專利名稱：積雪草總苷在制備防治慢性腎功能衰竭藥物中的應(yīng)用的制作方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及植物有效成份的醫(yī)藥用途，具體地說(shuō)是積雪草總苷在制備防治慢性腎功能衰竭藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
積雪草為傘形科積雪草屬植物，全草入草，其性甘、辛、涼、消熱解毒。民間常用于治療感冒、扁桃腺炎、傳染性肝炎、痢疾、跌打損傷、療瘡腫毒、外傷出水等。積雪草的有效組份積雪草總苷藥理及藥學(xué)用途已有很多研究與報(bào)道。例如該總苷具有抗胃清瘍作用(浦培炎等《現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)》1989，b(1)8)。增強(qiáng)記憶作用Nallni k，etat Fitoterapia.1992，63(3)232)；對(duì)中樞神經(jīng)的抑制作用(Piwan pv，et at.Fitoterapia 1991，62(3)253)；刺激生物合成作用(Tenai R et at，ItalJ Biochem，1988，37(2)69)等等，在臨床上用于治療靜脈功能不合(MonleverdtA et al Aeta Ther，1987.13(6)629)治療微血管病(Pelearo G，et al Carr Ther Res ClinExp，1989，46(6))，治療皮膚病和創(chuàng)傷(CTiardinaA，etal，Cbrcn.bermalol，1987，18(Suppl，1)109)等等。目前人們一直在繼續(xù)研究探詢積雪草總苷更多更好的醫(yī)藥新用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種積雪草總苷的醫(yī)藥新用途。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明人經(jīng)長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)積雪草總苷在防治慢性腎功能衰竭中具有一定的作用。鑒此發(fā)明了其在制備防治慢性腎功能衰竭藥物中的應(yīng)用。
慢性腎功能衰竭是各種腎臟疾病發(fā)展到終末期的共同通路，是各種腎小球、血管和小管間質(zhì)本身疾病的最后結(jié)局。是在各種致病因子如炎癥、各種損傷、藥物、糖尿病和遺傳因素等的作用下，間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)增多，基質(zhì)降解受抑造成細(xì)胞外基質(zhì)的大量堆積導(dǎo)致的腎小球硬化和小管間質(zhì)的纖維化，伴之腎功能逐漸減退和喪失。目前西醫(yī)學(xué)對(duì)慢性腎功能衰竭的治療尚無(wú)良策。
本發(fā)明研究證明，積雪草總苷具有良好的抗慢性腎功能衰竭的作用。
本發(fā)明的有益效果通過(guò)以下實(shí)施例得到了證明。
實(shí)施例1積雪草總苷對(duì)腺嘌呤腎功能衰竭的研究實(shí)驗(yàn)材料 雄性SD大鼠，體重120g左右(南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。腺嘌呤(C5H5N5)，分子量135.13，上海伯奧生物科技有限公司生產(chǎn)。免疫組織化學(xué)主要試劑一抗羊抗大鼠TGF-β1、TIMP-1、PAI-1多克隆抗體；二抗兔IgG免疫試劑盒；三抗SABC試劑盒，TGF-β1、TIMP-1原位雜交試劑盒博士德生物技術(shù)公司。
給藥方法大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，體重增加后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組用含量為98.0％腺嘌呤混懸液灌胃(劑量為100mg/kg.d、150mg/kg.d、200mg/kg.d，依次各一周)，造模3周后給予積雪草總苷9mg/kg，治療2周后處死動(dòng)物心臟采血檢測(cè)肝腎功能，并取腎組織分成兩部分，一部分進(jìn)行病理檢查，另一部分經(jīng)多聚甲醛固定后進(jìn)行原位雜交檢測(cè)，對(duì)照組灌胃同等體積的蒸餾水。
免疫組化方法切片脫蠟至水，0.3％H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，92℃抗原熱修復(fù)，加TGF-β1、TIMP-1、PAI-1多克隆抗體，4℃過(guò)夜。加用山羊抗兔IgG二抗，加SABC復(fù)合物，DAB-H2O2顯色。蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。鏡下觀察拍照，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色。本實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照和血清替代對(duì)照，各對(duì)照結(jié)果均為陰性。
原位雜交方法恢復(fù)室溫，0.6％H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，暴露mRNA核酸片段，加20μl預(yù)雜交液，37℃-40℃恒溫3小時(shí)，加20μl雜交液，40℃雜交過(guò)夜，洗滌，滴加牛血清白蛋白封閉液和生物素化鼠抗地高辛，加SABC和生物素化過(guò)氧化物酶，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，封片。鏡下拍片觀察，核藍(lán)染，胞漿內(nèi)陽(yáng)性物為棕黃色?？瞻讓?duì)照不加雜交探針，結(jié)果為陰性。
結(jié)果與分析圖像分析采用北京航空航天大學(xué)病理圖像分析系統(tǒng)，每組分析6個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本取6個(gè)腎小球或6個(gè)分區(qū)；免疫組化及原位雜交圖片分析每標(biāo)本6個(gè)分區(qū)的陽(yáng)性反應(yīng)物的含量。
結(jié)果見(jiàn)表1、表2
表1積雪草總苷對(duì)腺嘌呤慢性腎功能衰竭大鼠24h蛋白定量的影響

