專利名稱：利用整聯(lián)蛋白α4亞單位的拮抗劑治療纖維變性的方法
本申請(qǐng)是2001年12月14日向中國(guó)專利局提交的00808454.8號(hào)中國(guó)申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求先前于1999年4月22日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/130847和1999年6月1日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/137214的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
纖連蛋白和膠原蛋白是維持結(jié)締組織中細(xì)胞外基質(zhì)完整性所必須的蛋白質(zhì)。這些蛋白的產(chǎn)生是受到高度調(diào)節(jié)的過程，它的失調(diào)可導(dǎo)致組織纖維變性的發(fā)展。雖然纖維組織的形成是創(chuàng)傷后正常的有益的治愈過程之一，但在一些情況下，纖維物質(zhì)的異常積聚可最終導(dǎo)致器官衰竭(Border等，(1994)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，3311286-1292)。任何器官的創(chuàng)傷均可導(dǎo)致固定的生理反應(yīng)血小板誘導(dǎo)的止血，隨后是炎癥細(xì)胞和激活的成纖維細(xì)胞的進(jìn)入。源自這些細(xì)胞的細(xì)胞因子驅(qū)使新的細(xì)胞外基質(zhì)和血管(肉芽組織)的形成。肉芽組織的產(chǎn)生是一個(gè)精細(xì)協(xié)調(diào)的過程，其中蛋白酶抑制劑和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)上調(diào)，而蛋白酶的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的積聚。
纖維變性狀態(tài)(誘導(dǎo)的或自發(fā)的)進(jìn)展的關(guān)鍵是成纖維細(xì)胞活性的激活。炎癥細(xì)胞和激活的成纖維細(xì)胞向創(chuàng)傷器官的流入，依賴于這些細(xì)胞與主要由纖連蛋白和膠原蛋白組成的間質(zhì)的相互作用。這些細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用由細(xì)胞粘附分子的多個(gè)家族介導(dǎo)，其中一種這樣的家族包括整聯(lián)蛋白。整聯(lián)蛋白在結(jié)構(gòu)上和功能上與糖蛋白相關(guān)，這些糖蛋白由在幾乎每種類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以各種組合存在的各種α(α1、α2直到目前發(fā)現(xiàn)的α11)和β(β1和β7)異二聚體跨膜受體結(jié)構(gòu)域組成(見綜述E.C.Butcher，細(xì)胞，67，1033(1033)；D.Cox等，“整聯(lián)蛋白的藥理學(xué)”醫(yī)學(xué)研究綜述，第195卷(1994)和V.W.Englemen等，“以細(xì)胞粘附整聯(lián)蛋白作為藥物靶點(diǎn)”Ann.Rews.Medicinal Chemistry，第31卷，J.A.Bristol，編；Acad.Press，NY，1996，第191頁(yè))。二個(gè)含α4亞單位的整聯(lián)蛋白已被述及并被命名為α4β1(VLA-4)和α4β7。
間質(zhì)性肺纖維變性(IPF)是許多導(dǎo)致降低肺順應(yīng)性和損害有效氣體交換功能的間質(zhì)性肺疾病的最終途徑。不管病因如何，IPF是以肺的炎癥和纖維增生以及間質(zhì)中膠原蛋白的過度積聚為特點(diǎn)。IPF患者在活躍的肺纖維變性期間，通常出現(xiàn)募集(recruited)的免疫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，這表明肺纖維變性是在最初炎癥損傷之后異常修復(fù)的結(jié)果。在很多情況中，募集的炎癥細(xì)胞可能參與最初的損傷。另外，在調(diào)節(jié)該修復(fù)過程時(shí)，這些細(xì)胞可起復(fù)雜的作用。在各種情況中，肺中免疫和炎癥細(xì)胞的聚集在纖維變性反應(yīng)的判定中起重要作用。炎癥細(xì)胞和激活的成纖維細(xì)胞進(jìn)入損傷的肺依賴于這些細(xì)胞與ECM組分的相互作用。白細(xì)胞的輸送和激活狀態(tài)由各種整聯(lián)蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)。在隨后的反應(yīng)中(包括纖維變性反應(yīng))，阻止炎癥細(xì)胞進(jìn)入肺可能是關(guān)鍵。
許多與纖維組織增生相關(guān)的疾病是慢性疾病并經(jīng)常導(dǎo)致衰弱，包括例如硬皮病等皮膚疾病。包括肺纖維變性在內(nèi)的一些疾病可以是致命的，其部分原因是目前對(duì)這種疾病的治療有明顯的副作用，并且對(duì)減緩或阻止纖維變性的進(jìn)程沒有效果[Nagler等，1996，Am.J.Respir.Crit.Care.Med.，1541082-86]。因此一直需要有新的抗纖維變性藥物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了治療受試者的纖維變性的方法。我們通過給患肺纖維變性的小鼠施用含α1或α4亞單位的整聯(lián)蛋白的拮抗劑，研究了含α1和α4亞單位的整聯(lián)蛋白的拮抗劑在纖維變性發(fā)病機(jī)制中的可能作用。這些拮抗劑對(duì)膠原蛋白總積聚和肺纖維變性損傷范圍的有益作用，如本文所示，表明含α1和/或α4亞單位的整聯(lián)蛋白可能是抗纖維變性治療的合理靶點(diǎn)。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及方法，其包括向有纖維變性的受試者施用有效量的組合物，所述組合物包括拮抗含α4亞單位的整聯(lián)蛋白與其配體之間相互作用的拮抗劑。所述拮抗劑是α4整聯(lián)蛋白結(jié)合劑或α4整聯(lián)蛋白配體結(jié)合劑。優(yōu)選的α4整聯(lián)蛋白結(jié)合劑選自a)對(duì)VLA-4和α4β7與各自α4配體的相互作用均有拮抗作用的抗體同系物；b)拮抗VLA-4與其α4配體相互作用的抗體同系物；c)拮抗α4β7與其α4配體相互作用的抗體同系物。在其它實(shí)施方案中，抗體同系物選自人的抗體、嵌合抗體、人源化抗體及其片段。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及減少支氣管肺泡灌洗液樣品中由纖維變性誘導(dǎo)的白細(xì)胞增加的方法，包括給有纖維變性的受試者給藥有效量拮抗劑的步驟，所述拮抗劑為拮抗含α4亞單位的整聯(lián)蛋白與其配體之間相互作用的拮抗劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，α4亞單位的整聯(lián)蛋白的結(jié)合劑的編碼核酸序列包括在幾種嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自美國(guó)專利5840299的表6中核酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的核酸序列。在本方法的其它方面，所述α4亞單位的整聯(lián)蛋白的結(jié)合劑的編碼核酸序列包括在指定的嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自美國(guó)專利5932214中發(fā)現(xiàn)的或由細(xì)胞系A(chǔ)TCC CRL 11175產(chǎn)生的特定多肽的編碼核酸序列雜交的核酸。
更具體地，本發(fā)明涉及以下方面1、一種方法，其包括向患有纖維變性的受試者給藥有效量的含抗體同系物的組合物，所述抗體同系物可拮抗VLA-4和α4β7與各自α4配體的相互作用，或者所述抗體同系物拮抗VLA-4與其配體的相互作用，或者所述抗體同系物拮抗α4β7與其配體的相互作用。
2、項(xiàng)1的方法，其中抗體同系物選自人的抗體、嵌合抗體、人源化抗體及其片段。
3、項(xiàng)1的方法，其中所述組合物的給藥量為約0.1-20mg/kg體重。
4、用于降低支氣管肺泡灌洗液中由纖維變性誘導(dǎo)的白細(xì)胞增多的方法，包括向患有纖維變性的受試者給藥有效量的抗體同系物的步驟，該抗體同系物拮抗含α4亞單位的整聯(lián)蛋白與針對(duì)含α4亞單位的整聯(lián)蛋白的配體之間的相互作用。
5、項(xiàng)4的方法，其中所述抗體同系物可拮抗VLA-4和α4β7與其各自配體之間的相互作用，或者拮抗VLA-4與其配體之間的相互作用，或拮抗α4β7與其配體之間的相互作用。
6、項(xiàng)4的方法，其中抗體同系物選自人的抗體、嵌合抗體、人源化抗體及其片段。
7、項(xiàng)4的方法，其中抗體同系物的給藥量為約0.1-20mg/kg體重。
8、項(xiàng)7的方法，其中所述抗體同系物以有效量給予使得能提供大約0.1-30mg/kg體重的小分子劑量。
9、項(xiàng)1或4的方法，其中所述抗體同系物是一種人源化抗體，編碼該抗體的一部分的核酸序列包含能在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自美國(guó)專利5840299中表6的核酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的核酸。
10、項(xiàng)1或4的方法，其中所述抗體同系物是一種人源化抗體，編碼該抗體的一部分的核酸序列包含能在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自美國(guó)專利5840200中表6的核酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的核酸。
11、項(xiàng)1或4的方法，其中所述抗體同系物是一種人源化抗體，編碼該抗體的一部分的核酸序列包含能在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼下述多肽的核酸序列雜交的核酸，所述多肽選自a)美國(guó)專利5932214中的SEQ ID NO2；b)美國(guó)專利5932214中的SEQ ID NO4；和c)由細(xì)胞系A(chǔ)TCC CRL 11175所產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)。
12、項(xiàng)1或4的方法，其中所述抗體同系物是一種人源化抗體，編碼該抗體的一部分的核酸序列包含能在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼下述多肽的核酸雜交的核酸，所述多肽選自a)美國(guó)專利5932214中的SEQ ID NO2；b)美國(guó)專利5932214中的SEQ ID NO4；和c)由細(xì)胞系A(chǔ)TCC CRL 11175所產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)。
所有在前文中引用的文獻(xiàn)，以及在下文中引用的文獻(xiàn)和公布的專利，在此引入作為參考。
發(fā)明詳述I.定義為了更清晰和簡(jiǎn)潔的指出本發(fā)明的主題內(nèi)容，為在下文敘述和附加的權(quán)利要求中應(yīng)用的特定術(shù)語(yǔ)給出下述定義。
現(xiàn)在詳述本發(fā)明，其中包括如下定義整聯(lián)蛋白極晚期抗原(VLA)(very late antigen)超家族是由結(jié)構(gòu)上和功能上相關(guān)的糖蛋白組成，所述糖蛋白是由在幾乎每種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的各種組合的(α和β)異二聚體跨膜受體分子組成(見綜述E.C.Butcher，細(xì)胞，67，1033(1991)；D.Cox等，“整聯(lián)蛋白的藥理學(xué)”醫(yī)學(xué)研究綜述(1994)，和V.W.Englemen等，“以細(xì)胞粘附整聯(lián)蛋白作為藥物靶點(diǎn)”Ann.Rews.MedicinalChemistry，Vol.31，J.A.Bristol，編；Acad.Press，NY，1996，p.191)。VLA家族的整聯(lián)蛋白包括(目前)VLA-1、-2、-3、-4、-5、-6、-9和-11，其中每種分子包括分別與α(α1、α2、α3、α4、α5、α6等)鏈非共價(jià)結(jié)合的β1鏈。
α4β1整聯(lián)蛋白是VCAM-1、纖連蛋白以及其它可能配體(后者統(tǒng)稱為“α4配體”)的細(xì)胞表面受體。盡管本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員意識(shí)到存在VLA-4的其它配體并且能夠用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行分析，術(shù)語(yǔ)α4β1整聯(lián)蛋白(“VLA-4”或“a4b1”或“α4β1整聯(lián)蛋白”，可互換應(yīng)用)在此是指能夠與VCAM-1和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(尤其是纖連蛋白)成員或其同系物或片段結(jié)合的多肽。然而，已經(jīng)知道α4亞單位可以與除了β1之外的其它β亞單位結(jié)合，故我們將術(shù)語(yǔ)“α4整聯(lián)蛋白”或“含α4亞單位的整聯(lián)蛋白”定義為其α4亞單位與一個(gè)或另一個(gè)β亞單位結(jié)合的整聯(lián)蛋白。除了VLA4之外的另一個(gè)“α4”整聯(lián)蛋白的實(shí)例是α4β7(見上述Lobb和Adams)。同樣，“α1整聯(lián)蛋白”或“含α1亞單位的整聯(lián)蛋白”是指那些α1亞單位與一個(gè)或另一個(gè)β亞單位結(jié)合的整聯(lián)蛋白。
整聯(lián)蛋白“拮抗劑”包括任何抑制含α1和/或α4亞單位的整聯(lián)蛋白與整聯(lián)蛋白配體和/或受體結(jié)合的化合物?？拐?lián)蛋白抗體或含抗體同系物的蛋白(見下述)以及可溶型整聯(lián)蛋白配體蛋白等其它分子都可使用。含α4亞單位的整聯(lián)蛋白的可溶型配體蛋白包括可溶性VCAM-1、VCAM-1融合蛋白或雙功能VCAM-1/Ig融合蛋白。例如，可以給藥整聯(lián)蛋白配體的可溶型或其片段，來結(jié)合整聯(lián)蛋白，并且優(yōu)先競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞上的整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，從而導(dǎo)致產(chǎn)生與施用抗整聯(lián)蛋白(例如VLA-1、VAL-4)抗體相類似的作用。本發(fā)明特別包括能結(jié)合配體但不能激發(fā)整聯(lián)蛋白依賴性信號(hào)傳遞的可溶性整聯(lián)蛋白突變體。此整聯(lián)蛋白突變體可作為野生型整聯(lián)蛋白蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，并被視為“拮抗劑”。在本發(fā)明方法中應(yīng)用的其它拮抗劑是下述的“小分子”。
