專利名稱：修飾的無唾液酸－干擾素及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用干擾素治療肝病。
背景技術(shù)：
干擾素是一類天然存在的蛋白，其最早是由于其預防病毒復制的能力而被發(fā)現(xiàn)的。其它研究確定，干擾素具有抗增生效應并可用于對抗一些類型的癌細胞。具體地說，包括干擾素-α，-β和-γ家族的成員在內(nèi)的干擾素顯示對許多病毒和腫瘤指征有臨床效果，所述指征包括肝炎，毛細胞(hairycell)白血病，慢性骨髓源性白血病，黑素瘤，濾泡樣淋巴瘤(follicularlymphoma)和慢性肉芽腫性疾病(chronic granulomatous disease)。
乙型肝炎(HBV)和丙型肝炎(HCV)病毒感染是全世界性的健康問題。超過350,000,000人感染有HBV，使得其成為全世界最常見的嚴重慢性病毒感染。此外，在全世界范圍內(nèi)，HBV是導致肝癌的首要病因。此外，全世界大約170,000,000人患有慢性HCV感染，包括美國的至少3,900,000人。HCV導致30％的終末期肝病和肝癌，并且是導致患者需要肝移植的主要疾病。然而，HBV和HCV的治療選擇的有效性很有限，其會很快喪失有效性，且通常難以被患者耐受。
在美國，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率從1975到1995增加了71％，且被診斷患有肝癌的患者總數(shù)每年持續(xù)增加。在2002年，美國癌癥協(xié)會估計在美國將確診16,600例原發(fā)肝癌和膽管癌，并且14,100美國人將死于該疾病。
雖然干擾素是有功效的治療性化合物，它們很快從患者體內(nèi)清除，使得需要頻繁給藥以保持該化合物的治療有效水平。此外，干擾素不靶向具體的組織，且由此需要相對高的系統(tǒng)濃度以便在靶位點達到治療有效濃度。干擾素的這些性質(zhì)增加了治療導致的有害副作用出現(xiàn)的可能性。因此，需要將干擾素靶向疾病位點較長時間以使其效力最大化且副作用最小化。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及基本純的修飾的哺乳動物(例如人)無唾液酸-干擾素，其與水溶性聚合物結(jié)合(conjugate)，所述水溶性聚合物的平均分子量為大約1,000-60,000道爾頓，1,000-5,000，5,001-10,000，10,001-20,000，20,001-35,000，或35,001-60,000道爾頓。所述水溶性聚合物可以是線性的或分支的，并可內(nèi)部交聯(lián)。優(yōu)選，所述水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚(乙烯醇)(PVA)，聚(氧化烯烴)，諸如聚(丙二醇)(PPG)，聚三亞甲基二醇(PTG)，和聚(氧乙烯化多元醇)，諸如聚(氧乙烯化山梨醇)，聚(氧乙烯化甘油，和聚(氧乙烯化葡萄糖)。本發(fā)明的無唾液酸-干擾素可在一個，兩個，三個或更多個氨基酸殘基上進行修飾。對于在一個以上的氨基酸殘基上進行修飾的無唾液酸-干擾素，其可利用相同或不同的水溶性聚合物修飾。在所需的實施方案中，所述無唾液酸-干擾素在半胱氨酸，賴氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，精氨酸，或谷氨酸殘基；在C-末端羧基；或在N-末端胺基被修飾。在最優(yōu)選的實施方案中，所述無唾液酸-干擾素在半胱氨酸或賴氨酸上修飾。適合藥用的無唾液酸-干擾素包括，例如人無唾液酸-干擾素-α，無唾液酸-干擾素-β，和無唾液酸-干擾素-γ。本發(fā)明還提供了藥物組合物，其含有修飾的哺乳動物無唾液酸-干擾素和可藥用的賦型劑。
另一方面，本發(fā)明涉及通過給藥有效量的藥物組合物治療患肝病的患者的方法，所述藥物組合物包含修飾的哺乳動物(例如，人)無唾液酸-干擾素。適合于利用該方法治療的肝病包括，例如病毒性肝炎(例如，乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒感染)，肝纖維化，和肝癌諸如彌漫型肝細胞癌(diffuse-typeheptocellular carcinoma)，發(fā)熱型肝細胞癌(febrile-type heptocellularcarcinoma)，和淤膽型肝細胞癌，肝母細胞瘤，肝樣腺癌，以及灶性結(jié)節(jié)樣增生。在本發(fā)明該方面的所需實施方案腫，所述修飾的無唾液酸-干擾素是前述的任何一種。修飾的無唾液酸-干擾素的治療有效量為例如，約0.025μg/kg到10.0μg/kg體重(例如，約0.025，0.035，0.05，0.075，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，或3.5μg/kg體重)。此外，所述治療有效量可以是例如每天一次、每隔一天一次、每周兩次、每周一次、每隔一周一次或每月一次進行給藥。
″干擾素″指高同源物種家族-已知為干擾素的特定蛋白，其可抑制病毒復制和細胞增生，并調(diào)節(jié)免疫反應，且基本上與干擾素-α，-β或-γ或其生物活性片段相同。評估干擾素的生物活性的方法是眾所周知的(例如，Monkarsh等，Anal.Biochem.247434-440，1997；Grace等，J.InterferonCytokine Res.211103-1115，2001；Bailon等，Bioconj.Chem.12195-202，2001；Pepinsky等，J.Pharmacol.Exp.Therap.2971059-66，2001)。人干擾素根據(jù)其細胞來源和分子結(jié)構(gòu)而分成三類干擾素-α(白細胞)，干擾素-β(纖維母細胞)，和干擾素-γ(淋巴細胞)。
″干擾素-α″是指含有與干擾素-α2成熟多肽(氨基酸24-188，登錄號P01563；SEQ ID NO1)或其生物活性片段基本相同的氨基酸序列的蛋白。因此干擾素-α包括干擾素-α2前體多肽(登錄號P01563；SEQ ID NO1)以及保持成熟干擾素-α生物活性(例如，抗增生活性)的片段。該定義還包括干擾素-α2的變體形式，包括例如，干擾素-α2b(SEQ ID NO1的R46K突變)和干擾素-α2c(SEQ ID NO1的R57H突變)。干擾素-α2b是O-連接的糖蛋白。干擾素-α14c是N-連接的糖蛋白，其在Asn-72糖基化。天然干擾素可以Wellferon(Glaxo-SmithKline，Alferon(干擾素)，Sumiferon(Sumitomo)和Multiferon(Viragen)的商品名購得。非-糖基化的干擾素-α也可購得，包括例如重組干擾素-α2a，商品名為Roferon-A(Roche)，重組干擾素-α2b，商品名為Intron-A(Schering Ploμgh)，和重組干擾素-α2c，名為Berofor alpha2(Boehringer Ingelheim)。重組共有序列干擾素-con 1可以Infergen(Amgen)的名稱獲得。當然，在用于本發(fā)明的組合物和方法前，任何非-糖基化的干擾素必須用含有末端半乳糖殘基的寡糖來糖基化。
″干擾素-β”是指含有與成熟干擾素-β多肽(氨基酸22-187，登錄號P01574；SEQ ID NO2)或其生物活性片段基本相同的氨基酸序列的蛋白。因此干擾素-β包括不包含單個肽的成熟干擾素-β蛋白，包含所述單個肽的干擾素-β前體多肽(登錄號P01574；SEQ ID NO2)，以及其具有干擾素-β活性(例如，抗增生活性)的片段。干擾素-β是在成熟干擾素-β蛋白的Asn80上糖基化的糖蛋白。重組干擾素-β已經(jīng)開發(fā)出來并可購得。干擾素-β1a可以Avonex(Biogen)和Rebifg(Serono)的商品名購得。干擾素-β1b可以Betaseron(Berlex)的商品名購得。
″干擾素-γ″是指含有與成熟干擾素-γ多肽(氨基酸21-166，登錄號P01579；SEQ ID NO3)或其生物活性片段基本相同的氨基酸序列的蛋白。因此干擾素-γ蛋白包括，不包含單個肽的成熟干擾素-γ多肽，以及包含所述單個肽的干擾素-γ前體蛋白(登錄號P01579；SEQ ID NO3)，以及其具有干擾素-γ生物活性(例如，抗增生活性)的片段。干擾素-γ在Asn48糖基化，且在二聚體中于Asn120糖基化?？梢訟ctimmune(InterMune)的商品名購得干擾素-γ。
對于前述任何干擾素，其變體形式也可包含在它們的定義中，所述變體形式中所述干擾素多肽序列中的一種氨基酸被另一種替換而不喪失生物活性。一個實例為干擾素-α，-β，或-γ，其中的絲氨酸或蘇氨酸殘基被半胱氨酸殘基替換，所述半胱氨酸殘基隨后用于將其它部分(例如PEG部分)結(jié)合于干擾素。在一種這樣的實例中，干擾素分子中的半胱氨酸被取代，所述半胱氨酸在不干擾折疊的位置上并且至少部分暴露在所述分子的表面。
″無唾液酸-干擾素″是指缺乏存在于天然糖基化干擾素中的末端唾液酸基團的糖基化干擾素。去除所述末端唾液酸殘基使得其下方的半乳糖部分暴露。無唾液酸糖蛋白受體識別的是所述末端半乳糖。優(yōu)選，無唾液酸-干擾素含有存在于天然干擾素中的碳水化合物部分的至少50％，70％，80％，90％，或甚至95％。最優(yōu)選，無唾液酸-干擾素僅缺乏末端唾液酸殘基。無唾液酸-干擾素可通過從糖基化干擾素去除一或多個唾液酸殘基來產(chǎn)生，所述糖基化干擾素例如干擾素-α，-β或-γ。所述去除可例如通過溫和的酸水解，或用純化的神經(jīng)氨酸酶處理天然的糖基化干擾素來實現(xiàn)，所述糖基化干擾素例如干擾素-α，-β或-γ。對于含有一個以上糖鏈的干擾素，可使用具體的神經(jīng)氨酸酶(唾液酸酶)實現(xiàn)選擇性去唾液酸化。該定義具體排除的是完全去糖基化的干擾素，包括通常由原核細胞產(chǎn)生的干擾素和由真核細胞產(chǎn)生的干擾素并通過酶或化學方法進行去糖基化。當然，由于去除唾液酸殘基的目的是產(chǎn)生在其寡糖鏈具有至少一個末端半乳糖殘基的糖基化干擾素，可通過任何其他適合的方法對末端半乳糖殘基進行改造，所述方法包括例如將寡糖共價結(jié)合于去糖基化的干擾素。
″修飾的無唾液酸-干擾素″是指與至少一種水溶性聚合物結(jié)合的無唾液酸-干擾素，其保持天然干擾素生物活性的至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％(例如，抗增生或抗病毒活性)。
可與無唾液酸-干擾素結(jié)合的水溶性聚合物的實例包括聚烷基二醇，諸如聚乙二醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚(乙烯醇)(PVA)，聚(氧化烯烴)，諸如聚(丙二醇)(PPG)，聚三亞甲基二醇(PTG)，和聚(氧乙烯化多元醇)，諸如聚(氧乙烯化山梨醇)，聚(氧乙烯化甘油)，和聚(氧乙烯化葡萄糖)。優(yōu)選地，水溶性聚合物的平均分子量為大約100道爾頓-200,000道爾頓，例如，100-999，1,000-5,000，5,001-10,000，10,001-20,000，20,001-35,000，35,001-60,000，60,001-100,000或100,001-200,000道爾頓。在更優(yōu)選的實施方案中，水溶性聚合物的平均分子量為大約1,000-5,000，5,001-10,000，10,001-20,000，20,001-35,000，35,001-60,000或60,001-100,000道爾頓。此外，該定義還包括利用本文所述方法活化的這些聚合物的形式。
所述修飾的無唾液酸-干擾素可被修飾，例如，通過在半胱氨酸，賴氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，精氨酸或谷氨酸殘基；C-末端羧基；或N-末端胺基與聚合物共價結(jié)合。在其它優(yōu)選實施方案中，修飾的無唾液酸-干擾素通過將水溶性聚合物與一個以上氨基酸殘基結(jié)合來修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定將水溶性聚合物與無唾液酸-干擾素進行結(jié)合的最優(yōu)選殘基，并利用其確定所述聚合物的平均分子量，例如通過測定和比較修飾的無唾液酸-干擾素各位置異構(gòu)體的相對抗病毒活性，抗增生活性，或生物分布/藥物動力學確定。此外，數(shù)種異構(gòu)體的組合可用于產(chǎn)生復合藥物動力學圖譜。例如，這些活性可通過利用本文所述抗病毒或抗增生實驗來測定。
