專利名稱：獲得綴合疫苗的方法和含有該綴合疫苗的疫苗組合物的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別是涉及抗原性分子的化學(xué)綴合方法。動物研究已經(jīng)顯示，細(xì)菌多糖是毒性最強(qiáng)的抗原。因此，生產(chǎn)了幾種純化莢膜多糖疫苗，但是各種臨床試驗(yàn)證實(shí)它們是胸腺-非依賴性分子(TI)，這意味著它們對于兩歲以下的兒童不具有免疫原性(Lepow，M.L.等人，Persistence of an tibody fol1owing immunization ofchildren with group A and group C meningococca1polysaccharides。Pediatrics。1977，60673-80)。
為了獲得在較低齡兒童中針對不同細(xì)菌更有效的疫苗，開發(fā)了幾項(xiàng)工作戰(zhàn)略，其中包括多糖或其片段與載體蛋白質(zhì)間的共價(jià)結(jié)合。對于現(xiàn)有的B型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae Type B，Hib)商業(yè)疫苗也是這樣。(Decker，M.D.，等人，Comparative trial ininfants for four conjugates Haemophilus Influenzae Type Bvaccines.J.Pediatrics.1992.120(2)part I184-189.；Eskola，J. 等人，Ten year’s experience with Haemophilus influenzae TypeB(Hib)conjugate vaccines in Finland.Rev.Med.Microbiol.1996.7231-41)。
在其它分子中也已經(jīng)開發(fā)了綴合工作，比如腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitis)B或C多糖(Richmond，P.C.等人，Meningococcal serogroup C conjugate vaccine is immunogenic ininfancy and primes for memory.J.Infect.Dis.1999.1791569-1572；Borrow，R.等人，Meningococcal serogroupC-specific IgG antibody responses and serum bactericidal titresin children following vaccination with a meningococcal A/Cpolysaccharide vaccine.FEMS Immunology and MedicalMicrobiology.2000.2879-85)。
目前的文獻(xiàn)包括許多關(guān)于通過不同方法與蛋白質(zhì)綴合的多糖抗原的文章，例如美國專利No.4 673 574，其描述了與載體蛋白綴合的細(xì)菌莢膜多糖用于形成免疫原性化合物的用途。另一個(gè)例子描述于美國專利No.4 356 170，它利用了一種獲自腦膜炎奈瑟氏球菌(N.Meningitidis)血清群A微生物培養(yǎng)物、通過共價(jià)鍵與免疫原性蛋白質(zhì)結(jié)合的的多糖。
總的來說，所有用于多糖綴合的現(xiàn)有方法沿兩種基本方向工作。第一種涉及多糖片段的獲得；第二種涉及所使用的多糖鏈中含有功能基團(tuán)的區(qū)域(Martínez JC.等人，Preparación de Oligosacáridos deN.Meningitidis serogrupo C por hidrólisis ácida.Biotecnología aplicada.1999.1625-28；Pawlowski A.等人，Preparation of pneumococcal capsular polysaccharide-proteinconjugate vaccines utilizing new fragmentation and conjugationtechnologies.Vaccine.2000.18(8)1873-85；Cabrera O.andcol.Fragmentación del polisacárido de Neisseria meningitidisserogrupo C para su uso en vacunas conjugadas.VacciMonitor.2001.10(3)1-6)。
表A概括表示了迄今為止所使用方法的主要特征。
表A.主要綴合方法?？傮w特征。


圖例

有幾種方法將多糖與載體蛋白綴合。如果該多糖為流感嗜血桿菌(H.Influenzae)的PRP，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種其中首先形成PRP的四丁基銨的方法。將羥基基團(tuán)用羰基二咪唑(CDI)活化后；導(dǎo)入1，4-二氨基丁烷，最后我們導(dǎo)入一個(gè)溴化物，它將負(fù)責(zé)與蛋白質(zhì)的融合。所用于綴合的蛋白質(zhì)事先用N-乙酰高半胱氨酸硫內(nèi)脂活化，這導(dǎo)致形成一個(gè)與多糖溴化物反應(yīng)的SH基團(tuán)。
我們從所有利用腦膜炎奈瑟氏球菌多糖的綴合方法發(fā)現(xiàn)，在一些方法中多糖通過利用NaOH堿水解發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化以除去其中存在的乙酰基團(tuán)。我們已經(jīng)證實(shí)，NaOH 0.02N的濃度可以從腦膜炎球菌“C”多糖中除去這些基團(tuán)。也已經(jīng)用腦膜炎球菌“B”多糖和NaOH 2M濃度開展了其它研究，其中O-Ac基團(tuán)被除去并產(chǎn)生了活性氨基基團(tuán)，這使得我們有可能用?；鶊F(tuán)替換最初的乙酰基團(tuán)。后來，通過用高碘酸鈉氧化使多糖片段化，由此產(chǎn)生通過以氰基硼氫鈉為還原劑的還原胺化與蛋白質(zhì)結(jié)合的羰基基團(tuán)(US 5425946)。
然而，值得說起的是，該方法用N-酰基基團(tuán)取代N-乙?；鶊F(tuán)包括了利用pH為13至14(NaOH，2M)的堿性水解、以及90℃至110℃的溫度范圍，這促成多糖碎裂且構(gòu)成了抗原性失調(diào)的危險(xiǎn)。此外，N-脫乙酰作用的百分?jǐn)?shù)在30至100范圍間變化。
迄今描述的綴合方法已經(jīng)包括了PRP在有機(jī)溶劑中的活化，這需要產(chǎn)生四丁基銨鹽，實(shí)施幾個(gè)純化步驟，并使用幾種間隔子，比如己二酸二肼(adipic acid dihydrazine)(ADH)，1，4-二氨基丁烷，或氨基己酸。通常，綴合需要使用不止一項(xiàng)。
其它作者已經(jīng)對兩種多糖與蛋白質(zhì)綴合進(jìn)行了研究。對于PRP與肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)型6a多糖間的融合，以及這些多糖與腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B外膜蛋白復(fù)合物間的融合(歐洲專利No.0 534 764 A1)。
為獲得該產(chǎn)物，已經(jīng)使用了以下方法首先，PRP應(yīng)當(dāng)與草酸及N-四丁基氫氧化銨溶液反應(yīng)；之后，在二甲基甲酰胺(DMF)存在下用羰基二咪唑活化該多糖羥基基團(tuán)，并將該階段獲得的產(chǎn)物與1，4-二氨基丁烷和溴乙酰氯反應(yīng)。這樣，多糖被活化。接著用N-乙酰高半胱氨酸硫內(nèi)脂活化蛋白質(zhì)。之后，加入二硫蘇糖醇(DTT)以在該蛋白質(zhì)中得到與活化多糖反應(yīng)的巰基基團(tuán)。由此，將衍生的PRP與活化蛋白質(zhì)反應(yīng)18小時(shí)。這樣，得到第一蛋白質(zhì)-多糖基團(tuán)，且此處在蛋白質(zhì)的SH基團(tuán)和多糖的溴乙?；鶊F(tuán)間形成融合。然后，活化第二個(gè)多糖(從S.Pneumoniae 6a得到的那個(gè))，為此我們首先用Dowex50x2和N-四丁基氫氧化銨在一個(gè)柱子里從該多糖得到四丁基銨鹽。之后我們用DMF和CDI活化羥基基團(tuán)。使它們與以下試劑反應(yīng)2-(6-氨基己酰)4，9-二氧代-1，1 2-二氨基十二烷-萘(naphtalene)-1，5-二磺酸鹽(ACA-DODAD-NDSA)和S-乙酰巰基丁二酸酐(SAMSA)。這樣，衍生出第二個(gè)多糖。接下來，借助存在于綴合物多糖一側(cè)中的溴乙酰基團(tuán)使第二個(gè)多糖與(通過所產(chǎn)生的SH基團(tuán))前述綴合物結(jié)合。該新制備出的綴合物結(jié)構(gòu)將是如下的多糖2-間隔子-多糖1-間隔子-蛋白質(zhì)。
如果給定該方法中活化抗原所必需步驟的數(shù)量，抗原產(chǎn)量在綴合前是非常低的。
至于綴合，迄今現(xiàn)存的所有方法都利用了多糖斷裂化后源自多糖的羰基基團(tuán)、存在于多糖碳結(jié)構(gòu)中的羧基或羥基基團(tuán)、或蛋白質(zhì)的氨基或羧基基團(tuán)。令人很奇怪的是，到目前還沒有關(guān)于作為一種抗原分子綴合策略的在未斷裂(fragment)多糖結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生的氨基基團(tuán)與蛋白質(zhì)羧基基團(tuán)間的融合。
本發(fā)明所追求的技術(shù)目的是，創(chuàng)造一種通過在糖類抗原結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生氨基基團(tuán)并將這些基團(tuán)與蛋白質(zhì)的羧基基團(tuán)結(jié)合來綴合糖類抗原(對其抗原性不產(chǎn)生大的破壞)的方法。
