專利名稱：家畜動(dòng)物腦脂類復(fù)合物藥物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家畜動(dòng)物腦脂類復(fù)合物藥物的制備方法，具體涉及具有神經(jīng)保健治療作用的羊、牛及其他家畜動(dòng)物腦脂類的提取。
背景技術(shù)：
羊(牛)腦或其他動(dòng)物腦內(nèi)含有膽固醇(CH)、卵磷脂(PC)、腦磷脂(PE)、肌醇磷脂(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等脂類。除膽固醇外，其他幾種脂類均有抗動(dòng)脈粥樣硬化和降血脂的作用。PC是抗脂肪肝因子，PE是腦紊亂輔助治療藥。PI是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路成分，PS、DHA、EPA可增強(qiáng)記憶，PC、PE、PI、PS均是脂質(zhì)體的原料且均有不同程度的改善記憶，治療老年性癡呆的作用。
從動(dòng)物腦提取PC和CH已有報(bào)道，見吳梧桐主編《生物制藥工藝學(xué)》，中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1992，403-415；商業(yè)部臟器生化制藥情報(bào)中心站編著，《動(dòng)物生化制藥學(xué)》人民衛(wèi)生出版社，1980，239-244。不同純度的CH、PC、PE、PI的粗提方法也有報(bào)道，見張豁中、溫玉麟等，《動(dòng)物活性成份化學(xué)》，天津科學(xué)技術(shù)出版社1995，1224-1516。在增加記憶、抗老年性癡呆方面，以上各成分中，尤以PS效果最佳，這已被動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床所證實(shí)，參見魯·根阿莫德塞，M.D等，“磷脂酰絲氨酸對(duì)阿爾茨海默病的治療多項(xiàng)臨床研究結(jié)果”，精神藥理學(xué)報(bào)，24(1)，1988(Luigi Amaducci，M.D等.Phosphatidylserinein the treatment of Alzheimer’s DiseaseResults of a Multicenter study.Phychophar-Macology Bull 24(1)1988.)和扎諾蒂A等“長(zhǎng)期磷脂酰絲氨酸處理可改善老齡鼠的空間記憶和被動(dòng)躲避”，精神藥理學(xué)報(bào)，99316-321，1989(A.Zanotti等，chronic phosphatidylserine treatment improves spatial memory and passiveavoidance in aged rats.Psychopharmacology 99316-321.1989)。而且來自動(dòng)物腦的PS抗阿爾茨海默病(AD)效果好于植物提取的PS，參見阿建、布勞克蘭德等“磷脂酰絲氨酸對(duì)中齡鼠的短期處理的認(rèn)識(shí)強(qiáng)化特征牛腦PS、蛋黃PS和大豆PS的比較”，基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)，15(10)，779-783，1999(ARJAN Blokland等.Cognition-Enhancing properties ofsubchronic phosphatidyl serine(cps)Treatmeut in Middle-aged RatsComparisonof Bovine Cortex ps with egg ps and soybean ps. Basic Nutrition15(10)779-783.1999)。推測(cè)其主要原因是來自動(dòng)物腦PS含有DHA和EPA。而植物來源PS無DHA和EPA。