專利名稱：轉(zhuǎn)錄活性試驗(yàn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于測定可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物的生物活性的新方法，和基于此的一種用于測定化合物的相對生物活性的方法，以及一種鑒定可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物的方法。本發(fā)明的方法對于鑒定那些可以用于疾病治療的化合物尤為有用，其中所述疾病取決于患病的細(xì)胞和組織中的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
背景技術(shù)：
可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或病毒防御等細(xì)胞功能的化合物的生物活性的通常測定方法為在體外或在基于細(xì)胞的結(jié)合試驗(yàn)中測定這些因子和/或化合物與其天然或重組受體的結(jié)合活性的增減。這些用于評價(jià)化合物生物活性的方法的缺點(diǎn)在于結(jié)合親和力并不必然地與化合物的生物活性相關(guān)。
對于化合物生物活性更為直接且由此更為可靠的測定可以通過一些廣為人知的試驗(yàn)例如細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活、或細(xì)胞遷移試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)。然而，這些試驗(yàn)比較繁瑣，尤其對于較大規(guī)模的篩選而言。在很多情況下，調(diào)節(jié)這些細(xì)胞活性的化合物也調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。因而，這樣的化合物的生物活性可以通過測定基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)來確定，這通常通過報(bào)告基因試驗(yàn)來進(jìn)行，此試驗(yàn)需要制備可表達(dá)適宜報(bào)告基因構(gòu)建體的重組細(xì)胞?；蛘?，這樣的化合物的生物活性可以由測定(例如通過Northern雜交分析或定量PCR)適當(dāng)?shù)陌谢虻谋磉_(dá)來確定，但此法的效率不高。
本發(fā)明的問題是要提供一種可靠、易行的方法來測定轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)劑的生物活性，該法沒有結(jié)合試驗(yàn)的缺點(diǎn)，而又比通常采用的活性試驗(yàn)更高效。

發(fā)明內(nèi)容
出人意料的，發(fā)現(xiàn)化合物的生物活性能夠通過一種基于測定在這種化合物誘導(dǎo)下的總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答(general transcriptional gene response)的新方法而更為可靠地確定，此法包括對轉(zhuǎn)錄活性受所述化合物調(diào)節(jié)的基因的信號強(qiáng)度進(jìn)行定量。
本發(fā)明提供一種用于測定可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物的生物活性的新方法，包括以下步驟a)使化合物與宿主接觸；b)測定宿主的總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答；c)對所述化合物誘導(dǎo)的總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答進(jìn)行定量。優(yōu)選的，上述化合物的生物活性由步驟c)中定量的信號強(qiáng)度的歸一化平均差(normalized average difference)之和給出。本發(fā)明的一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答通過DNA陣列技術(shù)測定。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，陣列技術(shù)是寡核苷酸陣列技術(shù)。優(yōu)選地，DNA或寡核苷酸陣列是高密度的DNA或寡核苷酸陣列。這些陣列以及用這些陣列分析DNA或RNA的方法在已有的文獻(xiàn)例如EP0834575，EP0834576，WO96/31622，US5837832或WO98/30883中有所描述。WO97/10365提供了用高密度寡核苷酸陣列對大量基因的表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測的方法。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中寡核苷酸陣列是基因芯片(GeneChip)陣列。
這里用到的“總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答”一詞是指化合物的生物活性，由該化合物在有反應(yīng)的宿主中所調(diào)節(jié)的基因的信號強(qiáng)度的歸一化平均差之和來表示?？傮w轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答的確定是通過將來自處理過的宿主的標(biāo)記cDNA與DNA或更優(yōu)選地寡核苷酸陣列雜交而進(jìn)行的。然后測量陣列的原始數(shù)據(jù)，例如，用共聚焦激光掃描儀(Hewlett Packard，美國)進(jìn)行(此例子并不是為了對本發(fā)明加以限制)，并用通常已知的方法對象素水平加以分析。各個(gè)基因的表達(dá)水平都相對于與錯(cuò)配的寡核苷酸的雜交計(jì)算為歸一化平均差強(qiáng)度，用任意單位(AD)表示。用四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)的基因(1)處理過的細(xì)胞的強(qiáng)度值至少比未處理細(xì)胞的強(qiáng)度值高兩倍。(2)處理過的細(xì)胞的強(qiáng)度值應(yīng)大于或等于至少50個(gè)任意單元(AD)。(3)未經(jīng)處理的細(xì)胞的強(qiáng)度值應(yīng)小于50AD。(4)標(biāo)準(zhǔn)差必須顯著低于平均差的絕對變化，且基因的計(jì)算的置信水平設(shè)定在大于97％(p值＜0.03)。然后，受化合物誘導(dǎo)的宿主的總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答通過信號強(qiáng)度的歸一化平均差之和(任意單位之和，∑AD)來定量。
下文中描述的非限制性實(shí)施證明用這種新方法獲得的結(jié)果與生物活性之間的相關(guān)性比結(jié)合試驗(yàn)更為可靠，此外此方法還具有高效的優(yōu)點(diǎn)。這些例子還表明，用本發(fā)明的方法測定總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答比測定單個(gè)基因或選定的少數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平更為可靠。
本發(fā)明方法中所用的宿主可以是所有非人類生物體，包括但并不僅限于轉(zhuǎn)基因或基因敲除動物；來自任何物種的特定種類的組織，其中包括但并不僅限于肝臟、心臟、腎臟或原代細(xì)胞分離物，例如血細(xì)胞或從組織分離到的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。本發(fā)明中用于測定化合物的生物活性的宿主必須對目的化合物有反應(yīng)。此處所用“有反應(yīng)”一詞指宿主在響應(yīng)化合物時(shí)能夠表現(xiàn)出增強(qiáng)或降低的基因轉(zhuǎn)錄水平。作為一個(gè)非限制的例子，黑色素瘤細(xì)胞系ME15(WO02/18633中的CNCM I-2546)可被用于通過本發(fā)明的方法檢測PEG-IFN或PEG-IFN同種型的生物活性。
相對于通常所用的活性分析試驗(yàn)或測定基因轉(zhuǎn)錄的方法例如報(bào)告基因試驗(yàn)或Northern雜交，本發(fā)明的主要優(yōu)勢在于本方法無需制備任何經(jīng)報(bào)告基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，它還可以對大量受到轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)的基因進(jìn)行方便且有效的分析，因此使得活性分析更高效和可信。另外，如圖4所示，結(jié)合活性并不總是與生物活性相關(guān)聯(lián)，基于測定總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答而確定的化合物的轉(zhuǎn)錄活性卻總是與生物活性相關(guān)。因此，本發(fā)明的方法對于化合物生物活性的測定比結(jié)合試驗(yàn)更準(zhǔn)確。
在一個(gè)實(shí)施方案中，前面所述方法中的化合物是修飾的化合物，更優(yōu)選為修飾的蛋白，甚至更優(yōu)選是聚乙二醇化蛋白(pegylated protein)，或最優(yōu)選是聚乙二醇化蛋白的特定的分離的同種型。優(yōu)選地，該聚乙二醇化蛋白是促紅細(xì)胞生成素(EPO)或干擾素(IFN)。
這里所用到的“PEG-IFN”一詞包括從任何天然物質(zhì)(例如白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)或其衍生物(如細(xì)胞系)來源的IFN-α，或通過DNA重組技術(shù)得到的IFN-α。對IFN-α特別是在大腸桿菌(E.coli)中的克隆以及直接表達(dá)的細(xì)節(jié)在許多文獻(xiàn)中已有描述。重組IFN-α的制備是公知的，例如，可參見Goeddel等人(1980)Nature284，316-320和(1981)，Nature290，20-26，以及歐洲專利號32134，43980和211148。IFNα有許多種類，例如IFNαI，IFNα2；還有它們的亞類，包括但并不僅限于IFNα2A，IFNα2B，IFNα2C和IFNαII(又名IFNαII或ω-IFN)。“IFNα”一詞還包括從Amgen可購得的共有IFNα(consensus IFNα)或天然的和/或重組的IFNα的混合物。優(yōu)選地使用IFNα2A。IFNα2A的制備在歐洲專利號43980和211148中有記載。
IFN-α可以與取代或未取代的聚(亞烷基)二醇例如聚乙二醇等聚合物綴合，形成PEG-IFN-α綴合物。綴合可以通過多種本領(lǐng)域公知的連接體來實(shí)現(xiàn)，特別是例如在歐洲專利申請公開號0510356，0593868和0809996中公開的連接體。
聚合物，優(yōu)選聚乙二醇的分子量可以在300至70,000道爾頓的范圍；并且可以是一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選一到三個(gè)聚合物與IFN-α相綴合。優(yōu)選的PEG-IFN-α綴合物具有下式 其中R和R’是甲基，X是NH，n和n’分別為或同時(shí)為420或520。
在上文中描述的方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，被轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的基因是從Seq ID No.1至29的一組基因中選出的一個(gè)或多個(gè)基因，這些基因也在表3中列出。
本發(fā)明的方法適用于分析在任何類型宿主中調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的任何化合物。對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)包括上調(diào)或下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄。
上述的方法可以作為測定修飾后化合物的相對生物活性的方法的基礎(chǔ)，相對生物活性測定包括用上述方法對修飾后的化合物以及對應(yīng)的未修飾化合物的生物活性進(jìn)行測定，其中，修飾化合物的相對轉(zhuǎn)錄活性通過計(jì)算修飾化合物與未修飾的化合物的生物活性之比得出。優(yōu)選的，修飾化合物是經(jīng)化學(xué)或酶學(xué)方法修飾的化合物。更優(yōu)選的，修飾化合物是聚乙二醇化蛋白。因此，本方法提供了一種可以用于比較修飾化合物與其對應(yīng)的未修飾化合物的生物活性的簡單試驗(yàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明可以從化合物的同種型的混合物中，最優(yōu)選從聚乙二醇化蛋白質(zhì)中分離出生物活性最高的同種型。
生物活性可以通過本發(fā)明的方法測定的化合物包括所有能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物。它們可以是蛋白質(zhì)、多肽、核酸、聚合物或小分子。許多蛋白質(zhì)、多肽、核酸、聚合物或小分子可以直接地作為轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，或者間接地通過誘導(dǎo)最終能上調(diào)或下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄的信號級聯(lián)或者通過干擾別的能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。下列能夠用本發(fā)明的方法測定其生物活性的化合物只是能用上本發(fā)明方法的各類化合物，包括蛋白質(zhì)和多肽的非限定性例子。
在這些非限制的例子中，有可以誘導(dǎo)作為轉(zhuǎn)錄因子的核激素受體的激素例如視黃酸(A.Rowe視黃酸X受體，Int.J.Biochem.Cell Biol.，29(1997)，275-278；CK.Glass通過甲狀腺激素和視黃酸受體調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一些新手段，J.Endorinol，150(1996)，349-357)。本發(fā)明的方法可以用于測定這些激素和它們的核激素受體的生物活性，此方法還可以用于鑒定能夠干擾這些核激素受體的轉(zhuǎn)錄活性的化合物。因此，本發(fā)明可以用于例如鑒定和分析核激素受體如RXR或LXR的抑制物。
除了能夠激活核激素受體的激素之外，本發(fā)明的方法還可以用于測定其它能激活信號級聯(lián)從而引起基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的激素的生物活性。這些激素包括，但不限于，已知可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的激素如促紅細(xì)胞生成素(Epo)(Z.Z.Chong等人造血因子促紅細(xì)胞生成素通過新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)，J.Cereb.Blood Flow Metab.，22(2002)，503-514；D.M.Wojchowski和T.C.He促紅細(xì)胞生成素受體系統(tǒng)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Stem.Cells，11(1993)，381-392；J.L.Spivak促紅細(xì)胞生成素的作用機(jī)制，Int.J.Cell Cloning，4(1986)，139-166；以及L.Mulcahy促紅細(xì)胞生成素的受體Semin.Oncol.28(2001)，19-23)。
已知細(xì)胞因子和生長因子可以誘導(dǎo)能導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的信號級聯(lián)。因此，作為一個(gè)非限制的例子，本發(fā)明的方法也可以用于鑒定細(xì)胞因子和生長因子的激動劑或拮抗劑，并測定其生物活性。這些細(xì)胞因子和生長因子包括，但不僅限于干擾素、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(T.Hanada和A.Yoshimura細(xì)胞因子信號通路的調(diào)節(jié)及炎癥，CytokineGrowth Factor Rev.，13(2002)，413-421；和Y. Sato等人兩類血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)受體Flt-1和KDR在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的性質(zhì)，Ann.N Y.Acad.Sci.，902(2000)，201-207)。
除此以外，本發(fā)明的方法可以用于測定修飾或突變的蛋白或多肽的生物活性。修飾可以通過化學(xué)方法或酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。此應(yīng)用的一個(gè)非限制的例子是測定不同同種型的聚乙二醇化干擾素的生物活性，結(jié)果示于本申請的附圖中。因此本發(fā)明可用于測定修飾化合物的相對生物活性，包括用上述方法測定修飾的化合物和相應(yīng)的未修飾化合物的生物活性，其中修飾蛋白的相對轉(zhuǎn)錄活性通過計(jì)算修飾化合物與未修飾化合物的生物活性之比來得到。優(yōu)選的修飾化合物是經(jīng)化學(xué)方法或酶促反應(yīng)修飾的化合物。最為優(yōu)選的修飾化合物是聚乙二醇化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的方法還可以用于鑒定和表征酶的調(diào)節(jié)劑，其中，作為下游事件，此酶能夠引起基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。這種酶有，例如(但不限于此)磷酸二酯酶(PDE)，優(yōu)選PDE4，最優(yōu)選為PDE4D同工酶。優(yōu)選PDE4D同工酶從PDE4D1，PDE4D2，PDE4D3，PDE4D4，PDE4D5，PDE4D6，PDE4D7和PDE4D8組成的組中挑出。PDE可以降解能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的第二信使——環(huán)AMP(G.S.McKnight環(huán)AMP第二信使系統(tǒng)，Curr.Opin.CellBiol.，3(1991)213-7)，并且，已發(fā)現(xiàn)PDE的強(qiáng)抑制劑可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄(B.Wagner等人7-芐基氨基-6-氯-2-哌嗪并-4-吡咯烷蝶啶，cAMP-特異性磷酸二酯酶的強(qiáng)抑制劑，增強(qiáng)人的腫瘤細(xì)胞中核蛋白與CRE共有序列的結(jié)合，Biochemcial Pharmacology，63(2002)659-668；Y.Nishio等人Cilostazol，一種cAMP磷酸二酯酶抑制劑，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中減弱腫瘤壞死因子α引起的單核細(xì)胞趨化蛋白-1的產(chǎn)生，Hormone & MetabolicResearch，29(1997)491-495)。因此，本發(fā)明的方法可以用于篩選此類酶的調(diào)節(jié)劑。