注 & 與模型組相比p＜0.01，#與正常組相比p＜0.01表2積雪草總苷對(duì)腺嘌呤慢性腎功能衰竭大鼠肝腎功能的影響

注 & 與模型組相比p＜0.01，#與正常組相比p＜0.01積雪草總苷對(duì)腺嘌呤腎衰大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響積雪草總苷組小管上皮細(xì)胞空泡變性，偶見(jiàn)蛋白管型及局部單核細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組大鼠則見(jiàn)腎小管多灶性萎縮，肥大，明顯蛋白管型，間質(zhì)明顯纖維化及水腫，彌漫性單核細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組顯示腎小管排列紊亂，管腔重度變形，小管基底膜明顯增厚，小管細(xì)胞崩解，形態(tài)不清。間質(zhì)局部水腫，部分纖維增生明顯，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。部分腎小球纖維化，形態(tài)消失，部分腎小球體積縮小，包曼氏囊腔狹窄，基膜部分?jǐn)嗔选⒄尺B。系膜增寬，大部分毛細(xì)血管腔變形、消失，病變受累＞80％。部分小球包曼氏囊基膜增厚，囊腔變寬。
積雪草總苷對(duì)腺嘌呤腎衰大鼠TGF-β1、TIMP-1、PAI-1的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)表明免疫組化和原位雜交結(jié)果表明PAI-1、TGF-β1、TIMP-1的蛋白和mRNA陽(yáng)性反應(yīng)物主要分布在腎間質(zhì)，反應(yīng)強(qiáng)度模型組明顯強(qiáng)于積雪草總苷組。
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、是介導(dǎo)ECM沉積的主要因子，在腎組織損傷中，其濃度表達(dá)持續(xù)增高，與ECM成分增加相平行?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)為ECM降解三個(gè)主要系統(tǒng)之一(絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、MMPS)之一，MMP抑制物(TIMP)的濃度及纖溶酶系統(tǒng)與MMPS作用密切相關(guān)。纖溶酶原激活物(PA)是絲氨酸蛋白酶系統(tǒng)主要成員，EMC的堆積過(guò)程中，蛋白酶的調(diào)節(jié)變化是t-PA和纖溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)平衡的改變，在基質(zhì)擴(kuò)增過(guò)程中可能傾向于PAI-1，且PA的活性與PAI活性及濃度相關(guān)。鑒于三者在腎組織EMC堆積過(guò)程中的重要作用及相互影響關(guān)系，故本研究以這三種分子變化作為主要觀察指標(biāo)。TGF-β1、PAI-1、TIMP-1與CRF的關(guān)系。TGF-β在腎臟炎癥、硬化與修復(fù)過(guò)程中的作用已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，其對(duì)腎臟細(xì)胞的增生、肥大、凋亡及局部和全身免疫反應(yīng)都起重要作用，但最突出的是ECM的代謝調(diào)節(jié)作用。TGF-β1是腎小球硬化的重要介質(zhì)。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)體外培養(yǎng)的人、小鼠、大鼠系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞中，TGF-β1可誘導(dǎo)ECM不同成分的表達(dá)。同時(shí)，TGF-β1還是包括PAIS、TIMPS在內(nèi)的多種分子的上游因子而起到多種調(diào)節(jié)作用。PAI和PA是調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)活性的重要物質(zhì)。被PA激活的纖溶酶本身具有降解ECM某些成分的作用，如纖維連接蛋白、層粘蛋白及纖維蛋白等，且為基質(zhì)金屬蛋白酶的激活劑。體外研究證明，腎臟固有細(xì)胞(系膜細(xì)胞、腎小球上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞)可合成PA、PAI-1、及U-PA受體，PAI-1作為PAI主要成分在腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中起重要作用，其濃度的升高是導(dǎo)致腎臟ECM成分分泌增加、沉積的重要因素之一。TIMP-1是四種TIMP之一，廣泛分布于組織與體液中，能參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，在實(shí)驗(yàn)中Nakamura發(fā)現(xiàn)，模型大鼠腎組織TIMP-1mRNA水平增加，則膠原蛋白、層粘蛋白明顯增多。也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在單側(cè)腎切除加高膽固醇血癥大鼠模型中，腎間質(zhì)纖維化與TGF-β1、TIMP-1mRNA水平共同增高相關(guān)，而給予抗氧化劑可明顯抑制間質(zhì)纖維化。
積雪草總苷能阻止CRF病情發(fā)展，改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存質(zhì)量，降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血BUN和Scr水平。
積雪草總苷干預(yù)治療后目標(biāo)分子mRNA表達(dá)水平均不同程度上低于模型組，可降低腎小球、腎小管TGF-β1、PAI-1、TIMP-1mRNA表達(dá)水平，抑制ECM沉積，延緩腎纖維化過(guò)程。
實(shí)施例2積雪草總苷對(duì)5/6腎切除大鼠慢性腎功能衰竭的實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)材料雄性SD大鼠，體重120g左右(南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。兔抗鼠ColIV、FN多克隆抗體。
動(dòng)物模型的制作按照5/6腎切除方法。
適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，第2周的星期一摘除大鼠左側(cè)2/3腎臟，第3周的星期一摘除大鼠右側(cè)腎臟。手術(shù)后第4周的星期一按動(dòng)物的血清肌酐水平隨機(jī)分為(1)模型組；(2)積雪草組。分組后，開(kāi)始分組每日灌胃給藥(1)正常組、模型組給蒸餾水3ml/d；(2)積雪草總苷組按9mg/kg灌胃。治療12周后殺檢時(shí)，尾動(dòng)脈取血，測(cè)定血清肌酐和尿素氮水平，并取腎組織行病理學(xué)檢查。并于手術(shù)后4、8、12、16周測(cè)定24h尿蛋白定量。
腎組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)取新鮮腎組織，10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋做HE、PAS染色。對(duì)腎小球硬化進(jìn)行半定量分級(jí)。每組取6只動(dòng)物。每張切片觀察20個(gè)腎小球。計(jì)算出腎小球基質(zhì)面積占腎小球面積的百分比，用HPIAS-1000病理圖象分析系統(tǒng)對(duì)PAS染色切片進(jìn)行分析。同時(shí)對(duì)各組大鼠腎小管間質(zhì)病變進(jìn)行半定量分析。即根據(jù)小管間質(zhì)正常、小管擴(kuò)張、小管萎縮、管型、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維化分為正常(-)、輕(+)、中(++)、重(+++)4個(gè)級(jí)別。
免疫組化檢測(cè)切片脫蠟至水，0.3％H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，92℃抗原熱修復(fù)，加ColIV、FN多克隆抗體，4℃過(guò)夜。加用山羊抗兔IgG二抗，加SABC復(fù)合物，DAB-H2O2顯色。蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。鏡下觀察拍照，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色。本實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照和血清替代對(duì)照，各對(duì)照結(jié)果均為陰性。
結(jié)果一般情況模型組動(dòng)物明顯營(yíng)養(yǎng)不良，精神萎靡、活動(dòng)遲緩、食欲不振、皮毛蓬松、枯槁無(wú)光澤，死亡率20％。積雪草組較好，死亡率為8％。
積雪草總苷對(duì)5/6腎切除大鼠24h蛋白定量的影響見(jiàn)表3表3 積雪草總苷對(duì)24小時(shí)尿蛋白定量的影響