DHA有抗神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡的作用，參見金喜泳等“二十二碳六烯酸神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制作用”，生物化學(xué)雜志275(45)，35215-35223，2000(Hee-yong Kim等.Inhibition of Neuronal Apoptosis by Docosahexaenoic Acid(226n-3).The Journalof Biological chemistry 275(45)，35215-35223，2000)。
對(duì)于PS的提取大多數(shù)集中在分析和小樣制備方面，參見蘇晨等“從牛腦大批量制備高純度磷脂酰絲氨酸的方法”，色譜學(xué)雜志B集，666178-182，1995(Su chen等，Approachto the large-scale preparation of highly pure phosphatidylserine from bovinebrain.Journal of chromatography B.666178-182，1995)和阿貝得S.L“磷脂酰絲氨酸的分離過程”(綜述)，色譜學(xué)雜志B集，717279-293(S.L. Abidi.Separationprocedures for phosphatedylserine(review.)Journal of chromatographyB.717279-293.1998)在生產(chǎn)上則大多采用酶法合成，即在磷脂酶D存在情況下，用大豆磷脂，魚油和L-Serine合成，有的則采用Streptomyces sp.Strain(ATCC 55717)發(fā)酵產(chǎn)生磷脂酶D參見“一種工業(yè)化制備磷脂酰絲氨酸的工藝”，歐洲專利申請(qǐng)776976(A process forindustrial preparation of phosphatidylserine.European patent application 776976)和“磷脂酰絲氨酸的工業(yè)化制備工藝”，美國(guó)專利5700668(Process for the industrialpreparation of phosphatidylserine，us patent 5700668)。
對(duì)以上各成分分離純化后，經(jīng)動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PE具有明顯的凝血活性，參見約瑟等，生物化學(xué)與生物物理雜志，2871-80，1958(Rouser et al.Biochem.Biophys.Acta 2871-80 1958)和特諾等，油脂研究雜志，452-56，1963(Turner D.L. et al.J.Lip Res.452-56.1963)。而PS具備抗凝血活性，參見馬斯他得等，自然，1961063-1065，1962(Mustard.et al.Nature，1961063-1065，1962)。戴勒.維爾等(dellaValle et al)則將二者按比例合并使用來治療神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，參見戴勒.維爾等，“治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效而無凝血作用的、以磷脂酰絲氨酸為主要成分的藥物及其制備方法”，美國(guó)專利，4595680(Pharmaceutical compositions and method for preparaingphosphatidylserine compositions useful in treating central neuvous systemdisorders without effects on blood coagulation，us patent 4595680)。