在可被鑒定和分析的化合物中還包括功能抗體。功能抗體是指能夠抑制或刺激其所結(jié)合的蛋白質(zhì)的功能的一類抗體。已開發(fā)出抗多種靶蛋白的此類抗體，有一些抗體還具有治療價(jià)值。這其中，例如(但不限于)有抗-Her2/ErbB2抗體，又名赫賽汀(herceptin)抗體。此抗體正被成功的用于治療乳腺癌。它們通過抑制人表皮生長因子受體Her2/ErbB2(該受體在包括乳腺癌的多種癌癥中起關(guān)鍵作用)的活化來發(fā)揮作用。如同其它許多生長因子受體一樣，當(dāng)配體與Her2結(jié)合時(shí)，Her2能介導(dǎo)包括基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)在內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。已證明赫賽汀(herceptin)可以在表達(dá)Her2/ErbB2的細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄(A.H.Talukder等人抗人表皮生長因子受體2抗體赫賽汀(herceptin)抑制自分泌活動因子(AMF)表達(dá)，并增強(qiáng)AMF抑制劑的抗腫瘤效果，Clin.Cancer Res.8(2002)，3285-3289；以及R.Mandler等人合成策略中的修飾提高格爾德霉素-赫賽汀(herceptin)免疫綴合物的產(chǎn)率和效力，Bioconjugate Chemistry，13(2002)，786-791)。目前，存在8種不同的赫賽汀(herceptin)抗體，并且還可能生產(chǎn)出更多的種類。通常地，就功能性抗體而言，本發(fā)明的方法可以用于確定哪種抗體具有最高的生物活性且最適合于治療用途。因此，本發(fā)明的方法同樣適用于測定抗體的生物活性，例如用于鑒定抑制性或激活性抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是有治療用途的抗體。更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是赫賽汀(herceptin)抗體。
對于鑒定和分析通過抑制或激活另一化合物(例如激素、細(xì)胞因子、生長因子、酶等)的生物活性而間接起作用的化合物，本發(fā)明提供了一種可以鑒定間接調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物的方法，該法包括用上文所述方法測定已知可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的第一化合物在有或沒有第二化合物存在的情況下的生物活性，若第一化合物在存在所述第二化合物時(shí)測得的生物活性明顯不同于第一化合物在不存在第二化合物時(shí)測得的活性，則鑒定出可間接調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物。
本發(fā)明提供經(jīng)上述方法鑒定到的可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物。同時(shí)也提供上述方法在鑒定可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物中的用途。本發(fā)明還提供包含用于實(shí)施上述方法的成分的試劑盒。優(yōu)選的，所述成分包括DNA陣列，更為優(yōu)選的是寡核苷酸陣列。
進(jìn)一步的，提供藥物組合物，其包含經(jīng)上述方法鑒定的化合物和可藥用載體(carrier)。任何常規(guī)的載體材料均可以使用。載體材料可以是適于腸的、經(jīng)皮的或胃腸外施用的有機(jī)物或無機(jī)物。適宜的載體包括水、明膠、阿拉伯膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石、植物油、聚(亞烷基)二醇、凡士林等等。此外，藥物制劑可以包含其它藥學(xué)活性劑。額外的添加劑例如調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖液等可以按照藥物化合物的公認(rèn)慣例被添加進(jìn)去。
另外，本發(fā)明提供一種用于制備藥物組合物的方法，此法包括如下步驟用本發(fā)明的方法鑒定化合物，對鑒定到的化合物進(jìn)行修飾，然后與可藥用載體或稀釋劑一起配制所得化合物。
本發(fā)明還提供將按照上述方法鑒定到的化合物或該化合物的可藥用鹽用于制備治療疾病，特別是病毒性疾病或癌癥的藥物。
這里所用“可藥用”一詞是指在合理的醫(yī)學(xué)判定范圍內(nèi)，化合物、材料、組合物和/或劑型適用于與人和動物的組織接觸而不會引起過度的毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或別的問題或并發(fā)癥，并相稱地具有合理的藥效/風(fēng)險(xiǎn)比。
這里所提到的“可藥用鹽”指鑒定到的活性劑的衍生物，其中將親本活性劑修飾成為其酸或堿式鹽?？伤幱名}包括但不僅限于如堿性殘基如胺的無機(jī)酸或有機(jī)酸鹽；酸性殘基如羧酸的堿金屬鹽或有機(jī)鹽；等等?？伤幱名}包括親本化合物的常規(guī)無毒性鹽或季銨鹽，例如由無毒性的無機(jī)酸或有機(jī)酸形成的鹽。例如，這樣的常規(guī)無毒性鹽包括從無機(jī)酸衍生的鹽，無機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有機(jī)酸制備的鹽，有機(jī)酸有例如醋酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、棕櫚酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、安息香酸、水楊酸、磺胺酸、2-乙酰氧基安息香酸、反丁烯二酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙磺酸等。
本申請還要求保護(hù)上面提到的，尤其是參照上面例子所提到的方法、化合物、試劑盒及用途。
上面已經(jīng)對本發(fā)明做了一般性的描述，而通過特定的實(shí)施例，結(jié)合下面的附圖可以更好地理解本發(fā)明，這里包括的實(shí)施例除非特別地指明僅是用于舉例說明目的而并非為了加以限制。
附圖簡述

圖1180μg PEG-IFN的分析性IEC-HPLC。用分析性強(qiáng)陽離子交換柱(TOSOH-BIOSEP，SP-5PW，粒徑10μm，柱直徑7.5mm，柱高7.5cm)分離位置異構(gòu)體。
圖2(A)9種位置異構(gòu)體和PEG-IFN的抗病毒比活性圖中所示為位置異構(gòu)體的抗病毒比活性[U/μg]。該抗病毒活性在受到水泡性口炎病毒感染的MDBK細(xì)胞中測定。
(B)位置異構(gòu)體和PEG-IFN的抗增殖比活性圖中顯示100U/ml各種位置異構(gòu)體和PEG-IFN對ME15細(xì)胞增殖的單位抑制作用[OD490nm/μg]。
結(jié)果是三次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。給出PEG-IFN的抗病毒比活性和抗增殖比活性(虛線所示)用于比較。
圖3
對黑色素瘤細(xì)胞系(ME15)增殖的時(shí)間依賴性抑制。ME15細(xì)胞系在不同濃度(500，125，和15U/ml)的IFN，PEG-IFN和異構(gòu)體的存在下培養(yǎng)5天。每24小時(shí)對細(xì)胞增殖進(jìn)行一次測量。五天后對照細(xì)胞的密度設(shè)為100％作為參照。數(shù)據(jù)來自三次獨(dú)立的重復(fù)培養(yǎng)試驗(yàn)。
圖4動力學(xué)解離常數(shù)與PEG-IFN和具有高(K134)、中(K131，K164)、低(K121)抗病毒比活性的各異構(gòu)體的抗病毒活性的相關(guān)性。
圖5(A)各個(gè)異構(gòu)體的抗病毒比活性、抗增殖比活性和單位轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的相關(guān)性。PEG-IFN的值設(shè)為100％作為參照。虛線所示為PEG-IFN的生物學(xué)活性和轉(zhuǎn)錄活性。對于每個(gè)異構(gòu)體，相對mRNA豐度(AD)之和由所有可誘導(dǎo)基因的總和表示。
(B)對100U/ml IFN，PEG-IFN和各異構(gòu)體引起的不同總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答的AD的分級群聚(hierarchical clustering)。IFN和各聚乙二醇化異構(gòu)體的孵育時(shí)間是48小時(shí)；所用細(xì)胞系是IFN敏感的黑色素瘤細(xì)胞系(ME15)。數(shù)據(jù)分析的條件在文中描述?；虿町惐磉_(dá)譜的數(shù)據(jù)記錄于表3中。
圖6PEG-IFN介導(dǎo)的干擾素應(yīng)答的3D結(jié)構(gòu)模型。按照抗病毒比活性和抗增殖比活性將PEG-IFN位置異構(gòu)體分為4組。人干擾素α-2a的高分辨率結(jié)構(gòu)由NMR光譜測得(Klaus等人由雜核NMR光譜測得的溶液中的人干擾素α-2a的高分辨率三維結(jié)構(gòu)，J.Mol.Biol.274(1997)；661-675)。干擾素α-2a的聚乙醇化位點(diǎn)以紅色顯示。
實(shí)施例
IFN的抗病毒和抗增殖作用干擾素α-2a(IFN)在介導(dǎo)抗病毒和抗增殖應(yīng)答以及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中起著重要的作用(G.R.Stark細(xì)胞如何應(yīng)答干擾素，Annu.Rev.Biochem.67(1998)，227-264)。IFN的這些生物活性使其作為病原抑制劑而具有重要作用，并可被用于治療病毒感染和某些癌癥(S.Zeuzem等人慢性丙型肝炎患者中聚乙二醇化干擾素α-2a，New England Journal of Medicine 343(2000)，1666-1172)。自1986年以來，重組的人IFN(ROFERON-A)已經(jīng)成為治療患病毒性疾病和腫瘤的病人的一種重要治療劑(S.Zeuzem等人聚乙二醇化干擾素α-2a(40kDa)單一用藥一種治療慢性丙型肝炎的新藥劑，Expert Opinion on Investigational Drugs 10(2001)，2201-2213)。
IFN在臨床治療中的成功應(yīng)用部份地受到其在血清中的短半衰期(4-6小時(shí))的限制。IFN在靜脈或皮下給藥后的3-8小時(shí)達(dá)到峰濃度，每次給藥后血清中的濃度會發(fā)生大幅度的波動。24小時(shí)后，體內(nèi)留有的外源IFN的量微乎其微，因而一周三次的治療方案不可能保持抗病毒活性所需的濃度(J.M.Harris等人聚乙二醇化一種用于改變藥物動力學(xué)的新方法，Clin.Pharmacokinet.40(2001)，539-551；P.Bailon等人強(qiáng)效持久形式的干擾素的合理設(shè)計(jì)一種用于治療丙型肝炎的40kDa支鏈聚乙二醇綴合的干擾素2a，Bioconjugate Chem.12(2001)，195-202)。
IFN的施用頻率視疾病而定。例如，標(biāo)準(zhǔn)IFN治療性使用由3百萬國際單位的IFN每周皮下給藥三次并最多施用48周組成(J.M.Harris等人聚乙二醇化一種用于改變藥物動力學(xué)的新方法，Clin.Pharmacokinet.40(2001)，539-551)，而有的腫瘤適應(yīng)癥則需要每日給藥(P.Bailon等人強(qiáng)效持久形式的干擾素的合理設(shè)計(jì)一種用于治療丙型肝炎的40kDa支鏈聚乙二醇綴合的干擾素2a，Bioconjugate Chem.12(2001)，195-202)。為了提高IFN的藥物動力學(xué)和藥效學(xué)特性，將之與聚乙二醇(PEG)綴合。
幾年以來，就PEG的大小和PEG的種類對體內(nèi)和體外的生物活性的影響進(jìn)行了研究。研究的結(jié)果證明PEG的特性與生物活性有著重要的關(guān)聯(lián)。例如，對于掩蓋和保護(hù)IFN免于蛋白水解而言，支鏈的PEG部分比直鏈PEG結(jié)合更為有效，且支鏈的PEG部分還可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的吸收和改善蛋白質(zhì)的分布特性。另一效果是增加PEG部分的分子量可以降低治療分子的清除率，由此造成與病毒的持久接觸(J.M.Harris等人聚乙二醇化一種用于改變藥物動力學(xué)的新方法，Clin.Pharmacokinet.40(2001)，539-551)?；谶@些認(rèn)識以及聚乙二醇化手段的最新進(jìn)展，已開發(fā)出一種持久的支鏈單聚乙二醇化IFN(P.Bailon等人強(qiáng)效持久形式的干擾素的合理設(shè)計(jì)一種用于治療丙型肝炎的40kDa支鏈聚乙二醇綴合的干擾素2a，Bioconjugate Chem.12(2001)，195-202)。
一種通過酰氨鍵連接上40kDa支鏈PEG的干擾素α-2a(PEG-IFN)表現(xiàn)出持久的吸收和減低的腎清除率，其在整個(gè)每周一次給藥的方案中導(dǎo)致強(qiáng)的抗病毒壓力(M.C.Perry和B.Jarvis綜述聚乙二醇化干擾素α-2a(40kD)用于治療慢性丙型肝炎，Drugs 15(2001)，2263-2288；以及M.W.Lamb和E.N.Martin聚乙二醇化干擾素(40kDa)α-2a的基于體重給藥相對固定給藥，The Annals of Pharmacotherapy 36(2002)，933-938)。對此PEG-IFN混合物的表征顯示出有9種在賴氨酸上單聚乙二醇化的位置異構(gòu)體K31，K49，K70，K80，K112，K121，K131，K134和K164。在抗病毒試驗(yàn)中，所有的位置異構(gòu)體均能引起MDBK細(xì)胞對病毒的抵抗。
實(shí)施例1PEG-IFN的制備PEG-IFN由Hoffmann-La Roche公司生產(chǎn)。聚乙二醇化的干擾素α-2a如下制備用活化的支鏈聚乙二醇衍生物(分子量40000Da)與干擾素分子表面的賴氨酸ε-氨基基團(tuán)綴合(Bailon，P.等人強(qiáng)效持久形式的干擾素的合理設(shè)計(jì)一種用于治療丙型肝炎的40kDa支鏈聚乙二醇綴合的干擾素2a，Bioconjugate Chem.12(2001)，195-202；EP809996)。按照下文所述分離和分析PEG-IFN的異構(gòu)體。其它所有試劑和化學(xué)品均為能獲得的最高純度。
PEG-IFN的組成是單聚乙二醇化的IFN分子的混合物。每一個(gè)分子中僅一個(gè)賴氨酸通過結(jié)合PEG部分而被化學(xué)修飾，從而形成幾種物質(zhì)的混合物。因?yàn)榇嬖?1個(gè)賴氨酸和一個(gè)游離的N末端氨基基團(tuán)，預(yù)期有12種單聚乙二醇化的分子，但僅能發(fā)現(xiàn)9種賴氨酸修飾的分子(K31，K49，K70，K83，K112，K121，K131，K134和K164)。
實(shí)施例2純化和表征PEG-IFN位置異構(gòu)體我們開發(fā)了一種制備性兩步層析方法用于有效的分離這些種類的異構(gòu)體。制備的位置異構(gòu)體的純度可以用分析性離子交換方法檢驗(yàn)，例子參見圖1中的洗脫曲線。分離是基于這些異構(gòu)體的局部電荷差異進(jìn)行的，而這種差異是由于蛋白質(zhì)部份上聚乙二醇化位置的不同而造成的。
層析圖中基線吸收朝向末尾的下降意味著沒有別的種類的單聚乙二醇化IFN在更高的滯留時(shí)間被洗脫下來。通過兩步分離純化得到9種位置異構(gòu)體，之后的性質(zhì)分析顯示聚乙二醇化位點(diǎn)均在賴氨酸上K31，K49，K70，K83，K112，K121，K131，K134和K164。
實(shí)施例3位置異構(gòu)體的分離使用兩步分離純化的方案制備PEG-干擾素α2a單聚乙二醇化同種型。
a)第一步是在一個(gè)制備性低壓液相色譜柱上進(jìn)行位置異構(gòu)體的分離，柱基質(zhì)是弱陽離子交換基質(zhì)(TOSOH-BIOSEP，Toyopearl CM-650S，樹脂批號82A，其離子交換容量為123mEq/ml，柱直徑為16mm，柱長120cm)。以0.7mL/min流速使用具有遞增醋酸鈉濃度的線性pH梯度(25mM，pH4.0至75mM，pH7.8)。檢測波長為280nm。通過這個(gè)層析步驟，能夠得到1、2、5、6類型的異構(gòu)體以及3，4，4a，7和8類型異構(gòu)體的混合物，參見表1。
b)這些級分進(jìn)一步地用第二個(gè)制備步驟加以分離和純化。使用的制備性柱子的基質(zhì)和上文提及的分析性強(qiáng)陽離子交換柱的基質(zhì)相同，只是增加了柱的大小(30mm內(nèi)徑，70mm長)，另外，使用更高的流速和延長的運(yùn)行時(shí)間。就此分析方法，該柱先用3.4mM的醋酸鈉，10％乙醇和1％二甘醇，pH值調(diào)節(jié)為4.4的溶液(緩沖液A)預(yù)平衡。將PEG-IFN樣品上樣后，柱子用緩沖液A洗，之后用遞增線性梯度至10mM磷酸氫二鉀、10％乙醇和1％二甘醇，pH值6.6(緩沖液B)的溶液洗。流速為1.0mL/min，檢測波長為218nm。
基于PEG-IFNα2a的蛋白質(zhì)部分在280nm處的光吸收，用光譜法測定PEG-IFNα2a異構(gòu)體的蛋白濃度。
180μg的PEG-IFNα2a的分析性洗脫曲線示于圖1。此法的結(jié)果是分出8個(gè)洗脫峰，其中2個(gè)為基線分離，6個(gè)是部分的分離。基線吸收朝向?qū)游鰣D末端方向的下降意味著沒有別的單聚乙二醇化IFN種類在更高的滯留時(shí)間被洗脫下來。
此外，仔細(xì)觀測IEC的層析圖可以發(fā)現(xiàn)在峰2和峰3之間有另外一個(gè)接近檢測界限的峰，這說明還有另外的位置異構(gòu)體存在，這些異構(gòu)體對于PEG-IFNα2a混合物的比活性應(yīng)該也有貢獻(xiàn)。由于干擾素α-2a分子顯示出12個(gè)可聚乙二醇化的位點(diǎn)(11個(gè)賴氨酸以及N-末端)，故預(yù)期還有其它種類的異構(gòu)體。然而，鑒于這些種類的低豐度，它們沒有被分離出來，性質(zhì)未能得到檢測。
由優(yōu)化的IEC操作下得到的異構(gòu)體樣品在分離后直接分析(t＝0)和儲存于5℃下2周后進(jìn)行分析。就光譜測定法得到的蛋白含量而言，沒有發(fā)現(xiàn)來自IEC各峰的蛋白有明顯的差別；也沒在單聚乙二醇化位點(diǎn)、低-PEG-IFNα2a的含量、團(tuán)聚體的量和生物測定活性方面發(fā)現(xiàn)變化?？紤]到各個(gè)異構(gòu)體的相對豐度(由IEC法測得)以及比活性(由抗病毒試驗(yàn)測定)，用于異構(gòu)體分離的PEG-IFNα2a混合物的生物學(xué)比活力幾乎全部得以回收(回收率近93％)?？紤]到IEC級分中有其它位置異構(gòu)體的污染，故用分析性IE-HPLC檢測各個(gè)異構(gòu)體的純度。峰2，3，4，4a，5和7的純度大于98％，峰1和8純度為93％，峰6的純度為88％。
表1通過比較異構(gòu)體與標(biāo)準(zhǔn)參照的Lys-C消化譜鑒定的PEG-肽。
在分離出的各種PEG-IFN中鑒定到的PEG位點(diǎn)峰 肽圖譜中缺少的峰PEG-IFNPEG位點(diǎn) Mr(DA) 序列峰1K31A，E 24-49峰2K134I，I’ 134-164峰3K131C122-131a峰4K121B，C 113-131峰4a K164b134-164a，b峰5K70D，F(xiàn) 50-83峰6K83D，H 71-112峰7K49E，F(xiàn) 32-70峰8K112B，H 84-121a132-133太小而未檢測a bRP-HPLC.
