專(zhuān)利名稱(chēng)：預(yù)防流感病毒的截短的血凝素疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種生物制品，特別是一種預(yù)防流感病毒的截短的血凝素疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
流行性感冒病毒(influenza virus)是引起人類(lèi)死亡的主要原因之一。它能引起急性呼吸道感染，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康和生命。
血凝素(hemagglutinin，簡(jiǎn)稱(chēng)HA)是流感病毒最主要的表面抗原，它能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體以中和病毒。流感病毒HA由RNA節(jié)段4編碼，以A/PR/8/34(H1N1)毒株為例，其RNA節(jié)段4由1765個(gè)核苷酸組成。開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼566個(gè)氨基酸。HA是典型的I類(lèi)膜蛋白，其一級(jí)結(jié)構(gòu)含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域信號(hào)肽(前導(dǎo)序列)、胞漿域、跨膜域和胞外域。HA以三聚體的形式鑲嵌在病毒包膜上，每個(gè)單體糖蛋白由兩個(gè)經(jīng)二硫鍵連接的蛋白亞單位組成，它們來(lái)自于一條前體鏈(HA0)，經(jīng)蛋白水解酶的切割而形成，分別命名為HA1和HA2。
預(yù)防流感的最好方法就是在流感流行前對(duì)人體進(jìn)行疫苗接種，傳統(tǒng)的疫苗主要有裂解疫苗、亞單位疫苗、全病毒滅活疫苗等。由于HA是流感病毒最主要的表面抗原，流感病毒的流行與HA抗原結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)，因此，在流感病毒疫苗的研究中HA占有重要的地位。以去污劑裂解病毒，使病毒滅活，可以制備成裂解疫苗，疫苗的主要成分是HA。亞單位疫苗可以從裂解的病毒中提取純化，也可以用其它表達(dá)系統(tǒng)直接表達(dá)，如桿狀病毒系統(tǒng)?，F(xiàn)在臨床上使用的流感病毒疫苗是一種三聯(lián)全病毒滅活疫苗，它由H1N1、H3N2和B型病毒三種成分組成，其中HA成分占到了48％。傳統(tǒng)的疫苗能夠有效預(yù)防與其HA分子有著相同或交叉反應(yīng)表位的流感病毒株。但是流感病毒不斷發(fā)生抗原漂移，為了有效預(yù)防流感，這些疫苗的成分不得不經(jīng)常更換。由于傳統(tǒng)疫苗從病毒株分離到疫苗制備完成，需要4-6個(gè)月時(shí)間，在短時(shí)間內(nèi)難以生產(chǎn)出大量的疫苗，因此不能有效抵御突發(fā)性的流感流行，比如由抗原轉(zhuǎn)變?cè)斐傻拇罅餍幸约翱赡艹霈F(xiàn)的新型禽流感病毒在人類(lèi)中的流行。
核酸疫苗，又稱(chēng)DNA疫苗，是近十幾年發(fā)展起來(lái)的一種新型疫苗。DNA疫苗是指利用基因重組技術(shù)直接將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA)與真核表達(dá)載體重組后，直接導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，并通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。但是，流感病毒易突變，仍然無(wú)法克服DNA疫苗交叉保護(hù)能力較差的問(wèn)題。如果找到A/PR/8/34流感病毒HA基因抗流感病毒的關(guān)鍵序列，然后將各亞型流感病毒的截短片段構(gòu)建成多價(jià)DNA疫苗，就能實(shí)現(xiàn)良好的交叉保護(hù)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種預(yù)防流感病毒的截短的血凝素疫苗及其制備方法。該疫苗具有實(shí)用價(jià)值，它能夠有效地誘導(dǎo)宿主機(jī)體產(chǎn)生持久和全面的免疫應(yīng)答，同時(shí)引起細(xì)胞和體液免疫，以達(dá)到預(yù)防和治療流感疾病的目的。該疫苗制備方法簡(jiǎn)單，便于生產(chǎn)、貯存和運(yùn)輸，利于今后推向市場(chǎng)。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下提供預(yù)防流感病毒的截短的HA疫苗，其成分是截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因，該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1701核苷酸，編碼一個(gè)大小為566個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中nt1～nt825片段是最短的保護(hù)序列。
本發(fā)明疫苗由截短后的A/PR/8/34流感病毒HA基因代替全長(zhǎng)A/PR/8/34流感病毒HA基因制得。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下主要效果(1)確定了A/PR/8/34流感病毒HA基因nt1～nt825片段是最短的保護(hù)序列，從而為制備預(yù)防流感病毒的截短的HA疫苗(以下簡(jiǎn)稱(chēng)本疫苗)找到了有效的途徑。
(2)根據(jù)本發(fā)明技術(shù)，我們預(yù)見(jiàn)可將截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因與其它亞型流感病毒株截短的HA基因構(gòu)建成預(yù)防流感病毒多價(jià)DNA疫苗。