″聚乙二醇化無唾液酸-干擾素″是指與至少一種聚乙二醇(PEG)聚合物結(jié)合，的無唾液酸-干擾素，其保持天然干擾素的生物活性(例如，抗增生或抗病毒活性)的至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％。例如，PEG可以為單甲氧基PEG(mPEG)，且其可與無唾液酸-干擾素共價結(jié)合。優(yōu)選，所述PEG是mPEG聚合物，其平均分子量為例如，約1,000-5,000，5,001-10,000，10,001-20,000，20,001-35,000，或35,001-60,000道爾頓(例如，1,000，1,450，3,350，5,000，6,000，8,000，10,000，12,000，20,000，30,000，35,000，40,000，或60,000道爾頓)。在更優(yōu)選的實施方案中，所述mPEG聚合物的平均分子量為，例如，約5,000，12,000，20,000或40,000道爾頓。所述PEG化的無唾液酸-干擾素可以例如，在干擾素的半胱氨酸，賴氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，精氨酸，或谷氨酸殘基；C-末端羧基；N-末端胺基發(fā)生PEG化。在其它優(yōu)選實施方案中，PEG化無唾液酸-干擾素在一個以上的氨基酸殘基PEG化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易確定無唾液酸-干擾素中最優(yōu)選的可PEG化殘基，且利用其確定PEG的平均分子量，例如通過測定和比較PEG化的無唾液酸干擾素各位置異構(gòu)體的相對抗病毒活性，抗增生活性，或生物分布/藥物動力學確定。此外，數(shù)種異構(gòu)體的組合可用于產(chǎn)生復合藥物動力學圖譜。例如，這些活性可通過利用本文所述抗病毒或抗增生實驗來測定。
″聚乙烯吡咯烷酮化的無唾液酸-干擾素″是指與至少一個各聚乙烯吡咯烷酮(PVP)分子偶鏈的無唾液酸-干擾素，且其保持天然干擾素的生物活性(例如，抗增生或抗病毒活性)的至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％。PVP化的無唾液酸-干擾素可例如，在干擾素的半胱氨酸，賴氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，精氨酸，或谷氨酸殘基；C-末端羧基；N-末端胺基發(fā)生PVP化。在其它優(yōu)選的實施方案中，PVP化無唾液酸-干擾素在一個以上的氨基酸殘基發(fā)生PVP化。在具體有用的實施方案中，所述PVP聚合物的平均分子量為約17,000道爾頓。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易測定無唾液酸-干擾素中最優(yōu)選的可PVP化殘基以及PVP分子的數(shù)目，例如通過測定和比較PVP化的干擾素各位置異構(gòu)體的相對抗病毒活性，抗增生活性，或生物分布/藥物動力學確定。此外，數(shù)種異構(gòu)體的組合可用于產(chǎn)生復合藥物動力學圖譜。例如，這些活性可通過利用本文所述抗病毒或抗增生實驗來測定。
″肝病(hepatic disorder)″是指影響肝的組織或細胞的任何疾病。“肝病”的實例包括病毒性肝炎，肝癌，以及肝的纖維化。肝炎可通過例如乙型肝炎或丙型肝炎病毒引起的肝的感染造成。乙型肝炎或丙型肝炎病毒的感染可由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用標準方法測定，例如通過測定患者是否有抗肝炎病毒抗體或病毒RNA。
″肝癌″是指肝的組織或細胞發(fā)生異常增生的任何疾病?？梢鸶伟┑母渭毎懝芗毎?、血管諸如門靜脈的細胞、樹突細胞或肝細胞。肝癌包括但不限于，肝細胞癌，諸如彌漫型肝細胞癌，發(fā)熱型肝細胞癌，和淤膽型肝細胞癌，肝母細胞瘤，肝樣腺癌，以及灶性結(jié)節(jié)樣增生。此外，肝癌可以是肝炎病毒慢性感染的后果。
其肝癌表達無唾液酸糖蛋白受體的患者適合于通過修飾的無唾液酸-干擾素治療；這些患者可通過使用本領(lǐng)域標準診斷方法確定(例如Burgess等，Hepatology 15702-706，1992；Hirose等，Biochem.and Biophys.ResearchComm.287675-681，2001；Hyodo等，Liver 1380-5，1993；Trere等，Br.J.Cancer 81404-8，1999)。
″抗腫瘤治療(antineoplstic therapy)″是指用于部分或完全抑制腫瘤增生的醫(yī)學方法或治療。通常，抗腫瘤治療包括從患者去除部分或所有腫瘤細胞的外科方法(例如肝切除)，放射治療法和化學治療法?？膳c本發(fā)明的無唾液酸-干擾素聯(lián)合給藥的具體有用的抗腫瘤化療劑包括，例如烷基化劑，抗代謝物，亞硝基脲和植物生物堿。優(yōu)選“抗腫瘤治療”導致腫瘤增生降低例如，25％，50％，或75％。在更優(yōu)選的實施方案中“抗腫瘤治療”導致腫瘤增生減少例如，80％，90％，95％，或甚至99％。可與修飾的無唾液酸-干擾素聯(lián)用的抗腫瘤劑的實例在例如Wadler and Schwartz(Cancer Res.503473-3486，1990)中描述。
″抗病毒劑″是指破壞病毒或降低病毒在體內(nèi)復制或擴散的能力的化合物?？共《緞┑膶嵗ǜ蓴_素-α，-β，-γ，利巴韋林(1β-D呋喃核糖基(ribofuranosyl)-1H-1，2，4三唑3-甲酰胺)及其衍生物，以及合成的核苷酸類似物拉米夫定((順-1-[2′-羥基甲基-5′-(1，3-氧硫雜茂烷基(oxathiolanyl))]胞嘧啶)及其類似物。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解如何利用標準方法(例如以下文獻公開的方法Monkarsh等，Analytical Biochemistry 247434-440，1997；Bailon等，Bioconjμgate Chem.12195-202，2001；and Grace等，J.of干擾素and Cytokine Research 211103-1115，2001)以及本文所述的方法測定試劑的抗病毒活性。優(yōu)選，″抗病毒劑″造成病毒復制或擴散降低例如，至少10％，20％，30％，或50％。在更優(yōu)選的實施方案中，抗病毒劑降低病毒的復制或擴散例如70％，80％，90％，95％，甚至99％。
″無唾液酸糖蛋白受體-表達型肝病”是指含有這樣細胞的任何肝病，所述細胞表達可檢測水平的無唾液酸糖蛋白受體蛋白(登錄號NP001662或P07307)或基本上與所述無唾液酸糖蛋白受體相同的蛋白，或核酸。可利用任何適宜的體內(nèi)、離體或體外技術(shù)評估所述細胞的無唾液酸糖蛋白受體表達。例如在活檢或手術(shù)切除過程中從患者取出的細胞可通過無唾液酸糖蛋白受體表達表征，所述表征可利用標準免疫組織化學方法，Northern或Western印跡技術(shù)或ELISA來進行。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知無唾液酸糖蛋白受體并且所述受體在例如Spiess等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 826465-6469，1985)和Spiess等(J.Biol.Chem.2601979-1982，1985)中描述。
“基本相同”是指與參比氨基酸或核酸序列具有至少75％，優(yōu)選85％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％，或甚至99％相同的多肽或核酸。對于多肽，比較序列的長度通常為至少20個氨基酸，優(yōu)選至少30個氨基酸，更優(yōu)選至少40個氨基酸，且最優(yōu)選50個氨基酸。對于核酸，比較序列的長度通常至少60個核苷酸，優(yōu)選至少90個核苷酸，且最優(yōu)選至少120個核苷酸。
通常利用序列分析軟件(例如，Genetics Computer Group的序列分析軟件包(Sequence Analysis Software Package)，University of WisconsinBiotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705，BLAST，BESTFIT，GAP，或PILEUP/PRETTYBOX程序)測定序列同一性。這種軟件通過將同源性程度賦予各種取代，缺失，和/或其它修飾而與相同或相似的序列匹配。保守性取代通常包括下列取代甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；精氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
″有效量″是指抑制腫瘤生長或防止病毒在體內(nèi)復制或擴散所需要的本發(fā)明化合物單獨使用或聯(lián)用的量。用于治療腫瘤(即癌癥)和病毒感染的實施本發(fā)明使用的活性化合物的治療有效量取決于給藥方式、受治療者的年齡、體重和總體健康。最后，醫(yī)師將確定適宜的量和劑量方案。這種量通常稱為“治療有效”量。
修飾的無唾液酸-干擾素的“有效量”可以是，例如約0.0035μg到20μg/kg體重/天或0.010μg到140μg/kg體重/周。優(yōu)選，“治療有效量”為約0.025μg到10.0μg/kg，例如，約0.025，0.035，0.05，0.075，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，或9.0μg/kg體重，以每天一次，每隔一天一次，每周兩次，每周一次的方式給藥。此外，修飾的無唾液酸-干擾素的“治療有效量”為例如約100pg/m2到100,000μg/m2，以每天一次，每隔一天一次，每周兩次，每周一次，每隔一周一次，或每月一次的方式給藥。在優(yōu)選實施方案中，所述治療有效量為約1,000，μg/m2到20,000μg/m2，例如，約1,000，1,500，4,000，或14,000llg/m2的修飾的無唾液酸-干擾素，以每天一次，每隔一天一次，每周兩次，每周一次，每隔一周一次，或每月一次的方式給藥。
″片段″是指基本上與參比蛋白或核酸相同的部分蛋白或核酸，其保持參比蛋白或核酸的生物活性(例如抗腫瘤活性或抗病毒活性)的至少50％或75％，更優(yōu)選80％，90％，or 95％，或甚至99％，可通過使用本文所述抗病毒或抗腫瘤實驗測定。
本發(fā)明的修飾的無唾液酸-干擾素在治療疾病方面優(yōu)于天然存在的干擾素許多優(yōu)點。修飾(例如，PEG化或PVP化)的優(yōu)點在于增加溶解性，降低腎和免疫清除率，降低蛋白水解敏感性，以及降低免疫原性。如本文所述，無唾液酸-干擾素的修飾輔助降低所述化合物從身體清除的速率，從而增加該化合物的治療有效性。由于修飾的化合物在體內(nèi)存在的時間比其未修飾的對應物延長，可對患者給藥較少的修飾化合物而達到相同的治療效果。此外，所述修飾的無唾液酸-干擾素靶向肝，這可導致與給藥未修飾的干擾素相關(guān)的以及對治療不利的繼發(fā)效應的出現(xiàn)減少。
此外，從干擾素去除唾液酸基團可暴露其末端半乳糖殘基，且所述無唾液酸-干擾素由此可靶向任何表達無唾液酸糖蛋白受體的細胞。已顯示在受纖維化，硬化或肝細胞癌影響的肝中，受體位點的總數(shù)從正常肝中的每個細胞140,000(+/-65,000)位點增加到每個細胞300,000(+/-125,000)個位點(Eisenberg等，J.Hepatol.13305-309，1991)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，修飾的無唾液酸-干擾素可優(yōu)選靶向肝。這種靶向可增加治療性化合物在治療位點的局部濃度，從而可降低有效治療疾病所需的劑量。
