專利名稱：一種抑制血管滲漏和組織水腫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
目前的發(fā)現(xiàn)是關(guān)于通過(guò)各種因子，尤其是生長(zhǎng)因子，比如VEGF家族或亞型來(lái)控制血管滲透性和血管發(fā)生。
背景技術(shù)：
VEGF(特別是VEGF-A)是影響血管通透性和血管發(fā)生的同種肽家族的一員，正被討論的這個(gè)家族至少包括十種結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白，如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E；胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)；EG-VEGF和各種血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，如PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D。至少有三種生物學(xué)功能，如血管發(fā)生、血管生成、血管通透性，是通過(guò)VEGF家族不同的同種型介導(dǎo)。不管是生理還是病理狀態(tài)下VEGF家族成員是引發(fā)血管發(fā)生的重要因子，它們負(fù)責(zé)女性生殖周期、創(chuàng)傷愈合以及各種病理狀況下(如腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、糖尿病視網(wǎng)膜病變和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)血管的發(fā)生。
VEGF家族的三種結(jié)構(gòu)相關(guān)的高親和受體已被鑒定，它們分別是VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)，其中VEGFR-3在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)，而VEGFR-1和VEGFR-2則在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，VEGF-C和VEGF-D與VEGFR-2和VEGFR-3結(jié)合都能誘導(dǎo)血管和淋巴管生成反應(yīng)，而VEGF-B和PIGF只與VEGFR-1結(jié)合。這些相互作用的生物學(xué)功能仍然有待進(jìn)一步鑒定。VEGF誘導(dǎo)的生血管反應(yīng)是通過(guò)VEGFR-1和VEGFR-2介導(dǎo)，并且VEGF同種型與這兩種受體作用所引起的生物學(xué)反應(yīng)看起來(lái)是不同的，比如激活VEGFR-2可引起內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，然而激活VEGFR-1則不能。PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、和PDGF-D對(duì)血管發(fā)生過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞的反應(yīng)可能很重要，它們普遍被認(rèn)為是細(xì)胞存活的因素和管壁細(xì)胞如平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞和系膜細(xì)胞的有絲分裂原。VEGF家族成員彼此二聚化形成各種組合，這可能提示它們的受體之間存在相互作用和活動(dòng)。
VEGF(尤其是VEGF-A)最初是作為腫瘤細(xì)胞分泌的一種血管滲透因子被認(rèn)識(shí)的，鑒于腫瘤維管結(jié)構(gòu)是具有膜孔的、易擴(kuò)張的、不規(guī)則的、不穩(wěn)定的和易出血的這些事實(shí)，因此認(rèn)為VEGF是誘導(dǎo)腫瘤血管滲漏的原因。除了腫瘤以外，在一些具有膜孔內(nèi)皮的器官和組織，如脈絡(luò)叢和腎小球，VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2都持續(xù)表達(dá)，而且，相信內(nèi)皮間連接也與VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮滲漏有關(guān)，因此推測(cè)VEGF家族成員的持續(xù)產(chǎn)生與誘導(dǎo)和維持內(nèi)皮膜孔有關(guān)。確實(shí)，VEGF在體內(nèi)的短暫供給能誘導(dǎo)平滑肌、眼和皮膚內(nèi)皮膜孔的產(chǎn)生，在體外，培養(yǎng)腎上腺皮質(zhì)和腦來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞可以得到同樣的結(jié)果。
VEGF使血管通透性增加不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞播散而且對(duì)組織中液體的積聚同樣重要，從毛細(xì)血管運(yùn)輸液體主要依靠各種動(dòng)力，比如毛細(xì)血管內(nèi)流體靜壓、間質(zhì)壓力、胞漿和間質(zhì)液的膠體滲透壓以及毛細(xì)血管通透性，還有毛細(xì)血管濾過(guò)系數(shù)，這些壓力共同作用的結(jié)果使動(dòng)脈末端的毛細(xì)血管液體往外遷移(濾過(guò))，有時(shí)在靜脈部位的毛細(xì)血管濾過(guò)大于重吸收，這將引起組織當(dāng)中的液體積聚，在大部分組織中，積聚的液體通過(guò)淋巴系統(tǒng)排出，而在大腦則通過(guò)腦脊液排出。當(dāng)毛細(xì)血管通透性增加，如內(nèi)皮細(xì)胞間產(chǎn)生間隙或孔，引起液體積聚從而導(dǎo)致組織水腫。
VEGF，又稱為血管滲透因子(VPF)，對(duì)血管有兩個(gè)主要的功能，然而作為體內(nèi)一個(gè)強(qiáng)有力的特異性的生血管因子，它同樣會(huì)增加血管的滲漏。事實(shí)上VEGF是乞今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血管滲透因子，它對(duì)血管的作用比組胺強(qiáng)50,000倍。VEGF家族成員的一個(gè)獨(dú)特的生物學(xué)特性是在低氧條件下它們的表達(dá)能得到戲劇性地上調(diào)，這樣在心臟缺血性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、循環(huán)功能不全、中風(fēng)、糖尿病、慢性炎癥、呼吸功能不全和高山病等情況下引起VEGF產(chǎn)生增加，從而使血管通透性增加(隨后可能引起水腫)和引發(fā)新血管發(fā)生。VEGF水平的增高對(duì)許多器官產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。毛細(xì)血管通透性增加導(dǎo)致水腫形成，隨后組織腫脹，運(yùn)輸氧氣能力下降，這反過(guò)來(lái)引起低氧進(jìn)一步加重。在大腦，血腦屏障(BBB)通透性增加，從而發(fā)展成水腫尤為嚴(yán)重。因?yàn)槿菁{大腦的腦室是不能擴(kuò)張的。因此，大腦腫脹使顱內(nèi)壓升高，于是大腦血供受損或者引起腦嵌頓/腦疝，隨這而來(lái)的是大腦壞死。與水腫相伴而行的常常是許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，比如癌癥、腫瘤、感染、出血和梗塞引起的中風(fēng)，這些都被認(rèn)為與VEGF產(chǎn)量相關(guān)。目前治療腦水腫的方法很有限，包括滲透療法以及使用糖皮質(zhì)激素(地塞米松)治療，滲透療法的潛在療效常常不能湊效，因?yàn)闈B透療法把大腦中健康的區(qū)域和壞死的區(qū)域一起縮小了。