專(zhuān)利名稱(chēng)：用作診斷和治療靶標(biāo)的Sgk和Nedd的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷性檢測(cè)Sgk(血清和糖皮質(zhì)激素依賴(lài)性激酶)特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或蛋白激酶B(PKB)和/或Nedd(神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)基因)特別是Nedd4-2的物質(zhì)的用途。本發(fā)明還涉及影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的活性化合物的用途，特別是用于治療性治療與葡萄糖吸收紊亂相關(guān)的疾病，以及用于在增肥期使動(dòng)物變重。本發(fā)明也涉及診斷試劑盒。
上皮細(xì)胞頂端膜內(nèi)的Na+-偶聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sglt1(鈉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)負(fù)責(zé)葡萄糖腸和腎的轉(zhuǎn)運(yùn)。這種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中的紊亂將導(dǎo)致多種疾病，例如肥胖癥和糖尿病。
直到今天，關(guān)于Sglt1的調(diào)控了解得很少。最近發(fā)現(xiàn)了一種調(diào)控腎上皮Na+通道ENaC的新機(jī)制泛素連接酶Nedd4-2將通道泛素化，并因此使所述通道易于內(nèi)化和分解[Debonneville C，F(xiàn)lores SY，Kamynina E，Plant PJ，Tauxe C，Thomas MA，Munster C，Chraibi A，Pratt JH，Horisberger JD，Pearce D，Loffing J，Staub O.通過(guò)Sgk1磷酸化Nedd4-2而調(diào)控上皮Na+通道的細(xì)胞表面表達(dá)，EMBO J.2001；207052-7059]。Nedd4-2通過(guò)血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的激酶1(Sgk1)得以磷酸化，并且因此失活。所以，Sgk1是腎上皮Na+通道的有效刺激劑[De la Rosa等人.1999，Boehmer等人.2000，Chen等人.1999，Náray-Feies-T óth等人.1999，Lang等人.2000，Chigaev等人.2000，Wagner等人.2001]。
最近，雙胞胎研究顯示sgk1基因中某些單核苷酸多態(tài)性(SNPs)(E8CC/CT；I6CC)與高血壓有關(guān)[Busjahn A，Aydin A，Uhlmann R.等人，血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)控的激酶(SGK1)基因和血壓.Hypertension 2002；40256-260]。
在一般意義上，激酶是轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸基團(tuán)到單個(gè)底物的蛋白。血清和糖皮質(zhì)激素依賴(lài)的激酶(Sgk)最初從大鼠乳癌細(xì)胞克隆得到[Webster MK，Goya L，F(xiàn)irestone GL，Y.Biol.Chem.268(16)11482-11485，1993；WebsterMK，Goya L，Ge Y，Maiyar AC，F(xiàn)irestone GL，Mol.Cell.Biol.13(4)2031-2040，1993]。
Sgk1起初作為糖皮質(zhì)激素敏感基因得以克隆[Webster MK，Goya L，Ge Y，Maiyar AC，F(xiàn)irestone GL通過(guò)糖皮質(zhì)激素和血清誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因家族的一個(gè)新成員Sgk的表征，Mol Cell Biol 1993；132031-2040]。許多研究已經(jīng)表明Sgk1受到大量刺激物的影響[Lang F，Cohen P.血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶同工型的調(diào)控和生理作用。Science STKE.2001年11月13日；2001(108)RE17]，其中所述刺激物例如鹽皮質(zhì)激素的刺激[Chen SY，Bhargava A，Mastroberardino L，MeijerOC，Wang J，Buse P，F(xiàn)irestone GL，Verrey F，Pearce D醛固酮誘導(dǎo)的蛋白Sgk調(diào)控上皮鈉通道，Proc Natl Acad Sci USA 1999；962514-2519；Náray-Fejes-Tóth A，Canessa C，Cleaveland ES，Aldrich G，F(xiàn)ejes-Tóth GSgk是腎集合管中的由醛固酮誘導(dǎo)的激酶。對(duì)上皮Na+通道的作用，J BiolChem 1999；27416973-16978；Park J，Leong ML，Buse P，Maiyar AC，F(xiàn)irestone GL，Hemmings BA血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的激酶(Sgk)是PI3激酶刺激的信號(hào)通路的靶標(biāo)，EMBO J 1999；183024-3033；Brenan FE，F(xiàn)uller PJ.體內(nèi)通過(guò)皮質(zhì)類(lèi)固醇快速上調(diào)血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)控的激酶(Sgk)基因表達(dá)，Mol Cell Endocrinol.2000；30166129-36；Cowling RT，Birnboim HC。人粒細(xì)胞中的GM-CSF和其它促炎調(diào)節(jié)劑上調(diào)血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)控的激酶(Sgk)mRNA的表達(dá)，J Leukoc Biol.2000；67；240-248]，以及其它。胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF1通過(guò)胰島素和氧化應(yīng)激以信號(hào)級(jí)聯(lián)方式，以及通過(guò)磷脂酰肌醇3激酶(PI3-激酶)和磷酸肌醇依賴(lài)性激酶(Pdk1)刺激Sgk1[Kobayashi T，Cohen P.激活磷脂酰肌醇3激酶的激動(dòng)劑對(duì)血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)控的蛋白激酶的激活是由3-磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶-1(Pdk1)和pdk2介導(dǎo)的，Biochem J 1999；339319-328；Park J，LeongML，Buse P，Maiyar AC，F(xiàn)irestone GL，Hemmings BA血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的激酶(Sgk)是PI3激酶刺激的信號(hào)途徑的靶標(biāo)，EMBO J 1999；183024-3033；Kobayashi T，Deak M，Morrice N，Cohen P.血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶的兩種新同工型的結(jié)構(gòu)和調(diào)控特點(diǎn)，Biochem.J.1999；344189-197]。Pdk1激活Sgk1涉及422位絲氨酸的磷酸化。將這個(gè)絲氨酸突變?yōu)樘於彼?S422DSgk1)產(chǎn)生一種組成型活化的激酶[Kobayashi T，Cohen P激活磷脂酰肌醇3激酶的激動(dòng)劑對(duì)血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)控的蛋白激酶的激活是由3-磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶-1(Pdk1)和pdk2介導(dǎo)的，Biochem J 1999；339319-328]。