各級分通過本文中所述方法來鑒定其性質(zhì)。
實(shí)施例4通過質(zhì)譜肽作圖法分析各級分質(zhì)譜用MALDI-TOF MS儀(PerSeptive Biosystems Voyager-DE STR，使用“延遲引出”(delayed extraction))記錄。各個(gè)IEC(離子交換層析)級分通過透析脫鹽，用0.02M 1，4-二硫代-DL-蘇糖醇(DTT)還原，并用0.2M 4-乙烯基吡啶烷基化。然后用內(nèi)切蛋白酶Lys-C(Wako Biochemicals)消化蛋白質(zhì)，反應(yīng)溶液是0.25M Tris(三(羥甲基)-氨基乙烷)，pH8.5，酶與蛋白的比例約為1∶30。在37℃下反應(yīng)過夜。
20mg/mlα-氰基-4-羥基桂皮酸和12mg/ml硝酸纖維素在40/60(v/v)的丙酮/異丙醇中的溶液作為基質(zhì)(薄層施用)。首先，將0.5μL基質(zhì)鋪于靶上并讓其干燥。然后，加入1.0μL樣品。光譜在線性陽離子化模式下獲得，其中加速電壓為20,000V，柵極電壓為95％。每一個(gè)光譜至少收集可覆蓋整個(gè)點(diǎn)的190次激光發(fā)射。Des-Arg1-緩激肽和牛胰島素用來作為內(nèi)部校準(zhǔn)。
實(shí)施例5高效液相色譜(RP-HPLC)肽作圖肽通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)肽作圖法來表征。IEC的級分用上面MALDI-TOF MS肽作圖中的方法還原、烷基化、以及用內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化。消化的異構(gòu)體在Waters Alliance HPLC系統(tǒng)中進(jìn)行分析，所用為Vydac RP-C18分析柱(5μm，2.1×250mm)和填充同樣材料的前置柱。用水中的1％至95％的乙腈梯度進(jìn)行洗脫，時(shí)間為105分鐘，流速0.2mL/min。兩種溶劑均含有0.1％(v/v)TFA。每個(gè)消化樣品注射100μL，監(jiān)測波長為215nm。
實(shí)施例6未消化蛋白的MALDI-TOF譜18mg/ml的反式-3-吲哚基丙烯酸在70/30(v/v)的乙腈/0.1％三氟乙酸中的溶液與等體積的樣品溶液預(yù)混合。然后將1.0μL混合物施于靶表面。通常在線性陽離子化模式下平均進(jìn)行150-200次激光發(fā)射。加速電壓設(shè)為25,000V，柵極電壓至90％。牛血清M+和M2+用作外部校準(zhǔn)。
實(shí)施例7SE-HPLC(大小排阻HPLC)SE-HPLC在配有TosoHaas TSK gel G 4000 SWXL柱(7.8×300mm)的Waters Alliance 2690 HPLC系統(tǒng)下進(jìn)行。蛋白質(zhì)用含有0.02MNaH2PO4，0.15M NaCl，1％(v/v)二甘醇以及10％(v/v)乙醇(pH6.8)的流動相洗脫，洗脫流速為0.4mL/min，用210nm的波長監(jiān)測。注射量為每種異構(gòu)體20μg。
大小排阻HPLC以及SDS-PAGE用于測定不同的IEC級分中的低-PEG-IFNα2a和團(tuán)聚體的量。參照物含有2.3％團(tuán)聚體和2.2％低聚物。
峰1，4，4a，5，6和8含有小于0.7％的低聚乙二醇化IFNα2a，而峰2，3，和7中低聚乙二醇化IFNα2a的百分比低于測量的底限(＜0.2％)。對于團(tuán)聚體，觀察到不同趨勢。所有峰中團(tuán)聚體的量均低于0.9％。
實(shí)施例8SDS-PAGESDS-PAGE使用16％的Tris-甘氨酸凝膠(1.5mm，10孔)在非還原和還原條件下進(jìn)行。分子量分布在2.5到200kDa的Novex Mark 12分子量標(biāo)準(zhǔn)被用作參照，用牛血清白蛋白(BSA)(2ng)作為靈敏度標(biāo)準(zhǔn)。大約所有樣品各約1μg和0.5μg標(biāo)準(zhǔn)物加到膠上。電泳條件是在125V，6W下120分鐘。用Novex的SilverXpress銀染試劑盒對蛋白進(jìn)行固定和染色。
對于IEC級分1-8，在非還原條件下記錄的膠顯示出與參照標(biāo)準(zhǔn)PEG-IFNα2a相類似的模式。在還原條件下，與標(biāo)準(zhǔn)相比而言，凝膠顯示出在大約90kDa的次要條帶的強(qiáng)度有所增強(qiáng)。對于峰6，7和8，在6到10kDa之間有蛋白質(zhì)片斷。兩條帶一起相當(dāng)于被剪切物質(zhì)的約1％。在異構(gòu)體1，5，6，7，8的泳道中，可見大于100kDa的額外的條帶，這些條帶在標(biāo)準(zhǔn)物中也有出現(xiàn)。這些條帶可以推定為低聚體。因而，SDS-PAGE證實(shí)了SE-HPLC分析的結(jié)果。
總之，RP-HPLC和SDS-PAGE試驗(yàn)顯示IEC組分的純度可以被認(rèn)為與PEG-IFNα2a參照標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)。
由9個(gè)IEC-級分得來的各種PEG-IFNα2a的結(jié)構(gòu)基于上述方法的結(jié)果使用上述策略得以鑒定。
實(shí)施例9體外抗病毒保護(hù)活性分離到的異構(gòu)體的抗病毒活性通過水泡性口炎病毒(VSV)在Madin-Darby牛腎細(xì)胞(MDBK)上的致細(xì)胞病變效應(yīng)的減弱來測定。細(xì)胞系在含有10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了測定有效濃度，異構(gòu)體和PEG-IFN稀釋至終濃度為10ng/ml(試驗(yàn)起始濃度)。這里有效濃度(EC50)定義為使得50％細(xì)胞抵抗VSV所需的濃度。在所有測定中，細(xì)胞培養(yǎng)物在加入PEG-IFN異構(gòu)體后4小時(shí)經(jīng)VSV攻擊。在37℃下生長18小時(shí)后，細(xì)胞用結(jié)晶紫crystal violet_染色，以確定完好的細(xì)胞的數(shù)量。
測定EC50值以確定9個(gè)位置異構(gòu)體的抗病毒活性。在本試驗(yàn)中測定PEG-IFN作為參照。
圖2A顯示的是異構(gòu)體的比活性(U/μg，灰色柱)。在這個(gè)試驗(yàn)中，各個(gè)位置異構(gòu)體均有活性，只是水平不同。異構(gòu)體K31和K134有比PEG-IFN高的活性，分別相當(dāng)于PEG-IFN活性的170％和125％。K164的活性等于混合物的活性，而K49，K70，K83，K112，K121和K131的活性則較低。
實(shí)施例10抗增殖活性試驗(yàn)在此試驗(yàn)中，使用人的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系(ME15)的原代細(xì)胞培養(yǎng)物。此細(xì)胞系于2000年8月17日依據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在巴黎的國立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，Institut Pasteur)，保藏號為CNCM I-2546。細(xì)胞系在添加有10％FCS，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，10mM非必需氨基酸和HEPES緩沖液(均購自英國Gibco Life Sciences)的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合時(shí)。用胰蛋白酶消化以進(jìn)行細(xì)胞傳代。以平底96孔板中每孔約5000-6000個(gè)細(xì)胞為細(xì)胞增殖試驗(yàn)的起點(diǎn)，試驗(yàn)分別在有或沒有各個(gè)濃度的IFN，PEG-IFN和異構(gòu)體的情況下進(jìn)行5天。之后用細(xì)胞著色試劑盒(Promega，Madison，USA)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)是基于四氮唑鹽MTS裂解為甲月替(formazan)后的比色測定進(jìn)行的。按照廠商推薦加入MTS反應(yīng)溶液，37℃反應(yīng)4小時(shí)之后在分光光度計(jì)上測定490nm處的光吸收值。
用IFN-敏感的黑色素瘤細(xì)胞系(ME15)和商業(yè)試驗(yàn)來測定異構(gòu)體的抗增殖比活性。位置異構(gòu)體和作為參照的PEG-IFN的使用濃度為100U/ml(圖2B)。試驗(yàn)所用的異構(gòu)體的生物學(xué)單位(U)由本文中前述的抗病毒試驗(yàn)來定義和確定，以PEG-IFN為標(biāo)準(zhǔn)參照。
在本試驗(yàn)中，所有的異構(gòu)體均有活性，其中異構(gòu)體K31和K134相對于PEG-IFN的活性分別為159％和115％。異構(gòu)體K164顯示與PEG-IFN相同的活性；其余所有異構(gòu)體的活性均低于參照物。
此結(jié)果中的活性排序與抗病毒試驗(yàn)中的活性排序基本上相同，這表明上述活性來源于一個(gè)共同的引發(fā)機(jī)制或信號事件。
對于在以上二試驗(yàn)中9種位置異構(gòu)體具有不同比活性的一種解釋是它們的蛋白穩(wěn)定性有所不同。為了證實(shí)此點(diǎn)，我們在ME15細(xì)胞系中進(jìn)行了一個(gè)時(shí)間過程試驗(yàn)來測試不同的濃度下的一些異構(gòu)體。我們選擇了活力最高的異構(gòu)體K31和K134，以及活力最低的異構(gòu)體K121，用IFN以及PEG-IFN作為參照(參見圖3)。不同濃度(500，125和15U/ml)的IFN，PEG-IFN和位置異構(gòu)體被用來處理ME15細(xì)胞，作用時(shí)間為5天。每24小時(shí)計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量。
我們又發(fā)現(xiàn)了與上述抗增殖活性驚人的相關(guān)性K134活性最高，K31和PEG-IFN次之。和我們預(yù)想的一樣，活性最低的是K121和IFN。
可以觀察到，對增殖的抑制隨著濃度的降低而降低。有趣的是，5天之后，PEG-IFN在500U/ml使用濃度時(shí)的抗增殖活性與使用濃度為125U/ml的異構(gòu)體K134的抗增殖活性一致，而5天后，IFN和K121在使用濃度至少125U/ml時(shí)表現(xiàn)出較低或沒有抗增殖活性。
通過三個(gè)獨(dú)立的生物試驗(yàn)，我們在PEG部分的分子內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)和生物活性之間建立了聯(lián)系?？傮w而言，異構(gòu)體K31和K134比商購混合物表現(xiàn)出一貫的較高的比活性，而其余7個(gè)異構(gòu)體相對于商購混合物(等于K164)有相近似的比活性。活性范圍在170％到20％之間，說明不同的位置異構(gòu)體之間蛋白的比活性的差異是顯著的。
實(shí)施例11從大腸桿菌表達(dá)和純化重組干擾素受體2的胞外結(jié)構(gòu)域。
干擾素受體2的胞外結(jié)構(gòu)域(IFNR2-EC)被克隆進(jìn)pET15b-載體(美國Invitrogen)，N末端帶有His-Tag_。用此載體構(gòu)建體在E.coli中表達(dá)IFNR2-EC。目的蛋白在細(xì)胞中以包函體的形式沉淀。在完全培養(yǎng)基中發(fā)酵后將E.coli沉淀并重懸于含50mM Tris，10％蔗糖，0.02％疊氮化鈉，10mM氯化鎂以及無EDTA的蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中。在FrenchPress中勻漿并于13000rpm離心后，將包函體溶解于8M的尿素。第一個(gè)層析步驟是鎳螯和層析，用大于10個(gè)柱體積的0-500mM咪唑進(jìn)行線性梯度洗脫。合并的IFNR2峰在8M尿素中透析以去除咪唑。透析之后用含有150mM pH8.0 Tris/HCl的8M尿素稀釋樣品至A280吸收值為0.1，然后將之儲存在室溫下直到Ellman試驗(yàn)結(jié)果顯陰性。氧化的IFNR2-EC對50mM Tris pH8.4透析以使之重新折疊。pH8.4的50mM Tris溶液也是第二步層析的起始緩沖液。第二步層析用陰離子交換樹脂(HiTrap Q HP，5×5ml，Amersham Biosciences)，用0-500mM NaCl梯度進(jìn)行。
所有的純化步驟都用還原和非還原SDS-PAGE加以分析。蛋白質(zhì)的純度由使用Superdex_75和200 HR(PC 3.2/30，Amersham Biosciences)的分析性大小排阻層析進(jìn)行監(jiān)測。此層析方法同樣用于測定結(jié)合活性和能力(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例12用光學(xué)生物傳感器系統(tǒng)表征IFN以及PEG-IFN異構(gòu)體與IFNR2-EC的相互作用。
IFNR2-EC的固定用生物素標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)。生物素化蛋白質(zhì)被錨定在鏈親和素傳感器表面(SA Sensor，BIAcore)。
生物素化是通過將蛋白質(zhì)的儲存溶液(10mM醋酸，pH7.5)用Hepes(10mM，pH＝8.4)稀釋至最終蛋白濃度為0.23mg/ml(8.65μM)進(jìn)行的。8.65mM溶在DMSO中的生物素氨基己酸-正-羥基琥珀酰亞胺酯(Fluka)被加入溶液中使得生物素化試劑的終濃度為86.5μM?；旌衔锓磻?yīng)1小時(shí)后對10mM Hepes緩沖液(pH8.4，含150mM NaCl)透析過夜以去除低分子量的反應(yīng)產(chǎn)物。此溶液用于固定步驟中。固定是通過將生物素化蛋白質(zhì)溶液與SA傳感器表面相接觸來進(jìn)行的。固定化的蛋白質(zhì)的量通過接觸時(shí)間來控制。對于結(jié)合試驗(yàn)，固定4000RU，相當(dāng)于固定大約4ng/mm2蛋白質(zhì)。
結(jié)合試驗(yàn)以Hepes緩沖液(10mM Hepes，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％聚山梨醇酯20，pH7.4)為運(yùn)作緩沖液。干擾素溶液通過用運(yùn)作緩沖液稀釋干擾素貯液來制備。所有結(jié)合試驗(yàn)的流速設(shè)定為5μl/min。干擾素溶液與固定的IFNR2-EC接觸5分鐘的時(shí)段。
結(jié)合數(shù)據(jù)的計(jì)算基于形成1/1復(fù)合物的簡單動力學(xué)模型，將時(shí)間依賴的反應(yīng)曲線進(jìn)行數(shù)學(xué)擬合來確定解離常數(shù)值(KD)。Kon和koff值通過此擬合而得到。KD為koff/Kon之比。
當(dāng)用無標(biāo)記的固相探測例如表面等離子體共振(surface plasmonresonance，SPR)來研究蛋白質(zhì)的相互作用時(shí)，需要固定相互作用的化合物中的一個(gè)。
我們使用兩個(gè)不同的偶聯(lián)策略來將IFN或IFNR2-EC固定于傳感器表面。IFN經(jīng)由自由氨基基團(tuán)被固定到羧化葡聚糖傳感器表面，IFNR2-EC被生物素標(biāo)記并錨定在鏈親和素傳感器表面。分別用此兩種傳感器和對應(yīng)的IFN來進(jìn)行IFNR2-EC結(jié)合試驗(yàn)。獲得速率常數(shù)和結(jié)合親合力的一致值。結(jié)果顯示結(jié)合親合力與使用的固定手段和所固定的蛋白無關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些預(yù)試驗(yàn)對于增加異構(gòu)體測定的準(zhǔn)確性以及驗(yàn)證1/1復(fù)合體形成的簡單動力學(xué)模型是必要的。
為了測定親合力和動力學(xué)常數(shù)，我們選擇了可以涵蓋整個(gè)生物學(xué)比活性范圍的五種異構(gòu)體(K31，K121，K131，K134和K164)，參見圖2A，B。為了增加動力學(xué)和平衡參數(shù)的意義，我們用了不同的異構(gòu)體濃度在固定的IFNR2-EC上進(jìn)行結(jié)合研究。用IFN和PEG-IFN作為參照?；?/1復(fù)合物形成的動力學(xué)模型的結(jié)合曲線擬合結(jié)果示于表2。
表2野生型IFN；PEG-IFN以及幾種位置異構(gòu)體的相互作用的動力學(xué)常數(shù)
konkoffKDkin[105M-1×s-1] [10-2s-1][nM]IFN 12.5 1.14 9.12PEG-IFN 0.27 2.3851K31n.d. n.d. n.d.(＞1mM)K1340.87 3.96 455K1310.96 2.8289K1210.83 2.33 279K1640.652 2.19 335表中顯示了測得的親和力和動力學(xué)數(shù)據(jù)。對于動力學(xué)常數(shù)的計(jì)算是基于形成1/1的復(fù)合物的動力學(xué)模型進(jìn)行的。IFNR2-EC由生物素標(biāo)記。生物素化的蛋白質(zhì)被錨定在鏈親和素傳感器的表面(SA Sensor，Biacor)。結(jié)合試驗(yàn)在作為運(yùn)作緩沖液的Hepes緩沖液(10mM Hepes，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％聚山梨醇酯20，pH7.4)中進(jìn)行。
所獲得的KD-值顯示IFN的聚乙二醇化導(dǎo)致其與INFR2-EC的親和力降低。親和力的降低值由聚乙二醇化的位點(diǎn)而定。親和力的變化通常由結(jié)合常數(shù)(Kon)的變化引起。例如，異構(gòu)體K134使親和力改變了大約15倍。其kon減少了10倍以上，而其Koff僅增加大約4倍。
對于異構(gòu)體K31，因?yàn)槠涞鞍踪|(zhì)濃度太低，故只可能得出KD的估算值。
將抗病毒比活性或抗增殖比活性數(shù)據(jù)與IFNR2-EC親和力研究相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)一種有趣的聯(lián)系，參見圖4。它顯示，對于一個(gè)給定的異構(gòu)體，IFNR2-EC親和力越高(KD越低)，其生物學(xué)比活性越低。此關(guān)系與主要用于尋找具有低KD和高生物活性的配體的通常藥物篩選原則正相反。
實(shí)施例13異構(gòu)體相對于IFN的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答可用于同時(shí)測量數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)水平的DNA微陣列提供了一個(gè)全面的架構(gòu)以確定位置異構(gòu)體如何在基因組水平上影響細(xì)胞的新陳代謝和調(diào)節(jié)。
為了評價(jià)聚乙二醇化位點(diǎn)對于IFN轉(zhuǎn)錄活性的影響，我們用寡核苷酸陣列技術(shù)測量了IFN誘導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞系ME15的基因表達(dá)模式。
ME15細(xì)胞在100U/ml的IFN，PEG-IFN或PEG-IFN異構(gòu)體存在的條件下孵育48小時(shí)。經(jīng)過48小時(shí)后培養(yǎng)的細(xì)胞用刮除的方法收獲，并用RNA-BeeTM提取細(xì)胞的總RNA。從每個(gè)樣品中10μg的細(xì)胞總RNA被逆轉(zhuǎn)錄(Invitrogen，U.S.)，標(biāo)記(Ambion，U.S.)，并利用商購的試劑盒按生產(chǎn)廠商的說明進(jìn)行加工。堿性條件下加熱片斷化以及之后U95Av2 GeneChip陣列與cDNA的雜交依照microchip(Affymetrix，U.S.).的生產(chǎn)商提供的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。進(jìn)行寡核苷酸陣列分析的另外一個(gè)方法實(shí)例在文獻(xiàn)中有記載——Fambrough等人生長因子受體活化的多樣信號通路可以誘導(dǎo)在很大范圍上重疊而非獨(dú)立的多組基因，Cell 97(1999)，727-741。
陣列的原始數(shù)據(jù)用共聚焦激光掃描儀(Hewlett Packard，U.S.)測定，并用GeneChip v3.1軟件(Affymetrix，U.S.)分析像素水平。各個(gè)基因的表達(dá)水平相對于與錯(cuò)配寡核苷酸的雜交計(jì)算為熒光強(qiáng)度的歸一化平均差，用任意單位(AD)表示。樣品的每個(gè)分析均用來自三個(gè)不同的細(xì)胞板的標(biāo)記cDNA重復(fù)進(jìn)行三次。
判定一個(gè)基因在用IFN，PEG-IFN或PEG-IFN異構(gòu)體處理后相對于未處理細(xì)胞是否有差異表達(dá)的四項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)為(1)處理后的細(xì)胞的強(qiáng)度值至少比未處理的細(xì)胞高兩倍。(2)處理后的細(xì)胞的強(qiáng)度值應(yīng)至少大于或等于50AD。(3)未處理的細(xì)胞的強(qiáng)度值應(yīng)低于50 AD。(4)標(biāo)準(zhǔn)差必須顯著低于平均差的絕對變化值，計(jì)算的基因的置信水平設(shè)為大于97％(p值＜0.03)。
在這些試驗(yàn)中，我們所用的細(xì)胞系(ME15)和抗增殖試驗(yàn)中用到的相同。我們用100U/ml的各個(gè)異構(gòu)體或IFN和PEG-IFN處理細(xì)胞48小時(shí)。IFN用來作為參照。經(jīng)過這樣的處理之后從ME-15細(xì)胞中提取總RNA。用于制備cDNA以及隨后進(jìn)行雜交和U95Av2 GeneChip陣列掃描的方法見上文所述。加工前經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對總RNA樣品進(jìn)行肉眼觀察，沒有在樣品中發(fā)現(xiàn)任何降解跡象。對于每個(gè)異構(gòu)體、IFN和PEG-IFN的生物重復(fù)次數(shù)(n＝3)使得可以為數(shù)據(jù)分析應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)算法，以解決實(shí)驗(yàn)差異問題。數(shù)據(jù)分析集中于那些在未處理細(xì)胞中低于50 AD而在處理細(xì)胞中上調(diào)至少兩倍以致AD值至少為50AD的基因。
標(biāo)準(zhǔn)差必須顯著低于平均差的絕對變化值，基因的計(jì)算置信水平設(shè)為大于97％(p值＜0.03)。
運(yùn)用這些標(biāo)準(zhǔn)，觀察到29個(gè)上調(diào)的基因的表達(dá)譜。在這個(gè)表達(dá)模式下，相對于IFN，13種已知參與抗增殖和抗病毒通路的IFN所誘導(dǎo)的基因受到很大程度的上調(diào)(表3)。分級群聚(圖5B)顯示所有的異構(gòu)體都有轉(zhuǎn)錄活性，但強(qiáng)度有所不同。
針對每個(gè)異構(gòu)體和IFN，測定所誘導(dǎo)基因的AD值之和(∑AD)，轉(zhuǎn)錄、抗病毒、抗增殖活性均以IFN為參照進(jìn)行比較。圖5A顯示，當(dāng)異構(gòu)體具有增加的生物活性(與PEG-IFN相比較根據(jù)異構(gòu)體的抗病毒和抗增殖活性來確定)，其也具有增加的轉(zhuǎn)錄活性；而生物活性較低的異構(gòu)體顯示較低的轉(zhuǎn)錄活性，因此，與生物活性相對于結(jié)合試驗(yàn)的關(guān)系有所不同，生物活性與轉(zhuǎn)錄活性之間有著正相關(guān)性。
除了異構(gòu)體對于總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答的影響，還發(fā)現(xiàn)單個(gè)基因的不同的上調(diào)。例如，干擾素誘導(dǎo)的核磷蛋白基因在K49和K31接觸下的表達(dá)高于在K134或K131接觸下的表達(dá)。K49和K31異構(gòu)體比K134或K131具有較低的總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答。此發(fā)現(xiàn)突出了為了確定目的化合物的轉(zhuǎn)錄活性，有必要用本發(fā)明的方法分析總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答而不是測量某個(gè)或一小部分選定的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。
另外，針對轉(zhuǎn)錄特異的副作用也分析了微陣列芯片的數(shù)據(jù)，這些副作用可以指示出任何異構(gòu)體對于細(xì)胞的生存或代謝的不良影響。這些分析的標(biāo)準(zhǔn)與上述的相同，唯一的區(qū)別在于各個(gè)異構(gòu)體的數(shù)據(jù)是交叉比較的。本分析的結(jié)果顯示所有異構(gòu)體均無特異副作用。
表3取決于聚乙二醇化位點(diǎn)由IFN調(diào)節(jié)的基因


