專利名稱：用于藥物化合物的改進(jìn)的接頭的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的和改進(jìn)的改進(jìn)藥物化合物半衰期的方法，所述藥物化合物通過使用新的接頭以使診斷或治療部分與導(dǎo)向部分連接，或者使兩個(gè)診斷或治療部分彼此相互連接，或使一個(gè)診斷部分與一個(gè)治療部分連接而適用作診斷或治療劑。
背景技術(shù)：
藥物(例如，作為診斷成像劑、治療劑等)用來檢測和治療癌癥的用途是人們熟知的。在更近一些年，用于癌癥檢測和/或治療的定向位點(diǎn)的放射性藥物的發(fā)現(xiàn)獲得了廣泛應(yīng)用并繼續(xù)發(fā)展為更好地鑒別這類化合物的特異性、功效和實(shí)用性的醫(yī)學(xué)專業(yè)。
這些更新的放射性藥物物質(zhì)典型地由一種與金屬螯合劑連接的導(dǎo)向劑組成，所述金屬螯合劑可與診斷性金屬放射性核素例如，锝或銦，或治療性金屬放射性核素例如，镥、釔或錸螯合(例如，絡(luò)合)。金屬螯合劑的作用是結(jié)合(也就是，螯合)作為放射性藥物試劑的金屬放射性核素，使其被遞送至期望的部位。不能與金屬放射性核素強(qiáng)結(jié)合的金屬螯合劑將使放射性藥物物質(zhì)失去其期望的作用，因?yàn)榻饘俜派湫院怂貙⒁虼瞬荒艿竭_(dá)其期望的部位。因此，進(jìn)一步的研究與開發(fā)導(dǎo)致了金屬螯合劑的發(fā)現(xiàn)，例如在授予Pollak等的美國專利No.5,662,885中所報(bào)道的，由此通過參考將其并入，它表現(xiàn)出強(qiáng)的對金屬放射性核素的親和力和與導(dǎo)向劑結(jié)合的能力。隨后，使用“間隔區(qū)”以產(chǎn)生金屬螯合劑與導(dǎo)向劑之間的物理分離的概念被進(jìn)一步引入，例如在授予Pollak等的美國專利No.5,976,495中，由此通過參考將其并入。
導(dǎo)向劑的作用是通過它對某一結(jié)合位點(diǎn)有親和力的優(yōu)點(diǎn)將診斷或治療劑，例如，一種含有金屬放射性核素的放射性藥物物質(zhì)，導(dǎo)向到期望的檢測或治療的位點(diǎn)。典型地，導(dǎo)向劑可能包括一種蛋白質(zhì)，一種多肽，或者其他對特定的受體表現(xiàn)出特異親和力的大分子。其他已知的導(dǎo)向劑包括單克隆抗體(MAbs)，抗體片段(Fab和(Fab)2)，和受體親和肽。Donald J.Buchsbaum，“放射標(biāo)記抗體的癌癥治療；抗體和它的放射標(biāo)記的藥物動(dòng)力學(xué)；實(shí)驗(yàn)放射免疫治療和增強(qiáng)治療效果的方法”，CRC Press，Boca Raton，第10章，第115-140頁，(1995)；Fischman，等?！耙粡埑塑嚻笨贵w的放射性藥物學(xué)(A Ticket toRidePeptide Radiopha rmaceuticals)，”核醫(yī)學(xué)雜志(The Journa lof Nuclear Medicine)，第14卷，第12期，(1993年12月)。
在設(shè)計(jì)一種用于癌癥的診斷或治療劑的有效化合物時(shí)，藥物有合適的體內(nèi)導(dǎo)向和藥物動(dòng)力學(xué)特性是很重要的。例如，對于一種放射性藥物來說，放射標(biāo)記的多肽能被靶細(xì)胞高度特異地?cái)z取是優(yōu)選的。此外，一旦放射性核素定位在靶部位，它能夠在那兒保留一段期望的時(shí)間以便運(yùn)送高度定位的放射劑量到靶部位也是優(yōu)選的。
而且，改進(jìn)的放射標(biāo)記的多肽能被有效地從正常組織中清除，對于放射性藥物物質(zhì)來說，這也是一個(gè)重要的因素。當(dāng)被金屬放射性核素標(biāo)記(通過一種螯合的接合作用)的生物大分子(例如，MAb，F(xiàn)ab或多肽)，被應(yīng)用于一種動(dòng)物例如人時(shí)，大部分的金屬放射性核素(以某些化學(xué)形式)能在腎臟或肝臟實(shí)質(zhì)內(nèi)被俘獲(也就是，不排泄入尿和膽汁)。Duncan等；對于更小的放射標(biāo)記的生物大分子(也就是，F(xiàn)ab或多肽)，清除活動(dòng)的主要途徑是通過腎臟，腎臟也能夠保留高水平的放射性金屬(也就是，通常多于10-15％的注入劑量)。金屬放射性核素在腎臟或肝臟內(nèi)的潴留是不被期望的。
相反地，如果需要更長時(shí)間的診斷成像或者對放射治療來說需要更大的腫瘤攝取量，一種診斷或治療劑被腎臟從血流中清除太快也不是合乎需要的。放射性藥物化合物在患者體內(nèi)的潴留經(jīng)常是按照半衰期(也就是，用藥劑劑量的一半被從患者體內(nèi)清除所需要的時(shí)間)來計(jì)算的。一種半衰期更短的放射性藥物化合物與半衰期更長的放射性藥物化合物相比顯示它以更快的速度被從患者體內(nèi)清除。
一種用于改進(jìn)藥物化合物半衰期的新的和改進(jìn)的方法現(xiàn)在已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，這導(dǎo)致改進(jìn)的診斷或治療劑。
發(fā)明概述在本發(fā)明一個(gè)示范性的實(shí)施方案中，提供了一種新的和改進(jìn)的用于改進(jìn)供診斷或治療使用的藥物化合物半衰期的方法，以及表現(xiàn)出這樣一種改進(jìn)的半衰期的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷或治療劑(例如，能夠絡(luò)合醫(yī)學(xué)有用的金屬離子或放射性核素(金屬螯合劑)或光學(xué)標(biāo)記的化學(xué)部分)通過本發(fā)明的接頭或間隔區(qū)與導(dǎo)向肽連接。可選擇地，放射性鹵素通過本發(fā)明的接頭或間隔區(qū)與導(dǎo)向肽連接。
作為結(jié)果，本發(fā)明的化合物通?？删哂邢率組-N-O-P-Q其中M是診斷或治療劑，N-O-P是接頭，以及Q是導(dǎo)向部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，M可以是一種呈與金屬放射性核素絡(luò)合或未絡(luò)合形式的金屬螯合劑?？蛇x擇地，M可以是一種放射性鹵素而不是一種金屬螯合劑。
金屬螯合劑M可以是本領(lǐng)域中已知的與醫(yī)學(xué)有用的金屬離子或放射性核素絡(luò)合的金屬螯合劑中的任何一種。優(yōu)選的螯合劑包括DTPA，DOTA，DO3A，HP-DO3A，EDTA，TETA，EHPG，HBED，NOTA，DOTMA，TETMA，PDTA，TTHA，LICAM，MECAM，或者多肽螯合劑，例如，在這里討論的那些。金屬螯合劑可能與金屬放射性核素絡(luò)合也可能不絡(luò)合，并且也可能包括一個(gè)選擇性的間隔區(qū)例如單個(gè)氨基酸。優(yōu)選的用于閃爍照相術(shù)或放射治療的金屬放射性核素包括99mTc，51Cr，67Ga，68Ga，47Sc，51Cr，167Tm，141Ce，111In，168Yb，175Yb，140La，90Y，88Y，153Sm，166Ho，165Dy，166Dy，62Cu，64Cu，67Cu，97Ru，103Ru，186Re，188Re，203Pb，211Bi，212Bi，213Bi，214Bi，105Rh，109Pd，117mSn，149Pm，161Tb，177Lu，198Au和199Au。金屬的選擇將基于所期望的診斷或治療應(yīng)用來決定。例如，為了診斷的目的，優(yōu)選的放射性核素包括64Cu，67Ga，68Ga，99mTc和111In，特別優(yōu)選99mTc和111In。為了治療的目的，優(yōu)選的放射性核素包括64Cu，90Y，105Rh和90Y，111In，117mSn，149Pm，153Sm，161Tb，166Dy，166Ho，175Yb，177Lu，186/188Re，和199Au，特別優(yōu)選177Lu，90Y，186Re和188Re。用于本發(fā)明化合物中的最優(yōu)選的螯合劑是1-取代的4，7，10-三羧甲基-1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷三乙酸(DO3A)。
M是一種放射性鹵素時(shí)，優(yōu)選的放射性核素例如18F，124I，125I，131I，123I，77Br，和76Br也可以被使用。
M是一種診斷部分時(shí)，優(yōu)選的診斷部分包括，例如，使能夠通過如x-射線，磁共振成像，超聲，熒光和其它光學(xué)成像方法技術(shù)來檢測化合物的物質(zhì)。特別優(yōu)選的診斷部分是一種光標(biāo)記。
M是一種治療部分時(shí)，優(yōu)選的本發(fā)明化合物可結(jié)合，例如，治療部分比如抗生素，激素，酶，抗體，生長因子，等。
接頭N-O-P包括至少一種取代的膽汁酸。
導(dǎo)向肽Q是對特殊位點(diǎn)有結(jié)合親和力的任何肽，或其等同物，衍生物或者類似物。導(dǎo)向肽可以是與目的受體或酶結(jié)合的肽。例如，導(dǎo)向肽Q可以是LHRH(促黃體生成激素釋放激素)、胰島素、催產(chǎn)素，促生長素抑制素，NK-1(神經(jīng)激肽-1)，VIP(血管活性腸多肽)，GRP(胃泌激素釋放多肽)，鈴蟾肽或者本領(lǐng)域中已知的其它任意激素肽，以及它們的類似物和衍生物。
在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，一種診斷或治療劑通過本發(fā)明的接頭或間隔區(qū)與診斷或治療劑連接。這個(gè)實(shí)施方案的化合物通?？删哂邢率組-N-O-P-M其中M是如上面所定義的診斷或治療劑，并且N-O-P是如上所定義的接頭。
還提供一種新的使用本發(fā)明的化合物成像的方法。
進(jìn)一步提供一種新的制備診斷成像劑的方法，包括在一種可注射
PGlu-His-Trp-W-Tyr-DLys-X-Y-Pro-Z，其中W＝Ser、NMeSer或Thr；X＝Leu、NMeLeu、叔丁基Gly；Y＝Arg、Arg(Et2)、Cit、Lys(異丙基)；以及Z＝Gly-NH2、NHEthyl、氮雜Gly-NH2。
33.如下通式的化合物Glu-His-Trp-W-Tyr-DLys(M-N-O-P)-X-Y-Pro-Z，其中M是螯合劑；N是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；O是α氨基酸或取代的膽汁酸；以及P是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)，W＝Ser、NMeSer或Thr；X＝Leu、NMeLeu、叔丁基Gly；Y＝Arg、Arg(Et2)、Cit、Lys(異丙基)；以及Z＝Gly-NH2、NHEthyl、氮雜Gly-NH2，其中N、O或P的至少一個(gè)是取代的膽汁氨基酸。
34.權(quán)利要求31的化合物，其中M是DOTA-Gly。
35.權(quán)利要求30或31的化合物，其中所述取代的膽汁酸選自由下列物質(zhì)組成的組(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸；(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸；(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸；賴氨酸-(3，6，9)-三氧雜十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脫氧-3-氨基膽酸)；(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基-12-氧代膽烷-24-酸；以及(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基膽烷-24-酸。
36.權(quán)利要求24的化合物，其中至少一個(gè)M是胰島素或其類似物或衍生物。氨基]-膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-L-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺(L62)合成的連續(xù)反應(yīng)的圖示；圖7A是如在實(shí)施例IX中描述的中間體(3β，5β)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-12-氧代膽烷-24-酸(C)合成的一系列化學(xué)反應(yīng)的圖示；圖7B是如在實(shí)施例IX中描述的N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]-12，24-二氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺(L67)合成的連續(xù)反應(yīng)的圖示；圖7C是如在實(shí)施例IX中描述的(3β，5β)-3-氨基-12-氧代膽烷-24-酸(B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖7D是如在實(shí)施例IX中描述的(3β，5β)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-12-氧代膽烷-24-酸(C)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖7E是如在實(shí)施例IX中描述的N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]-12，24-二氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺(L67)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖8A是如在實(shí)施例X中描述的獲得中間體(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸(3b)的反應(yīng)順序的圖示；圖8B是如在實(shí)施例X中描述的N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]-12-羥基-24-氧代膽烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺(L63)；N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺(L64)；以及N-[(3β，5β)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]-12，24-二氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺(L67)合成的連續(xù)反應(yīng)的的圖示；圖8C是如在實(shí)施例X中描述的N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺(64)合成的連續(xù)反應(yīng)的的圖示；圖8D是如在實(shí)施例X中描述的(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸(2b)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖8E是如在實(shí)施例X中描述的(3β，5β，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-12-羥基膽烷-24-酸(3a)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖8F是如在實(shí)施例X中描述的(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸(3b)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖8G是如在實(shí)施例X中描述的N-[(3β，5β，12αα)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]-12-羥基-24-氧代膽烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺(L63)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖8H是如在實(shí)施例X中描述的N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺(L64)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖9是DO 3A-單酰胺-Gly-Lys-(3，6，9-三氧雜十一烷1，11-二羧酸-3，7-二脫氧-3-氨基膽酸)-L-精氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺(L65)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；

圖10A是N-[2-S-[[[[[12α-羥基-17β-(1-甲基-3-羧丙基)本膽烷-3β-氨基甲?；籽趸已趸已趸阴；鵠-氨基-6[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]-己酰-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺(L66)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖10B是N-[(3β，5β，7α，12α)-3-[[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1基]乙酰基]氨基]乙氧乙氧基]乙?；鵠氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺(L69)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖11A是如在實(shí)施例XV中描述的用Gd-L64的HAS的結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的圖示；圖11B是如在實(shí)施例XV中描述的用Gd-L64的HAS的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖示；圖12A是如在實(shí)施例XVII中描述的放射治療結(jié)果的圖示；圖12B是如在實(shí)施例XVII中描述的其它放射治療結(jié)果的圖示；圖13A是如在實(shí)施例XX中描述的(3β，5β，7α，12α)-3-(9H-芴-9基甲氧基)氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸(B)合成的反應(yīng)圖示；圖13B是如在實(shí)施例XX中描述的N-[(3β，5β，7α，12α)-3-[[[2-[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺)合成的反應(yīng)圖示。
發(fā)明的詳細(xì)說明在下列說明中，本發(fā)明的各個(gè)方面將被進(jìn)一步詳細(xì)闡述。為了解釋的目的，特定的結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié)將被闡明以便提供本發(fā)明的一個(gè)全面的了解。然而，沒有具體的細(xì)節(jié)可以實(shí)施本發(fā)明，這對本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說也是明顯的。而且，很熟知的特性可能被省略或被簡化以便不把本發(fā)明搞混。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種改進(jìn)用于診斷或治療的藥物化合物的半衰期的新的和改進(jìn)的方法，以及表現(xiàn)出這樣一種改進(jìn)的半衰期的化合物。在這些實(shí)施方案中，一種診斷或治療劑(例如一種金屬螯合劑，一種放射性鹵素，或一種光學(xué)標(biāo)記)通過本發(fā)明的接頭或間隔區(qū)與導(dǎo)向肽連接。
一般地，本發(fā)明的化合物包括下式的化合物M-N-O-P-Q其中M是診斷或治療劑，N-O-P是接頭，以及Q是導(dǎo)向部分。正如下面更詳細(xì)的解釋，M和Q可能被連接在接頭的任一端(例如在本發(fā)明的膽酸衍生物的氨基或羧酸基)或者M(jìn)和Q可能都與接頭的同一端連接(例如都與本發(fā)明的膽酸衍生物接頭的氨基或都與其羧酸基)。
在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，一種診斷或治療劑通過本發(fā)明的接頭或間隔區(qū)與第二種診斷或治療劑連接。這個(gè)實(shí)施方案的化合物通?？删哂邢率組-N-O-P-M其中M是如上面定義的診斷或治療劑，N-O-P是如上面定義的接頭。正如下面更詳細(xì)的解釋，每一個(gè)M可能被連接在接頭的任一端(例如在本發(fā)明的膽酸衍生物接頭的氨基或羧酸基)或者兩個(gè)M可能都與接頭的同一端連接(例如都與本發(fā)明的膽酸衍生物接頭的氨基或羧酸基)。
在下面的討論中將描述每個(gè)診斷或治療劑、接頭和導(dǎo)向部分。當(dāng)M是金屬螯合劑時(shí)，它可以是呈絡(luò)與金屬放射性核素合或者不絡(luò)合的形式?？蛇x擇地，M可以是一種放射性鹵素而不是一種金屬螯合劑。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，M是一種光學(xué)標(biāo)記(例如一種能被光成像，視聲學(xué)成像或者光致發(fā)光可檢測的或者在光線治療中有用的光標(biāo)記或其他標(biāo)記)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種新的和改進(jìn)的接頭或間隔區(qū)，該接頭或間隔區(qū)當(dāng)用來使診斷或治療劑與導(dǎo)向部分連接或者使一個(gè)診斷或治療劑與第二個(gè)診斷或治療劑相連接時(shí)，能夠改進(jìn)藥物化合物的半衰期。一般地，本發(fā)明的接頭可具有下式N-O-P在這里，N，O和P的每一個(gè)被定義在整個(gè)說明書中。
符合這些標(biāo)準(zhǔn)的化合物與本領(lǐng)域中已知的其它放射標(biāo)記的復(fù)合多肽相比有改進(jìn)的藥物動(dòng)力學(xué)特性。例如，用本發(fā)明的接頭制備的化合物顯示能夠在血流中更長時(shí)間地保留(與結(jié)合人血清白蛋白(HSA)一致))，因此將比以前已知的化合物有更長的半衰期。更長的半衰期在醫(yī)學(xué)上是有益處的，因?yàn)樗试S更長的診斷成像時(shí)間，或者對于治療的用處來說，它允許更長時(shí)間地暴露于導(dǎo)向細(xì)胞以便進(jìn)行放射治療。
1A.金屬螯合劑術(shù)語“金屬螯合劑”表示與金屬原子形成絡(luò)合物的分子，其中所說的絡(luò)合物在生理狀態(tài)下是穩(wěn)定的。也就是，金屬在體內(nèi)將保持與螯合劑骨架絡(luò)合。更特別地，金屬螯合劑是一種與放射性核素金屬絡(luò)合從而形成一種金屬絡(luò)合物的分子，這種金屬絡(luò)合物在生理狀態(tài)下是穩(wěn)定的，而且也有至少一個(gè)與接頭N-O-P結(jié)合的反應(yīng)官能團(tuán)。金屬螯合劑M可以是本領(lǐng)域中已知的絡(luò)合醫(yī)學(xué)上有用的金屬離子或放射性核素的任何一種金屬螯合劑。金屬螯合劑可能與，也可能不與金屬放射性核素絡(luò)合。而且，金屬螯合劑能包括一個(gè)可選擇的間隔區(qū)，例如，不與金屬絡(luò)合，但是能夠在金屬螯合劑和接頭之間產(chǎn)生物理性隔開的單個(gè)氨基酸(例如，Gly)。
本發(fā)明的金屬螯合劑可以包括，例如，線性的，大環(huán)的，三聯(lián)吡啶和N3S，N2S2，或N4螯合劑(也見，U.S.5,367,080，U.S.5,364,613，U.S.5,021,556，U.S.5，075099，U.S.5,886,142，通過參考將它們的公開內(nèi)容以其整體并入本申請)，以及本領(lǐng)域中已知的其他螯合劑，它包括，但不限于，HYNIC，DTPA，EDTA，DOTA，TETA，和雙氨基雙硫羥(BAT)螯合劑(也見U.S.5,720,934)。例如，N4螯合劑被描述在美國專利號(hào)6,143,274；6,093,382；5,608,110；5,656,329；5,656,254；和5,688,487中，通過參考將它們的公開內(nèi)容以其整體并入本申請。某些N3S螯合劑被描述在PCT/CA94/00395，PCT/CA94/00497，PCT/CA95/00249和美國專利號(hào)5,662,885；5,976,495；以及5,780,006中，通過參考將它們的公開內(nèi)容以其整體并入本申請。螯合劑也可以包括螯合配體巰基-乙酰基-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸(MAG3)的衍生物，它包括一個(gè)N3S和N2S2系統(tǒng)例如MAMA(單酰胺單胺二硫酚)，DADS(N2S二胺二硫酚)，CODADS等。在Liu和Edwards，ChemRev.1999，99，2235-2268及其中的參考文獻(xiàn)中描述了這些配體系統(tǒng)和一系列其它的配體系統(tǒng)，通過參考將它們的公開內(nèi)容以其全部并入本申請。
金屬螯合劑也可以包括含有配體原子的絡(luò)合物，這些配體原子在四配位基數(shù)組中不被供給金屬。這些包括锝和錸二肟的烴基代硼酸加合物，例如那些在美國專利號(hào)5,183,653；5,387,409；和5,118,797中被描述的，通過參考將它們的公開內(nèi)容以其全部并入本申請。
優(yōu)選的螯合劑的例子包括，但不限于，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、1-取代的1，4，7，-三羧甲基1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷三乙酸(D03A)、乙二胺四乙酸(EDTA和1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)。另外的螯合配體是亞乙基雙-(2-羥基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物，包括5-C1-EHPG、5-Br-EHPG、5-Me-EHPG、5-t-Bu-EHPG和5-sec-Bu-EHPG；苯并二亞乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、芐基-DTPA和二芐基DTPA；雙-2(羥基芐基)-亞乙基-二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；大環(huán)化合物類含有至少3個(gè)碳原子，更優(yōu)選至少6個(gè)和至少兩個(gè)雜原子(O和/或N)，該大環(huán)化合物可由一個(gè)環(huán)或在雜環(huán)元素處連接在一起的兩個(gè)或三個(gè)環(huán)組成，例如苯并-DOTA、二苯并-DOTA和苯并-NOTA，其中NOTA是1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷N，N’，N”-三乙酸、苯并-TETA、苯并-DOTMA，其中DOTMA是1，4，7，10-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，7，10-四(甲基四乙酸)，以及苯并-TETMA，其中TETMA是1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，8，11-(甲基四乙酸)；1，3-亞丙基二胺四乙酸(PDTA)和三亞乙基四胺六乙酸(TTHA)的衍生物；1，5，10-N，N’，N"-三(2，3-二羥基苯甲酰基)-三兒荼酚酸酯(tricatecholate，LICAM)和1，3，5-N，N′，N″-三(2，3-二羥基苯甲?；?氨甲基苯(MECAM)的衍生物。本發(fā)明考慮到的代表性螯合劑和螯合基團(tuán)的例子被描述在WO 98/18496，WO86/06605，WO 91/03200，WO 95/28179，WO 96/23526，WO 97/36619，PCT/US98/01473，PCT/US98/20182，以及U.S.4,899,755，U.S.5,474,756，U.S.5,846,519，U.S.6,143,274，共未決的申請U.S.S.N[律師立檔號(hào)057637/01021，名稱為“適用作金屬螯合劑的新化合物”，在或接近本申請的同一天提交，]，通過參考將它們的每一篇以其整體并入本申請。