Criscuolo和Fischer曾經(jīng)指出糖皮質(zhì)激素的療效與它能抑制VEGF表達(dá)之間的關(guān)系。在腦膜炎中，血腦屏障(BBB)的破壞以及腦水腫的產(chǎn)生被認(rèn)為與VEGF產(chǎn)量相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)在人體VEGF的表達(dá)、FLK-1的表達(dá)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度、腫瘤內(nèi)的多血管狀態(tài)、腫瘤外周腦水腫之間有明顯的相關(guān)性，這也表明VEGF的表達(dá)與水腫的發(fā)展之間存在聯(lián)系。在人體，缺血引起中風(fēng)時(shí)，大腦中異戊巴比妥區(qū)域VEGF表達(dá)上調(diào)已得到證實(shí)。在實(shí)驗(yàn)性的腦缺血病灶中，VEGF在1-3小時(shí)后開(kāi)始表達(dá)，24-48小時(shí)達(dá)到高峰，中風(fēng)后馬上系統(tǒng)供給VEGF將明顯增加BBB滲漏、出血轉(zhuǎn)移、缺血損害，腦缺血病灶中其它生長(zhǎng)因子的表達(dá)也會(huì)上調(diào)，但是VEGF對(duì)于疾病的轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要。在小鼠，用可溶性VEGF受體嵌合蛋白可以使內(nèi)源性的VEGF失活，從而緩解水腫，防止腦損傷進(jìn)一步擴(kuò)展。然而，在缺血情況下VEGF可以通過(guò)刺激新血管發(fā)生(血管發(fā)生和血管發(fā)生)從而產(chǎn)生顯著療效，這樣異戊巴比妥區(qū)或其它區(qū)域的大腦組織可以建立一個(gè)血供，因而可以提高神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)的范圍和速度。在其它器官，提高VEGF表達(dá)同樣重要。新血管的生長(zhǎng)雖然能有效地改善心肌缺血的狀況，但是VEGF所引起的水腫將給心臟帶來(lái)更加沉重的負(fù)擔(dān)。同樣的情況也出現(xiàn)在糖尿病視網(wǎng)膜病變治療中，事實(shí)上VEGF引起的水腫是失明的根源(濕型斑疹)。另外，慢性炎癥同樣會(huì)伴隨出現(xiàn)VEGF引起的血管滲漏和組織增厚。為了緩解缺血狀況，通過(guò)以VEGF為基礎(chǔ)的生血管治療誘導(dǎo)新血管發(fā)生的同時(shí)也帶來(lái)了嚴(yán)重的副作用，這是由于形成了高度滲漏的血管。另一方面，如果VEGF引起的血管滲漏增加可以選擇性地被封閉，那將有可能大大地改善以VEGF為基礎(chǔ)的生血管治療。
盡管人們?cè)诹私釼EGF受體介導(dǎo)的信號(hào)通路方面作了大量的努力，但仍沒(méi)有人能將VEGF和其它生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的生血管和血管滲漏兩條通路分開(kāi)。從受體介導(dǎo)的細(xì)胞骨架信號(hào)中得到提示的一個(gè)蛋白家族是Rho家族的小GTPases，這個(gè)家族的多肽包括Rho、Rac和Cdc42，它們影響粘連、肌動(dòng)蛋白的聚合作用、片狀偽足和線狀偽足的形成，所有這些對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的功能都很重要。
目前研究者發(fā)現(xiàn)Rho GTPases拮抗劑有治療潛能，比如發(fā)現(xiàn)了Rac拮抗劑代表N17Rac可選擇性地封閉VEGF引起的血管穿孔，令人感到驚訝的是它并沒(méi)有封閉VEGF引起的生血管作用，這就為將VEGF引起的生血管效應(yīng)與血管通透效應(yīng)分開(kāi)提供了依據(jù)。目前正在討論的Rho家族拮抗劑類型對(duì)于治療許多疾病似乎極具潛能，因?yàn)樗鼈儤O大地抵抗了VEGF引起的血管滲漏的增加，同時(shí)沒(méi)有影響VEGF的生血管效應(yīng)，比如中風(fēng)，VEGF引起的大腦水腫是危險(xiǎn)期主要的致死并發(fā)癥。至此，它將能很好地封閉VEGF引起的水腫，同時(shí)允許新血管生長(zhǎng)的進(jìn)行從而改善缺血狀況。這在缺血性心臟病中也得到證實(shí)，雖然VEGF表達(dá)增加而引起新血管的生長(zhǎng)對(duì)于改善心肌缺血的狀況大有裨益，但是與之相伴隨產(chǎn)生的水腫將增加心臟的負(fù)擔(dān)。結(jié)果，以VEGF為基礎(chǔ)的生血管治療所帶來(lái)的弊大于利。很顯然，在使用VEGF達(dá)到生血管治療目的的臨床實(shí)驗(yàn)中，VEGF引起的血管通透性增加必須被封閉，但是到目前為止還沒(méi)有能將這兩種生物學(xué)功能分開(kāi)的試劑可供利用。Soga等在另一同樣研究I型膠原的趨觸性和VEGF刺激的I型膠原的趨化性顯示，Rac足以刺激人體皮膚(包皮)微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生游動(dòng)性，Rac抑制物，N17Rac能抑制細(xì)胞在I型膠原上的游動(dòng)性，且能完全阻止VEGF引起的趨化性刺激，在Soga等研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，人們預(yù)料已被利用過(guò)的Rac抑制物將同樣能抑制生血管作用，但是沒(méi)有有關(guān)VEGF誘導(dǎo)生血管效應(yīng)的數(shù)據(jù)顯示。
近來(lái)有研究者驚訝地發(fā)現(xiàn)不僅正被討論的Rac抑制物能抑制血管通透性增加(這通常是由一種因子或VEGF其它亞型誘導(dǎo))，并且這種抑制作用不會(huì)同時(shí)抑制新血管發(fā)生，這通常是由正被討論的因子誘導(dǎo)。近來(lái)的發(fā)現(xiàn)來(lái)自VEGF通過(guò)不同胞內(nèi)通路介導(dǎo)生血管(血管細(xì)胞增殖)和血管通透性增加的認(rèn)識(shí)，盡管這兩種作用通過(guò)相同的細(xì)胞膜受體介導(dǎo)。
發(fā)明摘要這項(xiàng)研究是關(guān)于利用Rho家族成員拮抗劑或抑制劑達(dá)到治療、診斷和研究目的。目前研究的第一個(gè)方面是，通過(guò)提高能增加血管通透性的生長(zhǎng)因子水平在血管中的暴露，從而在實(shí)驗(yàn)對(duì)象(動(dòng)物和人)體內(nèi)實(shí)現(xiàn)抑制和降低血管通透性增加，這方法包括給予Rho家族成員拮抗劑。正如以上所討論的，增加血管通透性是引起組織水腫的主要原因，未來(lái)的研究方向是對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的治療，通過(guò)提高能增加血管通透性的生長(zhǎng)因子水平在血管中的暴露，以防止和減輕含有血管的組織水腫，這方法也包括給予Rho家族成員拮抗劑，比如，多肽或Rho家族的GTPases的拮抗劑或抑制劑，或Rho調(diào)控通路的拮抗劑或抑制劑。
正如上面也討論過(guò)，文章的后面方法提到的血管通透性誘導(dǎo)因子，是典型的能通過(guò)Rho家族成員介導(dǎo)的引起血管通透性增加的因子，比如Rho、Rac和Cdc42和同種型。
前面已不同程度提到，在未來(lái)的研究中，文章中的方法所使用的因子能刺激含血管的組織生血管，同時(shí)這種方法不會(huì)抑制和降低因子誘導(dǎo)的生血管作用。
未來(lái)的研究方向藥物組成成分，作為功能組分，包括Rho家族成員拮抗劑和藥物學(xué)上可接受的載體或稀釋液；使用Rho家族成員拮抗劑作治療用藥物制劑，或作為在血管透性誘導(dǎo)因子在血管中暴露增加的情況下，對(duì)引起的血管通透性增加的預(yù)防方法。