資料表明腦內(nèi)提取的PC、PE、PI和PS各成分均有延長(zhǎng)壽命，增加記憶和抗AD作用(尤其血管性AD)。作為神經(jīng)系統(tǒng)的保健治療，采用這些脂類的混合物，既能相互屏蔽了負(fù)作用，又能在低于單PS治療AD劑量情況下，增強(qiáng)其保健治療效果。也使我國(guó)日益昌盛的養(yǎng)殖業(yè)副產(chǎn)品(動(dòng)物腦)得以充分利用，提高經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種家畜動(dòng)物腦脂類復(fù)合物藥物的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案步驟如下1、以羊、牛及其他家畜動(dòng)物的腦為原料，以氯仿-甲醇-水三元提取體系，提取腦中脂類所有成分。
2、將1中所得提取物用丙酮萃取，殘?jiān)?jīng)干燥可獲粉狀腦磷脂復(fù)合物，丙酮液萃取走了膽固醇和脂肪酸。
3、上述2中丙酮液經(jīng)蒸餾冷卻得膽固醇結(jié)晶，除去膽固醇結(jié)晶，傾出丙酮液，蒸除丙酮得液體油脂肪酸，脂肪酸經(jīng)皂化、酯化、尿素絡(luò)合，脫色可得含DHA和EPA的不飽和脂肪酸。
4、上述2制得的腦磷脂復(fù)合物和上述3制得的DHA、EPA不飽和脂肪酸混合，酶法去殘余微量蛋白和多肽，CO2超臨界脫溶，獲得腦脂類復(fù)合物。
在上述步驟之后還可包括步驟5腦脂類復(fù)合物溶于色拉油或亞油酸，輔加脂溶性維生素A、D、E制成軟膠囊。
上述腦脂類復(fù)合物可用于制備各種劑型的藥物。有增強(qiáng)記憶，治療老年性癡呆，消除PS抗凝血及PE凝血作用。例如經(jīng)膠囊機(jī)制成軟膠囊，口服。
上述1中，當(dāng)動(dòng)物腦為100重量份時(shí)，氯仿-甲醇-水三元體系是氯仿∶甲醇∶水＝2∶2∶1體積比。
上述2中，當(dāng)提取物為50重量份時(shí)，按提取物∶丙酮＝1∶10；5；3；2重量比例萃取4次。
上述2中丙酮提取后的腦渣干燥后，按腦渣∶乙醚或氯仿＝1∶2.5～3重量比例浸泡萃取3次，合并乙醚或氯仿提取液，蒸去乙醚或氯仿得腦磷脂類復(fù)合物。
具體操作詳細(xì)說明如下，但不限于此1)新鮮羊、牛等動(dòng)物腦100g加入氯仿甲醇混合液(氯仿∶甲醇＝100ml∶200ml)，在組織搗碎器內(nèi)打碎勻質(zhì)，然后再加100ml氯仿，勻質(zhì)30秒，加100ml蒸餾水均質(zhì)30秒，濾紙過濾，靜置分層得氯仿層。殘?jiān)儆寐确螺腿〔⑾礊V紙，與以上濾液合并，蒸去氯仿得提取的腦中脂類復(fù)合物，蠟狀。
2)取提取物腦中脂類復(fù)合物50g按腦中脂類復(fù)合物∶丙酮＝1∶10；1∶5；1∶3；1∶2重量比例萃取4次，先在容器內(nèi)加入丙酮，80r/min磁力攪拌下逐漸加入腦中脂類復(fù)合物，攪拌萃取1h，置靜分層，傾出上清液。最后一次將沉淀過濾，真空干燥(溫度55℃，真空度為0.1)可得疏松磷脂粉狀物。
3)將2)中多次合并的丙酮萃取液70～80℃沸騰蒸發(fā)回收丙酮，蒸至丙酮萃取液的1/10時(shí)停止加熱，置冰箱中4-10℃冷放，可見膽固醇結(jié)晶出現(xiàn)。直接倒出丙酮液得膽固醇粗結(jié)晶品。再將丙酮液濃縮至1/10置-10℃--20℃，倒出丙酮液，得少量膽固醇粗品。蒸去剩余丙酮得液體油。
4)將得到的液體油加熱至50℃左右，緩緩加入NaOH乙醇溶液，回流皂化后，回收乙醇。皂膠在60℃經(jīng)鹽酸溶液酸化調(diào)PH2-3，然后用去離子水洗滌至近中性，得到混合脂肪酸?；旌现舅嵩跐饬蛩岽呋录尤脒^量乙醇進(jìn)行回流酯化，反應(yīng)結(jié)束后，回收乙醇。將酯化物用去離子水洗至中性，然后再精餾，可得含量在40％以上的DHA和EPA的乙酯濃縮物。該濃縮物在乙醇溶液中與尿素進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，回收乙醇，洗滌過量尿素后經(jīng)真空蒸餾脫羧，1％活性白土脫色，可得淺黃色，澄清透明的DHA乙酯和EPA乙酯含量在80％左右的制品。