因此，本發(fā)明的化合物的治療有效性增強，這是由于治療性化合物的儲留以及對具體組織的靶向增加。
附圖簡要說明

圖1是天然人干擾素-β結(jié)構(gòu)的示意圖解。還說明神經(jīng)氨酸酶對天然人干擾素-β的常見雙觸(biantennary)復合型糖鏈的切割位點?？s寫Fuc，巖藻糖；GlcNAc，N-乙酰葡糖胺；Man，甘露糖；Gal，半乳糖；NeuAc，N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)。
圖2A是人干擾素-α-2前體多肽(登錄號P01563)(SEQ ID NO1)的氨基酸序列，包括信號肽(氨基酸1-23；黑體字)。成熟干擾素-α-2多肽(普通字體)延伸為氨基酸24-188。氨基酸129的加下劃線的蘇氨酸是O-連接的糖基化位點。
圖2B是編碼人干擾素-α-2前體多肽的mRNA的核酸序列(登錄號NM_000605)(SEQ ID NO4)。所述編碼序列從核酸69延伸到核酸635。起始和終止密碼子加下劃線。該核酸序列有數(shù)種變體形式，包括以下核酸變化核酸位置205的A到G；核酸位置667的A到G；核酸位置909的C到T；和/或核酸位置949的A到G。
圖3A是干擾素-β前體多肽的氨基酸序列(登錄號P01574)(SEQ IDNO2)，包括信號肽(氨基酸1-21；黑體字)。所述成熟人干擾素-β多肽(普通自體)延伸為氨基酸22-187。在氨基酸位置101加下劃線的天冬酰胺是O-連接的糖基化位點。人干擾素-β變體多肽含有氨基酸位置162的酪氨酸(C到Y(jié))。
圖3B是編碼人干擾素-β前體多肽的mRNA的核酸序列(登錄號NM_002176)(SEQ ID NO5)。所述編碼序列延伸為核酸1-564。起始和終止密碼子加下劃線。該核酸序列有數(shù)種變體形式，包括以下核酸變化核酸位置153的C到T，以及核酸位置228的C到T。
圖4A是人干擾素-γ前體蛋白的氨基酸序列(登錄號.P01579)(SEQ IDNO3)，包括信號肽(氨基酸1-20；黑體字)。所述成熟人干擾素-γ多肽(普通字體)延伸為氨基酸21-166。干擾素-γ前體蛋白中氨基酸位置48和120的加下劃線的天冬酰胺是N-連接的糖基化位點(盡管Asn120是二聚體中唯一被糖基化的)。
圖4B是編碼人干擾素-γ前體蛋白的mRNA的核酸序列(NM_000619)(SEQ ID NO6)。所述編碼序列延伸為核酸109-609。起始和終止密碼子加下劃線。該核酸序列有數(shù)種變體形式，包括以下核酸變化核酸624的A到G；核酸705的A到G；核酸732的A到T；核酸789的C到T；核酸986的C到T；以及核酸1148的A到G。
發(fā)明詳細說明本發(fā)明涉及修飾的無唾液酸-干擾素，例如聚乙二醇化無唾液酸-干擾素和聚乙烯吡咯烷酮化的無唾液酸-干擾素，以及使用這些化合物治療腫瘤疾病和病毒感染的方法。修飾的無唾液酸-干擾素靶向表達無唾液酸糖蛋白受體以及干擾素受體的細胞。因此，這種化合物也可用于治療表達這些受體的細胞的腫瘤或病毒感染；然而，所述化合物對表達兩種受體的細胞治療活性最佳。
從干擾素去除唾液酸基團可暴露其末端半乳糖殘基，并且由此無唾液酸-干擾素可靶向任何表達無唾液酸糖蛋白受體的細胞。已顯示患有纖維化，硬化或肝癌的肝中，受體位點總數(shù)從正常肝中的每個細胞140,000(+/-65,000)個位點增加到每個細胞300,000(+/-125,000)個位點(Eisenberg等，J.Hepatol.13305-309，1991)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，修飾的無唾液酸-干擾素將優(yōu)選靶向肝。這種靶向增加治療性化合物在治療位點的局部濃度，從而使得有效治療疾病所需的劑量降低。因此，本發(fā)明的化合物由于治療性化合物的儲留延長且對具體組織的靶向增強而具有增強的治療有效性。
本發(fā)明修飾的無唾液酸-干擾素在治療疾病方面由于天然存在的干擾素形式而有許多優(yōu)點。修飾(例如，PEG化或PVP化)的優(yōu)點在于增加溶解性，降低腎和免疫清除率，降低蛋白水解敏感性，以及降低免疫原性。如本文所述，無唾液酸-干擾素的修飾有助于降低所述化合物從身體清除的速率，從而增加該化合物的治療有效性。由于修飾的化合物在體內(nèi)存在的時間比其未修飾的形式延長，可對患者給藥較少的修飾化合物。由于劑量減少，這可導致與給藥修飾的干擾素相關(guān)的以及對治療不利的繼發(fā)效應的出現(xiàn)減少。
修飾的無唾液酸-干擾素治療和天然干擾素一樣，修飾的無唾液酸-干擾素可用于治療肝病，包括肝炎和一些癌癥。例如，利用本發(fā)明所述方法，可通過將藥物組合物給藥哺乳動物來治療該哺乳動物(例如人)中的乙型和丙型肝炎以及表達無唾液酸糖蛋白的肝癌，所述藥物組合物包括治療有效量的修飾的無唾液酸-干擾素(例如，修飾的無唾液酸-干擾素-α，修飾的無唾液酸-干擾素-β或修飾的無唾液酸-干擾素-γ)。
此外，修飾的無唾液酸-干擾素可與其它治療方法聯(lián)用，所述治療方法諸如化療，放射治療，手術(shù)介入，以及給藥其它抗病毒化合物。(這樣的組合是本領(lǐng)域標準的并在例如Wadler等(Cancer Res.503473-86，1990)中描述)。例如，可將修飾的無唾液酸-干擾素與治療有效量的利巴韋林(1β-D呋喃核糖基(ribofuranosyl)-1H-1，2，4三唑3-甲酰胺(carboxamide))或其衍生物聯(lián)合給藥以治療病毒感染。另外，可將修飾的無唾液酸-干擾素與治療有效量的拉米夫定(lamivudine)((順-1-[2′-羥基甲基-5′-(1，3-氧硫雜茂烷基)]胞嘧啶)或其類似物聯(lián)合給藥以治療病毒感染。
無唾液酸糖蛋白受體無唾液酸糖蛋白受體是在肝細胞上以高密度(50,000到500,000位點/細胞)存在的跨膜蛋白并介導具有暴露的末端殘基的細胞外糖蛋白的內(nèi)化。該無唾液酸糖蛋白受體是低親和性受體，且其對配體的親和力隨該配體上存在的半乳糖簇(cluster)的數(shù)目而變化(Lee等，J.Biol.Chem.258199-202，1983)。該受體對具有兩個半乳糖殘基的簇(雙觸)的配體的親合力(KD～10-6)低于對具有三個半乳糖殘基的簇(三觸)的配體(KD～10-8-10-9)。
干擾素的遞送從任何天然干擾素去除唾液酸基團可暴露末端半乳糖殘基(圖1)，產(chǎn)生無唾液酸糖蛋白受體的識別位點。這種修飾使得無唾液酸-干擾素可選擇性靶向表達無唾液酸糖蛋白受體的組織諸如肝等。此外，與無唾液酸糖蛋白受體的結(jié)合以及受體復合物內(nèi)化很可能增加無唾液酸-干擾素活化細胞內(nèi)干擾素-α/β受體庫的能力。此外，將無唾液酸-干擾素靶向無唾液酸糖蛋白受體很可能增加無唾液酸-干擾素在細胞表面的局部濃度，從而增加該無唾液酸-干擾素與高親和力干擾素-α/β受體的結(jié)合的可能性，所述受體在肝細胞上以低密度(100-5,000位點/細胞)存在。
細胞表面干擾素受體結(jié)合此外，通過與無唾液酸糖蛋白受體結(jié)合來增加肝細胞表面的無唾液酸-干擾素局部濃度，使得無唾液酸-干擾素-α，-β或-γ很可能與干擾素-α/受體或干擾素-γ受體反應。將無唾液酸-干擾素從無唾液酸糖蛋白受體轉(zhuǎn)移到干擾素-α/β受體或干擾素-γ受體很可能在對無唾液酸糖蛋白受體親合力降低的無唾液酸-干擾素組合物中發(fā)生。所述無唾液酸糖蛋白受體對配體的親合力隨存在于該配體上的半乳糖簇數(shù)目而變化(Lee等，J.Biol.Chem.258199-202，1983)。所述無唾液酸糖蛋白受體對雙觸(biantennary)配體的(KD～10-6)親和力低于對三觸(triantennary)配體的親合力(KD～10-8-10-9)。
本領(lǐng)域已知各種方法來產(chǎn)生具有不同比例的雙觸復合物的干擾素。例如，纖維母細胞產(chǎn)生的干擾素的雙觸復合物比例高于CHO細胞產(chǎn)生的該干擾素。具體地，人纖維母細胞產(chǎn)生的人無唾液酸-干擾素-β含有約82％的雙觸半乳糖-末端寡糖以及約18％的三觸半乳糖-末端寡糖。
如果干擾素-β碳水化合物鏈的結(jié)構(gòu)擴展(Karpusas等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9411813-11818，1997)，干擾素-β很可能與無唾液酸糖蛋白受體和干擾素-α/β受體同時反應。因此大量無唾液酸糖蛋白受體可使無唾液酸-干擾素-β在細胞表面濃縮和其可能同時與較少量的干擾素-α/β受體反應。
細胞內(nèi)干擾素受體結(jié)合干擾素-α，-β或-γ與細胞內(nèi)干擾素受體的結(jié)合很可能引發(fā)干擾素信號傳遞(signaling)。摻入脂質(zhì)體的干擾素-α產(chǎn)生的活性明顯高于游離干擾素-α，支持了干擾素不需要到達細胞表面即可顯示活性這一假設。此外，配體與無唾液酸糖蛋白受體的結(jié)合激發(fā)了受體-配體復合物的內(nèi)化，使得無唾液酸-干擾素可接近細胞內(nèi)干擾素受體。
干擾素制備通常，本發(fā)明的多肽，諸如干擾素-α(圖2A)，-β(圖3A)或-γ(圖4A)可通過用全部或部分編碼多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化適宜的宿主細胞例如真核細胞來制備，所述核酸分子諸如圖2所示的干擾素-α編碼的核酸，圖3B所示的干擾素-β編碼的核酸，圖4B所示的干擾素-γ編碼核酸或位于適當表達載體中的片段。
分子生物學領(lǐng)域技術(shù)人員將理解多種表達系統(tǒng)可用于提供所述重組蛋白?？僧a(chǎn)生真核干擾素肽表達系統(tǒng)，其中干擾素肽基因序列被導入質(zhì)?；蚱渌d體，并隨后用于轉(zhuǎn)化活細胞。其中的干擾素肽cDNA含有以正確方向插入表達質(zhì)粒的整個開放讀框的構(gòu)建體可用于蛋白表達。真核表達系統(tǒng)允許干擾素肽融合蛋白的表達和回收，其中所述干擾素肽與標記分子共價連接，從而易于鑒定和/或純化?？稍诟蓴_素肽和標記分子之間改造酶或化學切割位點，使得所述標記可在純化后被去除。
常見表達載體含有用于指導大量mRNA合成的啟動子，所述mRNA對應攜帶質(zhì)粒的細胞中所插入的干擾素肽核酸。它們也可包括真核或原核復制起點序列，使其可在宿主生物體內(nèi)自主復制，編碼使得含載體細胞可在其它毒性干擾素的存在的條件下被選出的遺傳特性的序列，以及可增加合成mRNA的翻譯效率的序列。穩(wěn)定長期載體可利用調(diào)節(jié)元件例如病毒保持為游離復制實體(例如來自Epstein Barr病毒基因組的OriP序列)。還可產(chǎn)生所述載體整合到其基因組DNA的細胞系，且基因產(chǎn)物可以這種方式持續(xù)產(chǎn)生。
所用具體宿主細胞對本發(fā)明而言不是關(guān)鍵性的。本發(fā)明的多肽可在真核宿主(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，昆蟲細胞例如Sf21細胞，或哺乳動物細胞例如，NIH 3T3，HeLa，CHO，COS細胞，或優(yōu)選在纖維母細胞中)中制備。這種細胞可自多種來源獲得(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VA；也參見，例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，New York，2001)。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法以及表達載體的選擇取決于所選宿主系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染方法在例如Ausubel等(supra)；expression vehicles may be chosen fromthose provided，例如，in Cloning VectorsA Laboratory Manual(P.H.Pouwels等，1985，Supp.1987)中描述。