發(fā)明的詳細(xì)描述目前的研究是基于這樣的事實(shí)Rho家族成員中的小GTPases，包括Rho、Rac和Cdc42亞家族，是在VEGF和其它相關(guān)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)下調(diào)節(jié)血管透性增加的關(guān)鍵分子。然而，VEGF和其它相關(guān)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的生血管反應(yīng)涉及其它的通路，這樣就有可能通過(guò)VEGF和相關(guān)因子干撓Rho GTPases的功能，從而選擇性地抵抗血管透性增加。
在研究實(shí)踐中，VEGF或其它因素如局部或系統(tǒng)低氧引起的血管透性增加和組織水腫，可以給予至少一種有效劑量的Rho家族成員拮抗劑得到阻抗，而不會(huì)使隨著發(fā)生的生血管受到損害。在一些情況下這種治療方法已被報(bào)道，如中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷或其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、心臟缺血、低氧性肺水腫或其它器官水腫(這些地方血供不足)、視網(wǎng)膜病變、慢性炎癥、腫瘤(癌)、或一些經(jīng)過(guò)與VEGF活性有關(guān)生血管治療。研究的一個(gè)方面是關(guān)于利用Rho調(diào)控通路作為Rho拮抗劑的靶標(biāo)，這條通路涉及GDP/GTP交換蛋白(GEP’s)。Rho蛋白有兩種形式，GDP結(jié)合的非活化型和GTP結(jié)合的活化型，這兩種形式是可以相互轉(zhuǎn)換的。GEP’s有利于GDP/GTP的轉(zhuǎn)換，這樣就構(gòu)成了一個(gè)Rho活性的調(diào)控靶標(biāo)。另一方面是，GDP解離抑制劑(GDI’s)，可以抑制GDP從Rho上解離，這樣經(jīng)GTP結(jié)合的活化就成為了介質(zhì)調(diào)控Rho活性的靶標(biāo)?；罨腉TP-Rho可以通過(guò)GTPases催化轉(zhuǎn)變成非活化的GDP-Rho，這一反應(yīng)可以用特異性GTPases激活蛋白(GAP’s)易化。另一方面是關(guān)于利用GAP’s作為靶標(biāo)調(diào)控Rho活性。事實(shí)上Rho存在于胞漿并且與GDI復(fù)合，當(dāng)Rho轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上時(shí)與GTP結(jié)合從而成為活化型Rho，利用介質(zhì)促使Rho與GDI結(jié)合從而封閉了Rho與細(xì)胞膜的結(jié)合。另一個(gè)事實(shí)是，C3轉(zhuǎn)移酶，一種細(xì)菌的核糖基轉(zhuǎn)移酶，核糖基化的Rho使蛋白失活，提供了利用C3轉(zhuǎn)移酶使Rho失活的依據(jù)，這是研究的另一方面。另外，利用其它的細(xì)菌毒素，如毒素A和B，同樣可以抑制Rho的活性，這又是研究的另一方面。許多Rho蛋白的突變型有顯性失活的功能，這樣就有了使血管細(xì)胞內(nèi)源性Rho生物學(xué)功能失活的功能；利用它們抑制Rho活性構(gòu)成了研究的另一方面。抑制劑或拮抗劑的混合物，與Rho蛋白合成或穩(wěn)定性的抑制劑/拮抗劑一樣可被利用，Rho蛋白的抑制劑/拮抗劑包括任何RhoA、Rac1或Cdc42，還有Rho-GTP家族的其它成員。
文章中提到的“血管通透性”是指液體或溶液容易從血管腔進(jìn)入組織，或者從組織進(jìn)入血管腔。
文章中提到的“血管發(fā)生”是指產(chǎn)生新的血供，比如從已經(jīng)存在的血管組織中產(chǎn)生新的血管(毛細(xì)血管，靜脈和/或動(dòng)脈)，血管發(fā)生的過(guò)程可以涉及許多組織細(xì)胞類型，包括內(nèi)皮細(xì)胞，在血管管腔內(nèi)排列成單層狀，同時(shí)還涉及調(diào)控血流和周圍組織的液體、溶液、細(xì)胞、血?dú)獾鹊慕粨Q。新血管的發(fā)育(血管發(fā)生)可以通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的旁生長(zhǎng)從而代替小血管壁。血管發(fā)生不僅在健康個(gè)體正常生理過(guò)程中很重要，同時(shí)在許多病理情況下也非常重要。比如，血管發(fā)生過(guò)程可以保證低氧組織有足夠的血液和營(yíng)養(yǎng)供給。另一方面，在腫瘤組織中，血管發(fā)生對(duì)于向腫瘤組織提供血供，使腫瘤細(xì)胞存活和增殖(生長(zhǎng)，代謝)顯得尤為重要。關(guān)于這一點(diǎn)，研究方法的另一方面是供給抗血管發(fā)生藥和/或抗癌藥(如細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑)同時(shí)加上Rho家族成員拮抗劑。
文章中提到的“Rho家族成員”是指所謂的Rho家族的小GTPases(Rho GTPases)，包括RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、RhoE、RhoG和RhoH；Rac1、Rac2、Rac3；Cdc42；TC10；Rnd1、Rnd2。有報(bào)道稱這些成員調(diào)控著肌動(dòng)蛋白纖絲通過(guò)聚合作用形成應(yīng)力纖維、片狀偽足和絲狀偽足，另外，Rho結(jié)合蛋白激酶也包括在這一范圍之內(nèi)。
文章中所提到的Rho家族成員拮抗劑，是指具有抑制和拮抗文中所定義的有關(guān)的Rho家族成員功能的任何物質(zhì)。這些拮抗劑不僅指多肽或蛋白質(zhì)(包括能與受體結(jié)合的Rho家族成員的類似物，抗Rho家族成員蛋白或片段的抗體)，還指非多肽類物質(zhì)(典型的小分子有機(jī)物)，包括已命名的小分子Y-27632，它能抑制Rho結(jié)合蛋白激酶；肉毒梭菌胞外酶C3，它能抑制RhoA GTPases；艱難梭菌毒素B，它能非特異性地抑制大多數(shù)RhoGTPases，比如Rho、Rac、Cdc42的同種型。
研究中尤其感興趣的有關(guān)血管，包括心肌組織、腦組織、肺組織、骨胳肌組織、腎組織、肝組織或皮膚中的血管。研究中尤其重要的血管通性誘導(dǎo)或增加的因子，包括前面已經(jīng)提到的VEGF家族生長(zhǎng)因子；VEGF家族的某些成員又被稱為“血管滲透因子”(VPF)。
根據(jù)目前的研究，該方法更進(jìn)一步的探討是，為了誘導(dǎo)或增強(qiáng)血管發(fā)生作用，有可能將一種能刺激血管發(fā)生的因子與正在討論的Rho家族成員一起使用，比如，就起因因子而言(如血管通性誘導(dǎo)或增加的因子)它本身就能刺激血管發(fā)生，象VEGF/VPF家族或亞型，附加供給的血管發(fā)生刺激因子可能與這些因子是相同或不同家族與亞型。
研究中，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)對(duì)象或病人體內(nèi)血管透性發(fā)生或增加的因子水平的提高，通常是在慢性或急性病情況下。相關(guān)的慢性或急性病包括缺血性心臟病(動(dòng)脈粥樣硬化)；缺血性中風(fēng)；出血性中風(fēng)；I型和II型糖尿?。谎装Y(包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)；低氧引起的疾病，比如所謂的“高山病”。