本發(fā)明涉及一種將多糖抗原綴合以獲得多價(jià)疫苗制品的方法。它包括以下步驟a)于40℃至110℃溫度下，用濃度為0.1至0.9N的堿性物質(zhì)比如NaOH、KOH或LiOH處理第一糖類抗原3至10小時(shí)以促使產(chǎn)生氨基基團(tuán)，而不使抗原的抗原性受損害；
b)對于三價(jià)制品，用碳二亞胺活化該第一抗原的羧基基團(tuán)；c)將完成步驟(b)后得到的抗原的活化的羧基基團(tuán)與可以為蛋白質(zhì)或糖的第二抗原綴合；d)純化得自步驟(c)的綴合物；e)用碳二亞胺活化第三蛋白質(zhì)抗原的羧基基團(tuán)以增強(qiáng)糖類抗原的免疫原性；f)將在步驟(a)糖類抗原中形成的氨基基團(tuán)與步驟(e)的活化的蛋白質(zhì)抗原綴合以獲得二價(jià)制劑。將存在于步驟(d)糖類抗原中的氨基基團(tuán)與步驟(e)的活化蛋白質(zhì)抗原綴合以獲得三價(jià)制劑；g)純化得自步驟(f)的綴合物。
如果該糖類源自細(xì)菌，假如步驟(a)的糖類在其結(jié)構(gòu)中含有酰胺樣(amide-like)鍵，那么該綴合方法就會有效。該細(xì)菌可能是奈瑟氏球菌(Neisseria)屬的，尤其是腦膜炎奈瑟氏球菌，無論是組A、B或C。本發(fā)明還考慮了步驟(a)中所提到的糖類源自沙門氏菌(Salmonella)屬細(xì)菌，尤其是源自傷寒沙門氏菌(S.Typhi)，且該多糖為Vi的多糖可能性。同樣，還考慮了該糖類抗原源自弧菌屬(Vibrio)細(xì)菌，尤其是源自霍亂弧菌(V.Cholerae)種，且該多糖為霍亂弧菌脂多糖的可能性。
本發(fā)明所建議的方法在第二蛋白質(zhì)抗原為蛋白質(zhì)或肽時(shí)也是有效的，該肽或蛋白質(zhì)可通過天然、重組或合成方法獲得，并可以獲自病毒、真菌、植物或動物。該肽或蛋白質(zhì)甚至可來自細(xì)菌，即大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬(Shigella)、霍亂弧菌、和腦膜炎奈瑟氏球菌(N.Meningitidis)。
類似地，當(dāng)?shù)诙乖醋蕴穷悤r(shí)本方法也是有效的。該抗原可獲自奈瑟氏球菌屬的細(xì)菌，尤其是獲自腦膜炎奈瑟氏球菌，源自其中A、B或C組的多糖或脂多糖。本發(fā)明還考慮了該糖類來自沙門氏菌屬細(xì)菌，尤其是源自傷寒沙門氏菌，且該多糖為Vi的可能性。同樣，本發(fā)明還考慮了該糖類抗原可能源自弧菌屬細(xì)菌，尤其是源自霍亂弧菌這樣一種情況，尤其是當(dāng)該糖類抗原為霍亂弧菌的脂多糖時(shí)。
本發(fā)明在第二糖類抗原來自B型流感嗜血桿菌時(shí)也適用，尤其是多核糖基核糖醇磷酸(Polyribosil Ribitol Phosphate，PRP)。如果用作第二糖類抗原的PRP是以1，8-二氨基辛烷作為間隔子活化的，本發(fā)明也有效。
如果源自本方法中所使用蛋白質(zhì)的第三抗原來自細(xì)菌，本發(fā)明也是可行的。這可以通過天然、重組或合成方法獲得，以及可來自病毒、真菌、植物或動物。該抗原可來自細(xì)菌，即，腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B，尤其是來自外膜蛋白質(zhì)、重組蛋白(p64K)、clostridium tetanic，此處破傷風(fēng)類毒素(tetanic toxoid)、diphteric toxoid、和B型流感嗜血桿菌是來自外膜的重要蛋白。
本發(fā)明可以通過前述方法獲得綴合二價(jià)和三價(jià)疫苗，它需要實(shí)施相對較少的步驟。此外，由此方法獲得的綴合物恰好可以有效抵御由疫苗抗原所來源的細(xì)菌引起的疾病。
可直接從前述方法獲得的疫苗組合物也是本發(fā)明的一部分，即-疫苗組合物，其中腦膜炎奈瑟氏球菌“C”多糖通過共價(jià)鍵與破傷風(fēng)類毒素(tetanus toxoid)相結(jié)合。
-疫苗組合物，其含有與蛋白質(zhì)P64k綴合的腦膜炎奈瑟氏球菌“C”多糖。
-疫苗組合物，其中腦膜炎奈瑟氏球菌“B”脂多糖(LPS)通過共價(jià)鍵與破傷風(fēng)類毒素相結(jié)合。
-疫苗組合物，其含有與破傷風(fēng)類毒素綴合的腦膜炎奈瑟氏球菌“A”多糖。
-疫苗組合物，它由通過共價(jià)鍵與霍亂弧菌的毒素亞單位B結(jié)合的霍亂弧菌的LPS制成。
-疫苗組合物，其中霍亂弧菌的LPS與破傷風(fēng)類毒素綴合。
-疫苗組合物，帶有傷寒沙門氏菌的多糖Vi與志賀氏菌屬蛋白質(zhì)的綴合物，且途寒沙門氏菌的多糖Vi通過共價(jià)鍵與傷寒沙門氏菌的蛋白質(zhì)結(jié)合。
還包括在本發(fā)明內(nèi)容中的是，得自使用前述方法的三價(jià)疫苗組合物。例如，其中腦膜炎奈瑟氏球菌“C”多糖通過共價(jià)鍵與破傷風(fēng)類毒素和PRP結(jié)合的疫苗組合物；其中腦膜炎奈瑟氏球菌“C”多糖通過共價(jià)鍵與破傷風(fēng)類毒素和腦膜炎奈瑟氏球菌“A”多糖結(jié)合的疫苗組合物；由通過共價(jià)鍵與志賀氏菌屬和傷寒沙門氏菌的蛋白質(zhì)結(jié)合的傷寒沙門氏菌的多糖Vi構(gòu)成的三價(jià)疫苗組合物；由通過共價(jià)鍵與志賀氏菌屬的蛋白質(zhì)和霍亂弧菌的LPS結(jié)合的傷寒沙門氏菌的多糖Vi構(gòu)成的三價(jià)疫苗組合物；其中腦膜炎奈瑟氏球菌“C”多糖通過共價(jià)鍵與破傷風(fēng)類毒素和腦膜炎奈瑟氏球菌“B”的LPS結(jié)合的疫苗組合物；和其中腦膜炎奈瑟氏球菌“C”多糖通過共價(jià)鍵與腦膜炎奈瑟氏球菌“B”外膜蛋白質(zhì)和腦膜炎奈瑟氏球菌“A”多糖結(jié)合的疫苗組合物。
本發(fā)明和其它迄今已知的發(fā)明之間的區(qū)別在于，由本方法生產(chǎn)的綴合疫苗是在該結(jié)構(gòu)的糖類側(cè)產(chǎn)生氨基基團(tuán)的結(jié)果，它需要在低于110℃的溫度下利用介于9至11的pH范圍(使用濃度為0.1至0.7 N的NaOH)。
這一范圍尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，且低于由現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)所提及的范圍。令人驚奇的是，在這些條件下，可以實(shí)現(xiàn)高且穩(wěn)定百分比的N-脫乙酰作用。如本方法所述，利用在糖類結(jié)構(gòu)中形成的氨基基團(tuán)將蛋白質(zhì)固定到糖上，迄今尚未報(bào)道。出乎預(yù)料的是，觀察到了針對該綴合物糖一側(cè)的良好免疫應(yīng)答，盡管已經(jīng)有其它作者倡導(dǎo)在該結(jié)構(gòu)中需要O-乙?；鶊F(tuán)以獲得良好的免疫識別。
此外，本發(fā)明中使用的間隔子是雙功能試劑1，8-二氨基辛烷，它在之前并未就此目的而報(bào)道。
本發(fā)明描述了一種可工業(yè)規(guī)模使用的方法，因?yàn)樗潜ＷC高產(chǎn)量和有效疫苗產(chǎn)品的簡單方法。
下面給出的實(shí)施例包含了對下述發(fā)明的證實(shí)。
實(shí)施例1從從腦膜炎奈瑟氏球菌“C”多糖得到二價(jià)疫苗實(shí)施例1.1腦膜炎奈瑟氏球菌“C”多糖的N-脫乙酰作用將六十(60)毫克“C”組腦膜炎球菌多糖(PMGC)溶解于15ml0.1至0.9 N的NaOH。將溶液在105℃的烘箱中放置5小時(shí)。然后，讓其在室溫中冷卻。用鹽酸1∶2(V/V)中和pH。借助利用ophtaldialdehyde(OPA)的技術(shù)來評估PMGC中存在自由氨基基團(tuán)，結(jié)果是提高NaOH濃度逐步產(chǎn)生氨基基團(tuán)，如表1所示。
表1評估“C”組腦膜炎球菌多糖中氨基基團(tuán)的產(chǎn)生，這是C-5的N-脫乙酰作用結(jié)果。

實(shí)施例1.2經(jīng)NaOH修飾的“C”腦膜炎球菌多糖基團(tuán)與不同載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。
將15毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDAC)加到濃度為1mg/ml(用Lowry法估算)的5ml破傷風(fēng)類毒素(TT)溶液中。pH固定在4.5和6之間，室溫下攪拌該混合物15分鐘。之后，向其中加入2ml如實(shí)施例1中所得的經(jīng)NaOH處理的多糖溶液。調(diào)節(jié)pH，室溫下攪拌混合物5小時(shí)。4℃下用5L pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)將混合物透析過夜。更換了兩次緩沖液。第二天，將混合物用16×100mm的Sepharose CL 4B柱純化。用于洗脫峰的緩沖液為PBS，pH 7.4。于206nm處收集第一個(gè)檢測到的峰，這與280nm處洗脫的峰一致。我們用Lowry法估計(jì)了蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)。采用間苯二酚法用唾液酸估計(jì)多糖含量。獲得的綴合物于4℃保存。向樣品中添加硫柳汞(Thimerosal)(0.01％)直至進(jìn)一步使用。
對于均來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群“B”的蛋白質(zhì)P64K(重組)和VME，采用與TT同樣的程序。表2示出結(jié)果。
表2綴合過程結(jié)果

PMGCC組腦膜炎球菌多糖實(shí)施例1.3免疫過程8只一組的白色雄Balb/c小鼠(8-10周齡)腹膜內(nèi)接種3次(0、14和28天，每次含有10μg多糖)如實(shí)施例2所示制備的綴合物中的每一種。每次接種前和末次接種后7天和14天，從動物取血獲得血清，其進(jìn)一步在臨床實(shí)驗(yàn)中評估，以證實(shí)抗體和殺細(xì)菌劑的存在。
