專利名稱：抗流感病毒的藥物有效部位及活性成分的分離制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥有效部位及活性成分，特別是涉及一種抗流感病毒的中藥有效部位及活性成分的分離制備方法。
背景技術(shù)：
感冒是臨床常見病、多發(fā)病，尤其是由流感病毒引起的流行性感冒，對人體危害更大。目前用于治療感冒的中藥制劑和西藥制劑都很多見，但是從純中藥制劑中分離出具有抗流感病毒活性的藥物有效部位及活性成分的方法及相關(guān)制劑并不多見。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的在于提供一種抗流感病毒的中藥有效部位及活性成分的分離制備方法；本發(fā)明的目的還在于提供所述中藥有效部位及活性成分的抗流感病毒新用途；本發(fā)明目的還在于提供一種由所述中藥有效部位及活性成分制成的藥劑；本發(fā)明目的還在于提供一種新的化合物。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的按比例稱取金銀花9重量份、連翹9重量份、牛蒡子9重量份、甘草5重量份、薄荷6重量份、荊芥6重量份、桔梗6重量份、淡豆豉6重量份、淡竹葉4重量份，混合均勻，加水煎煮2-3次，合并各次水煎液，濃縮，通過弱極性的大孔吸附樹脂進行吸附，待水煎液全部通過樹脂柱后，用水繼續(xù)沖洗樹脂柱，至水洗液近無色止，然后再用40-70％乙醇對樹脂柱上吸附的物質(zhì)進行洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至干，即得到復方中藥抗流感病毒活性部位。
本發(fā)明抗流感病毒活性部位為淡黃色粉末，具有一定的吸濕性，易溶于水和稀乙醇，難溶于氯仿、石油醚等親脂性有機溶劑。三氯化鐵反應陽性，鹽酸-鎂粉反應陽性，沒食子酸-濃硫酸反應陽性，α-萘酚-濃硫酸反應陽性。主要含有黃酮類和木脂素類成分，其中總黃酮成分的含量為35.0％，總木脂素類成分的含量為21.1％。另含有一定量的三萜類、酚酸類和其它成分。
本發(fā)明抗病毒活性成分的分離方法取本發(fā)明抗流感病毒活性部位300重量份，通過弱極性大孔吸附樹脂，用30％、50％、70％、95％乙醇水溶液依次進行洗脫，各部分洗脫液減壓回收溶劑后，分別得到30％乙醇洗脫物A72重量份，50％乙醇洗脫物B93重量份，70％乙醇洗脫物C12重量份，95％乙醇洗脫物D6重量份。
上述95％乙醇洗脫物D，用聚酰胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
30％乙醇洗脫部分用Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物丙烯酸鹽。
50％乙醇洗脫部分經(jīng)硅膠柱層析分離，20∶1，18∶1，15∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，其中15∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫部分經(jīng)SephadexLH-20柱層析分離，甲醇洗脫，得到化合物金合歡素。
上述70％乙醇洗脫物C，用聚酰胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、30％乙醇洗脫部分和50％乙醇洗脫部分，水洗脫部分用Sephadex LH-20柱層析分離，水洗脫，得到化合物甘草次酸和連翹苷；30％乙醇洗脫部分經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，硅膠柱層析分離，19∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫、Sephadex LH-20柱層析分離，甲醇洗脫，得到化合物醉魚草苷；50％乙醇洗脫部分經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，硅膠柱層析分離，10∶1，9∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，其中自6∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫部分得到化合物連翹酯苷。
上述50％乙醇洗脫物B，用聚酰胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
水洗脫部分用硅膠柱層析分離，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
水洗脫部分用硅膠柱層析分離，98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1氯仿-甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，依次分為14個部分。其中部分4用硅膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物牛蒡子苷；部分7用硅膠柱層析分離，11∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物橙皮苷；部分9經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物烏拉爾甘草皂苷甲，烏拉爾甘草皂苷乙；部分14經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物甘草酸。
