專利名稱：基于脂肪族生物可降解連接體的可釋放的聚合物結(jié)合體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可用于延長生物學活性材料體內(nèi)循環(huán)壽命的支化聚合物。本發(fā)明還涉及使用該聚合物制成的結(jié)合體。
背景技術：
將肽或多肽結(jié)合于聚(乙二醇)PEG和類似的水溶性聚(環(huán)氧烷)的一些最初概念在美國專利4,179,337中公開，其公開被并入本文作為參考。由這些聚合物改性的多肽與未改性形式相比表現(xiàn)出免疫原性/抗原性降低并且在血流中的循環(huán)時間更長。
為了結(jié)合聚(環(huán)氧烷)，羥基端基之一被轉(zhuǎn)化為活性官能團。這種處理經(jīng)常稱為“活化”，并且產(chǎn)物稱為“活化的聚(環(huán)氧烷)”。其它基本上非抗原的聚合物類似地被“活化”或官能化。
活化的聚合物與具有作為連接位點的親核官能團的治療劑反應。通常用作連接位點的一種親核官能團為賴氨酸的ε-氨基。也可將游離的羧基、適當活化的羰基、氧化的碳水化合物部分和巰基作為連接位點。
胰島素和血紅素屬于被結(jié)合的第一治療劑。這些相對大的多肽包含幾個游離的ε-氨基連接位點。可為其連接充分數(shù)量的聚合物以降低免疫原性并增加循環(huán)壽命，而不顯著地損失生物活性。
然而，發(fā)現(xiàn)過度的聚合物結(jié)合和/或涉及其中與生物活性有關基團的治療劑部分活性部位的結(jié)合經(jīng)常引起活性喪失并從而喪失治療可用性。對于具有很少與生物活性無關的連接位點的低分子量肽尤其是這樣。許多非肽治療劑還缺乏充分數(shù)量的連接位點以得到聚合物改性的益處。
克服上述問題的一個建議是使用更長的、具有更高分子量的聚合物。然而，根據(jù)所需分子量，這些材料很難制備，并且使用費用大。另外，它們與更容易得到的聚合物相比有時提供很少的改善。
另一個選擇性建議為通過三嗪環(huán)為蛋白質(zhì)的氨基連接兩個聚合物鏈段。參見例如Enzyme，26，49-53(1981)和Proc.Soc.Exper.Biol.Med.，188，364-9(1988)。然而，三嗪為有毒物質(zhì)，很難在結(jié)合之后使其毒性降低到可接受的程度。另外，三嗪為平面基團，其只能被雙鏈聚合物取代。平面構(gòu)造嚴格地鎖定兩個聚合物鏈在適當?shù)奈恢谩＿@限制了聚合物結(jié)合的益處與通過增加聚合物鏈長度得到的益處幾乎相同。因此，非三嗪系活化的聚合物可能為本領域提供實質(zhì)的益處。
然而，在上述提及的情況中，在聚合物和母體生物學活性部分之間形成具有基本上耐水解的鍵(連接)的生物學活性聚合物結(jié)合體。因此，制備的是永久性連接的耐久性結(jié)合體，而本質(zhì)上不是前藥(其中母體分子在體內(nèi)最終釋放)。
共同轉(zhuǎn)讓的美國專利5,643,575、5,919,455和6,113,906公開了另外的改進，其涉及共用通過脂肪族連接體與親核體連接的節(jié)點的多鏈PEG。與以前的三嗪系支化聚合物結(jié)合體不同，脂肪族連接體使技術人員可避免三嗪的毒性，并且提供其它有用的優(yōu)點。
另外，近幾年來還提出了幾種制備前藥的方法。前藥包括生物學活性母體化合物的化學衍生物，其在給藥時在體內(nèi)最終釋放活性母體化合物。前藥的使用使得技術人員可以改變生物學活性物質(zhì)在體內(nèi)起作用的時間和/或作用持續(xù)時間。前藥經(jīng)常是母體化合物或活性化合物的生物學惰性形式或基本上的無活性形式。活性藥物的釋放速率受幾個因素的影響，包括將母體生物學活性物質(zhì)與前藥載體連接的連接體的水解速率。
已經(jīng)報到了一些基于酯或磷酸酯連接的前藥。在大多數(shù)情況中，用于形成前藥的特定類型的酯鍵在含水環(huán)境中提供高達數(shù)日的水解t1/2。盡管可能預期已經(jīng)形成了前藥，但大部分結(jié)合體在體內(nèi)實現(xiàn)充分水解之前被消除。因此，優(yōu)選提供具有在體內(nèi)能更迅速水解聚合物-藥物鍵的連接的前藥，以便更迅速地產(chǎn)生母體藥物化合物。
還報到了基于酰胺或氨基甲酸酯連接的前藥。通常，已知酰胺鍵為高度耐水解的。然而，最近發(fā)現(xiàn)ε-氨基酸的C-末端酰胺當N-末端被一個和兩個羥乙基基團N-羥乙基化時在25℃和pH 7.4容易水解。這種水解反應的關鍵為雙N-2-羥乙基甘氨酸(N-二(羥乙基)甘氨酸)類型的分子。這種N-二(羥乙基)甘氨酸類型的基團最近被用于合成前藥，參見共同轉(zhuǎn)讓的美國專利申請10/218,167，其內(nèi)容被并入本文作為參考。
在前藥設計領域中仍有改進的空間。本發(fā)明提供這樣一種改進。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的一個方面中，提供下式(I)的化合物 其中R1和R2獨立地選自基本上非抗原的聚合物殘基、H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基、和末端支鏈基團，條件是R1和R2不都是H；
Z選自主動轉(zhuǎn)運進入靶細胞的部分、疏水部分、雙官能連接部分及其組合；Y1-3可相同或不同并選自O、S或NR11；L1和L2可為相同或不同的雙官能連接體；R3-R11、R24和R25可相同或不同并選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基；L3和L4可相同或不同并選自-C(O)(CR30R31)Y15(CR32R33)C(O)-或-C(O)(CR30R31)(CR32R33)C(O)-其中Y15選自O、S、NR34或CH2，和R30-34可相同或不同并選自H、烷基、烯基、炔基、雜烷基或芳基；A選自離去基團、官能團、生物學活性部分和OH；a、b、c、d、和e獨立地為0或1，m、n、o、和p獨立地為正整數(shù)，f和g為0或1，條件是(f+a)或(g+c)中至少之一等于2。
本發(fā)明的另一個方面包括當(R1)和(R2)中至少一個為同時包括α和ω末端連接基團的聚合物殘基時形成的雙官能化合物。在本發(fā)明這一方面，技術人員能夠?qū)酆衔镄?優(yōu)選PEG)N-二(羥乙基)甘氨酸系統(tǒng)連接兩當量的生物活性劑藥物、蛋白質(zhì)、多肽、低聚核苷酸等。這種雙官能聚合物結(jié)合體的例子如下式(IIa)和(IIb)說明
其中，Z為 其中Y4為O、S或NR11，L5為雙官能連接體，所有其它變量如上所述。
還提供了本發(fā)明化合物的制備方法及使用該化合物的治療方法。
對于本發(fā)明的目的，術語“殘基”應該理解為其所指化合物的一部分，其在經(jīng)歷其中已經(jīng)連接聚合物前藥載體部分的取代反應之后保留的部分。
對于本發(fā)明的目的，術語“聚合物殘基”或“PEG殘基”各自應該理解為在其經(jīng)歷與生物學活性物質(zhì)的反應之后保留的聚合物或PEG的部分。
對于本發(fā)明的目的，術語“烷基”應該理解為包括直鏈、支鏈、被如鹵代-、烷氧基-、硝基-取代的C1-12烷基、C3-8環(huán)烷基或取代的環(huán)烷基等。
對于本發(fā)明的目的，術語“取代的”應該理解為包括用一個或多個不同的原子加成或代替包含在官能團或化合物中的一個或多個原子。
對于本發(fā)明的目的，取代的烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羥基烷基和巰基烷基；取代的烯基包括羧基烯基、氨基烯基、二烯基氨基、羥基烯基和巰基烯基；取代的炔基包括羧基炔基、氨基炔基、二炔基氨基、羥基炔基和巰基炔基；取代的環(huán)烷基包括基團如4-氯環(huán)己烷基；芳基包括基團如萘基；取代的芳基包括基團如3-溴-苯基；芳烷基包括基團如甲苯基；雜烷基包括基團如乙基噻吩；取代的雜烷基包括基團如3-甲氧基-噻吩；烷氧基包括基團如甲氧基；和苯氧基包括基團如3-硝基苯氧基。鹵代-應該理解為包括氟、氯、碘和溴。
用于本發(fā)明目的的術語“充分量”是指可實現(xiàn)的治療效果為本領域技術人員理解的效果的量。
對于本發(fā)明的目的，“有效地非抗原的”和“基本上非抗原的”應該理解為包括本領域中理解的在哺乳動物中基本上無毒的和不引起明顯免疫反應的所有聚合物材料。
對于本發(fā)明的目的，“正整數(shù)”應該理解為是正的整數(shù)，優(yōu)選為約1到6，更優(yōu)選為1或2。
本發(fā)明的一個主要優(yōu)點在于N-二(羥乙基)甘氨酸連接體能夠控制前藥的水解速率，從而以不同速率在體內(nèi)和體外釋放本來的實體。例如，多種雙官能部分，包括氨基酸或短的肽殘基，可作為L1-3中任一個的一部分，以調(diào)節(jié)前藥體內(nèi)和體外水解和/或細胞攝取等的速率。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點在于經(jīng)由聚合物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)遞送的目標化合物經(jīng)常顯示出體內(nèi)的水溶性和循環(huán)壽命顯著增加。