本發(fā)明還包括應(yīng)用拮抗一種以上含α4亞單位的整聯(lián)蛋白作用的分子的方法，例如小分子或同時(shí)拮抗VLA-4和α4β7或含α4亞單位的整聯(lián)蛋白的其它組合的抗體同系物。本發(fā)明還包括應(yīng)用拮抗一種以上含α1亞單位的整聯(lián)蛋白作用的分子的方法。本發(fā)明還包括利用分子的組合以拮抗一種以上整聯(lián)蛋白之作用的方法，例如應(yīng)用幾種小分子或抗體同系物的方法，其中所述小分子或同系物的組合可拮抗VAL-4和α4β7或含α4亞單位的整聯(lián)蛋白的其它組合。
如本文所述，特定的整聯(lián)蛋白拮抗劑可與例如免疫球蛋白或其片段等抗體同系物融合或結(jié)合，并且不限定于整聯(lián)蛋白或配體或其它分子的特定類型或結(jié)構(gòu)。因此，根據(jù)本發(fā)明，能夠形成嵌合蛋白(見下述)和能夠結(jié)合整聯(lián)蛋白配體并且有效阻斷或包被含α4和/或α1亞單位的整聯(lián)蛋白的任何制劑，均被視為在本文實(shí)施例中應(yīng)用的拮抗劑的等價(jià)物。
“抗體同系物”包括由二硫鍵連接的免疫球蛋白輕鏈和重鏈組成的完整抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體同系物”還包括由一個(gè)或多個(gè)多肽組成的蛋白，所述多肽選自免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈及其能夠結(jié)合一個(gè)或多個(gè)抗原(即整聯(lián)蛋白或整聯(lián)蛋白配體)的抗原結(jié)合片段。由一種以上多肽組成的抗體同系物的組成多肽可任選被二硫鍵或共價(jià)鍵交聯(lián)，因此“抗體同系物”包括完整的IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型免疫球蛋白(及其亞型)，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是κ型或λ型?！翱贵w同系物”還包括完整抗體的保留了抗體結(jié)合特異性的一部分，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、F(v)片段、重鏈和輕鏈的單體或二聚體或其混合物。
“人源化抗體同系物”是通過重組DNA技術(shù)制備的抗體同系物，其中在人免疫球蛋白輕鏈或重鏈的抗原結(jié)合中不需要的部分或全部氨基酸序列已被來源于非人哺乳動(dòng)物免疫球蛋白輕鏈或重鏈的相應(yīng)氨基酸取代?！叭丝贵w同系物”是以下抗體同系物，其中免疫球蛋白輕鏈和重鏈的所有氨基酸(不管它們對(duì)抗原結(jié)合是否需要)均來源于人。
如本文中所用，“人抗體同系物”是由重組DNA技術(shù)制備的抗體同系物，其中免疫球蛋白輕鏈或重鏈的所有氨基酸均來源于人。
整聯(lián)蛋白“激動(dòng)劑”包括可激活整聯(lián)蛋白配體的任何化合物。
“氨基酸”是肽、多肽或蛋白的單體單位。在天然的肽、多肽和蛋白中發(fā)現(xiàn)了20種氨基酸，它們均為L(zhǎng)-異構(gòu)體。該術(shù)語(yǔ)還包括氨基酸的類似物和蛋白氨基酸的D-異構(gòu)體和它們的類似物。
“共價(jià)連接”是指本發(fā)明指定的部分(例如PEG化的α4和/或α1整聯(lián)蛋白拮抗劑，免疫球蛋白片段/α4或α1整聯(lián)蛋白拮抗劑)相互間直接共價(jià)結(jié)合，或者通過一個(gè)間插組分或多個(gè)組分，例如一個(gè)或多個(gè)間隔組分，間接共價(jià)連接。所述間插組分稱為“連接集團(tuán)”。術(shù)語(yǔ)“偶聯(lián)”與“共價(jià)連接”可以互換應(yīng)用。關(guān)于“間隔子(spacer)”是指可以插入到整聯(lián)蛋白拮抗劑或片段的氨基酸或其它成分與該分子的剩余部分之間的組分。間隔子可以使氨基酸或其它成分與該分子的剩余部分分離，以防止所進(jìn)行的修飾干擾蛋白的功能和/或使得氨基酸或其它成分與另一組分的連接更容易。
“表達(dá)調(diào)控序列”-當(dāng)與基因可操作地連接時(shí)能調(diào)控這些基因的表達(dá)的多核苷酸序列。
“表達(dá)載體”-當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，允許至少一種基因表達(dá)的多核苷酸，例如DNA質(zhì)?；蚴删w(其它通常的實(shí)例之中)。所述載體可以或不可以在細(xì)胞中復(fù)制。
本發(fā)明制劑的“有效量”是對(duì)所要治療的特定狀態(tài)產(chǎn)生結(jié)果或影響的總量。
氨基酸殘基的“功能等效物”是(i)與被功能等效物替代的氨基酸的反應(yīng)特性的氨基酸；(ii)本發(fā)明拮抗劑的氨基酸，所述氨基酸具有與被功能等效物替代的氨基酸相似的特性；(iii)與被功能等效物替代之氨基酸的特性相似的非氨基酸分子。
編碼本發(fā)明的蛋白性拮抗劑的第一個(gè)多核苷酸如果滿足至少一個(gè)下述條件，則是編碼該拮抗劑蛋白的第二個(gè)多核苷酸的“功能等效物”(a)所述“功能等效物”是在標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下與第二個(gè)多核苷酸雜交的第一個(gè)多核苷酸，和/或是與第一個(gè)多核苷酸序列簡(jiǎn)并的多核苷酸。最優(yōu)選其編碼具有整聯(lián)蛋白拮抗劑蛋白活性的突變蛋白；(b)所述“功能等效物”是第一個(gè)多核苷酸，其控制第二個(gè)多核苷酸編碼的氨基酸序列的表達(dá)。
本發(fā)明中應(yīng)用的整聯(lián)蛋白拮抗劑包括但不限于在此所列舉的試劑及其功能等效物。因而在本文中，術(shù)語(yǔ)“功能等效物”是指整聯(lián)蛋白拮抗劑或編碼整聯(lián)蛋白拮抗劑的多核苷酸，所述整聯(lián)蛋白拮抗劑對(duì)受體的作用與被認(rèn)為是功能等效物的整聯(lián)蛋白拮抗劑相同或其作用更有效。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可能會(huì)意識(shí)到可以通過重組技術(shù)制備功能等效蛋白，例如通過表達(dá)“功能等效DNA”。因而，本發(fā)明包括由天然DNAs以及非天然DNAs編碼的整聯(lián)蛋白蛋白，該非天然DNAs編碼的蛋白與天然DNA所編碼的蛋白相同。由于核苷酸編碼序列的簡(jiǎn)并性，其它多核苷酸可以被用來編碼整聯(lián)蛋白蛋白。這包括通過用編碼相同氨基酸殘基的不同密碼子進(jìn)行替換而產(chǎn)生沉寂(silent)改變的上述序列的全部或部分。這種改變的序列被視為這些序列的等效序列。例如，Phe(F)由兩個(gè)密碼子TTC或TTT編碼，Tyr(Y)由TAC或TAT編碼，His(H)由CAC或CAT編碼。另一方面，Trp(W)是由一個(gè)密碼子TGG編碼。因此，應(yīng)該明白對(duì)于一個(gè)編碼特殊整聯(lián)蛋白的特定DNA，有編碼它的多種DNA簡(jiǎn)并序列。這些簡(jiǎn)并DNA序列也屬于本發(fā)明。
當(dāng)指本發(fā)明的拮抗劑時(shí)，術(shù)語(yǔ)“嵌合”意思是拮抗劑包括兩個(gè)或更多具有不同結(jié)構(gòu)和/或來源的蛋白的結(jié)合(化學(xué)交聯(lián)或共價(jià)連接或其它)。因而，嵌合α4整聯(lián)蛋白拮抗劑包括α4整聯(lián)蛋白拮抗劑部分或其片段，和非α4整聯(lián)蛋白拮抗劑。嵌合α1整聯(lián)蛋白拮抗劑包括α1整聯(lián)蛋白拮抗劑部分或片段，和非α1整聯(lián)蛋白拮抗劑。
一種“嵌合”蛋白是“融合體”或“融合蛋白”，其意指兩個(gè)或更多蛋白或其片段通過它們各自的肽骨架共線并共價(jià)連接，最優(yōu)選通過編碼那些蛋白的多核苷酸的遺傳表達(dá)進(jìn)行連接。因此，優(yōu)選的融合蛋白是包括與非α4(α1)整聯(lián)蛋白拮抗劑的第二部分共價(jià)連接的α4(α1)整聯(lián)蛋白拮抗劑或其片段的嵌合蛋白。本發(fā)明的優(yōu)選融合蛋白可以包括完整抗體中保持抗原結(jié)合特異性的一部分，例如Fab段，F(xiàn)ab’段，F(xiàn)(ab’)2段，F(xiàn)(v)段，重鏈單體或二聚體，輕鏈單體或二聚體，由一條重鏈和一條輕鏈組成的二聚體等等。
最優(yōu)選的融合蛋白是嵌合蛋白，并且包括整聯(lián)蛋白拮抗劑部分，其與全部或部分免疫球蛋白輕鏈、重鏈或二者的鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)融合或連接。因此，本發(fā)明的分子的特點(diǎn)是其包括(1)整聯(lián)蛋白拮抗劑部分，(2)第二個(gè)肽，例如增加整聯(lián)蛋白拮抗劑部分的穩(wěn)定性或增加其體內(nèi)生存期的肽，例如免疫球蛋白超家族的成員或其片段或其一部分，如IgG的一部分或片段，如CH2、CH3和鉸鏈區(qū)等人IgG1重鏈恒定區(qū)。“整聯(lián)蛋白拮抗劑/Ig融合蛋白”特指包括與免疫球蛋白鏈N末端結(jié)合的本發(fā)明之具有生物活性的整聯(lián)蛋白拮抗劑分子(例如可溶性VLA-4或VLA1配體或其生物活性片段)的蛋白，其中免疫球蛋白N末端的一部分由整聯(lián)蛋白拮抗劑所取代。一種整聯(lián)蛋白拮抗劑/Ig融合蛋白為“整聯(lián)蛋白/Fc融合蛋白”，其包括與至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)連接的本發(fā)明的整聯(lián)蛋白拮抗劑。優(yōu)選的Fc融合蛋白包括與含免疫球蛋白重鏈C末端結(jié)構(gòu)域的抗體片段相連接的本發(fā)明之整聯(lián)蛋白拮抗劑。
術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”還指通過單功能或不同功能的分子與第二部分進(jìn)行化學(xué)連接并如下述從純化的蛋白中重新制備的整聯(lián)蛋白拮抗劑，所述第二部分為非整聯(lián)蛋白拮抗劑(導(dǎo)致“嵌合”分子)。并非重組連接，而是化學(xué)連接的嵌合分子(融合蛋白)的實(shí)例包括(1)α4整聯(lián)蛋白亞單位靶向部分，例如能與攜有VLA-4的細(xì)胞表面的VLA-4結(jié)合的VCAM-1部分；(2)增加靶向部分穩(wěn)定性或其體內(nèi)生存期的第二個(gè)分子，例如聚乙二醇(PEG)等聚亞烷基二醇聚合物。α4靶向部分可以是任何自然產(chǎn)生的α4配體或其片段，例如VCAM-1肽或相似的經(jīng)保守替代的氨基酸序列。
本文中“異源啟動(dòng)子”是指并非與基因或純化的核酸天然相關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子。
本文中“同源”與“相同”同義，指兩個(gè)多肽、分子或兩個(gè)核酸之間的序列相似性。當(dāng)兩個(gè)相比較的序列在同一位置上的堿基或氨基酸單體亞單位相同(例如，在兩個(gè)DNA分子的某一位點(diǎn)上均為腺苷酸，或者在兩個(gè)多肽的某一位點(diǎn)上均為賴氨酸)，那么在這個(gè)位點(diǎn)上這兩個(gè)分子同源。兩個(gè)序列間的同源百分率等于兩個(gè)序列間相匹配或同源的位點(diǎn)個(gè)數(shù)除以被比較的位點(diǎn)總數(shù)再乘100。例如，在兩個(gè)序列中，如果10個(gè)位點(diǎn)中的6個(gè)位點(diǎn)相匹配或同源，那么這兩條序列的同源性為60％。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT的同源性為50％(在總共6個(gè)位點(diǎn)中有3個(gè)位點(diǎn)相匹配)。通常，將兩個(gè)序列排列，對(duì)其進(jìn)行比較以給出最大同源性?？梢詰?yīng)用如下細(xì)述的Karlin和Altschul法進(jìn)行這樣排列。
同源序列共有相同的或相似的氨基酸殘基，其中相似的氨基酸殘基是指對(duì)所排列的參考序列中相應(yīng)氨基酸殘基的保守替代或“允許的點(diǎn)突變”。在這點(diǎn)上，參考序列中“保守替代”的殘基在物理上或功能上與相應(yīng)參考?xì)埢嗨?，例如這些殘基具有相似的大小、形狀、電荷、包括形成共價(jià)鍵或氫鍵的能力等化學(xué)特性等等。尤其優(yōu)選的保守替代是符合“可接受的點(diǎn)突變”定義標(biāo)準(zhǔn)的替代(Dayhoff等，5蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖集，5增刊3，22章354-352，Nat.Biomed.Res.Foundation，華盛頓特區(qū)(1978))。
在本文中“同源性”和“同一性”可互換應(yīng)用，二者均指兩個(gè)多肽序列間的序列相似性?？梢酝ㄟ^比較為了對(duì)比而排列的各個(gè)序列中的位點(diǎn)來確定同源性和同一性。當(dāng)在被對(duì)比的序列中某個(gè)位點(diǎn)上為相同的氨基酸時(shí)，那么這些多肽可被認(rèn)為在那個(gè)位點(diǎn)上相同；當(dāng)在等價(jià)位點(diǎn)上為同樣的氨基酸(例如相同(identical))或相似的氨基酸(例如相似的立體性和/或電性)時(shí)，那么可以認(rèn)為這些分子在那個(gè)位點(diǎn)上同源。序列間同源性或同一性的百分率是這些序列中相匹配或同源的位點(diǎn)個(gè)數(shù)的函數(shù)?！胺窍嚓P(guān)”或“非同源”序列與本發(fā)明序列的同一性低于40％，優(yōu)選同一性低于25％。
利用Karlin和Altschul(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，872264(1990))的排列算法(在Karlin和Altschul(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，905873(1993))中進(jìn)行了修改)確定兩個(gè)氨基酸序列或核苷酸序列的“同源性百分率”。在NBLAST或XBLAST程序(Altschul等，J.Mol.Biol.215403(1990))中并入了此算法。用NBLAST程序(分值＝100，字長(zhǎng)＝12)進(jìn)行BLAST搜查，獲得與本發(fā)明的核酸同源的核苷酸序列。用XBLAST程序(分值＝50，字長(zhǎng)＝3)進(jìn)行BLAST蛋白搜查，獲得與參考多肽同源的氨基酸序列。為了得到缺口型對(duì)比排列，應(yīng)用Altschul等(核酸研究，253389(1997))所述缺口化BLAST。當(dāng)應(yīng)用BLAST和缺口化BLAST時(shí)，使用各自程序(XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。見http//www/ncbi.nlm.nih.gov.