30％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到第1、2、3部分；7∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到第4、5、6部分；4∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到第7部分。其中自部分1得到化合物芒柄花素；部分2經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，甲醇洗脫，聚酰胺柱層析分離，19∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，得到化合物蘆丁和異甘草素；部分7經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，聚酰胺柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，1∶1甲醇-水混合溶劑為流動相半制備高效液相色譜分離制備，得到化合物異甘草素-2’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷。
50％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，60∶1，50∶1，40∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為8個部分，其中自部分1得到化合物大豆素；部分2經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，80％甲醇洗脫，得到化合物染料木素；部分8用硅膠柱層析分離，20∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物三十八烯醇。
上述30％乙醇洗脫物A，用聚酰胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
水洗脫部分用硅膠柱層析分離，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為14個部分。其中部分13經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，50％甲醇洗脫，得到化合物異甘草素-4’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷。
10％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到10個部分。其中自部分2得到化合物甘草苷，自部分10得到化合物甘草素-4’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；部分9用聚酰胺柱層析分離，5∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，得到化合物金絲桃苷。
30％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，40∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為12個部分，其中自部分12得到化合物異甘草素-4-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；部分2經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，50％甲醇洗脫，得到化合物綠原酸；部分10用半制備高效液相色譜分離制備，1∶20甲醇-3％醋酸混合溶劑為流動相，得到化合物4，5-二咖啡?；鼘幩?，3，5-二咖啡酰基奎寧酸，3，4-二咖啡?；鼘幩?。
50％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為15個部分，其中自部分7得到化合物6-甲氧基大豆素；部分14經(jīng)制備薄層層析，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑為展開劑]制備得到化合物異甘草苷。
70％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為8個部分。其中自部分5得到化合物3，3’，4-三甲氧基鞣花酸，自部分8得到化合物甘草素。
上述分離得到的31個化合物的結(jié)構(gòu)均經(jīng)理化常數(shù)測定及波譜學方法(紫外光譜、紅外光譜、氫核磁共振光譜、碳核磁共振光譜和質(zhì)譜等)予以測定。其中異甘草素-2’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷為新化合物，丙烯酸鹽、金合歡素、醉魚草苷、大豆素、染料木素、三十八烯醇、6-甲氧基大豆素、3，3’，4-三甲氧基鞣花酸等8個化合物為首次從本發(fā)明各單味藥中分離得到的已知化合物，其余22個化合物為首次從本發(fā)明中分離得到的已知化合物。
本發(fā)明活性部位及活性成份均可按常規(guī)工藝制成任何臨床上可接受的劑型。
發(fā)明人采用雞胚法和病毒致細胞病變作用(CPE)方法，考察了本發(fā)明煎劑和本發(fā)明抗流感病毒活性部位的抗流感病毒活性。
1.實驗材料病毒毒株甲型流感病毒(A1京防86-1)，乙型流感病毒(B1京防93-184)，由北京市防疫站提供。