圖1-11示意性地說明形成在發(fā)明詳述和實施例中描述的本發(fā)明的化合物的方法。
發(fā)明詳述A.式(I)在本發(fā)明的一個實施方案中，提供下式(I)的化合物 其中R1和R2可相同或不同并選自基本上非抗原的聚合物殘基、H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基、和末端支鏈基團，條件是R1和R2不都是H；Z選自主動轉(zhuǎn)運進入靶細胞的部分、疏水部分、雙官能連接部分及其組合；Y1-3可相同或不同并選自O、S或NR11；L1和L2可為相同或不同的雙官能連接體；R3-R11、R24和R25可相同或不同并選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基；L3和L4可相同或不同并選自-C(O)(CR30R31)Y15(CR32R33)C(O)-或-(O)(CR30R31)(CR32R33)C(O)-，
其中Y15選自O、S、NR34或CH2，并且R30-34可相同或不同并選自H、烷基、烯基、炔基、雜烷基或芳基；A選自離去基團、官能團、生物學活性部分和OH；a、b、c、d、和e獨立地為0或1，m、n、o、和p獨立地為正整數(shù)，f和g為0或1，條件是(f+a)或(g+c)中至少之一等于2。
在本發(fā)明的某些優(yōu)選方面中，一個或多個R1和R2包括基本上非抗原的聚合物殘基如聚乙二醇(PEG)基團。選擇性地，R1-2包括本文中表示為J的封端基團。優(yōu)選用于聚合物封端的J基團包括基團如OH、NH2、SH、CO2H、C1-6烷基部分如CH3、和下式(IIIa)和(IIIb)的化合物 和 其中所有的變量如前定義。
本發(fā)明另一個實施方案為下式IV和V的化合物
和 其中，a、b、c、d、f和g為正整數(shù)，所有的其它變量如上所述。
在本發(fā)明的另一個方面中，R1和R2與它們所連接的碳原子一起可形成下式的橋連結(jié)構(gòu) 其中R70-80可相同或不同并選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基；n′為正整數(shù)，優(yōu)選為約1到約7，以及所有的其它變量如前定義。
對于構(gòu)成本發(fā)明的式子的其它變量，在本發(fā)明的某些方面中優(yōu)選以下在某些方面中，R1和R2為聚環(huán)氧烷殘基，更優(yōu)選為聚乙二醇殘基；在其它方面中，R1和R2為以下更詳細描述的N-二(羥乙基)甘氨酸系末端支鏈基團，以能夠加載多個聚合物鏈；R3-R10、和R24-25各自為氫；a、b、c、d、f、m、n、o和p各自優(yōu)選為1；e優(yōu)選為0或1；Z為如上定義的 或者，選擇性地，Z包括氨基酸殘基、肽殘基、主動轉(zhuǎn)運進入靶細胞、疏水性、或具有這些性質(zhì)的組合的基團，使得在與生物學活性的A基團結(jié)合時，形成從式(I)、(II)等的N-二(羥乙基)甘氨酸聚合物部分釋放的前藥。還參見共同轉(zhuǎn)讓的USSN 09/758,993，其內(nèi)容被并入本文作為參考。
B.基本上非抗原的聚合物如上所述，R1和R2更好地是各自為優(yōu)選基本上的非抗原的水溶性聚合物殘基，如聚環(huán)氧烷(PAO)，更優(yōu)選為聚乙二醇如mPEG。為了說明和非限制性地，R1和R2的聚乙二醇(PEG)殘基部分可選自J-O-(CH2CH2O)x-，J-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-，J-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NR12-，J-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-，-OC(O)CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-，-NR12CH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NR12-，和-SHCH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-，其中
x為聚合度；R12選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-12支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基，J為上述式II中所提及的封端基團。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，R1-2選自CH3-O-(CH2CH2O)x-、CH3-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-、CH3-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NH-和CH3-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-，其中x為正整數(shù)，優(yōu)選選擇為使得重均分子量為約2,000到約25,000Da。在本發(fā)明的選擇性方面中，聚合物的分子量為幾百到40,000或更大，其取決于技術人員的需要。
PEG通常由以下結(jié)構(gòu)表示 并且優(yōu)選R1和R2包括該式的殘基。
聚合物的聚合度(x)可為約10到約2,300。其表示聚合物鏈中重復單元的數(shù)目并且隨著聚合物分子量的改變而改變。(J)部分為本文中定義的封端基團，即，在聚合物末端上的基團，在某些方面中，其可選自NH2、OH、SH、CO2H、C1-6烷基或其它PEG末端活化基團中的任一個，這種基團可由本領域技術人員進行理解。
還可使用的是聚丙二醇、支鏈PEG衍生物如在共同轉(zhuǎn)讓的美國專利5,643,575(′575專利)中描述的那些支鏈衍生物、“星狀-PEG”和多臂狀PEG如在Shearwater Corporation′s 2001目錄″Polyethylene Glycol andDerivatives for Biomedical Application″中描述的那些。前述各個文獻的公開被并入本文作為參考?！?75專利提供的支鏈使得可從N-二(羥乙基)甘氨酸基團進行二代或三代支化，作為增加在生物學活性分子或酶的單個連結(jié)點上的聚合物加載的方法。應該理解，如果需要的話，可以對水溶性聚合物進行官能化用于連接雙官能連接基團，而不涉及不適當?shù)膶嶒灐?br> 雖然PAO和PEG在重均分子量范圍內(nèi)可以基本上不同，但是，在本發(fā)明的大多數(shù)方面中優(yōu)選R1和R2各自具有約2,000到約25,000Da的重均分子量。
優(yōu)選本文包括的聚合物在室溫下為水溶性的。這種聚合物的非限制性列表包括聚環(huán)氧烷均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚乙二醇化的多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物，條件是保持嵌段共聚物的水溶性。
在另外的實施方案中，作為PAO系聚合物的替代物質(zhì)，R1和R2各自選擇性地選自一個或多個有效地非抗原的材料，如右旋糖酐、聚乙烯醇、碳水化合物系聚合物、羥丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚環(huán)氧烷、和/或其共聚物。還參見共同轉(zhuǎn)讓的美國專利6,153,655，其內(nèi)容被并入本文作為參考。本領域技術人員應該理解，對于PAO如PEG，采用本文中所述相同類型的活化。本領域技術人員可能進一步認識到，上述列表只是示例性的并且考慮了具有本文所述性質(zhì)的所有聚合物材料，并且還考慮了其它聚環(huán)氧烷衍生物如聚丙二醇等。
本發(fā)明的聚合物還可以與雙官能物質(zhì)如聚(烷撐二醇)二胺共聚以形成適合用于滲透性隱形眼鏡、創(chuàng)傷敷料、給藥裝置等的互穿聚合物網(wǎng)絡?？捎杀绢I域技術人員容易地認識到這種支化的空間限制和水溶性。然而，優(yōu)選地，多支化聚合物的分子量不應超過80,000道爾頓。
C.雙功能連接基團L1、L2、L3和L4