“分離的(isolated)”(與“基本上純的”可互換應(yīng)用)在用于核酸時(shí)，即用于編碼整聯(lián)蛋白拮抗劑的多核苷酸序列時(shí)，是指RNA或DNA多核苷酸、基因組多核苷酸的一部分、cDNA或合成多核苷酸，依其來源或操作方法，這些多核苷酸(i)不與其天然相關(guān)聯(lián)的多核苷酸100％相關(guān)聯(lián)(例如，在宿主細(xì)胞中作為表達(dá)載體或其一部分而存在)；或(ii)與其天然連接的核酸或其它化學(xué)組分之外的核酸或其它化學(xué)組分連接；或(iii)非天然產(chǎn)生?！胺蛛x的”多核苷酸進(jìn)一步指如下多核苷酸序列(i)在體外通過例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的多核苷酸；(ii)化學(xué)合成的多核苷酸；(iii)通過克隆而重組制備的多核苷酸；或(iv)通過切割并經(jīng)膠分離純化的多核苷酸。因此，“基本上純的核酸”是不與兩個(gè)編碼序列之一或全部直接相鄰的核酸，而在正常情況下，所述編碼序列在該核酸的來源生物的天然基因組中與其相鄰?；旧霞兊腄NA還包括重組DNA，其為編碼附加整聯(lián)蛋白序列的雜合基因的一部分。
“分離的”(與“基本上純的”可互換應(yīng)用)在用于多肽時(shí)，依其來源和操作方法，這些多肽是指(i)在宿主細(xì)胞中作為表達(dá)載體的一部分表達(dá)產(chǎn)物而存在；或(ii)與其天然連接的蛋白或其它化學(xué)組分之外的蛋白或其它化學(xué)組分連接；或(iii)非天然產(chǎn)生，例如經(jīng)化學(xué)處理的蛋白，通過附加或增加至少一個(gè)疏水基團(tuán)，使所述蛋白形成非天然形態(tài)。“分離的”蛋白進(jìn)一步指如下蛋白(i)化學(xué)合成的蛋白；或(ii)在宿主細(xì)胞中表達(dá)并從相關(guān)蛋白和雜質(zhì)蛋白中純化的蛋白。該術(shù)語(yǔ)通常指從其它蛋白及其天然核酸中分離的多肽。優(yōu)選從用于純化的抗體或膠基質(zhì)(聚丙烯酰胺)等物質(zhì)中分離的所述多肽。
“多價(jià)蛋白復(fù)合物”指多價(jià)整聯(lián)蛋白拮抗劑(即一個(gè)或多個(gè))?？拐?lián)蛋白抗體同系物或片段可以與另一抗體同系物或片段進(jìn)行交聯(lián)或結(jié)合。各個(gè)蛋白可以相同或不同，而且各個(gè)抗體同系物或片段也可以相同或不同。
“突變體”-生物體遺傳物質(zhì)的任何改變，尤其是野生型多核苷酸序列的任何改變(即缺失、替代、插入或變更)或野生型蛋白的任何改變。術(shù)語(yǔ)“突變蛋白”與“突變體”可互換應(yīng)用。
“可操作地相連”-在表達(dá)調(diào)控序列調(diào)控多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)，多核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列可操作地相連。術(shù)語(yǔ)“可操作地相連”包括在要表達(dá)的多核苷酸序列的前面具有適當(dāng)?shù)钠鹗夹盘?hào)(例如ATG)，并且維持正確的閱讀框，以允許多核苷酸序列在表達(dá)調(diào)控序列控制下表達(dá)，產(chǎn)生該多核苷酸序列編碼的所需多肽。
“藥學(xué)制劑”定義為給受試者施用的一種或多種影響拮抗劑作用的化合物或分子或其它化學(xué)實(shí)體(除了本發(fā)明拮抗劑之外)。在此應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)制劑”指在“聯(lián)合治療”期間給藥的試劑，此時(shí)本發(fā)明的拮抗劑在一或多種藥學(xué)制劑給藥之前、之后或同時(shí)給藥。
“蛋白”-基本上由20種氨基酸中任何氨基酸組成的任何聚合物。雖然“多肽”經(jīng)常用來指相對(duì)大的多肽，而“肽”經(jīng)常用來指小的多肽，但在本領(lǐng)域中，這些術(shù)語(yǔ)的使用是重疊并變化的。除非注明，在此應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“蛋白”指肽、蛋白和多肽。
術(shù)語(yǔ)“肽”、“蛋白”和“多肽”在本文中可互換使用。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本文中也可互換使用。
本文中應(yīng)用的“重組體”是指蛋白來源于重組的哺乳動(dòng)物表達(dá)體系。因?yàn)檎?lián)蛋白即未被糖基化又不合二硫鍵，所以它可以在大多數(shù)原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。
“小分子”-見A2章節(jié)的定義。
短語(yǔ)“表面氨基酸”指當(dāng)?shù)鞍走M(jìn)行天然折疊時(shí)，暴露于溶劑的任何氨基酸。
“雜交條件”通常指雜交和洗滌的鹽和溫度條件，鹽的條件基本上等于0.5XSSC到5XSSC，溫度條件為65℃。因此，在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)準(zhǔn)雜交條件”是操作上的定義，其包括雜交條件的范圍。然而，“高度嚴(yán)謹(jǐn)”條件包括與噬菌斑篩選緩沖液(0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％Ficoll 400；0.2％牛血清白蛋白，50mM Tris-HCl(pH7.5)；1M NaCl；1％焦磷酸鈉；1％SDS)，10％硫酸葡聚糖和100μg/ml變性并經(jīng)超聲降解的鮭精DNA在65℃雜交12-20小時(shí)，并用75mM NaCl/7.5mM檸檬酸鈉(0.5XSSC)/1％SDS在65℃洗滌?！暗蛧?yán)謹(jǐn)度”條件包括與與噬菌斑篩選緩沖液，10％硫酸葡聚糖和110μg/ml變性并經(jīng)超聲降解的鮭精DNA在55℃雜交12-20小時(shí)，并用300mMNaCl/30mM檸檬酸鈉(2.0XSSC)/1％SDS在55℃洗滌。見現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，John Wiley和Sons，Inc.New York，6.3.1-6.3.6章節(jié)(1989)。
在本文中應(yīng)用的“治療組合物”定義為包括本發(fā)明的拮抗劑和其它生物學(xué)上可相容的成分。治療組合物可以包括水、礦物質(zhì)和蛋白等載體。
“患有纖維變性的受試者”是指但不限定于患有內(nèi)臟器官纖維變性的受試者，患有皮膚纖維變性疾病的受試者，和患有眼睛纖維變性的受試者。內(nèi)臟器官(例如肝臟，肺，腎，心血管，胃腸道)的纖維變性發(fā)生在肺纖維變性、骨髓纖維變性、肝硬化、系膜增生性腎小球腎炎、新月體性腎小球腎炎、糖尿病性腎病、腎間質(zhì)性纖維變性、環(huán)孢菌素治療所致腎纖維變性和HIV相關(guān)的腎病等疾病中。皮膚纖維變性疾病包括但不限定于硬皮病、局限性硬皮病、瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕、家族性皮膚膠原病和結(jié)締組織膠原痣。眼睛的纖維變性包括糖尿病視網(wǎng)膜病、手術(shù)后結(jié)瘢(例如，青光眼過濾手術(shù)和內(nèi)斜視手術(shù)之后)和增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變等。可以用本發(fā)明方法治療的其他纖維變性包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、與長(zhǎng)期關(guān)節(jié)痛和關(guān)節(jié)退化相關(guān)的疾?。贿M(jìn)行性系統(tǒng)性硬化病、多肌炎、皮肌炎、嗜酸細(xì)胞性筋膜炎、局限性硬皮病、Raynaud’s綜合癥和鼻息肉病。另外，可以用本發(fā)明方法治療的纖維變性狀態(tài)還包括在已知形成瘢痕瘤或肥厚性瘢痕的患者中抑制瘢痕的過度增殖，在各種類型傷口(包括外科切口、外科腹部傷口和創(chuàng)傷性撕裂)愈合期間抑制或預(yù)防瘢痕形成或瘢痕的過度增生，在冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后預(yù)防或抑制動(dòng)脈的瘢痕形成和再閉合，在梗死形成之后和過敏性血管病中抑制或預(yù)防與心臟纖維變性相關(guān)的過量瘢痕或與纖維組織形成。
“有效量”是足以產(chǎn)生有利效應(yīng)或所需結(jié)果的量。有效量可以一次或分多次給與。就治療而言，根據(jù)所治療疾病的可接受標(biāo)準(zhǔn)，在本發(fā)明中所使用的拮抗劑的有效量是足以減輕、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減緩或推遲纖維變性進(jìn)程的量。功效指征的檢測(cè)和測(cè)定可以通過多種有效診斷工具進(jìn)行，這些診斷工具包括例如驗(yàn)血、肺功能檢測(cè)和胸部X射線檢測(cè)等體檢；CT掃描；支氣管鏡檢；支氣管肺泡灌洗；肺活檢和CT掃描。
除非特別指出，本發(fā)明的實(shí)施將使用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、蛋白質(zhì)化學(xué)、藥理學(xué)和免疫學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)，這些技術(shù)屬于本領(lǐng)域的技術(shù)。這些技術(shù)已在文獻(xiàn)中被敘述，除非特殊規(guī)定，在詳述部分引用的參考文獻(xiàn)在此引入作為參考。
II優(yōu)選實(shí)施方案的敘述本申請(qǐng)涉及合α1和/或α4亞單位的整聯(lián)蛋白的拮抗劑及其片段可用于肺纖維變性治療的發(fā)現(xiàn)。
A.整聯(lián)蛋白拮抗劑為了本發(fā)明的目的，整聯(lián)蛋白拮抗劑可以是整聯(lián)蛋白與其同源配體或受體之間任何相互作用的拮抗劑，使得配體-受體相互作用所誘導(dǎo)的正常功能發(fā)生變化(即阻止或減慢或其它改變)。整聯(lián)蛋白拮抗劑的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是α4整聯(lián)蛋白與其配體，如VCAM-1/VLA-4相互作用的拮抗劑。這是一種能夠抑制或阻斷VCAM和/或VLA-4介導(dǎo)的結(jié)合，或者能夠調(diào)節(jié)VCAM-1和/或VLA-4功能的試劑，例如多肽或其它分子，它們通過例如抑制或阻斷VLA-4-配體介導(dǎo)的VLA-4信號(hào)傳遞或VCAM-1-配體介導(dǎo)的VCAM-1信號(hào)傳遞，并且在急性腦損傷的治療中有效，優(yōu)選用與抗VLA-4抗體治療相同的方式。
VCAM-1/VLA-4相互作用的拮抗劑是具有一個(gè)或多個(gè)下述特性的試劑(1)它以足夠的特異性包被或結(jié)合VLA-4負(fù)載細(xì)胞(例如內(nèi)皮細(xì)胞)表面上的VLA-4，來抑制VLA-4-配體/VLA-4相互作用，例如VCAM/VLA-4相互作用；(2)它以足夠的特異性包被或結(jié)合VLA-4負(fù)載細(xì)胞(即淋巴細(xì)胞)表面上的VLA-4，來改變(優(yōu)選抑制)VLA-4-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，例如VCAM-1/VLA-4介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)；(3)它以足夠的特異性包被或結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞上的VLA-4-配體(例如VCAM-1)，來抑制VLA-4/VCAM-1相互作用；(4)它以足夠的特異性包被或結(jié)合VLA-4-配體(例如VCAM-1)，來改變(優(yōu)選抑制)VLA-4-配體介導(dǎo)的VLA-4信號(hào)傳導(dǎo)，例如VCAM-1介導(dǎo)的VLA-4信號(hào)傳導(dǎo)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述拮抗劑擁有特性1和/或2。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述拮抗劑擁有特性3和/或4。而且，可以應(yīng)用一個(gè)以上的拮抗劑，例如可以將結(jié)合VLA-4的試劑與結(jié)合VCAM-1的試劑聯(lián)合應(yīng)用。
整聯(lián)蛋白拮抗劑的另一個(gè)實(shí)施方案是α1整聯(lián)蛋白與其配體相互作用例如膠原蛋白/VLA-1相互作用的拮抗劑。它是一種能夠抑制或阻斷膠原蛋白和/或VLA-1介導(dǎo)的結(jié)合，或者能夠調(diào)節(jié)膠原蛋白和/或VLA-1的功能的試劑，例如多肽或其它分子，它們例如通過抑制或阻斷VLA-1-配體介導(dǎo)的VLA-1信號(hào)傳導(dǎo)或膠原蛋白介導(dǎo)的膠原蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。膠原蛋白/VLA-1相互作用的拮抗劑是具有一個(gè)或多個(gè)下述特性的試劑(1)它以足夠的特異性包被或結(jié)合VLA-1負(fù)載細(xì)胞表面上的VLA-1(例如膠原蛋白)，來抑制VLA-1-配體/VLA-1相互作用，例如膠原蛋白/VLA-1相互作用；(2)它以足夠的特異性包被或結(jié)合VLA-1負(fù)載細(xì)胞表面上的VLA-1，來改變(優(yōu)選抑制)VLA-1-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，例如VLA-1/膠原蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)；(3)它以足夠的特異性包被或結(jié)合VLA-1-配體(例如膠原蛋白)，來抑制VLA-1/膠原蛋白相互作用；(4)它以足夠的特異性包被或結(jié)合VLA-1-配體，來改變并優(yōu)選抑制VLA-1-配體介導(dǎo)的VLA-1信號(hào)傳導(dǎo)，例如膠原蛋白介導(dǎo)的VLA-1信號(hào)傳導(dǎo)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述α1拮抗劑擁有特性1和/或2。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述拮抗劑擁有特性3和/或4。而且，可以向患者給藥一種以上的拮抗劑，例如可以將結(jié)合VLA-1的試劑與結(jié)合膠原蛋白的試劑聯(lián)合應(yīng)用。
如本文所討論，用于本發(fā)明方法的拮抗劑不限于特定類型或結(jié)構(gòu)的分子，所以對(duì)本發(fā)明來說，并且僅作為實(shí)例，能夠結(jié)合細(xì)胞表面的α4整聯(lián)蛋白(例如VLA-4)或α4配體(例如α4配體負(fù)載細(xì)胞表面上的VCAM-1)并有效阻斷或包被α4整聯(lián)蛋白(例如VLA-4)或α4配體(例如VCAM-1)(分別稱為“α4整聯(lián)蛋白結(jié)合劑”和“α4整聯(lián)蛋白配體結(jié)合劑”)的任何試劑均被視為在本文實(shí)施例中應(yīng)用的拮抗劑的等效物。
例如，可使用抗體或抗體同系物(見下述)以及VLA-4和VCAM-1的可溶型天然結(jié)合蛋白。VLA-4的可溶型天然結(jié)合蛋白包括可溶型VCAM-1肽，VCAM-1融合蛋白，雙功能VCAM-1/Ig融合蛋白(例如上述“嵌合”分子)，纖連蛋白，具有經(jīng)選擇性剪接的非III型連接片段的纖連蛋白，和包含氨基酸序列EILDV或類似的保守替代型氨基酸序列的纖連蛋白。VCAM-1的可溶型天然結(jié)合蛋白包括可溶型VLA-4肽，VLA-4融合蛋白，雙功能VLA-4/Ig融合蛋白等等。如本文中所用，“可溶型VLA-4肽”或“可溶型VCAM-1肽”是不能將其本身固定在膜上的VLA-4或VCAM-1多肽。例如，這樣的可溶型多肽包括缺少足以將其固定的跨膜結(jié)構(gòu)域部分的VLA-4和VCAM多肽，或者被修飾而使其跨膜結(jié)構(gòu)域功能喪失的VLA-4和VCAM多肽。這些結(jié)合試劑可以通過與VLA-4的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白競(jìng)爭(zhēng)或者通過改變VLA-4的功能而起作用。例如，可以給藥可溶型VCAM-1(例如見Osborn等，1989，細(xì)胞，591203-1211)或其片段來結(jié)合VLA-4，優(yōu)選競(jìng)爭(zhēng)VCAM-1負(fù)載細(xì)胞上的VLA-4結(jié)合位點(diǎn)，從而導(dǎo)致產(chǎn)生與小分子或抗VLA-4-抗體等拮抗劑給藥相似的效果。