細胞株MDCK細胞，由國家流感中心提供。細胞生長液為含小牛血清、青霉素、鏈霉素和谷胺酰胺的Eagle’s液。維持液同生長液，但不含小牛血清，而含終濃度為2mg/L的胰酶。
樣品(本發(fā)明煎劑)按本發(fā)明原方比例(金銀花∶連翹∶牛蒡子∶甘草∶薄荷∶荊芥∶桔?！玫刽玫袢~為9∶9∶9∶5∶6∶6∶6∶6∶4)，取金銀花、連翹等9味藥共60g，混合均勻，加水煎煮2次(第一次加水1000mL，煎煮2小時；第二次加水800mL，煎煮1.5小時)。合并2次水煎液，共計1300mL，水浴濃縮至干。實驗前，以高純水配置成相當于生藥0.01g/mL的濃度。
樣品(本發(fā)明抗病毒活性部位)取本發(fā)明抗流感病毒活性部位以高純水配置成相當于生藥0.01g/mL的濃度。
陽性對照藥病毒唑，湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究所出品。實驗前，以高純水配置成0.005g/mL的濃度。
2.抗病毒實驗2.1雞胚法將雞胚在實驗室39℃下孵育至10天胚齡，于尿囊腔分別接種100EID50甲型和乙型流感病毒，接種量為0.1ml/胚，每組實驗均接種20枚雞胚。室溫放置1小時后，對照組尿囊腔給予生理鹽水0.2ml，實驗組分別給予本發(fā)明煎劑和本發(fā)明抗流感病毒活性部位0.2ml，陽性對照組給予病毒唑0.2ml。石蠟封口，置孵箱內(nèi)孵化，48小時后將雞胚置冰箱內(nèi)2小時，收獲尿囊液，進行血凝實驗。
表1 對雞胚內(nèi)甲/乙流感病毒的作用*組別n 血凝(枚) 陽性 陰性生理鹽水 20/20 20/20 0/0本發(fā)明煎劑**20/20 4/316/17本發(fā)明抗病毒活性部位**20/20 0/020/20病毒唑***20/20 0/020/20*甲A/京防86-1，乙B/京防93-184**本發(fā)明、本發(fā)明抗病毒活性部位相當于生藥0.01g/mL***病毒唑0.005g/mL
表2對甲/乙流感病毒殺滅、預防和治療作用*給藥時間本發(fā)明煎劑**本發(fā)明活性部位**病毒唑***病毒對照病毒感染同時3.5/3.0 2.0/1.5 1.5/1.3 6.5/5.5病毒感染前 3.0/3.5 1.5/1.8 1.5/1.5 7.0/6.0病毒感染后 4.0/2.5 2.5/1.5 2.0/1.5 6.5/4.5*甲A/京防86-1，乙B/京防93-184**本發(fā)明、本發(fā)明抗病毒活性部位相當于生藥0.01g/mL***病毒唑0.005g/mL表3 不同濃度本發(fā)明抗流感病毒活性部位在細胞中抗甲/乙流感病毒作用*病毒 給藥時間本發(fā)明抗病毒活性部位濃度 病毒對照0.01g/mL0.005g/mL 0.0025g/mL甲/乙 病毒感染同時2.0/1.5 3.5/2.5 5.0/4.5 6.5/5.5*甲A/京防86-1，乙B/京防93-1842.2毒致細胞病變作用(CPE)取成片MDCK細胞，棄去生長液，用Hank’s液洗一次。將A1京防86-1和B1京防93-184病毒配置成10-1～10-8稀釋液，然后分別加入試管中。2小時后倒掉病毒液，用Hank’s液洗一次，在分別加入相當于生藥濃度0.01g/ml的本發(fā)明煎劑和本發(fā)明抗流感病毒活性部位以及終濃度為0.005g/ml的病毒唑，對照組分別加入1ml維持液。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72小時后在倒置顯微鏡下觀察。
表4 本發(fā)明抗流感病毒活性部位在MDCK細胞中的抗病毒作用樣品TCID50甲型流感病毒 乙型流感病毒生理鹽水 6.5 4.5本發(fā)明煎劑 4.0 2.5本發(fā)明抗病毒活性部位 2.5 1.5病毒唑 2.0 1.53.實驗結(jié)果由表1～3可知，本發(fā)明抗病毒活性部位和陽性對照組均未出現(xiàn)血凝現(xiàn)象，說明本發(fā)明抗病毒活性部位對甲型和乙型流感病毒均有顯著的抑制作用，使流感病毒滴度降低。由表4可知，本發(fā)明抗病毒活性部位對甲型和乙型流感病毒，其TCID50比病毒對照組低1.5log以上，說明本發(fā)明抗流感病毒活性部位在這兩種病毒感染過程中具有治療作用。
發(fā)明人還對抗流感病毒活性部位的抗流感病毒作用機理進行了研究1 實驗材料1.1藥物與試劑受試藥物本發(fā)明抗流感病毒活性部位陽性對照藥病毒唑(virazole)，湖北省濱湖制藥廠產(chǎn)品，為原料藥(批號970512)，體外實驗時以高純水配制成藥物濃度為0.5mg/ml的原藥液。
試劑細胞培養(yǎng)液含10％小牛血清、0.29g/ml谷氨酰胺、100u/ml青、鏈霉素的Eagle’s MEM(日本日水制藥株式會社出品)；細胞維持液除所含小牛血清為2％外，其它含量均同培養(yǎng)液。
1.2 病毒與細胞病毒呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒-I型(HN-I)、流感病毒A3型，購自中國預防醫(yī)學科學院病毒研究所及兒科研究所，中國中醫(yī)研究院中藥研究所病毒室傳代，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 細胞人喉癌傳代細胞Hep-2株，由衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所提供。
1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱，日本Yamato科學株式會社制造；倒置顯微鏡，德國產(chǎn)Olympus牌。