在本發(fā)明的許多方面中，特別是式(I)中，L1、L2、L3和/或L4為促進N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物與聚合物鏈如R1和/或R2連接的連接基團。提供的該連接可以直接地或通過本領域技術人員已知的另外的結(jié)合基團連接。在說明書中提及了其它Lx基團，應該理解，它們選自與L1相同的基團。在本發(fā)明的這一方面，L1和L2可相同或不同并選自-NR19(CR14R15)tO--NR19(CR14R15)t(CR16CR17O)qNR19--O(CR14R15)tNR19--O(CR14R15)tO--NRR19(CR14R15)tNR19--NR19(CR14R15)t(CR16CR17O)q--NR19(CR16CR17O)t--NR19(CR16CR17O)t(CR14R15)qNR19--NR19(CR16CR17O)t--O(CR14R15)t-NR19--O(CR14R15)tNR19--O(CR14R15)tO--O(CR16CR17O)tNR19- 其中R14-R17和R19獨立地選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基；和
R18選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基、NO2、鹵代烷基和鹵素；和t和q獨立地選自正整數(shù)，優(yōu)選約1到約4。
在本發(fā)明的其它方面中，L1和/或L2可包括氨基酸殘基。氨基酸可選自任何已知的天然存在的L-氨基酸類，如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、脯氨酸、和/或其組合，只是列舉了一部分。當L1和/或L2包括肽時，肽的大小為例如約2到約10個氨基酸殘基。在一個優(yōu)選實施方案中，肽為Gly-Phe-Leu-Gly。
優(yōu)選氨基酸殘基為下式 其中X′為O、S或NR26，Y5為O、S或NR27，并且R26、R27和R28獨立地選自與定義R3相同的基團，但優(yōu)選各自為H或低級烷基(即C1-6烷基)；f為約1到約10的正整數(shù)，優(yōu)選為1。
天然存在的氨基酸的衍生物和類似物、以及多種本領域中已知的非天然存在的氨基酸(D或L)，無論具有疏水性或非疏水性，都被考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。只是舉例來說，氨基酸類似物和衍生物包括2-氨基-己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、γ-氨基丁酸(piperidinic acid)、6-氨基己酸、2-氨基-庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-氨基丁酸、鎖鏈素、2，2-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天門東酰胺、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、allo-異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-N-甲基賴氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、及太多而不能贅述的其它，其在63Fed.Reg.，29620，29622中有列舉，所述文獻被并入本文作為參考。
短鏈肽為例如具有2個到約10個、或更多個上述氨基酸殘基的肽。
更優(yōu)選地，L1和L2可相同或不同并選自-NH(CH2CH2)2O--NH(CH2CH2)(CH2CH2O)NH--O(CH2CH2)NH--O(CH2CH2)O--NH(CH2CH2)NH--NH(CH2CH2)(CH2CH2O)--NH(CH2CH2O)--NH(CH2CH2O)(CH2)NH--NH(CH2CH2O)2--O(CH2)3NH--O(CH2)3O--O(CH2CH2O)2NH- 在本發(fā)明的另一個實施方案中，L3和L4可相同或不同并選自-(O)CR30R31OCR32R33C(O)-；
-(O)CR30R31NR34CR32R33C(O)-；-C(O)CR30R31SCR32R33C(O)-；或-C(O)(CR30R31)nC(O)-；其中R30-34獨立地選自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6雜烷基或芳基，和n為優(yōu)選約2到約3的正整數(shù)。
優(yōu)選地，L3和L4選自-C(O)CH2OCH2C(O)-；-C(O)CH2NHCH2C(O)-；-C(O)CH2SCH2C(O)-；-C(O)CH2CH2CH2C(O)-；或-C(O)CH2CH2C(O)-。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于技術人員可以控制生物學活性部分或藥物從聚合物N-二(羥乙基)甘氨酸平臺水解或釋放的速率。取決于所選擇的特定連接體，本領域技術人員可以修飾化合物以控制水解速率。本發(fā)明的這一優(yōu)選方面使得技術人員能夠控制生物學活性部分被遞送到預定目標的速率。在期望生物學活性部分或藥物快速釋放的情況中，L3和L4連接體的引入提供了增強的水解速率。相比之下，對于在共同轉(zhuǎn)讓的美國專利申請10/218,167中公開的其中所述部分或藥物從平臺的釋放經(jīng)常取決于各種條件如pH或酶存在的先前的N-二(羥乙基)甘氨酸系聚合物平臺，L3和L4連接體依靠鄰位促進作用而能夠不依賴pH條件或有或沒有酶存在的條件下顯著增強生物學活性部分或藥物從聚合物平臺釋放的速率。然而，在酶的存在下，水解速率受到當使用鄰位促進時的鄰位促進或酶促反應中更快的那一個控制。因此，水解速率高度依賴于在N-二(羥乙基)甘氨酸部分本身和PEG部分之間使用的連接體的類型。因此，本發(fā)明在N-二(羥乙基)甘氨酸部分的任一臂上能夠可互換地使用永久性的和可釋放的連接體，只要至少一個臂結(jié)合有可釋放的連接體部分L1-L3或L2-L4。
D.Z部分及其功能在本發(fā)明的一個方面中，Z為L5-C(＝Y(jié)4)，其中L5為選自用于定義L1和L2的基團中的雙官能連接體，Y4選自與用于定義Y1-3相同的基團。在本發(fā)明的這一方面，Z基團起到作為A基團和N-二(羥乙基)甘氨酸轉(zhuǎn)運形式的其余部分之間的連接的作用。
在本發(fā)明的其它方面中，Z為被主動轉(zhuǎn)運進入靶細胞的部分、疏水部分、及其組合。雖然Z優(yōu)選為單價的，Z可以選擇性地為二價的或多價的，使得能夠?qū)-二(羥乙基)甘氨酸系聚合物連接超過一個的A基團。為了實現(xiàn)主動轉(zhuǎn)運，Z可以包括氨基酸、肽殘基、或多胺殘基，如以上有關L1和L2描述的那些、糖殘基、脂肪酸殘基、C6-18烷基、取代的芳基、雜芳基、-C(＝O)、C(＝S)或-C(＝NR29)，其中R29為H、低級烷基等。
本發(fā)明的這一方面廣泛地基于以下原理適合于結(jié)合到N-二(羥乙基)甘氨酸聚合物系前藥結(jié)合體中的生物學活性的材料本身可為在從N-二(羥乙基)甘氨酸連接的組合物水解釋放之后沒有活性的物質(zhì)/化合物，但其可在經(jīng)歷進一步的化學過程/反應之后變?yōu)榛钚缘?。對于這種實施方案，通過N-二(羥乙基)甘氨酸系聚合物系統(tǒng)遞送到血流中的治療劑或診斷劑、肽、多肽等可能在進入或被主動轉(zhuǎn)運進入感興趣的靶細胞之前保持非活性的，而在通過細胞內(nèi)化學作用如存在于該組織或細胞中的酶或酶系統(tǒng)而活化。
制備本發(fā)明這一方面的前藥，使得N-二(羥乙基)甘氨酸聚合物系結(jié)合體的體內(nèi)水解使結(jié)合體裂開，從而將活性生物材料(在本文中表示為A)釋放到細胞外液中，其仍然連接于Z部分。本發(fā)明的這一方面的生物學活性材料優(yōu)選，但不是唯一地，為小分子治療劑和/或診斷劑。例如，一種可能的Z-A組合為亮氨酸-阿霉素，另一個是氨基酸連接的喜樹堿或紫杉醇，并且要處理的組織為腫瘤組織。
不打算束縛于本發(fā)明如何操作的任何理論或假設，但是認為取決于選擇作為轉(zhuǎn)運增強劑的另外的部分，生物學活性物質(zhì)進入腫瘤細胞中的轉(zhuǎn)運速率取決于生物學活性物質(zhì)以受保護形式和/或轉(zhuǎn)運增強形式遞送進行細胞外組織如表現(xiàn)出EPR效果的組織中的速率。
在另一個選擇中，轉(zhuǎn)運增強劑(Z)選自用于細胞膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的已知底物。只是舉例來說，可容易地使用已知主動轉(zhuǎn)運某些營養(yǎng)素和內(nèi)分泌因子等、和這種營養(yǎng)素、或其類似物的細胞，以增強生物學有效材料進入靶細胞中的主動轉(zhuǎn)運。這些營養(yǎng)素的例子包括氨基酸殘基、肽，如約2到約10個殘基或更多殘基的短鏈肽、單糖和脂肪酸、內(nèi)分泌因子等。
短鏈肽為例如上述具有2個到約10個或更多個氨基酸殘基的肽。在本發(fā)明的這一實施方案中，認為這種肽轉(zhuǎn)運增強劑不必要是疏水的，但是認為在其它方面起作用以增強吸收和/或保護連接的小分子劑免于在全身血流中過早水解。例如，認為肽轉(zhuǎn)運增強劑，諸如例如，聚精氨酸、和具有類似分子量范圍的其它轉(zhuǎn)運增強劑在空間阻礙生物活性劑被血漿系水解酶裂開，但是其然后在靶細胞內(nèi)被多種肽和/或蛋白酶如組織蛋白酶裂開。