上面已經(jīng)提到，研究中使用的Rho家族成員拮抗劑可能是蛋白(肽類)或非肽類物質(zhì)，就肽/蛋白拮抗劑而言，一組有用的拮抗劑由顯性失活的Rho家族成員組成。一個(gè)肽/蛋白的例子是N17Rac(有時(shí)也稱RacN17)，肽類/蛋白類包括它們的氨基酸序列，比如組成Rac的氨基酸序列，在這個(gè)序列中，天然Rac第17位的蘇氨酸殘基(T)被天冬酰胺殘基(N)代替。有關(guān)的Rho家族成員拮抗劑組包括Cdc42拮抗劑和GDP結(jié)合抑制劑(GDI’s)。
很顯然，據(jù)研究顯示，本發(fā)明所述的Rho家族成員拮抗劑通常能夠使靶細(xì)胞產(chǎn)生理想的通透性(進(jìn)入或轉(zhuǎn)運(yùn)的適當(dāng)能力)，這些能力與被因子(如生長(zhǎng)因子VEGF/VPF)的誘導(dǎo)而增加的血管通透性有關(guān)。增加某種潛在拮抗劑，例如效果并不理想的Priori，的細(xì)胞通透性能力的一種方法是融合一個(gè)附加物(例如一個(gè)基團(tuán)、亞基、氨基酸序列等等)，這些附加物能夠協(xié)同提高轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的能力，因此可以預(yù)期Rho家族成員采用這種方法來(lái)提高細(xì)胞通透性。關(guān)于具備這些能力的肽的氨基酸序列(如Gariepy和Kavamura提供的，2001)，作為相關(guān)的一系列候選物被考慮采用，如下K-FGF(卡波西成纖維生長(zhǎng)因子)N-端疏水區(qū)1-16殘基(Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro)；Src同源物2(SH2)的Grb2區(qū)域1-12號(hào)殘基(Ala-Ala-Val-Leu-Leu-Pro-Val-Leu-Leu-Ala-Ala-Pro)；整合蛋白β3(Val-Thr-Val-Leu-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Ala-Gly-Val-Gly-Val-Gly)；HIV-1 gp41(1-23)(Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala)；Caiiman crocodylus免疫球蛋白(V)輕鏈(Met-Gly-Leu-Gly-Leu-His-Leu-Leu-Val-Leu-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln-Gly-Ala-Met-Gly-Leu-Gly-Leu-His-Leu-Leu-Leu-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln-Gly-Ala)；流感血凝素融合肽合成類似物，如KALATrp-Glu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Leu-Ala-Lys-His-Leu-Ala-Lys-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Cys-Glu-Ala；GALATrp-Glu-Ala-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala；46Leu-Ala-Arg-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-Leu-Ala-Arg-Leu-Leu-Arg-Ala-Leu-Leu-Arg-Ala-Leu-Leu-Arg-Ala-Leu；Hel 11-7Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Trp-Lys-Leu Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys；來(lái)自三螺旋觸角蟲(chóng)的穿透素(43-58)Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Arg-Arg-Met-Lys-Lys-Trp-Lys；將融合的促生長(zhǎng)激素神經(jīng)肽轉(zhuǎn)化到乳頭狀病毒中Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Lys-Ile-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu；來(lái)自HIV-1 Tat蛋白的基礎(chǔ)殘基(47-57)Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg；來(lái)自HSV錄因子VP22(267-300)Asp-Ala-Ala-yr-Ala-Tyr-Arg-Gly-Arg-Ser-Ala-Ala-Ser-Arg-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Arg-Pro-Tyr-Glu-Arg-Pro-Arg-Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-Ala-Ser-Arg-Pro-Arg-Pro-Val-Glu。
成功/增強(qiáng)將Rho家族成員拮抗劑轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞的其它方法有，將它們包裹在能透過(guò)細(xì)胞膜的載體中，例如脂質(zhì)體或脂質(zhì)或與抗體吸附，病毒蛋白載體或其它尋靶載體靶向相關(guān)的血管?？梢园殡S注射重組的 病毒表達(dá)的拮抗劑，這里有一個(gè)有效的例子表明，使用一種所謂的TAT蛋白序列作用載體蛋白與N17Rac融合可以增強(qiáng)N17Rac轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞。
研究中，Rho家族成員拮抗劑(和其它的有藥物功效的物質(zhì)，有關(guān)的輔助物質(zhì)，載體、賦形劑或類似物)的給藥方式可被任何其它給藥路線所代替。包括局部的、胃腸外的、口服的、直腸的給藥路線。由于慢性或急性病情況下，常常結(jié)合血管通透性增加，通透性增加則抵抗(抑制或降低)本研究的給藥方式，這時(shí)胃腸外給藥路線常常是很合適的，胃腸外給藥路線常常有下列一些可供選擇動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、肺部、鼻腔、陰道內(nèi)給藥，在某些情況下，如外科手術(shù)過(guò)程中，藥物通過(guò)注射、灌入或其它方式直接供給受侵襲的組織可能是一種有效的胃腸外給藥路線。
上面已經(jīng)提到，目前更進(jìn)一步的研究是關(guān)于藥物的組成成分，作為有作用的成分，Rho家族成員拮抗劑與藥物學(xué)上可接受的載體或稀釋液一起，這種類型的組分將可以用于治療和預(yù)防由于暴露在血管中的因子水平的提高所引起的血管通透性增加(比如前述的其中一種因子，VEGF、PDGF、PIGF)；含有血管的組織水腫——尤其是上面已經(jīng)討論過(guò)的一些組織——是這種情況下非常嚴(yán)重的例子。
本研究另一方面是關(guān)于Rho家族成員拮抗劑作為治療和預(yù)防的藥物制劑，在血管透性誘導(dǎo)因子在血管中暴露增加的情況下使用。
總之，目前的研究可用于體內(nèi)和體外抑制血管通透性增加。本方法可用于治療動(dòng)物或人體內(nèi)各種疾病，尤其是生長(zhǎng)因子(如VEGF)引起的血管通透性增加，這些疾病包括中風(fēng)、心臟和大腦創(chuàng)傷、各種癌癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變、慢性炎癥和自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高海拔和組織低氧引起的疾病，并且當(dāng)生長(zhǎng)因子如VEGF用于生血管治療以矯正器官(心臟或肢體)血供不足時(shí)，利用這一研究發(fā)現(xiàn)將有可能防止不期望出現(xiàn)的血管通透性增加。