2 實驗方法2.1 本發(fā)明抗流感病毒活性部位對Hep-2培養(yǎng)細胞的毒性試驗將本發(fā)明抗流感病毒活性部位樣品液(實驗前用高純水配制成藥物濃度為100mg/ml的原藥液，過濾除菌)以細胞培養(yǎng)液作1∶2～1∶256倍比稀釋。取已長成單層的Hep-2細胞，倒掉培養(yǎng)液，加入不同稀釋度的藥液，每孔加100μl，每個稀釋度各加4個復孔，同時設(shè)正常細胞對照。將培養(yǎng)板置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，每日用倒置顯微鏡觀察藥液對細胞的影響，以細胞不出現(xiàn)退變的最小稀釋度判定為藥物對細胞的最大無毒濃度。
通過毒性試驗觀察到1∶256倍比稀釋的本發(fā)明抗流感病毒活性部位原藥液對細胞生長無明顯影響，故定為最大無毒濃度(即最大有效濃度)，實驗時以最大有效濃度順延至最小有效濃度。
2.2本發(fā)明抗流感病毒活性部位對病毒致細胞病變作用(CPE)的影響2.2.1先感染后加藥取已長成單層細胞的96孔培養(yǎng)板，倒掉培養(yǎng)液，分別接種100TCID50的不同病毒液50μl/孔，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中吸附1h；倒掉病毒液，用不含小牛血清的細胞維持液洗細胞面3次，然后加入相應稀釋度的藥液100μl/孔，每個稀釋度作4個復孔，同時設(shè)病毒對照、正常細胞對照及陽性藥對照。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在倒置顯微鏡下鏡檢1次，觀察細胞有無病變及病變進展情況。
2.2.2先加藥后感染取已長成單層細胞的96孔培養(yǎng)板，倒掉培養(yǎng)液，加入相應稀釋度的藥液100μl/孔，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中作用1h；倒掉藥液，再感染100TCID50的不同病毒液50μl/孔，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中吸附1h；倒掉病毒液，用細胞維持液洗細胞面3次，然后每孔加入100μl細胞維持液，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在倒置顯微鏡下鏡檢1次，觀察細胞有無病變及病變進展情況。
2.2.3對病毒的直接殺滅作用把100TCID50的不同病毒液加入到相應稀釋度的藥液中，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中作用1h；之后將其加入到已長成單層細胞的96孔培養(yǎng)板中，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中吸附1h；倒掉溶液，用細胞維持液洗細胞面3次，然后每孔加入100μl細胞維持液，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在倒置顯微鏡下鏡檢1次，觀察細胞有無病變及病變進展情況。
3 實驗結(jié)果上述實驗中，當病毒對照組細胞病變達到“++++”時記錄實驗結(jié)果。細胞病變程度(CPE)的判斷按以下6級分類標準，結(jié)果采用秩和檢驗進行統(tǒng)計學處理。細胞病變程度(CPE)判斷的6級分類標準“-”細胞正常生長，無病變出現(xiàn)；“±”細胞病變少于整個單層細胞的10％；“+”細胞病變約占整個單層細胞的25％；“++”細胞病變約占整個單層細胞的50％；“+++”細胞病變約占整個單層細胞的75％；“++++”細胞病變約占整個單層細胞的75％以上。同時計算相應的有效濃度范圍、抑制50％細胞病變的藥物濃度(IC50)及治療指數(shù)(TI)。實驗結(jié)果見表5、6、7。
有效濃度＝原藥液濃度/稀釋倍數(shù)治療指數(shù)＝最大無度濃度/最小有效濃度IC50按Reed-Muench法計算。
表5 本發(fā)明抗流感病毒活性部位的抗病毒活性濃度 先感染后加藥 先加藥后感染 對病毒的直接殺滅作用藥物(mg/ml)流感病毒A3HN-I RSV 流感病毒A3HN-I RSV influenza A3virus HN-IRSV0.390 ----** ----** 44443333 4444 44443333 44444444本發(fā)明0.195±±±±**±±±±* 44443333 4444 44443333 44444444抗流感0.0971111**2322** 44443333 4444 44443333 44444444病毒活0.0493333 4444 44443333 4444 44443333 4444 4444性部位0.0243333 4444 4444 3333 4444 44443333 4444 44440.500----**----** 3333 1111** ±±±±** 4444±±±±**±±±±** 44440.250----**----** 4444 2222* 1111** 44441111**1111** 4444病毒唑0.125 ±±±±**±±±±** 4444 3333 3333 44443333 3333 44440.062 3333 44444444 3333 4444 44443333 4444 44440.031 3333 44444444 3333 4444 44443333 4444 4444生理鹽水 3333 44444444 3333 4444 44443333 3333 4444注表中的數(shù)字為每個細胞孔的細胞病變程度(CPE)相應的病變等級。