1.抗整聯(lián)蛋白抗體同系物在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中用于結(jié)合(包括阻斷或包被)細(xì)胞表面α1和/或α4整聯(lián)蛋白(例如VLA-1，VLA-4或α4β7)和/或α1和/或α4整聯(lián)蛋白的細(xì)胞表面配體(例如分別為膠原蛋白或VCAM-1)的拮抗劑，是上述的抗-VLA-1或抗VLA-4和/或抗膠原蛋白和/或抗VCAM-1單克隆抗體或抗體同系物。用于治療的尤其是用于人類治療的優(yōu)選抗體和同系物，包括人抗體同系物，人源化抗體同系物，嵌合抗體同系物，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2和F(v)抗體片段，和抗體重鏈或輕鏈的單體或二聚體或其混合物。在本發(fā)明方法中，抗VLA-4單克隆抗體是優(yōu)選的結(jié)合試劑。
2.小分子整聯(lián)蛋白拮抗劑術(shù)語(yǔ)“小分子”整聯(lián)蛋白拮抗劑指能夠干擾整聯(lián)蛋白/整聯(lián)蛋白配體相互作用的化學(xué)試劑(即有機(jī)分子)，例如其通過結(jié)合細(xì)胞表面的VLA-4或結(jié)合細(xì)胞表面的VCAM-1而阻斷VLA-4/VCAM相互作用。這樣的小分子還可以分別結(jié)合VLA-4和VCAM-1受體。VLA-4和VCAM-1小分子抑制劑本身可以是肽，半肽化合物或非肽化合物，例如針對(duì)VCAM-1/VLA-4相互作用的拮抗劑的有機(jī)小分子。本文所定義的“小分子”不包括抗體或抗體同系物。小分子實(shí)例的分子量通常小于1000。
例如，可以使用能模擬VLA-4配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域并與VLA-4受體結(jié)構(gòu)域相吻合的寡糖等小分子。(見J.J.Devlin等，1990，科學(xué)249400-406(1990)，J.K.Scott和GP.Smith，1990，科學(xué)249386-390，和美國(guó)專利4833092(Geysen)，均在此引入作為參考)。相反，可以使用能模擬VCAM-1配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域并與VCAM-1受體結(jié)構(gòu)域相吻合的小分子。
在本發(fā)明中有用的其它小分子可以參見Komoriya等的文獻(xiàn)(“在選擇性剪接的纖連蛋白III型連接段結(jié)構(gòu)域之內(nèi)，主要細(xì)胞類型特異性粘附位點(diǎn)(CS1)的最小基本序列是亮氨酸-天冬氨酸-纈氨酸”，生物學(xué)化學(xué)雜志，266(23)，15075-79(1991))。他們鑒定了結(jié)合VLA-4所必須的最小有效氨基酸序列，并根據(jù)特定纖連蛋白CS-1區(qū)(VLA-4結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列，合成了多種重疊肽。他們鑒定了一個(gè)8氨基酸肽，Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr，以及兩個(gè)較小的重疊的5肽，Glu-Ile-Leu-Asp-Val和Leu-Asp-Val-Pro-Ser，這些肽具有抵抗纖連蛋白依賴性細(xì)胞粘附的抑制活性。后來證實(shí)某些含LDV序列的較大的肽在體內(nèi)具有活性(T.A.Ferguson等，“兩種整聯(lián)蛋白結(jié)合肽在體內(nèi)可消除T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，88，8072-76(1991)；和S.M.Wahl等，“合成性纖連蛋白在大鼠中通過干擾白細(xì)胞粘附和再生抑制關(guān)節(jié)炎”，J.Clin.Invest.，94，655-62(1994))。還有文獻(xiàn)報(bào)道了能同時(shí)抑制VLA-4和VLA-5與纖連蛋白的粘附的環(huán)狀五肽，Arg-Cys-Asp-Tpro-Cys(其中TPro指4-硫代脯氨酸)。(例如見D.M.Nowlin等，“一種新的環(huán)狀五肽抑制α4β1整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附”，生物學(xué)化學(xué)雜志，268(27)，20352-59(1993)；和PCT/US91/04862)。這個(gè)五肽是以源自纖連蛋白的三肽序列Arg-Gly-Asp為基礎(chǔ)，已知該三肽是幾種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的識(shí)別位點(diǎn)中的共同基序。例如，在Adams等(“細(xì)胞粘附抑制劑”，PCT US97/13013)中，還報(bào)道了其它VLA-4抑制劑的實(shí)例，該文獻(xiàn)描述了具有細(xì)胞粘附抑制活性的含β-氨基酸的線性肽基化合物。在國(guó)際專利出版物WO94/15958和WO92/00995中，敘述了具有細(xì)胞粘附抑制活性的環(huán)狀肽和peptidomimetic化合物。在國(guó)際專利出版物WO93/08823和WO92/08464中，敘述了含胍基、尿素和硫脲的細(xì)胞粘附抑制化合物。美國(guó)專利號(hào)5260277中敘述了胍基細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)化合物。在一些文獻(xiàn)中敘述了VLA-4的其它肽基拮抗劑，這些文獻(xiàn)包括D.Y.Jackson等，“強(qiáng)效α4β1肽拮抗劑作為潛在的抗炎試劑”，J.Med.Chem.，40，3359(1997)；H.Shroff等，“針對(duì)α4β7介導(dǎo)的MadCAM-1與淋巴細(xì)胞的粘附的小肽抑制劑”，Bio.Med.Chem.Lett.，1，2495(1996)；美國(guó)專利5510332，PCT出版物WO98/53814、WO97/03094、WO97/02289、WO96/40781、WO96/22966、WO96/20216、WO96/01644、WO96106108和WO95/15973等等。
通過合成大量的肽(例如長(zhǎng)度為5-20個(gè)氨基酸)、半肽化合物或非肽有機(jī)化合物，然后篩選這些化合物對(duì)相應(yīng)VLA-1/膠原蛋白或VLA-4/VCAM-1之間相互作用的抑制能力，可以制備這樣的小分子試劑。通常見美國(guó)專利號(hào)4833092，Scott和Smith，“在表位文庫(kù)中尋找肽配體”，科學(xué)，249，386-90(1990)，和Devlin等，“隨機(jī)肽文庫(kù)特異性蛋白結(jié)合分子的來源”，科學(xué)，249，40407(1990)。
B.制備抗整聯(lián)蛋白抗體同系物的方法制備單克隆抗體(例如包括抗整聯(lián)蛋白單克隆抗體)的技術(shù)眾所周知。例如見Mendrick等，1995，Lab.Invest.72367-375(鼠抗α1β1和抗α2β1的mAbs)；Sonnenberg等，1987，生物學(xué)化學(xué)雜志26210376-10383(鼠抗α6β1mAbs)；Yao等，1996，J Cell Sci 1996 1093139-50(鼠抗α7β1mAbs)；Hemeler等，1984，免疫學(xué)雜志，1323011-8(人α1β1mAbs)；Pischel等，1987 J Immunol 138226-33(人α2β1mAbs)；Wayner等，1988，J Cell Biol1071881-91(人α3β1mAbs)；Hemler等，1987，J Biol Chem 26211478-85(人α4β1mAbs)；Wayner等，1988 J Cell Biol 1071881-91(人α5β1mAbs)；Sonnenberg等，1987，J Biol Chem 26210376-10383(人α6β1mAbs)；A Wang等，1996 Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15664-672(人α9β1mAbs)；Davies等，1989 J Cell Biol 1091817-26(人αVβ1mAbs)；Sanchez-Madrid等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 797489-93(人αLβ2mAbs)；Diamond等，1993，J Cell Biol 1201031-43(人αMβ2mAbs)；Stacker等，1991 J Immunol 146648-55(人αXβ2mAbs)；Van der Vieren等，1995，Immunity 3683-90(人αDβ2mAbs)；Bennett等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802417-21(人αIIbβ3mAbs)；Hessle等，1984，Differetiation 2649-54(人α6β4mAbs)；Weinacker等，1994 J Biol Chem 2696940-8(人αVβ5mAbs)；Weinacker等，1994 J Biol Chem 2696940-8(人αVβ6mAbs)；Cerf-Bensussan等，1992Eur J Immunol 22273-7(人αEβ7mAbs)；Nishimura等，1994 J Biol Chem26928708-15(人αVβ8mAbs)；Bossy等，1991 EMBO J102375-85(人α8β1多克隆抗血清)；Camper等，1998 J Biol Chem，27320383-20389(人α10β1多克隆抗血清)。
本文中考慮的優(yōu)選整聯(lián)蛋白拮抗劑可以由完整或截取的基因組或cDNA或者合成的DNAs在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)?？梢詫⒍垠w蛋白從培養(yǎng)基中分離，和/或使其在體外再折疊或二聚體化以形成具有生物活性的組合物。通過將獨(dú)立的且不同的多肽鏈結(jié)合，可在體外形成異二聚體?；蛘?，通過將編碼獨(dú)立的且不相同的多肽鏈的核酸在單一細(xì)胞中進(jìn)行共表達(dá)，也可以形成異二聚體。例如，見WO93/09229，或美國(guó)專利5411941中幾個(gè)重組異二聚體蛋白制備方案的實(shí)例。目前優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括但不限于大腸桿菌等原核生物或者真核生物，所述真核生物包括酵母，糖酵母屬(Saccharomyces)，昆蟲細(xì)胞或CHO、COS或BSC細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到可以利用其它宿主細(xì)胞。
例如，通過免疫沉淀VLA-4表達(dá)細(xì)胞的125I標(biāo)記裂解物，可以鑒定抗VLA-4抗體。(見Sanchez等，1986，Eur.J.Immunol，161343-1349和Hemler等，1987，J.Biol.Chem.，262，11478-11485)。通過流式細(xì)胞術(shù)，例如通過檢測(cè)與識(shí)別VLA-4的抗體共同溫育的Ramos細(xì)胞的熒光染色，可以識(shí)別抗VLA-4抗體(見Elices等，1990細(xì)胞，60577-584)。在雜交瘤細(xì)胞制備中應(yīng)用的淋巴細(xì)胞通常從經(jīng)檢驗(yàn)其血清為抗VLA-4抗體陽(yáng)性的免疫哺乳動(dòng)物中分離。
永生化細(xì)胞系(如骨髓瘤細(xì)胞系)通常來源于與淋巴細(xì)胞來源相同的哺乳動(dòng)物物種。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，其對(duì)含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基”)敏感。典型的方法是利用1500分子量的聚乙二醇(“PEG1500”)將HAT敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞融合。然后用HAT培養(yǎng)基篩選融合所得雜交瘤細(xì)胞，未融合的和無效融合的骨髓瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中被殺死(由于未融合的淋巴細(xì)胞沒有被轉(zhuǎn)化，幾天之后它們將死掉)。通過篩選該雜交瘤培養(yǎng)上清，檢測(cè)產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤。例如，通過檢測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清中能夠與重組α4-亞單位-表達(dá)細(xì)胞系結(jié)合的分泌抗體，可以篩選用來產(chǎn)生抗VLA-4抗體的雜交瘤(見上述Elices等)。
為了產(chǎn)生完整免疫球蛋白形式的抗-VLA-4抗體同系物，在足以使雜交瘤細(xì)胞將單克隆抗體分泌到培養(yǎng)基中的條件下和時(shí)間中，將在所述篩選試驗(yàn)中檢測(cè)為陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。適合于雜交瘤細(xì)胞的組織培養(yǎng)技術(shù)和培養(yǎng)基眾所周知。用眾所周知的方法收獲經(jīng)調(diào)整的雜交瘤培養(yǎng)上清并任選進(jìn)一步純化抗VLA-4抗體。
或者，通過將雜交瘤細(xì)胞注射到未經(jīng)免疫的小鼠腹腔中而制備所需抗體。雜交瘤細(xì)胞在腹腔中增殖，分泌積聚為腹水形式的抗體?？梢酝ㄟ^用注射器從腹腔中抽出腹水的方法，收獲所述抗體。
在先前已經(jīng)有一些小鼠抗-VLA-4單克隆抗體的報(bào)道。例如，見上述Sanchez-Madrid等，1986；上述Hemler等，1987；Pulido等，1991，J.Biol.Chem，266(16)，10241-10245)；Issukutz和Wykretowica，1991，J.Immunol.，147109(TA-2mab)。這些抗VLA-4單克隆抗體以及能夠識(shí)別VLA-4的α和/或β鏈的其它抗VLA-4抗體(如美國(guó)專利5,888,507-Biogen公司，及其中的參考文獻(xiàn))在根據(jù)本發(fā)明的治療方法中將是有用的。優(yōu)選識(shí)別VLA-4α4鏈表位的抗VLA-4抗體，所述表位涉及VCAM-1與纖連蛋白配體的結(jié)合(即在涉及配體結(jié)合的位點(diǎn)上能與VLA-4結(jié)合并阻斷VCAM-1與纖連蛋白結(jié)合的抗體)。這類抗體已經(jīng)被定義為B表位特異的抗體(B1或B2)(上述Pulido等，1991)，它也是本發(fā)明抗-VLA-4抗體。
抗VLA-4的純?nèi)祟悊慰寺】贵w同系物是另一優(yōu)選的可以在本發(fā)明方法中阻斷或包被VLA-4配體的結(jié)合劑。它們可利用體外引發(fā)的脾細(xì)胞制備成完整形式，如Boerner等所述(Boerner等，1991，J.Immunol.，147，86-95)。或者可以用Presson等(Presson等，1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，882432-2436)或Huang和Stollar(Huang和Stollar，1991，J.Immunol.Methods 141，227-236)所述各組分分別克隆技術(shù)制備它們。美國(guó)專利5798230(1998年8月25日，“制備人單克隆抗體的方法及其應(yīng)用”)中敘述了從人B細(xì)胞中制備人單克隆抗體的方法。根據(jù)這個(gè)方法，通過用Epstein-Barr病毒或其表達(dá)Epstein-Barr病毒核抗原2(EBNA2)的衍生物轉(zhuǎn)染能產(chǎn)生人抗體的B細(xì)胞，使其永生化。隨后關(guān)閉永生化過程所必需的EBNA2功能，使抗體產(chǎn)量增加。
在另一個(gè)用于制備純?nèi)祟惪贵w的方法中，美國(guó)專利5789650(1998年8月4日，“用于制備異源性抗體的非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”)中敘述了能夠制備異源性抗體的非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和具有滅活的內(nèi)源性免疫球蛋白基因的非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。內(nèi)源性免疫球蛋白基因被反義多核苷酸抑制，和/或被抗內(nèi)源性免疫球蛋白的抗血清抑制。異源性抗體由并非在該非人類動(dòng)物基因組中正常存在的免疫球蛋白基因編碼。將包括未重排的異源性人免疫球蛋白重鏈序列的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨祟悇?dòng)物，形成能重排出有功能的轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白序列，并產(chǎn)生一整套由人免疫球蛋白基因編碼的各種同種型抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。所述異源性人抗體在B細(xì)胞中產(chǎn)生，這些B細(xì)胞然后通過例如與骨髓瘤等永生化細(xì)胞系融合而永生化，或者通過用其它技術(shù)處理該B細(xì)胞使能夠產(chǎn)生單克隆異源性純?nèi)丝贵w同系物的細(xì)胞系永生化。