圖形簡(jiǎn)述

圖1顯示VEGF可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染了VEGFR-2(而不是VEGFR-1)的PAE內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白重組織，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。
(a)轉(zhuǎn)染VEGFR-2，無(wú)VEGF；(b)轉(zhuǎn)染VEGFR-2，有VEGF；(e)表達(dá)VEGFR-1，無(wú)VEGF；(f)表達(dá)VEGFR-1，有VEGF；(b)無(wú)VEGF+Rac1；(c)有VEGF但無(wú)Rac1；(g)有VEGF+Rac1，用FITC結(jié)合的羊抗兔抗體染色；(h)有VEGF+Rac1，用TRITC—毒傘素染色結(jié)果(a)和(b)顯示，加入100ng/mlVEGF165到PAE/VEGFR-2作用6-12小時(shí)，結(jié)果經(jīng)過(guò)固定和用TRITC標(biāo)記的毒傘素檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白纖絲重組織同時(shí)細(xì)胞形態(tài)伸長(zhǎng)；
(e)和(f)顯示，在相同條件下，VEGF不能誘導(dǎo)表達(dá)VEGFR-1的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變；(g)和(h)顯示，通過(guò)顯微注射將顯性失活突變的Rac1注射入PAE/VEGFR-2細(xì)胞；過(guò)度表達(dá)的突變Rac1蛋白完全阻斷了VEGF刺激細(xì)胞形態(tài)改變的作用，兩者都可以看見(jiàn)相同的形狀。
圖2顯示TAT-N17Rac對(duì)VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生模型的作用。當(dāng)植塊植入C57BL6/J小鼠角膜5天后檢測(cè)和計(jì)數(shù)角膜血管發(fā)生，a、b、c組中大箭頭所指是植塊植入部位。
(a)單獨(dú)植入VEGF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高密度的毛細(xì)血管芽，血管滲漏并且趨于形成毛細(xì)血管斑[毛細(xì)血管生長(zhǎng)的邊緣發(fā)生融合，(小前頭所指)](b)VEGF與TAT-N17Rac包裹在緩釋多聚物中一起植入，結(jié)果引起新血管的發(fā)生，但這樣不會(huì)形成毛細(xì)血管芽/斑，小前頭所指是發(fā)育良好的微血管。
(c)單獨(dú)植入包裹TAT-N17Rac緩釋多聚物，結(jié)果不能誘導(dǎo)新血管發(fā)生。
(d)計(jì)數(shù)角膜新生血管的面積，數(shù)據(jù)代表10-12個(gè)眼睛的平均值。
圖3利用免疫組織化學(xué)法證明TAT-N17Rac被微血管吸收。
(e、h)將VEGF/TAT-N17Rac植入5天后，取角膜組織切片，與anti-CD31一起孵育，再用Cy3-結(jié)合二抗染色，顯示在原始圖片上紅色部分(f、i)同樣的切片用anti-HA標(biāo)記抗體染色，看見(jiàn)綠色的原始影像(g、j)利用數(shù)碼成像技術(shù)將CD31陽(yáng)性信號(hào)(紅色)與HA信號(hào)重疊，產(chǎn)生雙重染色信號(hào)，重疊的信號(hào)表示TAT-N17Rac被微血管吸收。
圖4顯示TAT-N17Rac阻斷了VEGF誘導(dǎo)的血管穿孔。通過(guò)電鏡觀察到微血管壁薄的部分長(zhǎng)成小鼠的角膜。
(i)VEGF誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管由一薄層具有很多膜孔的內(nèi)皮組成。
(i)由VEGF/TAT-N17Rac誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管完全沒(méi)有膜孔這說(shuō)明TAT-N17Rac能有效地減少VEGF誘導(dǎo)的血管產(chǎn)生膜孔。箭頭所指內(nèi)皮膜孔，L表示毛細(xì)血管腔，M表示角膜膠原基質(zhì)。
(k)定量分析顯示由VEGF/TAT-N17Rac誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管幾乎不能檢測(cè)到膜孔。
(l)TAT-N17Rac并沒(méi)有減少內(nèi)皮小凹，相反，VEGF/TAT-N17Rac誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管與VEGF相比，內(nèi)皮小凹明示增加。
(m)與這一發(fā)現(xiàn)相一致的，由VEGF/TAT-N17Rac誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)皮與VEGF相比明顯要厚。
這些數(shù)據(jù)至少代表15個(gè)區(qū)域的平均值。
圖5顯示為了檢測(cè)VEGF/VPF對(duì)血管通透性影響而進(jìn)行的改良Mile’s實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。Evansblue從靜脈穿出進(jìn)入皮膚組織是監(jiān)測(cè)VEGF誘導(dǎo)生成的血管通透性的指示，將Evans blue從Balb/c小鼠尾部靜脈注入，5分鐘后，20ul含有2ug的TAT-N17Rac經(jīng)皮內(nèi)注射，30分鐘后，再將20ul含有50ngVEGF的PBS液經(jīng)相同部位注射入皮內(nèi)，相同劑量的TAT-N17Rac和BSA單獨(dú)作為陰性對(duì)照，使用數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)間隔記錄Evans blue的外滲，結(jié)果顯示，單獨(dú)注入VEGF，通過(guò)檢測(cè)Evans blue染料外滲可知VEGF能快速誘導(dǎo)血管通透性反應(yīng)，VEGF誘導(dǎo)的血管通透性在注射3分鐘后就能檢測(cè)到，最大影響在大約135分鐘后右以檢測(cè)到。
圖6證明Rac能夠啟動(dòng)VEGF誘導(dǎo)的生血管作用，但不是嚴(yán)格必須的。不過(guò)Rac是介導(dǎo)刺激VEGF誘導(dǎo)生成內(nèi)皮膜孔和血管通透性這一信號(hào)系統(tǒng)中的必要組成部分。早期研究已經(jīng)證實(shí)VEGF是最早通過(guò)VEGFR-2誘導(dǎo)血管發(fā)生和血管通透性的。為了深入地詳細(xì)研究VEGF-Rac信號(hào)通路和了解潛在的機(jī)制，將PAE/VEGFR-2細(xì)胞中VEGFR-2轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)通路與目前的研究聯(lián)系起來(lái)。在VEGF(10ng/ml)刺激下，VEGFR-2發(fā)生磷酸化，從而以時(shí)間依賴方式引起PLCγ、Akt、eNOS、Erk1/2磷酸化，PLCγ、Akt和eNOS最大磷酸化作用在10-15分鐘后可以觀察到，而Erk1/2最大磷酸化作用則在30-60分鐘后才能觀察到，為了確定磷酯酰肌醇激酶(PI3K)在激活Rac和胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的作用有多大，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用一種叫渥曼青霉素的PI3K的特異性抑制劑，這種試劑可先后在30分鐘內(nèi)特異性地阻斷Akt和eNOS磷酸化，這與內(nèi)皮細(xì)胞中Akt是eNOS重要激活子是相符合，渥曼青霉素減少Erk1/2磷酸化的程度很小。為了闡明VEGFR-2與Rac之間的功能關(guān)系，我們用GST-PAK與谷胱甘肽-瓊脂糖珠結(jié)合進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，隨后又用Rac抗體進(jìn)行blotting.，這個(gè)實(shí)驗(yàn)使我們能特異性地檢測(cè)到Rac的活化片段。在VEGF刺激10分鐘后，可觀察到GTP-Rac至少增加了10倍，且渥曼青霉素能阻斷這一作用，這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Rac的激活要依賴PI3K，而PI3K也能引起Akt和eNOS的活化。這樣，在VEGF刺激的信號(hào)通路中PI3K同樣是一個(gè)重要的激活因子。