注#與模型組相比P＜0.01從第8周開(kāi)始，積雪草組與模型組相比，有顯著性差異p＜0.01，提示積雪草總苷能明顯降低模型組大鼠的尿蛋白。
積雪草總苷對(duì)5/6腎切除大鼠腎功能和血漿蛋白的影響(見(jiàn)表4)表4 積雪草總苷對(duì)5/6腎切除大鼠腎功能和血漿蛋白的影響

注#與模型組相比，p＜0.05或0.01，說(shuō)明積雪草總苷能改善模型組大鼠的腎功能，提高血漿蛋白。
腎臟病理學(xué)檢查 見(jiàn)表5、表6模型組腎小球系膜區(qū)呈局灶性或彌漫性中重度增寬，以系膜基質(zhì)增多為主，系膜細(xì)胞增生不明顯，毛細(xì)血管腔受增寬的系膜壓迫變窄和或閉塞。部分腎小球毛細(xì)血管襻與腎小囊粘連，有的腎小球硬化、萎縮，腎小囊增厚，甚至與小球周圍纖維化融合為一體。病變腎小球周圍的近曲小管上皮細(xì)胞變性腫脹，使管腔變小，部分小管腔內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型。間質(zhì)有散在的纖維組織增生，尤以硬化的腎小球周圍明顯，部分區(qū)域有大量的纖維組織增生，并見(jiàn)有散在的或局灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主。
積雪草組腎小球毛細(xì)血管腔開(kāi)放，多數(shù)腎小球系膜區(qū)呈輕度增寬，亦有少數(shù)腎小球系膜區(qū)成輕度或重度增寬，亦以系膜基質(zhì)增多為主，偶見(jiàn)球囊粘連。有少數(shù)近曲小管上皮細(xì)胞變性，間質(zhì)有少量的纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
表5 腎臟病理檢查結(jié)果

注 # 與模型組相比，p＜0.05或0.0l表6 腎小管間質(zhì)變化情況

注與正常組相比#p＜0.05，##p＜0.0l&與模型組相比p＜0.05免疫組化結(jié)果ColIV表達(dá)主要分布于腎小球毛細(xì)血管基底膜、系膜區(qū)以及腎小囊基底膜等部位；FN的表達(dá)主要分布于腎小球系膜區(qū)，基底膜上亦有表達(dá)，但著色淺淡，與正常組相比，模型組的表達(dá)范圍和強(qiáng)度明顯擴(kuò)大和增強(qiáng)，而積雪草總苷組與模型組相比，顯著減輕。見(jiàn)表7表7 各組系膜基質(zhì)中FN、ColIV相對(duì)含量的比較

