專利名稱：一種利用梅花鹿胎制備活性肽－鹿胎素的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于梅花鹿胎的深加工技術(shù)，具體涉及一種利用梅花鹿胎制備活性肽——鹿胎素的方法及該鹿胎素產(chǎn)品的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在傳統(tǒng)的制備鹿胎膏工藝中，水煮，熬制，破壞鹿胎中很多生物活性和藥效作用的成分，造成極大的資源浪費。最近有“提取純化鹿胎素的工藝方法”的專利申請，是利用生物技術(shù)從鹿胎中提取純化的方法，而本發(fā)明的目的是提供了一種利用梅花鹿胎，用蛋白水解酶制備具有生物活性鹿胎素的工藝方法，兩者具有本質(zhì)區(qū)別。本發(fā)明使鹿胎的生物活性和藥效作用發(fā)揮得更充分，利用的更完全，創(chuàng)造更大經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用酶水解的方法，以梅花鹿胎為原料制備活性肽的方法，及提供該產(chǎn)品的應(yīng)用。
本發(fā)明以梅花鹿胎為原料，取新鮮的或冷凍的鹿胎，洗凈、剪碎、攪成肉糜，用瓷盤在真空干燥箱中，在80℃以下真空干燥制成干粉，并用蒸餾水調(diào)制成濃度為2-15％的溶液，溫度在45-55℃，pH值在6-8，加入蛋白水解酶，其量是鹿胎干粉量的0.1-2％，在攪拌下，反應(yīng)2-6小時，期間保持pH恒定，終止反應(yīng)。將反應(yīng)液冷凍干燥制成干粉，也可在80℃下經(jīng)真空濃縮，制成所需濃度的溶液。


圖1本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實施例方式
下面我們結(jié)合本發(fā)明幾個實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實施例1將鹿胎干粉，用蒸餾水調(diào)制成濃度為10％的溶液，在溫度50℃，pH值7.0條件下，加入鹿胎干粉量的0.5％的胰蛋白水解酶，攪拌反應(yīng)4小時，期間保持pH恒定，終止反應(yīng)。反應(yīng)液冷凍干燥制成干粉。
實施例2將鹿胎干粉，用蒸餾水調(diào)制成濃度為10％的溶液，在溫度45℃，pH值6.7條件下，加入鹿胎干粉量的0.3％的木瓜蛋白水解酶，攪拌反應(yīng)4.5小時，期間保持pH恒定，終止反應(yīng)。反應(yīng)液冷凍干燥制成干粉。
實施例3將鹿胎干粉，用蒸餾水調(diào)制成濃度為3％的溶液，在溫度50℃，pH值7.0條件下，加入鹿胎干粉量的0.5％的中性蛋白水解酶，攪拌反應(yīng)5小時，期間保持pH恒定，終止反應(yīng)。反應(yīng)液冷凍干燥制成干粉。
本發(fā)明制備的梅花鹿胎活性肽——鹿胎素的藥理活性檢測實驗材料1.動物 昆明種小鼠體重11～14g和小鼠18～22g。Wistar大鼠體重60～80g，160～180g和300～350g。
2.藥物及試劑 鹿胎干粉為傳統(tǒng)制的鹿胎粉；鹿胎活性肽——鹿胎素為本發(fā)明制得的產(chǎn)品。
方法和結(jié)果1、鹿胎活性肽具有雌激素樣作用1.1對雌性幼小鼠動情期的影響將雌性幼小鼠60只按表1分組給藥，對照組按10ml/kg灌胃蒸餾水，每天灌胃一次，同時進(jìn)行陰道涂片檢查，觀察出現(xiàn)動情期的動物數(shù)(以出現(xiàn)大量形狀大而無規(guī)則的角化上皮細(xì)胞為指標(biāo))，結(jié)果見表1。鹿胎活性肽在給藥后可明顯促進(jìn)雌性幼小鼠動情期的出現(xiàn)。
表1 鹿胎活性肽對雌性幼小鼠動情期的影響(x±s n＝12)組別劑量 給藥后出現(xiàn)動情期小鼠數(shù)(mg/kg)8d9d10d11d12d對照 - 0 1 2 3 3己烯雌酚 4 2 8*9*11**12***鹿胎活性肽40 0 4 7*9*10*20 0 4 5 8*9*鹿胎粉500 0 3 4 5 7*
與對照比較 *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0011.2對去卵巢小鼠動情期的影響將成年小鼠80只摘除卵巢后，飼養(yǎng)20天，用陰道涂片法檢查，選出未出現(xiàn)動情期的小鼠，按表2分組給藥，觀察動情期出現(xiàn)的鼠數(shù)，結(jié)果見表2。鹿胎活性肽在給藥后可明顯促進(jìn)去卵巢小鼠動情期的出現(xiàn)。
