專利名稱：一種新的欖仁葉提取物、其制備方法及其醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，公開了一種欖仁葉提取物、其制備方法及其醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
欖仁(Terminalia catappa L.)為使君子科訶子屬植物，原產(chǎn)于馬來西亞，現(xiàn)廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，包括亞洲的印度、菲律賓、印度尼西亞、我國(guó)的海南和臺(tái)灣地區(qū)，非洲和南、北美洲都有引種。欖仁原為觀賞性植物，但民間亦流傳使用其不同部位治療一些疾病。在東南亞地區(qū)民間使用它的葉、皮以及果實(shí)治療痢疾、發(fā)熱并用于止血(T.C.Lin，Study onthe tannins and related compounds in the fruit of Terminalia catappa L. J Chin Med Pharm Res，1992，14165-174)；在臺(tái)灣、菲律賓地區(qū)流行使用其干枯的落葉代茶飲，用以防治肝臟疾病(C.C.Lin，W.S.Kan.Medicinal plants used for the treatment of hepatitis in Taiwan.Am.J ChinMed 1990，1835-43)；一些學(xué)者報(bào)道了欖仁葉水提物對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷具防護(hù)作用(C.C.Lin，Y.L.Chen，J.M.Lin，et al.Evaluation of the antioxidant and hepatoprotective activity of Terminaliacatappa.Am JChin Med，1997，25(2)153-161)。但未見有欖仁葉乙醇提取物、氯仿提取物防治肝臟疾病及抗腫瘤的報(bào)道，關(guān)于欖仁的抗炎作用尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的欖仁葉提取物，及欖仁葉的醇提取物及醇提取物進(jìn)一步用氯仿萃取的氯仿提取物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提取物對(duì)肝臟具有保護(hù)作用，并且比水提取物對(duì)肝臟的保護(hù)作用更強(qiáng)，治療效果更明顯；同時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)欖仁樹葉水提物、醇提取物、氯仿提取物均有較強(qiáng)的抗炎作用，并且氯仿提取物的抗炎作用最強(qiáng)，醇提取物次之，二者均強(qiáng)于水提物；本課題組還發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的提取物具有抗腫瘤作用，特別是抗肝癌的作用。
本發(fā)明公開了一種欖仁葉的提取物，其由以下方法制備得到將欖仁樹葉揉碎，用20％-80％乙醇提取1～3次，合并提取液，濃縮、干燥，即得(簡(jiǎn)稱TCE)。
上述提取物，可進(jìn)一步依次用石油醚、氯仿萃取，取氯仿萃取物濃縮、干燥，即得(簡(jiǎn)稱TCCE)。
本發(fā)明的欖仁葉提取物中三萜類含量大于2％，鞣質(zhì)含量大于20％。經(jīng)氯仿萃取后的氯仿提取物中三萜類含量更高，達(dá)到20～30％。
本發(fā)明的欖仁葉醇提取物(TCE)及氯仿提取物(TCCE)具有很強(qiáng)的護(hù)肝、抗炎及抗腫瘤作用。
本發(fā)明的提取物可將其直接用于臨床，也可通過加入藥用輔料制備成片劑、膠囊、軟膠囊、注射劑、乳劑等劑型使用。一般臨床用藥量為10-200mg/kg/日。
下面是部分藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一.欖仁葉提取物防治肝損傷的作用(一)TCE防治肝損傷的作用1、TCE對(duì)D-氨基半乳糖胺(D-galactosamine，D-GaLN)誘導(dǎo)的急性肝損傷的防護(hù)作用小鼠分6組，對(duì)照組以生理鹽水灌胃(0.3mL·d-1)，連續(xù)7d，第7d腹腔注射生理鹽水(0.15mL·10g-1)；D-GalN、TCE(20、50、100mg·kg-1)各組分別以生理鹽水、不同濃度TCE灌胃(0.3mL·d-1)，連續(xù)7d，于第7d腹腔注射D-GalN(800mg·kg-1，0.15mL.10g-1)，16h后取血，測(cè)sAST及sALT活力。
