專利名稱：包括cdk抑制劑和吉西他濱的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適于治療癌癥和其它增殖性疾病的藥物聯(lián)合。
背景技術(shù)：
哺乳動物細胞周期的啟動、進行和結(jié)束受對細胞生長至關(guān)重要的各種細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)復(fù)合物的調(diào)控。這些復(fù)合物包括至少一種催化亞基(CDK自身)和一種調(diào)節(jié)亞基(細胞周期蛋白)。對細胞周期調(diào)控的一些比較重要的復(fù)合物包括細胞周期蛋白A(CDK1-也稱為cdc2，和CDK2)、細胞周期蛋白B1-B3(CDK1)、細胞周期蛋白C(CDK8)、細胞周期蛋白D1-D3(CDK2，CDK4，CDK5，CDK6)、細胞周期蛋白E(CDK2)、細胞周期蛋白K和T(CDK9)和細胞周期蛋白H(CDK7)。這些復(fù)合物中的每一種涉及細胞周期的特定期。
通過與其它蛋白的短暫締合以及它們細胞內(nèi)定位的變化，CDK的活性在翻譯后被調(diào)節(jié)。腫瘤發(fā)展與基因改變和CDK及其調(diào)節(jié)劑的下調(diào)密切相關(guān)，這表明CDK抑制劑可為有用的抗癌治療藥。實際上，早期結(jié)果表明轉(zhuǎn)化細胞和正常細胞在它們對例如細胞周期蛋白A/CDK2的需求上有差別，因而有可能開發(fā)出新的抗腫瘤藥，沒有常規(guī)細胞毒性和細胞抑制藥物所觀察到的常見宿主毒性。
CDK的功能是磷酸化并因此激活或去激活特定蛋白，包括例如成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白、核纖層蛋白、組蛋白H1和有絲分裂紡錘體的成分。由CDK介導(dǎo)的催化步驟涉及從ATP到大分子酶底物的磷酰-轉(zhuǎn)移反應(yīng)。已發(fā)現(xiàn)幾類化合物(在例如N.Gray，L.Détivaud，C.Doerig，L.Meijer，Cur.Med.Chem.1999，6，859中有總結(jié))因由于CDK特異性ATP拮抗作用而具有抗增殖性能。
Roscovitine為化合物6-芐基氨基-2-[(R)-1-乙基-2-羥基乙基氨基]-9-異丙基嘌呤。Roscovitine已被證實為細胞周期蛋白依賴性激酶尤其是CDK2的有效抑制劑。這種化合物當(dāng)前正被開發(fā)成抗癌藥。CDK抑制劑被認為阻斷了細胞周期G2/M期的細胞途徑。
眾所周知，本領(lǐng)域中經(jīng)常聯(lián)合給予活性藥劑以使治療方案最佳。本發(fā)明因此設(shè)法提供已知藥劑的新型聯(lián)合，該聯(lián)合尤其適于治療增殖性疾病，尤其是癌癥。更具體地，本發(fā)明集中于與聯(lián)合使用特定藥劑有關(guān)的令人驚奇和出乎意料的效果。
發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供包括CDK抑制劑和吉西他濱或其衍生物或前體藥物的聯(lián)合。
第二方面提供包括根據(jù)本發(fā)明的聯(lián)合與藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑混合的藥物組合物。
第三方面涉及根據(jù)本發(fā)明的聯(lián)合在制備治療增殖性疾病的藥物中的用途。
第四方面涉及包括CDK抑制劑和吉西他濱或其衍生物或前體藥物的藥物制品，作為在治療中同時、依次或分別使用的聯(lián)合制劑。
第五方面涉及治療增殖性疾病的方法，所述方法包括同時、依次或分別對患者給藥CDK抑制劑和吉西他濱或其衍生物或前體藥物。
第六方面涉及CDK抑制劑在制備治療增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述治療包括同時、依次或分別對患者給藥CDK抑制劑和吉西他濱或其衍生物或前體藥物。
第七方面涉及CDK抑制劑和吉西他濱或其衍生物或前體藥物在制備治療增殖性疾病的藥物中的用途。
第八方面涉及CDK抑制劑在制備治療增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述藥物用于與吉西他濱或其衍生物或前體藥物的聯(lián)合治療。
第九方面涉及吉西他濱或其衍生物或前體藥物在制備治療增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述藥物用于與CDK抑制劑的聯(lián)合治療。