表2 鹿胎活性肽對去卵巢小鼠動情期的影響(x±s n＝10)組別 劑量給藥后出現(xiàn)動情期小鼠數(shù)(mg/kg) 5d 6d 7d 8d 9d對照 - 00011己烯雌酚 4 02510***10***鹿胎活性肽40 00049**20 00027*鹿胎粉50000017*與對照比較 *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0011.3對雌性幼大鼠子宮重量和蛋白質(zhì)含量的影響將大鼠50只按表3分組給藥，于15天內(nèi)，每天灌胃給藥一次，對照組按10ml/kg灌胃蒸餾水，末次給藥1h后，處死動物，摘取子宮，稱重，同時按Lowry法測蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見表3。鹿胎活性肽可明顯增加雌性幼大鼠子宮重量和蛋白質(zhì)含量。
表3 鹿胎活性肽對雌性幼大鼠子宮重量和蛋白質(zhì)含量的影響(x±s n＝10)組別 劑量(mg/kg)子宮(mg/100g體重)蛋白質(zhì)(mg/10g子宮)對照 - 95±66 3.0±0.6己烯雌酚 4 160±47*5.1±0.9*鹿胎活性肽40 157±41*4.2±0.7*鹿胎活性肽20 150±37*4.0±0.6*鹿胎粉500144±38*3.8±0.9*由表1-3可知，鹿胎活性肽具有雌激素樣作用，作用強(qiáng)于鹿胎。2鹿胎活性肽具有延緩衰老(或皮膚衰老)，美容養(yǎng)顏作用。
2.1對雌性初老大鼠全血SOD和血漿MDA的影響將大鼠50只按表4分組給藥，每天一次，連續(xù)15天，末次給藥1h后，取血，用鄰苯三酚自氧化法測超氧化物歧化酶(SOD)活性，用TBA法測脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量，結(jié)果見表4。鹿胎活性肽可明顯增強(qiáng)雌性初老大鼠全 SOD活性，降低血漿MDA含量。提示鹿胎活性肽可用于延緩衰老(或皮膚衰老)，具有美容養(yǎng)顏作用。作用強(qiáng)于鹿胎。
表4 鹿胎活性肽對雌性初老大鼠SOD活性和MDA含量的影響(x±s n＝10)組別劑量(mg/kg)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)對照- 899±198 7.2±2.0鹿胎活性肽 20 1202±221*3.0±1.1***鹿胎活性肽 10 1103±210*4.5±2.0**鹿胎粉 5001002±231*5.5±2.6*3 鹿胎活性肽具有補(bǔ)血作用3.1鹿胎活性肽對小鼠缺鐵性貧血的影響 將上述貧血模型小鼠50只按表所示分組給藥，每組動物雌雄各半，每天灌胃給藥一次，對照組灌胃蒸餾水10ml/kg，于給藥后第3、7天，取血測RBC和Hb值，結(jié)果見表6和表5。另外，處死動物，取血，測血清鐵含量，結(jié)果見表7。
表5鹿胎活性肽對缺鐵性貧血小鼠血紅蛋白值的影響(x±s，n＝10)組別劑量 Hb(g/dL)(mg/kg)0d 3d 7d對照 -7.8±0.97.9±0.5 12±0.8鹿胎活性肽40 7.6±0.99.2±1.2**14±1.2***20 7.8±0.99.8±1.5**14±1.2***鹿胎粉500 7.7±0.99.0±1.8 13±1.3*與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，下同表6鹿胎活性肽對缺鐵性貧血小鼠紅細(xì)胞值的影響(x±s，n＝10)
組別 劑量RBC(1012/L)(mg/kg) 0d 3d 7d對照 - 4.5±1.25.0±0.46.2±0.4鹿胎活性肽4.04.6±0.85.9±0.96.7±0.4**2.04.7±0.75.9±0.76.7±0.5**鹿胎粉5004.7±0.95.8±1.56.2±1.2表7鹿胎活性肽對缺鐵性貧血小鼠血清鐵含量的影響(x±s，n＝10)組別 劑量(mg/kg)血清鐵(μg/dL)對照 -52±9.3鹿胎活性肽40 63±8.8**20 61±8.4**鹿胎粉500 59±8.0*由表可見，鹿胎活性肽于給藥后第3、7天可明顯增加缺鐵性貧血小鼠Hb含量；可明顯增加缺鐵性貧血小鼠RBC數(shù)量；可明顯增加缺鐵性貧血小鼠血清鐵含量。