為了鑒定出受誘導(dǎo)的基因，ME15細(xì)胞系在沒有(未處理細(xì)胞)或有100U/ml IFN或PEG-IFN樣品存在的條件下被培養(yǎng)48小時(shí)。各個(gè)基因的表達(dá)水平相對于與錯(cuò)配寡核苷酸的雜交計(jì)算為熒光強(qiáng)度的歸一化平均差，以任意單位來表示。樣品的每個(gè)研究用來自三個(gè)不同的細(xì)胞板的標(biāo)記cDNA重復(fù)進(jìn)行三次測量。對于基因在IFN或PEG-IFN樣品處理后相對于未處理細(xì)胞是否差異表達(dá)的判斷準(zhǔn)則是處理細(xì)胞的平均值比未處理細(xì)胞的平均值至少高出兩倍，而處理細(xì)胞的平均值應(yīng)至少大于或等于50單位。且未處理的細(xì)胞的平均值應(yīng)小于50單位。另外，標(biāo)準(zhǔn)差必須顯著低于平均差的絕對變化值，基因的計(jì)算置信水平設(shè)為大于97％(p值＜0.03)。運(yùn)用這些標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)了29個(gè)受到調(diào)節(jié)的基因。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>轉(zhuǎn)錄活性試驗(yàn)<130>21574<160>29<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>597<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>干擾素α誘導(dǎo)的基因；ISG12基因<222>(1)..(597)<223>GenBank accession No.X67325<400>1agctgaagtt gaggatctct tactctctaa gccacggaat taacccgagc aggcatggag 60gcctctgctc tcacctcatc agcagtgacc agtgtggcca aagtggtcag ggtggcctct120ggctctgccg tagttttgcc cctggccagg attgctacag ttgtgattgg aggagttgtg180gccatggcgg ctgtgcccat ggtgctcagt gccatgggct tcactgcggc gggaatcgcc240tcgtcctcca tagcagccaa gatgatgtcc gcggcggcca ttgccaatgg gggtggagtt300gcctcgggca gccttgtggg tactctgcag tcactgggag caactggact ctccggattg360accaagttca tcctgggctc cattgggtct gccattgcgg ctgtcattgc gaggttctac420tagctccctg cccctcgccc tgcagagaag agaaccatgc caggggagaa ggcacccagc480catcctgacc cagcgaggag ccaactatcc caaatatacc tgggtgaaat ataccaaatt540ctgcatctcc agaggaaaat aagaaataaa gatgaattgt tgcaactctt aaaaaaa 597<210>2<211>996<212>DNA<213>人<220>
<221>BST-2<222>(1)..(996)<223>GenBank accession No.D28137<400>2gtggaattca tggcatctac ttcgtatgac tattgcagag tgcccatgga agacggggat 60aagcgctgta agcttctgct ggggatagga attctggtgc tcctgatcat cgtgattctg120ggggtgccct tgattatctt caccatcaag gccaacagcg aggcctgccg ggacggcctt180
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<221>干擾素誘導(dǎo)的肽(6-16)基因<222>(1)..(6803)<223>GenBank accession No.U22970<400>3agatctatca tgatggccac atgaacacag gcttcactgg tcttaccata tgcccatgac 60ccagaagcag ccagcctgag agaacaatgg aacaaagtga cttaatttcc aaagttctgg120gggtttataa acagcatatg gtatgtcaca tgactactgt gggattggaa aaagatcatg180taaatagagc actttgcaca gaccctggca tgcagcaagt gctcaataaa tgataggtgt240tgtttactaa ttggactgaa tggtgaaagg cctgtgtgcc ccagggggag ctggtgatca300ggcttcacta agcccagtat ggccgtggct ctcatctcag tgtgacatgc tttgaatacc360cttagcggct ccaaaagtcc tcagcttgaa gtgcattttt ctgccagcag gcagcacaca420aatgttccgc tgggcggagc tgggagagag gggaaaatga aactctgcag agtgcaggag480ctgggagaga ggggaaaatg aaactgcaga gtgcagaaat agaaactccg acagggattg540gctgcctagg gtgagacgtg ggaggatcca caagtgatga taaaaagcca gccttcagcc600
ggagaaccgt ttactcgctg ctgtgcccat ctatcagcag gctccgggct gaagattgct 660tctcttctct cctccaaggt aaactcagga gcttatgaag tgtgggcatt caagctgcca 720ccctctgcca ggctgcctgt ctgcctgtaa atctcatgtt ctgagagcca ggaggcccct 780tctcctggga ggcagcactc ctgggtccct tttagtgctc tgggctggga cttgtctaag 840aggatgggtt ggagattttt agggagatgg gatgcaaaac cccaagtggc atgagaccca 900gcttacaggt gcaatatcag cgatctgtgg ccttaacact gtcacctctt ggagccttaa 960ttacttcctc tgtaaaagga aagttaagtt gcctttgctg ctcaaaggac tggagtattt1020tagaatcccc tttattatag gatccaatgt gacagtgagt tcatctttaa ggatagatga1080agccatctgg agtggttgtt aaaaatgtgg gcttggtggc caggcgtggt ggttcacgcc1140tgtaatccca gcactttggg aggccgagac ccacggatca cgaggtcagg agatcgagac1200catcctggct aacacagtga aaccctgtct ctactaaaaa tacaaaaaaa attagccggg1260cttggtggtg ggcgcctgta gtctcagcta ctcgggaggc tgaggcaggc aggagaatgg1320catgaacctg ggaggtggag cttgcagtga gatgagattg cgccactgca ctccagcctg1380ggcgacagag aaagactcca tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatgtggg cttgggtatt1440agccaattgt gggtttaaac cctgactttg ccatgacctg gctaggcagc cttgggaata1500ttacttaacc tctctgagct tcagtttcct tatctataac atgtggttga taacaatggt1560acctacttcg tggtgttgtt ataggtacaa gtggactgcg tgccataaag tgctaagtac1620tcaatacatg agaggagttt cttgtttttc tttttaactt aagaaaatag cattgatctg1680acaaagatca tattagaggt gagtctgagg gcatatgcat tttccagttt tgtggtataa1740aggaaagagc ataggttcat gaattctgac tgtcttgaat gtgtacccat gttgcacaat1800ttgctgtgtg acctttatcc cttgtgatat tgtaaaatat attttttcat cccccagttc1860ctggcataca actcctaaaa tccttggaat cttcaaagtg ataaatatct tttgagtgat1920aactgtctaa taagttgact gatggctggc atttcctctg gggaggggag aggggctgaa1980ggttaagctg attaccaatg ggcagtgatt taatcagtca tgcctatgta atgaagcctc2040cataaaaaca caaaaggaca gggtttgaca agcttccaga tagccgaata caggaggtct2100ccagtgggtg gtgcttctgg agaggaatgg aaactccatg ccctttctcc cataccttgc2160cctatgcatc tcttcatctg gagcatttgt aatatccata aggaaccagt aaatgtagct2220gggtatggtg gctgatgcct gtaatctcag cactttggga ggctgaggca ggcagattgc2280gtgagttcag gagttcaaga tcagcctggg caacatggtg aaaccccatc tcaaaaaaaa2340aaaaaaaaat tagttgggcg tggtggtgca tacctgtagt cccagctatc tggaggctga2400ggtgggagga tcacttgagc ctgggaggcg aaggtctcag tgagctgaga tggggccact2460
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aggatctcgg gcaggcgggg cgggcctctg ccgcggacgc tccctcacct gctcctgttc4380ctccaggact cgcagtcgcc gggctgcccg cgctgggctt caccggcgcc ggcatcgcgg4440ccaactcggt ggctgcctcg ctgatgagct ggtctgcgat cctgaatggg ggcggcgtgc4500ccgccggggg gctagtggcc acgctgcaga gcctcggtga gtgcggggcc tgggcctggt4560gggacgttct ttactattat tttcatcata catctgggga aactgaggca ctcaggaatt4620aagtaattta ctcaagtaat taagtagttt accaggaatt aagtgattct ttatttattt4680attttgagac agagtctggc tgtgtcaccc aggcaggctg aagtgcagtg gtgtgatctt4740ggctcactgc aacctctgcc tccctggctc aagcgatttt cctgccacag cctcccaagt4800agctgggatt acaggcacac gccaccacgc ccggctaatt tttgtatttt tagtagagat4860ggggtttcac catgttggcc aggctggctc aaactcctga cctcagctga tccgcccgcc4920tcggcgtccc atagtgctag gattacaggc gtgagtcacc gcgtccggcc agaaattaag4980taacttactc aagtctccct gctagtttag accagagcct agattctgac ccagtcagta5040caatgcgaga agccccattc tcagcctcaa aggctgggtg cctcactgat gctttggcca5100aatcacaagc ctcagttccc tcagcggtgc gtggggatga tcatcctcag tttaacattt5160tttgaatctg ctcaatctca gagaccacag tagcaaagaa acatagtaga gtaactcaaa5220tcaatctcac accaaactgg tcttgacttg cactttttga acaccatgga gggaacagat5280aacagagctc acagtgactc ttctatcgat tgatcaatct attgatctat ttattataga5340taaaggtcaa aacaaggtct cacactgcca ggttggaatg cagtgcatga tcacagctca5400cagcagcctc gaactcccag gttcaagcta tcttcctgcc tcagattccc aagtagctgg5460gactataggc gcataccgcc acacactggc tttttttttt tttttttttt ttttttttgt5520agagacgggg tctcattgtg ttgcccagga tggtcttgaa ttcctgggct caagcaatcc5580tcccactttg gcctcccaaa gtgttgagac tgcaagcatg agccactgtg ctggcccaga5640gtgactcata aaaaatggcc ttacttccct ctctctcctc tctccccacc cacccccacc5700tctctctcgc gctctgaggc ctccaaaatc ctggagaaaa cctgcccctg acaaacttcc5760ctctctgcct ttctgaacct cgcatctcct cttctctcaa ttctgaatgg caaaagccca5820aagaaccagc ccaaaagaag agagccctgc tcagacgggg ccacacccct gcaatgggag5880gggaagagtg tgggcgagcc cagggacacc tctgggctat cagctagttg tcctctcaca5940tggcacatag ctgtgacaag atgaaatgat ccctggcttg tgaacccccc acacccacac6000agggctccat gaaggtggct gttagcatga ttaataacat ggcgtttcca tggcagacat6060caggtgaagg agccattatt tttgcctttt tcatcactga aacacatctc tgatttggga6120tgtcaaggca aggtaaaaat gggactcact ttgtagtagt gccatcccct ctcagggcct6180
ctgtttctcc atctagacat aaggggttgg actcaaccaa tggtttccag acatttggat6240tcccaggcct ggcacttggg cccagtgact catctgtgtt tgctttacag gggctggtgg6300cagcagcgtc gtcataggta atattggtgc cctgatgcgg tacgccaccc acaagtatct6360cgatagtgag gaggatgagg agtagccagc agctcccaga acctcttctt ccttcttggc6420ctaactcttc cagttaggat ctagaacttt gccttttttt tttttttttt ttttttttga6480gatgggttct cactatattg tccaggctag agtgcagtgg ctattcacag atgcgaacat6540agtacactgc agcctccaac tcctagcctc aagtgatcct cctgtctcaa cctcccaagt6600aggattacaa gcatgcgccg acgatgccca gaatccagaa ctttgtctat cactctcccc6660aacaacctag atgtgaaaac agaataaact tcacccagaa aacactttgt cctgctgtca6720atcatgtttg cagtgagaag cccaaaacaa tctggctctg gcctgcacca tccacacacc6780cccattccca ttttcccctc gag6803<210>4<211>634<212>DNA<213>人<220>
<221>干擾素誘導(dǎo)的17-kDa/15-kDa蛋白質(zhì)<222>(1)..(634)<223>GenBank accession No.M13755<400>4cggctgagag gcagcgaact catctttgcc agtacaggag cttgtgccgt ggcccacagc 60ccacagccca cagccatggg ctgggacctg acggtgaaga tgctggcggg caacgaattc120caggtgtccc tgagcagctc catgtcggtg tcagagctga aggcgcagat cacccagaag180attggcgtgc acgccttcca gcagcgtctg gctgtccacc cgagcggtgt ggcgctgcag240gacagggtcc cccttgccag ccagggcctg ggccctggca gcacggtcct gctggtggtg300gacaaatgcg acgaacctct gagcatcctg gtgaggaata acaagggccg cagcagcacc360tacgaggtcc ggctgacgca gaccgtggcc cacctgaagc agcaagtgag cgggctggag420ggtgtgcagg acgacctgtt ctggctgacc ttcgagggga agcccctgga ggaccagctc480ccgctggggg agtacggcct caagcccctg agcaccgtgt tcatgaatct gcgcctgcgg540ggaggcggca cagagcctgg cgggcggagc taagggcctc caccagcatc cgagcaggat600caagggccgg aaataaaggc tgttgtaaga gaat634<210>5<211>2058
<212>DNA<213>人<220>
<221>成骨細(xì)胞中表達(dá)的mRNA<222>(1)..(2058)<223>GenBank accession No.AB000115<400>5gcacgaggaa gccacagatc tcttaagaac tttctgtctc caaaccgtgg ctgctcgata 60aatcagacag aacagttaat cctcaattta agcctgatct aacccctaga aacagatata 120gaacaatgga agtgacaaca agattgacat ggaatgatga aaatcatctg cgcaactgct 180tggaaatgtt tctttgagtc ttctctataa gtctagtgtt catggaggta gcattgaaga 240tatggttgaa agatgcagcc gtcagggatg tactataaca atggcttaca ttgattacaa 300tatgattgta gcctttatgc ttggaaatta tattaattta cgtgaaagtt ctacagagcc 360aaatgattcc ctatggtttt cacttcaaaa gaaaaatgac accactgaaa tagaaacttt 420actcttaaat acagcaccaa aaattattga tgagcaactg gtgtgtcgtt tatcgaaaac 480ggatattttc attatatgtc gagataataa aatttatcta gataaaatga taacaagaaa 540cttgaaacta aggttttatg gccaccgtca gtatttggaa tgtgaagttt ttcgagttga 600aggaattaag gataacctag acgacataaa gaggataatt aaagccagag agcacagaaa 660taggcttcta gcagacatca gagactatag gccctatgca gacttggttt cagaaattcg 720tattcttttg gtgggtccag ttgggtctgg aaagtccagt tttttcaatt cagtcaagtc 780tatttttcat ggccatgtga ctggccaagc cgtagtgggg tctgatacca ccagcataac 840cgagcggtat aggatatatt ctgttaaaga tggaaaaaat ggaaaatctc tgccatttat 900gttgtgtgac actatggggc tagatggggc agaaggagca ggactgtgca tggatgacat 960tccccacatc ttaaaaggtt gtatgccaga cagatatcag tttaattccc gtaaaccaat1020tacacctgag cattctactt ttatcacctc tccatctctg aaggacagga ttcactgtgt1080ggcttatgtc ttagacatca actctattga caatctctac tctaaaatgt tggcaaaagt1140gaagcaagtt cacaaagaag tattaaactg tggtatagca tatgtggcct tgcttactaa1200agtggatgat tgcagtgagg ttcttcaaga caacttttta aacatgagta gatctatgac1260ttctcaaagc cgggtcatga atgtccataa aatgctaggc attcctattt ccaatatttt1320gatggttgga aattatgctt cagatttgga actggacccc atgaaggata ttctcatcct1380ctctgcactg aggcagatgc tgcgggctgc agatgatttt ttagaagatt tgcctcttga1440ggaaactggt gcaattgaga gagcgttaca gccctgcatt tgagataagt tgccttgatt1500ctgacatttg gcccagcctg tactggtgtg ccgcaatgag agtcaatctc tattgacagc1560
ctgcttcaga ttttgctttt gttcgttttg ccttctgtcc ttggaacagt catatctcaa1620gttcaaaggc caaaacctga gaagcggtgg gctaagatag gtcctactgc aaaccacccc1680tccatatttc cgtaccattt acaattcagt ttctgtgaca tctttttaaa ccactggagg1740aaaaatgaga tattctctaa tttattcttc tataacactc tatatagagc tatgtgagta1800ctaatcacat tgaataatag ttataaaatt attgtataga catctgcttc ttaaacagat1860tgtgagttct ttgagaaaca gcgtggattt tacttatctg tgtattcaca gagcttagca1920cagtgcctgg taatgagcaa gcatacttgc cattactttt ccttcccact ctctccaaca1980tcacattcac tttaaatttt tctgtatata gaaaggaaaa ctagcctggg caacatgatg2040aaaccccatc tccactgc 2058<210>6<211>2607<212>DNA<213>人<220>
<221>轉(zhuǎn)錄因子ISGF-3<222>(1)..(2607)<223>GenBank accession No.M97936<400>6attaaacctc tcgccgagcc cctccgcaga ctctgcgccg gaaagtttca tttgctgtat 60gccatcctcg agagctgtct aggttaacgt tcgcactctg tgtatataac ctcgacagtc120ttggcaccta acgtgctgtg cgtagctgct cctttggttg aatccccagg cccttgttgg180ggcacaaggt ggcaggatgt ctcagtggta cgaacttcag cagcttgact caaaattcct240ggagcaggtt caccagcttt atgatgacag ttttcccatg gaaatcagac agtacctggc300acagtggtta gaaaagcaag actgggagca cgctgccaat gatgtttcat ttgccaccat360ccgttttcat gacctcctgt cacagctgga tgatcaatat agtcgctttt ctttggagaa420taacttcttg ctacagcata acataaggaa aagcaagcgt aatcttcagg ataattttca480ggaagaccca atccagatgt ctatgatcat ttacagctgt ctgaaggaag aaaggaaaat540tctggaaaac gcccagagat ttaatcaggc tcagtcgggg aatattcaga gcacagtgat600gttagacaaa cagaaagagc ttgacagtaa agtcagaaat gtgaaggaca aggttatgtg660tatagagcat gaaatcaaga gcctggaaga tttacaagat gaatatgact tcaaatgcaa720aaccttgcag aacagagaac acgagaccaa tggtgtggca aagagtgatc agaaacaaga780acagctgtta ctcaagaaga tgtatttaat gcttgacaat aagagaaagg aagtagttca840caaaataata gagttgctga atgtcactga acttacccag aatgccctga ttaatgatga900
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<212>DNA<213>人<220>