此后，Sgk1的兩種同工型即Sgk2和Sgk3得以克隆[Kobayashi T，DeakM，Morrice N，Cohen P.1999.血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶的兩種新同工型的結(jié)構(gòu)和調(diào)控特點(diǎn)，Biochem.J.344189-197]。Sgk的全部三種同工型和蛋白激酶B(PKB)經(jīng)由PI3激酶和Pdk1激活[Kobayashi T和CohenP.1999，激活磷脂酰肌醇3激酶的激動(dòng)劑對(duì)血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)控的蛋白激酶的激活是由3-磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶-1(Pdk1)和pdk2介導(dǎo)的，Biochem J 1999；339319-328]。
本發(fā)明的目的在于提供新型的診斷和治療應(yīng)用以調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)調(diào)控葡萄糖攝取來(lái)增加動(dòng)物的體重。
令人吃驚的是，在雙電極電壓鉗實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明Nedd4-2也能使腎和腸Na+-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sglt失活，而且這種作用可通過(guò)抑制Sgk1和/或Sgk3和/或PKB而進(jìn)行。既然加速的葡萄糖吸收促進(jìn)肥胖的發(fā)展，舉例來(lái)說(shuō)，它意味著Nedd4-2、Sgk1、Sgk3和PKB在肥胖發(fā)展中起到因果關(guān)系的作用。通過(guò)檢測(cè)Nedd4-2和/或Sgk1和/或Sgk3和/或PKB，可例如確定肥胖的原因，并能通過(guò)適當(dāng)?shù)闹委熀皖A(yù)防措施進(jìn)行治療或預(yù)防。由加速的腸葡萄糖吸收誘導(dǎo)的肥胖癥以及高血糖癥也有助于糖尿病的發(fā)生。最后，腎Na+通道的同時(shí)調(diào)節(jié)異常將導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。肥胖、高血壓和糖尿病的發(fā)生是稱(chēng)為代謝綜合征的主要特點(diǎn)。
反過(guò)來(lái)，抑制Sgk1和/或Sgk3和/或PKB導(dǎo)致了對(duì)腎和腸Na+-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sglt的抑制。
因此，通過(guò)獨(dú)立權(quán)利要求1、10、13、23、28、30、31、32、34和46的主題達(dá)到了本發(fā)明的目的。優(yōu)選的實(shí)施方案在從屬權(quán)利要求中具體指出。所有權(quán)利要求中的措辭在此處引用作為參考。
本發(fā)明要求至少一種檢測(cè)活化的和/或失活的Sgk(特別是Sgk1和/或Sgk3)和/或PKB和/或Nedd(特別是Nedd4-2)的表達(dá)和/或功能的物質(zhì)的用途。這因此也使得所述物質(zhì)可以，特別是，診斷與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂相關(guān)的疾病。此物質(zhì)優(yōu)選地至少為一種選自抗體和/或核苷酸的物質(zhì)。例如，這種物質(zhì)可以是一種抗Sgk1、Sgk3、PKB和/或Nedd4-2的抗體并且可以用于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的檢測(cè)方法例如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))中。在這些免疫測(cè)定法中，將針對(duì)待測(cè)定抗原(如Sgk1、Sgk3和/或PKB)的特異性抗體(或?yàn)樵诳贵w測(cè)定情況下的同源測(cè)試抗原)結(jié)合到支持物上(如纖維素或聚苯乙烯)，在支持物上與樣本孵育后免疫復(fù)合物得以形成。在隨后步驟中，向這些免疫復(fù)合物提供經(jīng)標(biāo)記抗體。通過(guò)向反應(yīng)混合物中添加發(fā)光底物，能看見(jiàn)結(jié)合免疫復(fù)合物的酶/底物復(fù)合物，或者通過(guò)光度檢測(cè)結(jié)合免疫復(fù)合物的標(biāo)記酶與已知酶活性的標(biāo)準(zhǔn)品比較來(lái)確定樣本中的抗原濃度。如上面已經(jīng)提到的，也可用核苷酸特別是寡核苷酸進(jìn)行診斷性檢測(cè)，其中所述寡核苷酸適于例如通過(guò)分子遺傳方法使用聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定量檢測(cè)Sgk1，其中特異DNA片段得以選擇性擴(kuò)增。
優(yōu)選使用抗Nedd蛋白中至少一種磷酸化和/或非磷酸化激酶共有序列的抗體。就此而論，“共有序列”應(yīng)理解為激酶的底物位點(diǎn)，也就是磷酸化位點(diǎn)的氨基酸序列。Nedd蛋白中的Sgk1共有序列在本上下文中是特別優(yōu)選的。
也可檢測(cè)Nedd蛋白中的失活突變，特別是在激酶共有序列中的突變(例如，S338DNedd4-2或S444DNedd4-2)。另外，在病人DNA中可檢測(cè)活化突變，例如S422DSgk1和/或T308D，S473DPKB。在進(jìn)一步的用途中，在病人RNA中檢測(cè)相應(yīng)的突變。最后，在病人的Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、PKB、和/或Nedd蛋白特別是Nedd4-2蛋白中檢測(cè)相應(yīng)突變。優(yōu)選使用或者合適的抗體和/或合適的核苷酸、特別是寡核苷酸，作為這些檢測(cè)的探針。
與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂相關(guān)的和待診斷的疾病特別的是代謝綜合征或肥胖癥。
本發(fā)明進(jìn)一步包括了一種用于診斷易患肥胖或肥胖癥體質(zhì)的方法。此診斷方法的特點(diǎn)在于，在Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3中，在PKB、nedd特別是nedd4-2的基因中，和/或在sglt特別是sglt1中，檢測(cè)至少一種多態(tài)性。就此而論，優(yōu)選檢測(cè)Sgk1中的E8CC/CT；I6CC多態(tài)性。這種多態(tài)性與體重指數(shù)直接相關(guān)，因此它是突出易患肥胖的體質(zhì)的特別合適標(biāo)志。所述縮寫(xiě)代表外顯子8的一個(gè)SNP(C→T)和在距離551個(gè)堿基對(duì)處外顯子7的供體位點(diǎn)(內(nèi)含子6)的第二個(gè)SNP(T→C)。為了檢測(cè)相應(yīng)多態(tài)性，優(yōu)選從合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或病人中移出血液，并利用其中包含的基因材料通過(guò)適當(dāng)?shù)臏y(cè)序方法或通過(guò)使用其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法來(lái)測(cè)定相應(yīng)位點(diǎn)的序列。除血液外，可以從其中分離基因材料的其它所有生物樣品在原則上也是合適的。