在某些優(yōu)選的方面，Z為疏水部分。不打算束縛于疏水性如何有助于效力的任何理論或假設，認為疏水部分通過抑制細胞外組織間隙如血漿中存在的水解酶等的攻擊而抑制轉(zhuǎn)運增強劑離開活性生物制劑的細胞外裂開。因此，某些優(yōu)選的轉(zhuǎn)運增強劑包括例如疏水性氨基酸如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸，以及以上提及的非天然存在的衍生物，如γ-氨基酸、及其類似物。
在另一個選擇中，轉(zhuǎn)運增強劑為疏水性有機部分。只是舉例來說，有機部分為取代的或未被取代的C6-18烷基、或更大的烷基、芳基或雜芳基。還考慮有機部分轉(zhuǎn)運增強劑包括和包含有機官能團，有機官能團包括例如-C(＝S)和/或-C(＝O)。
E.式(I)A基團1.離去基團在其中A為離去基團的那些方面中，適當?shù)牟糠职ǖ幌抻诨鶊F如N-羥基苯并三唑基、鹵素、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺基、對硝基苯氧基、咪唑基、N-羥基琥珀酰亞胺基、噻唑烷基硫酮(thiazolidinylthione)、O-?；寤?或 其它適合的離去基團對于本領域技術人員來說是顯而易見的。
對于本發(fā)明的目的，離去基團應理解為能夠與所需目標上的親核體反應的那些基團，即生物學活性部分、雙官能間隔體、中間物等。因此，目標包含用于替代的基團，如蛋白質(zhì)、肽、酶、天然存在或化學合成的治療劑分子如阿霉素、間隔體如單保護的二胺上的NH2基團。
如果希望的話，本發(fā)明的化合物還可以在N-二(羥乙基)甘氨酸基團和離去基團或連接的目標(藥物)之間包括間隔基團。間隔基團可為含最多18個碳原子的雜烷基、烷氧基、烷基，乃至另外的聚合物鏈。可使用標準的合成技術加入間隔基團。應該理解選擇用于(A)的那些部分還可以與除了生物學活性親核體之外的其它部分反應。
2.官能團
A還可以為官能團。這種官能團的非限制性例子包括可以通過含胺的間隔體與N-二(羥乙基)甘氨酸部分連接的馬來酰亞胺基、乙烯基、砜的殘基、羥基、氨基、羧基、巰基、酰肼、肼基甲酸酯(carbazate)等。一旦連接于N-二(羥乙基)甘氨酸部分，官能團(如馬來酰亞胺)可用于將N-二(羥乙基)甘氨酸聚合物與目標如多肽、氨基酸或肽間隔體等的半胱氨酸殘基連接。
3.生物學活性部分在其中A為含胺或含羥基化合物的殘基的式(I)的那些方面中，這種適合的化合物的非限制性列表包括有機化合物、酶、蛋白質(zhì)、多肽等的殘基。有機化合物包括但不限于如蒽環(huán)類部分、抗生素化合物，包括柔毛霉素、阿霉素；對氨基苯胺芥子氣、美法侖、Ara-C(阿糖胞苷)和相關的抗代謝物化合物，如吉西他濱等?；蛘?，該部分可為含胺或含羥基的心血管藥、抗腫瘤藥如喜樹堿和紫杉醇、抗感染藥物、抗真菌藥如制霉菌素、氟康唑和兩性霉素B、抗焦慮藥、腸胃病藥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)活化劑、鎮(zhèn)痛藥、致育藥、避孕劑、抗炎藥、類固醇藥的殘基等。
除了上述之外，生物學活性部分還可以為酶、蛋白質(zhì)、多肽、低聚核苷酸、單克隆抗體、單鏈抗原結(jié)合蛋白(SCA)如CC49的殘基，還考慮了其片段。適合的蛋白質(zhì)包括但不限于具有至少一個可用于聚合物連接的基團如ε-氨基、胱氨酸硫代(cystinylthio)、N-末端氨基的多肽、酶、肽等，包括具有生理學或藥理學活性的材料以及能夠催化在有機溶劑中反應的那些材料。
涉及的蛋白質(zhì)、多肽和肽包括但不限于血紅素、血清蛋白如包括因子VII、VIII、和IX的血液因子；免疫球蛋白、細胞因子如白細胞介素，即IL-1到IL-13等、α、β和γ干擾素、包括粒細胞集落刺激因子的集落刺激因子、血小板衍生的生長因子和磷脂酶活化蛋白質(zhì)(PLAP)。一般生物學上或治療學上感興趣的其它蛋白質(zhì)包括胰島素、植物蛋白如外源凝集素和蓖麻毒蛋白、腫瘤壞死因子和相關蛋白質(zhì)、生長因子如轉(zhuǎn)化生長因于如TGFα或TGFβ和表皮生長因子、激素、生長調(diào)節(jié)素、紅細胞生成素、色素激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促甲狀腺激素、組織纖溶酶原激活物等。感興趣的免疫球蛋白包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD、及其片段。
某些蛋白質(zhì)如白細胞介素、干擾素和集落刺激因子還以非糖基化的形式存在，通常為利用重組體技術產(chǎn)生的。非糖基化形式也處在本發(fā)明的蛋白質(zhì)之中。
感興趣的酶包括碳水化合物特異性酶、蛋白水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和連接酶。不限于特定的酶，感興趣的酶的例子包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、過氧化物歧化酶、內(nèi)毒素酶、催化酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、二磷酸腺苷酶、酪氨酸酶和膽紅素氧化酶。感興趣的碳水化合物特異性酶包括葡萄糖氧化酶、glucodase、半乳糖苷酶、葡萄糖苷脂酶、glucouronidase等。
本文還包括表現(xiàn)出體內(nèi)生物活性的生物聚合物的任何部分。這包括氨基酸序列、核酸(DNA、RNA)、肽核酸(PNA)、抗體片段、單鏈結(jié)合蛋白(參見例如美國專利4,946,778，其公開被并入本文作為參考)、結(jié)合分子，包括抗體或片段的融合、多克隆抗體、單克隆抗體和催化性抗體。
可通過本領域技術人員已知的技術如組織培養(yǎng)、從動物來源提取、或通過重組DNA方法制備或分離蛋白質(zhì)或其部分。還考慮了蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸序列等的轉(zhuǎn)基因源。這種材料得自轉(zhuǎn)基因動物，即鼠、豬、牛等，其中蛋白質(zhì)為奶、血液或組織的形式。還考慮了轉(zhuǎn)基因的昆蟲和桿狀病毒表達系統(tǒng)作為來源。此外，蛋白質(zhì)的突變形式，如突變干擾素也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
感興趣的其它蛋白質(zhì)為過敏原蛋白質(zhì)如豚草屬、抗原E、蜜蜂毒液、螨過敏原等。上述只是適用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的示例性說明。應該理解，還考慮了沒有特別提及但具有可用氨基的本文中定義的那些蛋白質(zhì)，并且處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，含氨基或含羥基的化合物為適合用于處理動物如哺乳動物包括人的藥物或診斷應用的生物學活性物質(zhì)，用于希望這種處理的狀況。上述列表對可以修飾的化合物只是說明性的而不是限制性的。本領域技術人員應該能夠認識到可以無需不適當?shù)膶嶒灦愃频匦揎椘渌倪@種化合物/組合物。應該理解，還考慮了沒有特別提及但具有適合的連接基團的那些生物學活性材料，并且其處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本文對適合于包含在本文中的含氨基或含羥基的分子的唯一限制在于其具有至少一個(伯或仲)胺基或羥基，他們可以與聚合物結(jié)合體反應并連接，并且在前藥系統(tǒng)釋放和再生母體化合物之后生物活性沒有顯著喪失。
F.N-二(羥乙基)甘氨酸連接的聚合物的合成在以下實施例中提出特定的N-二(羥乙基)甘氨酸系聚合物的合成方法?，F(xiàn)在參考圖1以便說明，一個優(yōu)選的方法包括1)使封端的雙官能連接體與酐諸如例如二甘醇酸酐反應以形成延長的封端的雙官能間隔體，如 2)將封端的雙官能間隔體與被酸保護的N-二(羥乙基)甘氨酸分子的各個羥基連接， 其中tBu為保護基，所有其它變量與前述式(I)中的相同，3)將得到的中間體去掉封端并使其與活化的聚合物如PNP-PEG或SC-PEG在堿性偶聯(lián)條件下反應，4)將N-二(羥乙基)甘氨酸脫保護并然后在偶聯(lián)條件下將酸用適合的活化基團如噻唑烷基硫酮活化。
可以理解，可使用本領域已知的其它保護基代替t-Bu。現(xiàn)在，活化的PEG或聚合物N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物能夠與藥物、肽、間隔體等反應并結(jié)合。