(3)根據(jù)本發(fā)明技術(shù)，我們可以預(yù)見(jiàn)將截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因表達(dá)成蛋白，制備預(yù)防流感病毒的蛋白疫苗。
(4)本疫苗接種后，它們所編碼的蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，直接與組織相容性復(fù)合物MHC I類(lèi)或MHC II類(lèi)分子結(jié)合，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持久和全面的免疫應(yīng)答。
(5)本疫苗作為一種重組真核表達(dá)載體，易在工程菌內(nèi)大量擴(kuò)增，提純方法簡(jiǎn)單，真核表達(dá)載體穩(wěn)定性好，便于貯存和運(yùn)輸，無(wú)須冷藏。
(6)可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個(gè)真核表達(dá)載體中，或?qū)⒉煌乖虻亩喾N重組真核表達(dá)載體聯(lián)合應(yīng)用，制備多價(jià)DNA疫苗，而且該疫苗可以產(chǎn)生持久的免疫應(yīng)答，一次接種可獲得長(zhǎng)期免疫力，無(wú)需反復(fù)多次加強(qiáng)免疫，這樣就可以避免多次接種帶來(lái)的應(yīng)激反應(yīng)并大大減少人力、物力和財(cái)力。
(7)使用安全本疫苗接種后，蛋白質(zhì)抗原在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，具有與天然抗原相同的構(gòu)象和抗原性，沒(méi)有減毒、滅活疫苗可能引起的危險(xiǎn)，如病毒力返祖或殘留病毒顆粒引發(fā)疾病，也不會(huì)引起機(jī)體的不良反應(yīng)。
(8)實(shí)用性強(qiáng)本疫苗有預(yù)防流感作用。
基于上述效果，本發(fā)明為開(kāi)發(fā)出預(yù)防流感病毒的截短的血凝素疫苗提供了一條有希望的途徑。


圖1是A/PR/8/34流感病毒HA基因核苷酸全序列。
圖2是A/PR/8/34流感病毒HA基因3′端缺失示意圖。
圖3是A/PR/8/34流感病毒HA基因5′端缺失示意圖。
圖4是真核表達(dá)載體pCAGGSP7結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是一種預(yù)防流感病毒的截短的血凝素疫苗及其制備方法。
所述疫苗包括(1)預(yù)防流感病毒的截短的血凝素核酸疫苗，即預(yù)防流感病毒的截短的HA DNA疫苗。(2)預(yù)防流感病毒的截短的血凝素蛋白疫苗。
下面結(jié)合實(shí)例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
一.預(yù)防流感病毒的截短的血凝素疫苗(一)預(yù)防流感病毒的截短的HA DNA疫苗1.疫苗成分是截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因。
A/PR/8/34流感病毒HA基因核苷酸全序列見(jiàn)圖1全長(zhǎng)1701核苷酸，編碼一個(gè)大小為566個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，該基因中nt1～nt825片段是最短的保護(hù)序列。
2.用A/PR/8/34流感病毒HA基因截短后的序列代替全長(zhǎng)A/PR/8/34流感病毒HA基因，制備預(yù)防流感病毒的截短的HA DNA疫苗。
(二)預(yù)防流感病毒的截短的血凝素蛋白疫苗根據(jù)預(yù)防流感病毒的截短的HA DNA疫苗的技術(shù)，我們可以預(yù)見(jiàn)將截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因表達(dá)成蛋白，以制備預(yù)防流感病毒的蛋白疫苗。
(三)預(yù)防流感病毒多價(jià)DNA疫苗根據(jù)預(yù)防流感病毒的截短的HA DNA疫苗的技術(shù)，我們可以預(yù)見(jiàn)將截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因與其它亞型流感病毒株截短的HA基因構(gòu)建成預(yù)防流感病毒多價(jià)DNA疫苗。
二.截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因1.該基因的關(guān)鍵序列是通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn)的PCR的方法分別從5’端或3’端對(duì)A/PR/8/34流感病毒HA基因(全長(zhǎng)1701bp)進(jìn)行了部分缺失，構(gòu)建了一系列含缺失HA基因的真核表達(dá)載體。
驗(yàn)證方法將這些真核表達(dá)載體免疫小鼠，用致死量A/PR/8/34流感病毒攻擊，并且觀察小鼠的存活率、血清中抗HA抗體的效價(jià)和肺部病毒量。
2.具體制備方法包括以下步驟(1)從10日齡雞胚中增殖得到A/PR/8/34病毒，從中提取RNA，RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到單鏈cDNA。
(2)根據(jù)A/PR/8/34流感病毒HA基因核苷酸全序列，在其兩個(gè)末端設(shè)計(jì)PCR引物(分別見(jiàn)表1、表2)，正向引物含有XhoI酶切位點(diǎn)，反向引物含有SmaI酶切位點(diǎn)，以cDNA為模板對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物用XhoI酶與SmaI酶酶切，酶切片段克隆入真核表達(dá)載體pCAGGSP7(見(jiàn)圖4)中，獲得重組真核表達(dá)載體pCAGGSP7/HA。
