專利名稱：治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服液及其制取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種用于治療炎癥性牙槽骨吸收和其它破骨細(xì)胞性骨吸收疾病或骨質(zhì)疏松性疾病的藥物，尤其是一種能阻斷牙槽骨吸收或促進(jìn)牙槽骨再生的單方劑地龍口服液及其制取方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，骨代謝是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，該平衡的失調(diào)將引發(fā)骨代謝性疾病，例如牙周炎是各國(guó)人群中最為常見(jiàn)的口腔疾病之一，其主要病理改變之一是牙槽骨的吸收，從而導(dǎo)致牙松動(dòng)甚至脫落。牙槽骨是人體骨骼中代謝最為活躍的骨組織，正常生理情況下，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞平衡維持著牙槽骨代謝的穩(wěn)定；但牙周感染時(shí)，細(xì)菌內(nèi)毒素及多種炎性因子誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化、增殖，故抑制了成骨細(xì)胞的活性，使牙槽骨代謝平衡失調(diào)，從而出現(xiàn)病理性牙槽骨吸收。目前是在臨床上治療牙槽骨吸收，是采用自體骨或人工骨植入；該治療方法因自體損傷大、生物相容性差、對(duì)手術(shù)醫(yī)生的操作要求高、價(jià)格昂貴而受到制約，故難以在基層醫(yī)院推廣。因此人們期望得到一種能方便服用的、內(nèi)含有效治療牙槽骨吸收及骨科的其它疾病的中草藥制劑。
一種在中醫(yī)骨傷科方劑中較為常見(jiàn)的中藥-地龍，其拉丁文名為Pheretima guillelmi、是矩蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓或縞蚯蚓的干燥體。據(jù)我國(guó)有關(guān)藥典介紹，地龍含有多糖以及蚯蚓解熱堿(Lum-brofebrine)、蚯蚓素(Lumbrilin)、蚯蚓毒素(Terrestro-Lumbroly-sin)、氨基酸類、嘌呤類、膽堿、脂肪酸、微量元素、多種維生素和大量蛋白質(zhì)，還有人體所必需的八種氨基酸，它具有促進(jìn)骨折愈合、強(qiáng)骨補(bǔ)腎的功效，故長(zhǎng)期以來(lái)，地龍出現(xiàn)在中醫(yī)骨傷科的多方劑中草藥中，通過(guò)水煎成湯藥或壓研成粉末伴入藥劑。但遺憾的是人們至今還沒(méi)有對(duì)地龍的療效有準(zhǔn)確的了解，特別是對(duì)單方劑地龍能否有效抑制骨質(zhì)吸收、促進(jìn)骨質(zhì)再生等方面缺少研究、更無(wú)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，因此也就無(wú)法將藥典中記載的內(nèi)含眾多有效成份的單方劑地龍制成成藥、用于治療牙槽骨吸收及骨科的其它疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決人們長(zhǎng)期以來(lái)期望得到的一種能以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其確實(shí)有效治療牙槽骨吸收及骨科其它疾病的中草藥制劑的問(wèn)題，提供一種治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服液及其制取方法，并使該口服液具有療效可靠、其制取方法科學(xué)可行、制作簡(jiǎn)便且成本低等特點(diǎn)。
本發(fā)明治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服液，是一種多糖含量在10％以上的地龍水提液或地龍醇提液。
上述的單方劑地龍口服液的制取方法包含以下的步驟1)取用地龍，經(jīng)清洗、干燥并粉碎成粉料；2)取用提取液，該提取液是蒸餾水或95％乙醇，然后將地龍粉料和蒸餾水或95％乙醇以1∶10(W∶V)的比例混合均勻后，通過(guò)沸水回流3～10h進(jìn)行粗濾，并在其濾渣中再以上述比例加蒸餾水或95％乙醇進(jìn)行沸水回流3～10h、其后再粗濾；3)合并上述的兩次濾液并作蒸發(fā)濃縮，在濃度達(dá)到1-10kg/L、多糖含量在10％以上時(shí)，得到的地龍水提液或地龍醇提液即為本發(fā)明的治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服液。