適合的偶聯(lián)劑的非限制性列表包括1，3-二異丙基碳二亞胺(DIPC)、任何適合的二烷基碳二亞胺、2-鹵代-1-烷基吡啶鎓鹵化物(Mukaiyama試劑)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、丙烷膦酸環(huán)酐(PPACA)和二氯磷酸苯酯等，其可得自商業(yè)源如Sigma-Aldrich Chemical，或使用已知的技術合成。
優(yōu)選地，取代基在惰性溶劑如四氫呋喃(THF)、乙腈(CH3CN)、二氯甲烷(DCM)、氯仿(CHCl3)、二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物酯反應。適合的堿包括二甲氨基吡啶(DMAP)、二異丙基乙胺、吡啶、三乙胺、KOH、叔丁醇鉀和NaOH等。反應通常在約0℃到最高為約22℃(室溫)的溫度下進行。
制備N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物的選擇性方法包括1)使一當量的延長的封端的雙官能連接體與一當量的酸保護的N-二(羥乙基)甘氨酸部分反應，形成如下的中間體 其中tBu為保護基，所有其它變量與前述式(I)中的相同，2)將得到的中間體脫保護并使其與活化的聚合物如PNP-PEG或SC-PEG在堿性偶聯(lián)條件下反應，3)將N-二(羥乙基)甘氨酸脫保護并然后將酸在偶聯(lián)條件下用適合的活化基團如噻唑烷基硫酮活化。
制備N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物的另一個方法為1)使第一延長的封端的雙官能連接體與酸保護的N-二(羥乙基)甘氨酸中間體反應，形成下式 2)然后使第二封端的雙官能連接體與步驟1的中間體反應以形成 3)然后將上述得到的中間體去掉封端并在堿性條件下與活化的聚合物如PNP-PEG或SC-PEG反應，4)最后將N-二(羥乙基)甘氨酸脫保護并然后在偶聯(lián)條件下用適合的活化基團如噻唑烷基硫酮活化。
無論選擇的何種途徑，由本文所述合成技術得到的一些優(yōu)選的化合物包括

其中A1為離去基團如 和
或其它離去基團(如在上述章節(jié)E1中描述的那些)。
N-二(羥乙基)甘氨酸活化的聚合物與適當?shù)哪繕朔磻够罨木酆衔镛D(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合體，A1變形為A2，其中A2為生物學活性部分、間隔體等的殘基。
G.加載多聚合物在本發(fā)明的另一個方面中，提供了N-二(羥乙基)甘氨酸系多支化聚合物化合物。具體地，堿性N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物被進一步修飾，以包括一個或多個末端支鏈基團。優(yōu)選地，末端支鏈基團為下式 其中Y5為O、S或NR46；L6為選自與定義L1相同的雙官能連接體；L8為選自與定義L3相同的雙官能連接體；R40-R46可相同或不同并選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基；j、j′、k和k′各自獨立地為0或正整數(shù)；q為0或1；u、h、v和w獨立地選自正整數(shù)；R50選自基本上非抗原的聚合物殘基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基、和
其中L7為選自與定義L1相同的雙官能連接體；L9為選自與定義L3相同的雙官能連接體；R60選自基本上非抗原的聚合物殘基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基，并且所有其它變量如上定義。
得到的支鏈N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物具有下式結(jié)構(gòu) 和
其中所有變量如前述定義。
如以下和實施例中所示，包含封端的伯胺的N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物中間體與兩當量活化的N-二(羥乙基)甘氨酸聚合物反應，以形成包含連接于生物學活性分子、酶、目標等上的單個連結(jié)點上的高達四個聚合物鏈的N-二(羥乙基)甘氨酸聚合物系統(tǒng)?？芍貜驮撨^程通過使兩當量的上述四鏈聚合物N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物與一當量的封端的伯胺N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物反應形成八鏈衍生物。
H.體內(nèi)診斷學本發(fā)明的另一個方面提供選擇性地制備具有連接于上述轉(zhuǎn)運增強劑的診斷標記物的本發(fā)明的結(jié)合體，其中選擇標記物用于診斷目的或成像目的。因此，通過將任何適當?shù)牟糠秩绨被釟埢B接于任何本領域的標準放射性同位素、不透X射線的標記物、磁共振標記物、或適合于核磁共振成像的其它非放射性同位素標記物、熒光型標記物、在紫外或紅外或電化學刺激下表現(xiàn)出可見顏色和/或能夠發(fā)熒光的標記物而制備適合的標記物，用于在手術過程中使腫瘤組織成像，等等。選擇性地，將診斷標記物結(jié)合到和/或連接于共軛的治療部分，以能夠監(jiān)控治療生物學活性物質(zhì)在動物或者或人患者中的分布。
在本發(fā)明的另一個方面，可通過本領域已知的方法使用任何適合的標記物包括例如放射性同位素標記物容易地制備本發(fā)明的標記結(jié)合體。只是舉例來說，這些放射性同位素標記物包括碘131、碘125、锝99和/或銦111，用于生產(chǎn)在體內(nèi)被選擇性地攝取到腫瘤細胞內(nèi)的放射性免疫閃爍掃描劑。例如，本領域已知有許多將肽連接于Tc-99m的方法，只是舉例來說，由美國專利5,328,679、5,888,474、5,997,844、和5,997,845所示的那些，所述文獻被并入本文作為參考。
概括地，對于在患者中解剖學定位腫瘤組織，對懷疑患有腫瘤的患者或動物給藥共軛標記物。在使標記后的免疫球蛋白定位在腫瘤位置的充分時間之后，檢測標記物產(chǎn)生的信號，例如通過視覺檢測、通過X射線照相、計算機橫斷斷層、MRI檢測、通過發(fā)光標記物的儀器檢測、通過照相掃描裝置如γ照相機檢測、或通過適合于所選擇標記物性質(zhì)的任何其它方法或裝置檢測。
然后將檢測到的信號轉(zhuǎn)化為圖象或解剖學和/或生理學判定腫瘤位置。成像使得可能在體內(nèi)定位腫瘤和設計適當?shù)闹委煵呗?。在其中標記物部分本身是治療劑的那些實施方案中，檢測到的信號在治療過程中提供解剖學定位證據(jù)，為隨后的診斷和治療介入提供基準。
I.治療方法本發(fā)明的另一個方面提供治療哺乳動物中多種醫(yī)療狀況的方法。該方法包括對需要這種治療的哺乳動物給予有效量的前藥，如根據(jù)本文所述制備的阿霉素-N-二(羥乙基)甘氨酸連接-PEG結(jié)合體。該組合物可特別用于治療腫瘤疾病，降低腫瘤負荷、防止腫瘤轉(zhuǎn)移和防止癌/腫瘤在哺乳動物中生長的再發(fā)生。
前藥的給藥量可取決于其中包括的母體分子，如肽、多肽、蛋白質(zhì)、酶等的不同而不同。通常，用于該治療方法的前藥的量為在哺乳動物中有效地實現(xiàn)所需治療結(jié)果的量。自然地，各種前藥化合物的劑量多少取決于母體化合物、體內(nèi)水解速率、聚合物的分子量等的不同而不同。本領域技術人員能夠根據(jù)臨床經(jīng)驗和治療適應癥決定所選擇的前藥的最佳劑量。實際的劑量對于技術人員來說顯而易見，無需不適當?shù)膶嶒灐?br> 本發(fā)明的組合物可包括在對哺乳動物給藥的一種或多種適當?shù)乃帉W組合物中。藥學組合物可為根據(jù)本領域眾所周知的方法制備的溶液、懸浮液、片劑、膠囊等劑型。還考慮了這種組合物的給藥可取決于技術人員的要求經(jīng)口服和/或非腸道途徑進行?？墒褂媒M合物的溶液和/或懸浮液作為例如用于通過本領域已知方法例如通過靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、皮下注射等注射或滲透組合物的載體介質(zhì)。
這種給藥也可為通過輸液進入身體空間或腔中，以及通過吸入和/或經(jīng)鼻途徑。然而，在本發(fā)明優(yōu)選的方面中，對有需要的哺乳動物經(jīng)非腸道途徑給藥所述前藥。
實施例以下實施例用于提供對本發(fā)明的進一步說明，但是其不以任何方式限制本發(fā)明的有效范圍。實施例中敘述的帶下劃線和粗體數(shù)字相當于圖1到11中表示的那些。
總的方法所有反應都在干燥的氮氣或氬氣環(huán)境下進行。市售的試劑不經(jīng)進一步純化而使用。所有的PEG化合物都經(jīng)過真空干燥并在使用前從甲苯中進行共沸蒸餾。除非另外說明，使用Varian Mercury300NMRspectrometer和氘代氯仿作為溶劑獲得NMR圖譜數(shù)據(jù)?；瘜W位移(δ)報告為從四甲基硅(TMS)開始到低磁場位移的百萬分之一(ppm)。