圖7顯示在大鼠中右部腦動(dòng)脈瞬時(shí)閉塞2小時(shí)后，用TAT-N17Rac治療，24小時(shí)大鼠腦部梗塞體積將減少。只有載體到達(dá)的對(duì)照組，梗塞體積是20.1±2.7％，而給予TAT-N17Rac治療的梗塞體積是12.3±2.7％，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有明顯差異。
例子例1下面描述的這個(gè)實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)依據(jù)，即N17Rac能夠大大地抑制VEGF介導(dǎo)的血管通透性，但不影響VEGF介導(dǎo)的生血管反應(yīng)。
體外實(shí)驗(yàn)顯示，在表達(dá)VEGFR-2內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白重組織，引起細(xì)胞伸長(zhǎng)呈紡綞形狀改變，但卻不能使表達(dá)VEGFR-1的細(xì)胞改變。當(dāng)N17Rac經(jīng)cDNA轉(zhuǎn)染或顯微注射突變蛋白的方法進(jìn)入表達(dá)VEGFR-2細(xì)胞中，VEGF就不能誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白重組織和細(xì)胞形狀呈紡綞樣改變。并且，可透過(guò)細(xì)胞膜的Rac拮抗劑(Rho拮抗劑)TAT-N17Rac改變了滲漏生血管模型，它對(duì)于完全阻斷VEGF誘導(dǎo)形成血管膜孔是必須的，但是對(duì)于生血管卻是非必須。最后，VEGF誘導(dǎo)的血管通透性增加也可以被Rac拮抗劑阻斷。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，在小鼠角膜生血管模型中，VEGF誘導(dǎo)的新毛細(xì)血管形成膜孔，而FGF-2誘導(dǎo)的新細(xì)血管則不形成膜孔。VEGF進(jìn)一步使小凹增加可能介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的胞吞作用。VEGF誘導(dǎo)的血管形成的膜孔與新形成的微血管通透性增加有關(guān)。
例2下面描述的是，在組織低氧如中風(fēng)情況下上調(diào)VEGF將帶來(lái)嚴(yán)重的后果。血腦屏障通透性增加引起水腫，從而使組織壓力升高、血供受損。嚴(yán)重情況下，這不僅可能引起嵌頓/疝，還可能減少受損區(qū)域及周圍的局部血供，這樣梗塞體積隨時(shí)間而擴(kuò)大。在大鼠中風(fēng)模型中，我們觀察到當(dāng)中腦動(dòng)脈閉塞2小時(shí)后給予N17Rac治療，梗塞體積將比只給予載體的大鼠小。
例1的材料與方法試劑、細(xì)胞、動(dòng)物重組人VEGF165準(zhǔn)備如前所述。重組人FGF-2從Scios Novainc，Mountainview California獲得。質(zhì)粒構(gòu)建包括顯性失活的Rac cDNA(pGEX N17Rac和pEXV myc tag V12N17Rac1)，由Dr.Alan Hall惠贈(zèng)。表達(dá)VEGFR-1和VEGFR-2的穩(wěn)定豬主動(dòng)脈內(nèi)皮(PAE)細(xì)胞株的建立如前所述，保存在附加青毒素/鏈毒素和10％胎牛血清(FCS)的Ham’s F12培養(yǎng)基中。將4只或更少5-6周齡的C57BI6/J雄小鼠關(guān)在籠子里以使其適應(yīng)新環(huán)境。在進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物麻醉在甲氧氟烷箱中，隨后用致死劑量的甲氧氟烷將動(dòng)物殺死。實(shí)驗(yàn)中所使用的動(dòng)物是經(jīng)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的同意。
小鼠角膜血管發(fā)生實(shí)驗(yàn)小鼠角膜實(shí)驗(yàn)按前面描述的方法進(jìn)行。角膜微囊是用改良的瓦哥爾非型白內(nèi)障小刀在5-6周齡的C57BI6/J雄小鼠兩只眼睛上建立，一個(gè)覆蓋了親水多聚物NCC的蔗糖和硫化鋁微小植塊(0.35*0.35mm)，包裹了160ngVEGF或GFG-2帶有或不帶有可透過(guò)細(xì)胞膜的Rac拮抗劑(TAT-N17Rac)，被植入到每一個(gè)微囊植塊的位置離角膜邊緣0.6-0.8mm.，植入后用紅霉素搽每一個(gè)眼睛。植入后5-6天用狹縫燈生物顯微鏡檢測(cè)眼睛，這樣血管的長(zhǎng)度和血管發(fā)生輪廓就可以測(cè)到了。
電子顯微鏡當(dāng)VEGF或GFG-2植入6天后，將動(dòng)物殺死，取出眼睛，用3％戊二醛，0.1M二甲胂酸鈉-HCL緩沖液(pH7.3)，0.5M蔗糖浸泡和固定幾小時(shí)后，對(duì)有血管正在生長(zhǎng)的角膜部分進(jìn)行解剖，切下一小片，放到新鮮的固定液中，用緩沖液沖洗后，標(biāo)本在1.5％鋨酸，0.1M二甲胂酸緩沖液(pH7.3)，0.7％亞鐵氰化鈉溶液中4℃再固定2小時(shí)。用乙醇(70％、95％、100％)脫水，用2％乙酸雙氧鈾乙醇溶液染色，用低粘度的環(huán)氧樹(shù)脂包埋。薄片用鉆石刀在角膜表面垂直切下，放到碳覆蓋的透明塑料膠片上，用alkaline lead citrate染色，用飛利浦CM120Twin電子顯微鏡在80kv下檢測(cè)。
滲透性實(shí)驗(yàn)將6周齡的Balb/c雌白鼠刮毛，4天后，用碳酸鋰和咪銼安定以1∶1混合的含氧溶液麻醉小鼠，將150ul 1％的偶氮藍(lán)染液從尾部靜脈注入每只小鼠，5分鐘后，將含有50ngVEGF加上和不加2ug TAT-N17Rac的20ulPBS注入同一只小鼠背部中間的相鄰位置，偶氮藍(lán)染液外滲用數(shù)碼相機(jī)連續(xù)記錄4小時(shí)，2ugBSA或TAT-N17Rac作為對(duì)照，注入另一組動(dòng)物的相同位置，每一處理和對(duì)照組都由5只動(dòng)物組成。
