAg均無明顯的降低，說明LY對(duì)鴨乙型肝炎病毒表面抗原抑制作用不明顯。
由于鴨乙型肝炎動(dòng)物模型自身的特點(diǎn)，1-3日齡雛鴨免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，在感染DHBV后，僅出現(xiàn)單純的病毒攜帶狀態(tài)，肝臟組織病變輕微，肝功能無明顯異常[1，2]。的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)LY各劑量組肝組織病理檢測(cè)與對(duì)照組無明顯差異，可說明連續(xù)用藥1個(gè)月LY對(duì)肝組織無明顯毒性損害。
以上實(shí)驗(yàn)表明，LY具有保肝、抗炎、抑制鴨乙型肝炎病毒、增強(qiáng)免疫低下小鼠免疫功能及等作用。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其特征在于，它含有Y的乙醇提取物和L的水提取物。
2.權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征在于，它包括下述步驟(1)選取合格的藥材Y和L，壓碎成Y粉和L粉；(2)用乙醇提取Y粉，得Y的乙醇提取液，將其制成干粉I；(3)用水提取L粉，得L的水提取液，將其制成干粉II；(4)將干粉I與干粉II混合均勻，按照常規(guī)工藝制成口服藥物制劑。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物的制備方法，其特征在于，步驟(2)中的Y粉與步驟(3)中的L粉按照常規(guī)工藝制成口服藥物制劑。
4.權(quán)利要求1所述的組合物在制備治療急、慢性乙型肝炎攜帶者的藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的組合物在制備治療脂肪肝的藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的組合物在制備治療肝硬化的藥物中的應(yīng)用。
7.Y和L在制備治療急、慢性乙型肝炎攜帶者的藥物中的應(yīng)用。
8.Y和L在制備治療脂肪肝的藥物中的應(yīng)用。
9.Y和L在制備治療肝硬化的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種組合物，它含有Y的乙醇提取物和L的水提取物。本發(fā)明還提供了上述組合物的制備方法，它包括下述步驟(1)選取合格的藥材Y和L，壓碎成Y粉和L粉；(2)用乙醇提取Y粉，得Y的乙醇提取液，將其制成干粉I；(3)用水提取L粉，得L的水提取液，將其制成干粉II；(4)將干粉I與干粉II混合均勻，按照常規(guī)工藝制成固體藥物制劑。本發(fā)明還提供了上述組合物在制備治療肝病的藥物中的應(yīng)用，所述的肝病優(yōu)選為急、慢性乙型肝炎攜帶者、脂肪肝或肝硬化。本發(fā)明還提供了Y和L在制備治療肝病的藥物中的應(yīng)用，所述的肝病優(yōu)選為急、慢性乙型肝炎攜帶者、脂肪肝或肝硬化。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1586536SQ200410062800
公開日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月12日
發(fā)明者李求是 申請(qǐng)人:北京萬賽生物醫(yī)藥技術(shù)發(fā)展有限公司