本發(fā)明還要求了至少一種用于影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、特別是腸和/或腎葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的活性化合物的用途。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sglt，特別是Sglt1優(yōu)選地至少部分負(fù)責(zé)這種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。根據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)影響Sglt，特別是Sglt1的表達(dá)和/或活性來(lái)影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)?；钚曰衔飪?yōu)選地影響至少一種Sgk，特別是Sgk1和/或Sgk3，和/或PKB，和/或影響至少一種Nedd，特別是Nedd4-2?；钚曰衔飪?yōu)選地針對(duì)Sgk、特別是Sgk1和/或Sgk3，和/或PKB，和/或Nedd、特別是Nedd4-2。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，活性化合物針對(duì)Sgk，特別是Sgk1和/或Sgk3，和/或PKB和/或Nedd，特別是Nedd4-2的活化劑、抑制劑、調(diào)節(jié)劑和/或生物前體。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，活性化合物是多核苷酸。這種多核苷酸例如可包含降低或抑制至少一種上述蛋白質(zhì)表達(dá)的反義序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這種多核苷酸編碼肽、優(yōu)選多肽，這種肽影響Sgk，特別是Sgk1和/或Sgk3，和/或PKB，和/或Nedd，特別是Nedd4-2的表達(dá)和/或功能。另外，活性化合物能本身優(yōu)選地為影響上述蛋白的表達(dá)和/或功能的肽或多肽?；钚曰衔锟梢允恰靶》肿踊衔铩?，優(yōu)選具有分子量＜1000的“小分子化合物”。
根據(jù)目標(biāo)是治療與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂相關(guān)疾病還是目標(biāo)為與增肥相關(guān)的提高動(dòng)物的體重，必須以不同方式影響各種酶。為了防止或治療與葡萄糖吸收紊亂相關(guān)的疾病，活性化合物應(yīng)該抑制至少一種Sgk，特別是sgk1和/或sgk3，和/或PKB，和/或刺激至少一種Nedd，特別是Nedd4-2。因?yàn)镾gk和PKB是激酶，則本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的激酶抑制劑，例如星形孢菌素和/或白屈菜紅堿，或至少一種它們的類(lèi)似物，是特別適合的。因?yàn)镹edd是連接酶，則連接酶活化因子適于刺激它們。這些活性化合物優(yōu)選地用于產(chǎn)生藥物或藥物組合物。待治療的疾病優(yōu)選地為代謝綜合征，特別是肥胖癥。
另一方面，如果與上面描述的目的在于降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)而進(jìn)行的疾病預(yù)防或治療相反，目的在于獲得葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的提高，例如用于與增肥相關(guān)的增加動(dòng)物體重，則活性化合物優(yōu)選地刺激至少一種Sgk，特別是sgk1和/或sgk3，和/或PKB，和/或抑制至少一種Nedd，特別是Nedd4-2。刺激Sgk1例如導(dǎo)致Nedd4-2例如被抑制，這樣結(jié)果導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sglt1的分解被推遲。結(jié)果導(dǎo)致增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這種活性化合物至少是一種Sgk活化劑和/或PKB活化劑，特別是生長(zhǎng)因子，優(yōu)選IGF1和/或胰島素。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，這種活性化合物至少是sgk1和/或sgk3，和/或PKB基因的轉(zhuǎn)錄的一種刺激物，優(yōu)選至少一種糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、促性腺激素和/或細(xì)胞因子，特別是TGFβ。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及診斷試劑盒。此試劑盒包括至少一種用于檢測(cè)活化和/或失活Sgk，特別是sgk1和/或sgk3，和/或PKB和/或Nedd，特別是Nedd4-2的表達(dá)和/或功能的物質(zhì)，用于診斷與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂有關(guān)的疾病。這些疾病優(yōu)選地為代謝綜合征，特別是肥胖癥。該試劑盒特別地可包含抗體和/或寡核苷酸以用于檢測(cè)相應(yīng)的蛋白和/或核酸。例如，這些抗體和/或寡核苷酸能用來(lái)分析不同蛋白或酶的量和/或活性。另外檢測(cè)基因中的相應(yīng)突變也是可能的。關(guān)于該試劑盒的更多特征讀者可以參考以下的描述。
除此之外，本發(fā)明包括抗Nedd蛋白中的至少一種磷酸化激酶共有序列的抗體。這種激酶共有序列是被相應(yīng)激酶特別是被Sgk1磷酸化的序列?？贵w優(yōu)選地識(shí)別Nedd4-2蛋白中的激酶共有序列。使用這種抗體，可分析Nedd4-2是否被Sgk1磷酸化并因此失活。這因此使得研究Nedd4-2的活性狀態(tài)成為可能。本發(fā)明還包括抗Nedd蛋白中相應(yīng)的非磷酸化激酶共有序列的抗體。特別優(yōu)選的是在一個(gè)測(cè)試方案中根據(jù)本發(fā)明結(jié)合這兩種抗體，由此使得獲取關(guān)于Nedd活性狀態(tài)的信息結(jié)果成為可能。
本發(fā)明也包括抗Nedd蛋白中至少一種突變的激酶共有序列的抗體。這種共有序列優(yōu)選地為被相應(yīng)突變的Sgk1共有序列。該激酶共有序列優(yōu)選位于Nedd4-2蛋白中。就此而論，在此特別優(yōu)選的突變是S338DNedd4-2和/或S444DNedd4-2。相應(yīng)突變的效果是相關(guān)激酶特別是Sgk1再也不能磷酸化Nedd。這樣一種抗體可用作研究相關(guān)突變的有用工具。
本發(fā)明的抗體可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法得以制備。特別地，可制備單克隆或多克隆抗體，而單克隆抗體被優(yōu)選因?yàn)樗鼈兺ǔ＞哂懈咛禺愋浴?br> 在本發(fā)明的診斷試劑盒中特別有利的是使用所描述的抗體。另外，所描述的抗體也可非常有利地用于檢測(cè)Sgk、PKB和/或Nedd的表達(dá)和/或功能的本發(fā)明用途中。在此上下文中，這些抗體可依據(jù)常規(guī)的免疫學(xué)方法使用。特別地，可使用這些抗體以實(shí)施上面已經(jīng)提到的ELISA。