5)將2)制得的腦磷脂復(fù)合物和4)中DHA和EPA乙酯制品混合，取100g該混合物溶解在400ml甲苯中；另將中性蛋白酶0.5g放入250ml 50℃溫水中制酶水溶液；將甲苯溶液緩慢倒入酶水溶液，慢攪拌30r/min 50～50℃保溫10h，酶解脂中所含微量蛋白，靜置分層，取出上層甲苯層，下層含酶水溶液可作為下輪酶解實(shí)驗(yàn)用，也可90～100℃滅酶10分鐘，經(jīng)檢測(cè)，脂中不再含有任何多肽和蛋白。蒸去甲苯得腦脂類復(fù)合物。
6)腦脂類復(fù)合物在壓力為30Mpa，溫度50℃，萃取脫溶時(shí)間為6h條件下CO2超臨界脫殘留溶劑。
7)將脫溶的腦脂類復(fù)合物溶于色拉油或亞麻酸或亞油酸內(nèi)，也可在配好的軟膠囊內(nèi)容物按每kg加入維生素VA10萬IU，VE 5-10G VD1-2g一種或組合，攪拌溶解后，倒入軟膠囊機(jī)頂端料斗，經(jīng)管道輸送至滾動(dòng)的明膠帶之間由滾動(dòng)的模具擠壓成軟膠囊。經(jīng)40r/min轉(zhuǎn)籠成型干燥。95％乙醇中一沖二洗除去膠囊表面油、冷風(fēng)硬化成型，每粒軟膠囊含腦脂類復(fù)合物500mg。經(jīng)薄層層析掃描定量腦脂復(fù)合物含PS 15～19％、PC 18～22％、PE 20～25％、PI 18～22％、PA 20～35％。
下面是本發(fā)明的腦脂類復(fù)合物的動(dòng)物試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)情況。
腦脂類復(fù)合物對(duì)小鼠記憶障礙的改善作用實(shí)驗(yàn)提取的腦脂類復(fù)合物是去除膽固醇及飽和脂肪酸后的多種磷脂及不飽和脂肪酸的復(fù)合物，采用跳臺(tái)法，避暗法和水迷路法(除奇主編，中藥藥理研究方法學(xué)，人民衛(wèi)生出版社892-896，1993)，以PS作對(duì)照，觀察該脂類復(fù)合物對(duì)記憶障礙小鼠的改善作用其結(jié)果為1、跳臺(tái)法小鼠在銅柵箱內(nèi)觸電后跳上跳臺(tái)可逃避電擊，因此獲得記憶，用M-膽堿受體阻滯劑-樟柳堿造成小鼠記憶獲得障礙模型，表現(xiàn)觸電潛伏期縮短，觸電次數(shù)增加，用樟柳堿致小鼠記憶障礙后，PS和腦脂類復(fù)合物按表1中所給劑量給記憶障礙小鼠，5分鐘內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P＜0.05、P＜0.05)，跳臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.01、P＜0.01)。
表1 腦脂類復(fù)合物對(duì)樟柳堿所致小鼠記憶獲得障礙的改善作用(n＝10，X±SD)
*示與模型組相比與模型組相比潛伏期顯著延長(zhǎng)，5分鐘內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)降低，說明其對(duì)記憶獲得障礙有顯著改善作用。
2、避暗法小鼠放入暗箱，受電擊后入明箱獲得記憶，24h后重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
表2 腦脂類復(fù)合物對(duì)東莨菪堿所致小鼠記憶獲得障礙的改善作用(X±SD)
記憶好的小鼠入暗箱潛伏期延長(zhǎng)，鉆洞次數(shù)減少，用M-膽堿受體阻滯劑東莨菪堿造成小鼠記憶損傷模型，以PS為對(duì)照，用本法檢測(cè)腦脂類復(fù)合物對(duì)小鼠記憶障礙的保護(hù)作用。