表1 TCE對(duì)D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷的防護(hù)作用組別動(dòng)物數(shù)/只sAST活性/U·L-1sALT活性/U·L-1對(duì)照9403.8±37.4 312.4±31.6D-GalN 71192.5±187.11)1048.3±399.81)TCE(20mg·kg-1)+D-GalN 10 817.5±132.12)314.3±65.12)TCE(50mg·kg-1)+D-GalN 9527.5±111.32)365.1±106.02)TCE(100mg·kg-1)+D-GalN9455.0±80.02)369.1±91.52)注1)P＜0.01vs對(duì)照組，2)P＜0.01vs D-GaLN組由表1可知，TCE能以劑量依賴方式有效抑制D-GalN引起的小鼠sAST及sALT活性的顯著上升。
2、TCE對(duì)D-GalN誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞損傷的防護(hù)作用細(xì)胞分5組對(duì)照組、D-GalN(6.4g·L-1)損傷組、D-GalN+低劑量TCE(0.05g·L-1)組、D-GalN+中劑量TCE(0.1g·L-1)組、D-GalN+高劑量TCE(0.5g·L-1)組。給藥各組每孔加不同濃度TCE，36h后損傷組和給藥組每孔加D-GalN損傷，損傷6h后測(cè)上清液中SOD及AST的活力。
表2 TCE對(duì)D-GalN誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞損傷的對(duì)抗作用組別 SOD活性/U·L-1AST活性/U·L-1對(duì)照 181.7±15.9 94.3±52.0D-GalN95.9±25.81)185.2±21.51)TCE(0.05g·L-1)+D-GalN 170.8±14.52)101.2±28.62)TCE(0.1g·L-1)+D-GalN180.9±19.02)92.0±24.82)TCE(0.5g·L-1)+D-GalN188.8±9.12)96.2±57.92)
注1)P＜0.01vs對(duì)照組，2)P＜0.01vs D-GaLN組，n＝6，X±SD由表2可以看出，D-GalN損傷后，細(xì)胞懸液中SOD活性顯著下降，AST活性顯著升高。而預(yù)加各劑量的TCE可明顯對(duì)抗上述變化，基本或完全恢復(fù)至對(duì)照組水平。
3、欖仁葉水提物及欖仁葉醇提物(TCE)防治肝損傷作用的比較小鼠24只分4組，對(duì)照組以生理鹽水灌胃0.3mL·d-1，腹腔注射植物油每只0.15mL·10g-1；CCl4組及給藥組分別以等量生理鹽水、欖仁葉水提物(50mg·kg-1)及欖仁葉醇提物(TCE，50mg·kg-1)0.3mL·d-1，連續(xù)灌胃5天，第5天腹腔注射0.15％CCl4(0.1mL·10g-1)。24h后處死動(dòng)物，取血清測(cè)sAST及sALT活性。
表3欖仁葉水提物、醇提物對(duì)CCl4肝損傷小鼠體內(nèi)sAST及sALT活力的影響的比較。
組別 ALT活性(U/L) AST活性(U/L)對(duì)照組 223±51.4 405.3±35.2CCl4組2097.7±323.11)1142.5±271.41)欖仁葉水提物(50mg·kg-1) 1607±923.8579.2±463.92)TCE(50mg·kg-1) 565.8±363.42)3)383±209.22)1p＜0.01vs對(duì)照組；2p＜0.01vsCCl4組；3p＜0.01vs欖仁葉水提物，n＝6.X±SD。
由表3可看出，小鼠腹腔注射0.15％CCl424h后，sAST及sALT水平顯著增高，預(yù)先灌胃TCE(50mg·kg-1)后可完全對(duì)抗上述sAST及sALT活性的升高，抑制率分別為74.2％及72.1％，高于相同劑量欖仁葉水提物的抑酶率(23.8％及53.5％)。
(二)TCCE對(duì)肝損傷的防護(hù)作用1、TCCE對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的防護(hù)作用小鼠48只分6組，對(duì)照組以生理鹽水灌胃0.3mL·d-1，腹腔注射植物油每只0.1mL·10g-1CCl4組及給藥組(20，50，100mg·kg-1)分別以等量生理鹽水及不同濃度TCCE 0.3mL·d-1連續(xù)灌胃5天，第6天腹腔注射0.1％CCl40.1mL·10g-1，聯(lián)苯雙酯組(DDB)以200mg·kg-1聯(lián)苯雙酯灌胃0.3mL·d-1，于第6天腹腔注射0.1％CCl40.1mL·10g-1。24h后處死動(dòng)物，取血清測(cè)sALT及sAST水平。