特別優(yōu)選的金屬螯合劑包括式1、2和3的那些(例如111銦和放射性鑭系元素，例如，177Lu，90Y，152Sm和166Ho)和下述式4、5和6的那些(例如放射性99mTc，186Re和188Re)。這些和其它螯合基團(tuán)被描述在美國專利號(hào)6,093,382和5，608110中，通過參考將它們以其整體并入本申請。另外，例如美國專利號(hào)6,143,274中描述了式3的螯合基團(tuán)；例如美國專利號(hào)5,627,286和6,093,382中描述了式5的螯合基團(tuán)；以及例如美國專利號(hào)5,662,885、5,780,006；和5,976,495中描述了式6的螯合基團(tuán)。式6的特異性金屬螯劑包括N，N-二甲基-Gly-Ser-Cys；N，N-二甲基-Gly-Thr-Cys；N，N-二乙基-Gly-Ser-Cys；N，N-二芐基-Gly-Ser-Cys；以及它們的其它變體。例如，不實(shí)際上與金屬放射性核素絡(luò)合的間隔區(qū)例如額外的單個(gè)氨基酸Gly，可與這些金屬螯劑(例如N，N-二甲基-Gly-Ser-Cys-Gly；N，N-二甲基-Gly-Thr-Cys-Gly；N，N-二乙基-Gly-Ser-Cys-Gly；N，N-二芐基-Gly-Ser-Cys-Gly)連接。其它有用的金屬螯劑例如在美國專利號(hào)6,334,996中公開的那些的全部，通過參考也將其并入本申請(例如二甲基-Gly-L-叔丁基-Gly-L-Cys-Gly；二甲基-Gly-D-叔丁基-Gly-L-Cys-Gly；二甲基-Gly-L-叔丁基-Gly-L-Cys等)。
此外，硫保護(hù)基團(tuán)例如Acm(乙酰氨基甲基)、三甲苯基或其它已知的烷基、芳基、?；?、烷?；?、芳?；?、巰?；?、以及有機(jī)硫羥基可以與這些金屬螯合劑的半胱氨酸氨基酸連接。
此外，其它有用的金屬螯合劑包括
在上述式1和2中，R是烷基，優(yōu)選甲基。在上述式5a和5b中，X是CH2或O；Y是C1-C10支鏈或無支鏈的烷基；芳基、芳氧基、芳氨基、芳氨酰基；芳烷基-其中與芳基連接的烷基是C1-C10支鏈或無支鏈的烷基、C1-C10支鏈或無支鏈的羥基或多羥基烷基或多烷氧基烷基或多羥基多烷氧基烷基，J是任選的，但如果存在它是C(＝O)-、OC(＝O)-、SO2-、NC(＝O)-、NC(＝S)-、N(Y)、NC(＝NCH3)-、NC(＝NH)-、N＝N-、由合成或天然存在的氨基酸衍生的均聚酰胺或雜多胺；全部情況下n為1-100。例如在美國專利號(hào)6,093,382中描述了這些結(jié)構(gòu)的其它變體。在式6中，基團(tuán)S-NHCOCH3可以被SH或S-Z取代，其中Z是任何已知的硫保護(hù)基團(tuán)，例如上面描述的那些。式7說明了適用作金屬螯合劑的叔丁基化合物的一個(gè)實(shí)施方案。通過參考將前述專利、申請和參考文獻(xiàn)的每一篇以它們的整體并入本申請。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，金屬螯合劑包括環(huán)狀或無環(huán)多氨基羧酸例如DOTA(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸)、DTPA(二亞乙基三胺五乙酸)、DTPA-雙甲基酰胺、DTPA-雙嗎啉酰胺、D03AN-[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷-1基]乙?；P-D03A、D03A-單酰胺和它們的衍生物。
優(yōu)選的用于閃爍照相術(shù)或放射治療的金屬放射性核素包括99mTc，51Cr，67Ga，68Ga，47Sc，51Cr，167Tm，141Ce，111In，168Yb，175Yb，140La，90Y，88Y，153Sm，166Ho，165Dy，166Dy，62Cu，64Cu，67Cu，97Ru，103Ru，186Re，188Re，203Pb，211Bi，212Bi，213Bi，214Bi，105Rh，109Pd，117mSn，149Pm，161Tb，140La，177Lu，198Au，和199Au和它的氧化物或氮化物。金屬的選擇將根據(jù)希望的診斷或治療應(yīng)用來決定。例如，為了診斷的目的(例如，在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中診斷和監(jiān)測治療的進(jìn)展)，優(yōu)選的放射性核素包括64Cu，67Ga，68Ga，99mTG和111In，其中99mTc和111In是特別優(yōu)選的。為了治療的目的(例如，為原發(fā)腫瘤和前列腺癌，乳腺癌，肺癌等相關(guān)的轉(zhuǎn)移瘤提供放射治療)，優(yōu)選的放射性核素包括64Cu，90Y，105Rh，111In，117mSh，149Pm，153Sm，161Tb，166Dy，166Ho，175Yb，177Lu，186Re，188Re，和199Au，其中177Lu，90Y，186Re，和188Re是特別優(yōu)選的。99mTc是特別有用和優(yōu)選的診斷放射性核素，因?yàn)樗牡唾M(fèi)用，易得到，成像特性，和高特異活性。99mTc的核和放射性特性使這種同位素成為一種理想的閃爍照相成像的試劑。這種同位素有一種140keV的單光子能量和大約6小時(shí)的放射性半衰期，它從99Mo-99mTc的發(fā)生器中容易得到。例如，99mTc標(biāo)記的多肽能被用來在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中診斷和監(jiān)測治療的進(jìn)展。177Lu，90Y或其它治療的放射性核素標(biāo)記的多肽能被用來為原發(fā)腫瘤和前列腺癌，乳腺癌，肺癌等相關(guān)的轉(zhuǎn)移瘤提供放射治療。
1B.放射性鹵素在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物能通過使用放射性核素的鹵化進(jìn)行標(biāo)記，例如18F，124I，125I，131I，123I，77Br，和76Br而不是使用一種金屬螯合劑來連接金屬放射性核素。金屬或鹵素放射性核素的選擇將根據(jù)希望的治療或診斷應(yīng)用來決定。
2A.其它診斷部分在可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可以結(jié)合其它的診斷部分，例如能夠通過象x-射線，磁共振成像，超聲，熒光和其它光學(xué)成像方法之類技術(shù)來檢測化合物的物質(zhì)，如下面更詳細(xì)描述的那樣。診斷部分的選擇將根據(jù)希望的應(yīng)用來決定。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可以結(jié)合光標(biāo)記，例如光學(xué)染料，其包括有機(jī)發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)，有廣泛的不局限的環(huán)系統(tǒng)以及在400-1500nm的范圍內(nèi)有最大的吸收和發(fā)射。本發(fā)明的化合物可以選擇地用生物發(fā)光分子被衍生化。光標(biāo)記的優(yōu)選最大吸收范圍是在600和1000nm之間以使來自血紅蛋白的信號(hào)的干擾最小化。優(yōu)選地，光吸收標(biāo)記有大的摩爾吸附性，例如，＞105cm-1M-1，而熒光光學(xué)染料將有高的量子產(chǎn)量。光學(xué)染料的例子包括，但不限于被描述在WO 98/18497，WO 98/18496，WO 98/18495，WO98/18498，WO 98/53857，WO 96/17628，WO 97/18841，WO 96/23524，WO 98/47538中的那些，在這里引為參考。例如，光標(biāo)記可以共價(jià)地直接連接至本發(fā)明的化合物，例如，包括本發(fā)明的導(dǎo)向肽或診斷或治療部分和接頭的化合物。由于它們的生物相容性，高摩爾吸附性，和/或高熒光量子產(chǎn)量，幾種在電磁光譜的可見和近紅外線區(qū)內(nèi)吸收和發(fā)射光的染料正在被用于多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。與作為造影劑的染料結(jié)合的光學(xué)形態(tài)的高靈敏度可以與核醫(yī)學(xué)的高靈敏度相平行，并允許器官和組織可見化，沒有電離輻射的不希望的影響。在近紅外線區(qū)(NIR)有強(qiáng)烈吸收和發(fā)射的花菁染料是特別有用的，因?yàn)樯锝M織在這個(gè)區(qū)是光學(xué)透明的。例如，在NIR區(qū)有吸收和發(fā)射的靛花菁(indocyanine)綠已經(jīng)被用來監(jiān)測心臟的輸出量，肝功能，和肝血流，它的功能化衍生物已經(jīng)被用來結(jié)合生物分子用于診斷目的(R.B.Mujumdar，L.A.Ernst，S.R.Mujumdar，等，Cyanine dye labeling reagentsSulfoindocyanine succinimidyl esters.Bioconjugate Chemistry，1993，4(2)，105-111；Linda G.Lee和Sam L.Woo.“N-Heteroaromatic ion and iminium ion substituted cyanine dyesfor use as fluorescent labels”，美國專利號(hào)5,453,505；EricHohenschuh，等。“Light imaging Contrast agents“，WO98/48846；Jonathan Turner，等?！癘ptical diagnostic agents for thediagnosis of neurodegenerative diseases by means of nearinfer-red radiation”，WO 98/22146；Kai Licha，等?！癐n-vivodiagnostic process by near infrared radia tion”，WO 96/17628；Robert A.Snow，等，Compounds，WO 98/48838。多種成像技術(shù)和試劑被描述在美國專利6,663,847、6,656,451、6,641,798、6,485,704、6,423,547、6,395,257、6,280,703、6,277,841、6,264,920、6,246,919、6,228,344、6,217,848、6,190,641、6,183,726、6,180,087、6,180,086、6,180,085、6,013,023和公開的美國專利申請2003185756、20031656432、2003158127、2003152577、2003143159、2003105300、2003105299、2003072763、2003036538、20030316237、2003017164、2002169107、2002164287和2002156117中。
2B.其它治療部分在可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可結(jié)合其它治療部分比如抗生素，激素，酶，抗體，生長因子，如下面更詳細(xì)描述的那樣?？蛇x擇地，本發(fā)明的化合物可與一個(gè)治療部分結(jié)合應(yīng)用。治療部分的選擇將根據(jù)希望的應(yīng)用來決定。合適的治療部分包括，但不限于抗腫瘤劑，比如鉑化合物(例如螺鉑、順鉑和卡鉑)，甲氨蝶呤，阿霉素，絲裂霉素，美坦西醇，博來霉素，胞嘧啶，阿糖胞苷，阿糖腺苷，巰基多聚賴氨酸，長春新堿，白消胺，苯丁酸氮芥，抗瘤氨酸(例如，苯丙氨酸氮芥、a、美法倫或苯丙氨酸氮芥)，巰基嘌呤，米托坦，鹽酸丙卡巴肼，放線菌素D，鹽酸柔紅霉素，鹽酸多柔比星，紫杉醇，絲裂霉素，普卡霉素(光輝霉素)，氨魯米特，雌莫司汀磷酸酯鈉，氟他氨，醋酸亮丙瑞林，醋酸甲地孕酮，枸櫞酸他莫昔芬，睪內(nèi)酯，曲洛司坦，安吖啶(m-AMSA)，天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)歐文菌屬天冬酰胺酶(Erwina aparaginase)，依托泊甙(VP-16)，干擾素a-2a，干擾素a-2b，替尼泊甙(VM-26)，硫酸長春堿(VLB)，和阿拉伯糖基(arabinosyl)；血產(chǎn)品例如腸胃外的鐵，氯高鐵血紅素，血卟啉和它們的衍生物；生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑例如胞壁酰二肽，胞壁酰三肽；微生物細(xì)胞壁成分；淋巴因子(例如細(xì)菌內(nèi)毒素例如脂多糖，巨噬細(xì)胞激活因子)；細(xì)菌的亞單位(例如分枝桿菌，棒狀菌)；合成的二肽N-乙酰-胞壁酰-1-丙氨酰-I)-異谷酰胺；抗真菌劑例如酮康唑，制霉菌素，灰黃霉素，5-氟胞嘧啶(5-fc)，咪康唑，兩性霉素B，蓖麻毒蛋白，和β-內(nèi)酰胺抗生素(例如，磺胺澤辛)；激素例如生長激素，促黑素細(xì)胞激素，雌二醇，丙酸倍氯米松，二丙酸倍氯松，倍他米松，醋酸倍他米松和倍他米松磷酸酯鈉，vetamethsone disodiumphosphate，vetemthsone sodium phosphate，醋酸可的松，地塞米松，醋酸地塞米松，地塞米松磷酸鈉，氟尼縮松，皮質(zhì)醇(氫化可的松)，醋酸氫化可的松，環(huán)戊丙酸氫化可的松，氫可松磷酯鈉，氫化可的松琥珀酸鈉，甲潑尼龍，醋酸甲強(qiáng)龍，甲基強(qiáng)的松龍琥珀酸鈉，醋酸帕拉米松(對氟米松)，潑尼松龍，醋酸潑尼松龍，潑尼松龍磷酸鈉，強(qiáng)的松龍叔丁乙酯，潑尼松，曲安西龍，曲安奈德，雙乙酸曲安西龍，己曲安奈德和醋酸氟氫可的松；維生素例如維生素B12neinoic acid，視黃醛和衍生物例如維生素A棕櫚酸酯，和α-生育酚；酶例如錳超氧化物歧化酶或堿性磷酸酶；抗過敏劑例如amelexanox；抗凝劑例如苯丙香豆素和肝素；循環(huán)藥物例如普萘洛爾；代謝強(qiáng)化因子例如谷胱甘肽；抗結(jié)核藥例如對-氨基水楊酸，異煙肼，硫酸卷曲霉素cycloscrine，鹽酸乙胺丁醇乙硫異煙胺，吡嗪酰胺，利福平，和硫酸鏈霉素；抗病毒藥例如阿昔洛韋(無環(huán)鳥苷)，金剛烷胺疊氮胸苷(AZT或齊多夫定)，利巴韋林和阿糖腺苷一水化物(阿糖腺苷，ara-A)；抗心絞痛例如硫氮卓酮，硝苯地平，維拉帕米，丁四硝酯，硝酸異山梨酯，硝酸甘油(甘油三硝酸酯)和季戊四醇四硝酸酯；抗生素，抗炎藥物例如二氟苯水楊酸，布洛芬，吲哚美辛，甲氯芬那酸，甲芬那酸，甲氧奈普酸，羥基保泰松，保泰松，吡羅昔康(康吡氧噻嗪)，舒林酸，托美丁，阿司匹林和水楊酸酯；抗寄生蟲藥物例如氯喹，羥氯喹，甲硝唑，奎寧和銻酸葡胺；抗風(fēng)濕劑例如青霉胺；麻醉劑例如阿片樟腦酊；阿片制劑例如可待因，海洛因，美沙酮(非那酮)，嗎啡和阿片；強(qiáng)心甙例如去乙酰毛花甙，洋地黃毒苷，地高辛，洋地黃甙和洋地黃；神經(jīng)肌肉的阻滯劑例如阿曲庫銨甲磺酸鹽，加拉碘銨，溴化己芴銨，碘甲箭毒，泮庫溴銨，氯琥珀膽堿，氯化簡箭毒堿和維庫溴銨；鎮(zhèn)靜劑(催眠藥)例如異戊巴比妥，異戊巴比妥鈉，阿普比妥，仲丁巴比妥鈉，水合氯醛，乙氯叔醇，炔己蟻胺，鹽酸氟安定，格魯米特，鹽酸甲氧異丁嗪，甲乙哌酮，咪達(dá)唑侖鹽酸鹽，三聚乙醛，戊巴比妥，戊巴比妥鈉，苯巴比妥鈉，司可巴比妥鈉，他布比妥，替馬西泮和三唑侖；局部麻醉劑例如布比卡因鹽酸鹽，氯普魯卡因鹽酸鹽，鹽酸依替卡因，鹽酸利多卡因，甲哌卡因鹽酸鹽，鹽酸普魯卡因和丁卡因鹽酸鹽；以及全身麻醉劑例如氟哌利多，依托咪酯，含有氟哌利多的枸櫞酸芬太尼，鹽酸氯胺酮，甲己炔巴比妥鈉和硫噴妥鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，這個(gè)治療部分可以是單克隆抗體，例如能夠結(jié)合黑色素瘤抗原的單克隆抗體。
3.含有至少一種取代的膽汁酸的接頭在本發(fā)明的一個(gè)示范性的實(shí)施方案中，接頭N-O-P含有至少一種取代的膽汁酸。因此，在接頭N-O-P的這種實(shí)施方案中，N是0(其中0意思是指它不存在)、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；O是α氨基酸或取代的膽汁酸；以及P是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)，其中N、O或P中的至少一個(gè)是取代的膽汁酸。
在本領(lǐng)域中α氨基酸是熟知的并且包括天然存在的和合成的氨基酸。
膽汁酸存在于膽汁中(肝臟的一種分泌物)并且是具有羥基和終止于羧基的5個(gè)碳原子側(cè)鏈的類固醇。在取代的膽汁酸中，至少一個(gè)原子例如膽汁酸的氫原子被另一個(gè)原子、分子或化學(xué)基團(tuán)取代。例如，取代的膽汁酸包括具有3-氨基、24-羧基官能的那些，所述官能在7和12位任選被氫、羥基或酮基官能度取代。
在本發(fā)明中其它適用的取代的膽汁酸包括取代的膽酸及其衍生物。具體的取代膽酸衍生物包括(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸；
(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸；(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸；賴氨酸-(3，6，9)-三氧雜十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脫氧-3-氨基膽酸)；(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基-12-氧代膽烷-24-酸；以及(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基膽烷-24-酸。
3A.其它連接基團(tuán)可在接頭N-O-P中使用的其它連接基團(tuán)包括這樣的化學(xué)基團(tuán)，該化學(xué)基團(tuán)起使診斷部分或治療部分偶聯(lián)至導(dǎo)向肽或其它診斷部分或治療部分的作用，但對導(dǎo)向肽的導(dǎo)向功能或診斷或治療部分的診斷或治療功能無不利影響。適合的其它連接基團(tuán)包括單獨(dú)的肽(即連接在一起的氨基酸)、非肽基團(tuán)(例如烴鏈)或氨基酸序列與非肽間隔區(qū)的組合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于接頭N-O-P中的其它連接基團(tuán)包括L-谷氨酰胺和烴鏈，或它們的組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于接頭N-O-P中的其它連接基團(tuán)包括由一系列氨基酸(例如，雙甘氨酸、三甘氨酸、gly-gly-glu、gly-ser-gly等)組成的純肽連接基團(tuán)。
在還另一個(gè)實(shí)施方案中，用于接頭N-O-P中的其它連接基團(tuán)還可包括烴鏈[即，R1-(CH2)n-R2]，其中n是0-10，優(yōu)選n＝3至9，R1是可被用作共價(jià)連接配體骨架或預(yù)先形成的金屬螯合劑或金屬絡(luò)合骨架或診斷部分或治療部分的位點(diǎn)的基團(tuán)(例如，H2N-，HS-，-COOH)；以及R2是被用于共價(jià)偶聯(lián)至給定的導(dǎo)向肽的N-末端NH2基的基團(tuán)(例如，R2是激活的COOH基)或其它診斷部分或治療部分。用于使配體(即，螯合劑)或螯合物(與放射性核素絡(luò)合的螯合劑/配體)與生物分子(例如導(dǎo)向肽)共軛的多種化學(xué)方法已被很好地描述在文獻(xiàn)[Wilbur，1992；Parker，1990；Hermanson，1996；Frizberg等，1995]中。這些方法的一種或多種可被用于使未絡(luò)合的配體(螯合劑)或放射性金屬螯合物或其它診斷部分或治療部分連接至接頭或使接頭連接至導(dǎo)向肽或其它診斷部分或治療部分。這些方法包括酸酐、醛、異硫氰酸芳基酯、激活的酯或N-羥基琥珀亞酰胺的形成[Wilbur，1992；Parker，1990；Hermanson，1996；Frizberg等，1995]。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于接頭N-O-P中的其它連接基團(tuán)可由具有如下描述的親電體或親核體的接頭前體形成。
LP1在接頭的至少兩個(gè)部位上具有相同的親電體E1或親核體Nu1的接頭前體；LP2具有親電體E1和在接頭的另一個(gè)部位上具有不同的親電體E2的接頭前體；LP3具有親核體Nu1和在接頭的另一個(gè)部位上具有不同的親核體Nu2的接頭前體；或者LP4具有用親電體E1功能化的一端和有親核體Nu1的另一端的接頭前體。
優(yōu)選的親核體Nu1/Nu2包括-OH、-NH、-NR、-SH、-HN-NH2、-RN-NH2和-RN-NHR’，其中R’和R獨(dú)立地選自上面給出的R的定義，但R’不是H。
優(yōu)選的親電體E1/E2包括-COOH、-CH＝O(醛)、-CR＝OR’(酮)、-RN-C＝S、-RN-C＝O、-S-S-2-吡啶基、-SO2-Y、-CH2C(＝0)Y、和 其中Y可被選自下列基團(tuán)
4.導(dǎo)向部分導(dǎo)向部分(即式M-N-O-P-Q中的Q)是對特定位點(diǎn)或特定代謝官能具有結(jié)合親和性的任何分子。導(dǎo)向部分將本發(fā)明的化合物引向至合適的位點(diǎn)，或使化合物參與到反應(yīng)中，其中所需要的診斷或治療活性將發(fā)揮。在一個(gè)示范性的實(shí)施方案中，導(dǎo)向部分可以是肽、其等同物、衍生物或類似物，其起與特定位點(diǎn)結(jié)合的配體的作用。在另一個(gè)示范性的實(shí)施方案中，導(dǎo)向部分可以是酶、或與酶結(jié)合的分子。在另一個(gè)示范性的實(shí)施方案中，導(dǎo)向部分可以是抗生素。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，導(dǎo)向部分是肽，該肽與目的受體或酶結(jié)合。例如，導(dǎo)向肽Q可以是肽激素例如，黃體生成素激素釋放激素(LHRH)例如在文獻(xiàn)[例如，Radiometal-Bining Analogus of LeutenizingHormone Releasing Hormone PCT/US96/08695；PCT/US97/12084(WO98/02192)]中描述的；胰島素；催產(chǎn)素(oxytosin)；促生長素抑制素；神經(jīng)激肽-1(NK-1)；血管活性腸肽(VIP)，包括如在文獻(xiàn)，[例如，Comparison of Cyclic and Linear Analogs of VasoactiveIntestinal Peptide.D.R.Bolin，J.M.Cottrel，R.Garippa，N.Rinaldi，R.Senda，B.Simkio，M.O’Donnel1.PeptidesChemistry，Structure and Biology Pravin T.P.kaumaya，和Roberts S.Hodges(編輯).Mayflower Scienti fic LTD.，1996，pgs 174-175]中描寫的線性和環(huán)狀的；胃泌素釋放肽；鈴蟾肽和其它已知的激素肽，以及它們的類似物和衍生物。
其它適用的導(dǎo)向肽包括促生長素抑制素的類似物，其例如是蘭瑞肽(Nal-Cys-Thr-DTrp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2)、奧曲肽(Nal-Cys-Thr-DTrp-Lys-Val-Cys-Thr-ol)、和Maltose (Phe-Cys-Thr-DTrp-Lys-Val-Cys-Thr-ol)。這些類似物被描述在文獻(xiàn)[例如，PotentSomatostatin Analogs Containing N-terminal Modifications，S.H.Kim，J.Z.Dong，T.D.Gordon，H.l.Kimball，S.C.Moreau，J.-P.Moreau，B.A.Morgan，W.A.Murphy和J.E.Taylor；PeptidesChemistry，Structure and Biology，Pravin T.P.kaumaya，和RobertsS.Hodges(編輯).Mayflower Scientific LTD.，1996，pgs241-243]中。
其它還適用的導(dǎo)向肽包括P物質(zhì)激動(dòng)劑[例如，G.Bitan，G.Byk，Y.Mahriki，M.Hanani，D.Halle，Z.Selinger，C.Gilon，PeptidesChemistry，Structure and Biology Pravin T.P.kaumaya，和RobertsS.Hodges(編輯).Mayflower Scientific LTD.，1996，pgs697-698；G Protein Antagonists A novel hydrophobic peptide competes withreceptor for G protein binding，Hidehito Mukai，Eisuke Munekata，Tsutomu Higashijima，J.Bio.Chem.1992，267，16237-16243]；NPY(Y1)[例如，Novel Analogues of Neuropeptide Y with aPreferenee for the YI-receptor，Richard M.Soll，Michaela，C.Dinger，Ingrid Lundell，Dan Larhammer，Annette G.Beck-Sickinger，Eur.J.Biochem.2001，268，2828-2837；99mTc-Labeled Neuropeptide Y Ana logues as Potential Tumor ImagingAgents，Michael Langer，Roberto La Bella，Elisa Garcia-Garayoa，Annette G.Beck-Sickinger，Bioconjugate Chem.2001，12，1028-1034；Novel Peptide Conjugates for Tumor-SpecificChemotherapy，Michael Langer，F(xiàn)elix Kratz，BarbaraRothen-Rutishauser，Heidi Wnderli-Allenspach，Annette G.Beck-Scikinger，J.Med.Chem.2001，44，1341-1348]；催產(chǎn)素；內(nèi)皮縮血管肽A和內(nèi)皮縮血管肽B；緩激肽；表皮生長因子(EGF)；白細(xì)胞介素-1[Anti-IL-1 Activity of Peptide Fragments of IL-1Family Proteins，I.Z.Siemion，A.Kluczyk，Zbigtniew Wieczorek，Peptides 1998，19，373-382]；和縮膽囊肽(CCK-B)[CholecystokininReceptor Imaging Using an Octapeptide DTPA-CCK Analgue inPatients with Medullary Thryoid Carcinoma，Eur.J.Nucl Med.200，27，1312-1317]。