本實驗研究表明，鹿胎活性肽對缺鐵性貧血小鼠具有補(bǔ)血作用。作用強(qiáng)于鹿胎4.鹿胎活性肽具有抗炎作用4.1對小鼠二甲苯引起小鼠耳腫脹的影響 將成年小鼠50只按表分組給藥，于7天內(nèi)，每天灌胃一次，對照組灌胃等體積蒸餾水，末次給藥后30min，將二甲苯滴于小鼠右耳，15min后，處死動物，用6mm打孔器在左右耳相同部位打孔，以兩耳片重量差值作為腫脹程度指標(biāo)，結(jié)果見表8。鹿胎活性肽對二甲苯引起小鼠耳腫脹具有明顯的抑制作用。
表8鹿胎活性肽對小鼠二甲苯引起小鼠耳腫脹的影響(x±s，n＝10)組別 劑量(mg/kg)兩耳片重量差值(mg)抑腫率(％)對照 - 8.2±3.1鹿胎活性肽405.0±2.0**46205.6±3.0*39鹿胎粉500 5.8±1.5*40與對照比較，*P＜0.05
5.鹿胎活性肽具有鎮(zhèn)痛作用5.1對小鼠熱板痛閾時間的影響 將成年小鼠50只按表分組給藥，于7天內(nèi)，每天灌胃一次，對照組灌胃等體積蒸餾水，末次給藥1h后，測定小鼠痛閾時間，結(jié)果見表9。鹿胎活性肽可明顯延長小鼠熱板痛閾時間。
表9鹿胎活性肽對小鼠熱板痛閾時間的影響(x±s，n＝10)組別 劑量(mg/kg)痛閾時間(min)對照 -19±4.9鹿胎活性肽40 40±19**20 30±18*鹿胎粉500 29±15*與對照比較，**P＜0.015.2對醋酸引起小鼠扭體反應(yīng)的影響 將成年小鼠50只按表分組給藥，于7天內(nèi)，每天灌胃一次，對照組灌胃等體積蒸餾水，末次給藥1h后，將全部小鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液，記錄小鼠在10min內(nèi)發(fā)生扭體反應(yīng)的次數(shù)，結(jié)果見表10。鹿胎活性肽可明顯減少醋酸引起小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)。
表10鹿胎活性肽對醋酸引起小鼠扭體反應(yīng)的影響(x±s)組別 劑量(mg/kg)扭體反應(yīng)次數(shù)(次)對照 -35±3.4鹿胎活性肽40 11±3.9***20 13±4.0***鹿胎粉500 14±4.6*與對照比較，***P＜0.0016.鹿胎活性肽具有免疫增強(qiáng)作用6.1對小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響 將成年小鼠50只按表分組給藥，于7天內(nèi)，每天灌胃一次，對照組灌胃等體積蒸餾水，末次給藥1h后，將全部小鼠尾靜脈注射墨汁(1∶4)0.1ml/只，分別于注射后2min和5min，眼眶取血10μl，加入0.1％Na2CO3溶液2ml中，在600nm處測光密度值，將動物處死后，取肝和脾，稱重，計算吞噬指數(shù)K值和α值，結(jié)果見表11。鹿胎活性肽可明顯增加小鼠單核巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)K值和α值。
表11鹿胎活性肽對小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響(x±s，n＝10)組別 劑量(mg/kg)吞噬指數(shù)K值 吞噬指數(shù)α值對照 - 0.020±0.002 5.0±0.35鹿胎活性肽 400.029±0.005*5.7±0.40**200.027±0.004*5.6±0.60*鹿胎粉 500 0.027±0.005*5.5±0.6*與對照比較，*P＜0.05**P＜0.017.鹿胎活性肽具有增強(qiáng)睡眠作用7.1長睡眠時間 將成年小鼠50只按表分組給藥，于7天內(nèi)，每天灌胃一次，對照組灌胃等體積蒸餾水，末次給藥1h后，將全部小鼠ip戊巴比妥鈉55mg/kg，在24～25℃環(huán)境下，記錄小鼠睡眠時間，結(jié)果見表12。鹿胎活性肽可明顯延長小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間。
表12鹿胎活性肽對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間的影響(x±s，n＝10)組別 劑量(mg/kg)睡眠時間(min)對照 -41±21鹿胎活性肽40 60±11**20 58±14*鹿胎粉500 56±13*與對照比較，*P＜0.057.2催眠作用 將成年小鼠50只按表分組給藥，于7天內(nèi)，每天灌胃一次，對照組灌胃等體積蒸餾水，末次給藥1h后，將全部小鼠ip戊巴比妥鈉30mg/kg，在24～25℃環(huán)境下，記錄15min內(nèi)出現(xiàn)睡眠的動物數(shù)(以翻正反射消失1min以上為指標(biāo))，結(jié)果見表13。鹿胎活性肽可明顯增加閾下劑量戊巴比妥鈉出現(xiàn)睡眠的小鼠數(shù)。