注 *與正常組相比p＜0.01#與模型組p＜0.05或p＜0.01
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用5/6腎切除制作慢性腎功能衰竭模型，給予積雪草總苷治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，積雪草總苷能顯著減輕模型組大鼠的24小時(shí)尿蛋白，降低血肌酐、尿素氮，提高血漿蛋白。減少細(xì)胞外基質(zhì)在硬化區(qū)域的沉積，防治腎小球硬化、纖維化的形成。所以說(shuō)積雪草總苷對(duì)防止終末期腎衰的發(fā)生有至關(guān)重要的意義。
實(shí)施例3積雪草總苷對(duì)慢性血清病系膜增生性腎炎的影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組遠(yuǎn)交系健康雄性SD大鼠50只，體重150±21克，10周齡，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。，動(dòng)物經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，尿蛋白定性結(jié)果陰性，隨機(jī)分為正常組，模型對(duì)照，積雪草總苷組。每組10只。
主要試劑完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑(GIBCO公司)，牛血清白蛋白(BSA)和大腸桿菌內(nèi)毒素(SIGMA公司)。一抗包括兔抗鼠TGFβ1多克隆抗體、小鼠抗大鼠PDGF單克隆抗體(北京中山生物技術(shù)公司)，Tris堿、30％H2O2(南京創(chuàng)瑞生物技術(shù)公司)。SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)公司)。
大鼠實(shí)驗(yàn)性系膜增生性腎炎模型的復(fù)制采用改良的慢性血清病性MsPGN模型[1]，40只雄性SD大鼠，氯胺酮靜脈麻醉后經(jīng)背部切除左側(cè)腎臟，休養(yǎng)1周后進(jìn)行預(yù)免疫。在每只大鼠背部皮下分點(diǎn)注射完全弗氏佐劑0.1ml加BSA3mg，于1周末、2周末背部皮下注射不完全弗氏佐劑0.1ml加BSA3mg，3周末，腹腔注射BSA連續(xù)4次，每次間隔1h，注射劑量每只分別為0.5、1、1.5、3.0mg；次日每只在腹腔注射BSA2mg。正式免疫于預(yù)免疫完成后第一天起，尾靜脈與腹腔注射隔日交替進(jìn)行，每只鼠尾靜脈注射BSA劑量從0.5mg開(kāi)始，每次增加0.5mg，至2.5mg為止，繼續(xù)每周加量0.5mg，至每日用量5mg為止。腹腔注射量是尾靜脈注射量的1倍，至每日用量10mg為止。免疫2周后尾靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素100μg/只。全部大鼠與正式免疫8周后處死取腎組織。
生化及病理學(xué)檢查生化檢查(1)24小時(shí)尿蛋白定定量；(2)尿C3、NAG；(3)血尿素氮、肌酐；(4)血清總蛋白、白蛋白。半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)腎臟組織形態(tài)學(xué)的檢查免疫組化檢測(cè)切片脫蠟至水，0.3％H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，92℃抗原熱修復(fù)，加TGF-β1、PDGF多克隆抗體，4℃過(guò)夜。加用山羊抗兔IgG二抗，加SABC復(fù)合物，DAB-H2O2顯色。蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。鏡下觀察拍照，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色。本實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照和血清替代對(duì)照，各對(duì)照結(jié)果均為陰性。
結(jié)果濕熱傷腎大鼠模型尿蛋白及藥物干預(yù)情況自造模第六周起，模型組與積雪草組均有不同程度的蛋白尿，且隨時(shí)間推移逐漸加重，第六、八、十周末時(shí)，24小時(shí)尿蛋白定量各積雪草組顯著低于模型組。積雪草總苷組提示積雪草總苷能明顯減輕MsPGN大鼠的蛋白尿。見(jiàn)表8表8 第六、八、十周末24h尿蛋白定量變化情況(mg/24h)

注 # 與正常組相比p＜0.01，△與模型組相比p＜0.01濕熱傷腎大鼠模型血肌酐、尿素氮及血漿蛋白變化情況第十周末時(shí)，模型組的血CRE、BUN均明顯高于正常組(p＜0.01，積雪草組血CRE、BUN與模型組相比有極顯著性差異(p＜0.01，說(shuō)明積雪草總苷能改善MsPGN大鼠的腎功能，第十周末時(shí)，積雪草組血漿蛋白與模型組相比有極顯著性差異(p＜0.01，說(shuō)明積雪草總苷能明顯提高M(jìn)sPGN大鼠的總蛋白、白蛋白。見(jiàn)表9表9第十周末血肌酐、尿素氮及血漿蛋白變化情況

注 # 與正常組相比p＜0.01，&與模型組相比p＜0.01濕熱傷腎大鼠模型的腎小管間質(zhì)病變情況第十周末殺檢時(shí)，模型組的尿NAG、UUC3明顯升高，與正常組相比，有極顯著性差異(p＜0.01。積雪草組能降低尿NAG、UUC3。見(jiàn)表10表10 第十周末尿NAG、UUC3的變化情況