存在多種表達系統(tǒng)以制備本發(fā)明的多肽。例如可利用哺乳動物細胞表達干擾素多肽。穩(wěn)定或瞬時細胞系克隆可利用干擾素肽表達載體進行，從而產(chǎn)生可溶形式的(截短的和標記的)干擾素多肽。適宜的細胞系包括，例如COS，HEK293T，CHO或NIH 3T3細胞系。適宜的載體包括但不限于，染色體，游離基因以及病毒來源的載體，例如來自細菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母游離基因、插入元件、酵母染色體元件、病毒(諸如桿狀病毒，乳多泡病毒，諸如SV40，痘苗病毒，腺病毒，雞痘病毒，豬皰疹病毒1群(pseudorabies viruses)以及逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，以及來自其組合的載體。
一旦構(gòu)建出適宜的表達載體，通過轉(zhuǎn)化技術(shù)將其引入適宜的宿主細胞，所述技術(shù)諸如但不限于，磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染，電穿孔，顯微注射，原生質(zhì)融合或脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染。用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞可包括(但不限于)酵母，真菌，昆蟲細胞(利用例如桿狀病毒載體在SF9昆蟲細胞中進行表達)，或來自小鼠，人或其它動物的細胞。干擾素多肽的體外表達，融合，或克隆的DNA編碼的多肽片段也可使用。分子生物學領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將理解可利用多種表達系統(tǒng)和純化系統(tǒng)來制備重組干擾素多肽及其片段。一些這樣的系統(tǒng)在例如Ausubel等(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY(2000)，包含在本文中作為參考)中描述。
天然糖基化干擾素可從天然產(chǎn)生它的人細胞，或經(jīng)改造而表達重組干擾素基因的轉(zhuǎn)基因真核細胞分離。天然或重組制備干擾素的方法通常描述于美國專利4,124,702，4,130,641，4,680,261，4,758,510，5,376,567，5,795,779，和5,827,694。另外，分離和純化人干擾素可購得(例如，SigmaChemical Co.產(chǎn)品目錄號I 2396，I 2271，I 1640，和I 6507)。
一旦本發(fā)明的重組多肽被表達，就可利用如親和色譜法來分離。一個實例中，抗本發(fā)明多肽的抗體(例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準技術(shù)制備的)可附著于柱上并用于分離所述重組多肽。在親和色譜前可用標準方法對含多肽細胞進行裂解和分級(參見例如，Ausubel等，上文)。
一旦被分離，所述重組蛋白可根據(jù)需要被進一步純化，例如通過高效液相色譜或其它色譜法(參見例如Fisher，Laboratory Techniques InBiochemistry And Molecular Biology，eds.，Work and Burdon，Elsevier，1980)。
本發(fā)明的多肽，特別是短肽片段，也可通過化學合成制備(例如通過Solid Phase Peptide Synthesis，2nd ed.，The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，1984中所述方法)。
這些多肽表達和純化的常見技術(shù)也可用于制備和分離具有上述干擾素生物活性的有用的肽片段以及類似物。
無唾液酸-干擾素制備制備具有不同比例雙觸復合物的干擾素的各種方法是已知的。纖維母細胞產(chǎn)生的干擾素比中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產(chǎn)生的干擾素具有較高例如較高的雙觸復合物的比例。具體地，人纖維母細胞產(chǎn)生的人無唾液酸-干擾素-β含有約82％的雙觸半乳糖-末端寡糖以及約18％的三觸半乳糖-末端寡糖。
無唾液酸-干擾素可通過從干擾素去除末端唾液酸殘基來制備，所述干擾素是糖基化的并通常具有由于其從真核細胞產(chǎn)生而具有該殘基(見例如美國專利4,184,917及其中引用的參考文獻，和Kasama等，J.Interfer.Cyto.Res.15407-415，1995)。末端唾液酸殘基可通過例如溫和的酸水解或用分離的純化細菌或病毒神經(jīng)氨酸酶處理天然糖基化干擾素而被去除，如Drzenieck等(Microbiol.Immunol.5935，1972)所述。包括來自產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌(Clostridinm perfringens)，鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)，Arthrobacter ureafaciens，和霍亂弧菌(Vibrio cholera)的神經(jīng)氨酸酶在內(nèi)的純化的神經(jīng)氨酸酶可容易地自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)買到(產(chǎn)品目錄號N 3642，N 5146，N 7771，N 5271，N 6514，N 7885，N2876，N 2904，N 3001，N 5631，N 2133，N 6021，N 5254，和N 4883)。
例如，為制備人無唾液酸-干擾素-β，在微量離心管中將附著于瓊脂糖珠(beaded agarose)(約0.22單位)的20mg不溶性神經(jīng)氨酸酶混懸于1ml蒸餾水中，并使其短暫水合。所述瓊脂糖通過離心沉淀并用1ml乙酸鈉緩沖液(pH5.5)洗滌三次，所述緩沖液含有154mM NaCl和9mM氯化鈣，并將所述凝膠(約72ul)重懸浮于150μl乙酸鈉緩沖液中。例如，可將糖基化的人干擾素-β(3×106IU/小管，約0.15mg)懸浮于150μl乙酸鈉緩沖液中。所述凝膠和干擾素-β隨后被混合并在37C在旋轉(zhuǎn)平臺上溫育3小時，并通過用0.2μm的濾膜進行離心過濾而將所述混合物與所述神經(jīng)氨酸酶分離。可將所得無唾液酸-干擾素儲存在-80℃較長時間。
另一制備無唾液酸-干擾素的示例方法包括用一個單位的Arthrobacterureafaciens-產(chǎn)生的神經(jīng)氨酸酶消化天然人干擾素-β，所述消化在37℃、1ml 5mM甲酸(pH3.5)中進行3小時。水解后，所述無唾液酸-干擾素-β可在C18反相柱(例如，Zorbaxs PR-10)上用0.1％三氟乙酸中的乙腈線性梯度分離。其它制備無唾液酸-干擾素的方法通常描述于美國專利6,296,844(包含在本文中作為參考)。
制備聚乙二醇化的無唾液酸-干擾素聚乙二醇(PEG)是中性、水溶性、非毒性聚合物。(各種平均分子量的PEG可購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，且修飾成適合蛋白結(jié)合形式的PEG可得自Shearwater Corporation(Huntsville，AL)或Valentis，Inc.(Burlingame，CA.))。缺乏毒性可由PEG是FDA許可內(nèi)部使用的少數(shù)合成聚合物之一反映出來，其可見于食品，化妝品，個人護理產(chǎn)品和藥物。在含水介質(zhì)中，長鏈樣PEG分子大量水合，并迅速移動。所述迅速移動導致PEG清除(sweeping out)較大體積(其“排除體積(exclusion Volume))，并防止其它分子接近。實際上，PEG對于生物系統(tǒng)而言大部分是不可見的，并且通過移動結(jié)合的水分子顯示。這一特性的一個結(jié)果即PEG是非免疫源性的。
為使聚合物分子與多肽共價結(jié)合，所述聚合物分子的羥基末端基團必須以活性形式提供，所述活性形式即具有反應性功能基團(其實例包括伯氨基，酰肼(HZ)，硫醇，琥珀酸酯(SUC)，琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(succinimidylsuccinate)(SS)，琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(succinimidyl succinamide)(SSA)，琥珀酰亞胺基丙酸酯(succinimidyl proprionate)(SPA)，琥珀酰亞胺基羧甲基化產(chǎn)物(succinimidy carboxymethylate)(SCM)，苯并三唑碳酸酯(benzotriazolecarbonate)(BTC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，乙醛，碳酸硝基苯酯(NPC)，和tresylate(TRES))。適宜的活化的聚合物分子是可購得的，例如購自Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Ala.USA。另外，所述聚合物分子可通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法活化，例如WO 90/13540中公開的方法。
用于本發(fā)明的活化的線性或分支的聚合物分子的具體實例描述于Shearwater Polymers，Inc.1997 and 2000 Catalogs(FunctionalizedBiocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals，Polyethylene Glycoland Derivatives，包含在本文中作為參考)?；罨腜EG聚合物的具體實例包括以下線性PEGsNHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG和SCM-PEG)，以及NOR-PEG)，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，以及分支的PEG諸如PEG2-NHS和美國專利5,932,462和5,643,575描述的那些，其均在本文中作為參考。
可與無唾液酸-干擾素結(jié)合的PEG衍生物的實例包括以下衍生物 (mPEG-丙醛(mPEG-ALD)) (mPEG-琥珀酰亞氨基丙酸酯(mPEG-SPA)) (mPEG-琥珀酰亞氨基丁酸酯(mPEG-SBA)) (mPEG-馬來酰亞胺(mPEG-MAL)) (mPEG-乙烯砜) (mPEG-鄰-吡啶基-二硫化物)
(mPEG2-N-羥基琥珀酰亞胺(mPEG2-NHS)) (mPEG2-馬來酰亞胺(mPEG2-MAL))此外，以下出版物(包含在本文作為參考)公開了有用的聚合物分子和/或PEG化的化合物美國專利5,824,778，5,476,653，WO 97/32607，EP229,108，EP 402,378，美國專利4,902,502，5,281,698，5,122,614，5,219,564，WO 92/16555，WO 94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO 94/18247，WO 94/28024，WO 95/00162，WO 95/11924，WO 095/13090，WO 95/33490，WO 96/00080，WO 97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO 99/32134，WO99/32139，WO 99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO 95/06058，EP 439508，WO 97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921 131，U.S.Pat.No.5,736,625，WO 98/05363，EP 809 996，U.S.Pat.No.5,629,384，WO 96/41813，WO 96/07670，美國專利5,473,034，5,516,673，EP 605 963，美國專利5,382,657，EP 510 356，EP 400472，EP 183 503和EP 154 316。