實(shí)施例1.4ELISA法評估小鼠中的IgG抗體。
用帶有多聚L賴氨酸包被(100μl/孔)的Maxisorp平板(Nunc)來實(shí)施這一技術(shù)，室溫下使其在潮濕室(chamber)內(nèi)孵育1小時(shí)。之后，該板用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的pH 7.4的PBS洗滌四次。之后用PMGC(5μg/ml)或VME(依據(jù)目的)溶液包被，100μl/孔，4℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育4小時(shí)。之后該平板用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的PBS(pH 7.4)洗滌四次。然后，用戊二醛溶液(以0.015％溶于PBS)包被該板，添加100μl/孔。之后，于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后該板用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的PBS(pH 7.4)洗滌四次，然后用凝膠溶液(100μg/ml)包被該板，添加100μl/孔。于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后將板洗滌四次，根據(jù)建立的實(shí)驗(yàn)方案，我們添加了100μl/孔的來自各樣品的血清(稀釋1/800)。于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。將板洗滌四次。我們添加了100μl/孔的第二抗體，該抗體由山羊中產(chǎn)生的一種小鼠抗-IgG組成，與過氧化物酶綴合(Sigma No.3742)。于37℃下放置1小時(shí)。接下來，在洗滌該板后，我們加入了底物1，2-苯二胺和過氧化氫(OPD+H2O2)。室溫下放置15分鐘，加入50μl/孔的2N硫酸使反應(yīng)終止。在TitertekMultieskam裝置上讀取492nm處的DO值。結(jié)果示于附

圖1。實(shí)施例1.5ELISA法評估小鼠中的IgG抗體亞類。
為了評估動物血清中存在的IgG亞類，我們使用了生物素-鏈霉抗生物素?cái)U(kuò)增ELISA。我們使用了平底96孔聚苯乙烯板(Maxisorp，Nunc)，該板用稀釋于PBS、濃度為3μg/ml的聚L-賴氨酸包被。將板在室溫下孵育30分鐘，之后用PBS洗滌三次。用PMGC或VME(根據(jù)目的)加入第二包被。4℃下孵育整夜，之后用PBS+BSA+Tween20阻斷。所用樣品是用以1∶100稀釋于PBS/Tween 20的BSA制備的。4℃下孵育整夜。之后添加綴合物抗IgG1或生物素化的IgG 2a(Sigma)。然后，我們添加了鏈霉抗生物素(Sigma)。我們使用了100μl/孔的H2O2O.15％和鄰苯二胺(Sigma)為底物，并用2.5 N的H2SO4終止反應(yīng)。用微-ELISA讀取器(Titertek Multieskan)將吸光度固定在492nm。在每次孵育步驟中，樣品都用PBS/Tween 20洗滌。附圖3和4顯示這些評估的結(jié)果。
實(shí)施例1.6評估殺菌抗體。
已知，殺菌抗體在被接種個(gè)體的保護(hù)中起重要作用。用多糖制備的疫苗應(yīng)當(dāng)能夠產(chǎn)生殺菌抗體以確保正常的防護(hù)。這就是為什么將這一技術(shù)應(yīng)用于接種小鼠血清使我們覺得受到鼓舞的原因。結(jié)果示于附圖5。
此項(xiàng)工作中所描述的結(jié)果證實(shí)了第一種針對腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C的Cuban綴合疫苗的產(chǎn)生，同時(shí)，它也是世界上第一種利用多糖鏈中形成的氨基基團(tuán)(由此除去了多糖鏈中存在的與NH融合的乙?；鶊F(tuán))來與蛋白質(zhì)產(chǎn)生共價(jià)鍵的綴合疫苗，該疫苗不僅對腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C、而且對載體蛋白質(zhì)(腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B和破傷風(fēng)類毒素，依賴于所使用的配方)也具有高免疫原性。該疫苗將保護(hù)五歲以下的兒童抵御由這些細(xì)菌引起的疾病。
實(shí)施例2用霍亂弧菌多糖產(chǎn)生二價(jià)疫苗實(shí)施例2.1霍亂弧菌多糖的N-脫乙酰作用將30mg LPS溶解于8ml濃度介于0.25至1N的NaOH。將混合物在105℃的烘箱中放置2、4、和6小時(shí)。之后，讓其在室溫中冷卻。用鹽酸1∶2(V/V)中和pH。用OPA技術(shù)評估LPS中存在自由氨基基團(tuán)。這一過程的結(jié)果是，隨著NaOH濃度上升，逐步形成自由氨基基團(tuán)。反應(yīng)時(shí)間越久，濃度越高。結(jié)果示于附圖3。
表3對LPS中形成的氨基基團(tuán)的評估，這是脂質(zhì)A所含脂肪酸的N-脫?；饔玫慕Y(jié)果。

實(shí)施例2.2經(jīng)NaOH修飾的霍亂弧菌多糖與作為載體蛋白質(zhì)的破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)。
我們使用了3ml濃度為1mg/ml(根據(jù)Lowry法估算)的破傷風(fēng)類毒素溶液。我們添加了15mg EDAC。pH固定在4.5與6間。之后在室溫下攪拌15分鐘。之后我們添加了2ml經(jīng)NaOH處理的LPS溶液，其如實(shí)施例1所述獲得。pH固定在8。之后室溫下攪拌5小時(shí)。然后，4℃下用5L pH為7.4的PBS透析整夜。更換兩次緩沖液。第二天將其用16×100mm的Sepharose CL 4B柱純化。用于洗脫峰的緩沖液為PBS，pH 7.4。我們收集了在206nm處檢測到的第一個(gè)峰，這與280nm處的洗脫峰一致。我們用Lowry法估計(jì)了蛋白質(zhì)濃度，所使用的標(biāo)準(zhǔn)是BSA和多糖成分，其由苯酚-sulphuric法獲得。獲得的綴合物于4℃保存。我們添加了0.01％的硫柳汞直到其最終使用。所得結(jié)果示于表4。
表4綴合過程結(jié)果

實(shí)施例2.3用鱟變形細(xì)胞溶解物方法(Limulus Amebocytes Lysate，LAL)評估毒性。
利用Swedish Company Chromogenix AB的試劑盒CoatestEndotoxin，通過顯色法，采用鱟變形細(xì)胞溶解物測試(LAL)評估了脂多糖毒性。測試遵照制造商所創(chuàng)建的方法進(jìn)行，以介于0.15和1.2內(nèi)毒素單位(EU)間的curb為標(biāo)準(zhǔn)(pattern)。我們選擇了試管來操作，包括一個(gè)用于24支管的干燥阻斷加熱器“StuartScientific”。為了實(shí)施該方法，我們使用了“Associates of CapeCod”公司生產(chǎn)的10×75mm硼硅酸鹽試管(Pyrotubes)。我們還使用了“Costar”聚苯乙烯15ml離心管用于pattern curb，還使用了“Rainin”移液管。所有這些材料都不帶內(nèi)毒素。
LAL測試的結(jié)果是，天然LPS記錄的值為5.3477 EU/ng，而在實(shí)施例1所述條件下處理的LPS顯示的值為0.001 EU/ng，這表示比最初毒性降低了超過5000倍。
實(shí)施例2.4用ELISA法評估霍亂弧菌LPS在綴合后的抗原性。
為了核查LPS在水解和綴合后是否還保持最初的表位，我們用Maxisorp板(Nunc)做了抑制ELISA測試。我們把得自用1N NaOH在105℃處理了四小時(shí)的LPS的綴合物用作包被抗原；天然LPS為對照；以1/4000稀釋的人抗IgG-HRP綴合物；使用SIGMA的鄰苯二胺(OPD)為顯色劑。所使用的抗體是獲自已經(jīng)用霍亂弧菌減毒株O1 EI TorOgawa口服接種了的人的血清，這是一種針對霍亂的候選疫苗。所得結(jié)果示于附圖7。
實(shí)施例2.5免疫過程每組8只白色雄性Balb/c小鼠(8-10周齡)腹膜內(nèi)接種3次(0、7、和28天，每次劑量含LPS濃度為10μg)按照實(shí)施例2制備的各綴合物。每次接種前、以及最后一次接種7天后，我們從動物抽取了一些血液以獲得用于免疫化學(xué)測試中進(jìn)行評估的血清。
實(shí)施例2.6ELISA法評估小鼠中的IgG抗體。
用帶有多聚L賴氨酸(100μl/孔)包被的Maxisorp板(Nunc)來實(shí)施這一技術(shù)，之后于室溫下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后，我們用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的pH 7.4 PBS洗滌該板四次，以及用LPS(5μg/ml)或蛋白質(zhì)(依據(jù)目的)溶液將其包被。我們添加了100μl/孔，并使其在4℃潮濕室內(nèi)孵育4小時(shí)。我們用每 升緩沖液0.5ml Tween-20的pH 7.4 PBS洗滌該板四次，以及用戊二醛溶液(溶于PBS，0.015％)將其包被。我們添加了100μl/孔，并使其在37℃潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。我們用每升緩沖液中加入了0.5ml Tween-20的pH 7.4 PBS洗滌該板四次，以及用膠溶液(100μg/ml)將其包被。我們添加了100μl/孔，并使其在37℃潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。我們洗滌了該板四次，而且按照所建立的方案，我們添加了100μl/孔的來自各樣品的血清(稀釋度＝1/800)，并使其在37℃潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。我們洗滌了該板四次，并添加了100μl/孔的第二抗體，該抗體由山羊中產(chǎn)生的一種小鼠抗-IgG組成，與過氧化物酶綴合(Sigma No.3742)。于37℃下放置1小時(shí)。在洗滌該板后，我們加入了底物(OPD+H2O2)，我們等待了15分鐘多，同時(shí)將板保持在室溫下，通過加入50μl/孔的2N硫酸我們使反應(yīng)終止。在TitertekMultieskam裝置中讀取492nm處的DO值。結(jié)果示于附圖8。