在擴(kuò)增5’端缺失片段時(shí)，以起始密碼子ATG為起點(diǎn)，從A/PR/8/34流感病毒HA基因的5′端缺失3～591個(gè)核苷酸，1個(gè)缺失為3個(gè)核苷酸的倍數(shù)。在擴(kuò)增3’端缺失片段時(shí)，以終止密碼子TAG為起點(diǎn)，從A/PR/8/34流感病毒HA基因3’端缺失69～903個(gè)核苷酸，1個(gè)缺失為3個(gè)核苷酸的倍數(shù)。
上述PCR引物分別見(jiàn)表1、表2表1中HA-5′-d-3表示在HA序列5′端缺失3個(gè)核苷酸，真核表達(dá)載體編碼的是全長(zhǎng)HA基因的片段nt4--nt1701，所用F引物如表中所示，R引物是5’aaccccgggtctcagatgcatattctgcactgca-3’，表中其它真核表達(dá)載體以此類(lèi)推。
表2中HA-3′-d-69表示在HA序列3′端缺失69個(gè)核苷酸，真核表達(dá)載體編碼的是全長(zhǎng)HA基因的片段nt1--nt1632，所用R引物如表中所示，F(xiàn)引物是5’aacctcgagaatgaaggcaaacctactggtcc-3’，表中其它真核表達(dá)載體以此類(lèi)推。
(3)對(duì)所得pCAGGSP7/HA進(jìn)行測(cè)序，確定是A/PR/8/34流感病毒HA基因，并獲得其編碼區(qū)的1701個(gè)核苷酸。
(4)用PCR的方法以pCAGGSP7/HA為模板，構(gòu)建一系列真核表達(dá)載體，其中包含了從5’端或者3’端連續(xù)缺失的A/PR/8/34流感病毒HA基因，即得到截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因。
例如A/PR/8/34流感病毒HA基因5′端缺失3～591個(gè)核苷酸(見(jiàn)圖3)；A/PR/8/34流感病毒HA基因從3′端缺失69～903個(gè)核苷酸(見(jiàn)圖2)。圖2和圖3中黑色橢圓點(diǎn)為起始密碼子，黑色方塊為終止密碼子。
(5)用QIAGEN純化試劑盒純化，用紫外分光光度法測(cè)定包含A/PR/8/34流感病毒HA基因或者截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因的真核表達(dá)載體的濃度和純度，DNA的濃度和純度通過(guò)OD260、OD280確定，選取OD260/OD280比值在1.8～2.0的真核表達(dá)載體，測(cè)序驗(yàn)證。經(jīng)測(cè)序確認(rèn)無(wú)誤后免疫小鼠，以鑒定本疫苗效果。
在擴(kuò)增5’端缺失片段時(shí)，在目的片段5’端設(shè)置起始密碼子ATG。擴(kuò)增5’端缺失片段的方法是以起始密碼子ATG為起點(diǎn)，從A/PR/8/34流感病毒HA基因的5′端缺失3～591個(gè)核苷酸共10個(gè)連續(xù)位點(diǎn)，1個(gè)缺失為3個(gè)核苷酸的倍數(shù)。5’端的10個(gè)連續(xù)位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的截短的片段是nt4～nt1701、nt7～nt1701、nt13～nt1701、nt16～nt1701、nt25～nt1701、nt43～nt1701、nt52～nt1701、nt151～nt1701、nt220～nt1701和nt592～nt1701。
在擴(kuò)增3’端缺失片段時(shí)，在目的片段的3’端設(shè)置終止密碼子TAG。擴(kuò)增3’端缺失片段方法是以終止密碼子TAG為起點(diǎn)，從A/PR/8/34流感病毒HA基因3’端缺失69～903個(gè)核苷酸20個(gè)連續(xù)位點(diǎn)，1個(gè)缺失為3個(gè)核苷酸的倍數(shù)。3’端的20個(gè)連續(xù)缺失位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的截短的片段是nt1～nt1632、nt1～nt1590、nt1～nt1560、nt1～nt1470、nt1～nt1029、nt1～nt972、nt1～nt942、nt1～nt921、nt1～nt906、nt1～nt897、nt1～nt888、nt1～nt870、nt1～nt861、nt1～nt846、nt1～nt831、nt1～nt825、nt1～nt819、nt1～nt813、nt1～nt810和nt1～nt798。
3.真核表達(dá)載體pCAGGSP7來(lái)源由Niwa et al(Niwa H et al.Gene 1991，108103-200.)構(gòu)建(見(jiàn)圖4)。其方法是將多克隆位點(diǎn)KpnI、XhoI、ClaI、EcoRI、SmaI、NotI和SacI插入pCAGGS的EcoRI位點(diǎn)得到pCAGGSP7。真核表達(dá)載體pCAGGS含雞的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子成分，SV40的復(fù)制起始部位(Ori)，氨芐青霉素抗性基因，CMV瞬時(shí)增強(qiáng)子，牛生長(zhǎng)激素基因(BGH)多聚A。
三.實(shí)驗(yàn)材料和方法1.免疫和病毒攻擊每15只4～6周齡的雌性BALB/C小鼠為一組，表達(dá)HA基因或者HA基因缺失片段的真核表達(dá)載體以每只每次劑量30μg(溶于30μl TE)免疫小鼠。采用股四頭肌肌肉注射法，并在接種位點(diǎn)兩側(cè)5mm加入正反各3次的電擊(100V電壓，電擊時(shí)間為50ms)。初次免疫后第3周再以相同劑量的真核表達(dá)載體加強(qiáng)免疫一次。以未免疫的小鼠作為陰性對(duì)照組，以免疫全長(zhǎng)HA真核表達(dá)載體的小鼠作為陽(yáng)性對(duì)照組。第二次免疫后第7天，用致死量(40×LD50)的A/PR/8/34(H1N1)病毒懸液通過(guò)滴鼻法攻擊小鼠。這種感染能夠引起病毒在小鼠肺部快速、廣泛的復(fù)制，使未免疫小鼠6～8天內(nèi)死亡。病毒攻擊后3～21天內(nèi)定期觀測(cè)小鼠的體重變化和死亡情況(見(jiàn)表3)。