發(fā)現(xiàn)PS和腦脂類復(fù)合物(按表中所給劑量)能明顯減少5分鐘內(nèi)鉆洞次數(shù)(P＜0.01，P＜0.01)，潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.01，P＜0.01)。
3、水迷路法明暗道Y型小迷路裝置，小鼠至明道抵達(dá)終端平臺(tái)可得休息，經(jīng)訓(xùn)練可獲得記憶。用巴比妥鈉造模使小鼠腦中樞受抑制，產(chǎn)生方向辨別障礙。實(shí)驗(yàn)以PS為對(duì)照，觀察腦脂類復(fù)合物增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶的功效。實(shí)驗(yàn)所使用PS和脂類復(fù)合物劑量同表一，巴比妥鈉造模劑量為皮下注射15mg/kg。模型組與對(duì)照組相比，模型組每天正確反應(yīng)百分率顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，說明模型成功。PS陽性對(duì)照組小鼠正確反應(yīng)百分率顯著高于模型組，說明PS對(duì)巴比妥鈉所致小鼠方向辨別障礙有保護(hù)作用(P＜0.01)。腦脂類復(fù)合物給藥正確反應(yīng)百分率顯著高于模型組，組1(P＜0.05)，組2(P＜0.01)。
以上三種實(shí)驗(yàn)說明，所提取腦脂類復(fù)合物對(duì)記憶障礙小鼠有明顯改善作用。表明了該提取物增強(qiáng)記憶的生理作用。
腦脂類復(fù)合物的臨床實(shí)驗(yàn)一、老年性癡呆癥狀及分期0期，屬癡呆前期。老年癡呆作為一種慢性進(jìn)行性的腦器質(zhì)精神障礙，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中有其一定的特征，在此階段便可見到具有一定特征性的癥狀。
在疾病的最早期，僅可見到輕度的異常，主要表現(xiàn)為易疲勞，患者自覺哪兒都不舒服，類似神經(jīng)衰弱的癥狀。
隨疾病緩慢發(fā)展，患者的情感方面出現(xiàn)異常，積極性降低，有抑郁傾向、不安、情緒不佳，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)輕度的欣快感，進(jìn)一步發(fā)展，多出現(xiàn)人格方面的改變，象原有的性格傾向較前明顯，有夸大色彩，表現(xiàn)出性格的尖銳化趨勢(shì)，偏執(zhí)、缺乏耐性、易發(fā)怒等。
該階段，病理學(xué)上，尚未出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的脫落、壞死，可能是出現(xiàn)了神經(jīng)突觸功能的異常，因此，大體上還看不到腦萎縮，CT均無異常所見。這時(shí)是應(yīng)用藥物治療和預(yù)防Alzheimer病的最佳時(shí)期，但此期間所出現(xiàn)的不安、抑郁及人格方面的改變，在正常老年人中均可見到，在有明確的癡呆癥狀之前，單憑這些非常特異性的癥狀難以確定診斷，若結(jié)合基因診斷及智能檢測(cè)將會(huì)有利于早期診斷。
1期，為疾病的早期。該期以及記憶障礙為突出表現(xiàn)。外表看來，患者似健忘的正常老年人，記住新知識(shí)困難。然而隨疾病的進(jìn)一步發(fā)展，呈現(xiàn)病理性遺忘，患者反復(fù)問同一件事情，飯后馬上又催促開飯。與對(duì)最近的事易忘記相比，對(duì)以前的事情記得較好，但對(duì)自己生活史中發(fā)生的事時(shí)間順序混亂，把過去的事當(dāng)作現(xiàn)在的事，并與他人愉快地談?wù)?。此期的記憶力障礙，可影響到正常的工作和社交活動(dòng)。不過，此時(shí)的患者尚能保持自身和周圍環(huán)境的清潔衛(wèi)生，判斷能力基本正常，運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)未受損害，腦電和CT均無異常改變，仍可以在自己家里獨(dú)自生活，不需要特殊照顧，不必請(qǐng)專業(yè)人員護(hù)理。病程可持續(xù)1-3年。