本發(fā)明治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服，還可同藥用緩釋介質(zhì)復(fù)合成一種可置于牙周袋以治療牙周炎的緩釋型藥。該緩釋型藥的制備方法是將單方劑地龍口服液與藥用緩釋介質(zhì)混合，再按常規(guī)方法制成軟膏或凝膠或緩釋膜。
本發(fā)明的有益效果是1)本發(fā)明方法以單方劑地龍為原料制得的口服液，通過(guò)以小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1作為細(xì)胞模型，及以大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)的SD大鼠牙槽骨吸收模型的藥理實(shí)驗(yàn)，證實(shí)它具有對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化(堿性磷酸酶和骨鈣素分別是成骨細(xì)胞分化早期和中期的標(biāo)志物)和基質(zhì)礦化的促進(jìn)作用及對(duì)動(dòng)物性牙槽骨吸收的明顯的治療效果，也驗(yàn)證了我國(guó)藥典中記載的關(guān)于地龍具有促進(jìn)骨折愈合、強(qiáng)骨補(bǔ)腎的功效；并且在沸水回流中能充分提取地龍各有效組份并留存在口服液中；如再通過(guò)臨床試驗(yàn)，即可用于人類牙槽骨吸收及骨科的其它疾病的治療或促進(jìn)骨再生；從而可解決人們期望得到的能有效治療牙槽骨吸收及骨科的其它疾病的中草藥制劑的問(wèn)題；2)本發(fā)明方法所用的地龍是一種無(wú)害人體的安全可靠的中藥，且制取的方法簡(jiǎn)便可行、取材方便、價(jià)格低廉，故易于推廣應(yīng)用；3)本發(fā)明方法制得的單方劑地龍口服液，與現(xiàn)有骨傷科中醫(yī)多方劑中的地龍療效大有不同，中醫(yī)多方劑中的地龍?jiān)谂c其它藥同煎的過(guò)程中，因受到其它中草藥不能長(zhǎng)時(shí)間煎熬的影響，故不能充分提取地龍的有效成份；而本發(fā)明方法通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的沸水回流能充分提取地龍各有效組份，并可直接取用，以省去煎藥的麻煩。


圖1是大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)的牙槽骨吸收大鼠牙體-牙周標(biāo)本中位于牙槽骨表面的破骨細(xì)胞(蘇木素-伊紅染色，×100倍)；圖2是正常大鼠牙體-牙周標(biāo)本的形態(tài)(蘇木素-伊紅染色，×100倍)；圖3是大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)的牙槽骨吸收大鼠牙體-牙周標(biāo)本中位于牙槽骨表面的活性破骨細(xì)胞(抗酒石酸酸性磷酸酶染色，×400倍)；圖4是大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)后30d牙槽骨吸收大鼠牙體-牙周標(biāo)本中位于牙槽骨表面的破骨細(xì)胞(蘇木素-伊紅染色，×200倍)；圖5是用藥10天的牙槽骨吸收大鼠根分叉區(qū)新生未鈣化骨樣基質(zhì)及附著的成骨細(xì)胞(蘇木素-伊紅染色，×100倍)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、本實(shí)施例治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服液，是一種能通過(guò)凝膠滲透色譜測(cè)試方法測(cè)得其多糖的含量在10％(重量)以上的地龍水提液或醇提液。
上述的單方劑地龍口服液的制取方法是1)取用一種地龍，其拉丁文名是Pheretimaguillelmi，屬于矩蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓或縞蚯蚓的干燥體；先經(jīng)清洗、干燥并粉碎成粉料；2)取用提取液，該提取液是蒸餾水或外購(gòu)的95％乙醇，然后將地龍粉料和蒸餾水或95％乙醇以1∶10(W∶V)的比例混合，經(jīng)沸水回流3～10h后進(jìn)行粗濾，并在濾渣中以上述比例加蒸餾水或95％乙醇再進(jìn)行沸水回流3～10h、再粗濾；3)合并上述兩次濾液并作蒸發(fā)濃縮，在濃度達(dá)到1-10kg/L、多糖含量在10％以上時(shí)，所得到的地龍水提液或地龍醇提液即為本發(fā)明的治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服液。