表3中1.病毒攻擊后第3天采集小鼠心血，用ELISA方法測(cè)定IgG抗體(2n)，以每組小鼠的平均值±SD表示；2.體重變化為攻擊后第七天的體重丟失與攻擊前體重的百分比，以每組小鼠的平均值±SD表示；3.保護(hù)情況以攻擊后第二十一天剩余的實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)與實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)進(jìn)行對(duì)比表示。
“*”表示有顯著差異(p＜0.05)2.樣本采集病毒攻擊后第3天，將每組15只實(shí)驗(yàn)小鼠分為兩部分其中5只處死用來(lái)采集心血測(cè)抗體及取肺測(cè)肺部病毒量。另外10只用來(lái)觀測(cè)小鼠的體重變化和死亡情況，以判斷真核表達(dá)載體的保護(hù)效果。攻擊后用于采血的小鼠用氯仿麻醉，平放在實(shí)驗(yàn)桌上，從劍狀軟骨下方微偏左處以15～20°角插入注射器針頭，緩慢地抽取心血直至血流停止。將收集到的血液置于室溫1小時(shí)左右，使血液凝固并析出血清，然后以5000rpm離心10min，吸出血清，-20℃冰箱保存。收集的血清用來(lái)檢測(cè)真核表達(dá)載體誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG抗體量。采完血的小鼠，從小鼠的劍突至頦部腹向切開(kāi)，取出氣管和肺，注入2ml PBS(含0.1％BSA)漂洗3次，并將漂洗液離心去細(xì)胞碎片用于測(cè)病毒滴度。
3.抗體測(cè)定取小鼠血清樣本作ELISA，檢測(cè)IgG抗體。第一，用10μg/ml的A/PR/8/34(H1N1)流感病毒滅活疫苗包被96孔酶標(biāo)板，37℃溫育2小時(shí)；第二，PBS-T洗液洗三次后加入封閉液(封閉液為含1％BSA的PBS)4℃過(guò)夜；第三，用封閉液稀釋血清后，加入酶標(biāo)板，37℃溫育2小時(shí)；第四，PBS-T洗三次后，加入用生物素標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，37℃溫育1小時(shí)；第五，PBS-T洗三次后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈菌蛋白37℃溫育1小時(shí)；最后，PBS-T洗三次后，加入PNPP顯色。在30分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀(LabsystemsMultiskan Ascent芬蘭產(chǎn))利用雙波長(zhǎng)(414nm-405nm)測(cè)出OD值，最終確定抗體IgG的最高稀釋度，以此來(lái)確定抗體量的高低(見(jiàn)表3)。
4.病毒滴度測(cè)定將氣管和肺洗液作系列10倍稀釋?zhuān)妹總€(gè)稀釋度感染培養(yǎng)于24孔板中的MDCK細(xì)胞，并將感染細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中。37℃培養(yǎng)48小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變。以引起細(xì)胞病變的最低稀釋度計(jì)算出每個(gè)樣本的病毒滴度(以TCID50表示)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組病毒滴度是用每組所有5只小鼠樣本的病毒滴度的平均值±SD來(lái)表示。
5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用Student’s test對(duì)實(shí)驗(yàn)組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)定；P＜0.05定為顯著。小鼠存活率結(jié)果是否有意義用Fisher’s exact test比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組來(lái)確定。
6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果HA基因5′端缺失6個(gè)核苷酸仍然具有保護(hù)效果；缺失12個(gè)核苷酸不具有保護(hù)效果。HA基因從3′端缺失876個(gè)核苷酸仍然具有保護(hù)效果；缺失882個(gè)核苷酸不具有保護(hù)效果。
(1)A/PR/8/34流感病毒HA基因部分缺失真核表達(dá)載體的構(gòu)建用PCR的方法從模板中擴(kuò)增得到HA基因部分缺失片段，實(shí)驗(yàn)條件如上所示，引物見(jiàn)表1、2。使用限制性?xún)?nèi)切酶Xho I和Sma I雙酶切HA基因部分缺失片段，定向插入到同樣用Xho I和Sma I雙酶切過(guò)的PCAGGSP7表達(dá)載體中。所有表達(dá)HA基因截短片段真核表達(dá)載體經(jīng)377DNA測(cè)序儀測(cè)序證實(shí)沒(méi)有發(fā)生點(diǎn)突變和閱讀框改變。全長(zhǎng)HA的序列見(jiàn)圖1。構(gòu)建的HA基因截短片段真核表達(dá)載體如圖2、3所示(只表示出各真核表達(dá)載體所編碼的HA基因部分缺失片段，載體部分略去)。