例如可在下面的文獻(xiàn)中找到給出導(dǎo)向肽的一般綜述的文獻(xiàn)TheRole of Peptides and Their Receptors as Tumor Markers，Jean-Claude Reubi，Gastrointestinal Hormones in Medicine，Pg899-939；Peptide Radiopharmaceutical in Nuclear Medicine，D.Blok，R.I.J.Feitsma，P.Vermeij，E.J.K.Pauwels，Eur.J.Nu l Med.1999，26，1511-1519；和Radiolabeled Peptides and Other Ligandsfor Receptors Overexpressed in Tumor Cells for ImagingNeoplasms，John G.McAfee，Ronald D.Neumann，Nuclear Medicineand Biology，1996，23，673-676(促生長素抑制素、VIP、CCK、GRP、P物質(zhì)、Galanan、MSH、LHRH、精氨酸升壓素、內(nèi)皮縮血管肽)。通過參考將在前面段落中所有前面提到的文獻(xiàn)以其整體并入本申請。
其它導(dǎo)向肽參考文獻(xiàn)包括如下Coexpressed peptide receptorsin breast cancer as a molecular basis of in vivo multireceptortumor targeting.Jean Claude Reubi，Mathias Gugger，BeatriceWaser.Eur.J.Nul Med.2002，29，855-862，(包括NPY、GRP)；Radiometal-Binding Analogues of Leutenizing Hormone ReleasingHormones PCT/US96/08695(LHRH)；PCT/US97/12084(WO 98/02192)(LHRH)；PCT/EP90/01169(肽的放射治療)；WO/91/01144(肽的放射治療)；以及PCT/EP00/01553(用于腫瘤治療和診斷的分子)，通過參考將它們?nèi)恳云湔w并入本申請。
另外，可以使用導(dǎo)向肽的類似物。這些類似物包括導(dǎo)向所希望的位點(diǎn)受體的分子(具有大于或等于導(dǎo)向肽本身的親和力)，以及導(dǎo)向肽的突變蛋白、反肽(retropeptides)和反-翻轉(zhuǎn)肽(retro-inversopeptides)。普通技術(shù)人員將認(rèn)為，這些類似物還可含有修飾，該修飾包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、和/或缺失和/或添加，只要這些修飾不負(fù)面地改變其中所述肽的生物活性。可以通過用它們的同義氨基酸置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸實(shí)施這些取代。一組內(nèi)的同義氨基酸被定義為這樣的氨基酸，它具有充分相似的生理化學(xué)性質(zhì)以允許組的成員之間的取代以保持所述分子的生物學(xué)功能。本申請使用的同義氨基酸包括這些氨基酸的合成衍生物(例如D-型氨基酸和其它合成的衍生物)。
氨基酸的缺失或插入可被引入所定義的序列，只要它們不改變所說序列的生物學(xué)功能。優(yōu)先地，這樣的插入或缺失應(yīng)被限制于1、2、3、4或5個(gè)氨基酸并且不應(yīng)該移動(dòng)或物理擾亂或替代對功能構(gòu)象是關(guān)鍵的氨基酸。本申請所述肽或多肽的突變蛋白可具有與本說明書中公開的序列同源的序列，其中在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置存在氨基酸取代、缺失或插入。突變蛋白可具有為本申請所述肽的至少40％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選60-70％，最優(yōu)選80-90％的生物學(xué)活性。但是，它們還可以具有大于具體舉例的肽的生物學(xué)活性，因此不必要一定與所舉例的肽的生物學(xué)功能相等。導(dǎo)向肽的類似物還包括摻入引起肽骨架的酰胺鍵，包括硫酰胺、亞甲基胺、和E-烯烴變化的肽模擬物(peptidomimetics)或假肽(pseudopeptides)?；趯?dǎo)向肽或其具有被N-取代的肼羰基化合物取代的氨基酸(也被稱為氮雜氨基酸)的肽類似物的結(jié)構(gòu)的肽也被包括在本申請所使用的術(shù)語類似物中。
導(dǎo)向肽還可以通過N或C末端或通過與賴氨酸的ε氮、鳥氨酸的γ氮或天冬氨酸或谷氨酸的第二個(gè)羧基的連接與接頭連接。
在一個(gè)示范性的實(shí)施方案中，導(dǎo)向肽Q是LHRH或其類似物或衍生物。例如，本領(lǐng)域中熟知，LHRH激動(dòng)劑的位置6可被不同的功能基團(tuán)，例如D賴氨酸取代。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，導(dǎo)向肽Q是式PGlu-His-Trp-W-Tyr-DLys-X-Y-Pro-Z的LHRH類似物，其中W＝Ser、NMeSer或Thr。
X＝Leu、NMeLeu、叔丁基Gly。
Y＝Arg、Arg(Et2)、Cit、Lys(異丙基)。
Z＝Gly-NH2、NHEthyl、氮雜gly-NH2。
與甘氨酸和D賴氨酸偶聯(lián)的本發(fā)明的接頭可在位置6與LHRH連接。這種實(shí)施方案包括下式化合物PGlu-His-Trp-W-Tyr-DLys(M-M-O-P)-X-Y-Pro-Z，其中W＝Ser、NMeSer或Thr。
X＝Leu、NMeLeu、叔丁基Gly。
Y＝Arg、Arg(Et2)、Cit、Lys(異丙基)。
Z＝Gly-NH2、NHEthyl、氮雜gly-NH2。
M是如本申請所定義的金屬螯合劑，以及N-O-P是本發(fā)明的接頭。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括下式化合物PGlu-His-Trp-W-Tyr-DLys(DOTA-Gly-膽酸衍生物)-X-Y-Pro-Z，其中W＝Ser、NMeSer或Thr。
X＝Leu、NMeLeu、叔丁基Gly。
Y-Arg、Arg(Et2)、Cit、Lys(異丙基)。
Z＝Gly-NH2、NHEthyl、氮雜gly-NH2。
這里，DOTA-Gly是M(金屬螯合劑和Gly間隔區(qū))，N-O-P是本發(fā)明的接頭(例如膽酸衍生物)，以及Q是結(jié)合Dlys6和上面所列舉的其它取代的LHRH。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，上式中的W、X、Y或Z組分是W＝Ser，X＝Leu，Y＝Arg和Z＝Gly-NH2。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Q是導(dǎo)向GRP受體家族中受體的肽，例如GRP或鈴蟾肽的類似物或衍生物。在2003年1月13日提交的共未決(co-pending)的美國系列號(hào)10/341,577、以及美國專利6,200,546、US2002/0054855、US2003/0224998和WO02/87637中討論了這樣的導(dǎo)向肽，通過參考將它們以其全部并入本申請。
具有式M-N-O-P-Q的化合物的例子列在表1中，該式含有具有至少一種取代的膽汁酸的接頭，所述膽汁酸與導(dǎo)向肽例如BBN(7-14)連接。使用本申請，特別是在實(shí)施例中所公開的方法，以及通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相似方法可制備這些化合物。
表1
*BBN(7-14)是[SEQ ID NO1]1HPLC方法表示HPLC梯度10分鐘時(shí)間。
2HPLC RT表示HPLC中化合物的保留時(shí)間。
3MS表示質(zhì)譜，由質(zhì)量/單位電荷(m/e)計(jì)算分子量。
4IC50表示抑制碘化的鈴蟾肽與細(xì)胞上的GRP受體的50％結(jié)合的化合物的濃度。
如下文更詳細(xì)解釋的，含有本發(fā)明的接頭和GRP-R導(dǎo)向肽的化合物在動(dòng)物模型中證實(shí)了意料之外優(yōu)異的藥物動(dòng)力學(xué)和腫瘤攝取。
根據(jù)所選擇的螯合劑，可通過不同的方法制備所述導(dǎo)向肽。一般通過在肽合成領(lǐng)域中廣泛建立和已知的技術(shù)可最方便地制備所述肽，例如固相肽合成(SPPS)方法。固相肽合成(SPPS)涉及向形成的肽鏈分步添加氨基酸殘基，所述肽鏈與不可溶的支持體或基質(zhì)，例如聚苯乙烯連接。首先將所述肽的C-末端殘基與商業(yè)上可獲得的支持體錨定，其氨基用N-保護(hù)試劑例如叔丁氧羰基(Boc)或芴甲氧基羰基(Fmoc)基團(tuán)保護(hù)。用適合的脫保護(hù)試劑例如在Boc的情況下用TFA或?qū)moc來說用哌啶去除氨基保護(hù)基團(tuán)并與適合的偶聯(lián)試劑例如N，N’-二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)或N，N’-二異丙基碳二亞胺或2-(1H苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)一起添加下一個(gè)氨基酸殘基(以N-保護(hù)的形式)。形成肽鍵后，從支持體洗下所述試劑。添加最后的殘基后，用適合的試劑例如三氟乙酸(TFA)或氟化氫(HF)從支持體裂解所述肽。
然后可通過使導(dǎo)向肽的所選的殘基的游離氨基與接頭的適合的官能基團(tuán)反應(yīng)，將接頭偶聯(lián)以形成綴合物。還可以在樹脂上組裝上面討論的螯合劑、接頭和導(dǎo)向部分的整個(gè)構(gòu)建體，然后通過適合試劑例如三氟乙酸或HF的作用裂解。
5.放射性藥物化合物的標(biāo)記和施用通過配位化學(xué)領(lǐng)域中通常已知的各種方法可以實(shí)現(xiàn)金屬在本發(fā)明的放射性藥物綴合物內(nèi)的摻入。當(dāng)金屬是99mTc(一種優(yōu)選的用于診斷成像的放射性核素)時(shí)，可使用下面的一般方法以形成锝絡(luò)合物。通過最初將綴合物溶于水、稀釋的酸或于醇例如乙醇的水溶液中形成肽-螯合劑綴合物溶液。然后選擇性地將溶液脫氣以去除溶解的氧。當(dāng)肽中存在-SH基團(tuán)時(shí)，可選擇性地使用硫羥基保護(hù)基團(tuán)例如Acm(乙酰氨基甲基)、三甲苯基或其它硫羥基保護(hù)基團(tuán)以保護(hù)硫羥基免被氧化。用適合的試劑例如用氫氧化鈉去除硫羥基保護(hù)基團(tuán)，然后用有機(jī)酸例如乙酸(pH6.0-6.5)中和?；蛘?，在锝螯合過程中原位去除硫羥基保護(hù)基團(tuán)。在標(biāo)記步驟中，將從鉬發(fā)生器中獲得高锝酸鈉與足夠量的還原劑例如氯化亞錫一起添加到綴合物的溶液中，以還原锝，并允許在室溫下靜置或加熱。用色譜法例如用C-18Sep Pak筒[MilliporeCorpation，Waters Chromatography Division，34 Maple Street，Milford，Massachusetts 01757]或通過HPLC使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以將標(biāo)記的綴合物與污染物99mTcO4和膠態(tài)99mTcO2分開。
在一種替代的方法中，可以通過反式螯合(transchelation)反應(yīng)完成標(biāo)記。在這種方法中，锝來源是在與所選擇的螯合劑反應(yīng)前與不穩(wěn)定的配體絡(luò)合的锝溶液，因此促進(jìn)配體與所選擇的螯合劑交換。用于反式螯合的適合的配體的例子包括酒石酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽和葡庚糖酸鹽(heptagluconate)。將要理解的是，使用上面描述的技術(shù)可以標(biāo)記綴合物，或者，螯合劑本身可被標(biāo)記并且隨后被偶聯(lián)至肽以形成綴合物；被稱為“預(yù)標(biāo)記的螯合物”方法的方法。Re和Tc都在周期表的VIIB列中并且它們是化學(xué)同族元素。因此，在極大程度上，這兩種金屬與表現(xiàn)出體內(nèi)和體外高穩(wěn)定性的配體框架(framewofks)的絡(luò)合化學(xué)是相同的[Eckelman，1995]并且可使用相似的螯合劑和方法用Re標(biāo)記。被用于與肽和蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的放射性金屬絡(luò)合物的許多99mTc或186/188Re絡(luò)合物，在它們的+5氧化狀態(tài)螯合這些金屬[Lister-James等，1997]。該氧化狀態(tài)使得選擇性地將99mTc-或186/188Re置入配體框架中成為可能，所述配體框架已經(jīng)與生物分子綴合、由一系列99mTc(V)和/或186/188Re(V)弱螯合物(例如，99mTc-葡庚糖酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽等)構(gòu)建[Eckelman，1995；Lister-James等，1997；Pollak等，1996]。
可以使用本領(lǐng)域中已知的方法完成用放射性鹵素標(biāo)記本發(fā)明的導(dǎo)向肽或其它肽-接頭綴合物。實(shí)施例描述了多種可被使用的方法。
可將標(biāo)記有放射性核素金屬，例如99mTc的綴合物，以藥物上可接受的載體和/或溶液例如鹽溶液如等滲鹽水形式，通過靜脈內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)注射給予哺乳動(dòng)物，包括人患者或受試者。本發(fā)明提供的放射標(biāo)記的閃爍照相成像物質(zhì)被提供具有適合量的放射性。在形成99mTc放射性絡(luò)合物時(shí)，優(yōu)選在含有濃度為約0.01毫居里(mCi)至100mCi每毫升的放射性的溶液中形成放射性絡(luò)合物。通常，給予的單位劑量具有約0.01毫居里(mCi)至100mCi，優(yōu)選1mCi至30mCi的放射性。以單位劑量注射的溶液為0.01mL至約10mL。適合于施用的標(biāo)記的綴合物的量依賴于所選綴合物的分布特征，在某種意義上說快速清除的綴合物比較慢清除的綴合物可能需要給予更高的劑量。在施用后適合的時(shí)間，通過標(biāo)準(zhǔn)的閃爍照相技術(shù)可以追蹤體內(nèi)分布和定位；典型地在30分鐘和180分鐘之間，取決于在靶位點(diǎn)的累積速率和在非靶組織的清除速率。例如，在將本發(fā)明的診斷放射性核素標(biāo)記的化合物注射到患者中后，可使用根據(jù)被摻入成像物質(zhì)中的核素的γ射線能量進(jìn)行標(biāo)定的γ照相機(jī)使所述物質(zhì)的攝取部位成像并定量存在于所述位點(diǎn)的放射性的量。體內(nèi)位點(diǎn)的成像可發(fā)生在幾分鐘內(nèi)。但是，如果希望，在將放射標(biāo)記的肽注入患者后，成像可發(fā)生幾個(gè)小時(shí)或甚至更長時(shí)間。在大多數(shù)情況下，被給予劑量的足夠量將在約0.1小時(shí)內(nèi)累積被成像的部位以允許閃爍照片的拍攝。
可將本發(fā)明的化合物單獨(dú)或作為含有其它組分例如賦形劑、稀釋劑、自由基清除劑、穩(wěn)定劑和載體(它們?nèi)渴潜绢I(lǐng)域中已知的)的組合物的部分給予患者。也可以靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)將所述化合物給予患者。
有許多與本發(fā)明有關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。按照本發(fā)明制備的化合物形成穩(wěn)定、良好定義的99mTc或186/188Re標(biāo)記的化合物。通過使用各放射性金屬的適合的螯合劑框架也可以制備本發(fā)明類似的化合物，以形成穩(wěn)定、良好定義的用153Sm、99Y、166Ho、105Rh、199Au、149Pm、177Lu、111I或其它放射性金屬標(biāo)記的產(chǎn)物。不到達(dá)(即不結(jié)合)癌細(xì)胞的放射性物質(zhì)優(yōu)先有效地被排泄到尿中，在腎中具有最小的放射性金屬的保留。
6.可選擇的實(shí)施方案如在實(shí)施例中更詳細(xì)解釋的，含有本發(fā)明新接頭的化合物表現(xiàn)出增加的血清白蛋白親和性，其降低了所述化合物的排泄速率。因此這些化合物比沒有本發(fā)明接頭的化合物表現(xiàn)出更長的半衰期。令人驚奇地，導(dǎo)向肽與本發(fā)明膽酸衍生物接頭的氨基連接的化合物，以及導(dǎo)向肽與膽酸衍生物接頭的羧酸基連接的化合物，都表現(xiàn)出這種性質(zhì)。
在本發(fā)明的一個(gè)示范性實(shí)施方案中，導(dǎo)向肽可通過3位的氨基與本發(fā)明的膽酸衍生物接頭連接。診斷或治療部分通過24位的羧酸基團(tuán)被連接。
在另一個(gè)示范性實(shí)施方案中，導(dǎo)向肽可與本發(fā)明膽酸衍生物接頭的24位的羧酸基團(tuán)連接。診斷或治療部分可通過所述接頭的3位氨基被連接。例如，在L62(圖6B)和L69(圖10B)中，診斷部分(金屬螯合劑)在3位被連接并且導(dǎo)向肽(BBN[7-14]在膽酸衍生物接頭的24位被連接。
在另一個(gè)示范性實(shí)施方案中，診斷或治療部分可與膽酸衍生物接頭的氨基和羧基的任一個(gè)連接。在優(yōu)選的示范性實(shí)施方案中，化合物具有與3-氨基連接的治療部分(胰島素分子)和與膽酸衍生物接頭的24位羧基連接的另一個(gè)治療部分(胰島素分子)。參見例如化合物D(圖4)。在另一個(gè)優(yōu)選的示范性實(shí)施方案中，化合物具有與3-氨基連接的治療部分(胰島素分子)和與膽酸衍生物接頭的24位羧基連接的診斷部分(金屬螯合劑)(或相反)。參見例如化合物F(圖5B)。
本發(fā)明還包括一種實(shí)施方案，其中導(dǎo)向肽和診斷或治療部分(或兩個(gè)診斷和/或治療部分)都可通過膽酸衍生物接頭的3-氨基被連接。例如，在L65(圖9)和L66(圖10A)中，診斷部分(金屬螯合劑)和導(dǎo)向肽(13BN[7-14])都在本發(fā)明膽酸衍生物接頭的3-位被連接。
7A.診斷和治療用途當(dāng)用診斷和/或治療部分(例如，診斷或治療有用的金屬)標(biāo)記時(shí)，通過在診斷成像、放射診斷學(xué)和放射治療學(xué)領(lǐng)域中已建立的方法，可將本發(fā)明的化合物用于治療和/或檢測疾病例如癌，包括腫瘤，[Bushbaum，1995；Fischman et al.，1993；Schubiger etal.，1996；Lowbertz et al.，1994；Krenning et al.，1994]。
本發(fā)明的化合物，如在實(shí)施例中更詳細(xì)解釋的，比沒有在此公開的新接頭的化合物顯示在體內(nèi)更高的腫瘤中攝取，表現(xiàn)出提高的導(dǎo)向期望的受體表達(dá)性組織(例如受體表達(dá)性腫瘤)的能力。因此，本發(fā)明的化合物更好地能夠成像或輸送放射治療至這些期望的組織。事實(shí)上，如在實(shí)施例中所顯示的，使用本發(fā)明的化合物放射治療更有效(并且存活時(shí)間增加)。
這些化合物的診斷應(yīng)用，使用診斷成像(例如閃爍照相術(shù)、磁共振、超聲、光學(xué)、光聲術(shù)或聲致發(fā)光成像)時(shí)，可被作為靶細(xì)胞存在的第一線診斷篩選，使用手持放射檢測儀器時(shí)作為放射免疫導(dǎo)向的外科手術(shù)(PIGS)中導(dǎo)向所選組織的物質(zhì)，作為在施用相配的一對放射治療化合物前獲得計(jì)量學(xué)數(shù)據(jù)的工具，以及作為評估作為治療隨時(shí)間的函數(shù)的靶受體群的工具。
這些化合物的治療應(yīng)用可被定義為在治療疾病例如癌中將被用作第一線治療的物質(zhì)，在本發(fā)明的治療劑可與輔助化療結(jié)合(例如與在此公開的其它治療劑的一種)被應(yīng)用時(shí)作為組合治療，或作為相配的一對治療劑的治療部分。相配的一對的概念表示單個(gè)未金屬化的化合物，該化合物可起診斷和治療物質(zhì)的作用，取決于被選擇用于與適合的螯合物結(jié)合的放射性金屬。如果螯合劑不能容納期望的金屬，可進(jìn)行適合的取代以容納不同的金屬，同時(shí)保持藥理學(xué)，以致診斷化合物在體內(nèi)的行為可被用于預(yù)測放射治療化合物的行為。
7B.光學(xué)成像、聲致發(fā)光、光聲成像和光線療法按照本發(fā)明，在用光學(xué)標(biāo)記的本發(fā)明化合物注射受試者后，用體內(nèi)光成像可以使用許多光學(xué)參數(shù)來測定靶的定位。在制備圖象中，被檢測的光學(xué)參數(shù)可包括傳導(dǎo)的輻射性、吸收、熒光或磷光的發(fā)射、光反射、吸收幅度或最大值的變化，以及彈性散射的輻射。例如，在接近650-1000nm近紅外(NIR)波長，生物組織對光相對半透明的。NIR輻射可滲透組織直到幾分米，允許使用本發(fā)明的化合物來在體內(nèi)成像含靶組織。可見和近紅外(NIR)光在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用快速增長。在電磁譜的可見、NIR或長波長(UV-A，＞350nm)區(qū)域的化合物吸收或發(fā)射潛在地適用于X-線斷層成像、內(nèi)窺鏡檢查目視和光線療法。
生物醫(yī)學(xué)光學(xué)的主要優(yōu)點(diǎn)在于它的治療潛能。光線療法已被證實(shí)為安全和有效的用于治療各種表面?zhèn)?外部的和內(nèi)部的)的方法。在光學(xué)成像和光線療法中，增強(qiáng)信號(hào)檢測和/或組織的光敏感的染料是重要的。先前的研究顯示，某些染料可定位于腫瘤中并且起檢測和治療小癌的強(qiáng)力探針作用(D.A.Bellnier 等.，Murinepharmacokinetics and antitumor efficacy of the photodynamicsensitizer2-[1-hexyloxyethyl]-2-devinyl pyropheophorbide-a，J.Photochem.Photobiol.，1993，20，pp.55-61；G.A.Wagnieres等，In vivo fluorescence spectroscopy and imaging foroncological applications，Photochem.Photobiol.，1998，68，pp.603-632；J.S.Reynolds等.，Imaging of spontaneous caninemammary tumors using fluorescent contrast agents，Photochem.Photobiol.，1999，70，pp.87-94)。但是，這些染料不優(yōu)先定位在惡性組織中。
在一個(gè)示范性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可與光標(biāo)記(photolabels)，例如光學(xué)染料結(jié)合，其包括有機(jī)發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)，具有廣泛的非定域環(huán)系統(tǒng)并且具有400-1500nm范圍內(nèi)的吸收或發(fā)射最大值。本發(fā)明的化合物可選擇地被用于生物發(fā)光分子衍生化。光標(biāo)記的吸收最大值的優(yōu)選范圍在600和1000nm之間以最小化來自血紅蛋白的信號(hào)干擾。優(yōu)選地，光吸收標(biāo)記具有大的摩爾吸收性，例如＞105cm-1M-1，而熒光光學(xué)染料將有高的量子產(chǎn)量。光學(xué)染料的例子包括，但不限于，那些描述在WO 98/18497，WO 98/18496，WO 98/18495，WO98/18498，WO 98/53857，WO 96/17628，WO 97/18841，WO 96/23524，WO 98/47538，在這里引為參考。例如，光標(biāo)記可以共價(jià)地直接連接本發(fā)明的化合物，例如，包括本發(fā)明的導(dǎo)向肽和接頭的化合物或包括本發(fā)明的診斷或治療部分和接頭的化合物。
由于它們的生物相容性，高摩爾吸附性，和/或高熒光量子產(chǎn)量，幾種在可見光和近紅外線區(qū)的電磁光譜內(nèi)吸收和發(fā)射光的染料正在被用于多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。與作為造影劑的染料結(jié)合的光學(xué)形態(tài)連同染料的高可以與核醫(yī)學(xué)的高靈敏度相平行，并允許器官和組織可見化，沒有電離輻射的不希望影響。在近紅外線區(qū)(NIR)有強(qiáng)烈吸收和發(fā)射的花菁染料是特別有用的，因?yàn)樯锝M織在這個(gè)區(qū)是光學(xué)透明的(B.C.Wilson，Optical properties of tissues.Encyclopedia of HumanBiology，1991，5，587-597)。例如，在NIR區(qū)有吸收和發(fā)射的靛花菁綠已經(jīng)被用來監(jiān)測心臟的輸出量，肝功能，和肝血流，(Y-L.He，H.Tanigami，H.Ueyama，T.Mashimo和I.Yoshiya，Measurement ofblood volume using indocyanine green measured withpulse-spectrometryIts reproducibility and reliability.Critical Care Medicine，1998，26(8)，1446-1451；J.Caesar，S.Shaldon，L.Chiandussi等The use of Indocyanine green in themeasurement of hepatic blood flow and as a test of hepaticfunction Clin.Sci.1961，21，43-57)以及它的功能化衍生物已經(jīng)被用來結(jié)合生物分子用于診斷目的(R.B.Mujumdar，L.A.Ernst，S.R.Mujumdar，等，Cyanine dye labeling reagentsSulfoindocyanine succinimidyl esters.Bioconjugate Chemistry，1993，4(2)，105-111；Linda G.Lee 和Sam L.Woo.“N-Heteroaromatic ion and iminium ion substituted cyanine dyefor use as fluorescent labels”，美國專利號(hào)5,453,505；EricHohenschub，等?！癓ight imaging contrast agents“，WO98/48846；Jonathah Turner，等?！癘ptical diagnostic agents for thediagnosis of neurodegenerative diseases by means of nearinfer-red radiation”，WO 98/22146；Kai Licha，等。“In-vivodiagnostic process by near infrared radia tion”，WO 96/17628；Robert A.Snow，等。Compounds，WO 98/48838.