上述的沸水回流是通過(guò)對(duì)內(nèi)含地龍粉料和蒸餾水或95％乙醇的容器加熱、沸騰，蒸汽上升，并通過(guò)其上的冷凝器冷凝后又回到容器內(nèi)再加熱，如此不斷地加熱上升、冷凝回流，一個(gè)循環(huán)接下一個(gè)循環(huán)直到到達(dá)設(shè)定的時(shí)間為止。沸水回流的時(shí)間長(zhǎng)短是根據(jù)地龍粉料的顆粒度大小選擇并設(shè)定，顆粒度越大，沸水回流的時(shí)間越長(zhǎng)，顆粒度越細(xì)小，則沸水回流的時(shí)間可短，因此視顆粒度的大小在3～10h(小時(shí))內(nèi)選取，以充分提取地龍所含的各有效成份。
為證實(shí)本實(shí)施例的單方劑地龍口服液對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化(堿性磷酸酶和骨鈣素分別是成骨細(xì)胞分化早期和中期的標(biāo)志物)和基質(zhì)礦化的促進(jìn)作用及對(duì)動(dòng)物性牙槽骨吸收的治療效果，分別以小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1作為細(xì)胞模型、以大腸桿菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的SD大鼠牙槽骨吸收模型進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)。
藥理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)如下1)用大腸桿菌內(nèi)毒素(E-LPS)制備穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)性大鼠牙槽骨吸收模型；其中一組采用SD大鼠局部注射大腸桿菌內(nèi)毒素建立牙槽骨吸收模型(以下稱謂建模大鼠)先給SD大鼠吸入乙醚麻醉，然后在左上頜第一磨牙頰側(cè)正中齦下注射含10g/L大腸桿菌內(nèi)毒素的生理鹽水50μL，且每48小時(shí)注射1次，共4次；通過(guò)牙槽骨骨密度(BoneMineraldensity，BMD)、破骨細(xì)胞數(shù)、組織病理學(xué)檢查確定牙槽骨吸收模型制備的效果；該建模大鼠(n＝5)實(shí)驗(yàn)牙位牙槽骨BMD(0.220±0.026)低于正常大鼠(n＝4)(0.343±0.015)(p＜0.05)、破骨細(xì)胞數(shù)目(7.800±2.683)高于正常大鼠(0.400±0.548)，牙槽骨表面出現(xiàn)Howship陷窩，陷窩內(nèi)可見(jiàn)破骨細(xì)胞，未見(jiàn)成骨細(xì)胞及新生骨樣基質(zhì)，如圖1所示；另一組是正常對(duì)照組，即大鼠牙槽骨表面光滑完整，未見(jiàn)明顯破骨或成骨活動(dòng)，如圖2所示；2)對(duì)上述的建模大鼠用本實(shí)施例單方劑地龍口服液15g/kg每天灌胃1次，分別用藥10、20和30d；3)用血清堿性磷酸酶(Alkali phosphate，ALP)活性、鈣離子(Ca2+)和骨鈣素(Osteocalcin，OC)濃度測(cè)定，以及牙體-牙周聯(lián)合標(biāo)本骨密度(Bone Mineraldensity，BMD)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)、HE染色組織病理學(xué)檢查，評(píng)價(jià)DFS水提液治療實(shí)驗(yàn)性牙槽骨吸收的療效；結(jié)果顯示與相應(yīng)陰性對(duì)照組圖4比較，用地龍口服液(15g/kg)灌胃治療10天SD大鼠的實(shí)驗(yàn)牙位骨密度顯著升高、牙周破骨細(xì)胞消失(P＜0.05，如表1所示)，Howship陷窩明顯減少，大多出現(xiàn)根分叉區(qū)有成骨細(xì)胞附著的新生未鈣化骨樣基質(zhì)(如圖5所示)，且第20天和30天檢查結(jié)果與第10天相似。陰性對(duì)照組大鼠第10，20，30天的牙體-牙周標(biāo)本中仍存在著明顯的Howship陷窩，陷窩內(nèi)可見(jiàn)破骨細(xì)胞，未見(jiàn)成骨細(xì)胞及新生未鈣化骨樣基質(zhì)(如圖3、圖4所示)。由此可證明地龍水提液對(duì)SD大鼠實(shí)驗(yàn)性牙槽骨吸收有明顯的療效，它能抑制骨質(zhì)吸收、促進(jìn)骨質(zhì)再生。