注#與模型組相比P＜0.05或P＜0.01
腎組織學(xué)檢查光鏡檢查 模型組免疫6周部分腎小球增大，腎小球毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞呈顆粒及空泡變性，有紅細(xì)胞管型及透明管型形成。免疫8周系膜細(xì)胞局灶節(jié)段性增生，部分腎小囊粘連，炎細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫10周主要表現(xiàn)為個(gè)別腎小球出現(xiàn)萎縮而至纖維化，多數(shù)呈現(xiàn)彌漫的輕重不等的系膜組織增生，大部分區(qū)域?yàn)橹卸仍錾?，表現(xiàn)為系膜區(qū)增寬，增寬的系膜區(qū)內(nèi)系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)均有增生，個(gè)別區(qū)域出現(xiàn)重度增生，毛細(xì)血管腔狹小，個(gè)別結(jié)構(gòu)破壞，血管消失。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，積雪草總苷組個(gè)別區(qū)域腎小球系膜細(xì)胞輕度增生，系膜基質(zhì)輕度增寬，管腔無(wú)擠壓現(xiàn)象。見(jiàn)表11。
表11 大鼠的病理檢測(cè)結(jié)果

注△與模型組相比P＜0.01電鏡模型組可見(jiàn)腎小球系膜區(qū)系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增多，上皮細(xì)胞可見(jiàn)節(jié)段性足突融合或絨毛變，系膜區(qū)可見(jiàn)云霧狀電子致密物沉積，與模型組相比積雪草總苷組未見(jiàn)明顯系膜細(xì)胞增生及系膜基質(zhì)增多現(xiàn)象。
免疫熒光正常組腎小球系膜區(qū)無(wú)IgG、C3沉積，模型組免疫6周表現(xiàn)為腎小球內(nèi)有細(xì)顆粒狀I(lǐng)gG(+~++)和C3(+~++)在系膜區(qū)沉積，免疫8周腎小球內(nèi)有粗顆粒狀的IgG(++~+++)和C3(++~+++)在系膜區(qū)沉積，免疫10周末殺檢時(shí)IgG(+++~++++)和C3(+++~++++)呈粗大顆粒狀在系膜區(qū)沉積。積雪草總苷組IgG(+~++)和C3(+~++)沉積明顯減少，呈散在顆粒狀。
免疫組化結(jié)果結(jié)果顯示正常組TGFβ1腎小球有極其微弱的表達(dá)，而在腎間質(zhì)的分布較在腎小球內(nèi)為多。模型組在第6、8周時(shí)TGFβ1主要分布在包曼氏囊、腎小球的上皮基底膜，同時(shí)在腎間質(zhì)的分布亦明顯增多。在第10周殺檢時(shí)模型組可以見(jiàn)到TGFβ1大量分布在包曼氏囊、腎小球的上皮基底膜、血管內(nèi)皮，同時(shí)在腎間質(zhì)的分布亦明顯增多，部分呈團(tuán)塊狀。積雪草總苷TGFβ1在腎小球的分布較模型組相比明顯減少p＜0.01＝說(shuō)明積雪草總苷能明顯減少M(fèi)sPGN大鼠腎組織中TGFβ1的分布。
結(jié)果顯示正常組有PDGF的基礎(chǔ)表達(dá)，在第6、8周時(shí)可見(jiàn)PDGF主要分布于系膜基質(zhì)和某些腎小囊的上皮細(xì)胞及小管間質(zhì)部位。第10周殺檢時(shí)模型組的PDGF染色明顯增強(qiáng)，主要分布在系膜基質(zhì)和腎小囊的上皮細(xì)胞和小管間質(zhì)部位，與正常組相比，模型組的PDGF染色范圍顯著增強(qiáng)(p＜0.01＝，積雪草總苷的PDGF的染色范圍較模型組相比，顯著減少(p＜0.01＝，提示積雪草總苷能明顯減少M(fèi)sPGN大鼠系膜基質(zhì)中PDGF在腎小球的分布。見(jiàn)表12表12 PDGF和TGF-β1的免疫組化分析