實(shí)施例3從傷寒沙門氏菌Vi多糖獲得二價(jià)疫苗實(shí)施例3.1傷寒沙門氏菌Vi多糖的N-脫乙酰作用將20mg Vi多糖溶解于5ml NaOH中。將混合物在溫度介于50至60℃間的烘箱中放置8至12小時(shí)。之后，讓其在室溫中冷卻。用鹽酸1∶2(V/V)中和pH。用OPA方法評估Vi多糖中存在自由氨基基團(tuán)，其結(jié)果是，每ml溶液形成1.2∶mol氨基基團(tuán)。
實(shí)施例3.2經(jīng)NaOH修飾的Vi多糖與不同載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。
我們向2ml濃度為1mg/ml的破傷風(fēng)類毒素(TT)溶液中添加了15mg EDAC。pH固定在4.5和6之間。室溫下攪拌15分鐘。然后，我們添加了2ml活化的Vi多糖溶液，如實(shí)施例3.1所述。我們調(diào)節(jié)了pH并在室溫下攪拌了5小時(shí)。將其于4℃下用5L pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)將混合物透析整夜。我們更換了兩次緩沖液。第二天，用16×100mm的Sepharose CL 4B柱對其層析。用于洗脫峰的緩沖液為PBS，pH 7.4。我們收集了在206nm處檢測到的第一個(gè)峰，它和280nm處洗脫的峰一致，此處我們用Lowry法以BSA為標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)了蛋白質(zhì)濃度。通過ELISA法估計(jì)了多糖濃度，這一方法適于此目的。獲得的綴合物于4℃保存。添加了0.01％的硫柳汞直到其最終使用。
對于傷寒沙門氏菌的VME蛋白質(zhì)和血清型B腦膜炎奈瑟氏球菌的VME，我們遵循了對TT所描述的相同程序。結(jié)果示于下表。
表5綴合過程結(jié)果

VMEs＝傷寒沙門氏菌外膜囊泡VMEm-血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌外膜囊泡實(shí)施例3.3免疫過程每組8只白色雄性Balb/c小鼠(8-10周齡)腹膜內(nèi)接種2次(0、和28天，每次劑量含Vi濃度為10μg)按照實(shí)施例2制備的各綴合物。每次接種前、以及最后一次接種14天后，我們從動物抽取了一些血液以獲得用于免疫化學(xué)測試中進(jìn)行評估的血清。
實(shí)施例3.4ELISA法評估小鼠中的IgG抗體。
用帶有多聚L賴氨酸(100μl/孔)包被的Maxisorp板(Nunc)來實(shí)施這一技術(shù)，之后于室溫下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后，我們用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的pH 7.4 PBS洗滌該板四次。之后，將其用Vi多糖(5μg/ml)或蛋白質(zhì)(依據(jù)目的)溶液包被，添加100μl/孔，并使其在4℃潮濕室內(nèi)孵育4小時(shí)。之后，用每升緩沖液0.5ml Tween-20的pH 7.4 PBS洗滌該板四次。然后，用戊二醛溶液(以0.015％溶于PBS)包被該板，添加100μl/孔。之后，于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后該板用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的PBS(pH 7.4)洗滌四次，然后用凝膠溶液(100μg/ml)包被該板，添加100μl/孔。于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后將板洗滌四次，根據(jù)建立的實(shí)驗(yàn)方案，我們添加了100μl/孔的來自各樣品的血清(1/800稀釋)。于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。將板洗滌四次。我們添加了100μl/孔的第二抗體，該抗體由山羊中產(chǎn)生的一種小鼠抗-IgG組成，與過氧化物酶綴合(Sigma No. 3742)。于37℃下放置1小時(shí)。接下來，在洗滌該板后，我們加入了底物(OPD+H2O2)。室溫下放置15分鐘，加入50μl/孔的2N硫酸使反應(yīng)終止。在Titertek Multieskam裝置上讀取492nm處的DO值。結(jié)果示于附圖9。
實(shí)施例4從腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖和流感嗜血桿菌多糖獲得三價(jià)疫苗。
實(shí)施例4.1腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖的N-脫乙酰作用將六十(60)毫克“C”組腦膜炎球菌多糖溶解于15ml NaOH。將溶液在105℃的烘箱中放置3至4.5小時(shí)。然后，讓其在室溫中冷卻。pH用鹽酸1∶2(V/V)中和。用OPA方法評估“C”組腦膜炎球菌多糖中自由氨基基團(tuán)的存在，結(jié)果是產(chǎn)生6.47mM氨基基團(tuán)。
實(shí)施例4.2“B”型流感嗜血桿菌多糖(PRP)的羥基基團(tuán)的活化。
我們將40mg PRP溶解于300ul蒸餾水中。將其添加到溶解于二甲亞砜(DMSO)的1ml CDI溶液中。攪拌3小時(shí)。然后，我們制備了含有70mg溶解于0.7ml蒸餾水的1，8-二氨基辛烷和5N NaOH的溶液。將其在冷雙重蒸鍋中攪拌60分鐘。此后，我們將PRP-CDI添加到間隔子中，并允許反應(yīng)在冷雙重蒸鍋中持續(xù)1小時(shí)。然后，我們讓其在室溫放置20分鐘。最后，4℃下我們用5L pH為7.4的PBS透析該混合物。我們更換了6次緩沖液，并且在該過程結(jié)束的時(shí)候，我們將該混合物從透析袋中取出于4℃保存。
我們用OPA方法核查了在該活化PRP中氨基基團(tuán)的存在，其結(jié)果是濃度為的4.14mmols NH2/mg PRP。
實(shí)施例4.3經(jīng)修飾的“C”組腦膜炎球菌多糖與活化PRP的偶聯(lián)。
向?qū)嵤├?.1所改良的、由20mg PMGC和3ml pH為7.4的PBS組成的溶液中添加30mg EDAC。室溫下攪拌25分鐘。之后，我們加入了實(shí)施例4.2的活化PRP。之后攪拌該混合物3小時(shí)，并用pH 7.4的PBS滲濾。重復(fù)滲濾5次，每次使用50ml緩沖液。最后一次滲濾后，留下2ml，保存于4℃直到最終使用。
實(shí)施例4.4綴合多糖與載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。
我們向10ml濃度為1mg/ml(根據(jù)Lowry法測定)的破傷風(fēng)類毒素(TT)溶液中添加了50mg EDAC。室溫下攪拌15分鐘。之后，我們添加了2ml如實(shí)施例4.3中獲得的多糖。之后在室溫下攪拌2至4小時(shí)。之后在4℃下用pH為7.4的PBS(5L)透析整夜。我們更換了兩次緩沖液。第二天，將其用16×100mm的Sepharose CL 4B柱純化。用于洗脫峰的緩沖液為PBS，pH 7.4。我們收集了在280nm處檢測到的第一個(gè)峰，此處我們用Lowery法以BSA為標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)了蛋白質(zhì)濃度。用間苯二酚法估計(jì)了每唾液酸PMGC含量。用苔黑酚法估計(jì)了決定核糖的PRP含量。獲得的綴合物于4℃保存，添加了0.02％的硫柳汞直到其最終使用。
實(shí)施例4.5免疫過程白色雄性Balb/C小鼠(8-10周齡)組腹膜內(nèi)接種3次(0、14、和28天，每次劑量含多糖濃度為10μg PMGC)按照實(shí)施例4制備的各綴合物。最后一次接種后十二天，我們從動物中抽取了血液以獲得進(jìn)一步評估免疫原性和殺菌實(shí)驗(yàn)的血清。
實(shí)施例4.6ELISA法評估小鼠中的抗體。
用帶有多聚L賴氨酸(100μl/孔)包被的Maxisorp板(Nunc)來實(shí)施這一技術(shù)，接下來使其于室溫下在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。然后，該板用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的pH 7.4 PBS洗滌四次，并用PMGC或PRP(5μg/ml)溶液將其包被。我們添加了100μl/孔，4℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育4小時(shí)。之后該板用每升緩沖液中加0.5ml Tween-20的PBS(pH 7.4)洗滌四次。然后，用戊二醛溶液(以0.015％溶于PBS)包被該板，添加100μl/孔。之后，于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后該板用每升緩沖液中加0.5mlTween-20的PBS(pH 7.4)洗滌四次，然后用凝膠溶液(100μg/ml)包被該板，添加100μl/孔。于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后將板洗滌四次，根據(jù)建立的實(shí)驗(yàn)方案，我們添加了100μl/孔的來自各樣品的血清。于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。將板洗滌四次。我們添加了100μl/孔的第二抗體，該抗體由山羊中產(chǎn)生的一種小鼠抗-IgG組成，與過氧化物酶綴合(Sigma No. 3742)。于37℃下放置1小時(shí)。在洗滌該板后，我們加入了底物(OPD+H2O2)，我們等待了15分鐘多，同時(shí)將該板保持在室溫下，通過加入50μl/孔的2N硫酸我們使反應(yīng)終止。在Titertek Multieskam裝置中讀取492nm處的DO值。吸收值示于附圖10、11、和12。