表4 TCCE對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷的防護(hù)作用組別 動(dòng)物數(shù)/只sAST活性/U·L-1sALT活性/U·L-1對(duì)照 9401.3±35.2220±51.3CCl47813.8±1171)1252.3±173.11)TCCE(20mg·kg-1)+CCl410 777.5±96.8584.3±65.22)TCCE(50mg·kg-1)+CCl49498.8±79.72)339±522)TCCE(100mg·kg-1)+CCl49387.5±40.62)228.3±52.82)DDB(200mg·kg-1)+CCl49411.3±45.82)240±532)注1)P＜0.01vs對(duì)照組，2)P＜0.01vsCCl4組.X±SD。
由表4可知，TCCE能以劑量依賴方式抑制CCl4引起的小鼠sAST及sALT活性的顯著上升。100mg·kg-1TCCE可以完全抑制CCl4對(duì)肝臟的損傷作用。
2、TCCE對(duì)D-GalN誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞損傷的防護(hù)作用原代培養(yǎng)7天的細(xì)胞分為正常組，D-GaLN損傷組(6.4g·L-1)，D-GaLN+低劑量TCCE(0.05g·L-1)，D-GaLN+中劑量TCCE(0.1g·L-1)，D-GaLN+高劑量TCCE(0.5g·L-1)及DDB(0.5g·L-1)+D-GalN 6組。分別加入Hanks液(前兩組)，不同劑量的TCCE或DDB，孵育36小時(shí)后加入D-GaLN，6小時(shí)后取上清液，按照試劑盒說明測(cè)AST及ALT活性。
表5 TCCE對(duì)D-GalN誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞損傷的對(duì)抗作用組別 AST活性/U·L-1ALT活性/U·L-1對(duì)照 80.29±6.9590.86±7.47D-GalN 167±11.31)176.3±15.81)TCCE(0.05g·L-1)+D-GalN 151.1±28.7157.7±25.72)TCCE(0.1g·L-1)+D-GalN101.29±10.012)11 1.7±12.12)TCCE(0.5g·L-1)+D-GalN87.71±7.972)81.67±2.942)DDB(0.5g·L-1)+D-GalN 107.6±10.32)98.2±10.52)注1)P＜0.01vs對(duì)照組，2)P＜0.01vsD-GaLN組，n＝6，X±SD。
表5顯示與D-GaLN損傷組相比，各濃度TCCE對(duì)細(xì)胞上清AST的抑制率分別達(dá)到了10.8％、76.1％、90.5％，ALT的抑制率分別達(dá)到了27.3％、78.8％、106.1％，其中0.5g·L-1TCCE已經(jīng)完全對(duì)抗了D-GaLN的損傷作用。
二、欖仁葉提取物抗炎作用的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)(一)欖仁葉提取物對(duì)TPA誘導(dǎo)的小鼠急性耳腫脹的局部抗炎作用將ICR小鼠隨機(jī)分為空白組(丙酮)、TPA組、陽(yáng)性對(duì)照組(吲哚美辛)和給藥組。小鼠右耳兩面各涂致炎液[含10％(g·mL-1)TPA(佛波酯)/丙酮]10μl，TCE和TCCE溶于等體積的丙酮中，并在TPA涂于鼠耳后立即涂抹相同部位。6h后頸椎脫臼處死動(dòng)物，右耳相同部位用打孔機(jī)取耳組織(直徑6mm)，右耳片分別精密稱重，按下式計(jì)算腫脹抑制百分率腫脹抑制百分率＝{1-[(耳片重量給藥組-耳片重量丙酮組)/(耳片重量TPA組-耳片重量丙酮組)]}×100％。
表6欖仁葉提取物對(duì)TPA誘導(dǎo)的小鼠急性耳腫脹局部抗炎作用組別劑量 耳片重量aI.R.b(mg/耳) (mg)空白組(丙酮)-7.7±0.6d-對(duì)照組(TPA) -20.5±2.0 -TCE 116.8±2.2 28.9TCCE112.8±2.4d60.20.75 15.2±1.5d41.40.5 16.8±3.2 28.9水提物 118.6±2.6 10.9吲哚美辛0.3 13.7±2.5d53.1a平均值±S.D.，n＝6；b腫脹抑制百分率；dP＜0.01與對(duì)照組比較結(jié)果表明，欖仁葉乙醇提取物及氯仿提取物均具有抗炎作用，且氯仿提取物的抗炎效果更強(qiáng)。