注射光學(xué)標(biāo)記的化合物后，用一種或多種光源(例如激光)以適合物質(zhì)中所使用的光標(biāo)記的波長范圍掃描患者。使用的光可以是單色的或多色的和連續(xù)的或脈沖的。通過調(diào)諧至一或多波長的光測器檢測傳播的、散射的或反射的光以測定受試者中含靶組織的位置。可以隨時(shí)間監(jiān)測光學(xué)參數(shù)的變化以檢測光學(xué)標(biāo)記的試劑在靶位點(diǎn)的累積?？膳c本發(fā)明的光學(xué)成像試劑結(jié)合使用標(biāo)準(zhǔn)的成像方法和檢測裝置。
上面描述的光學(xué)成像試劑可被用于用光學(xué)標(biāo)記的成像試劑進(jìn)行的聲光或聲致發(fā)光成像。(見，U.S.5,171,298，WO 98/57666，以及其中的參考文獻(xiàn))。在聲光成像中，超聲輻射被應(yīng)用到受試者并且影響傳播的、發(fā)射的或反射的光的光學(xué)參數(shù)。在聲致發(fā)光成像中，所應(yīng)用的超聲實(shí)際上產(chǎn)生檢測的光。適合的使用這類技術(shù)的成像方法被描述在WO 98/57666中。
在美國專利6,663,847，6,656,451，6,641,798，6,485,704，6,423,547，6,395,257，6,280,703，6,277,841，6,264,920，6,264,919，6,228,344，6,217,848，6,190,641，6,183,726，6,180,087，6,180,086，6,180,085，6,013,243和公開的美國專利申請2003185756，20031656432，2003158127，2003152577，2003143159，2003105300，2003105299，2003072763，2003036538，2003031627，2003017164，2002169107，2002164287，和2002156117中描述了各種成像技術(shù)和試劑。
7C.磁共振成像本發(fā)明的化合物可有利地與一種或多種順磁性金屬螯合物結(jié)合以形成用于MRI的造影劑。優(yōu)選的順磁性金屬離子具有原子數(shù)21-29、42、44、或57-83。這包括過度金屬或鑭系的離子，其具有一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選五個(gè)或更多個(gè)未配對的電子和至少約1.7玻爾磁子的磁矩。優(yōu)選的順磁性金屬包括，但不限于，絡(luò)(III)、錳(II)、錳(III)、鐵(II)、鐵(III)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、鐠(III)、釹(III)、釤(III)、釓(III)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)、鉺(III)、銪(III)和鐿(III)。此外，本發(fā)明的化合物還可以與一種或多種超順磁顆粒結(jié)合。
特別優(yōu)選Gd(III)用于MRI，由于它的高松弛性和低毒性，以及只有一種生物學(xué)上可達(dá)到的氧化狀態(tài)的可利用性。自從1988以來，Gd(III)螯合物已被用于臨床和放射學(xué)MR應(yīng)用，并且大約30％的MR檢查目前使用基于釓(III)的造影劑。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將按照檢測含靶組織所需的劑量并考慮其它因素例如金屬對受試者的毒性選擇金屬。見，Tweedle等，MagneticResonance Imaging(2nd ed.)，vol.1，Partain等，eds.(W.B.Saunders Co.1988)，pp.796-7。通常，個(gè)體金屬所需要的劑量將與它的松弛性成比例，通過生物分布、藥物動(dòng)力學(xué)和金屬的代謝進(jìn)行修飾。特別優(yōu)選三價(jià)陽離子Gd3+用于MRI造影劑，由于它的高松弛性和低毒性，具有進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)它存在于唯一的生物學(xué)上可達(dá)到的氧化狀態(tài)，使患者的不期望的金屬代謝作用最小化。另一種有用的金屬是Cr3+，它相對地不昂貴。
順磁金屬螯合劑是具有一個(gè)或多個(gè)極性基團(tuán)的分子，所述極性基團(tuán)起順磁金屬的配體的作用或與順磁金屬絡(luò)合。適合的螯合劑是本領(lǐng)域中已知的并包括具有亞甲基膦酸基團(tuán)、亞甲基甲羥胺酸基團(tuán)、羧基亞乙基基團(tuán)或羧基亞甲基基團(tuán)。螯合劑的例子包括，但不限于，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、1-取代的1，4，7，-三羧甲基1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷三乙酸(D03A)、乙二胺四乙酸(EDTA和1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)。另外的螯合配體是亞乙基雙-(2-羥基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物，包括5-Cl-EHPG、5-Br-EHPG、5-Me-EHPG、5-t-Bu-EHPG和5-sec-Bu-EHPG；苯并二亞乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、芐基-DTPA和二芐基DTPA；雙-2(羥基芐基)-亞乙基-二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；大環(huán)化合物類含有至少3個(gè)碳原子，更優(yōu)選至少6個(gè)和至少兩個(gè)雜原子(O和/或N)，該大環(huán)化合物可由一個(gè)環(huán)或在雜環(huán)元素處連接在一起的兩個(gè)或三個(gè)環(huán)組成，例如苯并-DOTA、二苯并-DOTA和苯并-NOTA，其中NOTA是1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷N，N’，N’’-三乙酸、苯并-TETA、苯并-DOTMA，其中DOTMA是1，4，7，10-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，7，10-四(甲基四乙酸)，以及苯并-TETMA，其中TETMA是1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，8，11-(甲基四乙酸)；1，3-亞丙基二胺四乙酸(PDTA)和三亞乙基四胺六乙酸(TTHA)的衍生物；1，5，10-N，N′，N″-三(2，3-二羥基苯甲?；?-三兒茶酚酸酯(tricatecholate，LICAM)和1，3，5-N，N′，N″-三(2，3-二羥基苯甲?；?氨甲基苯(MECAM)的衍生物。優(yōu)選的用于本發(fā)明的螯合劑是DTPA。本發(fā)明考慮到的代表性螯合劑和螯合基團(tuán)的例子被描述在WO98/18496，WO 86/06605，WO 91/03200，WO 95/28179，WO 96/23526，WO 97/36619，PCT/US98/01473，PCT/US98/20182，以及U.S.4,899,755，U.S.5,474,756，U.S.5,846,519和U.S.6,143,274，通過參考以其整體并入本申請。特別優(yōu)選使用螯合物D03A。
放射性核素的螯合劑、順磁金屬的螯合劑可包括如上文所述定義的間隔基團(tuán)。
通常，本申請公開的方法以及其它已知的方法可被用于偶聯(lián)金屬螯合物和包含本發(fā)明接頭的化合物。參見例如，WO 95/28967，WO98/18496，WO 98/18497和其中的討論。本發(fā)明考慮到了螯合物在任何位置上的連接，條件是為了使毒性最小化金屬螯合物保留緊密結(jié)合金屬的能力。相似地，為了產(chǎn)生與金屬螯合物連接的位置，可以修飾或延長本發(fā)明化合物的組分，條件是這類修飾或延長不消除它結(jié)合靶的能力。
按照本申請公開內(nèi)容制備的MRI造影劑可以相同的方式被用作常規(guī)MRI造影劑。當(dāng)將含靶組織例如血管發(fā)生的位點(diǎn)成像時(shí)，可優(yōu)選某些MR技術(shù)和脈沖序列以增強(qiáng)所述位點(diǎn)與背景血液和組織的對比。這些技術(shù)包括(但單不限于)，例如，尋求使血變黑暗的黑血血管造影術(shù)序列，例如快速自旋回波序列(參見例如，Alexander等.，MagneticResonance in Medicine，40(2)298-310(1998))和流動(dòng)損害的梯度回波序列(參見例如，Edelman等，Radiology，177(1)45-50(1990))。這些方法還包括增強(qiáng)對比差異的流動(dòng)獨(dú)立技術(shù)，例如反轉(zhuǎn)-恢復(fù)制備序列或飽和恢復(fù)制備序列，其將增加含靶組織例如血管發(fā)生性腫瘤和背景組織之間的對比。最后，磁化轉(zhuǎn)移制備物還可以用這些物質(zhì)改進(jìn)對比(參見例如，Goodrich等，Investigative Radiology，31(6)323-32(1996))。
將標(biāo)記的試劑以可注射組合物的形式給予患者。給予MR造影劑的方法優(yōu)選胃腸外施用，意思是指靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、膜內(nèi)、間隙、或腔施用。就成像活性血管發(fā)生而言，優(yōu)選靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)施用。
就MRI來說，考慮到受試者將接受造影劑足以增強(qiáng)靶位點(diǎn)MR信號(hào)至少10％的劑量。注射包含MRI試劑的化合物構(gòu)建體后，將患者在MRI機(jī)器中掃描以測定含靶的任何位點(diǎn)的位置。在治療設(shè)置中，靶定位后，可以立即給予細(xì)胞毒性或治療劑，如果需要，可以隨后將患者掃描以使治療效果可視化。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含本發(fā)明接頭和導(dǎo)向肽或治療部分的化合物可與一種或多種順磁金屬螯合物或一種或多種超順磁顆粒結(jié)合。這類化合物構(gòu)建體與一種或多種順磁金屬絡(luò)合并以足以增強(qiáng)靶位點(diǎn)MR信號(hào)至少10％的劑量被施用。注射后，將患者在MRI機(jī)器中掃描以測定含靶的任何位點(diǎn)的位置。
7D.超聲成像當(dāng)通過物質(zhì)傳播超聲時(shí)，物質(zhì)的聲性質(zhì)將取決于傳播的速度和物質(zhì)的密度。在不同物質(zhì)(固體、液體、氣體)的界面處聲性質(zhì)的改變將是最明顯的。因?yàn)樵谠煊皠┖椭車M織之間的聲差別，超聲造影劑是強(qiáng)聲波反射劑。因?yàn)樵谝后w(例如血液)和含氣或產(chǎn)氣的超聲造影劑之間的聲差別，含氣或產(chǎn)氣的超聲造影劑特別有用。因?yàn)樗鼈兊拇笮。⑴?、微氣囊等的超聲造影劑在注射后可在血流中保持比其它可檢測部分更長的時(shí)間；因此靶向超聲試劑可證實(shí)表達(dá)或含有靶的組織的優(yōu)異成像。
在本發(fā)明的這一方面，本發(fā)明的化合物構(gòu)建體可包括作為診斷部分的物質(zhì)，該物質(zhì)適用于超聲成像。例如，包含本發(fā)明接頭和導(dǎo)向部分、另一個(gè)診斷部分或治療部分的化合物，可與用于形成含有液體或氣體的小泡(例如微泡、微氣囊、微球體等)或乳劑的物質(zhì)連接，它們起可檢測標(biāo)記(例如回波發(fā)生氣體或能夠產(chǎn)生回波氣體的物質(zhì))的作用。用于這類小泡制備的物質(zhì)包括表面活性劑、脂質(zhì)、鞘脂、寡脂、磷脂、蛋白質(zhì)、多肽、碳水化合物和合成或天然的聚合物質(zhì)。參見例如，WO 98/53857，WO 98/18498，WO 98/18495，WO 98/18497，WO98/18496和WO 98/18501，通過參考以其整體將它們并入本申請。
優(yōu)選包含穩(wěn)定的微泡(優(yōu)選的實(shí)施方案)、磷脂、以及特別是飽和的磷脂的懸浮液的造影劑。可通過本領(lǐng)域中已知的方法制備優(yōu)選的充氣微泡，例如通過在以下專利中的任一項(xiàng)中描述的方法EP 554213，US 5,413,774，US 5,578,92，EP 744962，EP 682530，US5,556,610，US 5,846,518，US 6,183,725，EP 474833，US 5,271,928，US5,380,519，US 5,531,980，US 5,567,414，US 5,658,551，US5,643,553，US 5,911,972，US 6,110,443，US 6,136,293，EP 619743，US 5,445,813，US 5,597,549，US 5,686,060，US 6,187,288和US5,908,610，通過參考以其整體將它們中的每一項(xiàng)并入本申請。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種磷脂部分具有在美國專利5,686,060中描述的結(jié)構(gòu)，通過參考以其整體將它并入本申請。
適合的磷脂的例子包括甘油與一個(gè)或兩個(gè)脂肪酸(相同或不同)和磷酸分子的酯，其中磷酸殘基依次與親水性基團(tuán)，例如膽堿、絲氨酸、肌醇、甘油、乙醇胺等基團(tuán)結(jié)合。存在于磷脂中的脂肪酸通常是脂族酸，典型地含有12至24個(gè)碳原子，優(yōu)選14至22，它們可被飽和或可含有一個(gè)或多個(gè)不飽和現(xiàn)象。適合的脂肪酸的例子是月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亞油酸和亞麻酸。在本領(lǐng)域中磷脂的單酯被稱為磷脂的“l(fā)yso”形式。
磷脂的進(jìn)一步的例子是磷脂酸，即甘油-磷酸與脂肪酸的二酯，鞘磷脂，即那些其中具有脂肪酸的甘油二酯的殘基被神經(jīng)酰胺置換的磷脂酰膽堿類似物，心磷脂，即1，3-二磷脂酰甘油與脂肪酸的酯，神經(jīng)節(jié)苷脂、腦苷脂等。
如本申請所使用的，術(shù)語磷脂包括天然存在的、半合成的或合成制備的產(chǎn)品，其可被單個(gè)地使用或作為混合物使用。天然存在的磷脂的例子是天然卵磷脂(磷脂酰膽堿(PC)衍生物)例如，典型地，大豆或卵黃卵磷脂。半合成的磷脂的例子是部分或全部氫化的天然存在的磷脂的衍生物。合成的磷脂的例子是例如，二月桂酰磷脂酰膽堿(“DLPC”)，二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(“DMPC”)，二棕櫚酰磷脂酰膽堿(“DPPC”)，二花生酰磷脂酰膽堿(“DAPC”)，二硬脂酰磷脂酰膽堿(“DSPC”)，1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿(“MPPC”)，1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(“PMPC”)，1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿(“PSPC”)，1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿(“SPPC”)，二油酰磷脂酰膽堿(“DOPC”)，1，2二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(乙基-DSPC)，二月桂酰磷脂酰甘油(“DLPG”)及其堿金屬鹽，二花生酰磷脂酰甘油(“DAPG”)及其堿金屬鹽，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)及其堿金屬鹽，二棕櫚酰磷脂酰甘油(“DPPG”)及其堿金屬鹽，二硬脂酰磷脂酰甘油(“DSPG”)及其堿金屬鹽，二油酰磷脂酰甘油(“DOPG”)及其堿金屬鹽，二肉豆蔻酰磷脂酸(“DMPA”)及其堿金屬鹽，二棕櫚酰磷脂酸(“DPPA”)及其堿金屬鹽，二硬脂酰磷脂酸(“DSPA”)，二花生酰磷脂酸(“DAPA”)及其堿金屬鹽，二肉豆蔻酰磷脂酰-乙醇胺(“DMPE”)，二棕櫚酰磷脂酰-乙醇胺(“DPPE”)，二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺(“DSPE”)，二肉豆蔻酰磷脂酰-絲氨酸(“DMPS”)，二花生酰磷脂酰-絲氨酸(“DAPS”)，二棕櫚酰磷脂酰-絲氨酸(“DPPS”)，二硬脂酰磷脂酰-絲氨酸(“DSPS”)，二油酰磷脂酰-絲氨酸(“DOPS”)，二棕櫚酰鞘磷脂(“DPSP”)和二硬脂酰鞘磷脂(“DSSP”)。
其它優(yōu)選的磷脂包括二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酸和二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸。組合物還可含有PEG-4000和/或棕櫚酸?？梢允褂帽旧暾埞_的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何氣體；然而，優(yōu)選惰性氣體，例如SF6或碳氟化合物，例如CF4、C3F8和C4F10。
使用已知的方法例如冷凍干燥或噴霧干燥粗磷脂在適合溶劑中的溶液或使用在EP 554213，US 5,413,774，US 5,578,292，EP 744962，EP 682530，US 5,556,610，US 5,846,518，US 6,183,725，EP 474833，US 5,271,928，US 5,380,519，US 5,531,980，US 5,567,414，US5,658,551，US 5,643,553，US 5,911,972，US 6,110,443，US6,136,293，EP 619743，US 5,445,813，US 5,597,549，US 5,686,060，US 6,187,288和US 5,908,610中描述的方法，由磷脂可制備優(yōu)選的微泡懸浮液，通過參考以其整體將它們并入本申請。最優(yōu)選地，將磷脂溶解在有機(jī)溶劑中并且不通過脂質(zhì)體形成階段干燥溶液。這可以通過將磷脂溶解在適合的有機(jī)溶劑，連同親水性穩(wěn)定劑物質(zhì)或既溶于有機(jī)溶劑又溶于水的化合物并且冷凍干燥或噴霧干燥所述溶液而被完成。在這種事實(shí)方案中，選擇親水性穩(wěn)定劑的標(biāo)準(zhǔn)是它在選擇的有機(jī)溶劑中的溶解度。可溶于水和有機(jī)溶劑中的親水性穩(wěn)定劑化合物的例子是例如聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)等，蘋果酸、乙醇酸(glycolic acid)、麥牙酚等。這類親水性化合物還有助于使微泡大小分布均勻化并且增加貯藏下的穩(wěn)定性?？墒褂萌魏芜m合的有機(jī)溶劑，只要它的沸點(diǎn)足夠低并且它的熔點(diǎn)足夠高以促進(jìn)后續(xù)干燥。典型的有機(jī)溶劑包括，例如二噁烷、環(huán)己醇、叔丁醇、四氯二氟亞乙基(C2Cl4F2)或2-甲基-2-丁醇，但是優(yōu)選2-甲基-2-丁醇和C2Cl4F2。
在通過分散在水性載體中形成微泡的懸浮液之前，將冷凍干燥或噴霧干燥的磷脂粉末與空氣或另一種氣體接觸。當(dāng)與水性載體接觸時(shí)，其結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破裂的粉末狀磷脂將形成層狀化部分，它將穩(wěn)定分散在其中的氣體微泡。這種方法允許產(chǎn)生微泡的懸浮液，該懸浮液是穩(wěn)定的，即使當(dāng)被貯藏長時(shí)期并且通過簡單溶解所需的層狀化磷脂(已在所需要的氣體下貯藏)，不用振動(dòng)或劇烈攪拌。
或者，可通過在高攪拌速度下將氣體懸浮在水溶液中制備微泡，如在WO 97/29783中公開的。制備微泡的進(jìn)一步方法被公開在共未決歐洲專利申請?zhí)?3002373，通過參考將其并入本申請，其包括在磷脂的存在下制備有機(jī)溶劑在適合水性介質(zhì)中的乳劑，隨后在任選的洗滌和/或過濾步驟后冷凍干燥所說的乳劑。
可將本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的添加劑包括在穩(wěn)定的微泡懸浮液中。例如，非成膜表面活性劑、包括聚氧化丙二醇和聚氧化二醇乙及相似的化合物，以及其各種共聚物；脂肪酸例如肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、或它們的衍生物，麥角甾醇，植物甾醇，谷甾醇，羊毛甾醇，生育酚，沒食子酸丙酯，棕櫚酸抗壞血酸酯和丁基化羥基甲苯可被添加。這些非成膜表面活性劑的量通常是以表面活性劑的總量計(jì)直到50％，但優(yōu)選以重量計(jì)在0和30％之間。
其它含氣體的懸浮液包括在例如，US 5,798,091和WO 97/29783中公開的那些，通過參考以其整體將它們并入本申請?？梢园凑赵赨S5,798,091或WO97/29783中所描述的制備這些物質(zhì)，通過參考以其整體將它們并入本申請。
另一種優(yōu)選的超聲造影劑包括微氣囊。術(shù)語“微氣囊”表示具有物質(zhì)邊界或外殼的充氣的物體。關(guān)于微氣囊制劑和制備方法的更多信息可在EP-A-0 324 938 US 4,844,882；US 5,711,933；US 5,840,275；US 5,863,520；US 6,123,922；US 6,200,548；US 4,900,540；US5,123,414；US 5,230,882；5,469,854；5,585,112；US 4,718,433；US 4774,958；WO9501187；US 5,529,766；US 5,536,490和US5,990,263中找到，通過參考以其整體將它們的每一篇并入本申請。
優(yōu)選的微氣囊具有包括生物可降解的生理學(xué)上相容的聚合物或生物可降解的固體脂質(zhì)的外殼。適用于本發(fā)明微氣囊制備的聚合物可以從生物可降解的生理學(xué)上相容的聚合物中選擇，例如在下面專利的任一篇中描述的那些的任一種EP 458745，US 5,711,933，US 5,840,275，EP 554213，US 5,413,774和US 5,578,292，通過參考以其整體將它們并入本申請。特別地，聚合物可以從生物可降解的生理學(xué)上相容的聚合物中選擇，例如低水溶解度的多糖類，聚丙交酯和聚乙交酯以及它們的共聚物，丙交酯和內(nèi)酯，例如ε-己內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯和多肽的共聚物。其它適合的聚合物包括聚(原酸)酯(參見例如，US 4,093,709；US 4,131,648；US 4,138,344；US 4,180,646)；聚乳酸和聚乙醇酸以及它們的共聚物，例如DEXON(參見J.Heller，Biomaterials 1(1980)，51；聚(DL-丙交酯-共-ε-己內(nèi)酯)，聚(DL-丙交酯-共-γ-戊內(nèi)酯)，聚(DL-丙交酯-共-γ-丁內(nèi)酯)，聚烷基氰丙烯酸酯；聚酰胺，聚羥基丁酸酯；聚dioxanone；聚-β氨基酮(A.S.Angeloni，P.Ferruti，M.Tramontini和M.Casolaro，The Mannich bases inpolymer synthesis3.Reduction of poly(beta-aminoketone)sto poly(gamma-aminoalcohol)s and their N-alkylation to poly(gamma-hydroxyquatemary ammonium salt)s，Polymer 23，pp1693-1697，1982.)；聚磷腈(Allcock，Harry R.Polyphosphazenesnew polymers with inorganic backbone atoms(Science 193(4259)，1214-19(1976))和聚酐。還可以按照WO-A-96/15815的方法制備本發(fā)明的微氣囊，通過參考將它并入本申請，其中微氣囊由包含生物可降解的脂質(zhì)的生物可降解膜制備，所述脂質(zhì)被選自一、二、三甘油酯、脂肪酸、甾醇、蠟和它們的混合物。優(yōu)選的脂質(zhì)是二或三甘油酯，例如二或三甘油肉豆蔻酸酯、二或三甘油棕櫚酸酯或者二或三甘油硬脂酸酯，特別是甘油三棕櫚酸酯或甘油三硬脂酸酯。
微氣囊可使用本申請公開的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何氣體；但是，優(yōu)選惰性氣體如氟化的氣體?？蓪⑽饽遗c任選的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的添加劑和穩(wěn)定劑一起懸浮在藥物上可接受的液體載體中。
其它的含氣體的造影劑制劑包括其中充氣的微粒(尤其微粒的聚集體)或與之有關(guān)的其它制劑(例如被吸收在其表面上和/或在空隙、腔或孔中含有的)。制備這些試劑的方法被描述在EP 0122624，EP0123235，EP 0365467，US 5,558,857，US 5,607,661，US 5,637,289，US 5,558,856，US 5,137,928，WO 9521631和WO 9313809中，通過參考以其整體將它們的每一篇并入本申請。
這些超聲組合物的任一種還應(yīng)該是，盡可能，與血液等滲。因此，在注射前，可將小量的等滲劑添加到上述超聲造影劑懸浮液的任一種中。所述等滲劑是在醫(yī)藥中通常使用的生理溶液并且它們包含鹽水溶液(0.9％NaCl)、2.6％甘油溶液、5％右旋糖溶液等。另外，超聲組合物可包括標(biāo)準(zhǔn)的藥物上可接受的添加劑，包括，例如，乳化劑、粘性調(diào)節(jié)劑、冷凍保護(hù)劑、lyoprotectants、填充劑等。