注#與模型組相比P＜0.01在腎臟疾病中，細(xì)胞因子至少通過(guò)兩種途徑參與病變過(guò)程一是作為攻擊性炎癥介質(zhì)，主要有IL-2、TNF-α、IL-1β、IFN-γ、PDGF、TGFβ1等；二是作為抗炎細(xì)胞因子，參與腎臟疾病的自我防御，促進(jìn)炎癥的消散與修復(fù)，主要有IL-4、IL-10、IL-13、IL-1ra等。致炎性和抗炎性細(xì)胞因子的平衡，決定腎臟病的轉(zhuǎn)歸。
PDGF是系膜細(xì)胞的一種最強(qiáng)的有絲分裂因子，在動(dòng)物和人類MsPGN均以發(fā)現(xiàn)腎組織中具有PDGF-A或PDGF-BmRNA及PDGF-B受體mRNA和蛋白的高表達(dá)。PDGF在影響炎癥增殖過(guò)程的同時(shí)，可能還影響細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)改變和重組。有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PDGF-B的拮抗劑和PDGF受體酪氨酸激酶抑制劑STI571能減輕腎小球硬化、小管間質(zhì)破壞，腎小球和間質(zhì)部位III、IV膠原的聚集以及TGF的過(guò)度表達(dá)，提示通過(guò)拮抗PDGF-B可以延緩進(jìn)展性腎病尤其使系膜增生性腎炎的進(jìn)展。
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGFβ1)是一種多功能的細(xì)胞因子，其過(guò)度表達(dá)，能導(dǎo)致組織器官的纖維化。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)證明，TGFβ1與腎小球硬化密切關(guān)系，TGFβ1通過(guò)促使系膜細(xì)胞分泌產(chǎn)生IV型膠原和纖維連接蛋白而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)聚集。TGFβ1可刺激培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞和近曲小管上皮細(xì)胞的ECM合成增加。應(yīng)用TGFβ1特異性抑制劑Decorin轉(zhuǎn)染人系膜細(xì)胞來(lái)拮抗腎纖維化。所以說(shuō)TGFβ1在腎小球疾病進(jìn)展到硬化的過(guò)程中是一個(gè)關(guān)鍵的介導(dǎo)因素。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在正常腎小球TGFβ1的分布在腎間質(zhì)較腎小球內(nèi)為多，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。而在模型組的第6、8周TGFβ1在腎小球的分布逐漸增多，10周末殺檢時(shí)TGFβ1的分布主要在腎小球基膜、系膜區(qū)、腎小囊壁層上皮及小管間質(zhì)部位，積雪草總苷能明顯減少PDGF和TGFβ1在腎小球尤其是在腎小管間質(zhì)部位的分布，降低其mRNA水平，說(shuō)明積雪草總苷能通過(guò)抑制PDGF與TGFβ1的蛋白和mRNA表達(dá)從而抑制系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增加。
實(shí)施例4積雪草總苷對(duì)膜性腎病大鼠的影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇健康SD大鼠40只，日齡46天，體重200±20克，購(gòu)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)期間給予大鼠全價(jià)顆粒飼料及自由飲水。保持溫度18～24℃，空氣相對(duì)濕度40～70％。
主要試劑及儀器陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(C-BSA)自備，弗氏不完全佐劑(美國(guó)Gibco公司)，羊抗大鼠I、III型膠原(福州邁新生物技術(shù)公司)，積雪草總苷，按9mg/kg劑量灌胃。ACETM全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)國(guó)際核電集團(tuán)產(chǎn)品)，BHS-313熒光顯微鏡(日本OLYMPUS產(chǎn)品)。
實(shí)驗(yàn)方法抗原制備根據(jù)文獻(xiàn)方法改變N-BSA的等電點(diǎn)，用雙蒸水(4℃)透析48h，冷凍干燥后測(cè)得C-BSA PI≥10，貯存于-80℃超低溫冰箱中備用。
模型制作參照文獻(xiàn)方法稍加改進(jìn)后制作大鼠膜性腎病(MN)動(dòng)物模型。將1.1mg-BSA溶于0.55ml生理鹽水中，與等量IFA充分乳化后，給大鼠多點(diǎn)皮下注射為預(yù)免疫；于1周后開(kāi)始致病免疫，即隔日一次給大鼠尾靜脈注射(iv)C-BSA4mg，連續(xù)4周。
分組及給藥SD大鼠購(gòu)回后先適應(yīng)飼養(yǎng)1周，尿檢蛋白全部陰性。預(yù)免疫后，根據(jù)大鼠體重隨機(jī)分為4組，每組各10只，即正常組、模型組、積雪草組。
正常組每日一次予雙蒸水3ml ig，1h后隔日一次尾部iv 1ml。
模型組每日一次予雙蒸水3ml ig，1h后隔日一次尾部iv C-BSA 4mg(將C-BSA用配制成5mg/ml的溶液)。
積雪草組造模同模型組，同時(shí)給藥治療。
觀察指標(biāo)一般情況觀察觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、體重、體毛、飲食及大小便等。
實(shí)驗(yàn)室檢查24h尿蛋白定量(24hUTP)、血清白蛋白(ALB)、血脂(TC、TG)和腎功能(Scr、BUN、Ccr)。ACE全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)上述指標(biāo)。
腎臟組織病理學(xué)檢查光鏡做HE、PAS兩種染色；免疫熒光。
免疫組化方法切片脫蠟至水，0.3％H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，92℃抗原熱修復(fù)，加羊抗鼠Col III和Col I多克隆抗體，4℃過(guò)夜。加用山羊抗兔IgG二抗，加SABC復(fù)合物，DAB-H2O2顯色。蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。鏡下觀察拍照，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色。本實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照和血清替代對(duì)照，各對(duì)照結(jié)果均為陰性。
計(jì)算機(jī)圖像分析采用HPIAS-1000病理圖像分析系統(tǒng)，測(cè)量每個(gè)腎小球中著色的陽(yáng)性物質(zhì)面積及整個(gè)腎小球的面積，以二者的比值表示每種成分在腎小球中的相對(duì)含量，每個(gè)標(biāo)本取3個(gè)腎小球，每組分析6個(gè)標(biāo)本。
一般狀況變化正常組反應(yīng)敏捷，活動(dòng)正常，毛色光澤，飲食與飲水正常，大便呈顆粒狀，24h尿量10ml左右，尿色淡黃。其余3組在實(shí)驗(yàn)期間，出現(xiàn)精神不振，反應(yīng)遲鈍；毛發(fā)欠光澤，倦怠踡臥，喜拱背扎堆；飲食與飲水減少，活動(dòng)量少，體重增長(zhǎng)緩慢；尿量減少，大便稀溏等。上述表現(xiàn)以模型組最為明顯，有的出現(xiàn)腹部脹大、會(huì)陰部水腫，有的處死時(shí)、剖腹可見(jiàn)有大量腹水。
尿量的變化24h尿量的變化，除正常組外，其余各組大鼠尿量均有減少，而以模型組減少最為明顯；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析大鼠尿量變化情況有顯著差異(P＜0.05)，見(jiàn)表13。
表13 積雪草總苷對(duì)膜性腎病大鼠尿量的影響(X±SD，ml/24h)