所述多肽與活化的聚合物分子的結(jié)合利用任何常規(guī)方法進行，例如以下參考文件中所描述的方法(也描述了活化聚合物分子的適宜方法)Harrisand Zalipsky，eds.，Poly(ethylene glycol)Chemistry and BiologicalApplications，AZC，Washington；R.F.Taylor，(1991)，″Protein immobilisation.Fundamental and applications″，Marcel Dekker，N.Y；S.S.Wong，(1992)，″Chemistry of Protein Conjμgation and Crosslinking″，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，″Immobilized Affinity Ligand Techniques″，Academic Press，N.Y)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解所用活化方法和/或結(jié)合化學方法取決于干擾素多肽的結(jié)合基團以及所述聚合物的功能基團(例如對于sulfydryl為氨基，羥基，羧基，醛)。PEG化可針對與多肽上所有可得結(jié)合基團(即暴露于所述多肽表面的這種結(jié)合基團)的結(jié)合，或者可針對特定的結(jié)合基團，例如N-末端氨基(美國專利5,985,265)。此外，所述結(jié)合可通過一步反應或逐步方式實現(xiàn)(例如，WO 99/55377中所述)。
可以和無唾液酸-干擾素結(jié)合的PEG包括平均分子量1,000-5,000，5,001-10,000，10,001-20,000，20,001-35,000，或35,001-60,000道爾頓(例如，3,350，5,000，8,000，10,000，12,000，20,000，30,000，35,000，40,000或60,000道爾頓)的PEG。低分子量PEG(例如，平均分子量為5000道爾頓的PEG)的靶位點相對非選擇性的，這是由于較小的PEG可通過蛋白表面上其他難以接近的區(qū)域。另外，可利用高分子量PEG。這種高分子量PEG的分子量可達60,000道爾頓。高分子量PEG的鍵合化學穩(wěn)定性增加，在需要位點特異性的PEG化時是有利的。具有分支結(jié)構(gòu)的PEG衍生物的分子體積相對較大。因此，利用分支PEG衍生物可獲得PEG結(jié)合的一些優(yōu)點而無需多個結(jié)合位點。
無唾液酸-干擾素可在氨基酸序列中的多個不同殘基發(fā)生PEG化，包括在干擾素的半胱氨酸，賴氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，精氨酸或谷氨酸殘基；C-末端羧基；或N-末端氨基。例如，N末端前導序列(氨基酸1-23)被去除的無唾液酸-干擾素-α-2b可在圖2A顯示的黑體序列中的以下位置之一PEG化半胱氨酸1，賴氨酸23，賴氨酸31，賴氨酸49，賴氨酸70，賴氨酸83，賴氨酸112，賴氨酸121，酪氨酸129，賴氨131，賴氨酸133，賴氨酸134，以及賴氨酸164。本發(fā)明的無唾液酸-干擾素可在一或多個位點與PEG聚合物結(jié)合。
PEG化反應可通過將溫育純化的無唾液酸-干擾素與PEG親電衍生物(SC-PEG)或PEG的其它任何活化形式在pH6.5的100mM磷酸鈉中保溫，然后通過離子交換色譜分離反應產(chǎn)物而進行。這樣的離子交換柱可以是SP-5PW強陽離子交換柱(21.5mm i.d.，長15cm，顆粒大小13μm，TosoHaas，Montgomeryville，PA)。所述柱可在pH5.8的10mM磷酸鈉緩沖液中平衡，且PEG化的產(chǎn)物可利用百分比漸增的pH5.880mM磷酸鈉緩沖液洗脫，并利用UV光在波長214nm進行檢測。為濃縮所述分離的產(chǎn)物，可利用分子量截斷(molecular mass cutoff)為10kDa的CENTRIPLUS-10微量濃縮柱(Amicon，Beverly，MA)。
另外，無唾液酸-干擾素可通過將摩爾比為1∶3的無唾液酸-干擾素和PEG的混合物在pH9.0的50mM硼酸鈉緩沖液中保溫而被PEG化。該混合物的終蛋白濃度為約5mg/ml。所述反應混合物可隨后在4℃攪拌2小時，并通過用冰醋酸調(diào)節(jié)混合物pH到4.5來終止反應。為分離所需的反應產(chǎn)物，所述混合物可用水稀釋10倍，并以線性速率1.3cm/min加樣于用FractogelEMD CM 650(M)基于甲基丙烯酸酯的聚合物親水色譜樹脂充填的柱上，，所述柱已經(jīng)用20mM乙酸鈉(pH4.5)平衡。蛋白可以2mg/ml的濃度加樣于柱上。所述柱可用平衡緩沖液洗滌以去除過量的PEG試劑和反應副產(chǎn)物。所需PEG化無唾液酸-干擾素可用平衡緩沖液中的200mM氯化鈉從該柱洗脫。純化的PEG產(chǎn)物可進一步濃縮并儲存在4℃的含有20mM乙酸鈉(pH5.0)和150mM氯化鈉的無菌緩沖液中。
此外，位置異構(gòu)體可通過以適宜該柱的流速(例如，對于21.5mm i.d.柱為6mL/min，對于7.5mm i.d.柱為1mL/min)通過用安裝有SP-5PW強陽離子交換柱(例如，Toso Haas，21.5mm i.d.，15cm長，13μm顆粒大小或7.5mmi.d.，75mm長，10μm顆粒大小)的Waters Delta Prep 3000制備HPLC系統(tǒng)(Analytical Sales and Service，Mahwah，NJ)而被區(qū)分出來。這些柱可使用磷酸鈉(pH5.8)濃度漸增的線性梯度，或pH漸增的線性梯度(4.3-6.4)，從0到100％磷酸氫二鉀(pH6.4)。所述位置異構(gòu)體可利用UV光在214nm或208nm的波長下檢測。
制備其它修飾的無唾液酸-干擾素除了上述的PEG化無唾液酸-干擾素，還可將其它水溶性聚合物結(jié)合于無唾液酸-干擾素。此外，單個干擾素可通過一種以上類型的水溶性聚合物來修飾。例如，可將干擾素與PEG和PVP聚合物結(jié)合。適宜的水溶性聚合物的實例包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚(乙烯醇)(PVA)，聚(氧化烯烴)，諸如聚(丙二醇)(PPG)，聚三亞甲基二醇(PTG)，和聚(氧乙烯化多元醇)，諸如聚(氧乙烯化山梨醇)，聚(氧乙烯化甘油)，和聚(氧乙烯化葡萄糖)。這種聚合物可購得，例如購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。此外，水溶性聚合物可在與無唾液酸-干擾素結(jié)合以前活化。
與蛋白結(jié)合前活化聚合物的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。例如，上述mPEG衍生物是PEG的活化形式。羥基的活化可利用三氯-s-三嗪(trichloro-s-triazine)(TsT；氰尿酸)進行。另外，羥基可通過胺反應性N-羥基琥珀酰亞胺基-或碳酸對-硝基苯基酯活性酯來活化(參見，例如，Zalipsky等，Biotechnol.Appl.Biochem.15100-114，1992)。此外，當含羥基聚合物首先與環(huán)式酸酐(例如琥珀酸或戊二酸(gluraric)酸酐)反應并隨后在碳化二亞胺存在下將本發(fā)明的羧基修飾的產(chǎn)物與N-羥基琥珀酰亞胺偶聯(lián)時，可實現(xiàn)活化。該反應產(chǎn)生琥珀酰亞氨基琥珀酸酯或戊二酸酯型活性酯(Abuchowski等，CancerBiochem.Biophys.7175-186，1984)?；罨部赏ㄟ^將該聚合物與N，N′-羰基二咪唑(CDI)反應形成的咪唑基氨基甲酸酯中間體實現(xiàn)。CDI-活化的聚合物與蛋白的胺基反應形成穩(wěn)定的N-烷基氨基甲酸酯連接，其與利用琥珀酰亞氨基碳酸酯化學法(succinimidyl carbonate chemistry)形成的相同(Beauchamp等，Anal.Biochem.13125-33，1983)。
本文所述任何聚合物可與無唾液酸-干擾素結(jié)合。通常，聚合物可經(jīng)過或不經(jīng)過預先活化而與蛋白通過側(cè)掛基團共價結(jié)合，所述側(cè)掛基團存在于干擾素中或者是利用化學修飾或其它標準方法加入無唾液酸-干擾素中的。這種側(cè)掛基團的實例包括伯氨基，羧基，芳香環(huán)和硫醇。將聚合物結(jié)合于無唾液酸-干擾素的可取基團包括例如，蛋白的賴氨酸殘基中的游離氨基，以及N-末端氨基酸的α-氨基。
進行結(jié)合反應的聚合物-蛋白比取決于所述聚合物的性質(zhì)(例如結(jié)構(gòu)，大小，電荷和反應性)以及與該聚合物結(jié)合的亞基的性質(zhì)?？赏ㄟ^常規(guī)實驗確定所述比，例如通過改變該比并測定反應產(chǎn)物的生物活性(例如抗增生或抗病毒活性，如下一部分所述)以及結(jié)合穩(wěn)定性。
修飾的無唾液酸-干擾素的生物活性分析本領(lǐng)域許多標準方法可用于分析修飾的無唾液酸-干擾素諸如PEG化的無唾液酸-干擾素的抗病毒和抗增生活性(例如，Monkarsh等，AnalyticalBiochemistry 247434-440，1997和Bailon等，Bioconjμgate Chem.12195-202，2001中公開的方法)。例如，各種修飾的無唾液酸-干擾素異構(gòu)體的抗病毒活性可在微量滴定板實驗中測定，如Grace等(J.of Interferon and CytokineResearch 211103-1115，2001)所述。在這種實驗中，易受病毒感染的哺乳動物細胞諸如Mardin-Darby牛腎細胞或人包皮纖維母細胞被病毒例如皰疹性口炎(vesicular stomatitis)病毒或腦心肌炎(encephalomyocarditis)病毒感染。修飾的無唾液酸-干擾素的相對效力可通過比較實驗用修飾的無唾液酸-干擾素的劑量與對照干擾素(例如干擾素-α2a，無唾液酸-干擾素，或?qū)φ誔EG化無唾液酸-干擾素)的劑量確定，所述實驗用修飾的無唾液酸-干擾素的劑量可防止50％的感染細胞受到病毒細胞病變作用影響。
此外，可利用動物模型測定修飾的無唾液酸-干擾素的抗腫瘤活性。例如，可將癌細胞系諸如人腎A498或人腎ACHN細胞移植到無胸腺裸小鼠體內(nèi)。具體地，將2×106個細胞移植到所述小鼠背部皮下。3-6周內(nèi)，所述細胞形成腫瘤，所述腫瘤體積為0.05-0.50立方厘米。所述小鼠可用實驗劑量的修飾的無唾液酸-干擾每周治療至少一次。所述治療方案可持續(xù)4-5周。治療后，可比較治療組和對照組(例如接受干擾素-α2a或干擾素-β1a)的腫瘤體積改變，由此可評估修飾的無唾液酸-干擾素的相對抗腫瘤活性。
另一方面，修飾的無唾液酸-干擾素的抗增生活性可利用細胞培養(yǎng)實驗測定。例如，保持在RMPI 1640中的固定懸浮培養(yǎng)物中的人Daudi細胞(Burkitt′s淋巴瘤)可用于所述實驗，其中RMPI 1640中補充了15％胎牛血清和2mM谷氨酰胺(所有均購自Grand Island Biologicals，Grand Island，NY)。將2×104個細胞加入微量滴定板(Costar，MA)的各孔的100μl培養(yǎng)基中。所述板可在37℃、5％CO2中保溫72小時。收集前16小時，所述細胞用0.25mCi/孔的[3H]胸苷(New England Nuclear，Boston，MA)沖擊(pulse)。所述細胞可收集到玻璃濾膜上并在液閃計數(shù)儀中計數(shù)。隨后比較修飾的無唾液酸-干擾素處理的和對照干擾素處理的細胞所得結(jié)果，以確定具體的修飾的無唾液酸-干擾素的相對抗增生活性以及抗腫瘤活性。可比較實驗和對照細胞的其它生物活性，諸如2′-5′寡腺苷酸合成酶活性，血清neopterin水平，β2-微球蛋白表達，以及自然殺傷(NK)細胞和淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞測定公開于Grace等(J.干擾素Cytokine Res.211103-1115，2001)和Bailon等(Bioconjμgate Chem.12195-202，2001)。