在適用于本發(fā)明的超聲造影劑中可使用任何生物相容的氣體。本申請使用的術(shù)語“氣體”包括在正常人體溫度下實(shí)質(zhì)上呈氣體形式的任何物質(zhì)(包括混合物)。氣體因此可以包括，例如空氣；氮?dú)?；氧氣；CO2；氬；氙或氪，氟化的氣體(包括例如，全氟化碳、SF6、SeF6)低分子量烴(例如，含有1至7個(gè)碳原子)，例如，烷例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷或戊烷，環(huán)烷例如環(huán)丙烷、環(huán)丁烷或環(huán)戊烷，烯例如乙烯、丙烯、丙二烯或丁烯、或炔例如乙炔或丙炔和/或它們的混合物。但是，優(yōu)選氟化的氣體。氟化的氣體包括含有至少一個(gè)氟原子的物質(zhì)，例如SF6、氟利昂(含有一個(gè)或多個(gè)碳原子和氟的有機(jī)化合物，即CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、CBrF3、CCI2F2、C2CIF5和CBrClF2)和全氟化碳。術(shù)語全氟化碳表示僅含有碳和氟原子的化合物并包括，特別是，飽和的、未飽和的和環(huán)狀全氟化碳。飽和的全氟化碳，其通常是優(yōu)選的，具有式CnFn+2，其中n是1至12，優(yōu)選2至10，最優(yōu)選3至8并且甚至更優(yōu)選3至6。適合的全氟化碳包括，例如CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、C5F12、C6F12、C7F14、C8F18和C9F20。最優(yōu)選地，氣體或氣體混合物包含SF6或選自由C3F8C4F8、C5F12、C6F12、C7F14、C8F18組成的組的全氟化碳，特別優(yōu)選C4F10。還參見WO 97/29783，WO98/53857，WO 98/18498，WO 98/18495，WO 98/18496，WO 98/18497，WO 98/18501，WO98/05364，和WO 98/17324。
在某些情況下，包括氣體物質(zhì)的前體(例如能夠在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化成氣體的物質(zhì)，經(jīng)常被稱為“氣體前體”)可能是理想的。優(yōu)選地氣體前體和其產(chǎn)生的氣體是生理上可接受的。氣體前體可以是pH-激活的、光-激活的、溫度激活的等。例如，某些全氟化碳可被用作溫度激活的氣體前體。這些全氟化碳，例如全氟五烷，具有高于室溫(或該物質(zhì)被生產(chǎn)和/或貯藏的溫度)但低于體溫的液/氣相轉(zhuǎn)變溫度；因此，它們經(jīng)歷相轉(zhuǎn)變并且在身體內(nèi)被轉(zhuǎn)化成氣體。
如所討論的，氣體可包括氣體的混合物。下面的組合是優(yōu)選的氣體混合物氣體(A)和(B)的混合物，其中，氣體(B)中的至少一種，以0.5-41％體積的量存在，具有大于80道爾頓的分子量并且是氟化的氣體，(A)選自由空氣、氧氣、氮?dú)?、二氧化碳和它們的混合物組成的組，混合物的平衡為氣體A。
因?yàn)槌曅∨菘纱笥诒旧暾埶枋龅钠渌蓹z測的標(biāo)記，為了增加所述物質(zhì)的導(dǎo)向效率，可將它們與許多化合物構(gòu)建體結(jié)合。與上述(或本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知)的超聲造影劑的連接可通過本發(fā)明的接頭和制備小泡所使用的物質(zhì)之間的共價(jià)鍵，或通過接頭，如前面所述的。
許多方法可被用于制備與化合物結(jié)合的微泡的懸浮液。例如，人們通過將5％(w/w)的N-MPB-PE(1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-4-(對-馬來酰亞胺-苯基丁酰胺)，(Avanti Polar-Lipids，Inc)摻入磷脂制劑中，可制備馬來酰亞胺衍生的微泡。然后，將本發(fā)明的巰基乙?；幕衔锏娜芤?10mg/mL在DMF中)添加到馬來酰亞胺衍生的微泡懸浮液中，所述巰基乙酰化的化合物的溶液已在去乙酰化溶液(50mM磷酸鈉、25mM EDTA、0.5M羥胺HCl，pH7.5)中被培育。在黑暗中培育后，在溫和的攪拌下，通過離心可純化與微泡結(jié)合的化合物。
可被用于微泡衍生化的化合物典型地包括下面的組分(a)疏水部分，與形成微泡或微氣囊的外殼的物質(zhì)相容，以允許化合物有效摻入小泡的外殼中；所說的部分典型地以脂質(zhì)部分(甘油二棕櫚酸酯、甘油二硬脂酸酯)為代表；以及(b)間隔區(qū)(典型地為不同分子量的PEG)，在一些情況中它可能是任選的(如果間隔區(qū)太長例如，微泡例如可存在被冷凍干燥的困難)或在一些其它情況下它是優(yōu)選的(例如當(dāng)用短間隔區(qū)與微泡結(jié)合時(shí)，肽可能更少活性)；以及(c)能夠與結(jié)合的肽上的相應(yīng)反應(yīng)部分反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)(例如具有半胱氨酸的-SH基團(tuán)的馬來酰亞胺)。
或者，可使用生物素/抗生物素蛋白制備與微泡綴合的化合物。例如，可使用如上制備的馬來酰亞胺激活的磷脂微泡懸浮液制備與抗生物素蛋白綴合的微泡，將其加入巰基乙酰化的抗生物素蛋白(它已被用去乙?；芤号嘤?。然后將本發(fā)明生物素化的化合物加入抗生物素蛋白綴合的微泡的懸浮液，得到與化合物綴合的微泡的懸浮液。
除非它含有超極性化的氣體，否則已知需要特殊的貯藏條件，本發(fā)明的冷凍干燥的殘余物可被貯藏和運(yùn)輸，不需要它環(huán)境的溫度控制并且特別是它可被供應(yīng)至醫(yī)院和醫(yī)生，用于現(xiàn)場形成立即可使用的可施用的懸浮液，不需要這類使用者有特殊的貯藏設(shè)施。優(yōu)選地在這樣的情況下，它可呈兩組分的試劑盒被供應(yīng)，所述試劑盒可包括兩個(gè)分開的容器或一種兩室容器。在前一種情況下，優(yōu)選地容器是常規(guī)的隔膜密封瓶，其中含有冷凍干燥的步驟b)殘余物的瓶被用隔膜密封，可使用任選預(yù)過濾的注射器通過隔膜注射載體液體。在這樣一種情況下，然后還將被用作第二組分的容器的注射器用于注射造影劑。在后一種情況下，優(yōu)選地所述雙室容器是兩室注射器，一旦冷凍干燥物被重構(gòu)然后適當(dāng)?shù)鼗旌匣驕睾偷卣駝?dòng)，可直接將容器用于注射造影劑。在兩種情況下，提供了指引或允許將足夠的泡形成性能量應(yīng)用至容器的內(nèi)容物的方法。但是，如上所注意到的，在按照本發(fā)明的穩(wěn)定的造影劑中，氣體微泡的大小實(shí)質(zhì)上獨(dú)立于被應(yīng)用至重構(gòu)干燥產(chǎn)品的振動(dòng)能量的量。因此，通常需要僅僅溫和的手振動(dòng)以得到可重復(fù)的具有一致微泡大小的產(chǎn)品。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，能夠以滅菌的方式用水溶液組合干燥粉末的其它兩室重構(gòu)系統(tǒng)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在這樣的系統(tǒng)中，如果將水相插入水不溶的氣體和環(huán)境之間，那將是特別有利的。當(dāng)形成造影劑必需的物質(zhì)不已經(jīng)存在于容器中時(shí)(例如在重構(gòu)過程中與磷脂連接的導(dǎo)向配體)，它可被用試劑盒的其它組分包裝，優(yōu)選以適合于促進(jìn)與試劑盒其它組分立即可用的組合的形式或容器。
不需要特殊的容器、瓶或連接系統(tǒng)；本發(fā)明可使用常規(guī)的容器、瓶或接管。唯一的要求是在塞子和容器之間好的密封。因此密封的質(zhì)量成為主要關(guān)注的事情；密封完整性的任何剝蝕將允許不希望的物質(zhì)進(jìn)入瓶中。除了確保滅菌性以外，真空保留是產(chǎn)品在環(huán)境或減少的壓力下塞好所必需的，以確保安全和適當(dāng)?shù)闹貥?gòu)。至于塞子，它可以是基于高彈體的化合物或多組分制劑，例如聚(異丁烯)或丁基橡膠。
可按照本發(fā)明的使用的超聲成像技術(shù)包括已知的技術(shù)，例如彩色多普勒，動(dòng)力多普勒，多普勒幅度、刺激的聲成像，以及二或三維成像技術(shù)。成像可以諧振(共振頻率)或基本模式完成，優(yōu)選第二諧振。
在超聲應(yīng)用中，由磷脂穩(wěn)定的微泡形成的造影劑可以，例如，以這樣的劑量被給予，以致注射的磷脂的量在0.1至200μg/kg體重，優(yōu)選約0.1至30μg/kg的范圍內(nèi)。含微氣囊的造影劑典型地以這樣的劑量給予，以致成壁聚合物或脂質(zhì)的量為約10μg/kg至約20mg/kg/體重。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本申請描述的超聲造影劑與與一種或多種由本發(fā)明的化合物(例如，本發(fā)明的接頭)構(gòu)成的化合物和導(dǎo)向肽，或其它診斷或治療部分綴合。導(dǎo)向超聲造影劑將定位在表達(dá)靶的組織的部位并且可被用于成像和/或治療這樣的組織。
7E.放射治療放射性同位素療法涉及以損傷或破壞靶組織的足夠的量給予放射標(biāo)記的化合物。給予化合物后(例如通過靜脈內(nèi)、皮下、或腹膜內(nèi)注射)，放射標(biāo)記的藥物優(yōu)先定位在疾病部位(在這種情況下，表達(dá)靶的腫瘤或組織)。一旦定位，放射標(biāo)記的化合物就用能量損傷或破壞發(fā)病的組織，所述能量是在被給予的同位素放射性衰變的過程中被釋放的。
成功的放射治療的設(shè)計(jì)涉及多種關(guān)鍵的因素1.輸送放射性至疾病部位的適合的導(dǎo)向基團(tuán)的選擇；2.釋放損傷所述疾病部位，不實(shí)質(zhì)性損傷鄰近正常組織的足夠能量的適合放射性核素的選擇；3.適合的導(dǎo)向基團(tuán)和放射性核素的組合的選擇，所述組合不會(huì)不利地影響這種綴合物定位在疾病部位的能力。關(guān)于放射性金屬，這經(jīng)常涉及螯合基團(tuán)，該螯合基團(tuán)與放射性核素緊密配位，與接頭結(jié)合，該接頭偶聯(lián)所說的螯合物至導(dǎo)向基團(tuán)，并且影響化合物的總體生物分布以使靶組織中的攝取最大化和使正常、非靶器官中的攝取最小化。
本發(fā)明提供了放射治療劑，通過導(dǎo)向基團(tuán)、放射性核素、金屬螯合物和接頭的適當(dāng)選擇，該放射治療劑滿足上述三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。
放射治療劑可含有螯合的3+金屬離子，該3+金屬離子來自被稱為鑭系元素的元素類(原子序數(shù)57-71)和它們的類似物(即M3+金屬例如釔和銦)。在這類中典型的放射性金屬包括同位素90-釔、111-銦、149-钷、153-釤、166-鏑、166-鈥、175-鐿和177-镥。所有這些金屬(以及在鑭系中的其它元素)具有非常相似的化學(xué)，因?yàn)樗鼈儽Ａ粼?3氧化態(tài)，并且優(yōu)選與配體螯合，該配體帶有硬(氧/氮)供體原子，以熟知的螯合物DTPA(二亞乙基三胺五乙酸)和聚氮雜-聚羧酸酯大環(huán)類例如DOTA(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’，N”，N-四乙酸)及其接近的類似物為代表。這些螯合配體的結(jié)構(gòu)，以其完全脫質(zhì)子化的形式顯示如下。
這些螯合配體使放射金屬膠囊化，通過多個(gè)氮和氧原子與它結(jié)合，因此防止了游離(未結(jié)合)的放射金屬釋放到體內(nèi)。這是重要的，因?yàn)樵隗w內(nèi)3+放射金屬從它們的螯合物的離解可能導(dǎo)致放射金屬在肝臟、骨和脾中的攝取[Brechbiel MW，Gansow OA，″Backbone-substituted DTPA ligands for90Y radioimmunothera y″，Bioconj.Chem.1991；2187-194；Li，WP，Ma DS，HigginbothamC，Hoffman T，Ketring AR，Cutler CS，Jurisson，SS，″Developmentof an in vitro model for assessing the in vivo stability oflanthanide chelates.″Nucl.Med.Biol.2001；28(2)145-154；Kasokat T，Urich K.Arzneim.-Forsch，″Quantification ofdechelation of gadopentetate dimeglumine inrats″.1992；42(6)869-76]。除非它特異地導(dǎo)向這些器官，這樣的非特異性攝取是非常不希望的，因?yàn)樗鼘?dǎo)致非靶組織的非特異性照射，這可能導(dǎo)致這樣的問題如由于骨髓照射的造血抑制。
關(guān)于放射治療應(yīng)用，可以使用本申請公開的治療放射性核素的任意螯合劑。但是，特別優(yōu)選DOTA螯合物的形式[Tweedle MF，GaughanGT，Hagan JT，″1-Substituted-1，4，7-triscarboxymethyl-1，4，7，10-tetraazacyclododecane and analogs.″US Patent 4,885,363，Dec.5，1989]，因?yàn)轭A(yù)料DOTA螯合物在體內(nèi)比DTPA或其它線性螯合物更少去螯合。
使DOTA型大環(huán)類通過接頭偶聯(lián)至導(dǎo)向基團(tuán)的一般方法(例如通過激活DOTA的羧酸酯的一種以形成活性酯，然后將它與接頭上的氨基反應(yīng)以形成穩(wěn)定的酰胺鍵)，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的(參見例如，Tweedle等美國專利4,885,363)。還可以在多氮雜環(huán)的骨架上被修飾的DOTA型大環(huán)上進(jìn)行偶聯(lián)。
用于特定放射治療應(yīng)用的適當(dāng)核素的選擇取決于許多因素，包括a.物理半衰期—這應(yīng)該足夠長以允許放射治療構(gòu)建體從放射性金屬和綴合物的合成和純化，以及所述構(gòu)建體向注射部位的輸送，在注射前沒有顯著的放射性衰變。優(yōu)選地，放射性核素應(yīng)具有約0.5和8天之間的物理半衰期。
b.來自放射性核素的發(fā)射能量—是粒子發(fā)射體(例如o發(fā)射體、β發(fā)射體和俄歇電子發(fā)射體)的放射性核素特別有用，因?yàn)樗鼈儼l(fā)射高能量粒子，該粒子在短距離內(nèi)沉積它們的能量，由此高度地局部損傷。特別優(yōu)選β發(fā)射的放射性核素，因?yàn)閬碜赃@些同位素的β粒子發(fā)射的能量在5至約150細(xì)胞直徑內(nèi)沉積。由這些核素制備的放射治療劑能夠殺滅發(fā)病的細(xì)胞(該發(fā)病的細(xì)胞相對接近它們的定位點(diǎn))，但不能前進(jìn)長距離損傷鄰近正常組織例如骨髓。
c.比活性(即每質(zhì)量放射性核素的放射性)—特別優(yōu)選具有高比活性的放射性核素(例如產(chǎn)生90-Y、111-In、177-Lu的發(fā)生器)。通過其產(chǎn)生的方法、被用于產(chǎn)生它的特定的靶和所討論的同位素的性質(zhì)測定放射性核素的比活性。
許多鑭系元素(lanthanides和lanthanoids)包括具有核性質(zhì)的放射性同位素，所述性質(zhì)使得它們適合于用作放射治療劑，因?yàn)樗鼈儼l(fā)射β粒子。這些中的一些列于下表中。
Pm钷，Sm釤，Dy鏑，Ho鈥，Yb鐿，Lu镥，Y釔，In銦制備放射性金屬例如β發(fā)射鑭系元素同位素對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的，并且在其它地方被描述[例如，ccutler CS，Smith CJ，Ehrhardt GJ.；Tyler TT，Jurisson SS，Deutsh E.“Current andpotential therapeutic uses of lanthanide radioisotopes.”Cancer Biother.Radiopharm.2000；15(6)531-545]。這些同位素中的許多可以相對低成本的高收率被生產(chǎn)，并且許多(例如，90-Y、149-Pm、177-Lu)可以接近無載體的比活性(即大量的原子是放射性的)被生產(chǎn)。因?yàn)榉欠派湫栽涌膳c它們的放射性類似物競爭與靶組織上的受體結(jié)合，高比活性放射性同位素的使用是重要的，以允許輸送盡可能高劑量的放射性至靶組織。還特別優(yōu)選含有錸(186-Re和188-Re)的β發(fā)射同位素的本發(fā)明放射治療劑衍生物。
8.劑量和添加劑關(guān)于本發(fā)明化合物的合適劑量方案對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來是已知的?？墒褂迷S多方法給予所述化合物，所述方法包括，但不限于，單次或多次IV或IP注射。就本發(fā)明的放射性藥物來說，人們給予一定量的放射性，該放射性足夠允許成像，或者在放射治療的情況下，引起靶GRP-R攜帶組織損傷或脫離，但不至于引起對非靶(正常組織)的實(shí)質(zhì)性損傷。上文討論了閃爍照相成像所需要的量和劑量。對于不同的構(gòu)建體，放射治療所需要的量和劑量也不同，取決于所使用的同位素的能量和半衰期、從身體的藥物的攝取和清除的程度以及腫瘤的質(zhì)量。通常，劑量可以從30-50mCi變化至直到約3居里的累積劑量。
可以將本發(fā)明的光學(xué)成像化合物單獨(dú)或作為組合物的部分給予患者，所述組合物含有其它組分例如賦形劑、稀釋劑、自由基清除劑、穩(wěn)定劑和載體，它們?nèi)慷际潜绢I(lǐng)域中已知的?？梢造o脈內(nèi)或腹膜內(nèi)將光學(xué)成像化合物給予患者。給予的化合物的量典型地將在大約0.01mg/kg至10.0mg/kg患者的體重的范圍內(nèi)。
在超聲應(yīng)用中，由磷脂穩(wěn)定的微泡形成的造影劑可以，例如，以這樣的劑量被給予，以致注射的磷脂的量在0.1至200μg/kg體重，優(yōu)選約0.1至30μg/kg的范圍內(nèi)。含微氣囊的造影劑典型地以這樣的劑量給予，以致成壁聚合物或脂質(zhì)的量為約10μg/kg至約20mg/kg體重。
就MRI來說，考慮到受試者將接受足以增強(qiáng)靶處的MR信號(hào)至少10％的造影劑劑量。注射包含MRI試劑的化合物后，將患者在MRI機(jī)器中掃描以測定含靶的任何位點(diǎn)的位置。在治療設(shè)置中，靶定位后，可以立即給予細(xì)胞毒性或治療劑，如果需要，可以隨后將患者掃描以使治療效果可視化。
本發(fā)明的藥物組合物可包括生理學(xué)上可接受的緩沖劑，以及典型的添加劑、賦形劑等。在放射性藥物的情況下，本發(fā)明的組合物可能需要輻射穩(wěn)定劑以防止在注射前對化合物的輻射分解損傷。輻射穩(wěn)定劑對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的，并且可以包括，例如，對-氨基苯甲酸、抗壞血酸、龍膽酸(gentistic acid)等。在共未決的臨時(shí)申請美國系列號(hào)60/489,850中討論了特別優(yōu)選的穩(wěn)定劑和制劑。
含有制備本發(fā)明診斷或治療劑需要的全部組分的單或多瓶試劑盒是本發(fā)明的組成部分。在本發(fā)明放射性藥物的情況下，這樣的試劑盒通常將包括制備放射性藥物需要的全部組分(放射性核素除外)。
例如，用于制備本發(fā)明放射性藥物的單瓶試劑盒優(yōu)選含有式M-N-O-P-Q的螯合物/接頭/導(dǎo)向肽綴合物、亞錫鹽的來源(如果需要還原，例如，當(dāng)使用锝時(shí))，或其它藥物上可接受的還原劑，并且被用藥物上可接受的酸或堿適當(dāng)?shù)鼐彌_以調(diào)節(jié)pH至約3至約9的值。使用的還原劑的量和類型將高度取決于要形成的交換絡(luò)合物的性質(zhì)。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說適當(dāng)?shù)臈l件是熟知的。優(yōu)選的是，試劑盒內(nèi)容呈凍干的形式。這樣的單瓶試劑盒可選擇地含有不穩(wěn)定的或交換的配體例如葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、甘露糖醇、蘋果酸鹽、檸檬酸或酒石酸并且還可含有反應(yīng)改進(jìn)劑例如二亞乙基三胺-五乙酸(DPTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)，或α、β或γ環(huán)糊精，它們起改進(jìn)終產(chǎn)物的放射化學(xué)純度和穩(wěn)定性。所述試劑盒還可以含有穩(wěn)定劑、膨脹劑例如甘露糖醇，它們被設(shè)計(jì)以有助于冷凍干燥過程，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它添加劑。
多瓶試劑盒優(yōu)選含有相同的一般組分，但在重構(gòu)所述放射性藥物中使用多于一個(gè)的瓶。例如。一個(gè)瓶可以含有在添加高锝酸鹽(例如亞錫來源或其它還原劑)時(shí)形成不穩(wěn)定的Tc(V)絡(luò)合物所需要的全部成分。向該瓶中添加高锝酸鹽，在等待一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，將該瓶的內(nèi)容物添加到第二瓶中，該第二瓶含有螯合物和導(dǎo)向肽以及適合調(diào)節(jié)pH至其最適值的緩沖劑。在約5至60分鐘的反應(yīng)時(shí)間后，形成了本發(fā)明的絡(luò)合物。將這種多瓶試劑盒的兩瓶的內(nèi)容物凍干是有利的。如上所述，反應(yīng)改進(jìn)劑、交換配體、穩(wěn)定劑、膨脹劑等可以存在于其中一瓶或兩瓶中。
化合物的一般制備可通過不同的方法制備本發(fā)明的化合物，這取決于所選擇的診斷或治療部分?？赏ㄟ^在肽合成領(lǐng)域中通常建立和已知的技術(shù)，例如固相肽合成(SPPS)方法，最方便地制備所述化合物的肽部分。因?yàn)榭砂凑展滔嗪铣商幚恚褂媒惶娴腇MOC保護(hù)和脫保護(hù)是優(yōu)選的制備短肽的方法。優(yōu)選重組DNA技術(shù)用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)及其長的片段。
固相肽合成涉及向生成的肽鏈分步添加氨基酸殘基，所述肽鏈與不可溶性的支持物或基質(zhì)，例如聚苯乙烯連接。首先將所述肽的C-末端殘基與商業(yè)上可獲得的支持物錨定，其氨基用N-保護(hù)劑例如叔丁氧羰基(Boc)或芴甲氧基羰基(Fmoc)保護(hù)。在Boc或Fmoc的哌啶的情況下用適合的脫保護(hù)劑例如TFA去除所述氨基保護(hù)基團(tuán)并與偶聯(lián)劑例如二環(huán)碳二亞胺(DCC)一起添加下一個(gè)氨基酸殘基(呈N-保護(hù)的形式)。形成肽鍵后，從支持物上洗滌試劑。添加最后的殘基后，用適合的試劑例如三氟乙酸(TFA)或氟化氫(HF)從支持物上裂解所述肽。
實(shí)施例下面的實(shí)施例提供了不同方法的例子，所述方法可被用來制備本發(fā)明的各種化合物。在每個(gè)實(shí)施例中，有以單一粗體大寫字母(例如，A、B、C)鑒別的化合物，該化合物與所鑒別的附圖中相同標(biāo)記的對應(yīng)化合物相關(guān)聯(lián)。實(shí)施例I至VII是預(yù)言性的。
一般實(shí)驗(yàn)描述A.使用的縮寫的定義整個(gè)說明書中使用下面通用的縮寫1，1-二甲基乙氧羰基(Boc或Boc)；9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；1-羥基苯并三唑(HOBT)；N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)；N-甲基吡咯烷酮(NMP)；乙酸酐(Ac2O)；(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環(huán)己-1-基)-3-甲基丁基(iv-Dde)；三氟乙酸(TFA)；試劑B(TFA∶HO∶苯酚∶三異丙基硅烷，88∶5∶5∶2)；二異丙基乙胺(DIEA)；O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸)(HBTU)；O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3四甲基脲六氟磷酸)(HATU)；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)；固相肽合成(SPPS)；
二甲亞砜(DMSO)；二氯甲烷(DMF)；二甲基甲酰胺(DMF)；二甲基乙酰胺(DMA)；異丁基氯甲酸酯(IBCF)；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)；三異丙基硅烷(TIPS)；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)(1R)-1-[1，4，7，10-四氮雜-4，7，10-三(羧甲基)環(huán)十二烷基]乙烷-1，2-二羧酸)(CMDOTA)；胎牛血清(FBS)；人血清白蛋白(HSA)；人前列腺細(xì)胞系(PC3)；放射化學(xué)純度(RCP)；高效液相色譜法(HPLC)，以及磁共振成像(MRI)。
B.材料使用的Fmoc保護(hù)的氨基酸購自NovaBiochem(San Diego，CA，USA)、Advanced Chem Tech(Louisville，KY，USA、ChemImpexInt ernational(Wood Dale Ill.，USA)和Multiple Peptide Systems(San Diego，CA，USA)。合成所需要的其它化學(xué)物、試劑和吸附劑從Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，WI，USA)和VWR ScientificProducts(Bridgeport，NJ.，USA)獲得。用于肽合成的溶劑從PhmarcoCo.(Brookfield CT.，USA)。用于HPLC分析和純化的柱從WatersCo.(Milford，MA.，USA)。關(guān)于不可商業(yè)獲得的那些的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)給出如下。
C.用于肽合成的儀器使用Advanced Chem Tech 496ΩMOS合成儀、Advanced Chem TechFBS合成儀和/或通過手動(dòng)肽合成制備了肽。然而使用的重復(fù)的脫保護(hù)和鏈延伸的方案對所有都是相同的。