詳細描述藥物聯(lián)合的效果本質(zhì)上是不可預(yù)料的，經(jīng)常存在一種藥物部分或完全抑制另一種藥物的效果的傾向。本發(fā)明基于令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即同時、分別或依次聯(lián)合給藥吉西他濱和roscovitine不會導(dǎo)致兩種藥劑之間的任何有害相互作用。出人意料的這種拮抗相互作用的缺乏對臨床應(yīng)用至關(guān)重要。
在優(yōu)選的實施方案中，與分別給藥的任何一種藥物相比，吉西他濱和roscovitine的聯(lián)合能產(chǎn)生增強的效果。這種發(fā)現(xiàn)的令人驚奇特性與根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)預(yù)料的大不相同。
下面闡述的優(yōu)選實施方案適用于本發(fā)明的所有上述方面。
吉西他濱，2’-去氧-2’，2’-二氟胞苷是對尤其是卵巢癌、胰腺癌和肺癌表現(xiàn)出抗腫瘤活性的核苷類似物。吉西他濱表現(xiàn)出細胞期特異性，主要殺死正進行DNA合成(S-期)的細胞，并還能阻斷細胞通過G1/S-期界線的進展。吉西他濱在細胞內(nèi)被核苷激酶代謝成活性二磷酸(dFdCDP)和三磷酸(dFdCTP)核苷。吉西他濱的細胞毒性效應(yīng)可歸因于二磷酸和三磷酸核苷的聯(lián)合作用導(dǎo)致的DNA合成的抑制。更具體地說，二磷酸吉西他濱抑制核糖核苷酸還原酶，而后者負責(zé)催化用于DNA合成的三磷酸脫氧核苷產(chǎn)生的反應(yīng)。二磷酸核苷對這種酶的抑制導(dǎo)致脫氧核苷酸濃度例如dCTP的降低。另外，三磷酸吉西他濱與dCTP競爭摻入到DNA內(nèi)。隨后的dCTP細胞內(nèi)濃度的減少增強了三磷酸吉西他濱摻入到DNA內(nèi)(自增強作用)。一旦吉西他濱核苷酸摻入到DNA內(nèi)，則只有一個其它核苷酸被加入到增長的DNA鏈中，然后不再抑制進一步的DNA合成。DNA聚合酶不能除去吉西他濱核苷酸和修復(fù)增長的DNA鏈(掩蔽鏈終止)。在CEMT類淋巴母細胞中，吉西他濱誘導(dǎo)核小體間細胞DNA片段化，這是細胞程序性死亡的特征。
CDK抑制劑優(yōu)選為CDK2和/或CDK4的抑制劑。CDK抑制劑更優(yōu)選選自Roscovitine、Purvalanol A、Purvalanol B、奧羅莫星和其它2，6，9-三取代的嘌呤，如WO 97/20842、WO 98/05335(CV Therapeutics)、WO99/07705(Regents of the University of Califomia)中所述。CDK抑制劑甚至更優(yōu)選選自Roscovitine和Purvalanol A。還更優(yōu)選地，CDK抑制劑為Roscovitine。
本文使用的術(shù)語“增殖性疾病”在廣泛意義上包括任何需要控制細胞周期的疾病，例如心血管疾病如再狹窄和心臟病、自身免疫性疾病如腎小球腎炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮膚病如牛皮癬、抗炎性、抗真菌、抗寄生蟲疾病如瘧疾、氣腫和脫發(fā)病。在這些疾病中，本發(fā)明的化合物可按照需要在所需的細胞內(nèi)誘導(dǎo)凋亡或保持停滯。優(yōu)選地，增殖性疾病為癌癥或白血病，最優(yōu)選地為肺癌、胰腺癌、膀胱癌、間皮瘤癌、頭頸癌、乳腺癌、胃癌或食道癌。
在一種優(yōu)選實施方案中，癌癥為肺癌、膀胱癌或胰腺癌。
在另一尤其優(yōu)選的實施方案中，癌癥為非小細胞肺癌(NSCLC)。還更優(yōu)選地，癌癥為IIIB/IV期非小細胞肺癌。
在尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及上文所述的聯(lián)合在治療CDK依賴性或敏感性疾病中的應(yīng)用。CDK依賴性疾病與一種或多種CDK酶的超過正?；钚运接嘘P(guān)。這類疾病優(yōu)選與CDK2和/或CDK4的異常活性水平有關(guān)。CDK敏感性疾病為CDK水平的失常不是主因而是下游初級異謝失常導(dǎo)致的疾病。在這種情況下，CDK2和/或CDK4被認為是敏感性代謝途徑的一部分，CDK抑制劑可因此在治療這類疾病中有活性。這類疾病優(yōu)選癌癥或白血病。
本文使用的術(shù)語“藥物制備”包括本發(fā)明的成分除了用于這類藥物制備的任意階段外還有直接作為藥物的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，在吉西他濱前依次或分別地給藥CDK抑制劑。優(yōu)選地，在吉西他濱前至少4小時給藥CDK抑制劑，更優(yōu)選地在吉西他濱前至少72小時。
在尤其優(yōu)選的實施方案中，在CDK抑制劑前依次或分別地給藥吉西他濱。優(yōu)選地，在CDK抑制劑前至少1小時給藥吉西他濱，更優(yōu)選地在CDK抑制劑前至少24小時。