(2)A/PR/8/34流感病毒HA基因5′部分缺失真核表達(dá)載體的保護(hù)效果真核表達(dá)載體HA-5′-d-3和HA-5′-d-6能夠保護(hù)小鼠抗致死量流感病毒的攻擊，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgG抗體水平以及體重變化與全長(zhǎng)HA組相當(dāng)。真核表達(dá)載體HA-5′-d-12不能保護(hù)小鼠抗致死量流感病毒的攻擊，小鼠血清中也檢測(cè)不到IgG抗體。缺失更多核苷酸的真核表達(dá)載體，如真核表達(dá)載體HA-5′-d-51，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與真核表達(dá)載體HA-5′-d-12的相似。
(3)A/PR/8/34流感病毒HA基因3′部分缺失真核表達(dá)載體的保護(hù)效果從真核表達(dá)載體HA-3′-d-69開(kāi)始，一直到HA-3′-d-876，HA基因3′端缺失的核苷酸數(shù)從69個(gè)連續(xù)增加到876個(gè)，真核表達(dá)載體所編碼的HA部分缺失片段從1632個(gè)核苷酸減少到825個(gè)核苷酸，這十六個(gè)真核表達(dá)載體都能夠保護(hù)小鼠抗致死量流感病毒攻擊，而且與全長(zhǎng)HA真核表達(dá)載體相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠在血清IgG抗體以及體重變化方面幾乎沒(méi)有差別。真核表達(dá)載體HA-3′-d-882到真核表達(dá)載體HA-3′-d-903，HA基因3′端缺失的核苷酸數(shù)從882個(gè)連續(xù)增加到903個(gè)，真核表達(dá)載體所編碼的HA缺失片段從819個(gè)核苷酸減少到798個(gè)核苷酸，這些真核表達(dá)載體都不能保護(hù)小鼠抗致死量流感病毒的攻擊，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgG抗體遠(yuǎn)低于全長(zhǎng)HA實(shí)驗(yàn)組，體重變化與不免疫對(duì)照組相似(見(jiàn)表3、4)。
表3、4中1.病毒攻擊后第3天采集小鼠心血，用ELISA方法測(cè)定IgG抗體(2n)，以每組小鼠的平均值±SD表示；2.體重變化為攻擊后第七天的體重丟失與攻擊前體重的百分比，以每組小鼠的平均值±SD表示；3.保護(hù)情況以攻擊后第二十一天剩余的實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)與實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)進(jìn)行對(duì)比表示。
“*”表示有顯著差異(p＜0.05)(4)真核表達(dá)載體免疫后小鼠肺洗液中的病毒滴度能夠保護(hù)小鼠抗致死量流感病毒攻擊的真核表達(dá)載體，如真核表達(dá)載體HA-5′-d-6，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺洗液的病毒滴度都要明顯低于對(duì)照組，與全長(zhǎng)HA組相當(dāng)；不能保護(hù)小鼠抗致死量流感病毒攻擊的真核表達(dá)載體，如真核表達(dá)載體HA-3′-d-882，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺洗液的病毒滴度與不免疫對(duì)照組相當(dāng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)表51)病毒攻擊后第3天采集小鼠心血，同時(shí)取器官肺，用2mlPBS(0.1％BSA)洗兩次，用MDCK細(xì)胞來(lái)測(cè)肺洗液中病毒的TCID50；2)以每組小鼠的TCID50平均值±SD表示；3)“+”表示能夠提供保護(hù)，“-”表示不能提供保護(hù)。
五.附表表1 A/PR/8/34流感病毒HA基因5′部分缺失片段真核表達(dá)載編碼片段 F引物體編號(hào)HA-5′-d-3 nt4--nt1701 cctctcgagtgatggcaaacctactggtcctgHA-5′-d-6 nt7--nt1701 tcgctcgagaagatgaacctactggtcctgttaHA-5′-d-12 nt13--nt1701 atgctcgagaacatgctggtcctgttatgtgcHA-5′-d-15 nt16--nt1701 aagctcgagctaatggtcctgttatgtgcacHA-5′-d-24 nt25--nt1701 tacctcgagttatgtgtgcacttgcagctgcaHA-5′-d-42 nt43--nt1701 gcactcgaggctatggatgcagaccacaatatgHA-5′-d-51 nt52--nt1701 gctctcgaggcaatgacaatatgtataggctaccHA-5′-d-150nt151--nt1701gttctcgagctcatggacagccacaacggaaaacHA-5′-d-219nt220--nt1701gggctcgagaacatggccggatggctcttgggHA-5′-d-591nt592--nt1701tggctcgagcatatgccgtctaacagtaagg表2 A/PR/8/34流感病毒HA基因3′部分缺失片段真核表達(dá)載編碼片段 R引物體編號(hào)HA-3′-d-69 nt1--nt1632tgccccgggggatcacaaaagcaccagtgaaHA-3′-d-111nt1--nt1590tgacccgggcgctcaaatctgatagatccccaHA-3′-d-141nt1--nt1560ttgcccgggatcacactccatctaccttttccHA-3′-d-231nt1--nt1470cttcccgggcatcaattgtcacacttgtggtaHA-3′-d-672nt1--nt1029tcccccgggacctcaggattgaatggacggaaHA-3′-d-729nt1--nt972 