與病毒對照組比較**P＜0.01*P＜0.05表5結(jié)果顯示，藥物直接作用于病毒及先給藥物后再感染病毒時，本發(fā)明抗流感病毒活性部位均沒有表現(xiàn)出抑制作用；而當先感染病毒后再給藥時，本發(fā)明抗流感病毒活性部位對流感病毒A3和副流感病毒所致細胞病變則表現(xiàn)出明顯的抑制作用，與病毒對照組比較有顯著性差異(P＜0.05＝；而對RSV則無效。
表6本發(fā)明抗流感病毒活性部位有效濃度范圍(mg/ml)本發(fā)明抗流感病毒活性部位 病毒唑流感病毒A30.097～0.390 0.125～0.500HN-I 0.097～0.390 0.250～0.500RSV ——注“—”表示對所試病毒無效表6結(jié)果顯示，在體外本發(fā)明抗流感病毒活性部位對對流感病毒A3和副流感病毒有明顯的抑制作用，有效濃度在0.097～0.390mg/ml之間，與陽性藥病毒唑作用相當。
表7本發(fā)明抗流感病毒活性部位的IC50(mg/ml)和治療指數(shù)TI本發(fā)明抗流感病毒活性部位 病毒唑IC50TI IC50TI流感病毒A30.0714 8.91 4HN-I 0.0834 8.91 2RSV — — ——注“—”表示對所試病毒無效表7結(jié)果顯示，在體外本發(fā)明抗流感病毒活性部位對流感病毒A3和副流感病毒的IC50在0.071～0.083之間，治療指數(shù)均為4。
實施例1按比例稱取金銀花0.9kg、連翹0.9kg、牛蒡子0.9kg、甘草0.5kg、薄荷0.6kg、荊芥0.6kg、桔梗0.6kg、淡豆豉0.6kg、淡竹葉0.4kg，取金銀花、連翹等9味藥共6kg，混合均勻，加水煎煮2次，第一次加水100L，煎煮2小時；第二次加水80L，煎煮1.5小時；合并2次水煎液，濃縮至60L；通過弱極性的AB-8大孔吸附樹脂進行吸附，樹脂體積為15L，吸附流速為2L/h；待水煎液全部通過樹脂柱后，用8倍樹脂體積，即約120L的水繼續(xù)沖洗樹脂柱，至水洗液近無色止，然后再用8倍樹脂體積，即約120L的50％乙醇對樹脂柱上吸附的物質(zhì)進行洗脫，洗脫流速為2L/h；收集50％乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至干，即得到本發(fā)明抗流感病毒活性部位350g。計算本發(fā)明抗流感病毒活性部位的得率為5.83％。
實施例2按比例稱取金銀花0.9kg、連翹0.9kg、牛蒡子0.9kg、甘草0.5kg、薄荷0.6kg、荊芥0.6kg、桔梗0.6kg、淡豆豉0.6kg、淡竹葉0.4kg，取金銀花、連翹等9味藥共6kg，混合均勻，加水煎煮3次，第一次加水100L，煎煮2小時；第二、三次加水80L，煎煮1.5小時；合并3次水煎液，濃縮至60L；通過弱極性的AB-8大孔吸附樹脂進行吸附，樹脂體積為15L，吸附流速為2L/h；待水煎液全部通過樹脂柱后，用8倍樹脂體積，即約120L的水繼續(xù)沖洗樹脂柱，至水洗液近無色止，然后再用8倍樹脂體積，即約120L的60％乙醇對樹脂柱上吸附的物質(zhì)進行洗脫，洗脫流速為2L/h；收集60％乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至干，即得到本發(fā)明抗流感病毒活性部位350g。計算本發(fā)明抗流感病毒活性部位的得率為5.83％；將活性部位常規(guī)賦性劑制成膠囊。
實施例3活性成份的分離方法取本發(fā)明抗流感病毒活性部位300g，通過弱極性大孔吸附樹脂，用30％、50％、70％、95％乙醇水溶液依次進行洗脫，各部分洗脫液減壓回收溶劑后，分別得到30％乙醇洗脫物A72g，50％乙醇洗脫物B93g，70％乙醇洗脫物C12g，95％乙醇洗脫物D6g。
上述95％乙醇洗脫物D，用聚酰胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
30％乙醇洗脫部分用Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物丙烯酸鹽5mg。
50％乙醇洗脫部分經(jīng)硅膠柱層析分離，20∶1，1 8∶1，15∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，其中15∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫部分經(jīng)SephadexLH-20柱層析分離，甲醇洗脫，得到化合物金合歡素18mg。
上述70％乙醇洗脫物C，用聚酰胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、30％乙醇洗脫部分和50％乙醇洗脫部分，水洗脫部分用Sephadex LH-20柱層析分離，水洗脫，得到化合物甘草次酸10mg和連翹苷22mg；30％乙醇洗脫部分經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，硅膠柱層析分離，19∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫、Sephadex LH-20柱層析分離，甲醇洗脫，得到化合物醉魚草苷18mg；50％乙醇洗脫部分經(jīng)SephadexLH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，硅膠柱層析分離，10∶1，9∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，其中自6∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫部分得到化合物連翹酯苷5mg。