在一種優(yōu)選實施方案中，相對于單獨成分，分別給藥治療有效量的CDK抑制劑和吉西他濱；換句話說，即使不是以聯(lián)合給藥的方式，CDK抑制劑和吉西他濱也是以治療有效量給藥。
在另一種優(yōu)選實施方案中，相對于單獨成分，分別給藥亞治療量(sub-therapeutic amount)的CDK抑制劑和吉西他濱；換句話說，如果不是聯(lián)合給藥給藥，CDK抑制劑和吉西他濱不是以治療有效量給藥。
優(yōu)選地，吉西他濱和CDK抑制劑以協(xié)同方式相互作用。本文使用的術(shù)語“協(xié)同”是指吉西他濱和CDK抑制劑在聯(lián)合使用時能產(chǎn)生比由兩種組分的單獨效應(yīng)相加預(yù)料到的效應(yīng)更大的效應(yīng)。有利地，協(xié)同相互作用可允許每種組分以較低劑量給藥于患者，從而降低化療的毒性，同時產(chǎn)生和/或保持相同的療效。因此，在尤其優(yōu)選的實施方案中，可以亞治療量給藥每種組分。
在所附實施例中詳細描述了支持協(xié)同相互作用的證據(jù)。
鹽/酯本發(fā)明的藥劑可以鹽或酯尤其是藥物可接受的鹽或酯的形式提供。
本發(fā)明藥劑的藥物可接受鹽包括它們合適的酸加成鹽或堿加成鹽。合適藥物鹽的綜述可見Berge等人的J.Pharm Sci，66，1-19(1977)。鹽為與例如以下酸形成的鹽強無機酸，如礦物酸，例如硫酸、磷酸或氫鹵酸；強有機羧酸，如未取代或取代(如被鹵代)的1至4個碳原子的鏈烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或四鄰苯二甲酸(tetraphthalic)；羥基羧酸，例如抗壞血酸、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或與有機磺酸，如未取代或取代(如被鹵代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或?qū)妆交撬帷?br> 取決于被酯化的官能團，使用有機酸或醇/氫氧化物形成酯。有機酸包括羧酸，如未取代或取代(如被鹵代)的1至12個碳原子的鏈烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或四鄰苯二甲酸；羥基羧酸，例如抗壞血酸、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或與有機磺酸，如未取代或取代(如被鹵代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或?qū)妆交撬?。合適的氫氧化物包括無機氫氧化物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁。醇包括未取代或取代(如被鹵代)的1至12個碳原子的鏈烷醇。
對映異構(gòu)體/互變異構(gòu)體本發(fā)明還適當(dāng)?shù)匕ㄋ巹┑娜繉τ钞悩?gòu)體和互變異構(gòu)體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認識到具有光學(xué)性質(zhì)(一個或多個手性碳原子)或互變異構(gòu)特征的化合物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的方法分離/制備相應(yīng)的對映異構(gòu)體和/或互變異構(gòu)體。
立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體本發(fā)明的一些藥劑可以立體異構(gòu)體和/或幾何異構(gòu)體的形式存在，例如它們可具有一個或多個不對稱和/或幾何中心，并因此可以二種或多種立體異構(gòu)和/或幾何形式存在。本發(fā)明包括這些抑制劑藥劑所有的單獨立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體及它們的混合物的使用。權(quán)利要求中使用的術(shù)語包括這些形式，只要所述形式保留適當(dāng)?shù)墓δ芑钚?但不必到相同程度)。