修飾的無唾液酸-干擾素的藥物動力學和生物分布修飾的無唾液酸-干擾素可利用本領(lǐng)域已知的方法通過其藥物動力學和藥效學特性表征?？煞治鏊幬飫恿W參數(shù)諸如Cmax，Tmax，t1/2，AUC(0-∞)，和清除率。此外，對病毒細胞病變作用的藥效測定可與修飾的無唾液酸-干擾素血清濃度相關(guān)。這種方法的實例描述于，如Pepinsky等(J.Pharmacol.Exp.Ther.2971059-1066，2001)和Bailon等(Bioconjμgate Chem.12195-202，2001)中。此外，可評估放射性標記的無唾液酸-干擾素的組織分布以證實其靶向肝。
劑量根據(jù)本發(fā)明的治療方法，不意圖限制修飾的無唾液酸-干擾素給藥患者的具體給藥方式，劑量或給藥頻率；本發(fā)明涉及所有給藥方式，包括經(jīng)肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、囊內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、傷口內(nèi)、皮下或任何可提供足以降低腫瘤細胞數(shù)目或防止病毒復制或擴散的劑量的給藥方式。所述化合物可以單個劑量或多個劑量給藥患者。當給藥多個劑量時，所述劑量可間隔例如一天，兩天，一周，兩周，或一個月。例如PEG化的無唾液酸-干擾素可以每周給藥一次，持續(xù)例如2，3，4，5，6，7，8，10，15，20，或更多周。應理解對于任何具體的患者，應根據(jù)個體需要和給藥者或該組合物給藥監(jiān)督者的專業(yè)判斷來隨時間調(diào)節(jié)具體的給藥方案。例如，如果低劑量不足以提供抗腫瘤或抗病毒活性，修飾的無唾液酸-干擾素的劑量可增加。反之，如果腫瘤或病毒感染已從患者體內(nèi)清除，則可降低修飾的無唾液酸-干擾素的劑量。
雖然主治醫(yī)師將最終決定適宜的量和給藥方案，修飾的無唾液酸-干擾素，諸如aPEG化或PVP化的無唾液酸-干擾素的治療有效量可以是，例如，約0.0035μg到20μg/kg體重/天或0.010μg到40μg/kg體重/周。優(yōu)選所述治療有效量為約0.025μg到10μg，例如，約0.025，0.035，0.05，0.075，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0或9.0μg/kg體重，每天一次，每隔一天一次，或每周兩次給藥。此外，所述治療有效量可為約0.05，0.7，0.15，0.2，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，或18.0μg/kg體重，每周一次，每隔一周一次，或每月一次給藥。此外，修飾的無唾液酸-干擾素的治療有效量可以是例如約100μg/m2到100,000μg/m2，以每隔一天一次，每周一次，或每隔一周一次給藥。在優(yōu)選的實施方案中，所述治療有效量可以為約1000μg/m2到20,000g/m2，例如，約1000，1500，4000，或14,000μg/m2的修飾的無唾液酸-干擾素，以每天一次，每隔一天一次，每周兩次，每周一次或每隔一周一次給藥。
藥物組合物的配制給藥修飾的無唾液酸-干擾素(例如，PEG化或PVP化的無唾液酸-干擾素)化合物可以采用任何適宜的方式，其中與其它組分聯(lián)用的修飾的無唾液酸-干擾素的濃度在到達靶區(qū)域時具有抗病毒或抗腫瘤性質(zhì)。所述化合物可以以任何適宜量包含在任何適宜載體物質(zhì)中，其通常占組合物總重的1-95％。所述組合物通常為適宜胃腸外(例如皮下，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，或腹膜內(nèi))給藥途徑的劑型。所述藥物組合物可根據(jù)常規(guī)藥物實踐進行配制(參見例如，RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy(20th ed.)，ed.A.R.Gennaro，Lippincott Williams & Wilkins，2000 and Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology，eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan，1988-1999，Marcel Dekker，NewYork)。
本發(fā)明的藥物組合物可配制成在給藥時或給藥后預定的時間或期間立即釋放活性化合物。后一種組合物形式通常已知為控釋制劑，其包括(i)可在體內(nèi)在較長時間內(nèi)產(chǎn)生基本恒定濃度的修飾的無唾液酸-干擾素的制劑；(ii)在給定延遲時間之后在體內(nèi)在較長時間內(nèi)產(chǎn)生恒定濃度的修飾的無唾液酸-干擾素的制劑；(iii)通過在體內(nèi)維持相對恒定有效的修飾的無唾液酸-干擾素水平、同時最小化與活性修飾的無唾液酸-干擾素物質(zhì)的血漿水平波動(鋸齒狀動力模式)相關(guān)的不良副作用，在預定的時間中維持修飾的無唾液酸-干擾素作用的制劑；(iv)通過例如空間替代患病組織或器官附近或其中的控釋組合物，定位修飾的無唾液酸-干擾素作用的制劑；(v)便于給藥的制劑，例如可每周一次或每兩周一次給藥所述組合物；和(vi)通過使用載體或化學衍生物來將修飾的無唾液酸-干擾素遞送到具體靶細胞類型從而靶向修飾的無唾液酸-干擾素作用的制劑。給藥控釋劑型的修飾的無唾液酸-干擾素對于在胃腸道中具有較窄的吸收窗或相對較短的生物半壽期的修飾的無唾液酸-干擾素而言是尤其優(yōu)選的。
為獲得其中目的化合物釋放速率超過代謝速率的控釋可采用多種策略。在一個實施例中，控釋通過適當選擇各種制劑參數(shù)和成分來獲得，所述參數(shù)和成分包括，例如各種類型的控釋組合物和包衣。因此，將修飾的無唾液酸-干擾素和適宜的賦型劑配制在藥物組合物中，所述藥物組合物在給藥時以受控的方式釋放修飾的無唾液酸-干擾素。實例包括單個或多個單位的片劑或膠囊組合物，油溶液，懸浮液，乳液，微膠囊，分子復合物，微球體，納米微粒，貼劑和脂質(zhì)體。
胃腸外組合物所述藥物組合物可通過注射，輸注或植入(皮下，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)等)以劑量形式，制劑或通過適宜的遞送載體或植入物經(jīng)胃腸外給藥，所述植入物可含有常規(guī)無毒可藥用載體和佐劑。所述組合物的配制和制備是藥物配制領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。制劑參見RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy，上文。
胃腸外用組合物可以單位劑量形式(例如單劑量安瓿劑)提供或在含有數(shù)個劑量并可添加適當防腐劑(見下文)的小瓶中提供。所述組合物可以是溶液，懸浮液，乳液，輸注裝置或用于植入的遞送裝置，或其可以為干粉以便在使用前用水或其它適宜載體再配制。除了活性修飾的無唾液酸-干擾素以外，所述組合物可包含適宜的胃腸外可接受的載體和/或賦型劑。所述活性無唾液酸-干擾素可摻入微球體，微膠囊，納米微粒，脂質(zhì)體等以便控制釋放。此外，所述組合物可包含混懸劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑，毒性調(diào)節(jié)劑和/或分散劑。
如上所述，本發(fā)明的藥物組合物可以是適宜無菌注射的形式。為制備這種組合物，適宜的活性修飾的無唾液酸-干擾素可溶解或混懸于胃腸外可接受的液體載體中?？墒褂玫目山邮艿妮d體和溶劑包括水，通過添加適宜量的鹽酸，氫氧化鈉或適宜的緩沖液調(diào)節(jié)到適宜pH的水，1，3-丁二醇，林格氏溶液，右旋糖溶液和等張氯化鈉溶液。含水制劑也可含有一種或多種防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸乙酯或?qū)?羥基苯甲酸正丙酯)。如果一種化合物在水中微溶，可加入增溶劑，或者所述溶劑可包含10-60％w/w的丙二醇等。
控釋胃腸外組合物控制胃腸外組合物可以是含水懸浮液，微球體，微膠囊，磁性微球，油溶液，油懸浮液或乳液。另一方面，所述活性修飾的無唾液酸-干擾素可摻入生物相容的載體，脂質(zhì)體，納米微粒，植入物或輸注裝置。
用于制備微球體和/或微膠囊的物質(zhì)為，例如可生物降解的/可生物腐蝕的聚合物，諸如聚催乳素(polygalactin)，聚-(氰基丙烯酸異丁基酯)，聚(2-羥乙基-L谷氨酰胺)，聚(乳酸)，聚乙醇酸及其混合物?？捎糜谂渲瓶蒯屛改c外制劑的生物相容性載體是碳水化合物(葡聚糖)，蛋白(例如白蛋白)，脂蛋白或抗體。用于植入物中的物質(zhì)可以是非-生物可降解的(例如聚二甲基硅氧烷)或生物可降解的(例如聚己內(nèi)酮)，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)或聚(原酸酯))或其組合物。
口服使用的固體劑型口服使用的制劑包括含有活性成分以及非毒性可藥用賦型劑的片劑，這種制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如，美國專利5,817,307，5,824,300，5,830,456，5,846,526，5,882,640，5,910,304，6,036,949，6,036,949，6,372,218，在文中引用作為參考)。這些賦型劑可以是例如，惰性稀釋劑或填充劑(例如蔗糖，山犁醇，糖，甘露糖，微晶纖維素，淀粉包括馬鈴薯淀粉，碳酸鈣，氯化鈉，乳糖，磷酸鈣，硫酸鈣，或磷酸鈉)，造粒劑和崩解劑(例如纖維素衍生物包括微晶纖維素，淀粉包括馬鈴薯淀粉，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(croscarmellose sodium)，藻酸鹽或藻酸)；粘合劑(例如，蔗糖，葡萄糖，山梨醇，阿拉伯膠，藻酸，藻酸鈉，明膠，淀粉，預膠化淀粉，微晶纖維素，硅酸鎂鋁，羧甲基纖維基，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，乙基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及潤滑劑，助流劑，和抗粘附劑(例如硬脂酸鎂，硬脂酸鋅，硬脂酸，硅石，氫化植物油或滑石)。其它可藥用的賦型劑可為著色劑，調(diào)味劑，增塑劑，保濕劑，緩沖劑等。
所述片劑可以是無包被的或其可由已知技術(shù)包被，任選用于延緩在胃腸道中的分解和吸收，從而在長時間內(nèi)提供持續(xù)的作用。所述包衣可適于以預定的方式釋放所述活性修飾的無唾液酸-干擾素物質(zhì)(例如為獲得控釋的制劑)，或其可適于在到達胃以后釋放所述活性修飾的無唾液酸-干擾素物質(zhì)(腸溶包衣)。所述包衣可以是糖包衣，膜包衣(例如基于羥丙基甲基纖維素，甲基纖維素，甲基羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，羧甲基纖維素，丙烯酸酯共聚物，聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)，或腸溶包衣(例如基于甲基丙烯酸共聚物，纖維素乙酸酞酸酯，羥丙基甲基纖維素乙酸琥珀酸酯，polyvinylacetate phthalate、蟲膠和/或乙基纖維素)。此外，可使用時間延遲物質(zhì)例如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
固體片劑組合物可包括適合保護所述組合物防止其發(fā)生不良化學變化的包衣，(例如在釋放所述活性修飾的無唾液酸-干擾素物質(zhì)前的化學降解)。所述包衣可以類似方式用于固體劑型，如Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology(上文)所述。