HPLC方法通過Beckman Coulter System GoldHPLC裝置監(jiān)控反應混合物以及監(jiān)控中間體和最終產(chǎn)品的純度，使用ZOBAX300SB C-8反相柱(150×4.6mm)或Phenomenex Jupiter300A C18反相柱(150×4.6mm)、多波長UV檢測器，使用0.5％三氟乙酸(TFA)中的30-90％乙腈梯度洗脫，流速為1mL/min。
實施例1化合物(1)的合成在1小時的時間內(nèi)向在冰浴中冷卻到5℃的二碳酸二叔丁酯(15g，86mmol)的1，4-二氧雜環(huán)己烷(150mL)溶液中滴加2，2′-(亞乙二氧基)雙(乙胺)(25.85g，174.4mmol)的1，4-二氧雜環(huán)己烷(100mL)溶液。使反應混合物升溫到室溫并再攪拌兩小時。減壓除去溶劑并將殘余物溶解于二氯甲烷(DCM，150mL)中，用水(3×150mL)洗，干燥(MgSO4)，過濾并減壓蒸發(fā)溶劑，得到1(13.84g，68.8mmol，80％)。13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ115.76，79.03，73.45，70.12，40.31，28.39。
實施例2化合物(3)的合成在室溫下攪拌1(3.0g，12.1mmol)、二甘醇酸酐(2，1.26g，10.9mmol)、和DMAP(1.4g，11.5mmol)在無水DCM(30mL)中的溶液18小時。混合物用0.1N HCl(30mL)洗，并將有機層干燥(無水硫酸鈉)，過濾，并減壓除去溶劑，得到3(1.5g，4.14mmol，38％)。13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ173.37，171.27，169.94，169.59，157.81，155.96，81.15，79.30，71.78-68.76(m)，41.59，40.13，38.94，38.73，28.27。
實施例3化合物(6)的合成在室溫下攪拌4(24.0g，0.228mol)和5(12.0g，0.061mol)在無水二氯甲烷(DCM，400mL)中的溶液18小時。反應混合物用水(4×150mL)洗并用無水硫酸鈉干燥有機層，隨后過濾并在真空中除去溶劑，得到6(6.1g，0.0279mol，46％)。13C NMR(67.8MHz，CDCl3)δ172.1，81.4，59.5，57.0，56.3，27.8。
實施例4化合物(7)的合成向冷卻到0℃的3(0.5g，1.37mmol)、6(0.090g，0.41mmol)、DMAP(0.46g，3.8mmol)、和三氟甲磺酸鈧(0.04g，0.023mmol)在無水DCM(10mL)中的溶液中加入EDC(0.35g，1.8mmol)。將混合物置于冰浴中自然升溫到室溫過夜?；旌衔镉盟?，然后用0.1N HCl洗。將有機層干燥(無水硫酸鈉)，過濾并減壓除去溶劑，得到7(0.37g，0.41mmol，～100％)。13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ170.15，169.38，168.64，155.73，81.23，79.05，70.95，69.86，69.58，68.33，67.55，63.18，53.09，52.85，40.31，38.59，28.37，28.14。
實施例5化合物(8)的合成向7(0.38g，0.42mmol)的DCM(8mL)溶液中加入三氟乙酸(TFA，2mL)并在室溫下攪拌溶液15分鐘，隨后減壓除去溶劑，得到8(0.38g，0.42mmol，～100％)。8的結(jié)構(gòu)由13C NMR證實。
實施例6化合物(10)的合成制備8(0.38g，0.42mmol)和DMAP(0.16g，1.3mmol)在無水DCM(30mL)中的溶液并首先將其22mL加入到9(8.0g，0.66mmol)的DCM(30mL)溶液中。在室溫下攪拌得到的混合物6小時，隨后加入剩余的8的溶液并再攪拌12小時。減壓下部分除去溶劑并用乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾，并將殘余物從異丙醇(IPA，160mL)結(jié)晶，得到10(7.8g，0.63mmol，95％)。13C NMR(75.5MHz，CDC13)δ169.82，169.10，168.32，155.87，80.85，71.51-67.28(PEG)，63.48，62.88，58.61，55.80，52.55，40.44，38.26，27.88。
實施例7
化合物(11)的合成在室溫下攪拌10(6.7g，0.27mmol)的DCM(68mL)和TFA(34mL)中的溶液15小時，隨后減壓下部分除去溶劑。用乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾器并用乙醚洗，得到化合物11(6.7g，0.27mmol，-100％)。13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ169.04，168.67，168.37，155.94，71.51-68.04(PEG)，63.48，62.71，58.59，55.07，52.84，40.43，38.23。
實施例8化合物(12)的合成將11(6.9g，0.27mmol)、2-巰基噻唑啉(0.10g，0.84mmol)、和DMAP(0.136g，1.12mmol)在DCM(70mL)中的溶液冷卻到0℃，隨后加入EDC(0.16g，0.84mmol)。使混合物升溫到室溫并攪拌12小時。減壓下部分除去溶劑并用乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾并從IPA(140mL)結(jié)晶，得到12(6.0g，0.23mmol，87％)。13C NMR(67.8MHz，CDCl3)δ201.05，172.52，169.10，168.31，155.85，71.51-67.11(PEG)，63.46，63.08，60.47，58.58，55.33，52.55，40.44，38.28，28.71。
實施例9化合物(13)的合成向12(2.0g，0.089mmol)和阿霉素鹽酸鹽(0.103g，0.179mmol)在DCM/DMF(20mL/20mL)的混合物中的溶液中加入DMAP(0.043g，0.35mmol)。在氮氣下攪拌混合物18小時，隨后在減壓下部分除去溶劑用乙醚沉淀PEG衍生物，通過過濾收集，并從DMF/IPA(8mL/32mL)結(jié)晶兩次，得到13(1.6g，0.065mmol，73％)。13C NMR(67.8MHz，CDCl3)δ313.32，186.56，186.18，169.50，168.93，168.55，160.58，155.99，155.85，155.23，135.38，135.05，133.46，133.28，120.47，119.39，118.17，111.14，110.93，100.54，72.0-69.0(PEG)，68.01，65.17，63.67，62.65，58.68，56.41，54.07，40.54，38.40，35.51，33.56，29.73，16.69。
實施例10
化合物(15)的合成在室溫下攪拌14(3.0g，12.1mmol)、2(1.26g，10.9mmol)、和DMAP(1.4g，11.5mmol)在無水DCM(30mL)中的溶液18小時。混合物用0.1N HCl(30mL)洗并干燥(無水硫酸鈉)有機層，過濾并在減壓下除去溶劑，得到15。15的結(jié)構(gòu)通過13C NMR證實。
實施例11化合物(16)的合成向冷卻到0℃的15(0.5g，1.37mmol)、6(0.090g，0.41mmol)、DMAP(0.46g，3.8mmol)、和三氟甲磺酸鈧(0.04g，0.023mmol)在無水DCM(10mL)中的溶液中加入EDC(0.35g，1.8mmol)。使混合物置于冰浴中在過夜期間自然升溫到室溫?；旌衔镉盟?，然后用0.1N HCl洗。有機層干燥(無水硫酸鈉)，過濾并減壓除去溶劑，得到16。16的結(jié)構(gòu)通過13C NMR證實。
實施例12化合物(17)的合成向16(0.38g，0.42mmol)的DCM(8mL)溶液中加入三氟乙酸(TFA，2mL)并在室溫下攪拌溶液15分鐘，隨后減壓下除去溶劑，得到17。17的結(jié)構(gòu)通過13C NMR證實。
實施例13化合物(18)的合成制備17(0.38g，0.42mmol)和DMAP(0.16g，1.3mmol)在無水DCM(30mL)中的溶液并首先將其22mL加入到9a(8.0g，0.66mmol)的DCM(30mL)溶液中。在室溫下攪拌得到的混合物6小時，隨后加入剩余的18的溶液并再攪拌12小時。減壓下部分除去溶劑并用乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾并將殘余物從異丙醇(IPA，160mL)結(jié)晶，得到18。18的結(jié)構(gòu)通過13C NMR證實。