本發(fā)明還包括藥劑或其藥物可接受鹽的所有合適的同位素變體。本發(fā)明藥劑或其藥物可接受鹽的同位素變體定義為其中至少一個原子被具有相同原子序數(shù)但原子質(zhì)量與自然界中通常發(fā)現(xiàn)的原子質(zhì)量不同的原子取代的物質(zhì)?？杀粨饺氲剿巹┖推渌幬锟山邮茺}的同位素的例子包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分別如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。藥劑和其藥物可接受鹽的一些同位素變體，例如結(jié)合放射性同位素如3H或14C的那些化合物，在藥物和/或底物組織分布研究中是有用的。含氚的即3H和碳-14即14C同位素因其容易制備和可檢測性而特別優(yōu)選。此外，用同位素如氘即2H的取代可因較大的代謝穩(wěn)定性而提供特定的治療益處，例如體內(nèi)半衰期增加或劑量要求降低，并因此可在一些情況下被優(yōu)選。通?？墒褂煤线m試劑的適當(dāng)同位素變體通過常規(guī)過程制備本發(fā)明藥劑和其藥物可接受鹽的同位素變體。
溶劑合物本發(fā)明還包括本發(fā)明藥劑的溶劑合物形式。權(quán)利要求中使用的術(shù)語包括這些形式。
多晶型物本發(fā)明還涉及各種結(jié)晶形式、多晶型形式和無水/水合形式的本發(fā)明的藥劑。眾所周知，在藥物工業(yè)中可通過稍微改變這種化合物合成制備中所用溶劑的純化方法和或分離形式來分離得到化合物的任意這類形式。
前體藥物本發(fā)明還包括前體藥物形式的本發(fā)明的藥劑。這種前體藥物通常為一個或多個適當(dāng)基團已被修飾以使在對人或哺乳動物對象給藥后所述的修飾可被逆轉(zhuǎn)的化合物。雖然為了實現(xiàn)體內(nèi)逆轉(zhuǎn)可與這種前體藥物一起給藥第二種藥劑，但通常通過在這類對象中天然存在的酶實現(xiàn)這種逆轉(zhuǎn)。這類修飾的例子包括酯(例如上述那些中的任一種)，其中可通過酯酶等進行逆轉(zhuǎn)。其它這類系統(tǒng)為本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員所熟知。
給藥可使本發(fā)明的藥物組合物適于口服、直腸、陰道、腸胃外、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、支氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻、口腔或舌下給藥途徑。
對于口服給藥，特別利用壓縮片劑、藥丸、片劑、凝膠(gellules)、滴劑和膠囊。優(yōu)選地，這些組合物每劑包含1-2000mg和更優(yōu)選50-1000mg的有效成分。
其它給藥形式包括溶液或乳液，它們可經(jīng)靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)給藥，并由無菌或可滅菌溶液制備。本發(fā)明的藥物組合物還可為栓劑、陰道栓劑、混懸劑、乳液、洗液、軟膏、乳膏劑、凝膠、噴霧劑、溶液或撲粉(dusting poeder)的形式。
經(jīng)皮給藥的替代方式是利用皮膚貼片。例如，可將有效成分摻入到由聚乙二醇含水乳液或液體石蠟組成的乳膏劑內(nèi)。還可以1-10wt％的濃度將有效成分摻入到由白蠟或白色軟石蠟基質(zhì)與所需要的穩(wěn)定劑和防腐劑共同組成的軟膏內(nèi)。
可注射形式每劑可包含10-1000mg、優(yōu)選10-500mg的有效成分。
組合物可被配制成單元劑型，即包含單元劑量或單元劑量的多重單位或亞單位的形式的離散部分。
在一種特別優(yōu)選的實施方案中，靜脈內(nèi)給藥本發(fā)明的聯(lián)合或藥物組合物。
劑量本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員不用額外試驗就可容易地確定對患者給藥的本發(fā)明的組合物的適宜劑量。典型地，醫(yī)師會確定對個體患者最適合的實際劑量，并且根據(jù)各種因素進行調(diào)整，包括使用的具體化合物的活性、化合物的代謝穩(wěn)定性和作用長短、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥方式和時間、排泄速度、藥物聯(lián)合、特定病癥的嚴重程度和個體正接受的治療。本文公開的劑量為一般情況的示例。當(dāng)然也可有有益的較高或較低劑量范圍個別情況，這都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
根據(jù)需要，可以0.1-30mg/kg體重，如2-20mg/kg體重，更優(yōu)選0.1-1mg/kg體重的劑量給藥所述藥劑。
指導(dǎo)性地，按照醫(yī)師指導(dǎo)，吉西他濱一般地以1000-1250mg/m2體表面積的劑量經(jīng)靜脈內(nèi)緩慢給藥。每周可給予所述的劑量，給藥2周直到7周，或每21-28天給藥一次。施用的劑量和給藥頻率一般根據(jù)患者的一般體格狀況和引起的副作用的嚴重程度，尤其是引起造血、神經(jīng)系統(tǒng)和腎系統(tǒng)的那些副作用的嚴重程度進行調(diào)整。