可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的噬菌體技術(shù)以大的未免疫的人噬菌體展示文庫(kù)來分離高親和力的可以發(fā)展成人類治療藥物的抗體(Vaughan等，1996)。
可以阻斷或包被本發(fā)明的方法中所用整聯(lián)蛋白配體的另一優(yōu)選結(jié)合試劑是具有抗整聯(lián)蛋白特異性的人源化重組抗體。在制備嵌合抗體的早期方法之后，EP 0239400(Winter等)描述了一種新方法，其中通過將一種抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)用另一種的相應(yīng)區(qū)代替而改變抗體。該方法可用于，例如將人類重鏈和輕鏈Ig可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的CDR用來自鼠的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的另一種CDR取代。隨后使這些已改變的Ig可變區(qū)與人的Ig恒定區(qū)組合，產(chǎn)生除取代的鼠CDR以外，完全由人的成分組成的抗體。預(yù)計(jì)這些CDR-取代型抗體相對(duì)于真正的嵌合抗體較不易于激發(fā)人類的免疫應(yīng)答，因?yàn)镃DR-取代型抗體只含有很少量的非人類成分。經(jīng)由CDR“移植”而產(chǎn)生人源化單克隆抗體的方法被稱為“整形(reshaping)”(Riechmann等，1988，自然332323-327；Verhoeyen等，1988，科學(xué)2391534-1536)。
通常，將鼠的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植在人類抗體中相應(yīng)區(qū)上，因?yàn)樗鯟DR(抗體重鏈上3個(gè)，輕鏈上3個(gè))是小鼠抗體上的特異性抗原結(jié)合區(qū)?？赏ㄟ^基因工程移植CDR，其中CDRDNA序列通過克隆鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)(V區(qū))基因片段來測(cè)定，然后通過定點(diǎn)誘變轉(zhuǎn)移至相應(yīng)人的恒定區(qū)。在該方法的最后階段，添加具有所需同種型的人類恒定區(qū)基因片段(通常為CH的γI型和CL的κ型)，使人源化重鏈和輕鏈基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共表達(dá)，以產(chǎn)生可溶性人源化抗體。
向人的抗體轉(zhuǎn)移這些CDR使該抗體具備了來源鼠抗體的抗原結(jié)合特性。鼠抗體上的6個(gè)CDR安裝在V區(qū)的“框架區(qū)”上。CDR-移植成功的原因是，小鼠與人的抗體框架區(qū)可能具有非常相似的三維結(jié)構(gòu)，且具有相似的CDR附著點(diǎn)，使得CDR可以互相交換。這類人源化抗體同系物可通過如Jones等，1986，自然321522-525；Riechmann，1988，自然332323-327；Queen等，1989，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)8610029和Orlandi等，1989，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)863833所述制備。
盡管如此，框架區(qū)中某些氨基酸被認(rèn)為可與CDR反應(yīng)并影響整個(gè)抗原結(jié)合親和力。直接從鼠抗體轉(zhuǎn)移CDR來產(chǎn)生人源化抗體，而不對(duì)人的V區(qū)框架作任何修飾，常常導(dǎo)致結(jié)合親和力的部分或完全喪失。在多個(gè)例子中，改變受體抗體的框架區(qū)中的殘基對(duì)獲得結(jié)合活性似乎是關(guān)鍵的。
Queen等，1989(如上述)和WO90/07861(Protein Design Labs Inc.)已描述，通過使鼠mAb(抗-Tac)的CDR與人的免疫球蛋白框架區(qū)及恒定區(qū)組合可制備在受體抗體的框架區(qū)中包含修飾的殘基的人源化抗體。他們已證實(shí)了不修飾人的V區(qū)框架殘基而直接轉(zhuǎn)移CDR常導(dǎo)致的親和力丟失問題的一種解決方法；其包括兩個(gè)關(guān)鍵步驟。第一，用計(jì)算機(jī)分析與來源鼠抗體(此例中為抗-Tac MAb)V區(qū)框架具有最佳同源性的蛋白序列，由此選擇人的V框架區(qū)。第二步，利用計(jì)算機(jī)作出該鼠V區(qū)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，以便觀察框架中最可能與鼠CDR作用的氨基酸殘基，然后將這些鼠氨基酸殘基重疊在人的同源框架上。另見美國(guó)專利5693762；5693761；5585089和5530101(ProteinDesign Labs)。
也可用另一種方法(Tempest，1991，生物技術(shù)9266-271)，和作為標(biāo)準(zhǔn)，利用分別衍生自NEWM和REI重鏈和輕鏈的V區(qū)框架在不隨機(jī)導(dǎo)入小鼠殘基的情況下進(jìn)行CDR移植。利用Tempest等，1991的方法構(gòu)建基于NEWM和REI的人源化抗體，其優(yōu)勢(shì)是，NEWM和REI可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)已通過X線晶體成像分析得知，并因此可構(gòu)建CDR與V區(qū)框架殘基的特異性相互作用的模型。
不管采用什么方法，迄今為止制備的最初的人源化抗體同系物的實(shí)例已經(jīng)表明它不是直截了當(dāng)?shù)倪^程。然而，盡管知道這樣的框架改變是必須的，但根據(jù)可采用的現(xiàn)有技術(shù)，不可能預(yù)測(cè)哪些框架殘基(如果有)需要改變以獲得具有所需特異性的功能性人源化重組抗體。迄今的結(jié)果表明保持特異性和/或親和力所必須的變化大部分是對(duì)指定的抗體特定的，而且不能根據(jù)不同抗體的人源化進(jìn)行預(yù)測(cè)。
在本發(fā)明中有效的某些含α4亞單位的整聯(lián)蛋白拮抗劑包括具有B表位特異性的嵌合和人源化重組抗體同系物(即完整免疫球蛋白及其部分)，該抗體已經(jīng)被制備，并且在美國(guó)專利5932214(mab HP1/2)中被敘述。制備嵌合(小鼠可變區(qū)-人恒定區(qū))和人源化的抗整聯(lián)蛋白抗體同系物的起始材料可以是先前所述的鼠抗整聯(lián)蛋白單克隆抗體，市售的抗整聯(lián)蛋白單克隆抗體(例如HP2/1，Amae Internation Inc，Westbrook，Maine)，或者是根據(jù)本文所述方法制備的抗整聯(lián)蛋白單克隆抗體。其它優(yōu)選的人源化抗VLA-4抗體同系物見Athena Neurosciences Inc在PCT/US95/01219(1995年7月27日)和美國(guó)專利5840299(在此引入作為參考)中所述。
這些人源化抗VLA-4抗體包括人源化輕鏈和人源化重鏈。所述人源化輕鏈包括三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1，CDR2和CDR3)和可變區(qū)框架，所述三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)中具有來自小鼠21-6免疫球蛋白輕鏈相應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列，所述可變區(qū)框架來自人κ輕鏈可變區(qū)框架序列，其中在最少的位點(diǎn)上的氨基酸被小鼠21-6免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)框架中等價(jià)位置的相同氨基酸占據(jù)。所述人源化重鏈包括三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1，CDR2和CDR3)和可變區(qū)框架，所述互補(bǔ)決定區(qū)具有來自小鼠21-6免疫球蛋白重鏈相應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列，所述可變區(qū)框架來自人重鏈可變區(qū)框架序列，其中至少一個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸被小鼠21-6免疫球蛋白重鏈可變區(qū)框架中等價(jià)位置的相同氨基酸占據(jù)。
本發(fā)明方法可以利用由下述核酸序列編碼的拮抗劑，該核酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼針對(duì)含α4亞單位的整聯(lián)蛋白的抗體的核酸雜交。例如，本發(fā)明的拮抗劑可以是其核酸在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與美國(guó)專利5840299的表6中一個(gè)或多個(gè)核酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的蛋白。拮抗劑還可以是其核酸在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與美國(guó)專利5932214中發(fā)現(xiàn)的編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的核酸雜交的蛋白。此外，拮抗劑還可以是其核酸在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼由細(xì)胞系A(chǔ)TCC CRL 11175產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)的核酸雜交的蛋白。
或者，本發(fā)明的拮抗劑可以是其核酸在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與美國(guó)專利5840299的表6中一個(gè)或多個(gè)核酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的蛋白。拮抗劑還可以是其核酸在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與美國(guó)專利5932214中發(fā)現(xiàn)的編碼SEQ IDNO2或SEQ ID NO4的核酸雜交的蛋白。此外，拮抗劑還可以是其核酸在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼由細(xì)胞系A(chǔ)TCC CRL 11175產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)的核酸雜交的蛋白。
C.片段和類似物的制備也可以通過利用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的重組方法、蛋白消化或化學(xué)合成的方法，有效地制備分離的α4整聯(lián)蛋白拮抗劑的片段(例如本文所述抗體同系物的片段)。在重組方法中，可以通過從編碼分離的刺猬狀(hedgehog)肽的DNA序列一端(對(duì)于末端片端)或兩端(對(duì)于內(nèi)部片段)去除一個(gè)或多個(gè)核苷酸，制備該多肽的內(nèi)部或末端片段。誘變DNA的表達(dá)可產(chǎn)生多肽片段。用“末端逐段(end nibbling)”內(nèi)切酶消化，也能產(chǎn)生編碼一系列片段的DNA。通過隨機(jī)剪切、限制性消化或者二者聯(lián)合，也可以產(chǎn)生編碼蛋白片段的DNA?？梢詮耐暾牡鞍字兄苯又苽涞鞍灼?。肽可以被蛋白酶特異性剪切，這些蛋白酶包括但不限于纖溶酶、凝血酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶。這些酶均對(duì)其所作用的肽鍵類型具有特異性。胰蛋白酶催化堿性氨基酸(通常為精氨酸或賴氨酸)上羰基參與形成的肽鍵的水解反應(yīng)。胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶催化色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸的肽鍵的水解反應(yīng)。通過阻止在蛋白酶易感位點(diǎn)上的切割，可以產(chǎn)生另一套切割的蛋白片段。例如，賴氨酸的ε氨基酸基團(tuán)與乙基三氟硫代乙酸(ethyltrifluorothioacetate)在弱堿性溶液中的反應(yīng)產(chǎn)生封閉的氨基酸殘基，其鄰近的肽鍵不再對(duì)胰蛋白酶的裂解敏感。蛋白質(zhì)可以被修飾，產(chǎn)生對(duì)蛋白酶敏感的肽連接。例如，半胱氨酸殘基與β鹵乙胺的烷基化可產(chǎn)生能被胰蛋白酶水解的肽連接(Lindley(1956)自然178，647)。此外，可以應(yīng)用在特異性殘基上切割肽鏈的化學(xué)試劑。例如，溴化氰在甲硫氨酸殘基處切割肽(Gross和Witkip，(1961)J.Am.Chem.Soc.83，1510)。因此，通過用修飾劑、蛋白裂解性酶和/或化學(xué)試劑的各種組合處理蛋白，可以將蛋白分割成所需長(zhǎng)度且不含重疊片段，或者分割成所需長(zhǎng)度的重疊片段。
還利用Merrifield固相F moc或t-Boc化學(xué)法等本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，化學(xué)合成蛋白片段。Merrifield，激素研究的新進(jìn)展，23451(1967)。
在下面討論了能產(chǎn)生和檢測(cè)片段和類似物的現(xiàn)有方法的實(shí)例。這些方法或類似方法可以用來制備并篩選具有生物活性的分離的α4整聯(lián)蛋白拮抗劑的片段和類似物。檢測(cè)含α4亞單位的整聯(lián)蛋白的拮抗劑其片段及類似物是否具有生物活性的方法實(shí)例見章節(jié)VI和實(shí)施例。
D.制備已改變的DNA和肽序列隨機(jī)方法通過使編碼蛋白或其特定部位的DNA隨機(jī)誘變，可以產(chǎn)生該蛋白的氨基酸序列變體。有效的方法包括PCR誘變和飽和誘變。也可以通過合成一套簡(jiǎn)并的寡核苷酸序列來制備隨機(jī)氨基酸序列變體文庫(kù)。利用已改變的DNA和肽制備指定蛋白的氨基酸序列的方法在本領(lǐng)域眾所周知。下述這些方法的實(shí)例不限制本發(fā)明的范圍，只是舉例說明代表性技術(shù)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到在這點(diǎn)上其它方法也是有效的。
PCR誘變例如見Leung等，(1989)技術(shù)1，11-15。
飽和誘變方法之一Mayers等，(1989)科學(xué)，229，242。
簡(jiǎn)并寡核苷酸誘變例如見Harang，S.A.(1983)，四面體39，3；Itakura等(1984)，Ann.Rev.Biochem.55，323和Itakura等，重組DNA，Proc.3rdCleveland Symposium on Marcromolecules，273-289(A.G.Walton編)，Elservier，Amsterdam，1981。
E.制備已改變的DNA和肽序列直接方法非隨機(jī)誘變或直接誘變可在編碼分離的多肽的多核苷酸序列中特定部位引入特異的序列或突變，從而提供變體，該突變包括在所述分離的多肽中已知氨基酸序列的殘基缺失、插入或替代。突變位點(diǎn)可以被分別修飾或逐次修飾，例如通過(1)首先用保守氨基酸替代，然后根據(jù)所得結(jié)果用更基本的選擇進(jìn)行替代；(2)使靶殘基缺失；或(3)將相同或不同類型的氨基酸插入到定點(diǎn)位點(diǎn)附近，或者選項(xiàng)1-3的組合。
很明顯，此類定點(diǎn)方法是將N末端半胱氨酸(或功能等效物)引入指定多肽序列來提供疏水部分的結(jié)合位點(diǎn)。
丙氨酸掃描誘變見Cunningham和Wells，(1989)科學(xué)244，1081-1085。
寡核苷酸介導(dǎo)的誘變例如見Adelman等，(1983)DNA 2，183。
盒式誘變見Wells等，(1985)基因34，315。
組合誘變例如見Ladner等，WO 88/06630。
噬菌體展示策略例如見Marks等的綜述，生物學(xué)化學(xué)雜志，267，16007-16010(1992)。
F.整聯(lián)蛋白拮抗劑的其它變體在氨基酸序列方面或在不涉及到序列的方面，或在這兩個(gè)方面，變體可以與本文所述其它整聯(lián)蛋白拮抗劑不同。本發(fā)明最優(yōu)選的多肽具備優(yōu)選的非序列修飾，包括在體內(nèi)或體外的化學(xué)衍生化(例如在其N末端)，以及乙?；⒓谆?、磷酸化、酰胺化、羧化或糖基化等可能變化。