實(shí)施例4.7ELISA法評估小鼠中的IgG抗體亞類。
為了評估動物血清中存在的IgG亞類，我們使用了生物素-鏈霉抗生物素?cái)U(kuò)增ELISA測試。我們使用了平底96孔聚苯乙烯板(Maxisorp，Nunc)，該板用稀釋于PBS、濃度為3μg/ml的聚L-賴氨酸包被。將板在室溫下孵育30分鐘，之后用PBS洗滌三次。用前述的多糖(PolyC或PRP)進(jìn)行第二次包被。4℃下孵育整夜，之后用PBS+BSA+Tween20阻斷。所用樣品是用以1∶100稀釋于PBS/Tween 20的BSA制備的。4℃下孵育整夜。之后添加抗IgG1或生物素化的IgG 2a綴合物(Sigma)。然后，我們添加了鏈霉抗生物素(Sigma)。我們使用了100μl/孔的H2O20.15％和鄰苯二胺(Sigma)為底物，并用2.5 N的H2SO4終止反應(yīng)。用微-ELISA讀取器(Titertek Multieskan)測定492nm處的吸光度。在每次孵育步驟后，樣品都用PBS/Tween 20洗滌。結(jié)果示于附圖13和14。
實(shí)施例5從血清群“A”腦膜炎奈瑟氏球菌多糖獲得二價(jià)疫苗。
實(shí)施例5.1血清群“A”腦膜炎奈瑟氏球菌多糖的N-脫乙酰作用將三十(30)毫克“A”組腦膜炎球菌多糖(PMGA)溶解于8ml 0.5至0.9N的NaOH。將溶液放在溫度40℃至60℃的烘箱中1至8小時(shí)。然后，讓其在室溫中冷卻。pH用1∶2(V/V)鹽酸中和。用(OPA)方法評估PMGA中自由氨基基團(tuán)的存在，其結(jié)果是每ml溶液中形成了2.5μmol氨基基團(tuán)。
實(shí)施例5.2經(jīng)NaOH-修飾的“A”組腦膜炎球菌多糖與破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)我們使用了3ml濃度為1mg/ml(根據(jù)Lowry法估算)的破傷風(fēng)類毒素溶液。我們添加了15mg EDAC。pH固定在4.5與6間。之后在室溫下攪拌15分鐘。然后我們添加了2ml如實(shí)施例5.1中獲得的活化PMGA溶液。調(diào)節(jié)pH。之后于室溫下攪拌5小時(shí)。然后，4℃下用5L pH為7.4的PBS透析整夜。更換了兩次緩沖液。第二天將其用16×100mm的Sepharose CL 4B柱純化。用于洗脫峰的緩沖液為PBS，pH7.4。我們收集了在206nm處檢測到的第一個(gè)峰，它與280nm處洗脫的峰一致。此時(shí)，我們用Lowry法評估了蛋白質(zhì)濃度。所使用的標(biāo)準(zhǔn)是BSA和多糖成分，通過估計(jì)磷酸鹽。獲得的綴合物于4℃保存。我們添加了0.01％的硫柳汞直到其最終使用。所得結(jié)果示于表4。該綴合過程所得結(jié)果示于表6。
表6綴合過程結(jié)果

PMGA＝“A”組腦膜炎球菌多糖實(shí)施例5.3免疫過程每組8只白色雄性Balb/c小鼠(8-10周齡)腹膜內(nèi)接種2次(0、和28天，每次劑量含PMGA濃度為10ug)按照實(shí)施例2制備的各綴合物。每次接種前、以及最后一次接種14天后，我們從動物抽取了一些血液以獲得進(jìn)一步用于免疫化學(xué)測試的血清。
實(shí)施例5.4ELISA法評估小鼠中的IgG抗體。
用帶有多聚L賴氨酸(100μl/孔)包被的Maxisorp板(Nunc)來實(shí)施這一技術(shù)，之后于室溫下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后，我們用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的pH 7.4 PBS洗滌該板四次。之后，將其用PMGA(5μg/ml)或TT(依據(jù)目的)溶液包被，添加100μl/孔，并使其在4℃潮濕室內(nèi)孵育4小時(shí)。之后，用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的pH 7.4 PBS洗滌該板四次。然后，用戊二醛溶液(以0.015％溶于PBS)包被該板，添加100μl/孔。之后，于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后該板用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的PBS(pH 7.4)洗滌四次，然后用凝膠溶液(100μg/ml)包被該板，添加100μl/孔。于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后將板洗滌四次，根據(jù)建立的實(shí)驗(yàn)方案，我們添加了100μl/孔的來自各樣品的血清(1/800稀釋)。于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。將板洗滌四次。我們添加了100μl/孔的第二抗體，該抗體由山羊中產(chǎn)生的一種小鼠抗-IgG組成，與過氧化物酶綴合(Sigma No.3742)。于37℃下放置1小時(shí)。接下來，在洗滌該板后，我們加入了底物(OPD+H2O2)。室溫下放置15分鐘，加入50μl/孔的2 N硫酸使反應(yīng)終止。在Titertek Multieskam裝置上讀取492nm處的DO值。
實(shí)施例6從血清群“B”腦膜炎奈瑟氏球菌多糖獲得二價(jià)疫苗。
實(shí)施例6.1血清群“B”腦膜炎奈瑟氏球菌多糖的N-脫乙酰作用將二十(20)毫克LPS溶解于5ml NaOH。將溶液放在溫度介于90℃至105℃間的烘箱中2至4小時(shí)。然后，讓其在室溫中冷卻。pH用1∶2(V/V)鹽酸中和。用(OPA)方法估計(jì)LPS中自由氨基基團(tuán)的存在，其氨基基團(tuán)的形成結(jié)果示于表7。
表7對LPS中形成的氨基基團(tuán)的評估，這是脂質(zhì)A脂肪酸的N-脫?；饔媒Y(jié)果。

實(shí)施例6.2經(jīng)NaOH修飾的血清群“B”腦膜炎奈瑟氏球菌多糖與作為載體蛋白質(zhì)的破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)。
我們使用了2ml濃度為lmg/ml(根據(jù)Lowry法估算)的破傷風(fēng)類毒素溶液。我們添加了15mg EDAC。pH調(diào)節(jié)在4.5與6之間。之后在室溫下攪拌15分鐘。之后我們添加了2ml如實(shí)施例1所述獲得的經(jīng)NaOH處理的LPS溶液。pH固定在8。之后室溫下攪拌5小時(shí)。然后，4℃下用5L pH為7.4的PBS透析整夜。更換了兩次緩沖液。第二天將其用16×100mm的Sepharose CL 4B柱純化。用于洗脫峰的緩沖液為PBS，pH 7.4。我們收集了在206nm處檢測到的第一個(gè)峰，這與280nm處的洗脫峰一致。我們用Lowry法估計(jì)了蛋白質(zhì)濃度，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)。多糖含量用苯酚-sulphuric法測定。所得綴合物于4℃保存。我們添加了0.01％的硫柳汞直到其最終使用。所得結(jié)果示于表8。
表8綴合過程結(jié)果

實(shí)施例6.3用鱟變形細(xì)胞溶解物法(LAL)評估毒性。
利用Swedish Company Chromogenix AB的試劑盒CoatestEndotoxin，通過顯色法，采用鱟變形細(xì)胞溶解物測試(LAL)評估了脂多糖毒性。測試遵照制造商所創(chuàng)建的方法進(jìn)行，以介于0.15和1.2內(nèi)毒素單位(EU)間的curb為pattern。我們選擇了試管來操作，包括一個(gè)用于24支管的干燥阻斷加熱器“Stuart Scientific”。為了實(shí)施該方法，我們使用了“Associates of Cape Cod”公司生產(chǎn)的10×75mm硼硅酸鹽試管(Pyrotubes)。我們還使用了“Costar”聚苯乙烯15ml離心管用于pattern curb，還使用了“Rainin”移液管。所有這些材料都不帶內(nèi)毒素。
從LAL測試結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，天然LPS記錄的值為12140EU/μg，而在實(shí)施例1所述條件下處理的LPS顯示的值為5.0EU/μg，這表示比最初毒性降低了超過2000倍。
實(shí)施例6.4免疫過程每組8只白色雄性Balb/c小鼠(8-10周齡)腹膜內(nèi)接種2次(0、和28天，每次劑量含多糖濃度為10ug)按照實(shí)施例2制備的各綴合物。每次接種前、以及最后一次接種14天后，我們從動物抽取了一些血液以獲得進(jìn)一步用于免疫化學(xué)測試的血清。
實(shí)施例6.5ELISA法評估小鼠中的IgG抗體。