roscovitine一般以約0.05-約5g/天，優(yōu)選約0.4-約3g/天給藥。roscovitine優(yōu)選以片劑或膠囊的形式口服給藥。roscovitine的總?cè)談┝靠勺鳛閱未蝿┝拷o藥，或以分散劑量每天給藥2、3或4次。
優(yōu)選地，以0.4-3g/天的劑量口服或靜脈內(nèi)給藥roscovitine。然后，按認為最合適的方式以上述適宜劑量給藥吉西他濱。優(yōu)選地，在給藥roscovitine至少24小時后給藥吉西他濱。
通過實施例并結(jié)合以下圖進一步描述本發(fā)明，其中

圖1顯示了預(yù)先暴露于roscovitine 24小時然后暴露于吉西他濱24小時對MiaPaCa胰腺腫瘤細胞系的作用。
圖2顯示了同時暴露于roscovitine和吉西他濱24小時的效應(yīng)。
實施例使用單層分析和腫瘤干細胞分析測定roscovitine單獨和聯(lián)合吉西他濱對MDA-435乳腺腫瘤細胞系的生長抑制活性。
方法和材料化合物在DMSO中制備CDK抑制劑(例如roscovitine)的儲備溶液并在-20℃下儲存等分試樣。使用前即刻在培養(yǎng)基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium；Life Technologies，Karlsruhe)中制備最終的稀釋液。
產(chǎn)克隆分析由人腫瘤異種移植物制備單細胞懸浮液在無菌條件下切出胸腺發(fā)育不全的裸小鼠(NMRI，Naval MedicalResearch Institute，USA，nu/nu株，得自我們自己的飼養(yǎng)設(shè)施)中在皮下連續(xù)傳代生長的固體人腫瘤異種移植物，機械分解，隨后用酶混合物在37℃下孵育30分鐘，其中酶混合物由膠原酶(41U/ml，Sigma)、DNAseI(125U/ml，Roche)、透明質(zhì)酸酶(100U/ml，Sigma)和分散酶(Dispase)II(1.0U/ml，Roche)在RPMI 1640-培養(yǎng)基(Life Technologies)中組成。使細胞通過200μm和50μm篩的篩，并用無菌PBS緩沖液(Life Technologies)洗滌兩次。利用臺盼藍排斥實驗在Neubauer血細胞計數(shù)計上測定活細胞的百分比。
培養(yǎng)方法根據(jù)Hamburger & Salmon[Alley，M.C.，Uhi，C.B.&M.M.Lieber，1982]介紹的改性雙層軟瓊脂分析以24孔形式上進行產(chǎn)克隆分析(clonogenicassay)。通過使用可代謝的四唑鹽改進軟瓊脂集落形成分析中藥物細胞毒性的檢測。Life Sci.313071-3078]。底層由0.2ml/孔的Iscove′s ModifiedDulbecco′s Medium(補充有20％(v/v)胎牛血清和0.01％(v/v)慶大霉素)和0.75％(w/v)瓊脂組成。向補充有0.4％(w/v)瓊脂的0.2ml相同培養(yǎng)基中加入4·104-8·104個細胞，并以24多孔皿形式接種到底層上。通過在0.2ml培養(yǎng)基中連續(xù)暴露(藥物覆層)施用細胞抑制藥。每個皿包括含有溶媒的6個對照孔，和6個濃度的三重的藥物處理組。在37℃下和有7.5％CO2的濕度氣氛中孵育培養(yǎng)物8-20天，使用倒置顯微鏡密切監(jiān)視集落生長。在此期間，體外腫瘤生長導(dǎo)致直徑＞50μm的集落形成。在最大集落形成時，用自動圖象分析系統(tǒng)(OMNICON FAS IV，Biosys GmbH)進行計數(shù)。在評價前24小時，用2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑氯化物的無菌水溶液(1mg/ml，100μl/孔)[i]染色活集落。
如果滿足下面的質(zhì)量控制標準，則認為分析完全可評價-24多孔板的對照組孔中的平均集落數(shù)≥20個集落且集落直徑＞50μm-陽性參考化合物5-氟尿嘧啶(5-FU)(在1000μg/ml中毒劑量時)必須實現(xiàn)＜20％對照的集落存活率-第0或2天上的初始板計數(shù)＜20％的最終對照組計數(shù)
-對照組中的變異系數(shù)≤50％數(shù)據(jù)評價用存活率百分數(shù)表示藥物效應(yīng)，通過比較處理板中的平均集落數(shù)和未處理對照的平均集落計數(shù)得到(相對集落計數(shù)用試驗組對對照組值表示，T/C值[％]) IC50和IC70值，分別是抑制50％(T/C＝50％)和70％(T/C＝30％)集落形成需要的藥物濃度，通過繪制化合物濃度對相對集落計數(shù)的曲線確定。根據(jù)下式計算平均IC50和IC70值；平均IC50,70=10[ΣX=1nlg(IC50,70)n]]]>其中x為特異性腫瘤模型，n為研究的腫瘤模型總數(shù)。如果在試驗的劑量范圍內(nèi)不能確定IC50或IC70值，則使用研究的最低或最高濃度用于計算。