實施例14化合物(19)的合成在室溫下攪拌18(6.7g，0.27mmol)在DCM(68mL)和TFA(34mL)中的溶液15小時，隨后減壓除去溶劑。用乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾并用乙醚洗，得到化合物19。19的結(jié)構(gòu)通過13C NMR證實。
實施例15化合物(20)的合成將19(6.9g，0.27mmol)、2-巰基噻唑啉(0.10g，0.84mmol)、和DMAP(0.136g，1.12mmol)的DCM(70mL)溶液冷卻到0℃，隨后加入EDC(0.16g，0.84mmol)。使反應混合物升溫到室溫并攪拌12小時。減壓下部分除去溶劑并用乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾并從IPA(140mL)結(jié)晶，得到20。20的結(jié)構(gòu)通過13C NMR證實。
實施例16化合物(21)的合成向20(2.0g，0.089mmol)和阿霉素鹽酸鹽(0.103g，0.179mmol)在DCM/DMF(20mL/20mL)的混合物中的溶液中加入DMAP(0.043g，0.35mmol)。在氮氣下攪拌混合物18小時，隨后減壓下部分除去溶劑。用乙醚沉淀PEG衍生物，通過過濾收集并從DMF/IPA(8mL/32mL)結(jié)晶兩次，得21。21的結(jié)構(gòu)通過13C NMR證實。
實施例17化合物(26)的合成在與制備化合物18相似的條件下制備化合物26。
實施例18化合物(29)的合成在與制備化合物21相似的條件下制備化合物29。
實施例19化合物35的合成除了只是將一當量的化合物3與一當量化合物6反應之外，在與制備化合物13相似的條件下制備化合物35。
實施例20化合物43的合成在與制備化合物13相似的條件下制備化合物35，除了只是將一當量的化合物3與一當量化合物6反應以得到化合物36、一當量的化合物36與一當量的化合物37反應以得到38之外，其余的反應條件相同，得到化合物43。
實施例21蛋白質(zhì)結(jié)合材料和方法雞蛋白溶菌酶(EC 3.2.1.17)、溶菌酶底物細菌(Micrococcuslysodeikticus)、和PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，pH 7.4，138mM NaCl，和2.7mM KCl)購自Sigma Inc.(St.Louis，MO)。預制的Tris-glycine SDS電泳凝膠和凝膠運行緩沖液得自Invitrogen(Carlsbad，CA)。用于測量結(jié)合體體內(nèi)水解的大鼠血漿在EDTA中處理并冷凍儲存。IL-2購自PeproTech(Princeton，NJ)，GFP得自Clontech(Palo Alto，CA)。所有的體內(nèi)測量進行一式三份，體外測量有±5％的標準偏差。
單PEG-溶菌酶結(jié)合體的制備得自雞蛋的溶菌酶的分子量為14,500并具有6個賴氨酸殘基。在快速攪拌下，將反應摩爾比為1∶1(PEG∶溶菌酶)的經(jīng)過活化的PEG粉末加入到5mg/mL溶菌酶在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.3)的溶液中。在25℃攪拌45分鐘之后，用0.2M磷酸鈉(pH 5.1)處理反應到最終的pH6.5。使用6,000-8,000MW截止膜將反應混合物相對于4℃的20mM磷酸鈉(pH 5.1)透析。透析之后樣品的導電率應小于2mS。使用具有NaCl梯度的20mM磷酸鈉(pH5.1)在陽離子交換柱(Pores，HS)上進行單PEG-溶菌酶的分離。收集單PEG-溶菌酶的峰并使用具有10kNMWL膜(Millipore Corp.，Bedford，MA)的ultrafree離心過濾裝置濃縮。純化的單PEG-溶菌酶的收率為約20-30％。
多PEG-溶菌酶結(jié)合體的制備在快速攪拌下，將反應摩爾比為30∶1(PEG∶溶菌酶)的經(jīng)過活化的PEG連接體加入到5mg/mL溶菌酶在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.3)的溶液中。在室溫下攪拌45分鐘之后，用0.2M磷酸鈉(pH 5.1)處理反應到最終的pH6.5。使用H2O稀釋反應混合物并在Hiload Superdex 200柱上以1mL/min分離。柱緩沖液包含20mM磷酸鈉(pH 6.8)和140mMNaCl。收集峰的級分并使用具有30k NMWL膜(Millipore Corp.，Bedford，MA)的ultrafree離心過濾裝置濃縮。純化的多PEG-溶菌酶的收率為約85％，并且通過熒光分析發(fā)現(xiàn)每溶菌酶分子的PEG數(shù)為約5-6。
濃度測定在280nm下在0.1M磷酸鈉(pH 7.3)中以2.39mL/mg.cm的消光系數(shù)測定PEG-溶菌酶結(jié)合體的濃度。
溶菌酶的酶活性分析在如上所述的反應條件下在只與單一PEG結(jié)合之后溶菌酶活性消失。在多種釋放條件下通過溶菌酶活性的再生并在SDS電泳凝膠上確認表明溶菌酶的釋放。在典型的溶菌酶活性分析中，在96孔滴定板上將0.2mL的0.02％(w/v)Mlysodeikticus(底物)加入到50μL的包含0.01％BSA的66mM磷酸鉀(pH 6.2)中的0.12-0.25μg溶菌酶中。跟蹤在450nm下的吸光率5分鐘。將吸光率的減少率作為酶活性的度量。在25℃時，一個單元的酶活性在450nm下生產(chǎn)0.001吸光率單位/分鐘的變化。
溶菌酶在大鼠血漿和化學緩沖液中的釋放使磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中的PEG-溶菌酶結(jié)合體經(jīng)歷與PBS(pH7.4)的緩沖液交換，以監(jiān)控在大鼠血漿中的釋放。測量37℃時PBS的穩(wěn)定性。結(jié)合體還經(jīng)歷與H2O的緩沖液交換用于在三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.5)中釋放。對單PEG-溶菌酶結(jié)合體使用CentriCon 10K離心管(Millipore Corp.，Bedford，MA)，而對多PEG-溶菌酶結(jié)合體使用CentriCon 30K。溶菌酶從單PEG-溶菌酶結(jié)合體或多PEG-溶菌酶結(jié)合體的釋放在氮氣下在0.15mg/mL條件下進行。在所指時間，抽取小份試樣，用0.2M磷酸鹽(pH 5.1)中和到pH 6.5，并在進一步分析之前保存在-20℃下。
結(jié)果表1.PEG-N-二(羥乙基)甘氨酸-阿霉素的性質(zhì)

表2.PEG化的溶菌酶在大鼠血漿和緩沖液中的釋放速率*

*數(shù)據(jù)表示為以小時計的t1/2。在血漿中釋放監(jiān)控為3天，在pH 8.5緩沖液中釋放監(jiān)控為5天，在PBS中釋放監(jiān)控為7天。PBS包含138mMNaCl、2.7mM KCl、和10mM磷酸鹽，pH 7.4。溶菌酶的釋放通過溶菌酶活性的再生檢測，并通過凝膠電泳加以證實。
權利要求
1.包括下式(I)的化合物 其中R1和R2獨立地選自下組中基本上非抗原的聚合物殘基、H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基、和末端支鏈基團；Z選自主動轉(zhuǎn)運進入靶細胞的部分、疏水部分、雙官能連接部分及其組合；Y1-3可相同或不同并選自O、S或NR11；L1和L2可為相同或不同的雙官能連接體；R3-R11、R24和R25可相同或不同并選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基；L3和L4可相同或不同并選自-C(O)(CR30R31)Y15(CR32R33)C(O)-或-C(O)(CR30R31)(CR32R33)C(O)-，其中Y15選自O、S、NR34或CH2，和R30-34可相同或不同并選自H、烷基、烯基、炔基、雜烷基或芳基；A選自離去基團、官能團、生物學活性部分和OH；a、b、c、d、和e獨立地為0或1，m、n、o、和p獨立地為正整數(shù)，f和g為0或1，條件是(f+a)或(g+c)中至少之一等于2。
2.權利要求1的化合物，其中R3-R10、R24-25和R30-34各自為氫；Y15為O或NR34。
3.權利要求1的化合物，其中a、b、c、d、f、g、m、n、o和p各自為1，e為0或1。
4.權利要求1的化合物，其中(c和g)各自為0。
5.權利要求1的化合物，其中(a和f)各自為0。
6.權利要求1的化合物，其中(c、g、和d)各自為0。
7.權利要求1的化合物，其中(a、b、和f)各自為0。
8.權利要求1的化合物，其中R1包括聚環(huán)氧烷。
9.權利要求1的化合物，其中R2包括聚環(huán)氧烷。
10.權利要求1的化合物，其中R1包括聚乙二醇。
11.權利要求1的化合物，其中R2包括聚乙二醇。
12.權利要求1的化合物，其中R1或R2進一步包括封端基團J，該封端基團J選自OH、NH2、SH、CO2H、C1-6烷基部分、 和