其它類似物包括蛋白或其生物活性片段，它們的序列與在美國(guó)專利5840299或美國(guó)專利5888507、美國(guó)專利5932214(均在此引入作為參考)或者PCT US/94/00266中發(fā)現(xiàn)的序列不同在于一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸替代或一個(gè)或多個(gè)非保守氨基酸替代，或者有不消除該分離的蛋白之生物活性的缺失或插入。保守替代通常包括具有相似特性的氨基酸之間的替代，例如下述各組中各氨基酸之間的替代纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸和異亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非極性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易的知道其它保守替代。例如，對(duì)于丙氨酸，保守替代的氨基酸可以是選自D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸中的任何一個(gè)氨基酸。對(duì)于賴氨酸，替代氨基酸可以是D-賴氨酸、精氨酸、D-精氨酸、同型精氨酸、甲硫氨酸、D-甲硫氨酸、鳥氨酸或D-鳥氨酸中的任何一個(gè)氨基酸。
在本發(fā)明中應(yīng)用的其它類似物包括具有增加肽穩(wěn)定性的修飾的類似物。例如，這樣的類似物在其肽序列中可以包含一個(gè)或多個(gè)非肽鍵(其替代了肽鍵)。本發(fā)明的類似物還包括含天然L-氨基酸之外的殘基如D-氨基酸或非天然或合成的氨基酸如β或γ氨基酸的類似物以及環(huán)狀類似物。將D-氨基酸代替L-氨基酸引入分離的刺猬狀多肽，可以增加其對(duì)蛋白酶的抵抗力。見上述美國(guó)專利5219990。
優(yōu)選的抗體同系物包括與PS/2抗體(見實(shí)施例)的氨基酸序列至少有60％、80％、90％、95％、98％、或99％同源性的氨基酸序列，或者包括與下述專利中所述氨基酸序列至少有60％、80％、90％、95％、98％、或99％同源性的氨基酸序列，這些專利為美國(guó)專利5840299(SEQ IN NO 15-輕鏈可變區(qū)或SEQ ID NO17-重鏈可變區(qū))或美國(guó)專利5932214(SEQ ID NOS2或4)；已公布的專利申請(qǐng)WO 94/16094(在已保藏的細(xì)胞系A(chǔ)TCC CRL 11175產(chǎn)生的抗VLA4抗體中發(fā)現(xiàn)的那些序列)G.聚合物偶聯(lián)形式在本發(fā)明范疇之內(nèi)，可以將單個(gè)聚合物分子與α1或α4整聯(lián)蛋白拮抗劑偶聯(lián)，盡管也考慮到多個(gè)聚合物分子也可偶聯(lián)。本發(fā)明的偶聯(lián)的α4整聯(lián)蛋白拮抗劑組合物具有體內(nèi)和體外應(yīng)用。另外，應(yīng)理解偶聯(lián)聚合物可以利用任何其它基團(tuán)、組分或其它偶聯(lián)形式，只要它們適于最終的應(yīng)用。如在一些應(yīng)用中，使聚合物與賦予其以UV-降解抗性或抗氧化能力或其它特性或特點(diǎn)的功能組分共價(jià)連接是有用的。又如，在一些應(yīng)用中活化聚合物而使其具有反應(yīng)性并使其能夠與藥物分子交聯(lián)以提高整個(gè)偶聯(lián)物的各種特性或特點(diǎn)也是有益的。因此，聚合物可以包括任何功能、重復(fù)基團(tuán)、連接或不妨礙所偶聯(lián)的α4整聯(lián)蛋白拮抗劑組合物發(fā)揮其預(yù)定功效的其它結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將在接下來的敘述和附加的權(quán)利要求中更完整的表現(xiàn)出來。
在下文的反應(yīng)方案中描述了可用于有效獲得上述所需特點(diǎn)的聚合物實(shí)例。在共價(jià)結(jié)合的拮抗劑/聚合物偶聯(lián)物中，聚合物可以被活化，然后與拮抗劑中游離的氨基酸偶聯(lián)，形成不穩(wěn)定的鍵。
最優(yōu)選將含α4或α1亞單位的整聯(lián)蛋白的拮抗劑通過末端反應(yīng)基團(tuán)連接在聚合物上，盡管也可使偶聯(lián)從非末端反應(yīng)基團(tuán)形成分支。具有反應(yīng)基團(tuán)的聚合物在此定義為“活化的聚合物”。該反應(yīng)基團(tuán)選擇性地與拮抗劑分子上的游離氨基或其它反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)。所述活化的聚合物通過反應(yīng)使結(jié)合可以在賴氨酸的α氨基或ε氨基等任何有效的α4整聯(lián)蛋白拮抗劑氨基上發(fā)生。α4整聯(lián)蛋白拮抗劑的游離羧基基團(tuán)、適當(dāng)激活的羰基基團(tuán)、羥基、胍基、氧化的碳水化合物部分和巰基基團(tuán)(如果存在)也可以用來作為結(jié)合位點(diǎn)。
雖然所述聚合物可以被結(jié)合在整聯(lián)蛋白拮抗劑分子的任何部位，優(yōu)選聚合物與整聯(lián)蛋白拮抗劑(尤其是那些蛋白性質(zhì)的拮抗劑)偶聯(lián)的位點(diǎn)是整聯(lián)蛋白拮抗劑的N末端。次級(jí)位點(diǎn)是C末端或在其附近，并且通過糖的部分(如果有)進(jìn)行偶聯(lián)。因此，本發(fā)明考慮(i)α1和α4整聯(lián)蛋白拮抗劑的N末端偶聯(lián)型聚合物偶聯(lián)物；(ii)α1和α4整聯(lián)蛋白拮抗劑的C末端偶聯(lián)型聚合物偶聯(lián)物；(iii)糖偶聯(lián)型偶聯(lián)物；(iv)以及α1和α4整聯(lián)蛋白拮抗劑的N-、C-和糖偶聯(lián)型聚合物偶聯(lián)物。
通常使用每摩爾拮抗劑約1.0到約10摩爾的活化型聚合物，這取決于拮抗劑濃度。最終量使得在獲得最大反應(yīng)程度與對(duì)產(chǎn)物的最小非特異性修飾之間達(dá)到平衡，且同時(shí)限定維持了最佳活性的化學(xué)物質(zhì)，又同時(shí)使拮抗劑的半衰期最佳化(如果可能)。優(yōu)選拮抗劑的生物活性保留至少大約50％，最優(yōu)選保留100％。
可以用任何適當(dāng)?shù)谋绢I(lǐng)域認(rèn)可的用于生物活性物質(zhì)與惰性聚合物進(jìn)行反應(yīng)的方法進(jìn)行所述的反應(yīng)。通常所述方法包括制備活化的聚合物(其至少具有一個(gè)末端羥基基團(tuán))，然后將拮抗劑與該活化的聚合物進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生適合于配制(formulation)的可溶型蛋白?？梢酝ㄟ^幾種包括一個(gè)或多個(gè)步驟的方法，進(jìn)行上述修飾反應(yīng)。
如上所述，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中利用整聯(lián)蛋白拮抗劑的N末端與聚合物結(jié)合。可以用適當(dāng)?shù)膫鹘y(tǒng)方法來選擇性的獲得N末端已修飾的α1或α4整聯(lián)蛋白拮抗劑。一種方法是還原性烷基化方法，其探討了可用于在適當(dāng)整聯(lián)蛋白拮抗劑上衍生的不同類伯氨基(賴氨酸上的ε氨基對(duì)N末端甲硫氨酸上的氨基)的不同反應(yīng)性。在適當(dāng)?shù)暮Y選條件下，可以用含羰基的聚合物使適當(dāng)?shù)恼?lián)蛋白拮抗劑在其N-末端上進(jìn)行實(shí)質(zhì)上選擇性的衍生。所述反應(yīng)在一定的pH值條件下進(jìn)行，此pH值允許利用賴氨酸殘基的ε氨基和整聯(lián)蛋白拮抗劑N末端殘基的α氨基之間的pKa差異。此類化學(xué)過程為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員眾所周知。
將PEG等聚亞烷基二醇靶向α1或α4整聯(lián)蛋白拮抗劑(如作為蛋白質(zhì))C末端的策略是化學(xué)連接或?qū)δ軌蛴糜诎邢蚓酆衔锊糠值奈稽c(diǎn)進(jìn)行遺傳改造。例如，在蛋白的C末端或其附近的位點(diǎn)上引入Cys，將允許利用本領(lǐng)域認(rèn)可的經(jīng)馬來酰亞氨、乙烯砜或鹵代乙酸活化的聚亞烷基二醇(如PEG)衍生物進(jìn)行特異性修飾。這些衍生物可特別用于修飾經(jīng)基因工程改造的半胱氨酸，因?yàn)檫@些試劑對(duì)Cys具有高度選擇性。修飾本發(fā)明整聯(lián)蛋白拮抗劑的C末端的其它方法有，在蛋白上引入可被靶向的組氨酸標(biāo)簽(Fancy等，(1996)Chem & Biol.3551)或引入一個(gè)額外的糖基化位點(diǎn)等。
針對(duì)糖基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾的方法也是眾所周知的，因此聚亞烷基二醇聚合物可能直接并特異性地加到已通過氧化作用而激活的整聯(lián)蛋白拮抗劑的糖基(如果有)上。例如，可以制備聚亞烷基二醇-酰肼，其通過使醛與酮縮合，形成相對(duì)穩(wěn)定的腙連接。這個(gè)特性曾經(jīng)被用于通過氧化型寡糖連接來修飾蛋白。見Andresz，H等，(1978)，Makromol.Chem.179301。尤其是用亞硝酸鹽處理PEG-羧甲基酰肼可產(chǎn)生PEG-羧甲基氮化物，它是可與氨基反應(yīng)的親電子活性基團(tuán)。此反應(yīng)也可以用來制備經(jīng)聚亞烷基二醇修飾的蛋白。見美國(guó)專利4101380和4179337。
可以用本領(lǐng)域認(rèn)可的巰基(thiol)接頭介導(dǎo)的化學(xué)過程進(jìn)一步促進(jìn)蛋白交聯(lián)，形成多價(jià)α1或α4整聯(lián)蛋白拮抗劑組合物。特別是可以用高碘酸鈉在碳水化合物部分上產(chǎn)生活性醛，通過所述醛形成胱胺偶聯(lián)物并且通過胱胺上的巰基誘導(dǎo)交聯(lián)反應(yīng)。見Pepinsky B，等，(1991)，生物學(xué)化學(xué)雜志，26618244-18249和Chen LL等，(1991)生物學(xué)化學(xué)雜志，26618237-18243。因此，此種化學(xué)過程可能還適合于用聚亞烷基二醇聚合物進(jìn)行的修飾，其中將接頭引入糖基并使該聚亞烷基二醇聚合物與接頭連接。雖然含氨基硫醇或肼的接頭允許添加單個(gè)聚合物基團(tuán)，但接頭的結(jié)構(gòu)可以變化以便添加多個(gè)聚合物和/或改變聚合物相對(duì)于整聯(lián)蛋白拮抗劑的空間定向。
在本發(fā)明的應(yīng)用中，將C1-C4烷基聚亞烷基二醇的聚亞烷基二醇?xì)埢?，?yōu)選聚乙二醇(PEG)或此二醇的聚(氧)亞烷基二醇?xì)埢肽康木酆衔锵到y(tǒng)較有利。因此，與蛋白連接的聚合物可以是聚乙二醇(PEG)的同型多聚體或者是聚氧乙基化的多元醇，只要該聚合物在室溫下溶于水。此類聚合物非限定性實(shí)例包括PEG或聚亞丙基二醇等聚亞烷基氧化物同型多聚物，聚氧亞乙基化二元醇，其共聚物及其嵌段(block)共聚物，只要能保持該嵌段共聚物的水溶性。聚氧乙基化多元醇的實(shí)例包括例如聚氧乙基化甘油，聚氧乙基化山梨醇，聚氧乙基化葡萄糖等等。聚氧乙基化甘油的甘油骨架與在動(dòng)物和人中天然存在的單-、二-和三甘油酯的骨架相同。因此，在體內(nèi)這些分支未必被視為外來試劑。
作為聚亞烷基氧化物的替代品，也可以應(yīng)用葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到上述所列僅為舉例說明，具有在此所述特性的所有聚合物物質(zhì)都將包括在內(nèi)。
所述的聚合物不需要具有任何特殊的分子量，但優(yōu)選約300-100000，更優(yōu)選10000-40000。尤其，在阻止因腎臟過濾作用而導(dǎo)致的產(chǎn)物丟失方面，以20000或更高的分子量為最佳。
實(shí)踐本發(fā)明時(shí)，聚亞烷基二醇衍生化作用在配制聚合物-整聯(lián)蛋白拮抗劑偶聯(lián)物時(shí)有多項(xiàng)有利特點(diǎn)，其與聚亞烷基二醇衍生物的以下特點(diǎn)相關(guān)提高水溶性，同時(shí)不誘導(dǎo)抗原性或免疫原性應(yīng)答；高度的生物相容性；缺乏聚亞烷基二醇衍生物的體內(nèi)生物降解；和容易被活生物體排泄。
而且，在本發(fā)明的另一個(gè)方面，可以利用與聚合物組分共價(jià)結(jié)合的α1或α4整聯(lián)蛋白拮抗劑，該偶聯(lián)涉及可切割型共價(jià)化學(xué)鍵。這使得能控制聚合物從整聯(lián)蛋白拮抗劑中被切割下來所需的時(shí)間。整聯(lián)蛋白拮抗劑與聚合物之間的此共價(jià)鍵可被化學(xué)裂解或經(jīng)酶反應(yīng)裂解。該聚合物-整聯(lián)蛋白拮抗劑產(chǎn)物仍保留可接受量的活性。同時(shí)，該偶聯(lián)型聚合物中聚乙二醇所占比例能使聚合物-整聯(lián)蛋白拮抗劑偶聯(lián)物具有較高水溶性和被延長(zhǎng)的血液循環(huán)能力。由于這些改進(jìn)的特點(diǎn)，本發(fā)明可用于將活性聚合物-α4整聯(lián)蛋白拮抗劑經(jīng)胃腸道外、鼻內(nèi)和口服途徑給藥至體內(nèi)，然后經(jīng)水解使整聯(lián)蛋白拮抗劑本身具有生物活性。
應(yīng)理解本文所述反應(yīng)方案僅為舉例說明，并非對(duì)修飾α1或α4整聯(lián)蛋白拮抗劑以便例如獲得適于胃腸道外給藥和口服給藥的水溶性、穩(wěn)定性及細(xì)胞膜親和力時(shí)所用的反應(yīng)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行限制。通過利用不同分子大小的聚合物，可以以多種方式使這些整聯(lián)蛋白拮抗劑偶聯(lián)物的活性和穩(wěn)定性發(fā)生改變。通過改變摻入到聚合物組合物中的聚乙二醇片段的比例和大小，可以改變偶聯(lián)物的溶解性。
III.應(yīng)用可與載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單個(gè)劑型的活性組分的量根據(jù)所治療的受試者和給藥的具體模式而不同。然而，應(yīng)該明白針對(duì)任何具體受試者的特異性劑量和治療方案將依賴于各種因素，包括使用的特定化合物的活性，年齡，體重，一般健康狀態(tài)，性別，飲食，給藥時(shí)間，排泄率，藥物組合，以及施治醫(yī)生的判斷和所治療的特定疾病的嚴(yán)重性。活性組分的量還依賴于與其共同給藥的治療性或預(yù)防性藥物(如果有)。
本發(fā)明的治療方法包括給受試者給藥有效量的本發(fā)明拮抗劑。本發(fā)明方法中的劑量是有效的無毒性的量。常規(guī)臨床檢測(cè)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員能夠確定用于所治特殊疾病的最佳劑量。
制藥在本發(fā)明方法中，本發(fā)明的拮抗劑可以通過胃腸道外給藥。在此應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“胃腸道外”包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、病損內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸液技術(shù)。將所需劑量經(jīng)靜脈內(nèi)、口、直腸、胃腸道外、鼻內(nèi)、局部或經(jīng)吸入給藥，每天一次或多次。所需劑量也可以通過連續(xù)的靜脈輸液給藥。
抗體同系物優(yōu)選以含可藥用載體的無菌藥用組合物形式給藥，其中所述的載體可以是任何已知的載體，例如水，鹽水，磷酸鹽緩沖液，葡萄糖，甘油，乙醇等等或它們的組合物。本發(fā)明所用化合物可以是衍生自無機(jī)或有機(jī)酸和堿的鹽類形式。所述酸的鹽包括乙酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽，苯磺酸鹽，硫酸氫鹽，丁酸鹽，檸檬酸鹽，樟腦酸鹽，樟腦磺酸鹽，環(huán)戊烷丙酸鹽，雙葡糖酸鹽，十二烷基硫酸鹽，乙磺酸鹽，富馬酸鹽，葡庚糖酸鹽，甘油磷酸鹽，半硫酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，2-羥基乙磺酸鹽，乳酸鹽，馬來酸鹽，甲磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，草酸鹽，雙羥萘酸鹽(pamoate)，果膠酸鹽，過硫酸鹽，3-苯基丙酸鹽，苦味酸鹽，新戊酸鹽，丙酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，硫氰酸鹽，甲苯磺酸鹽和十一酸鹽。堿的鹽包括銨鹽、堿金屬鹽如鈉鹽和鉀鹽，堿土金屬鹽如鈣鹽和鎂鹽，與有機(jī)堿如二環(huán)己胺、N-甲基-D-葡萄糖胺、三(羥甲基)甲胺形成的鹽，以及與氨基酸如精氨酸、賴氨酸等形成的鹽，等等。此外，含堿性氮的基團(tuán)可以用下述試劑季銨化，這些試劑包括甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物等低級(jí)烷基鹵化物；二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸鹽等二烷基硫酸鹽；十烷基、十二烷基、十四烷基、十八烷基氯化物、溴化物和碘化物等長(zhǎng)鏈鹵化物；芐基和苯乙基溴化物等芳烷基鹵化物，等。從而得到水溶型或油溶型或可分散的產(chǎn)物。