表1 治療組和對(duì)照組大鼠牙體-牙周標(biāo)本中的破骨細(xì)胞數(shù)目(x±s，n＝5)組別 時(shí)間(d)BMD/g·cm2破骨細(xì)胞數(shù)目P值(與對(duì)照比較)治療組 100.338±0.029*0.600±0.548*200.334±0.017*0.200±0.237*300.331±0.025*0.000±0.000*對(duì)照組 100.229±0.024 8.000±2.916200.299±0.013 5.000±1.345300.281±0.013 4.600±1.949注*中P＜0.05，**中P＜0.001表2 不同濃度地龍口服液作用的MC3T3-E1細(xì)胞MTT法吸收度A490(x±s，n＝6)組別藥物濃度(mg/L) 吸收度A490P值(與對(duì)照比較)水提液 0.01 0.4516±0.08351 0.4318±0.0204*1000.4794±0.0641對(duì)照組(水) - 0.3800±0.0141醇提液 0.01 0.4428±0.0125**1 0.4414±0.0296**1000.3862±0.0288對(duì)照組(醇) - 0.3723±0.0356注*中P＜0.05，**中P＜0.001表3 不同濃度地龍口服液作用的MC3T3-E1各增殖周期的細(xì)胞百分率(％)組別藥物濃度(mg/L)G0/G1S G2/M S+G2水提液0.01 53.740.26.146.3160.931.87.439.2100 55.642.22.244.4對(duì)照組(水)-63.032.05.037.0醇提液0.01 51.144.04.848.8155.639.94.544.4100 59.134.66.340.9對(duì)照組(醇)-61.533.45.138.5
表4 不同濃度地龍?zhí)崛∫鹤饔玫腗C3T3-E1細(xì)胞ALP活性(x±s，n＝6)組別藥物濃度(mg/L) ALP活性(U/L)水提液 0.01 9.5000±0.5477110.333±0.5164100 11.000±2.2804對(duì)照組(水) -9.6667±0.8165醇提液 0.01 9.5000±0.547719.5000±1.0488100 8.6667±1.0328對(duì)照組(醇) -10.000±0.8944表5 不同濃度地龍?zhí)崛∫鹤饔玫腗C3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)上清中的骨鈣素濃度(x±s，n＝6)骨鈣素濃度(ng/ml)組別 藥物濃度(mg/L) 3d P值(與對(duì)照組比較)6d 9d P值(與對(duì)照組比較)) 12d P值(與對(duì)照組比較)水提液 0.01 0.823±0.340*1.715±0.779 1.614±0.486 0.504±0.1251 0.634±0.0921.345±0.548 1.506±0.903 0.525±0.1171000.493±0.1832.117±0.544 2.372±0.798 0.837±0.100**對(duì)照組(水)- 0.481±0.1191.559±0.423 2.850±1.324 0.381±0.229醇提液 0.01 0.735±0.2520.970±0.159 1.967±0.378 1.019±0.2811 1.233±0.471*1.584±0.621 2.784±0.725 1.024±0.6951000.915±0.2540.748±0.210 2.023±0.454**0.817±0.128對(duì)照組(醇)- 0.741±0.1170.845±0.148 1.665±0.329 1.318±0.638注*中P＜0.05，**中P＜0.001表6 不同濃度地龍口服液作用的MC3T3-E1細(xì)胞基質(zhì)礦化面積百分比(x±s，n＝6)組別 濃度(mg/L-1) 基質(zhì)礦化面積(％)P值(與對(duì)照比較)地龍水提液 0.01 0.5250±0.1308*10.6017±0.0717**100 0.4567±0.0812對(duì)照組(水)- 0.3600±0.1014地龍醇提液 0.01 0.4933±0.0671*10.3550±0.0704100 0.4150±0.0592對(duì)照組(醇)- 0.3722±0.0213
注上述表中的*中P＜0.05，**中P＜0.001。
此外，在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，從表2中看到1mg/L地龍口服液能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖(P＜0.05)；1mg/L和0.01mg/L地龍醇提液能顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖(P＜0.001)。從表3中可看到；各濃度的地龍水提液和醇提液均能使S期MC3T3-E1細(xì)胞百分率升高，G1期細(xì)胞百分率減少。從表4中看到各試驗(yàn)組細(xì)胞ALP活性無(wú)明顯升高(P＞0.05)。從表5中看到0.01mg/L地龍水提液和1mg/L地龍醇提液在作用于MC3T3-E1細(xì)胞第1-3d內(nèi)可提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞骨鈣素合成和分泌(P＜0.05)，100mg/L地龍醇提液在提取液作用于MC3T3-E1細(xì)胞第7-9d內(nèi)、100mg/L地龍水提液在提取液作用于MC3T3-E1細(xì)胞第10-12d內(nèi)可顯著提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞骨鈣素合成和分泌(P＜0.001)。從表6中看到0.01mg/L地龍水提液和醇提液均可提高細(xì)胞體外鈣(P＜0.05)，1mg/L地龍水提液提液可顯著促進(jìn)細(xì)胞體外基質(zhì)礦化(P＜0.001)。