用帶有多聚L賴氨酸(100μl/孔)包被的Maxisorp板(Nunc)來實(shí)施這一技術(shù)，之后于室溫下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后，我們用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的pH 7.4 PBS洗滌該板四次。之后，將其用LPS(5μg/ml)或TT(依據(jù)目的)溶液包被，添加100μl/孔，并使其在4℃潮濕室內(nèi)孵育4小時(shí)。之后，該板用PBS(pH 7.4)洗滌四次，且每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20。然后，用戊二醛溶液(以0.015％溶于PBS)包被該板，添加100μl/孔。之后，于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后該板用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的PBS(pH 7.4)洗滌四次，然后用凝膠溶液(100μg/ml)包被該板，添加100μl/孔。于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后將板洗滌四次，根據(jù)建立的實(shí)驗(yàn)方案，我們添加了100μl/孔的來自各樣品的血清(1/800稀釋)。于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。將板洗滌四次。我們添加了100μl/孔的第二抗體，該抗體由山羊中產(chǎn)生的一種小鼠抗-IgG組成，與過氧化物酶綴合(Sigma No. 3742)。于37℃下放置1小時(shí)。接下來，在洗滌該板后，我們加入了底物(OPD+H2O2)。室溫下放置15分鐘，加入50μl/孔的2 N硫酸使反應(yīng)終止。在Titertek Multieskam裝置上讀取492nm處的DO值。
實(shí)施例7從腦膜炎奈瑟氏球菌“C”多糖和腦膜炎奈瑟氏球菌“A”多糖獲得三價(jià)疫苗。
實(shí)施例7.1腦膜炎奈瑟氏球菌“C”多糖的N-脫乙酰作用將六十(60)毫克PMGC溶解于15ml NaOH。將該溶液置于烘箱中。然后，讓其在室溫中冷卻。用鹽酸1∶2(V/V)中和pH。用OPA技術(shù)估計(jì)PMGC中自由氨基基團(tuán)的存在，結(jié)果是產(chǎn)生6.47mM氨基基團(tuán)。
實(shí)施例7.2血清群“A”腦膜炎奈瑟氏球菌多糖的N-脫乙酰作用將三十(30)毫克“A”組腦膜炎球菌多糖(PMGA)溶解于8ml NaOH。將該溶液放在烘箱中保持根據(jù)前述實(shí)施例對該多糖確立的時(shí)間。然后，讓其在室溫中冷卻。pH用1∶2(V/V)鹽酸中和。用(OPA)技術(shù)估計(jì)該多糖中自由氨基基團(tuán)的存在，其結(jié)果是每ml溶液中形成了2.5μmol氨基基團(tuán)。
實(shí)施例7.3經(jīng)修飾的“C”組腦膜炎球菌多糖與活化的“A”組腦膜炎球菌多糖的偶聯(lián)。
向如實(shí)施例7.1中所述經(jīng)過改造的由20mg PMGC和3ml PBS(pH7.4)組成的溶液中添加30mg EDAC。室溫下攪拌25分鐘。此后，我們添加了如實(shí)施例7.2中所述活化的PMGA。之后攪拌該混合物3小時(shí)，然后用pH 7.4的PBS滲濾。重復(fù)滲濾5次，每次使用50ml緩沖液。最后一次滲濾后，留下2ml，保存于4℃直到最終使用。
實(shí)施例7.4綴合多糖與載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。
我們向5ml濃度為1mg/ml(根據(jù)Lowry法測定)的破傷風(fēng)類毒素(TT)溶液中添加了50mg EDAC。室溫下攪拌15分鐘。之后，我們添加了2ml如實(shí)施例7.3中獲得的多糖溶液。之后在室溫下攪拌2至4小時(shí)。之后在4℃下用pH為7.4的PBS(5L)透析整夜。我們更換了兩次緩沖液。第二天，將其用16×100mm的Sepharose CL 4B柱純化。用于洗脫峰的緩沖液為PBS，pH 7.4。我們收集了在280nm處檢測到的第一個(gè)峰，此處我們用Lowery法以BSA為標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)了蛋白質(zhì)濃度。用間苯二酚法估計(jì)了每唾液酸PMGC含量。通過計(jì)算PO4估計(jì)PMGA含量。獲得的綴合物于4℃保存，添加了0.02％的硫柳汞直到其最終使用。
表9綴合過程結(jié)果

PMGA＝“A”組腦膜炎球菌多糖PMGC＝“C”組腦膜炎球菌多糖實(shí)施例7.5免疫過程每組8只白色雄性Balb/c小鼠(8-10周齡)腹膜內(nèi)接種2次(0、和28天，每次劑量含多糖濃度為10ug PMGC)按照實(shí)施例7.4制備的各綴合物。每次接種前、以及最后一次接種14天后，我們從動物抽取了一些血液以獲得進(jìn)一步用于免疫原性測試的血清。
實(shí)施例7.6ELISA法評估小鼠抗體。
用帶有多聚L賴氨酸(100μl/孔)包被的Maxisorp板(NuRc)來實(shí)施這一技術(shù)，之后于室溫下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后，我們用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的pH 7.4 PBS洗滌該板四次。之后，將其用PMGC或PMGA(5μg/ml)(依據(jù)目的)溶液包被，添加100μl/孔，并使其在4℃潮濕室內(nèi)孵育4小時(shí)。之后，用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的pH 7.4 PBS洗滌該板四次。然后，用戊二醛溶液(以0.015％溶于PBS)包被該板，添加100μl/孔。之后，于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后該板用每升緩沖液中溶解了0.5ml Tween-20的PBS(pH 7.4)洗滌四次，然后用凝膠溶液(100μg/ml)包被該板，添加100μl/孔。于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。之后將板洗滌四次，根據(jù)建立的實(shí)驗(yàn)方案，我們添加了100μl/孔的來自各樣品的血清(1/800稀釋)。于37℃下使其在潮濕室內(nèi)孵育1小時(shí)。將板洗滌四次。我們添加了100μl/孔的第二抗體，該抗體由山羊中產(chǎn)生的一種小鼠抗-IgG組成，與過氧化物酶綴合(Sigma No.3742)。于37℃下放置1小時(shí)。接下來，在洗滌該板后，我們加入了底物(OPD+H2O2)。室溫下放置15分鐘，加入50μl/孔的2N硫酸使反應(yīng)終止。在Titertek Multieskam裝置上讀取492nm處的DO值。
附圖簡述附圖1評估IgG抗-PMGC抗體該附圖顯示，“C”組腦膜炎球菌多糖(PMGC)用0.7N NaOH活化并通過共價(jià)鍵與破傷風(fēng)類毒素和VME融合后，用于免疫動物(三次，0、14、28天后)而獲得的血清在492nm的吸光度值，高于用含有P64K作為載體蛋白質(zhì)的綴合物獲得的值。通常，獲自三種綴合物的吸光度值高于獲自天然多糖的值。這是PMGC通過上述方法綴合后胸腺依賴性發(fā)生變化的第一項(xiàng)證據(jù)。
附圖2評估IgG抗-VME抗體該附圖顯示了檢測存在于被空白對照(Placebo)、VME、和用這些蛋白質(zhì)與PMGC得到的綴合物所免疫的動物血清中IgG抗-VME抗體時(shí)獲得的結(jié)果。正如可以看到的，綴合后，免疫動物血清中的IgG抗-VME抗體滴度保持高水平。盡管與用VME免疫的動物血清相比，我們可以察覺到在吸光度值上稍有降低，但我們可以確定應(yīng)用該綴合方法后，VME抗原特性沒有遭受任何相應(yīng)損害。
附圖3評估IgG抗-PMGC亞類(IgG1、IgG2a)該附圖顯示了評估小鼠血清樣品中的IgG抗-PMGC亞類(IgG1、IgG2a)時(shí)的獲得的結(jié)果，這些小鼠被施用了應(yīng)用我們方法后得到的PMGC和TT及VME的綴合物。同樣，它顯示了獲自用天然PMGC免疫的動物的血清結(jié)果。這里我們可以看到，首先，用本技術(shù)獲得的結(jié)果與對IgG抗體的評估之間存在相關(guān)性。正如我們可以看到的，從綴合物得到的滴度大大高于使用天然PMGC時(shí)獲得的滴度。此外，還可以看到，在用綴合物免疫的小鼠的樣品中IgG2a的滴度上升了。這些值在以VME為載體蛋白的綴合物中顯著更高?；谶@些結(jié)果我們可以確定，多糖一旦綴合后不僅僅在多糖的胸腺依賴性上有變化，當(dāng)綴合是與VME發(fā)生時(shí)，在多糖存在下它誘導(dǎo)細(xì)胞性T-輔助細(xì)胞(Th) 1型，這是與TT所誘導(dǎo)的相反，也即，在綴合后的多糖存在下誘導(dǎo)Th2型。
附圖4評估IgG抗-VME亞類(IgGl、IgG2a)該附圖顯示了評估用VME和PMGC-VME綴合物免疫的動物血清中IgG抗-VME亞類(IgG1，IgG2a)的結(jié)果。該附圖中顯示的結(jié)果與附圖2中觀察到的結(jié)果一致，其顯示了對被施用了VME或PMGC-VME綴合物的動物血清中的IgG的評估結(jié)果，因?yàn)檫@里的滴度高。同樣，該附圖顯示，VME具有非常高的IgG2a值，為Th1應(yīng)答類型。在用PMGC-VME綴合物免疫的動物血清中，我們還可以看到，盡管吸光度值降低了，但是仍然存在針對VME的Th1應(yīng)答類型。
附圖5評估針對血清群“C”腦膜炎奈瑟氏球菌的殺菌抗體該附圖所顯示的結(jié)果清楚的表明，含有被測試綴合物的動物血清能夠產(chǎn)生針對血清群“C”腦膜炎奈瑟氏球菌的殺菌抗體水平，該水平高于由天然PMGC產(chǎn)生的水平，這指示所獲得的綴合物是保護(hù)原性的(protectogenic)。
附圖6評估針對血清群“B”腦膜炎奈瑟氏球菌的殺菌抗體該附圖顯示評估針對血清群“B”腦膜炎奈瑟氏球菌的殺菌抗體的結(jié)果。正如可以看到的，在給動物第一次接種14天后，該綴合物顯示出類似于用VME得到的殺菌活性。我們在這里可以看到，該殺菌活性是如何在用該綴合物接種了的動物血清中保持的，與使用VME的情況不同。這里我們可以看到一種下降的趨勢。該結(jié)果表明。如同血清群“C”腦膜炎奈瑟氏球菌的情況，該綴合物針對血清群“B”腦膜炎奈瑟氏球菌進(jìn)行防護(hù)。