在均值圖形分析(IC曲線)中，在個別腫瘤類型中得到的試驗化合物的IC70值分布以相對于對全部試驗?zāi)[瘤的得到的平均IC70值給出。個別IC70值表示為對數(shù)坐標軸中的條(bar)。條左邊顯示低于平均值的IC70值(代表較敏感的腫瘤模型)，條右邊顯示較高的值(代表有相當(dāng)抗性的腫瘤模型)。因此IC曲線反映了化合物抗增殖圖的指紋。
試驗過程roscovitine與標準藥劑的聯(lián)合細胞系下面表1中顯示了6種人腫瘤細胞系的特征。
表1用于試驗roscovitine與標準藥劑聯(lián)合的細胞系
ud＝未分化，pd＝分化不足，md＝中度分化，wd＝充分分化，mm＝惡性黑素瘤；ND＝未測定肺癌細胞系LXFA 629L由人腫瘤異種移植物建立，如Roth等人1999年所述[Roth T，Burger AM，Dengler W，Willmann H，F(xiàn)iebig HH.Human tumorcell lines demonstrating the characteristics of patient tumors as useful models foranticancer drug screening.InFiebig HH，Burger AM(eds)，Relevance of TumorModels for Anticancer Drug Development Contrib.Oncol.1999，54145-156]。Fiebig等人于1992年描述了供體異種移植物源[Fiebig HH，Dengler WA，Roth T.Human tumor xenograftsPredictivity，characterization，and discoveryof new anticancer agents.InFiebig HH，Burger AM(eds)，Relevance of TumorModels for Anticancer Drug Development Contrib.Oncol.1999，5429-50]。
細胞系DLD1和HT29(結(jié)腸)以及前列腺癌DU145和PC3M得自US-NCI(National Cancer Institute，USA)。
前列腺癌22RV1購自American Type Culture Collection(ATCC)。
按常規(guī)每周傳代細胞1次或2次。在培養(yǎng)物中保持它們不超過20次傳代。在補充有10％胎牛血清(Sigma，Deisenhofen，Germany)和0.1％慶大霉素(Invitrogen)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中于37℃下和濕度氣氛(95％空氣，5％CO2)中培育所有細胞。
細胞增殖分析使用改性碘化丙啶(propidium iodide)分析評定roscovitine對人腫瘤細胞系生長的影響[Dengler WA，Schulte J，Berger DP等人(1995).Development ofa propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytotoxicity assay.Anti-Cancer Drugs 1995，6522-532]。簡單地說，通過胰蛋白酶化從指數(shù)生長期培養(yǎng)物中富集細胞，計數(shù)并以與細胞系有關(guān)的細胞密度(5-12.000活細胞/孔)接種在96孔平底微量滴定板中。在24小時使細胞重新開始指數(shù)生長的恢復(fù)期后，向孔中加入20μl培養(yǎng)基(每板3個對照孔)或包含各種濃度的試驗制品No.1(標準藥劑)的培養(yǎng)基。每種濃度一式三份接種。在每個板上，在微量滴定板的4個區(qū)域4次施加5種濃度的試驗制品No.1。區(qū)域1用于單獨的試驗制品No.1，在區(qū)域2-4，在3個不同的時間點分別施加試驗制品No.2(roscovitine)。在試驗制品連續(xù)暴露4天后，用200μl碘化丙啶(PI)水溶液(7μg/ml)代替有或沒有藥物的細胞培養(yǎng)基。由于PI只通過滲漏的或細胞溶解的細胞膜，因此可染色并測量死細胞的DNA，而活細胞不能被染色。為測量活細胞的比例，通過冷凍板引起全部細胞死亡使細胞透過。在解凍板后，然后使用Cytofluor 4000微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(激發(fā)530nm，發(fā)射620nm)測量熒光，給出與總細胞數(shù)的直接關(guān)系。生長抑制率表示為處理的/對照×100(％T/C)，通過繪制化合物濃度對細胞存活率的曲線確定每種聯(lián)合的IC50、IC70和IC90值。