上述50％乙醇洗脫物B，用聚酰胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
水洗脫部分用硅膠柱層析分離，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
水洗脫部分用硅膠柱層析分離，98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1氯仿-甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，依次分為14個部分。其中部分4用硅膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物牛蒡子苷95mg；部分7用硅膠柱層析分離，11∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物橙皮苷16mg；部分9經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物烏拉爾甘草皂苷甲24mg，烏拉爾甘草皂苷乙18mg；部分14經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物甘草酸18mg。
30％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到第1、2、3部分7∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到第4、5、6部分；4∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到第7部分。其中自部分1得到化合物芒柄花素8mg；部分2經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，甲醇洗脫，聚酰胺柱層析分離，19∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，得到化合物蘆丁33mg和異甘草素2 1mg；部分7經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，聚酰胺柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，1∶1甲醇-水混合溶劑為流動相半制備高效液相色譜分離制備，得到化合物異甘草素-2’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷12mg。
50％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，60∶1，50∶1，40∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為8個部分，其中自部分1得到化合物大豆素23mg；部分2經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，80％甲醇洗脫，得到化合物染料木素18mg；部分8用硅膠柱層析分離，20∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物三十八烯醇12mg。
上述30％乙醇洗脫物A，用聚酰胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
水洗脫部分用硅膠柱層析分離，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為14個部分。其中部分13經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，50％甲醇洗脫，得到化合物異甘草素-4’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷42mg。
10％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到10個部分。其中自部分2得到化合物甘草苷33mg；自部分10得到化合物甘草素-4’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷5mg；部分9用聚酰胺柱層析分離，5∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，得到化合物金絲桃苷15mg。
30％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，40∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為12個部分，其中自部分12得到化合物異甘草素-4-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷12mg；部分2經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，50％甲醇洗脫，得到化合物綠原酸13mg；部分10用半制備高效液相色譜分離制備，1∶20甲醇-3％醋酸混合溶劑為流動相，得到化合物4，5-二咖啡?；鼘幩?mg，3，5-二咖啡?；鼘幩?mg，3，4-二咖啡?；鼘幩? 2mg。