顯微注射PAE/VEGFR-2用含10％胎牛血清(FCS)的Ham’s F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，在蓋玻片上生長(zhǎng)到匯合率達(dá)70％，顯微注射前換成無(wú)血清Ham’s F12培養(yǎng)基，用Zeiss自動(dòng)注射系統(tǒng)和Eppendorf的玻璃毛細(xì)管，將重組的顯性失活Rac蛋白(用GST標(biāo)簽純化方法從E.coli中純化)注入正在生長(zhǎng)的細(xì)胞胞漿中，注射Rac蛋白的濃度是0.5ug/ul，顯微注射緩沖液由50mMTris，50mMNaCL，5mMgCL2，0.1mMDTT組成，含有0.5ug/ul兔IgG的顯微注射緩沖液作為對(duì)照，注射后不久，給細(xì)胞加入含100ng/mlVEGF，2％FCS Ham’s F12培養(yǎng)基孵育12小時(shí)后，用3％甲醛PBS(pH7.5)溶液固定30分鐘后，用PBS沖洗3次。接著用0.5％TritonX-100 PBS溶液透化30分鐘后，再用PBS洗3次。最后用1ug/mlTRITC-毒傘素PBS液染色30分鐘，用PBS洗5次后，蓋玻片用含有0.1％對(duì)苯二胺的甘油和PBS(90∶10)混合物固定制成標(biāo)本，最后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染單層的PAE/VEGFR-2細(xì)胞生長(zhǎng)在六孔板中的蓋玻片上，用含10％FCS的Ham’s F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)70％時(shí)，培養(yǎng)基換成1ml Opti-MEM，根據(jù)廠商推薦的方法，用10ug含c-myc標(biāo)簽的V12N17Rac DNA和20ug脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，8小時(shí)后加入含100ng/mlVEGF、10％FCS的Ham’s F12培養(yǎng)基，孵育12小時(shí)。用3％甲醛PBS(pH7.5)溶液固定30分鐘后，用PBS沖洗3次，再用0.5％Triton X-100 PBS溶液透化30分鐘，最后用PBS洗。接著與抗myc標(biāo)簽的單克隆抗體(9E10)一起孵育1小時(shí)，用PBS沖洗幾次后，用FITC結(jié)合的兔抗鼠IgG染色1小時(shí)，再用PBS洗。最后用TRITC-毒傘素染色，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
免疫組織化學(xué)法生長(zhǎng)因子植塊植入5天后摘出小鼠眼睛，立即置于干冰上，使用前放在-80℃保存。10um冰凍切片用冷凍切片機(jī)切，切片在空氣中干燥10分鐘，用丙酮固定，再用30％未免疫的羊血清封閉。內(nèi)源性的生物素用抗生物素蛋白—生物素試劑封閉。加入一抗混合物(一抗混合物包括大鼠抗小鼠CD31和小鼠抗人結(jié)蛋白)，室溫下孵育1小時(shí)，反復(fù)沖洗后，向組織切片中加入二抗(二抗是兔抗大鼠-FITC和生物素化的羊抗小鼠IgG)，孵育30分鐘。接著嚴(yán)格沖洗，向標(biāo)本中加入鏈毒素抗生物素結(jié)合Cy3，孵育30分鐘，用PBS洗，片子用90％甘油封閉制成標(biāo)本，在熒光顯微鏡下放大20倍觀察，成像用數(shù)碼相機(jī)儲(chǔ)存，用Adobe photoshop6.0軟件進(jìn)一步分析。
細(xì)胞形態(tài)實(shí)驗(yàn)和肌動(dòng)蛋白染色PAE/VEGFR-1和PAE/VEGFR-2細(xì)胞生長(zhǎng)在12孔板中的蓋玻片上，用含10％FCS的Ham’s F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)40-60％時(shí)，棄去舊培養(yǎng)液，換成新鮮的含2％FCS的Ham’s F12培養(yǎng)基，加上或不加上VEGF、PLGF、PLGF/VEGF或25％的條件培養(yǎng)基。16小時(shí)后，細(xì)胞用3％的低聚甲醛PBS(pH7.5)溶液固定30分鐘，然后用PBS沖洗3次，再用0.5％Triton X-100 PBS溶液透化15分鐘，用PBS沖洗3次，用1ug/mlTRITC-毒傘素PBS液染色30分鐘。PBS洗3次后，蓋玻片用含有甘油和PBS(9∶1)混合物固定制成標(biāo)本，最后用復(fù)合光和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。
檢測(cè)GTP-RacPAE/VEGFR-2細(xì)胞(5×106)用無(wú)血清Ham’s F12培養(yǎng)基饑餓19小時(shí)，加上或不加上渥曼青霉素作預(yù)處理，用50ng/mlVEGF刺激10分鐘。細(xì)胞用GST-Fish緩沖液裂解(50mmol/l Tris pH7.2，1％Triton X-100，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，500mmol/lNaCL，10mmol/lMgCL2，10ug/ml抑蛋白酶肽/亮抑蛋白酶肽，1mmol/LPMSF)。當(dāng)細(xì)胞裂解液離心后，上清與GST-PAK-CD-sepharose結(jié)合。簡(jiǎn)而言之，含GST-PAK的細(xì)菌裂解液(1.2ml)上清與300ul 50％GSH-sepharose的PBS溶液4℃孵育1小時(shí)，形成首尾相連。結(jié)合后的sepharose珠用細(xì)菌裂解液緩沖液洗3次后，用0.5mlGST-Fish緩沖液重懸，100ulGST-PAK sepharos與細(xì)胞裂解液孵育1小時(shí)，經(jīng)廣泛沖洗后，用LDS終止液處理后的結(jié)合材料被釋放，Western blotting(ECL)進(jìn)一步分析，用小鼠抗人Rac1單克隆抗體。
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)PAE/VEGFR-2細(xì)胞在60mm板上生長(zhǎng)到匯合率達(dá)90％時(shí)，清洗，用無(wú)血清培養(yǎng)基(RPMI)孵育30分鐘。加入500ul含有1.2ug/ml的抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和亮抑蛋白酶肽，1.25mmol/lNaF，PMSF，正釩酸鈉的LDS裂解緩沖液使細(xì)胞活性被終止。樣品混勻30秒后14,000rpm離心10分鐘。等量的蛋白樣品用SDS-PAGE(10％BAS-Tris)分開(kāi).蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用含0.1％吐溫的5％小牛血清白蛋白PBS溶液封閉非特異性位點(diǎn)?？贵w溶解在含5％BSA和0.1％吐溫的PBS溶液，在4℃下對(duì)膜進(jìn)行探測(cè)過(guò)夜，以檢測(cè)P-Akt(ser473)、P-eNOS(ser1177)、P-Erk1/2(Tyr204)、P-KDR。這些檢測(cè)須在含有1％BSA和0.1％吐溫的PBS溶液中孵育1小時(shí)后才能進(jìn)行。過(guò)氧化物結(jié)合的兔免疫球蛋白在檢測(cè)P-Akt、P-eNOS和P-PLCγ時(shí)以1∶1000稀釋，在檢測(cè)P-Erk1/2時(shí)以1∶5000稀釋，在檢測(cè)P-VEGFR-2時(shí)以1∶40000稀釋，蛋白條帶用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光屏顯示觀察。
在VEGFR-2/PAE細(xì)胞中，VEGF誘導(dǎo)的(10ng/ml)VEGFR-2、PLCγ、Erk1/2、Akt和e-NOS的磷酸化以及Rac的活化用Western blotting檢測(cè)，每一個(gè)樣品用相同量的細(xì)胞裂解液。細(xì)胞與10ng/mlVEGF和其它磷酸化酶共孵育10分鐘后測(cè)定與VEGF起反應(yīng)的VEGFR-2的自動(dòng)磷酸化情況，孵育10分鐘后測(cè)定GTR-Rac，細(xì)胞與渥曼青霉素預(yù)孵育10分鐘是為了封閉PI3K的活性。