D.分析和純化使用的儀器使用Sh imzdzu-LC-10A雙泵梯度分析LC系統(tǒng)進(jìn)行分析性HPLC，所述系統(tǒng)利用Shimadzu-Class軟件4.1版本進(jìn)行系統(tǒng)控制、數(shù)據(jù)獲取和后運(yùn)行處理。在Hewlett-Packard Series 1100MSD質(zhì)譜儀上獲取質(zhì)譜，該質(zhì)譜儀耦合有Hewlett-Packard Series 1100雙泵梯度HPLC分析系統(tǒng)，該HPLC分析系統(tǒng)配置有Agilent Technologies 1100自動(dòng)進(jìn)樣器，該自動(dòng)進(jìn)樣器適合于直接流量注射或注射到WatersAssociates Xterra MS C18柱(4.6mm×50mm，5μm顆粒，120?？?。通過使用用于樣品提交的‘MSD Anyone’軟件的HP Kayak工作站和用于儀器控制和數(shù)據(jù)獲取的HP化學(xué)工作站軟件驅(qū)動(dòng)儀器。在大多數(shù)情況下，通過使用濃度為1mg/ml樣品溶液的5μl注射的直接注射引入樣品并使用正離子電噴霧分析以獲得m/e和m/z(多電荷)離子，用于結(jié)構(gòu)的證實(shí)。以500MHz在Varian Innova分光計(jì)上獲得了1H-NMR譜。以125.73MHz在相同的儀器上獲得了13C-NMR譜。一般地殘留1H吸收，或在13C-NMR譜的情況下，使用溶劑的13C吸收被用作內(nèi)參考；在其他的情況下使用四甲基硅烷(δ＝0.00ppm)。以δ單位給出共振值。從Quantitative Technologies Inc.Whitehouse NJ.獲得微分析數(shù)據(jù)。在Shimadzu-LC-8A雙泵梯度制備性HPLC分析系統(tǒng)進(jìn)行制備性HPLC，該HPLC分析系統(tǒng)使用Shimadzu-ClassVP軟件4.3版本用于系統(tǒng)控制、數(shù)據(jù)獲取、級(jí)分收集和后運(yùn)行處理。
E.肽合成的固體支持物使用Rink Amide-Novagel HL樹脂(0.6mmol/g作為固體支持物。)F.偶聯(lián)方法在典型的實(shí)驗(yàn)中，將第一個(gè)氨基酸裝載在0.1g的樹脂(0.06mmol)上。將合適的在NMP(0.25M溶液；0.960mL中的Fmoc保護(hù)的氨基酸添加到所述樹脂中接著添加N-羥基苯并三唑(NMP中的0.5M；0.48mL)，將反應(yīng)部件(在自動(dòng)肽合成的情況下)和單個(gè)反應(yīng)瓶(在手動(dòng)肽合成的情況下)振搖約2分鐘。向上述混合物中，添加二異丙基碳二亞胺(NMP中的0.5M；0.48mL)并在環(huán)境溫度下振搖反應(yīng)混合物4小時(shí)。然后將反應(yīng)部件或單個(gè)反應(yīng)瓶通過應(yīng)用正壓的干氮?dú)馇逑捶磻?yīng)物。
G.洗滌方法將反應(yīng)部件的每孔填充1.2mL的NMP并振搖部件5分鐘。在正壓的氮?dú)庀屡懦芤?。重?fù)該方法三次。在使用單個(gè)瓶的手動(dòng)合成的情況下，用合適體積的NMP，使用相同的方法。
H.Fmoc基團(tuán)的去除用1.5mL 20％的DMF中的哌啶(v/v)處理含有Fmoc保護(hù)的氨基酸的樹脂并振搖反應(yīng)部件或單個(gè)手動(dòng)反應(yīng)瓶15分鐘。從樹脂中排除溶液。重復(fù)該方法一次并使用上述洗滌方法洗滌所述樹脂。
I.配體(DOTA和CMDOTA)的最后偶聯(lián)將樹脂結(jié)合肽接頭構(gòu)建體的N-末端氨基去封閉并洗滌樹脂。制備0.25M期望的配體和HBTU在NMP中的溶液，并且用兩倍等價(jià)的DIEA處理。將得到的激活的配體的溶液添加到樹脂(1.972mL；0.48mmol)中并在環(huán)境溫度下振搖反應(yīng)混合物24-30小時(shí)。排出溶液并洗滌樹脂。用1.5mL二氯甲烷(3X)進(jìn)行樹脂的最后洗滌。
J.最終肽的脫保護(hù)和純化將試劑B(2mL；88∶5∶5∶2-TFA∶苯酚∶水∶TIPS)的溶液添加到樹脂中并在環(huán)境溫度下哲搖反應(yīng)部件或單個(gè)瓶4.5小時(shí)。將得到的含有脫保護(hù)肽的溶液排入瓶中。用1mL的試劑B再重復(fù)該方法兩次。使用Genevac HT-12系列離心濃縮儀在減壓下濃縮合并的濾液。然后用2mL的Et2O研制每瓶中的殘余物并潷析上清夜。重復(fù)該方法兩次以提供無色固體形式的肽。將粗肽溶解在水/乙腈中并使用Waters Xterra MSC18ODS柱(50mm×19mm，5微米顆粒大小，120?？状笮?或Waters-YMC C18 ODS柱250mm×30mm i.d.，10微米粒子大小。120?？状笮?純化。收集具有產(chǎn)品的級(jí)分并通過HPLC分析。集合具有＞95％純度的級(jí)分并通過凍干分離所述肽。
制備性HPLC(Waters Xterra柱)的條件
洗脫速度50mL/min檢測UV，λ＝220nm洗脫劑A0.1％aq.TFA；溶劑B乙腈(0.1％TFA)。
條HPLC分析的條件柱Waters Xterra(Waters Co.；4.6×50mm；MS C18；5微米粒子，120埃)。
洗脫速度3mL/min；檢測UV，λ＝220nm洗脫劑A0.1％aq.TFA；溶劑B乙腈(0.1％TFA)。
實(shí)施例1-圖14-[[(3β，5β，12α)-23-[1，1-二甲基乙烷-1-(氧羰基)]-12-羥基-24-降膽烷-3-基]氨基]-4-氧代丁酸N-羥基琥珀酰亞胺基酯(化合物A-OSu)的合成按照由R.P.bONAR-Law等(J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，22451990)報(bào)道的膽酸酯化的方法，將脫氧膽酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的叔丁基酯1。應(yīng)用由P.L.Anelli等(Sybth.Commun.1998，28，109-117)開發(fā)的一點(diǎn)Mitsunobu-Staudinger方法，將化合物1轉(zhuǎn)變成3β-氨基衍生物2。
在三乙胺的存在下，將氨基酯2與THF中的等克分子量的琥珀酸酐反應(yīng)。在酸(適量HCl)混合(work up)后，用EtOAc提取混合物。將有機(jī)相蒸發(fā)至干并通過急驟色譜法純化殘余物得到衍生物3。收率55％。
在室溫下將酸3與在THF和乙腈混合物中的N-羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳二亞胺反應(yīng)。二環(huán)己基脲沉淀后，將混合物過濾并蒸發(fā)以提供粗化合物A-OSu，該化合物沒有進(jìn)一步純化被用于下面的步驟中。
實(shí)施例II-圖2牛NεB29-[4-[[(3β，5β，12α)-23羧基-12-羥基-24-降膽烷-3-基]氨基]-4-氧代丁酰基]-胰島素(化合物B)的合成按照Naithani V.K.& Gattner H.-G.Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.349，373-384，1968，制備NαA1，NαA2-二檸康酰(dicitraconyl)-胰島素(牛)。向NαAl，NαA2-二檸康酰-胰島素(14μmol)在24mL二甲基甲酰胺中的溶液中添加在1.2mL二甲基甲酰胺中的三乙胺(92.7μmol)。添加在1mL二甲基甲酰胺中的化合物A-OSu(79μmol)并允許反應(yīng)混合物在室溫下進(jìn)行30分鐘。用1M乙酸酸化反應(yīng)混合物并在1M乙酸中在Sephadex G-25(2×70em)上色譜分離。采集蛋白質(zhì)峰級(jí)分并凍干。在甲酸pH 3.5中72小時(shí)獲得去檸康?；?，接著重新凍干。按照RadolaBiochem.Biophys.Acta295，412-428，1973(但如洗滌凝膠介質(zhì)，使用UltradexTM(AmershamBiosciences Inc.))，通過在平板凝膠穩(wěn)定層中的制備性等電聚焦分級(jí)分離所述物質(zhì)。將凝膠懸浮在5M脲(用混合的層(bed)樹脂純化的)中并添加載體兩性物(2％)，pH 4至6。將於漿置于平板(Desaga/Brinkmann)(20×20cm)，從陰極應(yīng)用樣品2cm，并且在1-4℃冷卻板(Hormuth/Brinkmann)上在25至30V/cm下18至24小時(shí)獲得聚焦。形成了可視(折射性)帶，以及在凝膠樣品在水中稀釋后測定帶中的pH。主要的帶對應(yīng)于pH 5.1，，即具有用化合物A選擇性修飾LysεB29的胰島素的期望的pH。通過用三層體積的1M乙酸稀釋，從凝膠中回收主要的帶中的物質(zhì)。通過在1M乙酸中的SephadexG-25(2×70cm)上的色譜法去除脲并凍干蛋白質(zhì)級(jí)分。在室溫下將蛋白質(zhì)溶解在并裝載在7M脲，0.001MTris/HCl，pH 8.3中的DEAE-纖維素DE52(0.9×25cm)色譜柱上。用形成線性NaCl梯度(0至0.15M)的相同緩沖液洗脫柱。收集6.1mL的級(jí)分。收集主要的峰，在1M乙酸中在Sephadex G-25(2.5×70cm)柱上脫鹽并凍干蛋白質(zhì)級(jí)分。通過溶解在三氟乙酸中裂解叔丁基酯。蒸發(fā)三氟乙酸后，將蛋白質(zhì)(化合物B)溶解在1M乙酸中并凍干。按照Davis B.J.Am.N.Y.Acad.Sci.121，404-427，1964的分析性聚丙烯酰胺圓盤凝膠電泳，證實(shí)物質(zhì)的同質(zhì)性。離子噴霧質(zhì)譜法顯示出期望的化合物B的正確分子量?；衔顱包含與本發(fā)明膽酸衍生物接頭連接的治療部分(胰島素分子)。
實(shí)施例III-圖3和4(3β，5β，12α)-3-[[3，5-雙[[4-[(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1，4-二氧代丁基]氨基]苯甲?；鵠氨基-12-羥基膽烷-24-酸1，1-二甲基乙基酯(化合物C-(OSu)2)的合成將3，5-二硝基苯甲?；然?(商業(yè)產(chǎn)品)在無氯仿的乙醇中的溶液滴加至(3β，5β，12α)-3-氨基-12羥基膽烷酸叔丁基酯2在無氯仿的乙醇和三乙胺的溶液中。反應(yīng)完全后，混合物用水洗滌、干燥(Na2SO4)、過濾并蒸發(fā)。通過用硅膠的急驟色譜法純化粗的濾液得到純化合物3，用乙醇中的鈀(10％在活性炭上)氫化化合物3得到化合物4。將化合物4溶解在二氯甲烷中并與兩摩爾當(dāng)量的湖琥珀酸酐反應(yīng)。然后在1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)的存在下，將中間體二酸在無氯仿的乙醇中與N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)反應(yīng)。反應(yīng)完全后，混合物用水洗滌、用Na2SO4干燥、過濾并蒸發(fā)得到化合物5＝C-(OSu)2。
B.牛1-[[(3β，5β，12α)-23-[(1，1-二甲基)乙氧基羰基]-12-羥基-24-降膽烷-3-基]氨基]羰基-3，5-雙[[4-(胰島素-NBε29-基)-1，4-二氧代丁基]氨基]苯(化合物D)(圖4)按照Naitbani V.K.& Gattner H.-G.Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.349，373-384，1968制備NαA1，NαA2-二檸康酰-胰島素(牛)。向NαA1，NαA2-二檸康酰-胰島素(28μmol)在48mL二甲基甲酰胺中的溶液中添加在2.4mL二甲基甲酰胺中的三乙胺(185μmol)。添加在2mL二甲基甲酰胺中的化合物A-(Osu)2(14μmol)并允許反應(yīng)混合物在室溫下進(jìn)行30分鐘。反應(yīng)混合物用1M乙酸酸化并在1M乙酸中在Sephadex G-25(2×70cm)上色譜分離。采集蛋白質(zhì)峰級(jí)分并凍干。在甲酸pH 3.5中72小時(shí)獲得去檸康酰化，接著重新凍干。通過溶解在三氟乙酸中裂解叔丁基酯。蒸發(fā)三氟乙酸后，將蛋白質(zhì)溶解在1M乙酸中并通過在1M乙酸中在Sephadex G-50(2×70cm)上的色譜法分級(jí)分離。收集并凍干具有最大尺寸的分子的蛋白質(zhì)峰。在相同的柱上再分級(jí)分離一次。凍干分級(jí)分離的蛋白質(zhì)。離子噴霧質(zhì)譜法顯示了期望的化合物D的正確分子量?；衔顳包含與本發(fā)明的接頭連接的治療部分(胰島素分子)，它與另一個(gè)治療部分(胰島素分子)連接。
實(shí)施例IV用125I標(biāo)記化合物B和D通過在Lipkin E.W.，Teller D.C.& Haen C.J.Biol.Chem.261，1694-1701，1986中描述的或在本申請中描述的方法，實(shí)現(xiàn)了用125I標(biāo)記化合物B和D。
實(shí)施例V化合物B和D與人血清白蛋白的結(jié)合按照Whitlam J.B.& Brown K.F.J.Pharm. Sci.70，146-150，1981，應(yīng)用在0.6mM人血清白蛋白中的1nM牛胰島素溶液，摻有125I標(biāo)記的胰島素，通過超濾測定與人血清白蛋白的結(jié)合。明顯的是，相對于天然胰島素的腎排除，這樣的對白蛋白的結(jié)合將減少經(jīng)修飾的胰島素(化合物B和D)的腎排除。
實(shí)施例VI化合物B和D的生物活性已知與抗生物素蛋白與鐵蛋白的的1∶1綴合物結(jié)合的NεB29-生物素胰島素，四個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)中的三個(gè)被生物素占據(jù)，對于大鼠附睪脂肪細(xì)胞中的葡萄糖氧化的激活具有相同的劑量反應(yīng)曲線(May J.M.，Williams R.H.& de Haen C.J.Biol.Chem.253，686-690，1978)。使用其中描述的脂肪細(xì)胞試驗(yàn)，它涉及在含有血清白蛋白的緩沖液中的培育，顯示化合物B和D具有與天然胰島素相同的活性。結(jié)合減少的腎排除，這種性質(zhì)使得胰島素的化合物B和D形式具有延長的血漿半衰期，與不含有本發(fā)明接頭的化合物相比，提供了改進(jìn)的藥物動(dòng)力學(xué)特性。
實(shí)施例VII-圖5A-B111In-標(biāo)記的胰島素脫氧膽酸綴合物(化合物111In-F)的合成A.牛1-[[(3β，5β，12α)-23-[(1，1-二甲基)乙氧基羰基]-12-羥基-24-降膽烷-3-基]氨基]羰基-3-[[4-(胰島素-NεB29-基)-1，4-二氧代丁基]氨基]-5-[[[[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷基]乙?；鵠氨基]乙基]氨基]-1，4-二氧代丁基]氨基]苯的合成。(化合物F)按照Margerum，L.；Campion，B.；Fellmann，J.D.；Garrithy，M.；Varadarjan，J.PCT國際申請WO9528967，合成了N1，N4，N7-三醋酸根-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N10-(2-乙酰氨基乙胺)(化合物E)(圖5A)。按照Naithani V.K.& Gattner H.G.Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.349，373-384，1968制備了NaA1，NaA2-二檸康酰-胰島素(牛)。向NaA1，NaA2-二檸康酰-胰島素(28μmol)在48mL中二甲基甲酰胺的溶液中添加在2.4mL二甲基甲酰胺中的三乙胺(185μmol)。添加在2mL二甲基甲酰胺中的化合物C-(OSu)2(見實(shí)施例III)(140μmol)并在室溫下讓反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行30分鐘。然后添加在2mL二甲基甲酰胺中的化合物E(280μmol)并在室溫下讓反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行30分鐘。反應(yīng)混合物用1M乙酸酸化，使用具有1000標(biāo)稱切割分子量的透析膜用1M乙酸徹底透析。凍干存留液。在甲酸pH 3.5中72小時(shí)實(shí)現(xiàn)去檸康?；?，接著重新凍干。通過溶解在三氟乙酸中裂解叔丁基酯。蒸發(fā)三氟乙酸后，將蛋白質(zhì)溶解在1M乙酸中并通過在1M乙酸中在Sephadex G-50上的色譜法分級(jí)分離。收集主要的蛋白質(zhì)峰并凍干。然后在相同的柱上再分級(jí)分離一次所述物質(zhì)。凍干分級(jí)分離的蛋白質(zhì)。離子噴霧質(zhì)譜法顯示了期望的化合物F的正確分子量。(圖5B)?；衔颋包含與膽酸衍生物接頭連接的治療部分(胰島素分子)，所述接頭與診斷部分(金屬螯合劑)連接。
B.111In標(biāo)記的化合物F(化合物111In-F)的合成向適合用400μL自動(dòng)進(jìn)樣器插頭的5mL玻璃瓶中添加100μL溶解在0.2M NaOAc緩沖液(pH 4.8)與DMF的9∶1混合物中的化合物F的1mg/mL溶液。添加在0.05N HCl中的111InCl3[1.5mCi]，卷曲密封反應(yīng)瓶并在45℃下將溶液加熱30分鐘。冷卻至室溫后，通過反相HPLC，在V ydac C-18肽和蛋白質(zhì)柱[4.6×250mm；孔徑5微米；流速1.5mL/min，在30℃下]上，使用0.1％三氟乙酸在H2O中/0.085％三氟乙酸在乙腈中的水性/有機(jī)梯度，純化標(biāo)記混合物的等份樣。將對應(yīng)于111In標(biāo)記的化合物F的峰收集到含有0.2％人血清白蛋白的0.5mL的50mM檸檬酸鹽緩沖液，pH 5.7中，接著在減壓下使用Savant Speed Vacuum裝置去除乙腈。
實(shí)施例VIII-圖6A-BL62的合成概要如圖6A-B中所示，使用下面的步驟制備了L62用NaOH水解(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸甲基酯A得到相應(yīng)的酸B，然后將B與Fmoc-Cl 反應(yīng)得到中間體C。隨后將用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14][SEQ ID NO1])功能化的Rink酰胺樹脂與C、Fmoc-甘氨酸和DOTA三-叔丁基酯反應(yīng)。用試劑B裂解和脫保護(hù)后，通過HPLC純化粗產(chǎn)物得到L62。總收率2.5％。更詳細(xì)的內(nèi)容提供如下A.用鈴蟾肽[7-14]，(A)功能化的Rink酰胺樹脂在固相肽合成容器(見附件No.1)中，向Rink酰胺NovaGelTM樹脂(10g；6.0mmol)A在DMF(45mL)中的懸浮液中連續(xù)地添加Fmoc-氨基酸(24mmol)、N-羥基苯并三唑(HOBt)(3.67g；24mmol)和N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)(3.75mL；24mmol)。使用長操作臺(tái)面振動(dòng)器在室溫下振動(dòng)混合物3小時(shí)，然后倒空溶液并用DMF(5×45mL)洗滌樹脂。用在DMF(45mL)中的25％哌啶振動(dòng)樹脂4分鐘，倒空溶液并添加新鮮的在DMF(45mL)中的25％哌啶。振動(dòng)懸浮液10分鐘，然后倒空溶液并用DMF(5×45mL)洗滌樹脂。
連續(xù)地將這種方法應(yīng)用于下面的氨基酸N-α-Fmoc-L-甲硫氨酸、N-α-Fmoc-L-亮氨酸、N-α-Fmoc-N-im-三苯甲基-L-組氨酸、N-α-Fmoc-甘氨酸、N-α-Fmoc-L-纈氨酸、N-α-Fmoc-N-in-Boc-L-色氨酸。
在最后的偶聯(lián)反應(yīng)中，向在DMF(45mL)中的樹脂中添加N-α-Fmoc-N-γ-三苯甲基-L-谷氨酸(14.6g；24mmol)、HOBt(3.67g；24mmol)和DIC(3.75mL；24mmol)。在室溫下振動(dòng)混合物3小時(shí)，然后倒空溶液，用DMF(5×45mL)洗滌樹脂并真空干燥。
B.中間體B和C的制備1.(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸(B)的合成在45℃下，向(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸甲基酯(5.0g；12.8mmol)的MeOH(65mL)溶液中滴加1M的NaOH溶液(16.6mL；16.6mmol)。在45℃下攪拌3小時(shí)后，將混合物濃縮至25mL并添加H2O(40mL)和1M HCl(22mL)。過濾、用H2O(2×50mL)洗滌并真空干燥沉淀的固體，得到白色的固體的B(5.0g；13.3mmol)。收率80％。
2.(3β，5β)-3-(9H-芴-9-基甲氧基)氨基膽烷-24-酸(C)的合成向在0℃下攪拌的(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸B(1.0g；2.66mmol)在10％含水Na2CO3(16mL)和1，4-二噁烷(9mL)中的懸浮液中滴加9-芴基甲氧基羰基氯化物(0.76g；2.93mmol)的1，4-二噁烷(9mL)溶液。在室溫下6小時(shí)攪拌后，添加水(90mL)，用Et2O(2×90mL)洗滌水相，然后添加2MHCl(15mL)(最終pH1.5)。用EtOAc(2×100mL)提取水相，有機(jī)相用Na2SO4干燥并蒸發(fā)。通過急驟色譜法純化粗產(chǎn)物得到白色的固體的C(1.2g；2.0mmol)。收率69％。
C.L62(N-[(3β.5β)-3-[[[[[4.7.10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1基]乙?；鵠氨基]乙?；鵠氨基]-膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺)合成用在DMA(7mL)中的50％嗎啉在固相肽合成容器中振動(dòng)樹脂A(0.5g；0.3mmol)10分鐘，倒空溶液并添加新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。振動(dòng)懸浮液20分鐘，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。向樹脂中添加(3β，5β)-3-(9H-芴-9基甲氧基)氨基膽烷-24-酸C(0.72g；1.2mmol)、N-羥基苯并三唑(HOBT)(0.18g；1.2mmol)、N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)，在室溫下振動(dòng)混合物24小時(shí)，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。然后用在DMA(7mL)中的50％嗎啉振動(dòng)樹脂10分鐘，倒空溶液，添加新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉并振動(dòng)混合物另外20分鐘。然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。向樹脂中添加N-α-Fmoc-甘氨酸(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)。在室溫下振動(dòng)混合物3小時(shí)，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。然后用在DMA(7mL)中的50％嗎啉振動(dòng)樹脂10分鐘，倒空溶液，添加新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉并振動(dòng)混合物另外20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂，接著向樹脂中添加1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DI C(0.19mL1.2mmol)、DIEA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)的加合物。在室溫下振動(dòng)混合物24小時(shí)，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹脂并真空干燥。在具有試劑B(25mL)的燒瓶中振動(dòng)樹脂4.5小時(shí)。過濾樹脂并在減壓下蒸發(fā)溶液得到用Et2O(20mL)研制的油狀粗產(chǎn)物。通過離心收集沉淀并用Et2O(3×20mL)洗滌，然后通過HFLC分析并通過制備性HPLC純化。冷凍干燥含有產(chǎn)物的級(jí)分得到白色的固體的L62(6.6mg；3.8×10-3mmol)。收率4.5％。
實(shí)施例IX-圖7A-EL67的合成概要用NaOH水解(3β，5β)-3-氨基-12-氧代膽烷-24-酸甲基酯A得到相應(yīng)的酸B，然后將B與Fmoc-甘氨酸反應(yīng)得到中間體C。隨后將用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14][SEQ IDNO1])功能化的Rink酰胺樹脂與C和DOTA三-叔丁基酯反應(yīng)。用試劑B裂解和脫保護(hù)后，通過HPLC純化粗產(chǎn)物得到L67?？偸章?.2％。
A.合成(3β，5β)-3-氨基-12-氧代膽烷-24-酸，B(圖7A)在45℃下，向(3β，5β)-3-氨基-12-氧代膽烷-24-酸甲基酯A(2.1g；5.1mmol)在MeOH(15mL)中的溶液中滴加1M NaOH溶液(6.6mL；6.6mmol)。在45℃下攪拌3小時(shí)后，將混合物濃縮至25mL，然后添加H2O(25mL)和1M HCl(8mL)。過濾、用H2O(2×30mL)洗滌并真空干燥沉淀的固體，得到白色的固體的B(1.7g；4.4mmol)。收率88％。
B.(3β.5β)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-12-氧代膽烷-24-酸(C)的合成(圖7A)向在0℃下攪拌的N-α-Fmoc-甘氨酸(0.9g；3.1mmol)的THF(25mL)的溶液中滴加三丁基胺(0.7mL；3.1mmol)。隨后添加氯甲酸異丁基酯(0.4mL；3.1mmol)，10分鐘后，1小時(shí)內(nèi)，向冷卻的溶液中滴加三丁基胺(0.6mL；2.6mmol)和(3β，5β)-3-氨基-12-氧代膽烷-24-酸B(1.0g；2.6mmol)在DMF(30mL)中的懸浮液。讓混合物溫?zé)岵⒃?小時(shí)將溶液濃縮至40mL，然后添加H2O(50mL)和1M HCl(10mL)(最終pH1.5)。過濾、用H2O(2×50mL)洗滌、真空干燥并通過急驟色譜法純化沉淀的固體，得到白色的固體的C(1.1g；1.7mmol)。收率66％。