MTT分析利用MTT分析系統(tǒng)評價有和沒有吉西他濱的roscovitine。MTT分析為基于活細胞將MTT轉(zhuǎn)化成甲(formazan)的能力的分光光度分析。通過測量在測試波長570nm和參考波長630nm處的吸收度估計細胞濃度。使用自動過程測定這些研究中使用的所有藥劑的IC50值(抑制50％對照物細胞生長的藥物濃度)。考慮未來臨床試驗設(shè)計選擇有特異性可能的細胞系。
開始時，分別試驗一系列濃度的roscovitine和吉西他濱。在初始IC50分析完成后，然后測試聯(lián)合。對于聯(lián)合研究，用于表征相互作用類型的濃度(表示為單獨藥劑IC50的百分數(shù))圖表示在下面
藥物濃度(表示為IC50的百分數(shù))roscovitine吉西他濱100 0752560405050406025750 1000 0聯(lián)合研究的統(tǒng)計分析為了解釋聯(lián)合曲線，對每一測試聯(lián)合(75∶25roscovitine/吉西他濱)和端點(100∶0-roscovitine和0∶100-吉西他濱)進行統(tǒng)計比較。在聯(lián)合(roscovitine和吉西他濱)吸收率值和兩個端點值(單獨roscovitine和吉西他濱)之間存在差異，則認為統(tǒng)計學(xué)顯著[Greco等人，The search for synergy；Acritical reviewfrom a response surface perspective。Pharmacol；Review 47331-385，1995；Laska等人，Simple designs and model-free tests for synergy；Biometrics 50834-841，1994]。如果大多數(shù)(≥3/5)的值在統(tǒng)計上超過或低于線(端點)，則分別描述拮抗作用或協(xié)同作用。否則，模式更與加和相互作用一致。
結(jié)果Roscovitine暴露然后暴露于吉西他濱在這些研究中，乳腺腫瘤細胞(MDA-435)預(yù)先暴露于Roscovitine中24小時，然后暴露于吉西他濱24小時(表2和3，圖1)。對兩種藥劑的這種暴露順序產(chǎn)生了表明這些藥劑之間協(xié)同相互作用的模式。
表2
表3
同時暴露于Roscovitine和吉西他濱當(dāng)人前列腺腫瘤細胞同時暴露于Roscovitine和吉西他濱時，觀察到加和的藥物-藥物相互作用(表4和5，圖2)。
表4
表5
作為總結(jié)，結(jié)果表明，與單獨或同時給藥任何一種藥物相比，聯(lián)合給藥吉西他濱和Roscovitine能產(chǎn)生增強的效應(yīng)。這種效應(yīng)表明了兩種成分之間的協(xié)同相互作用。
在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本發(fā)明的各種改變和變化對本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來說是顯而易見的。盡管已結(jié)合具體的優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)該認識到要求的本發(fā)明不應(yīng)該不適當(dāng)?shù)叵拗浦吝@種具體實施方案。事實上，對相關(guān)領(lǐng)域那些技術(shù)人員明顯的用于實施本發(fā)明上述方式的各種改變都被本發(fā)明覆蓋。
權(quán)利要求
1.一種聯(lián)合，包括CDK抑制劑和吉西他濱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合，其中CDK抑制劑為CDK2或CDK4的抑制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聯(lián)合，其中CDK抑制劑選自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奧羅莫星。
4.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的聯(lián)合，其中CDK抑制劑為roscovitine。
5.一種藥物組合物，包括根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的聯(lián)合和藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的聯(lián)合在制備治療增殖性疾病的藥物中的用途。