2期，為疾病的中期，即中度癡呆期。大腦皮層明顯受損，各方面的損害均加重。有明顯的記憶力和定向力障礙，不知道現(xiàn)在是什么時(shí)候，無法區(qū)分白天和黑夜，把自己的家當(dāng)作別人的家，不能進(jìn)行簡(jiǎn)單的計(jì)算，極簡(jiǎn)單的工作也無法完成。表現(xiàn)出失語、失用、失認(rèn)。情感方面，患者性情急躁、缺乏耐性、易怒、一天中總要吃飯等人格改變異常突出。行為上，患者無法安靜，常無目的地外出，可出現(xiàn)幻覺、妄想，及不注意衛(wèi)生等行為異常及精神癥狀。此時(shí)，患者不能獨(dú)立生活，常會(huì)遇到意外事故，是本病看護(hù)中最困難的時(shí)期，需要多人看護(hù)，此期間的看護(hù)負(fù)擔(dān)也最重。在此期間，用電背景波呈發(fā)作性漫波，CT正?；蚰X室擴(kuò)大、腦溝加深。該期多持續(xù)在起病后的2-10年。
3期，病情極重，為疾病的終末期。此期大腦皮層功能喪失，患者智能崩潰，精神活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)功能變得不活躍，表情呆板，麻木，括約肌功能障礙，尿便失禁，四肢肌張力增高、屈曲攣縮，逐漸臥床，表現(xiàn)為①無任何意識(shí)性活動(dòng)；②不語、不動(dòng)，不能注視；③二便失禁；④自發(fā)性或反向性去皮質(zhì)強(qiáng)直，雙上肢屈曲過胸，雙下肢伸性強(qiáng)直；⑤基本的生命反射存在，呼吸、循環(huán)平穩(wěn)，睡眠節(jié)律存在。最終，可因感染或全身多器官功能衰竭而死亡。此期間，腦電呈彌漫性慢波，CT示腦室擴(kuò)大，腦溝增寬，呈現(xiàn)全腦萎縮，以額葉、顳葉更為明顯。該期多在發(fā)病后的8-12年。
二、國(guó)內(nèi)老年性癡呆診斷常用的MMSE表簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查表(Mini-Mental State Examination，MMSE)。MMSE的內(nèi)容較為全面，檢查方法簡(jiǎn)便，是各種檢查方式中最為實(shí)用的一種(王德生、張守信主編，老年性癡呆，2001，P306)。
精神狀態(tài)檢查表(MMSE)
得分()注總分為30分，得分在20分以下考慮為癡呆，其中14分以上為輕度智能障礙，6分到14分之間為中度智能減退，6分以下為重度癡呆。
三、腦脂類復(fù)合物對(duì)43例患者的臨床應(yīng)用結(jié)果對(duì)腦脂類復(fù)合物確定含量，按表2劑量服用。0期和1期患者大多自己前來就診，個(gè)別有陪伴。2期均有人陪伴，按MMES檢查表和CT法診斷，一般服用6個(gè)月，3個(gè)月檢查一次。0期3個(gè)月復(fù)查。
表2 腦脂類復(fù)合物臨床應(yīng)用結(jié)果
注效果評(píng)價(jià)(1)復(fù)查時(shí)按MMES表檢查，能從后一期進(jìn)入前一期為效，即3期變2期、2期變1期、1期變0期、0期轉(zhuǎn)為正常。(2)2期和3期均要有CT圖片，腦明顯擴(kuò)大，腦溝增寬，經(jīng)醫(yī)生檢查確定為腦萎縮。將CT圖片和MMSE結(jié)合診斷。
服用腦脂類復(fù)合物3個(gè)月，約有50％的人癡呆癥狀減輕，囑繼續(xù)服用，患者連服6個(gè)月無明顯不適，由統(tǒng)計(jì)可知，腦脂類復(fù)合物對(duì)早期癡呆更有效，對(duì)中度癡呆部分有效，對(duì)重度癡呆無效。