<221>ISGF3-γ<222>(1)..(1584)<223>GenBank accession No.M87503<400>7gatcagaggg cgatcagctg gacagcaact caggatggca tcaggcaggg cacgctgcac 60ccgaaaactc cggaactggg tggtggagca agtggagagt gggcagtttc ccggagtgtg 120ctgggatgat acagctaaga ccatgttccg gattccctgg aaacatgcag gcaagcagga 180cttccgggag gaccaggatg ctgccttctt caaggcctgg gcaatattta agggaaagta 240taaggagggg gacacaggag gtccagctgt ctggaagact cgcctgcgct gtgcactcaa 300caagagttct gaatttaagg aggttcctga gaggggccgc atggatgttg ctgagcccta 360caaggtgtat cagttgctgc caccaggaat cgtctctggc cagccaggga ctcagaaagt 420accatcaaag cgacagcaca gttctgtgtc ctctgagagg aaggaggaag aggatgccat 480gcagaactgc acactcagtc cctctgtgct ccaggactcc ctcaataatg aggaggaggg 540ggccagtggg ggagcagtcc attcagacat tgggagcagc agcagcagca gcagccctga 600gccacaggaa gttacagaca caactgaggc cccctttcaa ggggatcaga ggtccctgga 660gtttctgctt cctccagagc cagactactc actgctgctc accttcatct acaacgggcg 720cgtggtgggc gaggcccagg tgcaaagcct ggattgccgc cttgtggctg agccctcagg 780ctctgagagc agcatggagc aggtgctgtt ccccaagcct ggcccactgg agcccacgca 840gcgcctgctg agccagcttg agaggggcat cctagtggcc agcaaccccc gaggcctctt 900cgtgcagcgc ctttgcccca tccccatctc ctggaatgca ccccaggctc cacctgggcc 960aggcccgcat ctgctgccca gcaacgagtg cgtggagctc ttcagaaccg cctacttctg1020cagagacttg gtcaggtact ttcagggcct gggcccccca ccgaagttcc aggtaacact1080gaatttctgg gaagagagcc atggctccag ccatactcca cagaatctta tcacagtgaa1140gatggagcag gcctttgccc gatacttgct ggagcagact ccagagcagc aggcagccat1200tctgtccctg gtgtagagcc tgggggaccc atcttccacc tcacctcttt gttcttcctg1260tctcctttga agtagactca ttcttcacac gattgacctg tcctctttgt gataattctc1320agtagttgtc cgtgataatc gtgtcctgaa aatcctcgca cacactggct ggtggagaac1380tcaaggctaa ttttttatcc tttttttttt tttatttttg agatatacgc cctctttcat1440ctgtaaggga ctaggaaatt ccaaatggtg tgaacccagg gggcctttcc ctcttccctg1500acctcccaac tctaaagcca agcactttat atttttctct tagatattca ctaaggactt1560aaaataaaat ttttttgaaa gagg 1584
<210>8<211>483<212>DNA<213>人<220>
<221>丙型肝炎相關(guān)的微管聚集體<222>(1)..(483)<223>GenBank accession No.D28915<400>8cctctggttg cctttcctga gataatccac taagaatatt ttgtgtttct tttctcaggg 60aatctaaggg aggaaattat caactgtgca caaggaaaaa aatagatatg tgaaaggttc120acgtaaattt cctcacatca cagaagatta aaattcagaa aggagaaaac acagaccaaa180gagaagtatc taagaccaaa gggatgtgtt ttattaatgt ctaggatgaa gaaatgcata240gaacattgta gtacttgtaa ataactagaa ataacatgat ttagtcataa ttgtgaaaaa300taataataat ttttcttgga tttatgttct gtatctgtga aaaaataaat ttcttataaa360actcgggtct aacttgagag tgtgtgtgat tttggaaaaa ttatgatttg tcagcatctt420ctgatattca ctgctttcat cttaattttg ccttctgatt ttatttctaa agtatgtgat480ttt 483<210>9<211>1642<212>DNA<213>人<220>
<221>干擾素誘導(dǎo)的56Kd蛋白質(zhì)_(IFIT-1)<222>(1)..(1642)<223>GenBank accession No.M24594<400>9ccagatctca gaggagcctg gctaagcaaa accctgcaga acggctgcct aatttacagc 60aaccatgagt acaaatggtg atgatcatca ggtcaaggat agtctggagc aattgagatg120tcactttaca tgggagttat ccattgatga cgatgaaatg cctgatttag aaaacagagt180cttggatcag attgaattcc tagacaccaa atacagtgtg ggaatacaca acctactagc240ctatgtgaaa cacctgaaag gccagaatga ggaagccctg aagagcttaa aagaagctga300aaacttaatg caggaagaac atgacaacca agcaaatgtg aggagtctgg tgacctgggg360caactttgcc tggatgtatt accacatggg cagactggca gaagcccaga cttacctgga420caaggtggag aacatttgca agaagctttc aaatcccttc cgctatagaa tggagtgtcc480
agaaatagac tgtgaggaag gatgggcctt gctgaagtgt ggaggaaaga attatgaacg 540ggccaaggcc tgctttgaaa aggtgcttga agtggaccct gaaaaccctg aatccagcgc 600tgggtatgcg atctctgcct atcgcctgga tggctttaaa ttagccacaa aaaatcacaa 660gccattttct ttgcttcccc taaggcaggc tgtccgctta aatccagaca atggatatat 720taaggttctc cttgccctga agcttcagga tgaaggacag gaagctgaag gagaaaagta 780cattgaagaa gctctagcca acatgtcctc acagacctat gtctttcgat atgcagccaa 840gttttaccga agaaaaggct ctgtggataa agctcttgag ttattaaaaa aggccttgca 900ggaaacaccc acttctgtct tactgcatca ccagataggg ctttgctaca aggcacaaat 960gatccaaatc aaggaggcta caaaagggca gcctagaggg cagaacagag aaaagctaga1020caaaatgata agatcagcca tatttcattt tgaatctgca gtggaaaaaa agcccacatt1080tgaggtggct catctagacc tggcaagaat gtatatagaa gcaggcaatc acagaaaagc1140tgaagagaat tttcaaaaat tgttatgcat gaaaccagtg gtagaagaaa caatgcaaga1200catacatttc tactatggtc ggtttcagga atttcaaaag aaatctgacg tcaatgcaat1260tatccattat ttaaaagcta taaaaataga acaggcatca ttaacaaggg ataaaagtat1320caattctttg aagaaattgg ttttaaggaa acttcggaga aaggcattag atctggaaag1380cttgagcctc cttgggttcg tctataaatt ggaaggaaat atgaatgaag ccctggagta1440ctatgagcgg gccctgagac tggctgctga ctttgagaac tctgtgagac aaggtcctta1500ggcacccaga tatcagccac tttcacattt catttcattt tatgctaaca tttactaatc1560atcttttctg cttactgttt tcagaaacat tataattcac tgtaatgatg taattcttga1620ataataaatc tgacaaaata tt 1642<210>10<211>853<212>DNA<213>人<220>
<221>干擾素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)9-27<222>(1)..(853)<223>GenBank accession No.J04164<400>10ctagtcctga cttcacttct gatgaggaag cctctctcct tagccttcag cctttcctcc 60caccctgcca taagtaattt gatcctcaag aagttaaacc acacctcatt ggtccctggc120taattcacca atttacaaac agcaggaaat agaaacttaa gagaaataca cacttctgag180aaactgaaac gacaggggaa aggaggtctc actgagcacc gtcccagcat ccggacacca240
cagcggccct tcgctccacg cagaaaacca cacttctcaa accttcactc aacacttcct 300tccccaaagc cagaagatgc acaaggagga acatgaggtg gctgtgctgg gggcaccccc 360cagcaccatc cttccaaggt ccaccgtgat caacatccac agcgagacct ccgtgcccga 420ccatgtcgtc tggtccctgt tcaacaccct cttcttgaac tggtgctgtc tgggcttcat 480agcattcgcc tactccgtga agtctaggga caggaagatg gttggcgacg tgaccggggc 540ccaggcctat gcctccaccg ccaagtgcct gaacatctgg gccctgattc tgggcatcct 600catgaccatt ggattcatcc tgtcactggt attcggctct gtgacagtct accatattat 660gttacagata atacaggaaa aacggggtta ctagtagccg cccatagcct gcaacctttg 720cactccactg tgcaatgctg gccctgcacg ctggggctgt tgcccctgcc cccttggtcc 780tgcccctaga tacagcagtt tatacccaca cacctgtcta cagtgtcatt caataaagtg 840cacgtgcttg tga853<210>11<211>1377<212>DNA<213>人<220>
<221>干擾素誘導(dǎo)的2-5A合成酶<222>(1)..(1377)<223>X04371<400>11aacgaaacca acagcagtcc aagctcagtc agcagaagag ataaaagcaa acaggtctgg 60gaggcagttc tgttgccact ctctctcctg tcaatgatgg atctcagaaa taccccagcc120aaatctctgg acaagttcat tgaagactat ctcttgccag acacgtgttt ccgcatgcaa180atcaaccatg ccattgacat catctgtggg ttcctgaagg aaaggtgctt ccgaggtagc240tcctaccctg tgtgtgtgtc caaggtggta aagggtggct cctcaggcaa gggcaccacc300ctcagaggcc gatctgacgc tgacctggtt gtcttcctca gtcctctcac cacttttcag360gatcagttaa atcgccgggg agagttcatc caggaaatta ggagacagct ggaagcctgt420caaagagaga gagcattttc cgtgaagttt gaggtccagg ctccacgctg gggcaacccc480cgtgcgctca gcttcgtact gagttcgctc cagctcgggg agggggtgga gttcgatgtg540ctgcctgcct ttgatgccct gggtcagttg actggcagct ataaacctaa cccccaaatc600tatgtcaagc tcatcgagga gtgcaccgac ctgcagaaag agggcgagtt ctccacctgc660ttcacagaac tacagagaga cttcctgaag cagcgcccca ccaagctcaa gagcctcatc720cgcctagtca agcactggta ccaaaattgt aagaagaagc ttgggaagct gccacctcag780
tatgccctgg agctcctgac ggtctatgct tgggagcgag ggagcatgaa aacacatttc 840aacacagccc agggatttcg gacggtcttg gaattagtca taaactacca gcaactctgc 900atctactgga caaagtatta tgactttaaa aaccccatta ttgaaaagta cctgagaagg 960cagctcacga aacccacgcc tgtgatcctg gacccggcgg accctacagg aaacttgggt1020ggtggagacc caaagcgttg gaggcagctg gcacaagagg ctgaggcctg gctgaattac1080ccatgcttta agaattggga tgggtcccca gtgagctcct ggattctgct ggtgagacct1140cctgcttcct ccctgccatt catccctgcc cctctccatg aagcttgaga catatagctg1200gagaccattc tttccaaaga acttacctct tgccaaaggc catttatatt catatagtga1260caggctgtgc tccatatttt acagtcattt tggtcacaat cgagggtttc tggaattttc1320acatcccttg tccagaattc attcccctaa gagtaataat aaataatctc taacacc 1377<210>12<211>5503<212>DNA<213>人<220>
<221>Wilms腫瘤基因<222>(1)..(5503)<223>GenBank accession No.X69950<220>
<221>misc_feature<222>(2041)..(2041)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2083)..(2083)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2186)..(2186)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2187)..(2187)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2488)..(2488)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3386)..(3386)
<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3718)..(3718)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3720)..(3720)<223>不明確的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3938)..(3938)<223>不明確的核苷酸<400>12ggtgcgctca ggactggaag caactctcag ttcatcaatt tcatgggcct acgtatctgc 60tctggccacg gcctggcctc catccccact gtggcattaa tgcagaacaa attgagacat 120atcctctata taattagttc cagaatttaa aaagatttac ggtataataa tagaggcagt 180gccgcggaat cctttcactg aggactctcg gggagctcgg ggaccatctc gcggtggcat 240cagaacagac gagtaacccc agcggctcca ggcactgcga actgggggag agggggaaat 300tttgcaccgc attcggcagt acctaacggt tccgggctcc cagatagggt cagcgaggag 360agttaggaca gtaagtgggg actggttaaa aaaaatcgac ttaattttga aatgatcaga 420agaagctggg agtagttatc acaaagcccc tcccttgccc cccccttttt ttaattgaag 480gaatgacgtt gaaattttca ccgccagcgc ggggctggga accatcctaa acacttgccc 540tgcagccccg agtgggcaga ttccgaagag ttggagtcgg cggggagggg aggaacagct 600gttgggctgt cttgcgcgtg gggctcgggg cgcgggcccc ggggagaggc gctagtcgaa 660agcttgttcc tctcccgcga caggcagcag cgaggtcgag ccactcttta ttacggcctg 720cgggccccgc gcgcagtgtg gctgtccccg cccttgaccg accgcagcgc tttggggtgt 780ttattcagtt gtccgcggcc gctgggtgac tcccggaggc ggcccaggcg tgcgcactgg 840tccctggggt tgcggctgta gcagcccagc tccgcgctct gtcagatgca gtggacagcg 900ccggggtgaa agtaagggtt gagaaatcct cactgccctg ctcctaccca gcctcgattt 960tttcatattg caataattat gcaccttcga ggccgggatg cctgcgcttt gccagtgtat1020caacgccaca tggttttcca ggggctgtcc tcgcctctgc atcccattag ctctgaagag1080gtagaggggt ggtgggtaaa acctccaact ggacgttgag agacccgggt ttcagctcgg1140cgttgccact aacttgtttc ctgtccttaa acagtagtag taacaaaaac tgtaaagttg1200attgagtcaa aggcccacac tgctctccta tctaatcctc agaacaactc tatgaggtgg1260gcgctagtat cccattatcc cgtttgacca gtaaggaaac tgaggctcag agagactgcg1320
gaactcgtct agggtcacac agctgttggt tacctggcag agctgaggtt ccattctggg1380gccaccaacc ccttgctctt tacgtgcgct ccatagactg cctctccttc ggctgtctgg1440gcctcagttt ccttctctgt aaaacgagaa gtttaatctg cagctttctt tgccaatcgg1500tggttcagac caggaacctc tgctacagat ctcggcgctg acaggggtaa gaaggtgggt1560gaaagaaggg ggcgcccagt tttccacagc ctgcttttct ctgggacctc gcgaagggcg1620ggcctcgcga gctaaaggag gtacaggaga gcgcctatcg tccgcggcgg gtgaaggtgc1680tacctgcctt cgtgctaggc tgtgagtcct ggtgcttagc tcagggcgcc aaggccagtg1740tagctggcat gtcccccttg gaaaacctca ggtctcccgc agagaacgtt acccacaaca1800aagaagagga cagagaggca tggagcgccc tgcgactgca ggagtacgtc agttccccag1860cgctggctta gtgtcgcctg ggcttccggg catgtggatc cgttggggtc gtacggagac1920ttcctgtcgg gtccctgggg tcctccgact gcggctcctc agcttagcac tttcttcttg1980gccccgcagg ctgcagggaa ctcctcccac ctctttagtc ggagaagtcc aagtcgggcg2040agggggcacc ccggggttcg caccggtgct cttcccctcc ccncccccac aaggattctg2100agaaaataaa tggcagagga gagaggagtt ctacatttgc ttggctctcc tttcctccta2160tccaccccta catccctcac cccggnncaa aaacttattt ttgaaaaatg ttggcagaga2220tttacgtgtc tttgccttac ctgggtttca caaacacaac gactcacatt caagccagcc2280tcccttcaga taacctcctc tccccccgct aaaagtgcca aggatggtaa aagaagaaac2340aatctcaatc ttttcgtttg gaaatgaaag tccccggctt ttcataaagg gctcctcgcc2400cctcacagtt gagtcctagt taagaaaaac gacttccaag tagaaataat aggcggggag2460aaggaaggga gatacaggga tctggggngt tcttagggca actggcagtg aattttgtct2520cgagagtcct ttctccactc aaaaaaccaa acgcgcgagc cccgcgaaag gtttagggat2580agatcgtgtg ggagaggact gagcagagag cgtgggggca gtgtcttgta gaatctttct2640tttcttaata ataattttaa aagcttctga gtggagacga cgcaaagtca agcagcaaag2700gtggcctggg aggcaagcgg agggctcaag tgccgcatct ttaccctcag ggtctcctgc2760gcctacggga tgcgcattcc caagaagtgc gcccttcgag taagtcctgg gcccgcacac2820acttcgggtc cgcagccaga atttaatggc gacaacgttt atgcaatgca agctaaaaac2880caaagcgtaa aaaattacta tgtcatttat tgaaacgcca ttctttgtca aactgcaact2940actttgcttc acataagttt ggctggaaag cttgcagccc cagcccgggc cagccaggta3000caggaggccg gactgcaacc ggttgcttcc ctcccgtcgc gcctggccgt cccacgctgc3060gccgtcgctg ctgcctcctg gcgcccctgg gattttatac gcacctctga aacacgctcc3120gctccggccc ccggttcttc tccttgccta ggggttgttt cccaatagat actgactcct3180
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cggagccgca cgaggagcag tgcctgagcg ccttcactgt ccacttttcc ggccagttca5100ctggcacagc cggagcctgt cgctacgggc ccttcggtcc tcctccgccc agccaggcgt5160catccggcca ggccaggatg tttcctaacg cgccctacct gcccagctgc ctcgagagcc5220agcccgctat tcgcaatcag ggtaagtagg ccggggagcg ccccctacgc gcggggcagt5280ggcgccaggg actctccgct ctaggacacc cccctctcct accccttttg accgcagctc5340ttacccagct gcttcccaag ggccgtgagg atagcggaag cggcggctgg ggaggaggcc5400ggagagtggg agtgcacgca ggcactggcc cccgacatcc tccaaagcca ggcagagcta5460ggagcctgac tgttcgcaag agccgggagg gcgtctgggg ccc 5503<210>13<211>1816<212>DNA<213>人<220>