(二)欖仁葉提取物對(duì)TPA誘導(dǎo)的小鼠慢性耳部炎癥的抗炎作用將ICR小鼠隨機(jī)分為空白組(丙酮)、TPA組、陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松0.05mg/耳)和給藥組[TCCE(1.0mg/耳)]。小鼠右耳兩面各涂致炎液[含10％(g·mL-1)TPA(佛波酯)/丙酮]10μl，隨后立即將藥物涂于相同部位，每天兩次，間隔6h，連續(xù)三天，第四天涂抹一次。6h后頸椎脫臼處死動(dòng)物，右耳相同部位用打孔機(jī)取耳片(直徑6mm)，分別精密稱重，按下式計(jì)算腫脹抑制百分率腫脹抑制百分率＝{1-[(耳片重量給藥組-耳片重量丙酮組)/(耳片重量TPA組-耳片重量丙酮組)]}×100％。結(jié)果見圖1。
另取耳片樣品置于HTAB中凍存待測(cè)髓過氧化物酶，髓過氧化物酶(MPO)活力檢測(cè)耳片樣品置于0.75ml含有0.5％HTAB的PBS(80mM磷酸鈉緩沖液，pH5.4)，勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。加入少量HTAB，12,000×g離心，吸取上清夜(30μl)滴入96孔板內(nèi)，加入含有0.017％過氧化氫的PBS，反應(yīng)體系內(nèi)加入含有18.4mM TMB·HCl的8％的二甲基甲酰胺溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，37℃孵浴3min，冰浴，加入1.46M乙酸鈉(pH3.0)終止反應(yīng)，630nm處測(cè)定OD值。結(jié)果見圖2。
圖1和圖2顯示TCCE能顯著抑制小鼠耳腫脹。1mg/耳劑量下，TCCE的腫脹抑制率達(dá)66.0％。TCCE物在嗜中性粒細(xì)胞滲透性方面呈現(xiàn)出抑制作用，MPO酶活抑制率為59.0％。


圖1是欖仁樹葉提取物對(duì)耳腫脹程度的影響(A對(duì)照，BTCE，CTCCE，D地塞米松**P＜0.01vs對(duì)照)圖2是欖仁樹葉提取物對(duì)過氧化物酶(MPO)活力的影響(A對(duì)照，BTCE，CTCCE，D地塞米松**P＜0.01vs對(duì)照)三、欖仁葉醇提物(TCE)抗肝癌作用的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)(一)TCE對(duì)移植性肝癌H22小鼠實(shí)體瘤的影響按無菌操作程序，從接種后7d腫瘤生長(zhǎng)及動(dòng)物健康程度較好的瘤源動(dòng)物中抽取腹水，生理鹽水稀釋至2×107/ml個(gè)瘤細(xì)胞。取ICR小鼠50只，體重20g±2g，雌雄各半，于每只小鼠右側(cè)腋窩皮下接種H22肝癌瘤細(xì)胞懸液0.2ml。隨機(jī)分成生理鹽水(NS)組、環(huán)磷酰胺(CP)組、TCEL組、TCEM組、TCEH組，每組各10只。24h后進(jìn)行灌胃，NS組給予0.2ml生理鹽水、CP組給予CP 25mg/kg、各TCE組分別給予50mg/kg、200mg/kg、500mg/kg的TCE，每天一次，連續(xù)10天。于末次給藥后24h處死動(dòng)物，稱體重、剝?nèi)×鰤K，用濾紙吸干后稱重，求抑瘤率。統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析。
表7不同劑量TCE對(duì)小鼠H22瘤體的抑制作用動(dòng)物數(shù)(只) 體重(g)劑量組別瘤重(g) 抑瘤率(mg/kg天)實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)前 實(shí)驗(yàn)后NS - 101019.41±1.00 28.59±3.851.46±0.52CP 25101019.42±1.12 26.33±2.710.59±0.3159.6％*TCEL50101019 77±1.08 27.49±3.311.01±0.2924.7％*TCEM200 101019.25±1.10 27.22±3.411.00±0.2631.5％*TCEH500 101019.28±1.37 26.62±1.990.84±0.3342.5％**與生理鹽水組比P＜0.01由表7可以看出，TCE可以劑量依賴方式抑制H22肝癌實(shí)體瘤的瘤重，即有明顯的抗癌作用。
(二)TCE對(duì)移植性肝癌H22腹水瘤小鼠延命率的影響按無菌操作程序，從接種后7d腫瘤生長(zhǎng)及動(dòng)物健康程度較好的瘤源動(dòng)物中抽取腹水，生理鹽水稀釋至2×107/ml個(gè)瘤細(xì)胞。取ICR小鼠30只，體重20g±2g，雌雄各半，于每只小鼠腹腔接種H22肝癌瘤細(xì)胞懸液0.2ml。隨機(jī)分成生理鹽水(NS)組、環(huán)磷酰胺(CP)組、TCE組，每組各10只。24h后進(jìn)行灌胃，NS組、CP組和TCE組分別給予0.2ml生理鹽水、CP 25mg/kg、TCE 50mg/kg，每天一次，連續(xù)10天。于第11天停藥，記錄小鼠生存時(shí)間，計(jì)算延命率。