例2的材料與方法大鼠中風(fēng)模型成年的雌性Sprague-Dawley大鼠重275-300g，禁水一晚，用70％亞硝酸氧化物和30％的氧組成的混合物麻醉大鼠，用腔內(nèi)縫合技術(shù)使右側(cè)中腦動(dòng)脈閉鎖。從頸中線切口處用3-0縫線將頸總動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈連接起來(lái)，將一根頂端(0.3-0.32mm)用火焰燒圓且覆蓋poly-L-lysin的尼龍絲(0.25mm)，從動(dòng)脈分叉處插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直到感到阻力增加-—此處是中腦動(dòng)脈的開(kāi)端(常常要引入19mm的細(xì)絲)，細(xì)絲插入后，中止麻醉使大鼠恢復(fù)意識(shí)。兩小時(shí)后對(duì)待測(cè)大鼠進(jìn)行神經(jīng)學(xué)上的評(píng)估(按照Bederson和Pitts等提供的方法，1986 30/id)。只有能夠向右轉(zhuǎn)圈行為的大鼠才能在本實(shí)驗(yàn)中采用。在麻醉狀態(tài)下，撤去細(xì)絲后中腦動(dòng)脈循環(huán)重新建立。此后將一根導(dǎo)管插入頸總動(dòng)脈，過(guò)10秒鐘后供給大鼠0.3ml的肽TAT-N17Rac(15ug)，對(duì)照大鼠只得到載體。然后動(dòng)脈連接，皮膚縫合，大鼠恢復(fù)意識(shí)。
24小時(shí)后再次將大鼠麻醉(戊巴比妥，50mg/kg)，去頭后大腦作冠狀切片(2mm)，將切片暴露在2％2，3，5-氧化三苯基四氮唑溶液中以標(biāo)記活的(紅色)和梗塞(白色)區(qū)域。用成像分析系統(tǒng)檢測(cè)梗塞的擴(kuò)展，測(cè)得的梗塞體積通過(guò)水腫系數(shù)的分區(qū)調(diào)整為水腫體積，比如把每張切片右腦體積與左腦體積分開(kāi)，梗塞體積表示成整個(gè)大腦體積的百分?jǐn)?shù)。
權(quán)利要求
1.本課題是關(guān)于一種抑制或降低血管滲漏性增加的方法，該方法是通過(guò)將血管暴露在較高水平的能增加血管滲漏性的因子中，其中還包括給予該課題所述的Rho家族成員拮抗劑。
2.本課題還是關(guān)于一種通過(guò)這樣的處理以阻止或降低組織水腫的方法，該方法包括將血管暴露在較高水平的能增加血管滲漏性的因子中，還包括給予該課題所述的Rho家族成員拮抗劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述的因子還能刺激組織的血管生成，包括所提到的血管，并且這種方法大體上不會(huì)抑制或降低血管的生成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，所述的血管包括下列組織中的血管心肌組織；腦組織；肺組織；骨胳肌組織；腎組織；肝組織和皮膚。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，所述的因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)或血管滲透因子(VPF)。
6.根據(jù)前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，該方法將來(lái)還包括給予因子以刺激血管生成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，該方法所述的刺激血管生成因子與血管滲漏性增加因子不同。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，該方法所述的將血管暴露在較高水平的因子中所得到的結(jié)果是在慢性或急性疾病的情況下進(jìn)行的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，該方法所述的慢性或急性病包括下列疾病缺血性心臟病，包括動(dòng)脈粥樣硬化；缺血性中風(fēng)；出血性中風(fēng)；糖尿??；炎癥，包括類風(fēng)濕性關(guān)結(jié)炎；高山病。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述的Rho家族成員包括下面一組RhoA，RhoB，RhoC，Rac1，Rac2，Rac3，CDC-42和Rho相關(guān)蛋白激酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述的Rho家族成員拮抗劑是一種多肽或蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述的Rho家族成員拮抗劑是一種非多肽小分子。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，該方法所述的Rho家族成員拮抗劑包括N17 Rac的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，該方法所說(shuō)的Rho家族成員拮抗劑是Cdc42拮抗劑。
15.根據(jù)前面的任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述的Rho家族成員拮抗劑有一半能增加細(xì)胞的滲漏性。
16.根據(jù)前面的任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述的那一半是一種多肽氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，所述的氨基酸序列與下面一組多肽氨基酸序列不同或至少部分不同TAT；卡波西成纖維生長(zhǎng)因子(K-FGF)；Grb2(SH2domain)和整合素β3。
18.根據(jù)前面的任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述的給藥取代下面一組給藥途徑胃腸外給藥；口服給藥；直腸給藥。
19.根據(jù)前面的任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述的給藥取代下面一組胃腸外給藥途徑動(dòng)脈內(nèi)給藥；靜脈內(nèi)給藥；顱內(nèi)給藥；皮內(nèi)給藥；皮下給藥；肌肉內(nèi)給藥；鼻內(nèi)給藥和肺內(nèi)給藥。
20.藥物學(xué)成分包括活性成分Rho家族成員拮抗劑和藥物學(xué)上可接受的載體或稀釋度。
21.用于治療和預(yù)防由于將血管暴露在較高水平的能增加血管滲漏性的因子中，引起血管滲漏性增加的藥物學(xué)成分包括活性成分-Rho家族成員拮抗劑和藥物學(xué)上可接受的載體或稀釋度。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21，可用該藥物成分治療和預(yù)防由于將血管暴露在較高水平的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)或血管滲透因子(VPF)中，引起血管滲漏性增加。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-23中任何一項(xiàng)，可用該藥物成分治療和預(yù)防組織水腫包括所提到的血管的。
24.根據(jù)權(quán)利要求24，可用該藥物治療和預(yù)防下列一組組織的水腫心肌組織；腦組織；肺組織；骨胳肌組織；腎組織；肝組織和皮膚。
25.臨床前可使用Rho家族成員拮抗劑治療和預(yù)防由于將血管暴露在較高水平的能增加血管滲漏性的因子中，引起的血管滲漏性增加。
全文摘要
本項(xiàng)目是關(guān)于通過(guò)將血管暴露在一種較高水平的因子中，從而抑制或降低血管滲漏性增加的方法，例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，它與Rho家族成員拮抗劑一起使用能增加血管通透性。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1681525SQ03821207
公開(kāi)日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者曹義海 申請(qǐng)人:曹義海