表13鹿胎活性肽對小鼠閾下劑量戊巴比妥鈉作用的影響(x±s)組別 劑量(mg/kg) 動物數(shù)(只) 出現(xiàn)睡眠動物數(shù)(只) 出現(xiàn)率(％)對照 - 10 2 20鹿胎活性肽40 10 8 80**
2010 7 70*鹿胎粉500 10 7 70*與對照比較，*P＜0.058.鹿胎活性肽具有抗驚厥作用8.1對士的寧致小鼠驚厥的影響 將成年小鼠50只按表分組給藥，于7天內(nèi)，每天灌胃一次，對照組灌胃等體積蒸餾水，末次給藥1h后，將全部小鼠ip士的寧1.5mg/kg，記錄小鼠驚厥發(fā)生數(shù)、出現(xiàn)時間(從注射士的寧到強(qiáng)直性驚厥出現(xiàn)的時間)、死亡時間(從強(qiáng)直性驚厥到死亡發(fā)生的時間)、死亡率，結(jié)果見表14。鹿胎活性肽可明顯延長士的寧致小鼠驚厥出現(xiàn)時間和死亡時間，對小鼠驚厥發(fā)生數(shù)和死亡率無明顯影響。
表14鹿胎活性肽對士的寧致小鼠驚厥的影響(x±s)組別 劑量動物數(shù) 出現(xiàn)驚厥 驚厥出現(xiàn) 死亡時間 死亡數(shù)(mg/kg)(只) 動物數(shù)(只) 時間(sec) (sec)(只)對照 -10 10 148±1931±1810鹿胎活性肽40 10 10 198±68*85±64*1020 10 10 162±3571±22*10鹿胎粉500 10 10 160±3670±23*10與對照比較，*P＜0.058.2對安鈉咖致小鼠驚厥的影響將成年小鼠50只分組給藥，末次給藥1h后，將全部小鼠皮下注射安鈉咖800mg/kg，觀察指標(biāo)同前，結(jié)果見表15。鹿胎活性肽可明顯延長安鈉咖致小鼠驚厥出現(xiàn)時間，對小鼠死亡時間、驚厥發(fā)生數(shù)和死亡率無明顯影響。
表15鹿胎活性肽對安鈉咖致小鼠驚厥的影響(x±s)組別 劑量動物數(shù) 出現(xiàn)驚厥 驚厥出現(xiàn) 死亡時間 死亡數(shù)(mg/kg)(只) 動物數(shù)(只) 時間(sec) (sec) (只)對照 -10 10 312±102 586±301 10鹿胎活性肽40 10 10 413±103*645±223 1020 10 10 395±84*674±235 10鹿胎粉500 10 10 397±82*652±213 10與對照比較，*P＜0.05
上述實驗研究證明，鹿胎活性肽可明顯延長小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間，增加閾下劑量戊巴比妥鈉出現(xiàn)睡眠的小鼠數(shù)，延長士的寧致小鼠驚厥出現(xiàn)時間和死亡時間，和延長安鈉咖致小鼠驚厥出現(xiàn)時間。表明，鹿胎活性肽具有一定的催眠、鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用。
9.鹿胎活性肽具有抗缺氧作用9.1對小鼠常壓耐缺氧能力的影響 將成年小鼠50只按表分組給藥，于7天內(nèi)，每天灌胃一次，對照組灌胃等體積蒸餾水，末次給藥24h后，將小鼠放入容積為250ml含5g鈉石灰的廣口瓶中，塞緊，1只/瓶，記錄小鼠存活時間，結(jié)果見表16。鹿胎活性肽可明顯延長小鼠常壓缺氧下的存活時間。
表16鹿胎活性肽對小鼠常壓耐缺氧能力的影響(x±s，n＝10)組別 劑量(mg/kg)存活時間(min)對照 -32±8.9鹿胎活性肽40 45±13*20 43±11*鹿胎粉500 42±13*與對照比較，*P＜0.0510鹿胎活性肽具有抗疲勞作用 (強(qiáng)壯作用)10.1對小鼠游泳時間的影響 將成年小鼠50只按表分組給藥，于7天內(nèi)，每天灌胃一次，對照組灌胃等體積蒸餾水，末次給藥24h后，將小鼠投入溫度為23～25℃的水中，記錄小鼠游泳時間，結(jié)果見表17。鹿胎活性肽可明顯延長小鼠游泳時間。
表17鹿胎活性肽對小鼠游泳時間的影響(x±s，n＝10)組別 劑量(mg/kg)游泳時間(min)對照 -196±36鹿胎活性肽40 285±58***20 265±53*鹿胎粉500 259±48*與對照比較，*P＜0.05，***P＜0.001