caacccgggacttcagacgtattttgggcacHA-3′-d-759nt1--nt942 ctccccgggtgttcatgggtgtatattctggaHA-3′-d-780nt1--nt921 tatcccggggaatcagagactgctgtttatagcHA-3′-d-795nt1--nt906 agacccgggtttcaagctcccaggggtgtttgaHA-3′-d-804nt1--nt897 gttcccgggtcctcagggtgtttgacacttcHA-3′-d-813nt1--nt888 ccacccgggttcaacacttcgtgttacactcaHA-3′-d-831nt1--nt870 cttcccgggacatcaatgcattgatgcgtttgaHA-3′-d-840nt1--nt861 acacccgggcattcatgcgtttgaggtgatgaHA-3′-d-855nt1--nt846 atgcccgggaggttcagatgccggacccaaaHA-3′-d-870nt1--nt831 atgcccgggcctcagcctctactcagtgcgaaaHA-3′-d-876nt1--nt825 acccccgggctcaactcagtgcgaaagcataHA-3′-d-882nt1--nt819 aagcccgggcttcatgcgaaagcataccttHA-3′-d-888nt1--nt813 actcccgggtcaagcataccttggtgctattaHA-3′-d-891nt1--nt810 ctccccgggaatcaataccttggtgctattaHA-3′-d-903nt1--nt798 catcccggggtcatattagatttccatttgcc
表3血清中IgG抗體、小鼠體重變化和保護(hù)情況5′缺失真核 IgG抗體(2n)1體重變化(％)2保護(hù)情況3表達(dá)載體Control ＜1 25.2±7.70/10HA 14.7±1.5 2.8±3.4*10/10*HA-5′-d-3 14.0±1.0 3.8±2.1*10/10*HA-5′-d-6 15.3±1.2 5.0±2.4*10/10*HA-5′-d-12 ＜1 20.3±5.50/10HA-5′-d-15 ＜1 22.8±7.10/9HA-5′-d-24 ＜1 22.4±4.80/10HA-5′-d-42 ＜1 19.5±6.80/10HA-5′-d-51 ＜1 18.2±7.00/10HA-5′-d-150＜1 24.7±5.50/10HA-5′-d-219＜1 25.6±4.31/9HA-5′-d-591＜1 20.3±3.90/10表4血清中IgG抗體、小鼠體重變化和保護(hù)情況3′缺失真核表IgG抗體(2n)1體重變化(％)2保護(hù)情況3達(dá)載體Control ＜1 25.2±7.70/10HA 14.7±1.5 2.8±3.4*10/10*HA-3′-d-69 15.2±1.8 8.2±4.2*10/10*HA-3′-d-111 14.3±1.9 7.5±2.6*9/10*HA-3′-d-141 13.8±1.5 6.5±3.5*10/10*HA-3′-d-231 14.0±1.0 6.9±4.2*8/10*HA-3′-d-672 12.0±0.8 5.0±3.9*10/10*HA-3′-d-729 14.8±2.2 7.5±3.6*10/10*HA-3′-d-759 12.2±1.5 10.5±5.8*8/10*HA-3′-d-780 14.6±1.3 6.4±4.0*10/10*HA-3′-d-795 15.2±1.9 10.3±7.0*9/9*HA-3′-d-804 13.5±2.2 8.4±6.2*10/10*HA-3′-d-813 14.7±1.6 5.2±5.1*10/10*HA-3′-d-831 13.0±1.0 8.3±7.1*9/9*HA-3′-d-840 12.0±1.0 9.5±6.6*10/10*HA-3′-d-855 13.3±2.5 6.5±4.4*10/10*HA-3′-d-870 13.7±2.6 9.0±6.1*10/10*HA-3′-d-876 14.0±1.6 10.4±4.3*10/10*HA-3′-d-882 5.8±1.826.4±4.70/10HA-3′-d-888 7.1±2.525.2±6.71/10HA-3′-d-891 7.5±1.824.8±4.20/10HA-3′-d-903 8.3±2.823.1±7.90/9
表5真核表達(dá)載體免疫后小鼠肺洗液中的病毒滴度5′和3′缺失真核表肺部病毒滴度保護(hù)情況3達(dá)載體(TCID50)1，2Control 5.2±0.7 -HA3.3±0.3 +HA-5′-d-33.0±0.2 +HA-5′-d-63.5±0.2 +HA-5′-d-12 5.6±0.3 -HA-5′-d-51 4.9±0.5 -HA-3′-d-111 3.0±0.4 +HA-3′-d-672 3.3±0.2 +HA-3′-d-813 3.5±0.4 +HA-3′-d-876 3.2±0.5 +HA-3′-d-882 4.9±0.6 -HA-3′-d-903 5.4±0.8 -