△與模型組比P＜0.05；實(shí)驗(yàn)室檢查24h尿蛋白的變化于致病免疫2周末，除正常組外，其余2大鼠24h尿蛋白均明顯增加，尤以模型組增加明顯且最高，于致病免疫4周末，除正常組外，模型組大鼠24h尿蛋白增高明顯。經(jīng)方差分析，2周末和4周末各組大鼠尿蛋白變化情況，均有非常顯著性差異(P＜0.01)，見(jiàn)表14。
表14 積雪草總苷對(duì)膜性腎病大鼠24h尿蛋白的影響(X±SD，mg/24h)

*與模型對(duì)照組比P＜0.01；血清白蛋白變化于致病免疫2周末，除正常組外，其余2大鼠血清白蛋白均有降低，尤以模型組降低明顯且最低，致病免疫4周末，仍以模型組最低。經(jīng)方差分析，2周末和4周末積雪草組大鼠血清白蛋白的變化情況，有非常顯著性差異(P＜0.01)，見(jiàn)表15表15積雪草總苷對(duì)膜性腎病大鼠血清白蛋白的影響(X±SD，g/L)

*與模型組比P＜0.0l；血漿膽固醇情況于致病免疫2周末，除正常組外，其余2大鼠血漿膽固醇均明顯升高，尤以模型組升高明顯且最高，于致病免疫4周末，仍以模型組最高，經(jīng)方差分析，2周末和4周末積雪草組大鼠血漿膽固醇的變化情況，均有非常顯著性差異(P＜0.01)，見(jiàn)表16。
表16 積雪草總苷對(duì)膜性腎病大鼠血漿膽固醇的影響(X±SD，mmol/L)

*與模型組比P＜0.01；血漿甘油三脂的變化情況于致病免疫2周末，除正常組外，其余2組大鼠血漿甘油三脂均明顯升高，尤以模型組升高明顯且最高，于致病免疫4周末，仍以模型組最高，2周末和4周末積雪草組大鼠血漿甘油三脂的變化情況，均有非常顯著性差異(P＜0.01)，見(jiàn)表17。
表17 積雪草總苷對(duì)膜性腎病大鼠血漿甘油三脂的影響(X±SD，mmol/L)

*與模型對(duì)照組比P＜0.01血肌酐的變化情況于致病免疫2周末，除正常組外，其余2組大鼠血肌酐均有明顯升高，尤以模型組升高明顯，致病免疫4周末，仍以模型組最高，經(jīng)方差分析，2周末與4周末積雪草組大鼠血肌酐變化情況，均有非常顯著性差異(P＜0.01)。見(jiàn)表18表18 積雪草總苷對(duì)膜性腎病大鼠血肌酐的影響(X±SD，μmol/L)

*與模型對(duì)照組比P＜0.01。
血尿素氮變化情況于免疫2周末，除正常組外，其余2組大鼠血尿素氮均有明顯升高，尤以模型組升高明顯且最高，致病免疫4周末，仍以模型組最高，經(jīng)方差分析，2周未與4周末積雪草組大鼠血尿素氮的變化情況，均有非常顯著性差異(P＜0.01)，見(jiàn)表19。
表19 積雪草總苷對(duì)膜性腎病大鼠血尿素氮的影響(X±SD，mmol/L)