<221>干擾素調(diào)節(jié)因子7B_IRF-7<222>(1)..(1816)<223>GenBank accession No.U53831<400>13ggcacccagg gtccggcctg cgccttcccg ccaggcctgg acactggttc aacacctgtg 60acttcatgtg tgcgcgccgg ccacacctgc agtcacacct gtagccccct ctgccaagag120atccataccg aggcagcgtc ggtggctaca agccctcagt ccacacctgt ggacacctgt180gacacctggc cacacgacct gtggccgcgg cctggcgtct gctgcgacag gagcccttac240ctcccctgtt ataacacctg accgccacct aactgcccct gcagaaggag caatggcctt300ggctcctgag agggcagccc cacgcgtgct gttcggagag tggctccttg gagagatcag360cagcggctgc tatgaggggc tgcagtggct ggacgaggcc cgcacctgtt tccgcgtgcc420ctggaagcac ttcgcgcgca aggacctgag cgaggccgac gcgcgcatct tcaaggcctg480ggctgtggcc cgcggcaggt ggccgcctag cagcagggga ggtggcccgc cccccgaggc540tgagactgcg gagcgcgccg gctggaaaac caacttccgc tgcgcactgc gcagcacgcg600tcgcttcgtg atgctgcggg ataactcggg ggacccggcc gacccgcaca aggtgtacgc660gctcagccgg gagctgtgct ggcgagaagg cccaggcacg gaccagactg aggcagaggc720ccccgcagct gtcccaccac cacagggtgg gcccccaggg ccattcttgg cacacacaca780tgctggactc caagccccag gccccctccc tgccccagct ggtgacaagg gggacctcct840gctccaggca gtgcaacaga gctgcctggc agaccatctg ctgacagcgt catggggggc900agatccagtc ccaaccaagg ctcctggaga gggacaagaa gggcttcccc tgactggggc960
ctgtgctgga ggcgaggccg cggccccaga gtccccgcac caggcagagc cgtacctgtc1020accctcccca agcgcctgca ccgcggtgca agagcccagc ccaggggcgc tggacgtgac1080catcatgtac aagggccgca cggtgctgca gaaggtggtg ggacacccga gctgcacgtt1140cctatacggc cccccagacc cagctgtccg ggccacagac ccccagcagg tagcattccc1200cagccctgcc gagctcccgg accagaagca gctgcgctac acggaggaac tgctgcggca1260cgtggcccct gggttgcacc tggagcttcg ggggccacag ctgtgggccc ggcgcatggg1320caagtgcaag gtgtactggg aggtgggcgg acccccaggc tccgccagcc cctccacccc1380agcctgcctg ctgcctcgga actgtgacac ccccatcttc gacttcagag tcttcttcca1440agagctggtg gaattccggg cacggcagcg ccgtggctcc ccacgctata ccatctacct1500gggcttcggg caggacctgt cagctgggag gcccaaggag aagagcctgg tcctggtgaa1560gctggaaccc tggctgtgcc gagtgcacct agagggcacg cagcgtgagg gtgtgtcttc1620cctggatagc agcagcctca gcctctgcct gtccagcgcc aacagcctct atgacgacat1680cgagtgcttc cttatggagc tggagcagcc cgcctagaac ccagtctaat gagaactcca1740gaaagctgga gcagcccacc tagagctggc cgcggccgcc cagtctaata aaaagaactc1800cagaacaaaa aaaaaa1816<210>14<211>2056<212>DNA<213>人<220>
<221>干擾素誘導(dǎo)的60kDa蛋白質(zhì)(CIG49)<222>(1)..(2056)<223>GenBank accession No.AF026939<400>14gtggaaacct cttcagcatt tgcttggaat cagtaagcta aaaacaaaat caaccgggac 60cccagctttt cagaactgca gggaaacagc catcatgagt gaggtcacca agaattccct120ggagaaaatc ctcccacagc tgaaatgcca tttcacctgg aacttattca aggaagacag180tgtctcaagg gatctagaag atagagtgtg taaccagatt gaatttttaa acactgagtt240caaagctaca atgtacaact tgttggccta cataaaacac ctagatggta acaacgaggc300agccctggaa tgcttacggc aagctgaaga gttaatccag caagaacatg ctgaccaagc360agaaatcaga agtctagtca cttggggaaa ctacgcctgg gtctactatc acttgggcag420actctcagat gctcagattt atgtagataa ggtgaaacaa acctgcaaga aattttcaaa480tccatacagt attgagtatt ctgaacttga ctgtgaggaa gggtggacac aactgaagtg540
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<221>核自身抗原(SP-100)<222>(1)..(1879)<223>GenBank accession No.M60618<400>15ctgaggccca cgcagggcct agggtgggaa gatggcaggt gggggcggcg acctgagcac 60caggaggctg aatgaatgta tttcaccagt agcaaatgag atgaaccatc ttcctgcaca 120cagccacgat ttgcaaagga tgttcacgga agaccagggt gtagatgaca ggctgctcta 180tgacattgta ttcaagcact tcaaaagaaa taaggtggag atttcaaatg caataaaaaa 240gacatttcca ttcctcgagg gcctccgtga tcgtgatctc atcacaaata aaatgtttga 300agattctcaa gattcttgta gaaacctggt ccctgtacag agagtggtgt acaatgttct 360tagtgaactg gagaagacat ttaacctgcc agttctggaa gcactgttca gcgatgtcaa 420catgcaggaa taccccgatt taattcacat ttataaaggc tttgaaaatg taatccatga 480caaattgcct ctccaagaaa gtgaagaaga agagagggag gagaggtctg gcctccaact 540aagtcttgaa caaggaactg gtgaaaactc ttttcgaagc ctgacttggc caccttcggg 600ttccccatct catgctggta caaccccacc tgaaaatgga ctctcagagc acccctgtga 660aacagaacag ataaatgcaa agagaaaaga tacaaccagt gacaaagatg attcgctagg 720aagccaacaa acaaatgaac aatgtgctca aaaggctgag ccaacagagt cctgcgaaca 780aattgctgtc caagtgaata atggggatgc tggaagggag atgccctgcc cgttgccctg 840tgatgaagaa agcccagagg cagagctaca caaccatgga atccaaatta attcctgttc 900tgtgcgactg gtggatataa aaaaggaaaa gccattttct aattcaaaag ttgagtgcca 960agcccaagca agaactcatc ataaccaggc atctgacata atagtcatca gcagtgagga1020ctctgaagga tccactgacg ttgatgagcc cttagaagtc ttcatctcag caccgagaag1080tgagcctgtg atcaataatg acaacccttt agaatcaaat gatgaaaagg agggccaaga1140agccacttgc tcacgacccc agattgtacc agagcccatg gatttcagaa aattatctac1200attcagagaa agttttaaga aaagagtgat aggacaagac cacgactttt cagaatccag1260tgaggaggag gcgcccgcag aagcctcaag cggggcactg agaagcaagc atggtgagaa1320ggctcctatg acttctagaa gtacatctac ttggagaata cccagcagga agagacgttt1380cagcagtagt gacttttcag acctgagtaa tggagaagag cttcaggaaa cctgcagctc1440atccctaaga agagggtcag gtaaagaaga ttaggatgcc aagacttggc ctgcagaatg1500tcaggaatgt gaattaaaag ctgctgtttc cagacgcttt ttattctgag caccttcact1560accttgtatc cagttcatct gggaactcct ttttgcattt tagaaaatgg aaagaggcag1620gaaattatga taaactcatg tttaacagaa agagtttcac tgactaaatg tatgtaatta1680tattttgttg ttgtagaaga aataaatagc aaatttgtgg tattcttttt tttaaacctg1740
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<221>KIAA0793<222>(1)..(3997)<223>GenBank accession No.AB018336<400>16ggcgacgccg acgcgagtct ggcggctgct gcttgcgact gcggaggccg ggcgaggccg 60gtgaggacgc ggcgggcgag cgagaggccg aggtgttttc ttcactcatg gtgaagaatg 120ggggagatag aaggaacata cagagtcctg cagactgcag ggatgcgctt gggtgcccag 180acccctgtgg gagttagcac ccttgagcct gggcagactc tcttgcccag aatgcaagag 240aagcacctgc acctcagagt aaagctgctg gacaacacca tggaaatatt tgacattgag 300cctaaatgcg atggccaggt attactgaca caagtgtgga agcgtttaaa cctggtagaa 360tgtgactact tcgggatgga gtttcaaaat actcagtcct actggatttg gcttgaacct 420atgaaaccca tcattaggca aatacgaagg ccaaagaatg tggtgcttcg cctagctgta 480aaattttttc cacctgatcc tggtcagcta caagaagaat atacaagata cttgtttgcc 540ttgcaactta agagagacct gctggaagag cgtttgacct gtgctgacac cacagcggcc 600cttctcacgt cccatctcct gcagtcggaa ataggagatt acgatgaaac gctggaccga 660gagcacctca aagtgaacga gtatttgcct ggccagcagc actgccttga gaagatacta 720gaattccatc agaagcacgt gggccagaca cctgctgagt cggatttcca ggtgctcgaa 780attgctcgaa agttggaaat gtacggcatc agatttcaca tggcttctga cagggaagga 840accaagattc aactggcagt ttcccacatg ggtgtactcg tgttccaggg caccaccaaa 900atcaacactt tcaactggtc caaggtccgt aaactaagct tcaagaggaa aagatttctt 960atcaaacttc atccagaggt tcatggacct taccaggaca cattagaatt tttgttgggt1020agtagagatg aatgtaagaa cttctggaag atttgtgtgg agtatcacac cttttttaga1080cttttggacc aacctaagcc aaaagcaaaa gccgtcttct tcagccgggg ctcctccttc1140agatacagtg gaagaactca gaaacaacta gtagattatt tcaaagacag tggaatgaag1200agaattccat atgaaagaag gcacagcaag acccacacgt ccgttcgagc tctgactgca1260
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<221>2′5′寡腺苷酸合成酶(p69 2-5A合成酶)<222>(1)..(2905)<223>GenBank accession No.M87434<400>17cggcagccag ctgagagcaa tgggaaatgg ggagtcccag ctgtcctcgg tgcctgctca 60gaagctgggt tggtttatcc aggaatacct gaagccctac gaagaatgtc agacactgat120cgacgagatg gtgaacacca tctgtgacgt ctgcaggaac cccgaacagt tccccctggt180gcagggagtg gccataggtg gctcctatgg acggaaaaca gtcttaagag gcaactccga240tggtaccctt gtccttttct tcagtgactt aaaacaattc caggatcaga agagaagcca300acgtgacatc ctcgataaaa ctggggataa gctgaagttc tgtctgttca cgaagtggtt360gaaaaacaat ttcgagatcc agaagtccct tgatgggtcc accatccagg tgttcacaaa420aaatcagaga atctctttcg aggtgctggc cgccttcaac gctctgagct taaatgataa480tcccagcccc tggatctatc gagagctcaa aagatccttg gataagacaa atgccagtcc540
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<221>組蛋白H2A<222>(1)..(840)<223>GenBank accession No.Z80776<400>18ggatgaattg tctctgtgtg ccctgtggta tgcaaattag gtgattctag cgtttctttg 60caattggttg gttgttctag ccaatcaaat agcgttattt acaattcgac ctccaagtat120aatagtttct cacttgctaa caaaactcac ttttacattt ttgtcttcat tgcttaacat180cgtttttaag aattcaaaat gtccggacgc ggcaagcaag gcggaaaggc ccgagctaag240gctaagaccc gctcttcgcg ggccggactc cagttccctg tgggccgcgt acaccgcttg300ctccgcaagg gcaactactc cgagcgagtc ggggccggcg cgccagtgta tctggcggcg360gtgttggagt acctgaccgc cgagatcctg gagctggcgg gcaacgccgc ccgcgacaac420aagaagaccc gcatcatccc ccgacacctg cagctggcca tccgcaacga cgaggagcta480aacaagttgc tgggtaaagt cacaattgct cagggcggtg ttctgcccaa catccaggct540gtactgctcc ccaagaagac tgagagtcac cacaaggcca agggcaagta aaacgagaac600tcttatattg gctttttaag gaagcagtct taacaaaggc tcttttcaga gccacccatg660tattccttaa aagggctcac attttctgtg taaatagcta ttttgcagtt ttctttaata720atttttccat ttataagtgg gtgttcttaa cactgaatcg tgaaactaac cgtccatttt780aaagatgcca taaaaataca taagcaaatt ggcggggcgc ggttgcttac gcctgtaatc840
<210>19<211>1230<212>DNA<213>人<220>
<221>GPR12 G蛋白偶聯(lián)受體<222>(1)..(1230)<223>GenBank accession No.U18548<400>19aagcttgtgg catttggtac tggtatctga gcaggggctg gctttctgtt tgtctgtgtg 60ttttttgcat gatcttggat tgtcaccctg ctgtatttaa acattaaaaa gcctgtcttt 120tcgttgaaga ggacaggggt taaaatgaat gaagacctga aggtcaattt aagcgggctg 180cctcgggatt atttagatgc cgctgctgcg gagaacatct cggctgctgt ctcctcccgg 240gttcctgccg tagagccaga gcctgagctc gtagtcaacc cctgggacat tgtcttgtgt 300acctcgggaa ccctcatctc ctgtgaaaat gccattgtgg tccttatcat cttccacaac 360cccagcctgc gagcacccat gttcctgcta ataggcagcc tggctcttgc agacctgctg 420gccggcattg gactcatcac caattttgtt tttgcctacc tgcttcagtc agaagccacc 480aagctggtca cgatcggcct cattgtcgcc tctttctctg cctctgtctg cagcttgctg 540gctatcactg ttgaccgcta cctctcactg tactacgctc tgacgtacca ttcggagagg 600acggtcacgt ttacctatgt catgctcgtc atgctctggg ggacctccat ctgcctgggg 660ctgctgcccg tcatgggctg gaactgcctc cgagacgagt ccacctgcag cgtggtcaga 720ccgctcacca agaacaacgc ggccatcctc tcggtgtcct tcctcttcat gtttgcgctc 780atgcttcagc tctacatcca gatctgtaag attgtgatga ggcacgccca tcagatagcc 840ctgcagcacc acttcctggc cacgtcgcac tatgtgacca cccggaaagg ggtctccacc 900ctggctatca tcctggggac gtttgctgct tgctggatgc ctttcaccct ctattccttg 960atagcggatt acacctaccc ctccatctat acctacgcca ccctcctgcc cgccacctac1020aattccatca tcaaccctgt catatatgct ttcagaaacc aagagatcca gaaagcgctc1080tgtctcattt gctgcggctg catcccgtcc agtctcgccc agagagcgcg ctcgcccagt1140gatgtgtagc acccttgcac ccaggaggac tctgcattta ccaagcactt ccactgcctg1200gccaaggttt gagatgcttc ccttgaattc 1230<210>20<211>5141<212>DNA<213>人<220>
<221>類固醇21-羥化酶(CYP21)<222>(1)..(5141)<223>GenBank accession No.M12792<400>20agatctttct cccagtagct gctcagcatg gtggtggcat aagcccattt tccggagcca 60gggattcagt tgcagcaaga catggcccgg tctgggaggt caaccatgaa gaaggcagta 120gctgtcattg cccaacccca gaaatcccaa tcctgttttc tccctctcag tcctgatcat 180ggattcagca gcagcgaact cgccaatgta gtgggtggca cagccagggt cttgactctg 240gctctgcagt agcacagtct ggaaaagctc tgaggggaga gagaccccca ctggtccgag 300ggtctggcac agagccagaa atggggggga aggtatgagg ctgggtcgcc tctgacctct 360caggtaccat ccaggaggcc ctggcctctc actgaacccg gccactcctc tttggcatgg 420cctcttccca aatccccaaa ctgcctcctt acccacaaaa gtggtctctg agtgtcagtc 480cagtgggacc cccacccctt atggcttcag ttccccaaat agggctggac ccttgatcct 540gatccagctg tggctatcca gccccttcct ggggactttg gactttgagg ggggcatgcc 600acttgtgctg ggaatccata ctttccctgg ctggagtaga acctgtggac tgtagtcctg 660agggcagtca tgttctgcct gtgcctggaa agacaagaaa cttgactgca gagagaagaa 720agaggagaga ggaacagagc gaggaaaccg cccgtctccg gggctttttc tgttccctat 780ccttgacttt ctaagaccag tggggtcccc tcctctgctt ctttttcctg agttctgtga 840aattccccaa ttcttatttt ttatctcaaa ccagctcaag gtgggctgtt ttcctttcaa 900ccaaagaaag gtgctcctgg tggctaaagg tacatattcg acagctagat ttccaggctg 960gaatcctgcc ctccacaaca tgcgaacaat acccgtgttg catatagagc atggctgtga1020agagttgagt gagtgcccac aaagcactta gagcagtgtc tggtacatgc tattactccg1080cagcgggaaa ccacttcctc ctttgtcttc tgggcacttt tgtgagtgaa aggaggcact1140aataacaatc acactgggat acctgtatat actggaatgc cccaggcaaa ccaggcttaa1200actgtattac tctatctgta gcttaaacta acaaacaacc cacacaaatc acattttgtt1260cttcaggcga ttcaggaagg cctattaggc agggactgcc attttctctc tgagacaaac1320atcattccat aaactggccc acggtgggtg gcagagggag agggcccagg tgggggcgga1380cactattgcc tgcacagtga tgtggaacca gaaagctgac tctggatgca ggaaaaaggt1440cagggttgca tttcccttcc ttgcttcttg atgggtgatc aatttttttg aaatacggac1500gtcccaaggc caatgagact ggtgtcattc cagaaaaggg ccactctgtg ggcgggtcgg1560tgggagggta cctgaaggtg gggtcaaggg aggccccaaa acagtctaca cagcaggagg1620gatggctggg gctcttgagc tataagtggc acctcagggc cctgacgggc gtctcgccat1680gctgctcctg ggcctgctgc tgctgcccct gctggctggc gcccgcctgc tgtggaactg1740