本發(fā)明還包含組合物，優(yōu)選藥物組合物，其中包含至少一種活性化合物，所述活性化合物影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是腸和/或腎葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，而且，根據(jù)需要，所述藥物組合物還包含可藥用賦形劑。特別優(yōu)選地是，該活性化合物影響至少一種Sgk和/或PKB，和/或至少一種Nedd。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種活性化合物影響Sgk，特別是sgk1和/或sgk3，和/或PKB和/或Nedd，特別是Nedd4-2中的活化因子、抑制劑、調(diào)節(jié)劑和/或生物前體。
所述活性化合物有利地是多核苷酸。該多核苷酸可以包含降低或抑制相關(guān)基因表達(dá)的反義序列。也可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的顯性陰性(dominant negative)法，選擇一種相關(guān)多肽，以抑制單個(gè)基因或多個(gè)基因的表達(dá)，或限制相應(yīng)基因產(chǎn)物的功能。另外，所述多核苷酸可編碼肽，優(yōu)選多肽，其中所述肽影響Sgk，特別是sgk1和/或sgk3，和/或PKB和/或Nedd，特別是Nedd4-2的表達(dá)和/或功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得這些方法所需的相應(yīng)分子生物學(xué)操作。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該活性化合物是所描述的肽本身。這種活性化合物優(yōu)選地是“小分子化合物”，優(yōu)選分子量＜1000的“小分子化合物”。
特別地為了治療與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂相關(guān)的疾病，所述活性化合物抑制至少一種Sgk和/或PKB和/或刺激至少一種Nedd。為了治療這些疾病，所述活性化合物特別優(yōu)選地為至少一種激酶抑制劑，優(yōu)選星形孢菌素和/或白屈菜紅堿或一種它們的類(lèi)似物，和/或至少一種連接酶活化因子。
為增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是與動(dòng)物增肥有關(guān)時(shí)，所這活性化合物優(yōu)選刺激至少一種Sgk和/或PKB和/或抑制至少一種Nedd。為增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，所述活性化合物有利地是一種Sgk活化因子，特別是生長(zhǎng)因子，優(yōu)選IGF1和/或胰島素。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述活性化合物是sgk1和/或sgk3和/或PKB的轉(zhuǎn)錄刺激物，優(yōu)選地為至少一種糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、促性腺激素和/或細(xì)胞因子，特別是TGFβ。
所描述的不同可能性可以相互結(jié)合。
本發(fā)明還包括一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表現(xiàn)出脂肪組織中脂肪沉積增加。本發(fā)明的此方面不包括人類(lèi)。特別地，因?yàn)檫@些動(dòng)物體重長(zhǎng)得較快，這些動(dòng)物對(duì)食物生產(chǎn)很有前途。用這些動(dòng)物可以更快和更有效地實(shí)施增肥。用于產(chǎn)生這些動(dòng)物的方法的特點(diǎn)在于這些動(dòng)物中的Sglt，特別是Sglt1的表達(dá)和/或功能得到了增強(qiáng)。這樣就加速了葡萄糖的腸吸收，因此導(dǎo)致血漿中葡萄糖濃度增長(zhǎng)更快。這導(dǎo)致分泌更高水平的胰島素，因此最后導(dǎo)致脂肪組織中的脂肪沉積被刺激。
本發(fā)明這方面的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，Sglt特別是Sglt1為此目的在動(dòng)物中得到過(guò)量表達(dá)。其中所述Sglt特別是Sglt1的過(guò)量表達(dá)例如是通過(guò)將攜帶有位于合適sglt序列上游的合適功能性強(qiáng)啟動(dòng)子的合適基因構(gòu)建體特別是載體導(dǎo)入而實(shí)現(xiàn)的。也優(yōu)選的是表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)膹?qiáng)sglt特別是sglt1表達(dá)的克隆動(dòng)物。其實(shí)施方法步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Sgk，特別是sgk1和/或sgk3，和/或PKB的表達(dá)和/或功能得以增強(qiáng)。在最后的結(jié)果中，這因此也增強(qiáng)了Sglt，特別是Sglt1的活性或蛋白量，這意味著葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)得到了增強(qiáng)。為了做到這些，用常規(guī)分子生物學(xué)方法可以過(guò)量表達(dá)相關(guān)基因。另一方面，也可將表達(dá)適當(dāng)組成型活化突變體的基因構(gòu)建體導(dǎo)入或整合入生物體中。就此而論，尤其優(yōu)選突變體S422DSgk1和/或T308D，S473DPKB。這些突變體的活性與其它酶活性特別是激酶活性無(wú)關(guān)，并且所述突變體因而總是有活性的。它們抑制由于泛素連接酶Nedd特別是Nedd4-2引起的Sglt特別是Sglt1的分解，這是，因而導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)得到增強(qiáng)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，泛素連接酶Nedd特別是Nedd4-2的表達(dá)和/或功能降低。這對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的增加產(chǎn)生影響，原因在于Sglt特別是Sglt1被分解而降低。使用常規(guī)分子生物學(xué)方法，如反義或顯性陰性法同樣也可實(shí)現(xiàn)適當(dāng)降低Nedd的表達(dá)和/或功能。特別優(yōu)選的是穩(wěn)定地將nedd特別是nedd4-2的適當(dāng)突變體整合到生物體中或抑制Nedd基因以便以這種方式在一個(gè)長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)降低或抑制這種酶的表達(dá)。適當(dāng)?shù)姆椒ú襟E為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。在此方面，特別優(yōu)選的是插入至少一種失活突變到Nedd特別是Nedd4-2中。在此上下文中可以非常有利地使用S338DNedd4-2和/或S444DNedd4-2突變體。本發(fā)明也包括可通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的動(dòng)物。
已經(jīng)描述的特征和本發(fā)明的其它特征，由下面與從屬權(quán)利要求以及附圖結(jié)合的優(yōu)選實(shí)施方案的描述產(chǎn)生。就此而論，每種情況下單個(gè)特征可以它們自己或和幾個(gè)相互結(jié)合起來(lái)實(shí)現(xiàn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了Nedd4-2和Sgk1對(duì)Na+-偶聯(lián)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sglt1的調(diào)控。上部原始測(cè)量數(shù)據(jù)；下部算術(shù)平均±SEM(n＝6-15)。注射sglt1、nedd4-2和/或sgk1 cRNA到非洲瓜蟾卵母細(xì)胞中。Nedd4-2下調(diào)表達(dá)Sglt1的卵母細(xì)胞中由20mM葡萄糖誘導(dǎo)的電流，Sgk1刺激電流并且反轉(zhuǎn)了Nedd4-2的作用。*表示與在僅表達(dá)Sglt1的卵母細(xì)胞中測(cè)定的電流相比存在明顯差異。#表示與在表達(dá)Sglt1和Nedd4-2的卵母細(xì)胞中的相應(yīng)值相比存在明顯差異。