*與模型組比P＜0.01。
腎臟組織病理學(xué)改變情況光鏡檢查正常組HE染色可見(jiàn)腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，腎小球毛細(xì)血管袢開(kāi)放良好，GBM無(wú)增厚、上皮細(xì)胞足突形態(tài)正常，系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)無(wú)增多。
模型組進(jìn)行HE、PAS、染色在鏡下觀察，可見(jiàn)腎小球體積稍增大，GBM明顯增厚，細(xì)胞數(shù)略增加，基質(zhì)稍增多；積雪草組腎小球體積稍微增大，GBM無(wú)明顯增厚，細(xì)胞數(shù)略增多，與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異。
免疫組化檢測(cè)結(jié)果正常組Col-III主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞基底膜及間質(zhì)處，且染色較淺。模型組Col-III表達(dá)顯著增強(qiáng)，膜性腎病是成人腎病綜合征常見(jiàn)的病理類型之一，主要是由于腎小球基底膜上原位免疫復(fù)合物沉積而形成的一種典型的自身免疫性疾病。其病理特點(diǎn)是有多數(shù)位于腎小球上皮細(xì)胞下或基底膜外側(cè)的免疫復(fù)合物沉積，從而表現(xiàn)為腎小球毛細(xì)血管基底膜彌漫性增厚。臨床上則表現(xiàn)為大量蛋白尿或腎病綜合征。
本次實(shí)驗(yàn)積雪草組的尿蛋白較模型組明顯減少，推測(cè)積雪草總苷可能是通過(guò)減輕尿蛋白排泄量、改善腎臟小血管內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)及高代謝狀態(tài)而達(dá)到保護(hù)腎小管的目的。血尿素氮和血肌酐的改善也提示積雪草組能提高腎小球?yàn)V過(guò)率，促進(jìn)尿素氮和肌酐的排出，改善腎功能。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，積雪草總苷具有減少免疫復(fù)合物沉積，減輕腎小球基膜增厚，減輕腎小球病理?yè)p害的作用。
本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，正常組Col-III主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞基底膜及間質(zhì)處，且染色較淺。模型組Col-III表達(dá)顯著增強(qiáng)，積雪草組與模型組比較有顯著性差異。提示積雪草總苷可顯著減少Col-III在腎小管間質(zhì)的表達(dá)，延緩MN模型大鼠腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。
綜上所述，積雪草總苷能顯著減輕模型組大鼠的24小時(shí)尿蛋白，降低血肌酐、尿素氮，提高血漿蛋白，提高腎小球?yàn)V過(guò)率；減少細(xì)胞外基質(zhì)在硬化區(qū)域的沉積，減輕腎小球基膜增厚，減輕腎小球病理?yè)p害，防治腎小球硬化、纖維化的形成；所以，積雪草總苷完全可以在制備防治慢性腎功能衰竭藥物中得到應(yīng)用，特別是在制備防治膜性腎病藥物中的應(yīng)用更具有顯著意義。
積雪草總苷原料藥可以在醫(yī)藥市場(chǎng)上購(gòu)得。以其為活性成分，可制備成用于防治慢性腎功能衰竭或防治膜性腎病的各種藥物制劑。
以下實(shí)施例例舉了積雪草總苷的幾種劑型
實(shí)施例5積雪草總苷口服液將250mg積雪草總苷()，溶于1000ml水中，制成0.25％濃度的水溶液，加熱溶解，混合均勻，裝入20ml藥瓶中，封口、消毒。
服用方法口服，每日服用積雪草總苷50-100mg。
實(shí)施例6積雪草總苷注射液取積雪草總苷2000mg，按注射劑常規(guī)制備方法，制成4mg/2ml/支濃度的注射液，蒸汽流通滅菌30分鐘。
用法用量肌注或靜脈注射，每日20-100mg。
實(shí)施例7積雪草總苷片劑取積雪草總苷2000mg，按常規(guī)片劑制備方法，加入淀粉，糊精、硬酯酸鎂等，混合制成濕粒，機(jī)器沖壓成片，每片含積雪草總苷25mg。
用法用量口服，每日2-3次，每次25mg-100mg。
本發(fā)明的藥物劑型不完全限于此，它可以制備成更多的劑型，如滴丸、膠囊劑、軟膠囊劑、緩控釋制劑等等。
本發(fā)明的藥物用法用量，也不完全限于此。臨床醫(yī)師也可以根據(jù)病人的具體情況決定藥物的用法用量。
權(quán)利要求
1.積雪草總苷在制備防治慢性腎功能衰竭藥物中的應(yīng)用。
2.積雪草總苷在制備防治膜性腎病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雪草總苷在制備防治慢性腎功能衰竭藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明證實(shí)積雪草總苷能顯著減輕模型組大鼠的24小時(shí)尿蛋白，降低血肌酐、尿素氮，提高血漿蛋白，提高腎小球?yàn)V過(guò)率；減少細(xì)胞外基質(zhì)在硬化區(qū)域的沉積，減輕腎小球基膜增厚，減輕腎小球病理?yè)p害，防治腎小球硬化、纖維化的形成；所以，積雪草總苷完全可以在制備防治慢性腎功能衰竭藥物中得到應(yīng)用，特別是在制備防治膜性腎病藥物中的應(yīng)用更具有顯著意義。
文檔編號(hào)A61K31/7028GK1712013SQ200410012358
公開(kāi)日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2004年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月22日
發(fā)明者黃懷鵬 申請(qǐng)人:神威藥業(yè)有限公司