存活期用存活天數(shù)的中位數(shù)(M)表示，統(tǒng)計(jì)方法采用秩和檢驗(yàn)。
表8不同劑量TCE對(duì)小鼠H22腹水瘤的抑制作用組別 劑量 動(dòng)物數(shù) 存活期 延命率(mg/kg天)(只) (天) (％)NS - 1010.5 -CP 25101438.1*TCEL50101438.1**與生理鹽水組比P＜0.01由表8可見，TCE可顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生命，和CP一樣，有抑癌作用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1欖仁樹葉乙醇提取物的制備干欖仁樹葉50g揉碎，加入30％乙醇750ml回流提取1小時(shí)，過濾；渣葉再次用500ml 30％乙醇回流提取1小時(shí)；合并兩次濾液、減壓濃縮、干燥，得醇提物棕色干粉10.0g。
實(shí)施例2欖仁樹葉乙醇提取物的制備干欖仁樹葉50g揉碎，加入50％乙醇600ml回流提取1小時(shí)，過濾；渣葉再次用500ml 50％乙醇回流提取1小時(shí)；合并兩次濾液、減壓濃縮、干燥，得醇提物棕色干粉11.2g。
實(shí)施例3欖仁樹葉乙醇提取物的制備干欖仁樹葉50g揉碎，加入75％乙醇750ml浸泡提取3天，過濾；渣葉再次用600ml75％乙醇浸泡提取1天；合并兩次濾液、減壓濃縮、干燥，得醇提物棕色干粉10.5g。
實(shí)施例4欖仁樹葉氯仿提取物的制備干欖仁樹葉1.1Kg揉碎，加入50％乙醇600ml回流提取1小時(shí)，過濾；渣葉再次用500ml50％乙醇回流提取1小時(shí)；合并兩次濾液、減壓濃縮；濃縮液依次用正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇1∶1萃取兩次，分別回收溶劑，減壓濃縮、干燥，得干浸膏F1正己烷相21.0g、F2氯仿相32.0g、F3乙酸乙酯相34.2g、F4正丁醇相46.2g及F5水相94.5g。
實(shí)施例5欖仁樹葉氯仿提取物的制備干欖仁樹葉1.9Kg揉碎，加入75％乙醇750ml浸泡提取3天，過濾；渣葉再次用600ml75％7醇浸泡提取1天；合并兩次濾液、減壓濃縮；濃縮液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇1∶1萃取兩次，分別回收溶劑，減壓濃縮、干燥，得干浸膏F1石油醚相50.0g、F2氯仿相46.0g、F3乙酸乙酯相40.2g、F4正丁醇相60.2g及F5水相175.6g。
實(shí)施例6欖仁樹葉氯仿提取物的制備干欖仁樹葉1.5Kg揉碎，加入60％乙醇600ml回流提取1小時(shí)，過濾；渣葉再次用500ml60％乙醇回流提取1小時(shí)；合并兩次濾液、減壓濃縮；濃縮液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇1∶1萃取兩次，分別回收溶劑，減壓濃縮、干燥，得干浸膏F1石油醚相40.0g、F2氯仿相40.0g、F3乙酸乙酯相50.2g、F4正丁醇相50.2g及F5水相110.5g。氯仿相中三萜類含量為25.0％。
權(quán)利要求
1.一種欖仁葉的提取物，其特征是由以下方法制備得到將欖仁葉揉碎，用20％-80％乙醇提取1～3次，合并提取液，濃縮、干燥。
2.權(quán)利要求1所述的提取物，其特征是將提取物濃縮液進(jìn)一步依次用石油醚、氯仿萃取，取氯仿萃取物，濃縮、干燥。
3.權(quán)利要求1或2所述的提取物用于制備護(hù)肝藥物的用途。
4.權(quán)利要求3所述的用途，其中護(hù)肝是預(yù)防和/或治療肝損傷、肝炎、肝硬化或肝癌。
5.權(quán)利要求1或2所述的提取物用于制備抗炎藥物的用途。
6.權(quán)利要求1或2所述的提取物用于制備抗腫瘤藥物的用途。
7.權(quán)利要求6所述的用途，其中抗腫瘤藥物是抗肝癌藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，公開了欖仁葉的乙醇提取物及其醫(yī)藥用途，其可用于肝細(xì)胞保護(hù)及抗腫瘤，并且療效比水提取物強(qiáng)；本發(fā)明還公開了欖仁葉提取物的抗炎作用。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1544007SQ200310106320
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月18日
發(fā)明者高靜, 徐力致, 范怡梅, 趙曉寧, 王勇, 湯新慧, 楊曉荷, 竇環(huán), 王燕萍, 朱俐, 高 靜 申請(qǐng)人:南京大學(xué)