圖2顯示Nedd4-2、組成型活化的S422DSgk1和失活的K127NSgk1對(duì)Na+-偶聯(lián)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sglt1的調(diào)控。上部原始測(cè)量曲線；下部算術(shù)平均±SEM(n＝8-71)。注射sglt1，nedd4-2和/或S422DSgk1或K127NSgk1cRNA到非洲瓜蟾卵母細(xì)胞中。Nedd4-2顯著地下調(diào)表達(dá)Sglt1的卵母細(xì)胞中由20mM葡萄糖誘導(dǎo)的電流，S422DSgk1而不是K127NSgk1刺激電流并且反轉(zhuǎn)了Nedd4-2的作用。*表示與自身表達(dá)Sglt1的卵母細(xì)胞中測(cè)定的電流相比存在明顯差異。#表示與表達(dá)Sglt1和Nedd4-2的卵母細(xì)胞中相應(yīng)值相比存在明顯差異。
圖3顯示Nedd4-2、T308D，S473DPKB和Sgk3對(duì)Na+-偶聯(lián)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sglt1的調(diào)控。上部原始測(cè)量曲線；下部算術(shù)平均±SEM。注射sglt1、nedd4-2、T308D，S473DPKB和/或Sgk3 cRNA到非洲瓜蟾卵母細(xì)胞中。Nedd4-2顯著下調(diào)表達(dá)Sglt1的卵母細(xì)胞中由20mM葡萄糖誘導(dǎo)的電流。T308D，S473DPKB和Sgk3刺激電流并且反轉(zhuǎn)了Nedd4-2的作用。
*表示與自身表達(dá)Sglt1的卵母細(xì)胞中測(cè)定的電流相比存在明顯差異。
#表示與表達(dá)Sglt1和Nedd4-2的卵母細(xì)胞中相應(yīng)值相比存在明顯差異。
圖4顯示Nedd4-2和Sgk1對(duì)Na+-偶聯(lián)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sglt1的調(diào)控。算術(shù)平均±SEM(n＝18)。注射sglt1，nedd4-2和/或S422DSgk1(SD)cRNA到非洲瓜蟾卵母細(xì)胞中。同時(shí)表達(dá)的Nedd4-2減小了由加入的5mmol葡萄糖誘導(dǎo)的電流，而同時(shí)表達(dá)組成型活化的激酶S422DSgk1顯著增加了電流。
圖5顯示Nedd4-2、Sgk3和PKB對(duì)Na+-偶聯(lián)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sglt1的調(diào)控。算術(shù)平均±SEM(實(shí)驗(yàn)方法如圖4)。
實(shí)施例方法1.非洲瓜蟾卵母細(xì)胞中的表達(dá)和雙電極電壓鉗法編碼野生型Sgk1[Waldegger S，Barth P，Raber G，Lang F細(xì)胞體積等壓和變壓變化中經(jīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的推定人絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的克隆和描述，Proc Natl Acad Sci USA 1997；94；4440-4445]、編碼組成型活化的Sgk1(S422DSgk1)和失活Sgk1(K127NSgk1)[Kobayashi T，Cohen P.激活磷脂酰肌醇3激酶的激動(dòng)劑對(duì)血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)控的蛋白激酶的激活是由3-磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶-1(Pdk1)和pdk2介導(dǎo)的，Biochem J 1999；339319-328]、野生型Sgk3和PKB[Kobayashi T，Deak M，Morrice N，Cohen P.血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶的兩種新同工型的結(jié)構(gòu)和調(diào)控特點(diǎn)，Biochem.J.1999；344189-97]、組成型活化的T308D，S473DPKB[AlessiDR，Cohen P.蛋白激酶B的激活機(jī)理和功能，Curr.Opin Gene Dev.1998；855-62]、野生型Nedd4-2[Debonneville C，F(xiàn)lores SY，Kamynina E，PlantPJ，Tauxe C，Thomas MA，Munster C，Chraibi A，Pratt JH，HorisbergerJD，Pearce D，Loffing J，Staub O.通過(guò)Sgk1磷酸化Nedd4-2而調(diào)控上皮Na+通道的細(xì)胞表面表達(dá)，EMBO J.2001；207052-7059]和野生型Sglt1[Hediger MA，Coady MJ，Ikeda TS，Wright EM.Na+/葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的克隆表達(dá)和cDNA測(cè)序.Nature.1987；330379-381]的cRNAs在體外合成[Wagner CA，F(xiàn)riedrich B，Setiawan I，Lang F，Brer S非洲瓜蟾卵母細(xì)胞的用途，用于對(duì)異源表達(dá)的膜蛋白進(jìn)行功能性描述，Cell PhysiolBiochem 2000；101-12]。非洲瓜蟾卵巢的剝離以及卵母細(xì)胞的收集和處理已有詳細(xì)描述[Wagner CA，F(xiàn)riedrich B，Setiawan I，Lang F，Brer S非洲瓜蟾卵母細(xì)胞的用途，用于對(duì)異源表達(dá)的膜蛋白進(jìn)行功能性描述，CellPhysiol Biochem 2000；101-12]。用5ng的人sglt1、7.5ng人sgk1、K127Nsgk1、S422Dsgk1、sgk3、PKB或T308D、S473DPKB cRNA和/或5ng的非洲瓜蟾nedd4-2cRNA注射卵母細(xì)胞。對(duì)照卵母細(xì)胞注射水。注射各種cRNA三天后室溫下實(shí)施電生理實(shí)驗(yàn)。用雙電極電壓鉗法測(cè)定胞外施用20mM或5mM葡萄糖所誘導(dǎo)的電流[Wagner CA，F(xiàn)riedrich B，Setiawan I，Lang F，Brer S非洲瓜蟾卵母細(xì)胞的用途，用于對(duì)異源表達(dá)的膜蛋白進(jìn)行功能性描述，CellPhysiol Biochem 2000；101-12]并用作對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的衡量。用MacLab數(shù)字模擬轉(zhuǎn)換器和相應(yīng)的軟件(AD Instruments，Castle Hill，澳大利亞)在10Hz下過(guò)濾數(shù)據(jù)并分析。對(duì)照浴溶液(ND 96)包含96mM NaCl、2mMKCl、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2和5mM HEPES，PH值為7.4。所有物質(zhì)在規(guī)定的濃度下使用。用HCl或NaOH滴定終溶液到規(guī)定的PH或PH7.4?？焖俟嗔魅芤毫魉贋?0ml/分鐘，在10秒鐘之內(nèi)實(shí)現(xiàn)溶液的全部轉(zhuǎn)變。