四、典型病例劉建春，女，67歲，山東東阿縣人，經(jīng)山東省立二院CT檢查，確診為腦萎縮，MMES檢查10分，能走動(dòng)，但不穩(wěn)，反應(yīng)遲鈍，有明顯記憶和定向力障礙。吃飯需人照料幫助，有失用表現(xiàn)；常無目的外出，有時(shí)自己不能返回，失認(rèn)；個(gè)別時(shí)候自己跌倒難以站起，患者獨(dú)立生活困難，難以自理，有冠心病和輕度糖尿病，診斷為中度癡呆(2期)，服用腦脂類復(fù)合物2400mg/天，連服6個(gè)月，先是癥狀停止發(fā)展，3個(gè)月后有所好轉(zhuǎn)，其家人也照顧細(xì)心、耐心、周到。服用腦脂類復(fù)合物3個(gè)月和6個(gè)月后，CT檢查腦室未再擴(kuò)大。MMES檢查分?jǐn)?shù)上升分別為12分和15分。反應(yīng)，記憶，行動(dòng)，精神狀態(tài)均好轉(zhuǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11)新鮮羊腦100g加入氯仿甲醇混合液(氯仿∶甲醇＝100ml∶200ml)，在組織搗碎器內(nèi)打碎勻質(zhì)，然后再加100ml氯仿，勻質(zhì)30秒，加100ml蒸餾水均質(zhì)30秒，濾紙過濾，靜置分層得氯仿層。殘?jiān)儆寐确螺腿〔⑾礊V紙，與以上濾液合并，蒸去氯仿得腦中脂類復(fù)合物(蠟狀)。
2)取腦中脂類復(fù)合物50g按腦脂類復(fù)合物∶丙酮＝1∶10；5；3；2比例萃取4次，先在容器內(nèi)加入丙酮，80r/min磁力攪拌下逐漸加入腦脂類復(fù)合物，攪拌萃取1h，置靜分層，傾出上清液。最后一次將沉淀過濾，真空干燥(溫度55℃，真空度為0.1)可得疏松磷脂粉狀物。
3)將2)中多次合并的丙酮萃取液70～80℃沸騰蒸發(fā)回收丙酮，蒸至丙酮萃取液的1/10時(shí)停止加熱，置冰箱中4-10℃冷放，可見膽固醇結(jié)晶出現(xiàn)。直接倒出丙酮液得膽固醇粗結(jié)晶品。再將丙酮液濃縮至1/10置-10℃--20℃，倒出丙酮液，得少量膽固醇粗品。蒸去剩余丙酮得液體油。
4)將得到的液體油加熱至50℃左右，緩緩加入NaOH乙醇溶液，回流皂化后，回收乙醇。皂膠在60℃經(jīng)鹽酸溶液酸化調(diào)PH2-3，然后用去離子水洗滌至近中性，得到混合脂肪酸。混合脂肪酸在濃硫酸催化下加入過量乙醇進(jìn)行回流酯化，反應(yīng)結(jié)束后，回收乙醇。將酯化物用去離子水洗至中性，然后再精餾，可得含量在40％以上的DHA和EPA的乙酯濃縮物。該濃縮物在乙醇溶液中與尿素進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，回收乙醇，洗滌過量尿素后經(jīng)真空蒸餾脫羧，1％活性白土脫色，可得淺黃色，澄清透明的DHA乙酯和EPA乙酯含量在80％左右的制品。
5)將2)制得的磷脂復(fù)合物和4)中DHA和EPA乙酯制品混合，取100g該混合物溶解在400ml甲苯中；另將中性蛋白酶0.5g放入250ml 50℃溫水中；將甲苯溶液緩慢倒入酶水溶液，慢攪拌30r/min50～50℃保溫10h，酶解脂中所含微量蛋白，置靜分層，取出上層甲苯層，下層含酶水溶液可作為下輪酶解實(shí)驗(yàn)用，也可90～100℃滅酶10分鐘，經(jīng)檢測(cè)，脂中不再含有任何多肽和蛋白。蒸去甲苯得腦脂類復(fù)合物。
6)腦脂類復(fù)合物在壓力為30Mpa，溫度50℃，萃取脫溶時(shí)間為6h條件下CO2超臨界脫殘留溶劑。得腦脂類復(fù)合物藥物。
實(shí)施例2如實(shí)施例1所述，所不同的是在得到腦脂類復(fù)合物藥物后，將其制成軟膠囊。
將脫溶的腦脂類復(fù)合物溶于色拉油、亞麻酸或亞油酸內(nèi)也可在配好的軟膠囊內(nèi)容物按每kg加入VA10萬IU，VE 5-10G VD1-2g(也可只加三種維生素中的一種，攪拌溶解后)，倒入軟膠囊機(jī)頂端料斗，經(jīng)管道輸送至滾動(dòng)的明膠帶之間由滾動(dòng)的模具擠壓成軟膠囊。經(jīng)40r/min轉(zhuǎn)籠成型干燥。95％乙醇中一沖二洗除去膠囊表面油、冷風(fēng)硬化成型，每粒軟膠囊含腦脂類復(fù)合物500mg。