C.L67(N-[(3β，5β)-3-[[[[[4.7.10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]-12，24-二氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺)的合成(圖7B和7E)用在DMA(7mL)中的50％嗎啉在固相肽合成容器中振動(dòng)樹脂D(0.5g；0.3mmol)10分鐘，倒空溶液并添加新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。攪拌懸浮液20分鐘，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。向樹脂中添加(3β，5β)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基]-12-氧代膽烷-24-酸C(0.80g；1.2mmol)、N-羥基苯并三唑(HOBT)(0.18g；1.2mmol)、N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)，在室溫下振動(dòng)混合物24小時(shí)，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。用在DMA(7mL)中的50％嗎啉振動(dòng)樹脂10分鐘，倒空溶液，添加新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉并振動(dòng)混合物另外20分鐘。然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。向樹脂中添加1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、DI EA(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)的加合物。在室溫下振動(dòng)混合物24小時(shí)，倒空溶液，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹脂并真空干燥。在具有試劑B(25mL)的燒瓶中振動(dòng)樹脂4.5小時(shí)。過濾樹脂并在減壓下蒸發(fā)溶液得到用Et2O(20mL)研制的油狀粗產(chǎn)物。L67包含與膽酸衍生物接頭連接的診斷部分(金屬螯合劑)，其與導(dǎo)向肽(BBN[7-14])連接。
實(shí)施例X-圖8A-HL63和L64的合成概要用NaOH水解(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲基酯1b得到中間體2b，然后將2b與Fmoc-甘氨酸反應(yīng)得到3b。將用八肽Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(BBN[7-14][SEQ ID NO1])功能化的Rink酰胺樹脂與3b反應(yīng)，然后與DOTA三-叔丁基酯反應(yīng)。用試劑B裂解和脫保護(hù)后，通過制備性HPLC純化粗產(chǎn)物得到L64。從已經(jīng)獲得的中間體2a開始，重復(fù)上述相同步驟，得到L63?？偸章史謩e為9和4％。
A.(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸(2b)的合成(圖8A)
向在45C下加熱的(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲基酯1b(42.1g；0.1mol)在MeOH(300mL)中的溶液中滴1M NaOH溶液(130mL；0.13mol)。在45℃下攪拌3小時(shí)后，將混合物濃縮至150mL并添加H2O(350mL)。用CH2Cl2(2×100mL)提取后，將水相濃縮至200mL并添加1M HCl(150mL)。過濾、用H2O(2×100mL)洗滌并真空干燥沉淀的固體，得到白色的固體2b(34.8g；0.08mol)。收率80％。
B.(3β，5β，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-12-羥基膽烷-24-酸，(3a)的合成(圖8A)向在0C下攪拌的N-α-Fmoc-甘氨酸(6.0g；20.2mmol)的THF(120mL)的溶液中滴加三丁基胺(4.8mL；3.1mmol)。隨后添加氯甲酸異丁基酯(0.4mL；3.1mmol)，10分鐘后，1小時(shí)內(nèi)，向冷卻的溶液中滴加三丁基胺(2.6mL；20.2mmol)并且，10分鐘后，1小時(shí)內(nèi)向冷卻的溶液中滴加(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸2a(6.6g；16.8mmol)在DMF(120mL)中的懸浮液。讓混合物溫?zé)岵⒃?小時(shí)將溶液濃縮至150mL，然后添加H2O(250mL)和1N HCl(40mL)(最終pH1.5)。過濾、用H2O(2×100mL)洗滌、真空干燥并通過急驟色譜法純化沉淀的固體，得到白色的固體3a(3.5g；5.2mmol)。收率31％。
C.(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸，(3b)的合成(圖8B)向在0℃下攪拌的N-α-Fmoc-甘氨酸(6.0g；20.2mmol)的THF(120mL)的溶液中滴加三丁基胺(4.0g；13.5mmol)。隨后添加氯甲酸異丁基酯(1.7mL；13.5mmol)，10分鐘后，1小時(shí)內(nèi)向冷卻的溶液中滴加三丁基胺(2.6mL；11.2mmol)和(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-羥基膽烷-24-酸3a(6.6g；16.8mmol)在DMF(80mL)中的懸浮液。讓混合物溫?zé)岵⒃?小時(shí)將溶液濃縮至120mL，然后添加H2O(180mL)和1N HCl(30mL)(最終pH1.5)。過濾、用H2O(2×100mL)洗滌、真空干燥并通過急驟色譜法純化沉淀的固體，得到白色的固體3a(1.9g；2.8mmol)。收率25％。
在一種替代方法中，(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙酰基]氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸，(3b)可被制備如下向攪拌的Fmoc-Gly-OH(4.0g，13.45mmol)的二氯甲烷(15mL)溶液中連續(xù)添加N-羥基琥珀酰亞胺(1.70g，14.77mmol)和DIC(1.87g，14.77mmol)；在室溫下攪拌得到的混合物4小時(shí)。通過過濾去除形成的N，N’-二異丙基脲并用乙醚(20mL)洗滌固體。去除揮發(fā)性物質(zhì)并用乙醚(3×20mL)洗滌形成的Fmoc-Gly-琥珀酰亞胺基酯。然后將Fmoc-Gly-琥珀酰亞胺基酯重溶解在無水DMF(15mL)中并向澄清的溶液中添加3-氨基脫氧膽酸(5.21g，12.78mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物4小時(shí)。添加水并過濾、用水洗滌、干燥和通過硅膠色譜法(TLC(硅膠)(Rf0.50，硅膠，CH2Cl2/CH3OH，9∶1)(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH，(9∶1))純化沉淀的固體，得到為無色固體的Fmoc-Gly-3[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸，(3b)。收率7.46g(85％)。
D.L63(N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙?；鵠氨基]乙酰基]氨基]-12-羥基-24-氧代膽烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺)的合成(圖8B和8G)用在DMA(7mL)中的50％嗎啉在固相肽合成容器中振動(dòng)樹脂A(0.5g；0.3mmol)10分鐘，倒空溶液并添加新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。攪拌懸浮液20分鐘然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。向樹脂中添加(3β，5β，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-12-羥基膽烷-24-酸3a(0.82g；1.2mmol)、N-羥基苯并三唑(HOBT)(0.18g；1.2mmol)、N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)，在室溫下振動(dòng)混合物24小時(shí)，倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。然后用在DMA(7mL)中的50％嗎啉振動(dòng)樹脂10分鐘，倒空溶液，添加新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉并振動(dòng)混合物20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。向樹脂中添加1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)、DIEA(0.4mL；2.4mmol)和DMA(7mL)的加合物。在室溫下振動(dòng)混合物24小時(shí)，倒空溶液并用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌并真空干燥樹脂。在具有試劑B(25mL)的燒瓶中振動(dòng)樹脂4小時(shí)。過濾樹脂并在減壓下蒸發(fā)溶液得到油狀粗產(chǎn)物，該粗產(chǎn)物用Et2O(5mL)處理后得到沉淀。通過過濾收集并用Et2O(5×5mL)洗滌，然后通過HPLC分析和純化沉淀。冷凍干燥含有產(chǎn)物的級(jí)分得到為白色蓬松固體形式的L63(12.8mg；0.0073mmol)。收率9％。L63包含與膽酸衍生物接頭連接的診斷部分(金屬螯合劑)，其與導(dǎo)向肽(BBN[7-14])連接。
E.L64(N-[(3β，5β，12α)-3-[[[[[4，7.10-三(羧甲基)-1，4，7，10，四氮雜環(huán)十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙?；鵠氨基]-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24-基]L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-甲硫氨酰胺)的合成(圖8C和8H)用在DMA(7mL)中的50％嗎啉在固相肽合成容器中振動(dòng)樹脂A(0.5g；0.3mmol)10分鐘，倒空溶液并添加新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。攪拌懸浮液20分鐘然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。攪拌懸浮液20分鐘，倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。向樹脂中添加(3β，5β，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸3b(0.81g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DI C(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)，在室溫下振動(dòng)混合物24小時(shí)，倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。用在DMA(7mL)中的50％嗎啉振動(dòng)樹脂10分鐘，倒空溶液，添加新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉并振動(dòng)混合物20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。向樹脂中添加1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)、DIEA(0.4mL；2.4mmol)和DMA(7mL)的加合物。在室溫下振動(dòng)混合物24小時(shí)，倒空溶液并用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌并真空干燥樹脂。在具有試劑B(25mL)的燒瓶中振動(dòng)樹脂4小時(shí)。過濾樹脂并在減壓下蒸發(fā)溶液得到用Et2O(5mL)研制的油狀粗產(chǎn)物。通過過濾收集并用Et2O(5×5mL)洗滌沉淀。然后將沉淀溶解在H2O(5mL)中，添加Na2CO3(0.10mg；0.70mmol)；在室溫下攪拌得到的混合物4小時(shí)。通過HPLC純化該溶液。冷凍干燥含有產(chǎn)物的級(jí)分得到為白色蓬松固體形式的L64(3.6mg；0.0021mmol)。收率4％。L64包含與膽酸衍生物接頭連接的診斷部分(金屬螯合劑)，其與導(dǎo)向肽(BBN[7-14])連接。
實(shí)施例XI-用于細(xì)胞結(jié)合和生物分布研究的177Lu-L64的制備在90℃下通過培育10μg L64配體(10μ11mg/mL的水溶液)、100μl乙酸銨緩沖液(0.2M，pH5.2)和～1-2mCi的在0.05N HCl中的177LuCl3(MURR)15分鐘，合成了這種化合物。通過添加20μl1％ Na2EDTA.2H2O(Aldrich)的水溶液清除游離的177Lu。得到的放射化學(xué)純度(RCP)是～95％。用HPLC將放射標(biāo)記的產(chǎn)物與未標(biāo)記的配體和其它雜質(zhì)分離，所述HPLC使用YMC堿性C8柱[4.6×150mm]，30℃的柱溫和1mL/min的流速，梯度為30分鐘內(nèi)68％A/32％B至66％A/34％B，其中A是檸檬酸鹽緩沖液(0.02M，pH 3.0)，以及B是80％CH3CN/CH3OH。分離的化合物具有～100％的RCP和23.4分鐘的HPLC保留時(shí)間。
通過在體內(nèi)研究的30分鐘內(nèi)將需要的HPLC峰收集到1000μl檸檬酸鹽緩沖液(0.05M，pH5.3，含有1％抗壞血酸鈉和0.1％HSA)中至50μCi/mL的終濃度，制備了用于生物分布和細(xì)胞結(jié)合研究的樣品。關(guān)于細(xì)胞結(jié)合研究，在體內(nèi)研究的30分鐘內(nèi)用細(xì)胞結(jié)合培養(yǎng)基稀釋純化的樣品至1.5μCi/mL的濃度。關(guān)于生物分布研究，在體內(nèi)研究的30分鐘內(nèi)用檸檬酸鹽緩沖液(0.05M，pH5.3，含有1％抗壞血酸鈉和0.1％HSA)稀釋純化的樣品至50μCi/mL的終濃度。
實(shí)施例XII-用于放射治療研究的177Lu-L64的制備在85℃下通過培育70μgL64配體(70μ11mg/mL的水溶液)、200μl乙酸銨緩沖液(0.2M，pH5.2)和～30-40mCi的在0.05N HCl中的177LuCl3(MURR)10分鐘，合成了這種化合物。冷卻至室溫后，通過添加20μl 2％Na2EDTA.2H2O(Aldrich)的水溶液清除游離的177Lu。得到的放射化學(xué)純度(RCP)是～95％。用HPLC將放射標(biāo)記的產(chǎn)物與未標(biāo)記的配體和其它雜質(zhì)分離，所述HPLC使用300VHP陰離子交換柱(7.5×50mm)(Vydac)，用水、50乙腈/水，然后用1g/L乙酸銨水溶液以1mL/min的流速洗脫所述柱。用50％CH3CN從柱中洗脫期望的化合物并將它與含有5％抗壞血酸、0.2％HSA和0.9％(vv)芐醇的～1ml檸檬酸鹽緩沖液(0.05M，pH5.3)。通過自旋真空40分鐘去除分離級(jí)分的有機(jī)部分，在體內(nèi)研究的30分鐘內(nèi)含有5％抗壞血酸、0.2％HSA和0.9％(v∶v)芐醇的～1ml檸檬酸鹽緩沖液(0.05M，pH5.3)將濃縮的溶液(～20-25mCi)調(diào)節(jié)至7.5mCi/mL的濃度。得到的化合物具有＞95％的RCP。
實(shí)施例XIII-111In-L64的制備在85℃下通過培育10μgL64配體(5μl2mg/mL的0.01N HCl溶液)、60μl乙醇、在0.05N HCl中的1.12mCi/mL111InCl3和155μl乙酸鈉緩沖液(0.5M，pH4.5)30分鐘，合成了這種化合物。通過添加20μl1％Na2EDTA.2H2O(Aldrich)的水溶液清除游離的111In。得到的放射化學(xué)純度(RCP)是87％。用HPLC將放射標(biāo)記的產(chǎn)物與未標(biāo)記的配體和其它雜質(zhì)分離，所述HPLC使用Vydac C18柱，[4.6×250mm]，50℃的柱溫和1.5mL/min的流速。梯度為20分鐘內(nèi)75％A/25％B至65％A/35％B，其中A是TFA的水，B是0.085％TFA的乙腈。用該系統(tǒng)，111In-L64的保留時(shí)間是15.7分鐘。分離的化合物具有96.7％的RCP。
實(shí)施例XIV-177Lu-L63的制備
通過將L63配體(如美國申請公開No.2002/0054855和WO02/87637中所述進(jìn)行制備)溶解在0.01N HCl中至1mg/mL的濃度，制備了肽的儲(chǔ)備溶液。通過以所示次序混合如下試劑制備了177Lu-L63。
0.2M NH40Ac，pH 6.8100μl肽儲(chǔ)備液，1mg/mL，在0.01N HCl中5μl在0.01M HCl中的177LuCl3(MURR)1.2μl(1.4mCi)在85℃下培育反應(yīng)混合物10分鐘。在水浴中冷卻至室溫后，添加20μl 1％EDTA溶液和20μl EtOH。通過使用C18柱(VYDACCat#218TP54)的HPLC分析化合物，用20分鐘內(nèi)30-34％B的梯度以1mL/min的流速洗脫所述柱，其中溶劑是A.0.1％TFA/H2O和B是0.1％TFA/CH3CN。形成的177Lu-L63在該系統(tǒng)上具有97.8％的RCP和～14.2分鐘的HPLC保留時(shí)間。
實(shí)施例XV-Gd-L64的松弛性(Relaxivity)和HAS結(jié)合-圖11A-CGd-L64在約1045Mm-1s-1的HEPES中表現(xiàn)出松弛性，它與基于分子量的期望的值是一致的。
如在圖11A中所顯示的，用HAS滴定Gd-L64的HEPES溶液顯示相對強(qiáng)的結(jié)合(Ka＝1.2×104M-1；Rb＝20mM-1s-1)。擬合實(shí)驗(yàn)曲線得到1.2×104M-1的Ka值和約20mM-1s-1的完全結(jié)合核素的松弛性。
如在圖11b中所顯示的，通過比較在HEPES和在血清中的NMRD特征證實(shí)了Gd-L64于HAS的結(jié)合，其中在HAS的存在下在10-30MHz的頻率處看到了結(jié)合核素的特征峰。這些結(jié)果顯示，盡管在24位缺乏游離的羧酸，含有本發(fā)明接頭的化合物與HAS結(jié)合。
實(shí)施例XVI-體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究A.示蹤物劑量生物分布在異種移植的、攜帶PC3腫瘤的小鼠([Ncr]-Foxnl<nu>)中，使用本發(fā)明下文鑒定的化合物和L134，一個(gè)對照，進(jìn)行了低劑量藥物動(dòng)力學(xué)研究。L134室DO3A單胺-氨基辛烷基-BBN[7-14]。在全部研究中，每組(n＝3-4)以200μmCi/kg，靜脈內(nèi)注射，給予小鼠100μL的177Lu標(biāo)記的測試化合物，停留時(shí)間為1和24小時(shí)。用合適的標(biāo)準(zhǔn)物在LKB1282CompuGamma計(jì)數(shù)儀中分析組織。
表2與對照比較，本發(fā)明的Lu-177標(biāo)記的化合物在攜帶PC3腫瘤的裸小鼠(200μmCi/kg；值為％ID/g)中在第1和第24天的藥物動(dòng)力學(xué)比較
有鑒于L64注射后，在血液、肝和腎中的放射性的分布與對照化合物，L134的相似，L64在第1和第24天在腫瘤中的攝取要更大得多。雖然在更早的時(shí)間具有增加的血液和肝值，L63也顯示了高腫瘤攝取。L64和L63在小鼠胰(已知具有GRP受體的正常器官)中的攝取比L134的大得多。
實(shí)施例XVII-放射治療研究-圖12A-BA.短程功效研究使用攜帶PC3腫瘤的裸小鼠模型進(jìn)行放射治療研究。將本發(fā)明的Lu-177標(biāo)記的化合物L(fēng)64、L63和處理對照化合物L(fēng)134與未處理的對照組比較。(每個(gè)處理組的n＝12以及未處理組的n＝36)。關(guān)于第一項(xiàng)研究，在滅菌的條件下，以30μmCi/kg，靜脈內(nèi)或皮下注射，給予小鼠100μL的177Lu標(biāo)記的測試化合物。將受試動(dòng)物養(yǎng)在柵欄環(huán)境中直到30天。每周對每只動(dòng)物收集體重和腫瘤大小(通過測徑規(guī)測量)達(dá)研究的持續(xù)時(shí)間。早期終止的標(biāo)準(zhǔn)包括死亡；總體重減輕等于或大于20％；腫瘤大小等于或大于2cm3。結(jié)果顯示在圖12A中。這些結(jié)果顯示，相對于未被給予處理的對照動(dòng)物和那些被給予相同劑量的L134的動(dòng)物，用L64或L63處理的動(dòng)物增加了存活。
使用與前面相同的劑量，但每個(gè)化合物使用更多的動(dòng)物(n＝46)并跟蹤它們更長的時(shí)間，用L64進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖12B中。相對于與以前相同的對照(n＝36)，L64處理得到顯著增加的存活(p＜0.0001)。
實(shí)施例XVIIILHRH肽的合成使用Applied Biosystems Peptitde Synthesizer，433A型合成了線性肽。將Fmoc-Pal-Peg-PS樹脂用于肽合成，應(yīng)用正交Fmoc策略。用三甲苯基-(用于組氨酸)、叔丁基(用于絲氨酸和酪氨酸)、boc-(用于色氨酸)、甲基三甲苯基-(用于D-賴氨酸)和Pmc-(用于精氨酸)基團(tuán)保護(hù)氨基側(cè)鏈。肽的裂解和建立進(jìn)行如下在室溫下用88％三氟乙酸(TFA)/5％苯酚/5％水/2％三異丙基硅烷(TIS)(試劑‘B’)處理裝載有目的肽的樹脂4小時(shí)和隨后的在乙醚中的蒸發(fā)和沉淀提供了粗肽。然后將灰白色的固體溶解在水中、過濾并通過HPLC純化，所述HPLC使用具有反相C-18柱(YMC-Pack ODS/A柱)的Shimadzu系統(tǒng)，使用水和具有0.1TFA的乙腈作為洗脫劑。
A.Fmoc-Gly-3-氨基脫氧膽酸的合成(3β，5β，7α，12α)-3-[[(9H-芴-9基甲氧基)氨基]乙?；鵠氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸向Fmoc-Gly-OH(4.0g，13.45mmol)的二氯甲烷(15mL)溶液中添加N-羥基琥珀酰亞胺(1.70g，14.77mmol)，接著添加DIC(二異丙基碳二亞胺)(1.87g，14.77mmol)并在室溫下攪拌混合物4小時(shí)。通過過濾去除形成的脲并用乙醚(20mL)洗滌固體。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)合并的濾液以去除溶劑并用乙醚(3×20mL)洗滌形成的固體，F(xiàn)moc-Gly-琥珀酰亞胺基酯。然后將Fmoc-Gly-琥珀酰亞胺基酯重溶解在無水DMF(15mL)中，然后向澄清的溶液中添加3-氨基脫氧膽酸(5.21g，12.78mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物4小時(shí)。將反應(yīng)混合物加至水(200mL)中并過濾、用水洗滌、干燥和通過硅膠色譜法(Rf0.50，硅膠，CH2Cl2/CH3OH，9∶1)(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH，(9∶1))純化沉淀的固體，得到為無色固體形式的Fmoc-Gly-3-氨基脫氧膽烷酸。收率7.46g(85％)。
MS(API-ES，正離子)710.2(M+Na)，687.7(M+H)。
B.Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLys(DOTA-Gly-Adca3)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2向Fmoc-Gly-3-氨基脫氧膽酸(20mg，0.029mmol)的二氯甲烷(0.2mL)溶液中添加N-羥基琥珀酰亞胺(4.0mg，0.035mmol)，接著添加DIC(二異丙基碳二亞胺)(5.0mg，0.039mmol)并在室溫下攪拌4小時(shí)。蒸發(fā)溶劑后，用乙醚(5×1.0mL)洗滌固體并干燥固體。然后將然后將Fmoc-Gly-3-氨基脫氧膽酸琥珀酰亞胺基酯溶解在無水DMF(0.5mL)中并向澄清的溶液中添加純的H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(30mg；0.024mmol)和二異丙基乙胺(7.5mg；0.058mmol)，在室溫下攪拌反應(yīng)混合物18小時(shí)。向反應(yīng)混合物中添加哌啶(0.1mL)并攪拌20分鐘以去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。用水稀釋，用TFA酸化溶液至pH4.0并裝載在YMC-Pack ODS/A，30×250mm柱。使用水和具有0.1％TFA的乙腈作為洗脫劑洗脫所述柱，收集含有需要的肽的級(jí)分(基于MS結(jié)果)并冷凍干燥以得到純的無色蓬松固體形式的Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLys(H-Gly-Adca3)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(15mg；41％)。MS(API-ES，正離子)1700.4(M+H)，851.5[M+H]/2。