附圖7評估與TT綴合的LPS的抗原性如該附圖所示，存在于用霍亂弧菌減毒株免疫的人血清中的抗體識別我們實(shí)驗(yàn)室得到的綴合物，并顯示出比由天然LPS樣品獲得的更高的吸光度值(492nm)。
附圖8評估IgG抗-霍亂弧菌-LPS抗體如該附圖所示，用獲自我們實(shí)驗(yàn)室的綴合物L(fēng)PS-TT免疫的動物血清表現(xiàn)出的吸光度值(492nm)高于由用LPS和空白對照(placebo)免疫的血清獲得的吸收值。
附圖9評估IgG抗-多糖-Vi抗體在附圖9所示結(jié)果中，我們看到，第一次劑量后我們獲得了抗-ViIgG應(yīng)答，用天然Vi多糖免疫的動物組的抗-Vi IgG應(yīng)答高于用綴合物免疫的動物組的。這些后者動物組在接受第二次劑量后，其抗體滴度在28天后上升了，直到第35天吸光度值達(dá)到最大，而用天然Vi多糖免疫的動物組在第二次劑量后未表現(xiàn)任何上升。這些結(jié)果證明了在用綴合物免疫的動物中次級免疫應(yīng)答的存在。我們還可以看到，在第56天(第二次劑量后28天)與天然Vi多糖相比，綴合物的吸光度值更高，這暗示了這一想法獲自綴合物的IgG抗體應(yīng)答比非綴合Vi多糖的更加長久。這些結(jié)果確證了已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述的東西，利用制備疫苗時(shí)所使用的綴合方法有可能改變所使用多糖的TD。
附圖10評估IgG抗-PMGC抗體(綴合物PRP-PMGC-TT)如該附圖所示，我們在評估小鼠血清中IgG抗-血清群“C”腦膜炎奈瑟氏球菌-多糖抗體的產(chǎn)生時(shí)意識到，在用綴合物免疫的動物血清中觀察到的吸光度水平高于獲自所研究的其余樣品(用PBS免疫的小鼠的血清和用血清群“C”腦膜炎奈瑟氏球菌天然多糖免疫的小鼠的血清)的吸光度值。我們還可以看到，在由綴合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中存在血清-轉(zhuǎn)變，因?yàn)楂@得的應(yīng)答比初始應(yīng)答高2倍。
附圖11評估IgG抗-PRP抗體(綴合物PRP-PMGC-TT)如該附圖所示，我們在評估所研究小鼠的血清中IgG抗-PRP抗體的產(chǎn)生時(shí)，在用綴合物免疫的動物血清中所發(fā)現(xiàn)的應(yīng)答第十四天后較高，此時(shí)它們接受第二次接種。此處在該研究我們還可以看到，存在針對B型流感嗜血桿菌免疫應(yīng)答的血清-轉(zhuǎn)變。
附圖12評估IgG抗-TT抗體(綴合物PRP-PMGC-TT)該附圖顯示了對所研究小鼠血清中所產(chǎn)生的IgG抗-TT抗體的評估。此處我們可以看到，用綴合物免疫的動物中的抗-TT應(yīng)答高，這使我們想到，綴合過程中蛋白質(zhì)未受影響并保持其免疫原性特征。
附圖13評估IgG抗-PMGC抗體亞類(綴合物PRP-PMGC-TT)如該附圖所示，在我們評估小鼠血清中IgG1抗-PMGC抗體的產(chǎn)生時(shí)，我們在用綴合物免疫的小鼠血清中獲得了非常高的吸光度值，高于用天然血清群“C”腦膜炎奈瑟氏球菌多糖免疫的動物血清樣品獲得的吸光度值。對于從IgG 2a獲得的吸光度值，盡管我們意識到有輕微的T3(對于Var I)上升，但這是非常小的，而且IgG1型應(yīng)答占主導(dǎo)。類似于前面的例子，我們可以看到，存在由綴合物誘導(dǎo)的IgG1免疫應(yīng)答的血清-轉(zhuǎn)變，因?yàn)樗@得的應(yīng)答是初始應(yīng)答的兩倍。
附圖14評估IgG抗-PRP抗體亞類(綴合物PRP-PMGC-TT)在該附圖中，在我們評估小鼠血清中的IgG1抗-“B”型流感嗜血桿菌多糖抗體時(shí)我們可以看到類似于前述出現(xiàn)過的情形，盡管對于該多糖所獲得的值稍低于用血清群“C”腦膜炎奈瑟氏球菌多糖所獲得的值，這是所預(yù)期的，因?yàn)槲覀円呀?jīng)知道血清群“C”腦膜炎奈瑟氏球菌多糖本身就比“B”型流感嗜血桿菌多糖具有更好的抗原性。然而，如該附圖所顯示，從用綴合物免疫的小鼠血清獲得的吸光度值大大高于獲自用PRP免疫的小鼠血清的吸光度值。對于對IgG 2a所得的吸光度值，盡管我們可以看到有輕微的T3上升(對于VarI)，這樣的上升時(shí)非常小的。IgG1型應(yīng)答占主導(dǎo)。如同前面的例子，我們可以推斷，對IgG1存在由綴合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的血清轉(zhuǎn)變，因?yàn)樗玫膽?yīng)答是初始應(yīng)答的兩倍。
所建議方法的優(yōu)點(diǎn)本方法中所使用的pH和溫度水平降低了多糖斷裂的可能性、以及損害抗原特性的可能。在本發(fā)明內(nèi)，我們除去了發(fā)生綴合時(shí)形成多糖的四丁基銨鹽。同樣，它防止了經(jīng)過多個(gè)階段來衍生得到它們，這使得可以以低成本短時(shí)間實(shí)施本方法。
為三價(jià)疫苗活化抗原的過程需要幾個(gè)步驟。不需要利用比如2-(6-aminocapropyl)4，9-二氧代-1，12-二氨基十二烷-萘-1，5-二磺酸鹽(ACA-DODAD-NDSA)和S-乙酰巰基丁二酸酐(SAMSA)這樣的復(fù)雜分子，或?yàn)槌ミ@些殘余試劑的中間純化步驟?？傊?，存在提高抗原產(chǎn)出、以及減少外源物質(zhì)存在于疫苗配方中的趨勢，外源物質(zhì)存在于疫苗中是不希望的。所有這些都省去了在整個(gè)過程中以及最終疫苗產(chǎn)品中的中間控制。
權(quán)利要求
1.獲得多價(jià)疫苗綴合物的方法，它包括以下步驟a.于40℃至110℃溫度下，在濃度為0.1至0.9N的堿性介質(zhì)中處理第一糖類抗原3至10小時(shí)；b.用碳二亞胺活化第一抗原的羧基基團(tuán)；c.將得自步驟(b)的抗原的活化羧基基團(tuán)與可以為蛋白質(zhì)或糖的、預(yù)先活化或未活化的第二抗原綴合；d.純化得自步驟(c)的綴合物；e.用碳二亞胺活化第三抗原蛋白質(zhì)的羧基基團(tuán)；f.將存在于步驟(d)的糖類抗原中的氨基基團(tuán)與步驟(e)中活化的蛋白質(zhì)綴合或?qū)⒋嬖谟诓襟E(a)中的糖類抗原中的氨基基團(tuán)與步驟(e)中活化的蛋白質(zhì)綴合；g.純化得自步驟(f)的綴合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于為處理第一糖類抗原的堿性基質(zhì)可以選自NaOH或KOH或LiOH。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述的第一糖類抗原含有酰胺樣鍵。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述的第一糖類抗原來自細(xì)菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于所述的第一糖類抗原可以選自奈瑟氏球菌屬、沙門氏菌屬或弧菌屬的細(xì)菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述的來自奈瑟氏球菌屬細(xì)菌的第一糖類抗原來自腦膜炎奈瑟氏球菌種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于所述的糖類抗原可選自血清群C腦膜炎奈瑟氏球菌、血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌或血清群A腦膜炎奈瑟氏球菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述的來自沙門氏菌屬的細(xì)菌的糖類抗原來自傷寒沙門氏菌種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于糖類抗原為Vi多糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述的來自弧菌屬的細(xì)菌的糖類抗原來自霍亂弧菌種。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于糖類抗原為霍亂弧菌脂多糖。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于第二抗原是蛋白質(zhì)類型，可以是蛋白質(zhì)或肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于這樣的抗原可以通過天然、重組或合成方法獲得。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征在于這樣的抗原來自病毒、真菌、植物、動物或細(xì)菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于這樣的抗原可以選自埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、弧菌屬、奈瑟氏球菌屬或梭狀芽孢桿菌屬的細(xì)菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于來自埃希氏菌屬的細(xì)菌的抗原是來自大腸埃希氏菌種。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于來自沙門氏菌屬的細(xì)菌的抗原是來自傷寒沙門氏菌種。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于來自志賀氏菌屬的細(xì)菌的抗原是來自宋內(nèi)氏志賀氏菌種。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于來自弧菌屬的細(xì)菌的抗原是來自霍亂弧菌種。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于這樣的抗原是霍亂毒素的亞單位B(CTB)。