gtggaagctc cggagcctcc acctcccgcc tcttgccccg ggcttcttgc acttgctgca1800gcccgacctc ccaatctatc tgcttggcct gactcagaaa ttcgggccca tctacaggct1860ccaccttggg ctgcaaggtg agaggctgat ctcgctctgg ccctcaccat aggagggggc1920ggaggtgacg gagagggtcc tctctccgct gacgctgctt tggctgtctc ccagatgtgg1980tggtgctgaa ctccaagagg accattgagg aagccatggt caaaaagtgg gcagactttg2040ctggcagacc tgagccactt acctgtaagg gctgggggca ttttttcttt cttaaacaaa2100ttttttttta agagatgggt tcttgctatg ttgcccaggc tggtcttaaa ttcctagtct2160caaatgatcc tcccacctca gcctcaagtg tgagccacct ttggggcatc cccaatccag2220gtccctggaa gctcttgggg ggcatatctg gtggggagaa agcaggggtt ggggaggccg2280aagaaggtca ggccctcagc tgccttcatc agttcccacc ctccagcccc cacctcctcc2340tgcagacaag ctggtgtcta agaactaccc ggacctgtcc ttgggagact actccctgct2400ctggaaagcc cacaagaagc tcacccgctc agccctgctg ctgggcatcc gtgactccat2460ggagccagtg gtggagcagc tgacccagga gttctgtgag gtaaggctgg gctcctgagg2520ccacctcggg tcagcctcgc ctctcacagt agcccccgcc ctgccgctgc acagcggcct2580gctgaactca cactgtttct ccacagcgca tgagagccca gcccggcacc cctgtggcca2640ttgaggagga attctctctc ctcacctgca gcatcatctg ttacctcacc ttcggagaca2700agatcaaggt gcctcacagc ccctcaggcc cacccccagc ccctccctga gcctctcctt2760gtcctgaact gaaagtactc cctccttttc tggcaggacg acaacttaat gcctgcctat2820tacaaatgta tccaggaggt gttaaaaacc tggagccact ggtccatcca aattgtggac2880gtgattccct ttctcagggt gaggacctgg agcctagaca cccctgggtt gtaggggaga2940ggctggggtg gagggagagg ctccttccca cagctgcatt ctcatgcttc ctgccgcagt3000tcttccccaa tccaggtctc cggaggctga agcaggccat agagaagagg gatcacatcg3060tggagatgca gctgaggcag cacaaggtgg ggactgtacg tggacggcct cccctcggcc3120cacagccagt gatgctaccg gcctcagcat tgctatgagg cgggttcttt tgcatacccc3180agttatgggc ctgttgccac tctgtactcc tctccccagg ccagccgctc agcccgctcc3240tttcaccctc tgcaggagag cctcgtggca ggccagtgga gggacatgat ggactacatg3300ctccaagggg tggcgcagcc gagcatggaa gagggctctg gacagctcct ggaagggcac3360gtgcacatgg ctgcagtgga cctcctgatc ggtggcactg agaccacagc aaacaccctc3420tcctgggccg tggttttttt gcttcaccac cctgaggtgc gtcctgggga caagcaaaag3480gctccttccc agcaacctgg ccagggcggt gggcaccctc actcagctct gagcactgtg3540cggctggggc tgtgcttgcc tcaccggcac tcaggctcac tgggttgctg agggagcggc3600
tggaggctgg gcagctgtgg gctgctgggg caggactcca cccgatcatt ccccagattc3660agcagcgact gcaggaggag ctagaccacg aactgggccc tggtgcctcc agctcccggg3720tcccctacaa ggaccgtgca cggctgccct tgctcaatgc caccatcgcc gaggtgctgc3780gcctgcggcc cgttgtgccc ttagccttgc cccaccgcac cacacggccc agcaggtgac3840tcccgagggt tggggatgag tgaggaaagc ccgagcccag ggaggtcctg gccagcctct3900aactccagcc cccttcagca tctccggcta cgacatccct gagggcacag tcatcattcc3960gaacctccaa ggcgcccacc tggatgagac ggtctgggag aggccacatg agttctggcc4020tggtatgtgg gggccggggg cctgccgtca aaatgtggtg gaggctggtc cccgctgccg4080ctgaacgcct ccccacccac ctgtccaccc gcccgcagat cgcttcctgg agccaggcaa4140gaactccaga gctctggcct tcggctgcgg tgccccggtg tgcctgggcg agccgctggc4200gcgcctggac ctcttcgtgg tgctgacccg actgctgcag gccttcacgc tgctgccctc4260cggggacgcc ctgccctccc tgcagcccct gccccactgc agtgtcatcc tcaagatgca4320gcctttccaa gtgcggctgc agccccgggg gatgggggcc cacagcccag gccagaacca4380gtgatggggc aggaccgatg ccagccgggt acctcagttt ctcctttatt gctcccgtac4440gaacccctcc cctcccccct gtaaacacag tgctgcgaga tcgctggcag agaaggcttc4500ctccagcggc tgggtggtga aggaccctgg ctcttctctc ggggcgaccc ctcagtgctc4560ggcagtcata ctggggtgcg agagaggtgg gcagcagctc agcctccccc cgctggggag4620cgaaagtttc ttggtctcag cttcatttcc gtgaagggca ccgagaactc gaagcccttc4680cagtggtacc agctcactcc ctgggaaagg ggttgtcaag agagagtcaa agccggatgt4740cccatctgct cttcccgttc cccttaagga ggtagctccc agcactcaac caacctcccc4800gcagagctcc cttcctgacc ctccgctgca gaggattgag gcttaattct gagctggccc4860tttccagcca ataaatcaac tccagctccc tctgcgaggc tggcatgatt gttccatttc4920acccagccgc tcagtccctt gcctgttaca ctgtggggct gaaacctagg caggccgagc4980cccagccacc ccagctctga gccggcctcc ccacccctca cctgatggtc cactgtgctc5040ccgtagagcc cgttgaggtt ggcgtagtgg cagttcctgt accaccaggc ccctcggtag5100gagacagcgc aggagatgag caagctgttg gggtcccgat c5141<210>21<211>1117<212>DNA<213>人<220>
<221>推測的腫瘤抑制蛋白(101F6)<222>(1)..(1117)<223>GenBank accession No.AF040704<400>21tccggaagta aagcggctcc gtgacggagc ggcggtgcgc gcggcagggc ccggagtatc 60ccgctttctt tggaggaaac caccgcatca gatctgcgct gcggcagagg caggctacaa 120ccactagcac ggctgacgat ggccctttct gcggagaccg agtcacacat ctaccgagct 180ctgcgtactg cttctggcgc tgccgcccac cttgtggccc tgggctttac catctttgtg 240gctgtgcttg ccaggcctgg ctccagcctg ttctcctggc acccggtgct tatgtctttg 300gctttctcct tcctgatgac cgaggcacta ctggtgtttt ctcctgagag ttcgctgctg 360cactccctct cacggaaagg ccgagcacgc tgccactggg tgctgcagct gctggccctg 420ctgtgtgcac tgctgggcct cggccttgtc atcctccaca aagagcagct tggcaaagcc 480cacctggtta cgcggcatgg gcaggcaggg ctgctggctg tgctgtgggc agggctgcag 540tgctcaggtg gggtggggct gctctacccc aagctgctgc cccgatggcc cctggcgaag 600ctcaagctat accatgctac ttctgggctg gtgggctacc tgctgggtag tgccagcctc 660ttgctgggca tgtgctcact ctggttcact gcctctgtca ctggtgcagc ctggtacctg 720gctgtattat gccctgtcct caccagcttg gtcattatga accaggtgag caatgcctac 780ctataccgca agaggatcca accatgagct cttcccagcc taggggaagc ctggatttgc 840ccctccatgt aggagctggg cctagggacc tgttgaactc tctcagctga gtcaggggac 900acctcaggca ctgggacagt tgggcatttg gaggcccgtg tgtgaattcc tgctcctcat 960gctggagtgc ctcccatttc cttccccttt ctctgtcatc ccagaggaac ataggcatca1020tgtgtctgga tgaagctggg gctgcaagac tgcctctcct gcaaggcagc tcatacttgt1080actgtatgtt cagaaatttt aggagagaaa aaagtaa 1117<210>22<211>4396<212>DNA<213>人<220>
<221>轉(zhuǎn)錄因子E2A<222>(1)..(4396)<223>GenBank accession No.M31523<400>22gcctgaggtg cccgccctgg ccccaggaga atgaaccagc cgcagaggat ggcgcctgtg 60ggcacagaca aggagctcag tgacctcctg gacttcagca tgatgttccc gctgcctgtc120accaacggga agggccggcc cgcctccctg gccggggcgc agttcggagg ttcaggtctt180
gaggaccggc ccagctcagg ctcctggggc agcggcgacc agagcagctc ctcctttgac 240cccagccgga ccttcagcga gggcacccac ttcactgagt cgcacagcag cctctcttca 300tccacattcc tgggaccggg actcggaggc aagagcggtg agcggggcgc ctatgcctcc 360ttcgggagag acgcaggcgt gggcggcctg actcaggctg gcttcctgtc aggcgagctg 420gccctcaaca gccccgggcc cctgtcccct tcgggcatga aggggacctc ccagtactac 480ccctcctact ccggcagctc ccggcggaga gcggcagacg gcagcctaga cacgcagccc 540aagaaggtcc ggaaggtccc gccgggtctt ccatcctcgg tgtacccacc cagctcaggt 600gaggactacg gcagggatgc caccgcctac ccgtccgcca agacccccag cagcacctat 660cccgccccct tctacgtggc agatggcagc ctgcacccct cagccgagct ctggagtccc 720ccgggccagg cgggcttcgg gcccatgctg ggtgggggct catccccgct gcccctcccg 780cccggtagcg gcccggtggg cagcagtgga agcagcagca cgtttggtgg cctgcaccag 840cacgagcgta tgggctacca gctgcatgga gcagaggtga acggtgggct cccatctgca 900tcctccttct cctcagcccc cggagccacg tacggcggcg tctccagcca cacgccgcct 960gtcagcgggg ccgacagcct cctgggctcc cgagggacca cagctggcag ctccggggat1020gccctcggca aagcactggc ctcgatctac tccccggatc actcaagcaa taacttctcg1080tccagccctt ctacccccgt gggctccccc cagggcctgg caggaacgtc acagtggcct1140cgagcaggag cccccggtgc cttatcgccc agctacgacg ggggtctcca cggcctgcag1200agtaagatag aagaccacct ggacgaggcc atccacgtgc tccgcagcca cgccgtgggc1260acagccggcg acatgcacac gctgctgcct ggccacgggg cgctggcctc aggtttcacc1320ggccccatgt cgctgggtgg gcggcacgca ggcctggttg gaggcagcca ccccgaggac1380ggcctcgcag gcagcaccag cctcatgcac aaccacgcgg ccctccccag ccagccaggc1440accctccctg acctgtctcg gcctcccgac tcctacagtg ggctagggcg agcaggtgcc1500acggcggccg ccagcgagat caagcgggag gagaaggagg acgaggagaa cacgtcagcg1560gctgaccact cggaggagga gaagaaggag ctgaaggccc cccgggcccg gaccagccca1620gacgaggacg aggacgacct tctcccccca gagcagaagg ccgagcggga gaaggagcgc1680cgggtggcca ataacgcccg ggagcggctg cgggtccgtg acatcaacga ggcctttaag1740gagctggggc gcatgtgcca actgcacctc aacagcgaga agccccagac caaactgctc1800atcctgcacc aggctgtctc ggtcatcctg aacttggagc agcaagtgcg agagcggaac1860ctgaatccca aagcagcctg tttgaaacgg cgagaagagg aaaaggtgtc aggtgtggtt1920ggagaccccc agatggtgct ttcagctccc cacccaggcc tgagcgaagc ccacaacccc1980gccgggcaca tgtgaaaggt atgcctccgt gggacgagcc acccgctttc agccctgtgc2040
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ccccatggta gatgcaaggg aaacctcaag gccagctcaa tgcctggtat ctgcccccag3960tccaggccag gcggagggga ggggctgtcc ggctgcctct cccttctcgg tggcttcccc4020tgcgccctgg gagtttgatc tcttaaggga acttgcctct ccctcttgtt ttgctcctgc4080cctgccccta ggtctgggtg gcagtggccc catagcctct ggaactgtgc gttctgcata4140gaattcaaac gagattcacc cagcgcgagg aggaagaaac agcagttcct gggaaccaca4200attatggggg gtggggggtg tgatctgagt gcctcaagat ggttttcaaa aaattttttt4260taaagaaaat aattgtatac gtgtcaacac agctggctgg atgattggga ctttaaaacg4320accctctttc aggtggattc agagacctgt cctgtatata acagcactgt agcaataaac4380gtgacatttt ataaag4396<210>23<211>4133<212>DNA<213>人<220>
<221>KIAA0691<222>(1)..(4133)<223>GenBank accession No.AB014591<400>23aaattctccc tgggggtaag gtaccagccc tgtcctttat gggcttcttg ttctaaagca 60tatccgtccc atatggttgc tgctagtcac atgtggtgat tagtaactag ttaaaaatga120aaaattcagt tcctccatta cacttgccac atttcagatg ttcagtggcc aacagatatg180cgcaaataga gtgtttccag cattgcaaag ttctgttgga tagcactgtt tgccagatgt240tcccttcttt gtgggtgagg actcttttgg tgtgacttcc ctctgtattg aggctcttgt300tcctcagtat ggggctgttt ctgtctttac agtaagtgac tactccaggg ttccctgccc360tgcacacgta gagtgggagc ggcccgtgga tcccagggaa ctgtgctttt cattgtaggc420cccctccctg gaggggaaga gggcaatctc cgctggtatc tcagaagtct tcttctgagg480cataagcctc tcttcccagg gctcccctgg tctcgctgtc aggccctaag gtatgtcttc540ccttggacta aagctccttg gaactccctt ttgacctcag tcttctctgg gttccaggta600acttccttta aaataaagac gctcctctct tgaagttttg ggttcctgcc ctgatggtct660atgtctccct gactctaaat taccaatcca cttgctatgg gattcctcca tgagtgcaga720ttggctccct cacagctgcg gtacctttgc accctcttat cttagtaaga tttctgtctt780ctcccaggtc tctcttgggt actgccttct gcccccaaat ctctaagcct tcttggtatt840agcttctttg ggttaggagt gttatttcct tttggtttaa ggatcctgct ctggaataaa900
tgtcttggtg gtttgagtcc cttctacttg gcattcagcc ctgtctgcat gagcgggttc 960agctcttcac agctttcggc atctctgctc gccgtcgttt tcccccaccc ccaatctttc1020ttctcctacc tacagcttac acacacacac acacacacac acacacacac acgcccttct1080ctgtgagctg ccagtttcat ttgtctcctg acttgtctga gggatgacct ctcctagcca1140cctctgccca gcccctctga gtaggaagtg tgatttccag ggctaatgcc tccatcccag1200tcatcagctg tgtgcagcat gactgtcctg ctctgaaaaa cctttttgag tgtattctgg1260gggaaggtac tccatgctct aggaattttc cacttcctga gtcagaggca cacaaaaaag1320tatgtaactt ttcttgtttc aacaaactta tggggtcccc tgttggccag acactatgct1380gggcagtcaa gcgagcatca ggagaactgg ggctggtctc ttgtcagata gcaaatgctt1440cttctcttta ccagtcccac ctacctcact atgctgacta ggtccatgtc tctgggtttt1500taccagccag ggaatacgtg ttaattcctc tccaatctct cctagcagcg tccgtctcca1560agagagtatg aagagagtgc gtctgtaggg cagggaagat ggcggacaag cgcaaactcc1620aaggtgagat tgatcgctgc ctcaagaagg tgtccgaggg cgtggagcag tttgaagata1680tttggcagaa gctccacaat gcagccaacg cgaaccagaa agaaaagtat gaggctgacc1740taaagaagga gattaagaag ctacaacggc tgagggacca aatcaagaca tgggtagcgt1800ccaacgagat caaggacaag aggcagctta tagacaaccg caagctcatt gagacgcaaa1860tggaacggtt caaagttgtg gaacgagaga ccaaaaccaa agcttacagc aaagagggcc1920tgggcctggc ccagaaggta gatcctgccc agaaggagaa ggaagaggtt ggccagtggc1980tcacgaatac catcgacacg ctcaacatgc aggtggacca gtttgagagt gaagtggagt2040cactgtcagt gcagacacgc aagaagaagg gcgacaagga taagcaggac cggattgagg2100gcttgaagcg gcacatcgag aagcaccgct accacgtgcg catgctagag accatcctgc2160gcatgctgga caatgactcc atcctcgttg acgccatccg caagatcaag gacgacgttg2220agtactatgt tgactcatcc caggaccccg acttcgagga gaacgagttt ctctacgatg2280acctggacct cgaggacatt ccacaggcgc tggtcgccac ctcccccccc agccacagcc2340acatggagga tgagatcttc aaccagtcca gcagcacgcc cacctcaacc acctccagct2400ctcccatccc gcccagccca gccaactgta ccacggaaaa ctctgaagat gataagaaga2460ggggacgttc cacagacagt gaagtcagcc agtctccagc caaaaacggc tccaagcctg2520tccacagcaa ccagcaccct cagtccccag ctgtgccgcc cacctacccc tccggccccc2580cgcctgctgc ctctgccttg agcaccactc ctggcaacaa tggggtcccc gcccccgcag2640cacccccaag tgccctgggc cccaaggcca gtccagctcc cagccacaac tcgggcaccc2700ctgctcccta tgcccaggct gtggccccac cagctcccag tgggcccagc acgacccagc2760