為了計(jì)算，將數(shù)據(jù)提供為算術(shù)平均±SEM。n是觀測(cè)的卵母細(xì)胞數(shù)。所有試驗(yàn)在卵母細(xì)胞的至少三不同組中進(jìn)行。在所有重復(fù)實(shí)驗(yàn)中得到了質(zhì)量上相似的數(shù)據(jù)。用Studentt檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)結(jié)果的顯著性差異。僅有P＜0.05的結(jié)果視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。
2.雙胞胎研究征募了126對(duì)同卵雙生和70對(duì)異卵雙生雙胞胎以研究血壓調(diào)控和心血管表型。也包括了異卵雙生雙胞胎的父母。所有參與者是來(lái)自德國(guó)不同地方的德國(guó)白種人。為了確定接合性和用于其它分子遺傳學(xué)研究，從所有雙胞胎和異卵雙生雙胞胎的父母抽取血液。對(duì)每個(gè)參與者進(jìn)行了醫(yī)學(xué)和生理檢查。沒(méi)有一個(gè)參與者具有家族史慢性醫(yī)學(xué)疾病。在外顯子8中(C→T)中確定了一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，并且在距離551個(gè)堿基對(duì)處外顯子7的供體位點(diǎn)(內(nèi)含子6)中確定了第二個(gè)SNP(T→C)[Busjahn A，AydinA，Uhlmann R.等人，血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)控的激酶(SGK1)基因和血壓，Hypertension 2002；40256-260]。分析這兩個(gè)單獨(dú)的SNPs，即內(nèi)含子6(T→C)和外顯子8(C→T)。
對(duì)這兩種SNP的描述統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示作用的隱性模式。群叢分析因此基于兩組比較，即基于變體的純合攜帶者與雜合攜帶者和非攜帶者。用chi2檢驗(yàn)檢驗(yàn)了這兩種SNP的獨(dú)立性。SNPs與表型之間的關(guān)系通過(guò)單維方差分析(unidimensional ANOVA)檢驗(yàn)，其中這兩種多態(tài)性被同時(shí)引入。對(duì)異卵雙生雙胞胎對(duì)的兩部分和對(duì)同卵雙生雙胞胎對(duì)的隨機(jī)選擇部分進(jìn)行了這種分析。這種檢驗(yàn)比t檢驗(yàn)更可靠，而且有可能同時(shí)考慮兩種多態(tài)性并包括它們的相互作用。另外，通過(guò)這種方法，減少研究的數(shù)量也是可能的。因?yàn)楫惵央p生雙胞胎對(duì)的兩部分并不是相互獨(dú)立的，在ANOVA檢驗(yàn)中將家族影響以及年齡和性別包括在內(nèi)以作為協(xié)變因子。顯著性水平設(shè)為0.05。在確認(rèn)組中，通過(guò)單維ANOVA檢驗(yàn)了同時(shí)使用兩種SNP的相關(guān)性效果。
結(jié)果20mM葡萄糖的施用導(dǎo)致注射了Sglt1 mRNA的非洲瓜蟾卵母細(xì)胞而不是注射水的卵母細(xì)胞中產(chǎn)生了48.6±11.5nA(n＝18)的內(nèi)向電流(Iglc)。經(jīng)比較，葡萄糖處理導(dǎo)致注射水的卵母細(xì)胞產(chǎn)生了1.3±0.7nA(n＝6)的電流。在注射了Sglt1 mRNA和Nedd4-2 mRNA(共表達(dá))的非洲瓜蟾卵母細(xì)胞中，Iglc顯著降低了49.2±6.8％(n＝15)。結(jié)果，sglt1受到泛素連接酶Nedd4-2的下調(diào)(圖1)。
野生型Sgk1的共表達(dá)上調(diào)葡萄糖誘導(dǎo)的電流81.3±19.0％(n＝15)，并且反轉(zhuǎn)了Nedd4-2的作用。在表達(dá)Sglt1、Sgk1和Nedd4-2的卵母細(xì)胞中，葡萄糖誘導(dǎo)的電流比自身表達(dá)Sglt1的卵母細(xì)胞中觀察的值高34.8±11.8％(n＝14)(圖1)。
組成型活化的S422DSgk1與野生型Sgk1有類(lèi)似的效果(圖2)。S422DSgk1的共表達(dá)提高了葡萄糖誘導(dǎo)的電流達(dá)72.4±9.1％(n＝57)。在這一系列實(shí)驗(yàn)中，Nedd4-2的共表達(dá)降低電流達(dá)35.3±4.4％(n＝46)。此作用通過(guò)額外共表達(dá)的S422DSgk1反轉(zhuǎn)。在共表達(dá)Nedd4-2和S422DSgk1的卵母細(xì)胞中，電流比本身表達(dá)Sglt1的卵母細(xì)胞高59.2±19.8％(n＝16)(圖2)。與野生型或組成型活化的Sgk1相比，失活突變的K127NSgk1沒(méi)有顯著改變底物誘導(dǎo)的電流(-2.0±5.3％，n＝14)，并且沒(méi)有反轉(zhuǎn)Nedd4-2的作用。在表達(dá)Sglt1及K127NSgk1和Nedd4-2的卵母細(xì)胞中，葡萄糖誘導(dǎo)的電流比本身表達(dá)Sglt1的卵母細(xì)胞低54.9±9.7％(n＝8)(圖2)。
T308D，S473DPKB的作用類(lèi)似于sgk1的作用(圖3)。在這一系列實(shí)驗(yàn)中，Nedd4-2的共表降低電流達(dá)26.5±5.5％(n＝42)。對(duì)表達(dá)Sglt1的卵母細(xì)胞，共表達(dá)組成型活化的T308D，S473DPKB顯著增加葡萄糖誘導(dǎo)的電流達(dá)117.4±15.8％(n＝31)，并且反轉(zhuǎn)了Nedd4-2的作用。在共表達(dá)T308D，S473DPKB、Nedd4-2和Sglt1的非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，電流比本身表達(dá)Sglt1的卵母細(xì)胞中高106.5±18.2％(n＝27)(圖3)。
Sgk3與T308D，S473DPKB和Sgk1以可比較的方式刺激葡萄糖誘導(dǎo)的電流并且反轉(zhuǎn)Nedd4-2的作用。與本身表達(dá)Sglt1的非洲爪蟾卵母細(xì)胞中葡萄糖誘導(dǎo)的電流相比，在表達(dá)Sglt1和Sgk3的卵母細(xì)胞中葡萄糖誘導(dǎo)的電流較之高123.6±15.0％(n＝22)，在表達(dá)Sglt1、Nedd4-2和Sgk3的卵母細(xì)胞中葡萄糖誘導(dǎo)的電流較之高112.4±19.4％(n＝22)。
圖4顯示sglt1和S442DSgk1(SD)的共表達(dá)提高的Iglc值為77±23％到65.4±10.6nA(n＝18)。在表達(dá)Sglt1、Sgk1和Nedd4-2的卵母細(xì)胞中，葡萄糖誘導(dǎo)的電流達(dá)到60.5±8.9nA(n＝18)，比只注射Sglt1的卵母細(xì)胞中的相應(yīng)值高61±21％，比注射Sglt1和Nedd4-2mRNA的卵母細(xì)胞高126±23％。這些實(shí)驗(yàn)中用5mM葡萄糖誘導(dǎo)電流。
在另外一系列實(shí)驗(yàn)中，除組成型活化的S422DSgk1(SD)外，還檢測(cè)了Sgk的同工型即Sgk2和Sgk3，以及蛋白激酶B(PKB)。通過(guò)共表達(dá)S442DSgk1，葡萄糖誘導(dǎo)的電流提高了55±12％(n＝44)，通過(guò)共表達(dá)Sgk3，葡萄糖誘導(dǎo)的電流提高了117±16％(n＝16)，通過(guò)共表達(dá)PKB，葡萄糖誘導(dǎo)的電流提高了101±18％(n＝24)，而Sgk2沒(méi)有統(tǒng)計(jì)上的明顯的效果。盡管共表達(dá)Nedd4-2降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)23±4％(n＝79)，但它不阻止通過(guò)額外共表達(dá)S442DSgk1(+48±11％，n＝48)、Sgk3(+114±26％，n＝16)和PKB(+107±20％，n＝24)產(chǎn)生的刺激。再一次地，Sgk2沒(méi)有明顯效果。