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防流感病毒血凝素疫苗，其特征是預(yù)防流感病毒的截短的血凝素疫苗即預(yù)防流感病毒的截短的HA疫苗，該疫苗成分是截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因，A/PR/8/34流感病毒HA基因核苷酸全序列如下ATGAAGGCAAACCTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTGCAGATGCAGACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTAGAGAAGAATGTGACAGTGACACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGAAAACTATGTAGATTAAAAGGAATAACCCCACTACAATTGGGGAATTGTAACATCGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCCAGAATGCGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATTGTAGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGATTTCATCGACTATGAAGAACTGAGGGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAAGAAAGCTCATGGCCCAACCACAACACAAACAAAGGAGTAACGGCAGCATGCTCCCATGCGGGGAAAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAGCTGAAAAATTCTTATGTGAACAAGAAAGGGAAGGAAGTCCTTGTACTGTGGGGTATTCATCACCCGTCTAACAGTAAGGAACAACAGAATCTCTATCAGAATGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGACTTCAAATTATAACAGGAGATTTACCCCGGAAATAGCAGAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAAGCTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAAAACCCGGAGACACAATAATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCACCAAGGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGCTTTGGGTCCGGCATCATCACCTCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACACCCCTGGGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTTCCAGAATATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCCAAAATACGTCAGGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATTCCGTCCATTCAATCCAGAGGTCTATTTGGAGCCATTGCCGGTTTTATTGAAGGTGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAACTCTGTTATCGAGAAAATGAACACTCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAAATTAGAAAAAAGGATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAGTTCTACTGGAAAATGAAAGGACTCCGGATTTCCATGACTCAAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGATGTTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAAATGGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAGTCAAAGTTGAACAGGGAAAAGGTAGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGATCTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGTTCTAATGGATCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGA上述A/PR/8/34流感病毒HA基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1701核苷酸，編碼一個(gè)大小為566個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，該基因中nt1～nt825片段是最短的保護(hù)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防流感病毒血凝素疫苗，其特征在于預(yù)防流感病毒的截短的血凝素疫苗是預(yù)防流感病毒的截短的血凝素核酸疫苗，即預(yù)防流感病毒的截短的HA DNA疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防流感病毒血凝素疫苗，其特征在于預(yù)防流感病毒的截短的血凝素疫苗是預(yù)防流感病毒的截短的血凝素蛋白疫苗。