21.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于來自奈瑟氏球菌屬的細(xì)菌的抗原是來自腦膜炎奈瑟氏球菌種。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其特征在于這樣的抗原來自血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌。
23.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于來自梭狀芽孢桿菌屬的細(xì)菌的抗原是來自破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌種。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其特征在于蛋白質(zhì)是破傷風(fēng)類毒素。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于第二抗原是來自細(xì)菌的糖類。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其特征在于糖類抗原可選自嗜血桿菌屬、奈瑟氏球菌屬或弧菌屬的細(xì)菌。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征在于來自嗜血桿菌屬的細(xì)菌的該糖類抗原來自流感嗜血桿菌種。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其特征在于這樣的抗原來自b型流感嗜血桿菌。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其特征在于糖類抗原為多核糖基核糖醇磷酸(PRP)。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于當(dāng)該第二糖類抗原是PRP時(shí)，它必須由1，8二氨基辛烷活化。
31.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征在于來自奈瑟氏球菌屬的細(xì)菌的該糖類抗原來自腦膜炎奈瑟氏球菌種。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其特征在于該糖類抗原可選自血清群C腦膜炎奈瑟氏球菌、血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌或血清群A腦膜炎奈瑟氏球菌。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其特征在于該糖類抗原可以是血清群C腦膜炎奈瑟氏球菌多糖、血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌脂多糖或血清群A腦膜炎奈瑟氏球菌多糖。
34.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征在于來自弧菌屬的細(xì)菌的該糖類抗原來自霍亂弧菌種。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其特征在于糖類抗原為霍亂弧菌脂多糖。
36.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于第三蛋白質(zhì)抗原可以通過天然、重組或合成方法獲得。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其特征在于第三蛋白質(zhì)抗原來自病毒、真菌、植物、動物或細(xì)菌。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其特征在于該蛋白質(zhì)可選自沙門氏菌屬、奈瑟氏球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬或志賀氏菌屬的細(xì)菌。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其特征在于來自沙門氏菌屬細(xì)菌的該蛋白質(zhì)是來自傷寒沙門氏菌種。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其特征在于這樣的抗原是外膜蛋白。
41.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其特征在于來自奈瑟氏球菌屬細(xì)菌的蛋白質(zhì)是來自腦膜炎奈瑟氏球菌種。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其特征在于蛋白質(zhì)來自血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其特征在于該抗原是外膜蛋白質(zhì)。
44.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其特征在于蛋白質(zhì)為由重組方法獲得的血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌的p64k。
45.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其特征在于來自梭狀芽孢桿菌屬細(xì)菌的蛋白質(zhì)是來自破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌種。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其特征在于蛋白質(zhì)是破傷風(fēng)類毒素。
47.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其特征在于來自氏志賀氏屬細(xì)菌的蛋白質(zhì)是來自宋內(nèi)氏志賀氏菌種。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其特征在于該抗原是外膜蛋白質(zhì)。
49.通過權(quán)利要求1至48所述方法獲得的多價(jià)疫苗組合物，其特征在于包括溶解于藥學(xué)安全載體中的綴合糖類。
50.權(quán)利要求49的多價(jià)疫苗組合物，其特征在于包括10至25μg的綴合糖類。
51.根據(jù)權(quán)利要求49的疫苗組合物，其特征在于所述綴合物包括血清群C腦膜炎奈瑟氏球菌多糖，其可以共價(jià)結(jié)合破傷風(fēng)類毒素、通過重組方法獲得的血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌的蛋白質(zhì)p64k或血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白。
52.根據(jù)權(quán)利要求49的疫苗組合物，其特征在于所述綴合物包括霍亂弧菌脂多糖，其可共價(jià)結(jié)合霍亂弧菌毒素的亞單位B或破傷風(fēng)類毒素。
53.根據(jù)權(quán)利要求49的疫苗組合物，其特征在于所述綴合物包括Vi多糖，其可共價(jià)結(jié)合破傷風(fēng)類毒素、來自志賀氏菌屬的蛋白質(zhì)或來自沙門氏菌屬的蛋白質(zhì)。
54.根據(jù)權(quán)利要求49的疫苗組合物，其特征在于所述綴合物可以是共價(jià)結(jié)合破傷風(fēng)類毒素的血清群A腦膜炎奈瑟氏球菌多糖或血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌脂多糖的化合物。
55.根據(jù)權(quán)利要求49的疫苗組合物，其特征在于所述綴合物包括共價(jià)結(jié)合破傷風(fēng)類毒素和多核糖基核糖醇磷酸(PRP)的血清群C腦膜炎奈瑟氏球菌多糖。
56.根據(jù)權(quán)利要求49的疫苗組合物，其特征在于所述綴合物包括共價(jià)結(jié)合來自志賀氏菌屬的蛋白質(zhì)和沙門氏菌屬蛋白質(zhì)的Vi多糖。
57.根據(jù)權(quán)利要求49的疫苗組合物，其特征在于所述綴合物包括共價(jià)結(jié)合來自志賀氏菌屬的蛋白質(zhì)和霍亂弧菌的脂多糖的Vi多糖。
58.根據(jù)權(quán)利要求49的疫苗組合物，其特征在于所述綴合物包括共價(jià)結(jié)合破傷風(fēng)類毒素和血清群A腦膜炎奈瑟氏球菌多糖的血清群C腦膜炎奈瑟氏球菌多糖。
59.根據(jù)權(quán)利要求49-58的疫苗組合物的用途，用于預(yù)防由細(xì)菌，如血清群A、B或C腦膜炎奈瑟氏球菌、傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌或破傷風(fēng)類毒素引起的疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別是涉及抗原分子的化學(xué)綴合方法。具體地本發(fā)明涉及糖類抗原的綴合方法。本發(fā)明包括在糖結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生氨基基團(tuán)，由此可以獲得具有兩個(gè)功能基團(tuán)的糖，用于將蛋白質(zhì)結(jié)合到糖上。本發(fā)明還涉及對抵御細(xì)菌性疾病有效的綴合物，它也通過本發(fā)明方法獲得。
文檔編號A61K47/48GK1738642SQ200380108779
公開日2006年2月22日 申請日期2003年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月14日
發(fā)明者O·卡布雷拉布蘭克, M·庫爾羅佩雷茲, V·G·希爾拉岡薩雷茲, C·R·索托羅德里戈茲, M·E·馬丁內(nèi)茲波佐 申請人:血清疫苗研究生產(chǎn)中心芬雷學(xué)院