所述兩種修飾的無唾液酸-干擾素可一起混合在片劑中或可為分開的形式。在一個實施例中，第一修飾的無唾液酸-干擾素含在片劑內(nèi)部，第二修飾的無唾液酸-干擾素位于其外部，使得在釋放所述第一修飾的無唾液酸-干擾素前已經(jīng)釋放了大部分第二修飾的無唾液酸-干擾素。
口服使用制劑可以咀嚼片或硬的明膠膠囊存在，其中的活性成分與惰性固體稀釋劑(例如馬鈴薯淀粉，乳糖，微晶纖維素，碳酸鈣，磷酸鈣或高嶺土)混合；或者以軟明膠膠囊存在，其中的活性成分與水或油介質(zhì)，例如花生油，液體石蠟或橄欖油混合。粉劑和顆粒劑可利用上述用于片劑和膠囊的成分以常規(guī)方式利用混合器，流化床裝置來制備。
控釋口服劑型口服用控釋組合物可例如構(gòu)建成通過控制活性修飾的無唾液酸-干擾素物質(zhì)的溶解和/或擴散來釋放所述活性修飾的無唾液酸-干擾素。
溶解或擴散控制釋放可通過適宜包被化合物的片劑，膠囊，丸或顆粒狀制劑，或通過將所述化合物摻入適宜基質(zhì)來實現(xiàn)?？蒯尠驴砂ㄒ换蚨喾N上述包衣物質(zhì)和/或例如，蟲膠，蜂蠟，糖蠟，蓖麻蠟，巴西棕櫚蠟，十八烷醇，甘油單硬脂酸，甘油二硬脂酸，甘油棕櫚酰硬脂酸酯，乙基纖維素，丙烯酸樹脂，dl-聚乳酸，纖維素乙酸丁酸酯、聚氯乙烯，聚乙酸乙烯酯，乙烯基吡咯烷酮，聚乙烯，聚甲基丙烯酸酯，甲基甲基丙烯酸甲酯，2-羥基甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯水凝膠，1，3-丁二醇，乙二醇甲基丙烯酸酯，和/或聚乙二醇。在控釋基質(zhì)制劑中，所述基質(zhì)物質(zhì)也可包括，例如水合甲基纖維素，巴西棕櫚蠟和十八烷醇，卡波普(carbopol)934，聚硅氧烷，甘油三硬脂酸酯，丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯，聚氯乙烯，聚乙烯和/或鹵化氟烷。
含有所述組合物中的一種或多種化合物的控釋組合物也可為可漂浮的片劑或膠囊(即在口服給藥時可在胃內(nèi)容物上方漂浮一段時間的片劑或膠囊)。所述化合物的漂浮片劑可通過對所述修飾的無唾液酸-干擾素與賦型劑和20-75％w/w的水膠體的混合物進行顆粒化來制備，所述水膠體諸如羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，或羥丙基甲基纖維素。所得顆粒可壓成片。一旦與胃液接觸，所述片劑在其表面形成基本上不透水的膠體屏障。該凝膠屏障參與保持低于1的密度，從而使得所述片劑可漂浮在胃液中。
其它實施方案本文引用的所有出版物和專利申請包含在本說明書中作為參考，就好像具體并單獨指出的每篇出版物和專利申請都包含于本說明書中作為參考。盡管前述發(fā)明通過說明和舉例進行詳細描述以便于清楚理解，根據(jù)本發(fā)明的教導本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是可進行任何改變和改進而不偏離所附權(quán)利要求的精神和范圍。
序列表<110> 通用醫(yī)療公司(The General Hospltal corporation)<120> 修飾的無唾液酸-干擾素及其用途<130> 50206/013WO3<150> US 60/431,148<151> 2002-12-05<150> US 60/408,361<151> 2002-09-05<160> 6<170> FastSEQ for Windows Version 4.0<210> 1<211> 188<212> PRT<213> 人<400> 1Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys1 5 10 15Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu20 25 30Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser35 40 45Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu50 55 60Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His65 70 75 80Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser85 90 95Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr100 105 110Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val115 120 125Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys130 135 140Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro145 150 155 160Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu165 170 175Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu180 185<210> 2<211> 187<212> PRT<213> 人<400> 2
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser1 5 10 15Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg20 25 30Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg35 40 45Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu50 55 60Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile65 70 75 80Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser85 90 95Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val100 105 110Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu115 120 125Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys130 135 140Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser145 150 155 160His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe TYr165 170 175Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn180 185<210> 3<211> 166<212> PRT<213> 人<400> 3Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu1 5 10 15Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu20 25 30Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn35 40 45Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp50 55 60Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe65 70 75 80Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile85 90 95Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg100 105 110Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val115 120 125Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser130 135 140Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg145 150 155 160Gly Arg Arg Ala Ser Gln165<210> 4<211> 1142
<212> DNA<213> 人<400> 4gagaacctgg agcctaaggt ttaggctcac ccatttcaac cagtctagca gcatctgcaa 60catctacaat ggccttgacc tttgctttac tggtggccct cctggtgctc agctgcaagt 120caagctgctc tgtgggctgt gatctgcctc aaacccacag cctgggtagc aggaggacct 180tgatgctcct ggcacagatg aggagaatct ctcttttctc ctgcttgaag gacagacatg 240actttggatt tccccaggag gagtttggca accagttcca aaaggctgaa accatccctg 300tcctccatga gatgatccag cagatcttca atctcttcag cacaaaggac tcatctgctg 360cttgggatga gaccctccta gacaaattct acactgaact ctaccagcag ctgaatgacc 420tggaagcctg tgtgatacag ggggtggggg tgacagagac tcccctgatg aaggaggact 480ccattctggc tgtgaggaaa tacttccaaa gaatcactct ctatctgaaa gagaagaaat 540acagcccttg tgcctgggag gttgtcagag cagaaatcat gagatctttt tctttgtcaa 600caaacttgca agaaagttta agaagtaagg aatgaaaact ggttcaacat ggaaatgatt 660ttcattgatt cgtatgccag ctcacctttt tatgatctgc catttcaaag actcatgttt 720ctgctatgac catgacacga tttaaatctt ttcaaatgtt tttaggagta ttaatcaaca 780ttgtattcag ctcttaaggc actagtccct tacagaggac catgctgact gatccattat 840ctatttaaat atttttaaaa tattatttat ttaactattt ataaaacaac ttatttttgt 900tcatattatg tcatgtgcac ctttgcacag tggttaatgt aataaaatgt gttctttgta 960tttggtaaat ttattttgtg ttgttcattg aacttttgct atggaacttt tgtacttgtt 1020tattctttaa aatgaaattc caagcctaat tgtgcaacct gattacagaa taactggtac 1080acttcatttg tccatcaata ttatattcaa gatataagta aaaataaact ttctgtaaac 1140ca 1142<210> 5<211> 757<212> DNA<213> 人<400> 5atgaccaaca agtgtctcct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt 60tccatgagct acaacttgct tggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag 120ctcctgtggc aattgaatgg gaggcttgaa tattgcctca aggacaggat gaactttgac 180atccctgagg agattaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc attgaccatc 240tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactggctgg 300aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag 360acagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gattttacca ggggaaaact catgagcagt 420ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt 480cactgtgcct ggaccatagt cagagtggaa atcctaagga acttttactt cattaacaga 540cttacaggtt acctccgaaa ctgaagatct cctagcctgt ccctctggga ctggacaatt 600gcttcaagca ttcttcaacc agcagatgct gtttaagtga ctgatggcta atgtactgca 660aatgaaagga cactagaaga ttttgaaatt tttattaaat tatgagttat ttttatttat 720ttaaatttta ttttggaaaa taaattattt ttggtgc 757<210> 6<211> 1193<212> DNA<213> 人<400> 6tgaagatcag ctattagaag agaaagatca gttaagtcct ttggacctga tcagcttgat 60acaagaacta ctgatttcaa cttctttggc ttaattctct cggaaacgat gaaatataca 120agttatatct tggcttttca gctctgcatc gttttgggtt ctcttggctg ttactgccag 180gacccatatg taaaagaagc agaaaacctt aagaaatatt ttaatgcagg tcattcagat 240gtagcggata atggaactct tttcttaggc attttgaaga attggaaaga ggagagtgac 300agaaaaataa tgcagagcca aattgtctcc ttttacttca aactttttaa aaactttaaa 360gatgaccaga gcatccaaaa gagtgtggag accatcaagg aagacatgaa tgtcaagttt 420
ttcaatagca acaaaaagaa acgagatgac ttcgaaaagc tgactaatta ttcggtaact 480gacttgaatg tccaacgcaa agcaatacat gaactcatcc aagtgatggc tgaactgtcg 540ccagcagcta aaacagggaa gcgaaaaagg agtcagatgc tgtttcaagg tcgaagagca 600tcccagtaat ggttgtcctg cctgcaatat ttgaatttta aatctaaatc tatttattaa 660tatttaacat tatttatatg gggaatatat ttttagactc atcaatcaaa taagtattta 720taatagcaac ttttgtgtaa tgaaaatgaa tatctattaa tatatgtatt atttataatt 780cctatatcct gtgactgtct cacttaatcc tttgttttct gactaattag gcaaggctat 840gtgattacaa ggctttatct caggggccaa ctaggcagcc aacctaagca agatcccatg 900ggttgtgtgt ttatttcact tgatgataca atgaacactt ataagtgaag tgatactatc 960cagttactgc cggtttgaaa atatgcctgc aatctgagcc agtgctttaa tggcatgtca 1020gacagaactt gaatgtgtca ggtgaccctg atgaaaacat agcatctcag gagatttcat 1080gcctggtgct tccaaatatt gttgacaact gtgactgtac ccaaatggaa agtaactcat 1140ttgttaaaat tatcaatatc taatatatat gaataaagtg taagttcaca act 119權(quán)利要求
1.修飾的無唾液酸-干擾素，其包含與水溶性聚合物結(jié)合的無唾液酸-干擾素，所述聚合物的平均分子量大約為1,000-60,000道爾頓。
2.權(quán)利要求1的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述水溶性聚合物的平均分子量大約10,000-20,000道爾頓。
3.權(quán)利要求1或2的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述修飾的無唾液酸-干擾素是聚乙二醇化的無唾液酸-干擾素
4.權(quán)利要求1-3任一的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述聚乙二醇化的無唾液酸-干擾素在半胱氨酸，賴氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，精氨酸或谷氨酸殘基；在C-末端羧基；或在N-末端胺基聚乙二醇化。
5.權(quán)利要求1-3任一的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述聚乙二醇化的無唾液酸-干擾素在半胱氨酸殘基聚乙二醇化。
6.權(quán)利要求1-3任一的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述聚乙二醇化的無唾液酸-干擾素在賴氨酸殘基聚乙二醇化。
7.權(quán)利要求1或2的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述修飾的無唾液酸-干擾素是聚乙烯吡咯烷酮化的無唾液酸-干擾素。
8.權(quán)利要求7的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述聚乙烯吡咯烷酮化的無唾液酸-干擾素在半胱氨酸，賴氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，精氨酸或谷氨酸殘基；在C-末端羧基；或在N-末端胺基發(fā)生聚乙烯吡咯烷酮化。
9.權(quán)利要求7或8的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述聚乙烯吡咯烷酮化的無唾液酸-干擾素在半胱氨酸殘基聚乙烯吡咯烷酮化。
10.權(quán)利要求7或8的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述聚乙烯吡咯烷酮化的無唾液酸-干擾素在賴氨酸殘基聚乙烯吡咯烷酮化。
11.權(quán)利要求1-10任一的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述修飾的無唾液酸-干擾素包含無唾液酸-干擾素-α，無唾液酸-干擾素-β，或無唾液酸-干擾素-γ。
12.權(quán)利要求11的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述無唾液酸-干擾素是人無唾液酸-干擾素。
13.權(quán)利要求1-11任一的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述無唾液酸-干擾素的多肽序列與成熟干擾素多肽序列相比包含另外的半胱氨酸殘基。
14.權(quán)利要求13的修飾的無唾液酸-干擾素，其中所述半胱氨酸替換所述成熟干擾素多肽的蘇氨酸或絲氨酸殘基。
15.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-14任一的無唾液酸-干擾素以及可藥用的賦型劑。
16.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述水溶性聚合物的平均分子量為大約1,000-60,000道爾頓。
17.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述水溶性聚合物的平均分子量為大約10,000-20,000道爾頓。
18.權(quán)利要求15-17任一的藥物組合物，其中所述修飾的無唾液酸-干擾素是聚乙二醇化的無唾液酸-干擾素。
19.權(quán)利要求15-17任一的藥物組合物，其中所述修飾的無唾液酸-干擾素是聚乙烯吡咯烷酮化的無唾液酸-干擾素。
20.權(quán)利要求15-19任一的藥物組合物，其中所述修飾的無唾液酸-干擾素包括無唾液酸-干擾素-α，無唾液酸-干擾素-β，或無唾液酸-干擾素-γ。
21.權(quán)利要求15-20任一的藥物組合物，其中所述修飾的無唾液酸-干擾素是修飾的人無唾液酸-干擾素。
22.治療患有肝病的患者的方法，包括將治療有效量的藥物組合物給藥所述患者，所述藥物組合物包含與水溶性聚合物結(jié)合的哺乳動物無唾液酸-干擾素，所述水溶性聚合物的平均分子量為大約1,000-60,000道爾頓。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述修飾的無唾液酸-干擾素是聚乙二醇化的無唾液酸-干擾素。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述修飾的無唾液酸-干擾素是聚乙烯吡咯烷酮化的無唾液酸-干擾素。
25.權(quán)利要求22-24任一的方法，其中所述肝病是病毒性肝炎，肝癌，或肝纖維化。
26.權(quán)利要求22-24任一的方法，其中所述患者感染了乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
27.權(quán)利要求22-24任一的方法，其中所述肝病是彌漫型肝細胞癌，發(fā)熱型肝細胞癌，和淤膽型肝細胞癌，肝母細胞瘤，肝樣腺癌，以及灶性結(jié)節(jié)樣增生。
28.權(quán)利要求22-27任一的方法，其中所述修飾的無唾液酸-干擾素包含無唾液酸-干擾素-α，無唾液酸-干擾素-β，或無唾液酸-干擾素-γ。
29.權(quán)利要求22-28任一的方法，其中所述無唾液酸-干擾素是人無唾液酸-干擾素。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備修飾的無唾液酸－干擾素的方法以及使用所述干擾素治療肝病的方法。通過加入水溶性聚合物修飾無唾液酸－干擾素，所述水溶性聚合物包括例如聚乙二醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚(乙烯醇)(PVA)，聚(氧化烯烴)，諸如聚(丙二醇)(PPG)，聚三亞甲基二醇(PTG)，和聚(氧乙烯化多元醇)，諸如聚(氧乙烯化山梨醇)，聚(氧乙烯化甘油)，和聚(氧乙烯化葡萄糖)等?？杀恍揎棽⒂糜谥委煾尾〉臒o唾液酸－干擾素包括例如，無唾液酸－干擾素－α，－R，和－γ。
文檔編號A61K38/00GK1694718SQ03824900
公開日2005年11月9日 申請日期2003年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月5日
發(fā)明者尼古拉斯·P·巴克, 丹尼爾·K·波多爾斯基 申請人:通用醫(yī)療公司, Gi公司