本發(fā)明的藥用組合物包括本發(fā)明的任何化合物或其可藥用衍生物，以及任何可藥用載體。本文中應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“載體”包括合適的佐劑和賦形劑?？伤幱貌⒖稍诒景l(fā)明藥用組合物中應(yīng)用的載體包括但不限于離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，人血清白蛋白等血清蛋白，磷酸鹽等緩沖物質(zhì)，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯的混合物，水，硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽等鹽或電解質(zhì)，膠體硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，基于纖維的物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，石蠟，聚亞乙基-聚氧亞丙基-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。
根據(jù)本發(fā)明，所述藥用組合物可以是無菌注射制劑，例如無菌可注射的水或油性懸浮液?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，利用適當(dāng)?shù)姆稚┗驖?rùn)濕劑和懸浮劑配制該懸浮液。所述無菌注射制劑還可以是溶于無毒的胃腸道外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸浮液，例如溶于1，3-丁二醇的溶液。在可接受的賦形劑和溶劑中，可以使用水、Ringer’s溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，傳統(tǒng)上以無菌固定油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。為了此目的，可以使用任何溫和的固定油，包括合成的單-或二-甘油酯。脂肪酸如油酸甘油酯及其甘油酯衍生物等可用于制備注射制劑，可藥用的天然油如橄欖油或蓖麻油，尤其它們的聚氧乙基化形式也可使用。
本發(fā)明的藥用組合物也可以口服給藥。如果口服給藥，它們可以以任何適合口服的劑型給藥，包括但不限定于膠囊，片劑，水性懸浮液或溶液。對(duì)于用于口服的片劑，常用的載體包括乳糖和玉米淀粉。通常還添加硬脂酸鎂等潤(rùn)滑劑。對(duì)于膠囊形式的口服制劑，有效的稀釋劑包括乳糖和干玉米淀粉。當(dāng)需要口服水性懸浮液時(shí)，可將活性組分與乳化劑和懸浮劑混合。如果需要也可以添加甜味劑、調(diào)味劑或生色劑。
本發(fā)明方法中應(yīng)用的具體組合物是那些將所述拮抗劑配制在小囊泡中的組合物，例如含脂質(zhì)體的組合物。脂質(zhì)體是由極性脂質(zhì)等兩性分子形成的小泡，極性脂質(zhì)包括例如磷脂酰膽堿，乙醇胺和絲氨酸，鞘磷脂，心磷脂，縮醛磷脂，磷脂酸和cerebioside。脂質(zhì)體如下形成使適當(dāng)?shù)膬尚苑肿釉谒蛩芤褐信蛎?，形成通常為多層結(jié)構(gòu)的液態(tài)晶體，其由多個(gè)雙層相互以水性物質(zhì)分隔而成(也稱為粗脂質(zhì)體)。另一種脂質(zhì)體已知由囊內(nèi)包含了水性物質(zhì)的單個(gè)雙層結(jié)構(gòu)組成，稱為單層小泡。如果脂質(zhì)膨脹期間水相中含有水溶性物質(zhì)，它們就被捕獲在脂質(zhì)雙層之間的含水層中。
制備本發(fā)明拮抗劑脂質(zhì)體劑型的特別方便的方法是在EP-A-253619中所述的方法，在此引入作為參考。在這個(gè)方法中，內(nèi)含活性組分的單一雙層脂質(zhì)體通過如下方法制備，即將脂質(zhì)組分溶于有機(jī)介質(zhì)中，在壓力作用下將脂質(zhì)組分的有機(jī)溶液注射到含水組分中，同時(shí)用高速勻漿器或混合工具混合有機(jī)組分和含水組分，從而使脂質(zhì)體自發(fā)形成。內(nèi)含活性組分的單一雙層脂質(zhì)體可以直接使用，或者可在適于局部給藥的適當(dāng)可藥用載體中使用。通過加入一種或多種適當(dāng)?shù)脑龀韯┤琰S原膠，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素和它們的混合物，可以增加脂質(zhì)體的粘性。水相組分可以僅由水組成，或者它也可以包括電解質(zhì)、緩沖系統(tǒng)和防腐劑等其它組分?？梢允褂玫倪m合電解質(zhì)包括金屬鹽，例如堿金屬鹽和堿土金屬鹽。優(yōu)選的金屬鹽是氯化鈣，氯化鈉和氯化鉀。電解質(zhì)的濃度可以在0-260mM之間，優(yōu)選5mM-160mM之間。將水相組分放置在適當(dāng)?shù)娜萜髦?，此容器能適應(yīng)在有機(jī)組分注射期間通過引起大渦流而進(jìn)行的勻漿。兩種組分的勻漿可以在該容器內(nèi)完成，或者將水相組分和有機(jī)組分分別注射到位于該容器之外的混合工具中。在后一種情況中，脂質(zhì)體在混合工具中生成，然后將其轉(zhuǎn)移到另一個(gè)收集容器中。
有機(jī)組分由適當(dāng)?shù)臒o毒性可藥用溶劑和溶于該溶劑的適當(dāng)磷脂組成，所述溶劑包括例如乙醇，甘油，丙二醇和聚乙二醇等?？梢允褂玫倪m當(dāng)?shù)牧字ɡ缏蚜字字Ｄ憠A，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，溶血磷脂酰膽堿，磷脂酰甘油等。為了選擇性修飾脂質(zhì)體的特性，可以使用其它親脂性添加劑。此類親脂性添加劑包括硬脂酰胺，磷脂酸、生育酚，膽固醇和羊毛脂提取物。
另外，還可以在有機(jī)組分中添加阻止磷脂氧化的其它組分。這些組分的實(shí)例包括生育酚，丁基化茴香醚，丁基化羥基甲苯，棕櫚酸抗壞血酸酯和油酸抗壞血酸酯。還可以添加防腐劑如苯甲酸、甲基對(duì)羥基苯甲酸酯和丙基對(duì)羥基苯甲酸酯等。
除了上述組合物外，還可使用含適量抗VLA-抗體藥物的覆蓋物，例如石膏，繃帶，敷料，紗布?jí)|等等。在一些情況中，還可以應(yīng)用已用含治療制劑的局部制劑浸透過的石膏，繃帶，敷料，紗布?jí)|等等。
本發(fā)明的治療組合物還可利用噴霧器、干粉吸入器或計(jì)量吸入器以鼻氣溶膠或吸入形式給藥。所述組合物可根據(jù)制藥領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)制備，并可制備成鹽水溶液，其中使用芐醇或其它適當(dāng)?shù)姆栏瘎?、用來增加生物利用度的促吸收劑、碳氟化合物?或其它傳統(tǒng)的增溶劑或分散劑，將其。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，含本發(fā)明化合物的組合物還可以包括選自皮質(zhì)激素、抗炎劑、免疫抑制劑、抗代謝藥和免疫調(diào)節(jié)劑的其它試劑。所述類別的具體化合物可以選自“綜合醫(yī)藥化學(xué)(Comprehensive Medicinal Chemistry)”(Pergamon Press，Oxford，England，970-986(1990))中相應(yīng)標(biāo)目下所列的任何化合物，此書所述內(nèi)容在此引入作為參考。此組中的化合物還包括例如荼堿，水楊酸偶氮磺胺吡啶和氨基水楊酸(抗炎劑)；環(huán)孢菌素，F(xiàn)K-506和雷怕霉素(rapamycin)(免疫抑制劑)；環(huán)磷酰胺和氨甲蝶呤(抗代謝藥)；甾類化合物(吸入型，口服型或局部用藥型)和干擾素(免疫調(diào)節(jié)劑)。
本發(fā)明化合物產(chǎn)生所需效應(yīng)的劑量和用藥頻率依賴于各種因素，例如拮抗劑的本性，受試者的個(gè)體大小，治療目的，所治療病理狀態(tài)的本質(zhì)，所用的具體藥用組合物和施治醫(yī)生的判斷。
活性組分化合物的有效劑量水平為每天約0.001-100mg/kg體重，優(yōu)選每天約0.1-50mg/kg體重。最優(yōu)選VLA-4結(jié)合劑如果是抗體或抗體衍生物，給藥的劑量范圍是約0.1mg/kg體重/天-約20mg/kg體重/天，優(yōu)選范圍是約0.1mg/kg體重/天-約10mg/kg體重/天，并且每1-14天間隔給藥。對(duì)于非抗體或小分子結(jié)合劑，優(yōu)選抗體劑量范圍的摩爾等效量范圍。優(yōu)選給藥可有效提供至少1mg/ml抗體血漿水平的抗體組合物量。通過在體內(nèi)給藥一定劑量所述結(jié)合劑后，在各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)被結(jié)合劑包被的整聯(lián)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，可以確定最佳劑量。
所給試劑的存在可根據(jù)該個(gè)體的細(xì)胞與標(biāo)記的(例如熒光染料標(biāo)記的)相同試劑的結(jié)合能力下降或消失，在體外(或離體)檢測(cè)。優(yōu)選的劑量應(yīng)該使絕大部分整聯(lián)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞產(chǎn)生可檢測(cè)的包被。對(duì)于抗體同系物，優(yōu)選使包被持續(xù)1-14天。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易的檢測(cè)本發(fā)明拮抗劑是否具有所需作用。熟練的技術(shù)人員將使用標(biāo)準(zhǔn)的臨床恢復(fù)檢測(cè)(例如檢測(cè)抗體結(jié)合的灌洗和FACS掃描；forced vital lung capacity的改善)來確定療效。例如，利用可檢測(cè)所給試劑的第二個(gè)試劑在體外(或離體)檢測(cè)個(gè)體肺組織樣品所含細(xì)胞中所給試劑的存在。例如，該試劑可以是熒光染料標(biāo)記的對(duì)所給試劑特異的抗體，然后用標(biāo)準(zhǔn)的FACS(熒光激活細(xì)胞分揀術(shù))進(jìn)行檢測(cè)?；蛘?，根據(jù)該個(gè)體的細(xì)胞與標(biāo)記的(例如熒光染料標(biāo)記的)相同試劑的結(jié)合能力下降或消失，而體外(或離體)檢測(cè)所給試劑的存在。優(yōu)選的劑量應(yīng)該使絕大部分整聯(lián)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞產(chǎn)生可檢測(cè)的包被。對(duì)于抗體同系物，優(yōu)選使包被持續(xù)1-14天。
下述實(shí)施例是用來舉例說明本發(fā)明，而不是對(duì)其進(jìn)行限制。
實(shí)施例1肺纖維變性動(dòng)物模型在廣泛應(yīng)用的博來霉素(bleomycin，BL)-嚙齒類動(dòng)物肺纖維變性模型中，已經(jīng)記錄了許多涉及炎癥細(xì)胞和介質(zhì)的證據(jù)。這個(gè)模型有吸引力的原因是它給出了許多人類疾病纖維變性的特征性景象，還因?yàn)锽L-誘導(dǎo)的肺纖維變性是人類的化療中非常公認(rèn)的副作用。在嚙齒類動(dòng)物中氣管內(nèi)(IT)滴注BL的方法被廣泛的用于研究纖維形成的機(jī)制和篩選潛在的所需抗纖維變性化合物。雖然BL誘導(dǎo)的肺毒性的起始原因是由于其一旦與鐵和DNA結(jié)合則產(chǎn)生反應(yīng)性氧物質(zhì)(ROS)，但是導(dǎo)致最終肺纖維變性臨床表現(xiàn)的過程涉及各種炎癥介質(zhì)的釋放(Giri和Wang，Comments Toxicol.，3145-176(1989))。BL誘導(dǎo)的肺損傷發(fā)病機(jī)制最初為水腫，出血和以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的細(xì)胞浸潤(rùn)。肺部的血管、間質(zhì)和肺泡間隙中過度積累的炎性白細(xì)胞，可以通過產(chǎn)生ROS和蛋白分解酶造成血管和實(shí)質(zhì)損傷。中性粒細(xì)胞含大量的髓過氧化物酶(MPO)，它與H2O2反應(yīng)可以將Cl-氧化為次氯酸(HOCl)，已知中性粒細(xì)胞源性的HOCl可引起細(xì)胞毒性。來源于巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的ROS能夠刺激產(chǎn)生前炎性和致纖維變性的細(xì)胞因子，它們介導(dǎo)增強(qiáng)的纖維增殖反應(yīng)(Phan和Kunkel，Exp.Lung.Res.，1829-43(1992))。除了大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)外，激活的成纖維細(xì)胞的過度增殖反應(yīng)是纖維變性進(jìn)程的另一個(gè)特點(diǎn)。成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞是造成肺膠原蛋白含量絕對(duì)增加和膠原蛋白超微結(jié)構(gòu)和空間分布異常的主要原因。
實(shí)施例2用針對(duì)含α4亞單位的整聯(lián)蛋白的拮抗劑抑制纖維變性材料和方法應(yīng)用了非特異性對(duì)照抗體(1E6)和針對(duì)含α4亞單位的整聯(lián)蛋白的抗體(PS2)。1E6是小鼠抗人LFA3(結(jié)構(gòu)域1)IgG1單克隆抗體。見Miller，Hochman，Meier，Tizard，Bixler，Rosa和Wallner(1992)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，178211-222。PS/2按Miyake等(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，173599-607，1991)的方法制備。
無慢性呼吸系統(tǒng)疾病的體重為25-30g的雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室。硫酸博來霉素(商標(biāo)品Blenoxane)由Bristol實(shí)驗(yàn)室(Syracuse，NY)惠贈(zèng)。用于標(biāo)記脯胺酰羥化酶原膠原底物的L-[3，4-3H]脯氨酸來自NENLife Science Products(Boston，MA)。水性緩沖的鋅福爾馬林Z-fix購(gòu)自Anatech，LTD(Battle Creek，MI)。其他所有試劑均為試劑級(jí)或更高純度的試劑，來自標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)化來源。
對(duì)動(dòng)物的處理根據(jù)NIH的動(dòng)物福利標(biāo)準(zhǔn)將小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠4只。在治療前一周，使小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。保持12h/12h的光亮/黑暗循環(huán)，并且隨時(shí)進(jìn)食水和Rodent Laboratory固型食物(Chow)。將動(dòng)物隨機(jī)分為四個(gè)實(shí)驗(yàn)組1)SA+SA；2)BL+IE6；3)BL+SA和4)BL+PS2。在甲苯噻嗪和氯胺酮的麻醉下，給小鼠氣管內(nèi)(IT)注射單劑量的鹽水或BL 0.08單位/100微升/小鼠。在IT滴注后，給小鼠IP注射IE6、SA或PS2(100μg/0.2ml/小鼠)，一周三次。BL滴注的21天之后，在戊巴比妥麻醉下，處死小鼠，取支氣管肺泡灌洗液(BALF)、進(jìn)行生物化學(xué)和組織病理學(xué)分析。
BALF和肺組織的制備在麻醉之后，打開腹腔，隨后經(jīng)降腹主動(dòng)脈放血。通過用與注射器相連的鈍性針頭進(jìn)行插管，制備用于灌洗的肺。用3ml冷等滲生理鹽水進(jìn)行肺灌洗，每次輸注1ml。取一等份BALF用于計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。將剩下的BALF在4℃下1500g離心20分鐘，然后將得到的上清分裝并在-70℃保存。在BALF之后，將肺葉快速解剖，去除非實(shí)質(zhì)組織，并立即在液氮中冷凍，-70℃保存。
隨后，將冷凍的肺組織解凍，并在0.1M KCl、0.02M Tris(pH7.6)中用Polytron勻漿器(Brinkmann Instruments Inc.Westbury，NY)進(jìn)行勻漿。通過反復(fù)翻轉(zhuǎn)，充分混合勻漿物，記錄最終的勻漿物體積(4-5ml)。將勻漿物分成幾等份，在-70℃中保存，以備生化檢測(cè)。
檢測(cè)肺的丙二醛當(dāng)量和羥脯氨酸含量根據(jù)Ohkawa等(Ohkawa等，Anal.Biochem，95351(1979))的方法，從未分級(jí)勻漿物中硫代巴比土酸反應(yīng)產(chǎn)物的總量估測(cè)肺丙二醛當(dāng)量。對(duì)于肺羥脯氨酸的檢測(cè)，將1ml勻漿物用0.25ml冰冷卻的50％(w/v)三氯醋酸沉淀并離心，將沉淀物在110℃下于2ml 6N HCl中水解18小時(shí)。用Woessner(Woessner，J.F.，Arch.Biochem.Biophys，93440(1961))所述技術(shù)檢測(cè)羥脯氨酸含量。