為研究體重調(diào)控中Sglt1與Sgk1的功能相關(guān)性，將具有Sgk1基因多態(tài)性的雙胞胎的體重指數(shù)關(guān)聯(lián)起來(lái)。帶有多態(tài)性E8CC/CT；I6CC的雙胞胎的平均體重達(dá)到26.7±1.4kg/m2(n＝13)。這個(gè)值比雙胞胎整體的相應(yīng)平均值(23.3±0.2kg/m2，n＝263)明顯要高(P＜0.008)。
總之，實(shí)驗(yàn)表明Sgk1、Sgk2和PKB對(duì)Sglt1有強(qiáng)刺激作用。Sglt1活性的提高加快了葡萄糖的腸吸收，以至血漿中的葡萄糖濃度增加得較快。這增加了胰島素的釋放，并且因此刺激脂肪組織中脂肪的沉積。另一方面，Sglt1的抑制劑防止肥胖癥。
雙胞胎研究表明與升高的血壓相關(guān)的同一多態(tài)性也與高體重指數(shù)相關(guān)。
權(quán)利要求
1.至少一種用于檢測(cè)活化和/或失活的Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB、和/或Nedd特別是Nedd4-2的表達(dá)和/或功能的物質(zhì)的用途，用于診斷與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂相關(guān)的疾病。
2.如權(quán)利要求1中所述的用途，其特征在于所述物質(zhì)至少是一種選自抗體和核苷酸的物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1或2中所述的用途，其特征在于所述用途中使用的抗體是抗Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、PKB、和/或Nedd特別是Nedd4-2中的磷酸化和/或非磷酸化序列。
4.如權(quán)利要求3中所述的用途，其特征在于所述用途中使用的抗體是抗至少一種磷酸化和/或非磷酸化的激酶共有序列，特別是抗Nedd蛋白尤其是Nedd4-2蛋白中的Sgk1共有序列。
5.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于對(duì)來(lái)自生物樣本的、特別是對(duì)來(lái)自患者的樣本的DNA、RNA和/或Nedd蛋白，檢測(cè)在Nedd特別是在nedd4-2中的至少一種突變，特別是失活突變，其中所述突變優(yōu)選地存在于編碼Nedd蛋白中Sgk1共有序列的nedd片段。
6.如權(quán)利要求5中所述的用途，其特征在于突變?yōu)镾338DNedd4-2和/或S444DNedd4-2。
7.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于對(duì)來(lái)自生物樣本的、特別是對(duì)來(lái)自患者的樣本的DNA、RNA和/或Sgk蛋白和/或PKB蛋白，檢測(cè)在sgk特別是sgk1和/或sgk3、和/或PKB基因中的至少一種突變，特別是活化突變。
8.如權(quán)利要求7中所述的用途，其特征在于突變?yōu)镾422DSgk1和/或T308D，S473DPKB。
9.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述疾病為代謝綜合征，特別是肥胖癥。
10.用于診斷易患肥胖癥的體質(zhì)的方法，其特征在于在sgk特別是sgk1和/或sgk3、PKB基因、nedd特別是nedd4-2、和/或sglt特別是sglt1中檢測(cè)至少一種多態(tài)性。
11.如權(quán)利要求10中所述的方法，其特征在于所述多態(tài)性為單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
12.如權(quán)利要求10或11中所述的方法，其特征在于所述多態(tài)性為sgk1中的E8CC/CT；I6CC。
13.至少一種活性化合物的用途，其用于影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是腸和/或腎的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。
14.如權(quán)利要求13中所述的用途，其特征在于所述活性化合物影響至少一種Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB，和/或影響至少一種Nedd特別是Nedd4-2。
15.如權(quán)利要求13或14中所述的用途，其特征在于所述活性化合物是針對(duì)Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB、和/或Nedd特別是Nedd4-2。
16.如權(quán)利要求13到15中任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述活性化合物是針對(duì)Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB、和/或Nedd特別是Nedd4-2的活化劑、抑制劑、調(diào)節(jié)劑和/或生物前體。
17.如權(quán)利要求13到16中任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述活性化合物是優(yōu)選地編碼肽的多核苷酸，特別是編碼多肽的多核苷酸。
18.如權(quán)利要求13到17中任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述活性化合物是肽，優(yōu)選地是多肽。
19.如權(quán)利要求17或18中所述的用途，其特征在于所述肽影響Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB、和/或Nedd特別是Nedd4-2的表達(dá)和/或功能。
20.如權(quán)利要求13到19中任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述活性化合物是“小分子化合物”，優(yōu)選地是分子量(MW)＜1000的“小分子化合物”。
21.如權(quán)利要求13到20中任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述活性化合物抑制至少一種Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB，和/或刺激至少一種Nedd特別是Nedd4-2，特別是用于預(yù)防或治療與葡萄糖吸收紊亂有關(guān)的疾病。
22.如權(quán)利要求13到21中任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述活性化合物是至少一種激酶抑制劑，優(yōu)選地為星形孢菌素和/或白屈菜紅堿或一種它們的類(lèi)似物，和/或至少一種連接酶活化劑。
23.影響特別是抑制至少一種Sgk和/或PKB，和/或影響特別是刺激至少一種Nedd的至少一種活性化合物的用途，用于產(chǎn)生治療與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂相關(guān)疾病的藥物或藥物組合物。
24.如權(quán)利要求21到23中任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述疾病為代謝綜合征，特別是肥胖癥。
25.如權(quán)利要求13到20中任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述活性化合物刺激至少一種Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB、和/或抑制至少一種Nedd特別是Nedd4-2，用于增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，特別用于增加動(dòng)物的體重。