向預(yù)先激活的DOTA-三叔丁基酯(25.3mg；0.04mmol)、HBTU(15.2mg；0.04mmol)和二異丙基乙胺(12mg；0.09mmol)在無水DMF(0.2mL)的溶液中添加Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLys(H-Gly-Adca3)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(15mg；0.01mmol)并攪拌反應(yīng)混合物15小時(shí)。真空蒸發(fā)溶劑后，用TFA-苯甲醚(95∶5，2mL)處理殘留物5小時(shí)。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)揮發(fā)性物質(zhì)后，通過添加乙醚沉淀肽。通過離心獲得粗肽，用乙醚洗滌并分離出所需要的無色固體形式的肽Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLys(DOTA-Gly-Adca3)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.收率12.5mg(68％)。
MS(API-ES，正離子)2086.5(M+H)，1044.3[M+H]/2。
實(shí)施例XIX-125I-標(biāo)記的化合物的制備使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或其適合的改進(jìn)的標(biāo)記和純化方法，用放射性鹵素例如125I、131I或123I標(biāo)記本發(fā)明的化合物。A.E.Bolton，Comparative Methods For The Radiolabeling Of Peptides，在“Methods in Enzymology”，1986，Vol.124，第18-29頁中描述了使用Bolton-Hunter試劑、乳過氧化物酶、碘原和氯胺T試劑，用放射碘(或其它放射性鹵素)標(biāo)記的典型方法。例如，可通過使未標(biāo)記的化合物在(例如)事先使用例如具有無水Bolton-Hunter試劑的二異丙胺調(diào)節(jié)至pH8.5-9.0的小體積硼酸鹽緩沖液或DMF中反應(yīng)，用125I標(biāo)記本發(fā)明的化合物。振動(dòng)所述瓶然后在冰上培育約30分鐘，偶爾振動(dòng)。此后，可以選擇性地用(例如)甘氨酸溶液猝滅反應(yīng)，然后使用例如反相HPLC純化以從雜質(zhì)和從未標(biāo)記的化合物中去除游離的標(biāo)記化合物?；蛘撸梢詫⒒衔锶芙庠诹姿猁}緩沖液中至pH接近7，可以添加碘化物(如Na125I)，用緩沖的氯胺T溶液處理上述溶液以影響碘化，然后用還原劑例如焦亞硫酸鈉處理以猝滅反應(yīng)。通過離子交換色譜法可以去除游離的I-并且使用HPLC方法例如C8或C18反相色譜法可以去除未標(biāo)記的化合物。
實(shí)施例XX-L69的合成-圖13A和13B概要(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸A與Fmoc-C1反應(yīng)得到中間體B。隨后將用八肽GlnTrpAlaValGlyHisLeuMetNH2(BBN[7-14](A)功能化的Rink酰胺樹脂與B、Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸和DOTA三-叔丁基酯反應(yīng)。用試劑B(2)裂解和脫保護(hù)后，通過制備性HPLC純化粗產(chǎn)物得到L69?？偸章?.2％。
A.(3β，5β，7α，12α)-3-(9H-芴-9基甲氧基)氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸，B(圖13A)向在0℃下攪拌的(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸A(2.0g；4.9mmol)在10％含水Na2CO3(30mL)和1，4-二噁烷(18mL)中的懸浮液中滴加9-芴基甲氧基羰基氯化物(1.4g；5.4mmol)的1，4-二噁烷(18mL)溶液。在室溫下攪拌6小時(shí)后，添加水(100mL)，用Et2O(2×90mL)洗滌水相，然后添加2M HCl(15mL)(最終pH1.5)。過濾、用H2O(3×100mL)洗滌、真空干燥然后通過急驟色譜法純化沉淀的固體得到白色的固體形式的B(2.2g；3.5mmol)。收率71％。
B.N-[(3β，5β，7α，12α)-3-[[[2-[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]-7，12-二羥基-24-氧代膽烷-24-基]-L-谷氨酰胺酰-L-色氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-甘氨酰-L-組氨酰-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰胺)，L69(圖13B)用在DMA(7mL)中的50％嗎啉在固相肽合成容器中振動(dòng)樹脂A(0.5g；0.3mmol)10分鐘，沖洗掉溶液并添加新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉。攪拌懸浮液另一個(gè)20分鐘，然后沖洗掉溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。向樹脂中添加(3β，5，7α，12α)-3-(9H-芴-9基甲氧基)氨基-7，12二羥基膽烷-24-酸B(0.75g；1.2mmol)、N-羥基苯并三唑(HOBT)(0.18g；i.2mmol)、N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)，在室溫下振動(dòng)混合物24小時(shí)，倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。然后用在DMA(7mL)中的50％嗎啉振動(dòng)樹脂10分鐘，倒空溶液，添加新鮮的在DMA(7mL)中的50％嗎啉并振動(dòng)混合物另外20分鐘。倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。向樹脂中添加Fmoc-8-氨基-3，6二氧雜辛酸(0.79g；1.2mmol)(7)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL；1.2mmol)和DMA(7mL)。在室溫下振動(dòng)混合物3小時(shí)，然后倒空溶液并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂。然后用在DMA(7mL)中的50％嗎啉振動(dòng)樹脂10分鐘，清洗掉溶液，并用DMA(5×7mL)洗滌樹脂，向樹脂中添加1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸三(1，1-二甲基乙基)酯與NaCl(0.79g；1.2mmol)、HOBT(0.18g；1.2mmol)、DIC(0.19mL1.2mmol)、N-乙基二異并基胺(0.40mL；2.4mmol)和DMA(7mL)的加合物。在室溫下振動(dòng)混合物24小時(shí)，清洗掉，用DMA(5×7mL)、CH2Cl2(5×7mL)洗滌樹脂并真空干燥。在具有試劑B(25mL)的燒瓶中振動(dòng)樹脂4.5小時(shí)。過濾樹脂并在減壓下蒸發(fā)溶液得到油狀粗產(chǎn)物。用Et2O(20mL)處理該粗產(chǎn)物后得到沉淀。通過離心收集沉淀并用Et2O(3×20mL)洗滌沉淀得到固體(124mg)，通過HPLC分析所述固體。通過制備性HPLC純化一定量的粗產(chǎn)物(50mg)。冷凍干燥含有產(chǎn)物的級(jí)分得到白色的固體的L69(6.5mg；3.5×10-3mmol)(圖13B)。收率5.8％。
貫穿本發(fā)明的前面描述，引用或參考了不同的專利、論文和其它出版物。由此通過參考將每篇專利、論文和其它出版物并入本主題申請中。
權(quán)利要求
2.如下通式的化合物M-N-O-P-Q其中M是診斷部分；N是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；O是α氨基酸或取代的膽汁酸；以及P是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；以及Q是導(dǎo)向部分，并且其中N、O或P的至少一個(gè)是取代的膽汁酸。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中所述導(dǎo)向部分與取代的膽汁酸的氨基或取代的膽汁酸的羧基連接。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中所述導(dǎo)向部分與取代的膽汁酸的氨基連接。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中所述導(dǎo)向部分與取代的膽汁酸的羧基連接。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中所述診斷部分與取代的膽汁酸的氨基連接并且所述導(dǎo)向部分與取代的膽汁酸的羧基連接。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中所述診斷部分與取代的膽汁酸的羧基連接并且所述導(dǎo)向部分與取代的膽汁酸的氨基連接。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中所述診斷部分與取代的膽汁酸的氨基連接并且所述導(dǎo)向部分與取代的膽汁酸的所述氨基連接。
9.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)的化合物，其中M選自由X-射線成像劑、磁共振成像劑、超聲成像劑、熒光劑、放射性核素成像劑和光學(xué)成像劑組成的組。
10.權(quán)利要求8任一的化合物，其中M是光學(xué)成像劑。
11.如下通式的化合物M-N-O-P-Q其中M是治療部分；N是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；O是α氨基酸或取代的膽汁酸；以及P是0、α氨基酸或取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；以及Q是導(dǎo)向部分，并且其中N、O或P的至少一個(gè)是取代的膽汁酸。
12.權(quán)利要求10的化合物，其中所述導(dǎo)向部分與取代的膽汁酸的氨基或取代的膽汁酸的羧基連接。
13.權(quán)利要求10的化合物，其中所述導(dǎo)向部分與取代的膽汁酸的氨基連接。
14.權(quán)利要求10的化合物，其中所述導(dǎo)向部分與取代的膽汁酸的羧基連接。
15.權(quán)利要求10的化合物，其中所述治療部分與取代的膽汁酸的氨基連接并且所述導(dǎo)向部分與取代的膽汁酸的羧基連接。
16.權(quán)利要求10的化合物，其中所述治療部分與取代的膽汁酸的羧基連接并且所述導(dǎo)向部分與取代的膽汁酸的氨基連接。
17.權(quán)利要求10的化合物，其中所述治療部分與取代的膽汁酸的氨基連接并且所述導(dǎo)向部分與取代的膽汁酸的所述氨基連接。
18.權(quán)利要求10～16中任一項(xiàng)的化合物，其中M選自由放射治療劑、光治療劑、抗生素、激素、酶、抗體和生長因子組成的組。
19.權(quán)利要求17的化合物，其中M是胰島素。
20.如下通式的化合物M-N-O-P-M其中每個(gè)M獨(dú)立地是診斷或治療部分；N是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；O是α氨基酸或取代的膽汁酸；以及P是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；并且其中N、O或P的至少一個(gè)是取代的膽汁酸。
21.權(quán)利要求19的化合物，其中一個(gè)M與取代的膽汁酸的氨基連接并且第二個(gè)M與取代的膽汁酸的羧基連接。
22.權(quán)利要求19的化合物，其中第一個(gè)M與取代的膽汁酸的氨基連接并且第二個(gè)M與取代的膽汁酸的所述氨基連接。
23.權(quán)利要求19的化合物，其中第一個(gè)M與第二個(gè)M相同或不同。
24.權(quán)利要求19的化合物，其中第一個(gè)M與第二個(gè)M相同。
25.權(quán)利要求19的化合物，其中第一個(gè)M與第二個(gè)M不同。
26.一種改善藥物化合物的半衰期的方法，該方法包括使用具有式N-O-P的接頭，使診斷部分、治療部分、金屬螯合劑或放射性鹵素與導(dǎo)向肽連接的步驟其中N是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；O是α氨基酸或取代的膽汁酸；以及P是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)，其中N、O或P的至少一個(gè)是取代的膽汁酸。
27.權(quán)利要求21的方法，其中所述取代的膽汁酸選自由下列物質(zhì)組成的組(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸；(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸；(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸；賴氨酸-(3，6，9)-三氧雜十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脫氧-3-氨基膽酸)；(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基-12-氧代膽烷-24-酸；以及(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基膽烷-24-酸。
28.如下通式的化合物M-N-O-P-Q其中M是金屬螯合劑；N是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；O是α氨基酸或取代的膽汁酸；以及P是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；以及Q是導(dǎo)向肽，并且其中N、O或P的至少一個(gè)是取代的膽汁酸。
29.權(quán)利要求27的化合物，其中Q是選自由下列物質(zhì)組成的組的肽激素LHRH、胰島素、催產(chǎn)素、促生長素抑制素、NK-1、VIP、P物質(zhì)、NPY、內(nèi)皮縮血管肽A、內(nèi)皮縮血管肽B、緩激肽、白細(xì)胞介素-1、EGF、CCK、galanan、MSH、蘭瑞肽、奧曲肽、Maltose、精氨酸升壓素和它們的類似物與衍生物。
30.權(quán)利要求27的化合物，其中所述取代的膽汁酸選自由下列物質(zhì)組成的組(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸；(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸；(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸；賴氨酸-(3，6，9)-三氧雜十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脫氧-3-氨基膽酸)；(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基-12-氧代膽烷-24-酸；以及(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基膽烷-24-酸。
31.如下通式的化合物M-N-O-P-Q其中M是金屬螯合劑；N是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；O是α氨基酸或取代的膽汁酸；以及P是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；以及Q是LHRH肽或其類似物或衍生物，并且其中N、O或P的至少一個(gè)是取代的膽汁酸。
32.權(quán)利要求30的化合物，其中Q是下式的LHRH類似物PGlu-His-Trp-W-Tyr-DLys-X-Y-Pro-Z，其中W＝Ser、NMeSer或Thr；X＝Leu、NMeLeu、叔丁基Gly；Y＝Arg、Arg(Et2)、Cit、Lys(異丙基)；以及Z＝Gly-NH2、NH、氮雜Gly-NH2。
33.如下通式的化合物Glu-His-Trp-W-Tyr-DLys(M-N-O-P)-X-Y-Pro-Z，其中M是螯合劑；N是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；O是α氨基酸或取代的膽汁酸；以及P是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)，W＝Ser、NMeSer或Thr；X＝Leu、NMeLeu、叔丁基Gly；Y＝Arg、Arg(Et2)、Cit、Lys(異丙基)；以及Z＝Gly-NH2、NHEthyl、氮雜Gly-NH2，其中N、O或P的至少一個(gè)是取代的膽汁氨基酸。
34.權(quán)利要求31的化合物，其中M是DOTA-Gly。
35.權(quán)利要求30或31的化合物，其中所述取代的膽汁酸選自由下列物質(zhì)組成的組(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸；(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸；(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸；賴氨酸-(3，6，9)-三氧雜十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脫氧-3-氨基膽酸)；(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基-12-氧代膽烷-24-酸；以及(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基膽烷-24-酸。
36.權(quán)利要求24的化合物，其中至少一個(gè)M是胰島素或其類似物或衍生物。
37.權(quán)利要求28的化合物，其中Q是胰島素或其類似物或衍生物。
38.化合物牛NεB29-[4-[[(3β，5β，12α)-23-羧基-12-羥基-24-降膽烷-3-基]氨基]-4-氧代丁?；鵠-胰島素。
39.化合物4-[[(3β，5β，12α)-23-羧基-12-羥基-24-降膽烷-3-基]氨基]-4-氧代丁酸N-羥基琥珀酰亞胺基酯。
40.化合物牛1-[[(3β，5β，12α)-23[(1，1-二甲基)乙氧羰基]-12-羥基-24-降膽烷-3-基]氨基]羰基-3，5-雙[[4-(胰島素-NeB29-基)-1，4-二氧代丁基]氨基]苯。
41.化合物牛1-[[(3β，5β，12α)-23-[(1，1-二甲基)乙氧羰基]-12-羥基-24-降膽烷-3-基]氨基]羰基-3-[[4-(胰島素-NεB29-基)-1，4-二氧代丁基]氨基]-5[[[[2-[[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷基]乙?；鵠氨基]乙基]氨基]-1，4-二氧代丁基]氨基]苯。
42.權(quán)利要求40的化合物，其中所述化合物被用111銦標(biāo)記。
43.如下通式的化合物M-N-O-P-Q其中M是放射性鹵素；N是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；O是α氨基酸或取代的膽汁酸；以及P是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；以及Q是導(dǎo)向肽，并且其中N、O或P的至少一個(gè)是取代的膽汁氨基酸。
44.權(quán)利要求42的化合物，其中Q是選自由下列物質(zhì)組成的組的肽激素LHRH、胰島素、催產(chǎn)素、促生長素抑制素、NK-1、VIP、P物質(zhì)、NPY、內(nèi)皮縮血管肽A、內(nèi)皮縮血管肽B、緩激肽、白細(xì)胞介素-1、EGF、CCK、galanan、MSH、蘭瑞肽、奧曲肽、Maltose、精氨酸升壓素和它們的類似物與衍生物。
45.權(quán)利要求42的化合物，其中所述取代的膽汁酸選自由下列物質(zhì)組成的組(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸；(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸；(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸；賴氨酸-(3，6，9)-三氧雜十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脫氧-3-氨基膽酸)；(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基-12-氧代膽烷-24-酸；以及(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基膽烷-24-酸。
46.權(quán)利要求42的化合物，其中Q是胰島素或其類似物或衍生物。
47.一種成像的方法，該方法包括如下步驟向患者給予包含與診斷放射性核素絡(luò)合的權(quán)利要求23或35的化合物的診斷成像劑，并且將所述患者成像。
48.一種制備診斷成像劑的方法，該方法包括向可注射的介質(zhì)中添加包含權(quán)利要求27或30的化合物的物質(zhì)的步驟。
49.一種用于制備診斷成像劑的試劑盒，該試劑盒包括含有可注射治療介質(zhì)的第一瓶和含有權(quán)利要求27的化合物的第二瓶。
50.一種治療患者的方法，該方法包括向患者給予包含與治療放射性核素絡(luò)合的權(quán)利要求27或30的化合物的放射治療劑的步驟。
51.一種制備放射治療劑的方法，該方法包括向可注射的治療介質(zhì)中添加包含權(quán)利要求27或30的化合物的物質(zhì)的步驟。
52.一種用于制備放射性藥物物質(zhì)的試劑盒，該試劑盒包括含有可注射治療介質(zhì)的第一瓶和含有權(quán)利要求27的化合物的第二瓶。
53.權(quán)利要求49的方法，該方法還包括給予治療劑。
54.如下通式的化合物M-N-O-P-Q其中M是診斷部分；N是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；O是α氨基酸或取代的膽汁酸；以及P是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；以及Q是導(dǎo)向部分，并且其中N、O或P的至少一個(gè)是取代的膽汁酸。
55.權(quán)利要求54的化合物，其中所述取代的膽汁酸選自由下列物質(zhì)組成的組(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸；(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸；(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸；賴氨酸-(3，6，9)-三氧雜十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脫氧-3-氨基膽酸)；(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基-12-氧代膽烷-24-酸；以及(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基膽烷-24-酸。
56.一種改善藥物化合物的半衰期的方法，該方法包括使具有式N-O-P的接頭與診斷部分、治療部分、金屬螯合劑或放射性鹵素連接的步驟其中N是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)；O是α氨基酸或取代的膽汁酸；以及P是0、α氨基酸、取代的膽汁酸或其它連接基團(tuán)，其中N、O或P的至少一個(gè)是取代的膽汁酸。
57.權(quán)利要求21的方法，其中所述取代的膽汁酸選自由下列物質(zhì)組成的組(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸；(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸；(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸；賴氨酸-(3，6，9)-三氧雜十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脫氧-3-氨基膽酸)；(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基-12-氧代膽烷-24-酸；以及(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基膽烷-24-酸。
全文摘要
一種延長用于診斷成像或治療的藥物化合物半衰期的新和改進(jìn)的方法，使用新的接頭使診斷或治療部分與導(dǎo)向肽或另一個(gè)診斷或治療部分連接。得到的化合物具有通式M－N－O－P－Q，其中M是診斷或治療部分，N－O－P本發(fā)明的接頭，以及Q是導(dǎo)向肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物可具有式M－N－O－P－M，其中M獨(dú)立地是診斷或治療部分并且N－O－P本發(fā)明的接頭還提供了使用本發(fā)明的化合物成像或治療患者的方法。進(jìn)一步提供了由所述化合物制備診斷成像劑的方法和試劑盒。還提供了所述化合物放射治療患者的方法，以及由所述化合物制備放射治療劑的方法。
文檔編號(hào)A61K51/00GK1738652SQ200380108750
公開日2006年2月22日 申請日期2003年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月13日
發(fā)明者C·德海恩, A·奴恩, R·E·斯溫森 申請人:伯拉考成像股份公司