cccggccccc cagcgtccag cctagcggag gcggaggcgg cggcagcgga ggcggaggga2820gcagcagcag tagtaacagc agtgccggtg gaggggctgg caagcagaat ggcgccacca2880gttacagctc agttgtggca gacagcccgg cagaggtggc tttgagcagc agtgggggca2940acaatgccag cagccaggcc ttgggccccc cttccggccc ccacaaccca cctcccagca3000cctcgaagga acccagtgcg gcagccccaa cgggggctgg gggcgtggcc ccaggctcag3060ggaacaactc agggggaccc agcctcctgg tgccactgcc tgtgaatcct cccagctccc3120caacgcccag cttcagtgat gccaaggcag ccggtgccct gctcaatggg cctccacagt3180tcagcaccgc cccagaaatc aaggcccctg agcctctgag ctccttgaag tccatggcgg3240aacgggcagc catcagctct ggcattgagg accctgtgcc aacgctgcac ctgaccgagc3300gagacatcat cctgagcagt acatcagcac ctccggcctc agcccagccg cccctgcagc3360tgtcagaggt gaacataccg ctgtcgctgg gtgtctgtcc actgggccct gtgcccctca3420ccaaggagca gctctatcag caggccatgg aagaggccgc ctggcaccac atgcctcacc3480cctctgactc tgagcgtatt cggcagtacc tcccccggaa cccctgtccg acgcccccct3540accaccacca gatgccaccc ccacactcgg acactgtgga attctaccag cgcctgtcga3600ccgagacact cttcttcatc ttctactatc tggagggcac taaggcacag tatctggcag3660ccaaggccct aaagaagcag tcatggcgat tccacaccaa gtacatgatg tggttccaga3720ggcacgagga gcccaagacc atcactgacg agtttgagca gggcacctac atctactttg3780actacgagaa gtggggccag cggaagaagg aaggcttcac ctttgagtac cgctacctgg3840aggaccggga cctccagtga caccggcccc tccctctacc cacccccttc ccccgcatgc3900tgatccccct gcccaggtga gggccctgcc ctggaagact ggagggaggc cccaagccac3960ggggcatccc cctctcccag gaagcaggga gggggccggg aggttttcct ctcagcccca4020ccctgggggc ccgggggcga gggctgcccc ctcctcccct ccccagtgag ggacattttt4080tggtaaacct attttcattt tggaaaatat ttatgaataa atagttttat atg 4133<210>24<211>1260<212>DNA<213>人<220>
<221>5-羥色胺1D受體5-HT1D<222>(1)..(1260)<223>Genank accession No.M81590<400>24ccctctcctt cgtccgctcc atgcccaaga gctgcgctcc ggagctgggg cgaggagagc 60
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<221>凝血因子XII(Hageman因子)<222>(1)..(1990)<223>GenBank accession No.M31315<400>25ctgctgctcc tggggttcct gctggtgagc ttggagtcaa cactttcgat tccaccttgg 60gaagccccca aggagcataa gtacaaagct gaagagcaca cagtcgttct cactgtcacc120ggggagccct gccacttccc cttccagtac caccggcagc tgtaccacaa atgtacccac180aagggccggc caggccctca gccctggtgt gctaccaccc ccaactttga tcaggaccag240
cgatggggat actgtttgga gcccaagaaa gtgaaagacc actgcagcaa acacagcccc 300tgccagaaag gagggacctg tgtgaacatg ccaagcggcc cccactgtct ctgtccacaa 360cacctcactg gaaaccactg ccagaaagag aagtgctttg agcctcagct tctccggttt 420ttccacaaga atgagatatg gtatagaact gagcaagcag ctgtggccag atgccagtgc 480aagggtcctg atgcccactg ccagcggctg gccagccagg cctgccgcac caacccgtgc 540ctccatgggg gtcgctgcct agaggtggag ggccaccgcc tgtgccactg cccggtgggc 600tacaccggac ccttctgcga cgtggacacc aaggcaagct gctatgatgg ccgcgggctc 660agctaccgcg gcctggccag gaccacgctc tcgggtgcgc cctgtcagcc gtgggcctcg 720gaggccacct accggaacgt gactgccgag caagcgcgga actggggact gggcggccac 780gccttctgcc ggaacccgga caacgacatc cgcccgtggt gcttcgtgct gaaccgcgac 840cggctgagct gggagtactg cgacctggca cagtgccaga ccccaaccca ggcggcgcct 900ccgaccccgg tgtcccctag gcttcatgtc ccactcatgc ccgcgcagcc ggcaccgccg 960aagcctcagc ccacgacccg gaccccgcct cagtcccaga ccccgggagc cttgccggcg1020aagcgggagc agccgccttc cctgaccagg aacggcccac tgagctgcgg gcagcggctc1080cgcaagagtc tgtcttcgat gacccgcgtc gttggcgggc tggtggcgct acgcggggcg1140cacccctaca tcgccgcgct gtactggggc cacagtttct gcgccggcag cctcatcgcc1200ccctgctggg tgctgacggc cgctcactgc ctgcaggacc ggcccgcacc cgaggatctg1260acggtggtgc tcggccagga acgccgtaac cacagctgtg agccgtgcca gacgttggcc1320gtgcgctcct accgcttgca cgaggccttc tcgcccgtca gctaccagca cgacctggct1380ctgttgcgcc ttcaggagga tgcggacggc agctgcgcgc tcctgtcgcc ttacgttcag1440ccggtgtgcc tgccaagcgg cgccgcgcga ccctccgaga ccacgctctg ccaggtggcc1500ggctggggcc accagttcga gggggcggag gaatatgcca gcttcctgca ggaggcgcag1560gtaccgttcc tctccctgga gcgctgctca gccccggacg tgcacggatc ctccatcctc1620cccggcatgc tctgcgcagg gttcctcgag ggcggcaccg atgcgtgcca gggtgattcc1680ggaggcccgc tggtgtgtga ggaccaagct gcagagcgcc ggctcaccct gcaaggcatc1740atcagctggg gatcgggctg tggtgaccgc aacaagccag gcgtctacac cgatgtggcc1800tactacctgg cctggatccg ggagcacacc gtttcctgat tgctcaggga ctcatctttc1860cctccttggt gattccgcag tgagagagtg gctggggcat ggaaggcaag attgtgtccc1920attcccccag tgcggccagc tccgcgccag gatggcgagg aactcaataa agtgctttga1980aaatgctgag 1990
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<221>原癌基因酪氨酸蛋白激酶c-abl<222>(1)..(3840)<223>GenBank accession No.M14752<400>26ggccttcccc ctgcgaggat cgccgttggc ccgggttggc tttggaaagc ggcggtggct 60ttgggccggg ctcggcctcg ggaacgccag gggcccctgg gtgcggacgg gcgcggccag 120gagggggtta aggcgcaggc ggcggcgggg cgggggcggg cctggcgggc gccctctccg 180ggccctttgt taacaggcgc gtcccggcca gcggagacgc ggccgccctg ggcgggcgcg 240ggcggcgggc ggcggtgagg gcggcctgcg gggcggcgcc cgggggccgg gccgagccgg 300gcctgagccg ggcccggacc gagctgggag aggggctccg gcccgatcgt tcgcttggcg 360caaaatgttg gagatctgcc tgaagctggt gggctgcaaa tccaagaagg ggctgtcctc 420gtcctccagc tgttatctgg aagaagccct tcagcggcca gtagcatctg actttgagcc 480tcagggtctg agtgaagccg ctcgttggaa ctccaaggaa aaccttctcg ctggacccag 540tgaaaatgac cccaaccttt tcgttgcact gtatgatttt gtggccagtg gagataacac 600tctaagcata actaaaggtg aaaagctccg ggtcttaggc tataatcaca atggggaatg 660gtgtgaagcc caaaccaaaa atggccaagg ctgggtccca agcaactaca tcacgccagt 720caacagtctg gagaaacact cctggtacca tgggcctgtg tcccgcaatg ccgctgagta 780tccgctgagc agcgggatca atggcagctt cttggtgcgt gagagtgaga gcagtcctag 840ccagaggtcc atctcgctga gatacgaagg gagggtgtac cattacagga tcaacactgc 900ttctgatggc aagctctacg tctcctccga gagccgcttc aacaccctgg ccgagttggt 960tcatcatcat tcaacggtgg ccgacgggct catcaccacg ctccattatc cagccccaaa1020gcgcaacaag cccactgtct atggtgtgtc ccccaactac gacaagtggg agatggaacg1080cacggacatc accatgaagc acaagctggg cgggggccag tacggggagg tgtacgaggg1140cgtgtggaag aaatacagcc tgacggtggc cgtgaagacc ttgaaggagg acaccatgga1200ggtggaagag ttcttgaaag aagctgcagt catgaaagag atcaaacacc ctaacctagt1260gcagctcctt ggggtctgca cccgggagcc cccgttctat atcatcactg agttcatgac1320ctacgggaac ctcctggact acctgaggga gtgcaaccgg caggaggtga acgccgtggt1380gctgctgtac atggccactc agatctcgtc agccatggag tacctagaga agaaaaactt1440catccacaga gatcttgctg cccgaaactg cctggtaggg gagaaccact tggtgaaggt1500
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ttccactgcc ttcatccctc tcatatcaac ccgagtgtct cttcggaaaa cccgccagcc3420tccagagcgg gccagcggcg ccatcaccaa gggcgtggtc ttggacagca ccgaggcgct3480gtgcctcgcc atctctggga actccgagca gatggccagc cacagcgcag tgctggaggc3540cggcaaaaac ctctacacgt tctgcgtgag ctatgtggat tccatccagc aaatgaggaa3600caagtttgcc ttccgagagg ccatcaacaa actggagaat aatctccggg agcttcagat3660ctgcccggcg tcagcaggca gtggtccggc ggccactcag gacttcagca agctcctcag3720ttcggtgaag gaaatcagtg acatagtgca gaggtagcag cagtcagggg tcaggtgtca3780ggcccgtcgg agctgcctgc agcacatgcg ggctcgccca tacccatgac agtggctgag3840<210>27<211>1628<212>DNA<213>人<220>
<221>AF1q<222>(1)..(1628)<223>GenBank accession No.U16954<220>
<221>misc_feature<222>(114)..(114)<223>不明確的核苷酸<400>27agtcagcacg ggggtgctgg aagagatcgg gaataatagc gcagaccaat gagcctaggg 60agatgctttc atcgtctctc cttccctcaa gtgttctgga acctatcatt tganttagcc120gagtcaggca ggagggggcg gggaatcctt ccgcccttct taggaggggc tgcattgcag180ggggagagtg aactgacaga ctcagtcact gaagagggaa aaggagtgag aagacaaagc240cgtcaaagcc ccaacagctt tgtatttctc cagcccggcc ggcagacccc ggagctcccg300aggcactccc tccatctttg gaacgcgcca gtaattgaat tgataacagg aagctatgag360ggaccctgtg agtagccagt acagttcctt tcttttctgg aggatgccca tcccagaact420ggatctgtcg gagctggaag gcctgggtct gtcagataca gccacctaca aggtcaaaga480cagcagcgtt ggcaaaatga tcgggcaagc aactgcagca gaccaggaga aaaaccctga540aggtgatggc ctccttgagt acagcacctt caacttctgg agagctccca ttgccagcat600ccactccttc gaactggact tgctctaagg ccaagacttc tctctcccat caccttgccc660tcattgtctt ccctctcaag ccccttcctt tccactcctt tcccatttta atcttgttct720ctccctactg tgttggtggt gctgatgaat ctgccagagt tgagttctat gtatttattt780atctatctgt ctactccatt tctctcaaaa gccctcaagt cacaaagtaa atggttcaag840
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<221>胍乙酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶<222>(1)..(993)<223>GenBank accession No.Z49878<400>28cggcggcgcg cgatcgaggt cgggtcgccg tccagcctgc agcatgagcg cccccagcgc 60gacccccatc ttcgcgcccg gcgagaactg cagccccgcg tggggggcgg cgcccgcggc120ctacgacgca gcggacacgc acctgcgcat cctgggcaag ccggtgatgg agcgctggga180gaccccctat atgcacgcgc tggccgccgc cgcctcctcc aaagggggcc gggtcctgga240ggtgggcttt ggcatggcca tcgcagcgtc aaaggtgcag gaggcgccca ttgatgagca300ttggatcatc gagtgcaatg acggcgtctt ccagcggctc cgggactggg ccccacggca360gacacacaag gtcatcccct tgaaaggcct gtgggaggat gtggcaccca ccctgcctga420cggtcacttt gatgggatcc tgtacgacac gtacccactc tcggaggaga cctggcacac480acaccagttc aacttcatca agaaccacgc ctttcgcctg ctgaagccgg ggggcgtcct540cacctactgc aacctcacct cctgggggga gctgatgaag tccaagtact cagacatcac600
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<221>干擾素誘導(dǎo)的核磷蛋白<222>(1)..(835)<223>Genbank accession No.as of 09 Dec 2002L22342<400>29atggcgagca gcggagtcaa gaacacacca cgatggcgga gaaaagcccc tcatgggagg 60gaaaggaaag agaaaggaaa gaaaagaaaa agatgtatct ggtcaactcc aaaaaggaga 120cataagaaaa aaagcctccc aagagagatc attgatggca cttcagaaat gaatgaagga 180aagaggtccc agaagatgcc tagtacacca cgaagggtca cacaaggggc agcctcacct 240gggcatggca tccaagagaa gctccaagtg gtggataagg tgactcaaag gaaagacgac 300tcaacctgga actcagaggt catgatgagg gtccaaaagg caagaactaa atgtgcccga 360aagtccagat cgaaagaaaa gaaaaaggag aaagatatct gttcaagctc aaaaaggaga 420tttcagaaaa atattcaccg aagaggaaaa cccaaaagtg acactgtgga ttttcactgt 480tctaagtccc ccgtgacctg tggtgaggcg aaagggattt tatataagaa gaaaatgaaa 540cacggatcct cagtgaagtg cattcggaat gaggatggaa cttggttaac accaaatgaa 600tttgaagtcg aaggaaaagg aaggaacgca aagaactgga aacggaatat acgttgtgaa 660ggaatgaccc taggagagct gctgaagagt ggacttttgc tctgtcctcc aagaataaat 720ctcaagagag agttaaatag caagtgaatt tctactaccc tctcagtcac catgttgcag 780actttccctg tctggaggct caccttagag cttctgagtt tccaagcccg gaatt 83權(quán)利要求
1.一種測定能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物的生物活性的方法，包括以下步驟a)使宿主和化合物接觸；b)測定宿主的總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答；并且c)對所述化合物誘導(dǎo)的總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答進(jìn)行定量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答通過DNA陣列技術(shù)來測定。
3.權(quán)利要求2的方法，其中DNA陣列技術(shù)為寡核苷酸陣列技術(shù)。
4.權(quán)利要求1-3的任意一項(xiàng)的方法，其中化合物為修飾的化合物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中修飾的化合物是修飾的蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中修飾的蛋白質(zhì)是聚乙二醇化蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中聚乙二醇化蛋白質(zhì)是聚乙二醇化蛋白質(zhì)的特定的分離的同種型。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其中聚乙二醇化蛋白質(zhì)是Epo或IFN。
9.權(quán)利要求1-8的任意一項(xiàng)的方法，其中被轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的基因是選自SEQ ID No.1到29的一個(gè)或多個(gè)基因。
10.一種測定修飾的化合物的相對生物活性的方法，包括用權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的方法測量修飾的化合物和相應(yīng)的未修飾化合物的生物活性，其中修飾蛋白的相對轉(zhuǎn)錄活性由計(jì)算出的修飾化合物與未修飾化合物的生物活性之比確定。
11.權(quán)利要求8的方法，其中修飾化合物是化學(xué)或酶學(xué)方法修飾的化合物。
12.權(quán)利要求9的方法，其中修飾化合物是聚乙二醇化蛋白質(zhì)。
13.一種鑒定能間接調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物的方法，其包括用權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法測定已知為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的第一化合物在有或沒有第二化合物存在的條件下的生物活性，若第一化合物在有所述第二化合物存在時(shí)測定到的生物活性顯著不同于第一化合物在沒有所述第二化合物存在時(shí)測定到的生物活性，則鑒定到能夠間接調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中已知的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑是Epo或IFN。
15.通過權(quán)利要求1-14的方法所鑒定到的能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物。
16.權(quán)利要求1-14的方法在鑒定能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的化合物中的用途。
17.包含用于實(shí)施權(quán)利要求1-14的方法的成分的試劑盒。
18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述的成分包含DNA陣列。
19.藥物組合物，其包含權(quán)利要求15的化合物以及可藥用載體。
20.權(quán)利要求15的化合物或其可藥用鹽在制備用于治療疾病，優(yōu)選病毒性疾病或癌癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于測定化合物的生物活性的新方法，包括步驟a)使宿主和化合物接觸；b)測定宿主的總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答；c)對所述化合物誘導(dǎo)的總體轉(zhuǎn)錄基因應(yīng)答進(jìn)行定量。
文檔編號A61P35/00GK1532292SQ200410029500
公開日2004年9月29日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月21日
發(fā)明者U·塞爾塔, S·福瑟爾, K·韋耶, , U 塞爾塔 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司, 弗 哈夫曼-拉羅切有限公司