實(shí)施例3新鮮牛腦切成片狀，55℃溫度下熱風(fēng)干燥，粉碎成米粒大小按腦粒重∶丙酮＝1∶10；5；5比例攪拌萃取3次得丙酮萃取液，以下DHA和EPA乙酯制法以及膽固醇制法按實(shí)施例1，而丙酮提取后的腦渣干燥后，按腦渣∶乙醚(或氯仿)＝1∶2.5～3浸泡萃取3次，合并乙醚(或氯仿)提取液，蒸去乙醚(或氯仿)得腦磷脂類復(fù)合物。
實(shí)施例4國(guó)內(nèi)現(xiàn)已有生化原料廠，將牛腦烘干后提取膽固醇，如以此除膽固醇后的腦渣為原料，可按實(shí)施例2中乙醚(或氯仿)萃取方法制得腦磷脂類復(fù)合物。
實(shí)施例5原料為其他動(dòng)物如豬、馬、驢、狗、兔等動(dòng)物的鮮腦、干腦或提取過膽固醇的腦，萃取方法同實(shí)施例1、2、3。提取的脂類復(fù)合物也具有較好的增強(qiáng)記憶和抗老年性癡呆的作用。
權(quán)利要求
1.家畜動(dòng)物腦脂類復(fù)合物藥物的制備方法，其特征在于，包括步驟如下(1)以羊、牛及其他家畜動(dòng)物的腦為原料，以氯仿-甲醇-水三元提取體系，提取腦中脂類所有成分，(2)將(1)中所得提取物用丙酮萃取，殘?jiān)?jīng)干燥可獲粉狀腦磷脂復(fù)合物，丙酮液萃取走了膽固醇和脂肪酸，(3)上述(2)中丙酮液經(jīng)蒸餾冷卻得膽固醇結(jié)晶，除去膽固醇結(jié)晶，傾出丙酮液，蒸除丙酮得液體油脂肪酸，脂肪酸經(jīng)皂化、酯化、尿素絡(luò)合，脫色可得含DHA和EPA的不飽和脂肪酸，(4)上述(2)制得的腦磷脂復(fù)合物和上述(3)制得的DHA、EPA不飽和脂肪酸混合，酶法去殘余微量蛋白和多肽，CO2超臨界脫溶，獲得腦脂類復(fù)合物。
2.如權(quán)利要求1所述的家畜動(dòng)物腦脂類復(fù)合物藥物的制備方法，其特征在于，所述(1)中，當(dāng)動(dòng)物腦為100重量份時(shí)，氯仿-甲醇-水三元體系是氯仿∶甲醇∶水＝2∶2∶1體積比。
3.如權(quán)利要求1所述的家畜動(dòng)物腦脂類復(fù)合物藥物的制備方法，其特征在于，所述(2)中，當(dāng)提取物為50重量份時(shí)，按提取物∶丙酮＝1∶10；5；3；2重量比例萃取4次。
4.如權(quán)利要求1所述的家畜動(dòng)物腦脂類復(fù)合物藥物的制備方法，其特征在于，所述(2)中丙酮提取后的腦渣干燥后，按腦渣∶乙醚或氯仿＝1∶2.5～3重量比例浸泡萃取3次，合并乙醚或氯仿提取液，蒸去乙醚或氯仿得腦磷脂類復(fù)合物。
5.如權(quán)利要求1所述的家畜動(dòng)物腦脂類復(fù)合物藥物的制備方法，其特征在于，還包括步驟(5)腦脂類復(fù)合物溶于色拉油、亞麻酸或亞油酸，輔加脂溶性維生素A、D、E制成軟膠囊。
全文摘要
一種家畜動(dòng)物腦脂類復(fù)合物藥物的制備方法，本發(fā)明以羊(牛等動(dòng)物)腦為原料，去除膽固醇和飽和脂肪酸，保留多種脂類成分，如卵磷脂(PC)、腦磷脂(PE)、肌醇磷脂(PI)和磷脂酰絲氨酸(PS)、DHA、EPA等，所得腦脂類復(fù)合物經(jīng)動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)證明具有增強(qiáng)記憶，治療老年性癡呆的作用，消除了PS抗凝血作用及PE的凝血作用。所制軟膠囊可直接為正常人和老年癡呆病人食用。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1562081SQ200410023740
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月16日
發(fā)明者劉代成, 安立國(guó) 申請(qǐng)人:山東師范大學(xué)