脯胺酰羥化酶(EC 1.14.11.2)活性的測(cè)定脯胺酰羥化酶底物(原膠原)的制備方法和脯胺酰羥化酶的檢測(cè)方法見Giri，S.N.等(Giri，S.N.，Exp.Mol.Pathol.，39317(1983))所述。簡(jiǎn)言之，將從十日齡雞胚中新分離的脛骨，用[3H]-脯氨酸在無脯氨酸的培養(yǎng)基中37℃標(biāo)記6小時(shí)。在通過洗滌去除未摻入的標(biāo)記物之后，將組織進(jìn)行勻漿并4℃3000g離心20分鐘。將所得上清充分透析，去除未摻入的標(biāo)記物。將標(biāo)記的原膠原底物分裝并-70℃保存。用于酶檢測(cè)的溫育混合物總體積為2ml，其中包括硫酸亞鐵銨(0.1mmol/l)，α-酮戊二酸(0.1mmol/l)，[3H]脯氨酸原膠原(200,000dpm)，肺勻漿物(0.2ml)，抗壞血酸(0.5mmol/l)和Tris-鹽酸緩沖液(0.1mol/l，pH 7.8)。在Dubnoff代謝震蕩器中37℃反應(yīng)30分鐘之后，向反應(yīng)中加入0.2ml 50％三氯醋酸。在反應(yīng)期間，按與脯胺酰羥化作用成比例的化學(xué)計(jì)量釋放氚水，將其用于測(cè)量酶活性。反應(yīng)體系的氚水通過將全部反應(yīng)混合物進(jìn)行真空蒸餾而分離并計(jì)數(shù)其放射活性。酶活性用每份總肺每30分鐘釋放的氚水的dpm表示。
BALF中細(xì)胞數(shù)的測(cè)定用Wang等(Wang Q等，Lab.Invest.，67234-242(1992))所述方法測(cè)定BALF中的總細(xì)胞數(shù)。用Coulter計(jì)數(shù)器(Model F，Coulter Electronic，Inc.，Hialeah，F(xiàn)L)根據(jù)用戶手冊(cè)估測(cè)BALF中的白細(xì)胞總數(shù)。
BALF蛋白檢測(cè)利用Bio-Rad蛋白檢測(cè)儀(Bio-Rad，Laboratories，Richmond，CA)并以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定BALF上清中的蛋白。
組織病理學(xué)和免疫組化檢驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)的最后，從每個(gè)治療組中隨機(jī)選出3-4個(gè)動(dòng)物進(jìn)行組織病理學(xué)和免疫組化檢測(cè)。將動(dòng)物的腹腔打開，隨后經(jīng)腹主動(dòng)脈放血。緊接著按上述Wang等的上述方法立即制備用于組織學(xué)分析的肺組織。在用鈍針頭進(jìn)行氣管插管之后，打開胸腔，然后將心臟和肺作為一個(gè)總體取出。在30cm水柱壓力下，通過氣管用Z-fix溶液固定肺組織。隨后將右邊頭部和尾部肺葉和左邊肺葉封閉，包埋于石蠟，將其切成7微米切片，用蘇木精和伊紅進(jìn)行染色。對(duì)于αSMA的免疫組化染色，將肺組織切片脫蠟，并用內(nèi)源性過氧化物酶封閉。然后將待染色的切片用封閉羊血清處理30分鐘，并與單克隆抗αSMA第一抗體(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)溫育16h。
數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析動(dòng)物數(shù)據(jù)以每個(gè)總肺為基礎(chǔ)，表示為均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)。在4組內(nèi)用雙側(cè)方差分析(SIGMASTAT)和Student-Newman-Keuls方法進(jìn)行數(shù)據(jù)比較。P≤0.05時(shí)具有顯著意義。
結(jié)果小鼠肺中的脂質(zhì)過氧化作用檢測(cè)了各組小鼠中作為脂質(zhì)過氧化作用指標(biāo)的肺丙二醛當(dāng)量的含量。與SA+SA和BL+PS 2組相比，在BL+IE6和BL+SA組中BL滴注可顯著增加肺丙二醛當(dāng)量的含量(未顯示數(shù)據(jù))。用PS2治療可有效阻斷BL誘導(dǎo)的肺脂質(zhì)過氧化作用，因?yàn)锽L+PS2組中肺丙二醛當(dāng)量的水平與SA+SA組沒有差別。
小鼠肺中羥脯氨酸含量檢測(cè)了4組小鼠的肺羥脯氨酸，它是肺膠原蛋白水平的主要指標(biāo)。BL的IT滴注可顯著提高BL+IE6和BL+SA組的肺羥脯氨酸水平，分別為SA+SA對(duì)照組的185％和205％。與BL+SA組相比，在BL+PS2組中通過PS2的治療，BL誘導(dǎo)的肺羥脯氨酸水平顯著下降35％。BL+TR組中肺羥脯氨酸水平并不顯著高于IT滴注的SA(SA+SA)對(duì)照組。
小鼠肺中脯胺酰羥化酶活性各組小鼠的肺脯胺酰羥化酶活性表明，在BL+SA組中，單獨(dú)給藥BL可顯著增加肺脯胺酰羥化酶活性，為SA+SA對(duì)照組的207％。PS2可顯著降低BL+SA組中由BL處理而提高的脯胺酰羥化酶活性。
小鼠肺總BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)在IT滴注生理鹽水或BL之后21天，各組小鼠BALF中的總細(xì)胞數(shù)表明，與生理鹽水對(duì)照組(SA+SA)相比，BL處理可增加BL+IE6和BL+SA組BALF總細(xì)胞數(shù)，雖然只有BL+IE6組的水平顯著高于SA+SA組。BL+PS2組的BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)與SA+SA組沒有顯著差別。
BALF中蛋白含量4個(gè)實(shí)驗(yàn)組BALF上清的蛋白含量表明，與SA+SA對(duì)照組相比，IT滴注BL可顯著增加所有BL處理組的BALF蛋白水平。然而，在BL+PS2組中用PS2處理可降低BL誘導(dǎo)的BALF上清蛋白的增加，盡管差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
小鼠肺的組織病理學(xué)小鼠肺的組織病理學(xué)檢測(cè)表明SA+SA組的肺實(shí)質(zhì)組織正常。然而，BL+IE6和BL+SA組的肺表現(xiàn)為不規(guī)則的肺泡炎和包括細(xì)胞外纖維積累的多源性間質(zhì)纖維變性。這些組的小鼠肺小泡間間隔增厚，并且在鄰近的空間中出現(xiàn)炎癥細(xì)胞。與BL+IE6和BL+SA組相比，BL+PS2組的肺的纖維變性損傷更輕，盡管一些肺葉仍有輕度的間質(zhì)纖維變性。
小鼠肺的αSMA免疫組化染色為了檢測(cè)在BL處理后小鼠中成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的積聚，我們利用抗XSMA單克隆抗體檢測(cè)了XSMA在肺組織中的表達(dá)。在對(duì)照肺中，在血管和支氣管平滑肌層出現(xiàn)免疫陽(yáng)性染色。在BL和對(duì)照抗體組或生理鹽水處理組中，在間質(zhì)和胸膜的纖維變性區(qū)之內(nèi)有廣泛的強(qiáng)免疫染色。然而，與BL+IE6和BL+SA組相比，經(jīng)BL和PS2處理的肺αSMA免疫染色大大降低。
討論IPF是致殘性疾病，目前的治療效果較差。在本研究中，我們的證據(jù)表明含α4亞單位的整聯(lián)蛋白在IPF治療中是另一個(gè)可能的靶點(diǎn)。通常認(rèn)為肺的白細(xì)胞通過分泌ROS、致纖維變性細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子而參與肺纖維變性的進(jìn)展。白細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)和激活狀態(tài)是由整聯(lián)蛋白等各種表面蛋白調(diào)節(jié)。已經(jīng)明確細(xì)胞-細(xì)胞相互作用和細(xì)胞-ECM相互作用在肺纖維變性發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。在活動(dòng)性纖維變性患者和纖維性肺疾病的動(dòng)物模型中相一致的發(fā)現(xiàn)是經(jīng)歷纖維變性的區(qū)中越來越多免疫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的積累。
VLA-4在所有的循環(huán)白細(xì)胞上表達(dá)，并且與血管細(xì)胞粘附分子(VCAM-1)和基質(zhì)蛋白纖連蛋白結(jié)合，VCAM-1是在細(xì)胞因子激活的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的Ig基因超家族成員。α4β7在T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群、自然殺傷細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞上表達(dá)。它與粘膜血管粘著素(MAdCAM-1)以及VCAM-1和纖連蛋白結(jié)合，粘膜血管粘著素是Ig和粘附分子的粘蛋白樣家族成員。體外研究證實(shí)VLA-4與VCAM-1的相互作用涉及單核白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附及其穿內(nèi)皮的遷移，并且α4β7被認(rèn)為主要參與腸相關(guān)淋巴組織中的白細(xì)胞聚集。
本研究中，PS2治療降低BALF中由BL誘導(dǎo)的總白細(xì)胞的增加。BL+PS2組小鼠肺中白細(xì)胞減少可能是經(jīng)BL處理的動(dòng)物的肺中炎癥損傷和纖維變性消除的原因。肺脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的測(cè)定結(jié)果表明PS2的治療可顯著降低BL-誘導(dǎo)的肺損傷。肺中膠原蛋白的增加與間質(zhì)和肺泡間隙中成纖維細(xì)胞數(shù)的增加相關(guān)。很多這些成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞，它們具有特殊的表型，包括αSMA的表達(dá)，αSMA是通常存在于平滑肌細(xì)胞中的可收縮蛋白，并且被認(rèn)為在纖維形成和傷口愈合中有重要作用。本研究的重要發(fā)現(xiàn)是PS2治療可減輕BL誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞增殖。不限定于任何特殊的理論，抗α整聯(lián)蛋白抗體的給藥可以降低肺中由浸潤(rùn)的白細(xì)胞釋放的生長(zhǎng)因子的水平，或直接影響肌成纖維細(xì)胞的行為。在任一種情況中，增殖中的肌成纖維細(xì)胞的減少可導(dǎo)致降低BL+PS2組BL處理動(dòng)物的肺中膠原蛋白的積累。
實(shí)施例3用針對(duì)含α1亞單位的整聯(lián)蛋白的拮抗劑抑制纖維變性對(duì)動(dòng)物的處理在由美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)認(rèn)證協(xié)會(huì)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室中，將體重為28-30g的雄性C57/BL6小鼠分成4組，在塑料籠中飼養(yǎng)。在治療前一周，使小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。隨時(shí)進(jìn)食Rodent Laboratory Chow5001(Purina Mills，Inc.，St.Louis，MO)和水，并且將其飼養(yǎng)在經(jīng)空氣過濾并保持12h/12h光亮/黑暗循環(huán)的房間中。將小鼠分為下列各組
在氣管內(nèi)(IT)輸注之前用無熱原質(zhì)的無菌等滲生理鹽水新鮮溶解博來霉素。在甲氧氟烷麻醉下，將100μl無菌等滲生理鹽水或100μl 0.08單位博來霉素溶液給相應(yīng)組小鼠氣管內(nèi)輸注。給相應(yīng)組小鼠腹膜內(nèi)注射抗體(4mg/kg)，一周三次，直到博來霉素給藥后21天。之后，用過量的戊巴比妥(100-125mg/kg ip)處死各組動(dòng)物，并將它們的肺進(jìn)行處理以備支氣管灌洗、生化和組織病理學(xué)分析。
測(cè)定支氣管灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和蛋白水平支氣管插管之后，將肺用共5ml等滲生理鹽水灌洗，每次1ml。用注射器通過插管輸注生理鹽水，輕輕按摩胸腔壁，然后回收灌洗液。將灌洗液在4℃1500g離心20分鐘，并用等滲生理鹽水溶液重新懸浮。用Lowry等(Lowry等，生物學(xué)化學(xué)雜志，1193265-275(1951))所述方法以牛血清白蛋白為準(zhǔn)標(biāo)測(cè)定支氣管灌洗液標(biāo)本的上清中蛋白含量。用Coulter Counter(CoulterElectronics，Hialeah，F(xiàn)L)測(cè)定懸浮液中的總白細(xì)胞數(shù)。
羥脯氨酸的測(cè)定用冰冷卻的等滲生理鹽水經(jīng)右室在原位灌注用于生化研究的動(dòng)物肺，通過左心房的開口將肺血管中的血液洗出。迅速切去肺葉的非實(shí)質(zhì)組織，在液氮中速凍，然后在-80℃保存。隨后將冰凍的肺解凍，并用Polytron勻漿器在0.1M KCl、0.02M Tris緩沖液(pH7.6)中進(jìn)行勻漿。將肺勻漿物中的羥脯氨酸含量作為膠原蛋白含量的指標(biāo)，用Woessner(Woessner，Arch.Biochem.Biophys.93440-447(1961))所述的技術(shù)定量。
組織病理學(xué)研究肺灌洗之后，打開胸腔，并將心臟和肺整個(gè)取出。用溶于1.2M二甲胂酸鹽緩沖液中的1％戊二醛-多聚甲醛固定劑，在30cm水柱的壓力下以400mOsm進(jìn)行肺輸注。在這個(gè)壓力下將肺固定約2小時(shí)，然后將氣管閉塞并在固定劑中保存。在包埋之前，通過鈍性切除術(shù)去除心臟和所有的非肺組織，分離出肺。從每個(gè)肺的右側(cè)頭、右側(cè)尾和左肺葉中切出至少兩個(gè)矢狀厚片(2-3mm厚)的組織塊。所切出的每個(gè)組織塊表面約為1cm2。將組織塊在一系列濃度的乙醇溶液中脫水并包埋于石蠟中。從石蠟包埋塊中制備切片(5μl厚)并將其用蘇木精和伊紅染色，用于組織學(xué)分析。
數(shù)據(jù)分析和解釋用均值及其標(biāo)準(zhǔn)差和均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用基于計(jì)算機(jī)的統(tǒng)計(jì)軟件包(SAS/STAT指南，第6版Cary，N.C.183-260(1985))，應(yīng)用Student’st-檢驗(yàn)、卡方分布、相關(guān)系數(shù)、方差分析(ANOVA)和多重比較檢驗(yàn)來判斷對(duì)照組和治療組之間的差異的顯著性。
結(jié)果在本研究中，我們檢測(cè)了整聯(lián)蛋白中和抗體α1β1(抗α1β1)在體內(nèi)減少博來霉素(BL)-誘導(dǎo)的肺纖維變性的假說。給雄性C57/BL6小鼠氣管內(nèi)(IT)注射生理鹽水(SA)或0.1ml 0.08U BL，隨后腹膜內(nèi)(IP)注射抗體(100μg/0.2ml)，一周三次。在IT滴注的21天之后，將小鼠處死，進(jìn)行支氣管灌洗(BAL)、生化和組織病理學(xué)分析。
肺的組織病理學(xué)檢測(cè)我們預(yù)計(jì)用生理鹽水和對(duì)照IgG處理的小鼠不出現(xiàn)可目測(cè)的損傷，并且具有正常的薄型肺泡間隔。相反，在用博來霉素和對(duì)照IgG處理的小鼠中出現(xiàn)各種損傷，從在近腺泡中的聚集到彌散分布，偶爾也累及胸膜。我們預(yù)計(jì)用博來霉素和抗α1整合素抗體處理的小鼠肺部的表現(xiàn)與B組(上述)小鼠的表現(xiàn)更為相似。我們預(yù)計(jì)D組動(dòng)物僅出現(xiàn)有限數(shù)量的纖維變性損傷，具有輕度的多發(fā)性間隔增厚和小量的單核細(xì)胞聚集。
雖然為了便于清楚的理解本發(fā)明，通過舉例和實(shí)施例敘述了上述發(fā)明的一些細(xì)節(jié)，但這可以進(jìn)行某些改變和修飾，這對(duì)于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員是顯而易見的。因此，這些敘述和實(shí)施例不是對(duì)在附加的權(quán)利要求中敘述的本發(fā)明范圍的限制。
權(quán)利要求
1.VLA-1拮抗物在制備治療受試者纖維變性的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了人或動(dòng)物受試者中纖維變性的治療方法，該方法包括給受試者給藥有效量的VLA－4整聯(lián)蛋白或其片段的拮抗劑。
文檔編號(hào)A61P17/02GK1596979SQ20041000804
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2000年4月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月22日
發(fā)明者菲利普·戈特沃爾斯, 羅伊·R·洛布 申請(qǐng)人:比奧根公司