11.鹿胎活性肽具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成作用11.1對小鼠肝組織DNA、RNA和蛋白質(zhì)含量的影響 將成年小鼠50只按表分組給藥，于7天內(nèi)，每天灌胃一次，對照組灌胃等體積蒸餾水，末次給藥1h后，將小鼠處死，取肝組織，測DNA、RNA和蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見表18。鹿胎活性肽可明顯增加小鼠肝組織RNA和蛋白質(zhì)含量，對DNA含量也有增加作用，但無統(tǒng)計學(xué)差異。
表18鹿胎活性肽對小鼠肝DNA、RNA和蛋白質(zhì)含量的影響(x±s，n＝10)組別 劑量(mg/kg)DNA(mg/g)RNA(mg/g)蛋白質(zhì)(mg/g)對照 - 3.6±0.2 14±1.1252±28鹿胎活性肽40 5.0±0.6 18±1.0*287±25*20 4.7±0.4 17±1.2*276±19*鹿胎粉5004.6±0.4 16±1.1*270±16*與對照比較*P＜0.05本實驗研究表明鹿胎活性肽具有一定的耐缺氧和抗疲勞作用。其作用的生化機(jī)理很可能與其增加肝組織RNA和蛋白質(zhì)含量有關(guān)。
經(jīng)過上述對鹿胎活性肽——鹿胎素的藥理活性檢測可以看出，經(jīng)過本發(fā)明所制得的鹿胎素比原鹿胎干粉具有非常明顯的優(yōu)點?？蓱?yīng)用在生化藥品中，既可做單方，也可做復(fù)方應(yīng)用。具有補(bǔ)血、抗炎、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫活性和雌激素樣作用等藥效功能。
在化妝品方面，應(yīng)用本發(fā)明所制得的鹿胎素凍干粉和濃縮液所配制的護(hù)膚化妝品，具有使皮膚易吸收、潤膚、養(yǎng)顏、美容、延緩皮膚衰老的功效。
權(quán)利要求
1.一種制備鹿胎活性肽——鹿胎素的方法，其步驟是取新鮮的或冷凍的鹿胎，洗凈、剪碎、攪成肉糜，用瓷盤在真空干燥箱中，在80℃以下真空干燥制成干粉，并用蒸餾水調(diào)制成濃度為2-15％的溶液，溫度在45-55℃，pH值在6-8，加入蛋白水解酶，其量是鹿胎干粉量的0.1-2％，在攪拌下，反應(yīng)2-6小時，期間保持pH恒定，終止反應(yīng)后將反應(yīng)液冷凍干燥制成干粉，也可在80℃下經(jīng)真空濃縮，制成所需濃度的溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的制備鹿胎活性肽——鹿胎素的方法，其特征在于蛋白水解酶可以是胰蛋白水解酶、木瓜蛋白水解酶或中性蛋白水解酶。
3.權(quán)利要求1或2方法制備的鹿胎素，在用于制備具有補(bǔ)血、抗炎、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫活性和雌激素樣作用的藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1或2方法制備的鹿胎素，在用于制備具有潤膚、養(yǎng)顏、美容、延緩皮膚衰老的化妝品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用梅花鹿胎制備活性肽——鹿胎素的方法。本發(fā)明以長白山梅花鹿(馬鹿)胎為原料，制成干粉，通過生物技術(shù)方法，在特定的蛋白水解酶、溫度、酸堿度、濃度、時間條件下水解，制成的具有生物活性的肽——鹿胎素。蛋白水解酶可以是胰蛋白水解酶、木瓜蛋白水解酶或中性蛋白水解酶。本發(fā)明具有利用生物技術(shù)方法，改變傳統(tǒng)的鹿胎熬制破壞鹿胎生物活性和藥理療效的舊方法，使鹿胎的新產(chǎn)品鹿胎素具有更好的藥理和生理活性，更易被人體吸收和利用，從而提高鹿胎的利用價值和經(jīng)濟(jì)效益，在制藥和化妝品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K35/48GK1543987SQ20031011005
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月18日
發(fā)明者王國彥, 陳曉光 申請人:吉林大學(xué)