50％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，1 6∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為15個部分，其中自部分7得到化合物6-甲氧基大豆素4mg；部分14經(jīng)制備薄層層析，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑為展開劑]制備得到化合物異甘草苷12mg。
70％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為8個部分。其中自部分5得到化合物3，3’，4-三甲氧基鞣花酸50mg，自部分8得到化合物甘草素15mg。
權(quán)利要求
1.一種抗流感病毒的藥物有效部位，其特征在于該有效部位是由下述方法制得的按比例稱取金銀花0.9kg、連翹0.9kg、牛蒡子0.9kg、甘草0.5kg、薄荷0.6kg、荊芥0.6kg、桔梗0.6kg、淡豆豉0.6kg、淡竹葉0.4kg，取金銀花、連翹等9味藥共6kg，混合均勻，加水煎煮2次，第一次加水100L，煎煮2小時第二次加水80L，煎煮1.5小時合并2次水煎液，濃縮至60L；通過弱極性的AB-8大孔吸附樹脂進行吸附，樹脂體積為15L，吸附流速為2L/h待水煎液全部通過樹脂柱后，用8倍樹脂體積，即約120L的水繼續(xù)沖洗樹脂柱，至水洗液近無色止，然后再用8倍樹脂體積，即約120L的50％乙醇對樹脂柱上吸附的物質(zhì)進行洗脫，洗脫流速為2L/h；收集50％乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至干，即得到本發(fā)明抗流感病毒活性部位。
2.如權(quán)利要求1所述的有效部位，其特征在于該有效部位在制備抗流感病毒的藥物中的應用。
3.抗流感病毒的藥物活性成分，其特征在于該活性成分是由下述方法制得的按比例稱取金銀花9重量份、連翹9重量份、牛蒡子9重量份、甘草5重量份、薄荷6重量份、荊芥6重量份、桔梗6重量份、淡豆豉6重量份、淡竹葉4重量份，混合均勻，加水煎煮2-3次，合并各次水煎液，濃縮，通過弱極性的大孔吸附樹脂進行吸附，待水煎液全部通過樹脂柱后，用水繼續(xù)沖洗樹脂柱，至水洗液近無色止，然后再用40-70％乙醇對樹脂柱上吸附的物質(zhì)進行洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至干，即得到復方中藥抗流感病毒活性部位取本發(fā)明抗流感病毒活性部位300重量份，通過弱極性大孔吸附樹脂，用30％、50％、70％、95％乙醇水溶液依次進行洗脫，各部分洗脫液減壓回收溶劑后，分別得到30％乙醇洗脫物A72重量份，50％乙醇洗脫物B93重量份，70％乙醇洗脫物C12重量份，95％乙醇洗脫物D6重量份；上述95％乙醇洗脫物D，用聚酰胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分；30％乙醇洗脫部分用Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物丙烯酸鹽；50％乙醇洗脫部分經(jīng)硅膠柱層析分離，20∶1，18∶1，15∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，其中15∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫部分經(jīng)SephadexLH-20柱層析分離，甲醇洗脫，得到化合物金合歡素上述70％乙醇洗脫物C，用聚酰胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、30％乙醇洗脫部分和50％乙醇洗脫部分，水洗脫部分用Sephadex LH-20柱層析分離，水洗脫，得到化合物甘草次酸和連翹苷；30％乙醇洗脫部分經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，硅膠柱層析分離，19∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫、SephadexLH-20柱層析分離，甲醇洗脫，得到化合物醉魚草苷；50％乙醇洗脫部分經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，硅膠柱層析分離，10∶1，9∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，其中自6∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫部分得到化合物連翹酯苷上述50％乙醇洗脫物B，用聚酰胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分；水洗脫部分用硅膠柱層析分離，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分；水洗脫部分用硅膠柱層析分離，98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1氯仿-甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，依次分為14個部分；其中部分4用硅膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物牛蒡子苷；部分7用硅膠柱層析分離，11∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