4.一種預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因代替全長(zhǎng)A/PR/8/34流感病毒HA基因，制備預(yù)防流感病毒的截短的HA疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于所述的截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因，由以下步驟獲得(1)從10日齡雞胚中增殖得到A/PR/8/34病毒，從中提取RNA，RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到單鏈cDNA，(2)根據(jù)A/PR/8/34流感病毒HA基因核苷酸全序列，在其兩個(gè)末端設(shè)計(jì)PCR引物，正向引物含有XhoI酶切位點(diǎn)，反向引物含有SmaI酶切位點(diǎn)，以cDNA為模板對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物用XhoI酶與SmaI酶酶切，酶切片段克隆入真核表達(dá)載體pCAGGSP7中，獲得重組真核表達(dá)載體pCAGGSP7/HA，(3)對(duì)pCAGGSP7/HA進(jìn)行測(cè)序，確定是長(zhǎng)度為1701個(gè)核苷酸的A/PR/8/34流感病毒HA基因，(4)用PCR的方法以pCAGGSP7/HA為模板，構(gòu)建一系列真核表達(dá)載體，其中包含了從5’端或者3’端連續(xù)缺失的A/PR/8/34流感病毒HA基因，即得到截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因，(5)用QIAGEN純化試劑盒純化，用紫外分光光度法測(cè)定包含A/PR/8/34流感病毒HA基因或者截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因的真核表達(dá)載體的濃度和純度，DNA的濃度和純度通過(guò)OD260、OD280確定，選取OD260/OD280比值在1.8～2.0的真核表達(dá)載體，測(cè)序驗(yàn)證。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于在擴(kuò)增5’端缺失片段時(shí)，在目的片段5’端設(shè)置起始密碼子ATG；在擴(kuò)增3’端缺失片段時(shí)，在目的片段的3’端設(shè)置終止密碼子TAG。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于在擴(kuò)增5’端缺失片段時(shí)，以起始密碼子ATG為起點(diǎn)，從A/PR/8/34流感病毒HA基因的5′端缺失3～591個(gè)核苷酸共10個(gè)連續(xù)位點(diǎn)，1個(gè)缺失為3個(gè)核苷酸的倍數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于5’端的10個(gè)連續(xù)位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的截短的片段是nt4～nt1701、nt7～nt1701、nt13～nt1701、nt16～nt1701、nt25～nt1701、nt43～nt1701、nt52～nt1701、nt151～nt1701、nt220～nt1701和nt592～nt1701。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于在擴(kuò)增3’端缺失片段時(shí)，以終止密碼子TAG為起點(diǎn)，從A/PR/8/34流感病毒HA基因3’端缺失69～903個(gè)核苷酸共20個(gè)連續(xù)位點(diǎn)，1個(gè)缺失為3個(gè)核苷酸的倍數(shù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的預(yù)防流感病毒的疫苗，其特征在于3’端的20個(gè)連續(xù)缺失位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的截短的片段是nt1～nt1632、nt1～nt1590、nt1～nt1560、nt1～nt1470、nt1～nt1029、nt1～nt972、nt1～nt942、nt1～nt921、nt1～nt906、nt1～nt897、nt1～nt888、nt1～nt870、nt1～nt861、nt1～nt846、nt1～nt831、nt1～nt825、nt1～nt819、nt1～nt813、nt1～nt810和nt1～nt798。
全文摘要
本發(fā)明是預(yù)防流感病毒的截短的血凝素疫苗及其制備方法。本疫苗成分是截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因。A/PR/8/34流感病毒HA基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1701核苷酸，編碼一個(gè)大小為566個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，該基因中nt1～nt825片段是最短的保護(hù)序列。用截短的A/PR/8/34流感病毒HA基因代替全長(zhǎng)A/PR/8/34流感病毒HA基因而制得本疫苗。本發(fā)明確定了A/PR/8/34流感病毒NA基因核苷酸全序列，并且確定了其中的最短的保護(hù)序列。本發(fā)明提供的疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持久和全面的免疫應(yīng)答，具有實(shí)用性強(qiáng)、使用安全等優(yōu)點(diǎn)，從而為開(kāi)發(fā)出預(yù)防流感病毒的截短的血凝素疫苗提供了一條有希望的途徑。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1631439SQ20041006120
公開(kāi)日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2004年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月29日
發(fā)明者陳則 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所