7.一種藥物制品，包括CDK抑制劑和吉西他濱，作為在治療中同時、依次或分別使用的聯(lián)合制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物制品，其中CDK抑制劑為CDK2或CDK4的抑制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的藥物制品，其中CDK抑制劑選自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奧羅莫星。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項所述的藥物制品，其中CDK抑制劑為roscovitine。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項所述的藥物制品，以包括藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物的形式存在。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至11中任一項所述的藥物制品，用于治療增殖性疾病。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物制品，其中增殖性疾病為癌癥。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物制品，其中癌癥為前列腺癌。
15.一種治療增殖性疾病的方法，所述方法包括同時、依次或分別地對患者給藥吉西他濱和CDK抑制劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，包括在對患者依次或分別地給藥吉西他濱前對所述患者給藥所述CDK抑制劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，包括在對患者依次或分別地給藥CDK抑制劑前對所述患者給藥吉西他濱。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項所述的方法，其中CDK抑制劑為CDK2或CDK4的抑制劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中CDK抑制劑選自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奧羅莫星。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中CDK抑制劑為roscovitine。
21.根據(jù)權(quán)利要求15至20中任一項所述的方法，其中相對于單獨成分，分別以治療有效量給藥CDK抑制劑和吉西他濱。
22.根據(jù)權(quán)利要求15至20中任一項所述的方法，其中相對于單獨成分，分別以亞治療量給藥CDK抑制劑和吉西他濱。
23.根據(jù)權(quán)利要求15至22中任一項所述的方法，其中增殖性疾病為癌癥。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中癌癥為肺癌或胰腺癌。
25.CDK抑制劑在制備治療增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述治療包括同時、依次或分別地對患者給藥吉西他濱和CDK抑制劑。
26.CDK抑制劑和吉西他濱在制備治療增殖性疾病的藥物中的用途。
27.CDK抑制劑在制備治療增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述藥物用于與吉西他濱的聯(lián)合治療。
28.吉西他濱在制備治療增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述藥物用于與CDK抑制劑的聯(lián)合治療。
全文摘要
本發(fā)明的第一方面涉及包括CDK抑制劑和吉西他濱的聯(lián)合。本發(fā)明的第二方面涉及包括CDK抑制劑和吉西他濱的藥物制品，作為在治療中同時、依次或分別使用的聯(lián)合制劑。本發(fā)明的第三方面涉及治療增殖性疾病的方法，所述方法包括同時、依次或分別地對患者給藥CDK抑制劑和吉西他濱。
文檔編號A61K45/06GK1708319SQ200380102233
公開日2005年12月14日 申請日期2003年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月6日
發(fā)明者阿索斯·賈內(nèi)拉－博爾－拉多里 申請人:西克拉塞爾有限公司