13.權利要求10的化合物，其選自下組中 和
14.權利要求1的化合物，其中R1選自下組中J-O-(CH2CH2O)x-，J-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-，J-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NR12-，J-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-，-OC(O)CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-，-NR12CH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NR12-，和-SHCH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-，其中x為聚合度；R12選自下組中氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基，和J為封端基團。
15.權利要求1的化合物，其中R2選自下組中J-O-(CH2CH2O)x-，J-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-，J-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NR13-，J-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-，-OC(O)CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-，-NR13CH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NR13-，和-SHCH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-，其中x為聚合度；R13選自下組中氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-12支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基，和J為封端基團。
16.權利要求1的化合物，其中R1-2獨立地選自下組中CH3-O-(CH2CH2O)x-，CH3-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-，CH3-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NH-，和CH3-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-，其中x為聚合度。
17.權利要求1的化合物，其中R1和R2各自包括下式所示的聚合物殘基， 其中x為聚合度。
18.權利要求17的化合物，其中R1和R2各自的重均分子量為約2,000Da到約25,000Da。
19.權利要求1的化合物，其中L1和L2獨立地選自下組中-NR19(CR14R15)tO--NR19(CR14R15)t(CR16CR17O)qNR19--O(CR14R15)tNR19--O(CR14R15)tO--NR19(CR14R15)tNR19--NR19(CR14R15)t(CR16CR17O)q--NR19(CR16CR17O)t--NR19(CR16CR17O)t(CR14R15)qNR19--NR19(CR16CR17O)t--O(CR14R15)t-NR19--O(CR14R15)tNR19--O(CR14R15)tO--O(CR16CR17O)tNR19- 其中R14-R17和R19獨立地選自下組中氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-12支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基；和R18選自下組中氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-12支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基、NO2、鹵代烷基和鹵素；和t和q獨立地選自約1到約4的正整數(shù)。
20.權利要求1的化合物，其中L3和L4獨立地選自下組中-(O)CR30R31OCR32R33C(O)-；-(O)CR30R31NR34CR32R33C(O)-；-C(O)CR30R31SCR32R33C(O)-；或-C(O)(CR30R31)nC(O)-；其中R30-34獨立地選自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6雜烷基或芳基，和n為約2到約3的正整數(shù)。
21.權利要求1的化合物，其包括下式 其中A1為離去基團。
22.權利要求1的化合物，其選自下組中 其中A1為離去基團。
23.權利要求1的化合物，其中A1為選自下組中的離去基團 和
24.權利要求23的化合物，其中A為
25.權利要求1的化合物，其中A選自下組中馬來酰亞胺基、乙烯基、磺?；?、羥基、氨基、羧基、巰基、酰肼、肼基甲酸酯官能團。
26.權利要求1的化合物，其中所述末端支鏈基團包括下式 其中Y5為O、S或NR46；L6為選自與定義L1相同組中的雙官能連接體；L8為選自與定義L3相同組中的雙官能連接體；R40-R46可相同或不同并選自下組中氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基；j、j′、k和k′各自獨立地為0或正整數(shù)；q為0或1；g、h、v和w獨立地選自正整數(shù)；R50選自下組中基本上非抗原的聚合物殘基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基，和 其中L7為選自與定義L1相同組中的雙官能連接體；L9為選自與定義L3相同組中的雙官能連接體；R60選自下組中基本上非抗原的聚合物殘基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、和芳烷基。
27.權利要求26的化合物，其包括以下結(jié)構(gòu)
28.權利要求26的化合物，其包括以下結(jié)構(gòu)
29.權利要求1的化合物，其選自下組中 和
30.權利要求1的化合物，其選自下組中 其中A為離去基團。
31.制備聚合物結(jié)合體的方法，其包括使下式的化合物 其中A1為離去基團；R1和R2獨立地選自下組中基本上非抗原的聚合物殘基、H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基、和末端支鏈基團，條件是R1和R2不都是H；Z選自主動轉(zhuǎn)運進入靶細胞的部分、疏水部分、雙官能連接部分及其組合；Y1-3可相同或不同并選自O、S或NR11；L1和L2可為相同或不同的雙官能連接體；R3-R11、R24和R25可相同或不同并選自下組中氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基；L3和L4可相同或不同并選自-C(O)(CR30R31)Y15(CR32R33)C(O)-或-C(O)(CR30R31)(CR32R33)C(O)-，其中Y15選自O、S、NR34或CH2，和R30-34可相同或不同并選自H、烷基、烯基、炔基、雜烷基或芳基；與含胺的生物活性劑在足以形成下式的條件下反應， 其中A2為含胺的生物活性劑的殘基。
32.制備N-二(羥乙基)甘氨酸系聚合物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的方法，其包括a)使封端的雙官能連接體與酐反應以形成下式所示的延長的封端的雙官能間隔體 b)將封端的雙官能間隔體與被酸保護的N-二(羥乙基)甘氨酸分子的各個羥基連接；c)將得到的中間體去掉封端并使其在堿偶聯(lián)條件下與活化的聚合物反應；和d)將N-二(羥乙基)甘氨酸脫保護并然后在偶聯(lián)條件下用適當?shù)幕罨鶊F使該酸活化。
33.治療方法，其包括對有需要的哺乳動物給予有效量的權利要求1的化合物，其中A為生物活性劑的殘基。
34.權利要求1的化合物，其中A為選自低聚核苷酸、蛋白質(zhì)、酶和有機化合物組中的生物學活性部分。
全文摘要
本發(fā)明公開了式(I)所示的活化的聚合物 N－二(羥乙基)甘氨酸衍生物，以及由其制備的結(jié)合體。還公開了制備和使用N－二(羥乙基)甘氨酸衍生物的方法。
文檔編號A61K38/16GK1771057SQ03826566
公開日2006年5月10日 申請日期2003年8月13日 優(yōu)先權日2003年5月30日
發(fā)明者趙洪, 理查德·B·格林沃爾德 申請人:安龍公司