物橙皮苷；部分9經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物烏拉爾甘草皂苷甲，烏拉爾甘草皂苷乙部分14經(jīng)SephadexLH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物甘草酸；30％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到第1、2、3部分；7∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到第4、5、6部分；4∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到第7部分；其中自部分1得到化合物芒柄花素部分2經(jīng)SephadexLH-20柱層析分離，甲醇洗脫，聚酰胺柱層析分離，19∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，得到化合物蘆丁和異甘草素；部分7經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，聚酰胺柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，1∶1甲醇-水混合溶劑為流動相半制備高效液相色譜分離制備，得到化合物異甘草素-2’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；50％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，60∶1，50∶1，40∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為8個部分，其中自部分1得到化合物大豆素；部分2經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，80％甲醇洗脫，得到化合物染料木素；部分8用硅膠柱層析分離，20∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物三十八烯醇上述30％乙醇洗脫物A，用聚酰胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分；水洗脫部分用硅膠柱層析分離，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為14個部分；其中部分13經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，50％甲醇洗脫，得到化合物異甘草素-4’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；10％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到10個部分；其中自部分2得到化合物甘草苷，自部分10得到化合物甘草素-4’-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；部分9用聚酰胺柱層析分離，5∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，得到化合物金絲桃苷30％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，40∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為12個部分，其中自部分12得到化合物異甘草素-4-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；部分2經(jīng)SephadexLH-20柱層析分離，50％甲醇洗脫，得到化合物綠原酸；部分10用半制備高效液相色譜分離制備，1∶20甲醇-3％醋酸混合溶劑為流動相，得到化合物4，5-二咖啡?；鼘幩幔?，5-二咖啡?；鼘幩幔?，4-二咖啡酰基奎寧酸；50％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為15個部分，其中自部分7得到化合物6-甲氧基大豆素；部分14經(jīng)制備薄層層析，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑為展開劑制備得到化合物異甘草苷；70％乙醇洗脫部分用硅膠柱層析分離，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為8個部分其中自部分5得到化合物3，3’，4-三甲氧基鞣花酸，自部分8得到化合物甘草素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗流感病毒的藥物組合物及其有效部位和活性成分的分離制備方法，本發(fā)明所獲得的活性成分包括新化合物異甘草素－2’－O－芹糖(1－2)－葡萄糖苷和30種已知化合物，本發(fā)明有效部位及活性成分具有良好的殺滅流感病毒的作用。
文檔編號A61P1/16GK1504232SQ20031011343
公開日2004年6月16日 申請日期2001年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月12日
發(fā)明者石任兵, 劉斌, 陸蘊如, 石鉞, 何勤, 肖詩鷹 申請人:北京中醫(yī)藥大學