上述的藥理實(shí)驗(yàn)是本實(shí)施例單方劑地龍口服液治療牙槽骨吸收的理論基礎(chǔ)，它具有進(jìn)一步研發(fā)抗骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)吸收新藥的前景。
實(shí)施例2、本實(shí)施例治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服，還可同藥用緩釋介質(zhì)復(fù)合成一種可置于牙周袋以治療牙周炎的緩釋型藥。該緩釋型藥的制備方法是將單方劑地龍口服液與藥用緩釋介質(zhì)，如羥乙基纖維素、氯化鎂等混合，再按常規(guī)方法制成軟膏或凝膠或緩釋膜。使用該緩釋型藥時(shí)，只要將它置于牙周袋內(nèi)，以使緩釋的藥物對(duì)口腔中該局部區(qū)域的牙周組織發(fā)揮持續(xù)作用。它不僅有助于對(duì)局部疾病的控制與治療，并且該藥物不會(huì)刺激到口腔的正常部位。
權(quán)利要求
1.一種治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服液，是一種多糖含量在10％以上的地龍水提液或地龍醇提液。
2.一種制取權(quán)利要求1的治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服液的方法，其特征是它包含以下的步驟1)取用地龍，經(jīng)清洗、干燥并粉碎成粉料；2)取用提取液，該提取液是蒸餾水或95％乙醇，然后將地龍粉料和蒸餾水或95％乙醇以1∶10(W∶V)的比例混合均勻后，通過(guò)沸水回流3～10h進(jìn)行粗濾，并在其濾渣中再以上述比例加蒸餾水或95％乙醇進(jìn)行沸水回流3～10h、其后再粗濾；3)合并上述的兩次濾液并作蒸發(fā)濃縮，在濃度達(dá)到1-10kg/L、多糖含量在10％以上即是治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服液。
3.一種含權(quán)利要求1所述的治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服液的復(fù)合藥，其特征是單方劑地龍口服液還同藥用緩釋介質(zhì)結(jié)合成一種可置于牙周袋的治療牙周炎的緩釋型藥，其制備方法是直接將單方劑地龍口服液與藥用緩釋介質(zhì)結(jié)合，成為軟膏或凝膠或緩釋膜。
全文摘要
治療牙槽骨吸收的單方劑地龍口服液及其制取方法。用于治療炎癥性牙槽骨吸收和其它破骨細(xì)胞性骨吸收疾病。其制法取地龍，經(jīng)清洗、干燥并粉碎后與蒸餾水或95％乙醇以1∶10(W∶V)混合，經(jīng)沸水回流、粗濾，并將濾渣再沸水回流、粗濾，合并兩次濾液并蒸發(fā)濃縮，在水提液或醇提液的濃度達(dá)1－10kg/L、多糖含量10％以上便得。以小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3－E1作為細(xì)胞模型、以大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)SD大鼠牙槽骨吸收作為動(dòng)物模型的藥理實(shí)驗(yàn)，證實(shí)對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)礦化的促進(jìn)作用及對(duì)動(dòng)物性牙槽骨吸收抑制的顯著效果，從而為治療牙槽骨吸收及相關(guān)骨科疾病提供中草藥制劑。其方法簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、易于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P19/00GK1593466SQ200410025710
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月28日
發(fā)明者陳莉麗, 嚴(yán)杰, 唐琪 申請(qǐng)人:陳莉麗, 嚴(yán)杰