26.如權(quán)利要求25中所述的用途，其特征在于所述活性化合物是至少一種Sgk的活化劑和/或PKB活化劑，特別是生長(zhǎng)因子，優(yōu)選IGF1，和/或胰島素。
27.如權(quán)利要求25或26中所述的用途，其特征在于所述活性化合物至少是一種sgk1和/或sgk3和/或PKB基因轉(zhuǎn)錄的刺激劑，優(yōu)選地為至少一種糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、促性腺激素和/或細(xì)胞因子，特別是TGFβ。
28.診斷試劑盒，其包含至少一種用于檢測(cè)活化和/或失活的Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB、和/或Nedd特別是Nedd4-2的表達(dá)和/或功能的物質(zhì)，以用于診斷與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂相關(guān)的疾病。
29.如權(quán)利要求28中所述的診斷試劑盒，其特征在于所述疾病為代謝綜合征，特別是肥胖癥。
30.一種抗體，特征在于其抗Nedd蛋白特別是Nedd4-2蛋白中的至少一個(gè)磷酸化的激酶共有序列，特別是磷酸化的Sgk1共有序列。
31.一種抗體，其特征在于其抗Nedd蛋白特別是Nedd4-2蛋白中的至少一個(gè)非磷酸化的激酶共有序列，特別是非磷酸化的Sgk1共有序列。
32.一種抗體，特征在于其抗Nedd蛋白特別是Nedd4-2蛋白中的至少一個(gè)突變的激酶共有序列，特別是突變的Sgk1共有序列。
33.如權(quán)利要求32中所述的抗體，其特征在于具有突變的激酶共有序列的Nedd蛋白是S338DNedd4-2和/或S444DNedd4-2。
34.一種組合物，特別是藥物組合物，其包含有效量的至少一種影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是影響腸和/或腎的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的活性化合物，而且，根據(jù)需要，還包含可藥用賦形劑。
35.如權(quán)利要求34中所述的組合物，其特征在于所述活性化合物影響至少一種Sgk和/或PKB和/或至少一種Nedd。
36.如權(quán)利要求34或35中所述的組合物，其特征在于所述活性化合物影響Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB、和/或Nedd特別是Nedd4-2的活化劑、抑制劑、調(diào)節(jié)劑和/或生物前體。
37.如權(quán)利要求34到36中任意一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于所述活性化合物是優(yōu)選編碼肽特別是多肽的多核苷酸。
38.如權(quán)利要求34到37中任意一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于所述活性化合物是肽，優(yōu)選多肽。
39.如權(quán)利要求37或38中所述的組合物，其特征在于所述肽影響Sgk，特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB、和/或Nedd特別是Nedd4-2的表達(dá)和/或功能。
40.如權(quán)利要求34到39中任意一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于所述活性化合物是“小分子化合物”，優(yōu)選分子量(MW)＜1000的“小分子化合物”。
41.如權(quán)利要求34到40中任意一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于所述活性化合物抑制至少一種Sgk和/或PKB和/或刺激至少一種Nedd。
42.如權(quán)利要求34到41中任意一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于所述活性化合物是至少一種激酶抑制劑，優(yōu)選星形孢菌素和/或白屈菜紅堿，或一種它們的類(lèi)似物，和/或至少一種連接酶活化劑。
43.如權(quán)利要求34到42中任意一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于所述活性化合物刺激至少一種Sgk和/或PKB和/或抑制至少一種Nedd。
44.如權(quán)利要求43中所述的組合物，其特征在于活性化合物是至少一種Sgk活化劑和/或PKB活化劑，特別是生長(zhǎng)因子，優(yōu)選IGF1，和/或胰島素。
45.如權(quán)利要求43或44中所述的組合物，其特征在于所述活性化合物是至少一種sgk1和/或sgk3、和/或PKB基因的轉(zhuǎn)錄刺激劑，優(yōu)選至少一種糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、促性腺激素和/或細(xì)胞因子，特別是TGFβ。
46.一種方法，所述方法用于產(chǎn)生不包括人類(lèi)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表現(xiàn)出脂肪組織中脂肪沉積的增加，其特征在于Sglt、特別是Sglt1的表達(dá)和/或功能增加。
47.如權(quán)利要求46中所述的方法，其特征在于Sglt，特別是Sglt1過(guò)量表達(dá)。
48.如權(quán)利要求46或47中所述的方法，其特征在于增強(qiáng)了至少一種Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB的表達(dá)和/或功能。
49.如權(quán)利要求48中所述的方法，其特征在于至少一種sgk特別是sgk1和/或sgk3、和/或至少一種PKB基因過(guò)量表達(dá)。
50.如權(quán)利要求48或49中所述的方法，其特征在于使用了sgk特別是sgk1和/或sgk3、和/或PKB基因的至少一種活化突變，其中所述突變特別是S422Dsgk1和/或T308D，S473DPKB。
51.如權(quán)利要求46到50中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于至少一種Nedd特別是Nedd4-2的表達(dá)和/或功能降低。
52.如權(quán)利要求51中所述的方法，其特征在于使用了nedd特別是nedd4-2的至少一種失活突變，其中所述突變特別是S338Dnedd4-2和/或S444Dnedd4-2。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于診斷性檢測(cè)Sgk特別是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB、和/或Nedd特別是Nedd4－2的物質(zhì)的用途，本發(fā)明還涉及影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的活性成分的用途，用于治療與葡萄糖吸收紊亂相關(guān)的疾病，以及用于使動(dòng)物變胖。本發(fā)明也涉及診斷試劑盒及包含活性量的至少一種影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的活性成分的藥物組合物。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1668762SQ03816051
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2003年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月4日
發(fā)明者邁克爾·迪特爾, 弗洛里安·朗, 卡爾·朗 申請(qǐng)人:弗洛里安·朗