專利名稱：用于減少心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的油體締合蛋白質(zhì)的組合物和方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于減少膽固醇水平并減少心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的新的組合物、多肽和方法。更特別地，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療升高的膽固醇和心血管疾病，包括油體締合蛋白質(zhì)的新的組合物及其用途。
背景技術(shù)：
心血管疾病是人類群體內(nèi)發(fā)病和致死的主要原因。尤其是在美國和西歐國家。許多的病因因素已經(jīng)涉及心血管疾病的發(fā)展。這些因素中的部分包括該疾病的遺傳誘因，例如吸煙和日常飲食的生活方式因素、年齡、性別、高血壓和高脂血癥，包括高膽固醇血癥。許多因素，特別是高脂血癥和高膽固醇血癥，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化這一心血管疾病的根本原因的發(fā)展。
高血液膽固醇濃度是人類中一種主要的心血管疾病危險(xiǎn)因素。升高的低密度脂蛋白膽固醇(“LDL”)和總膽固醇直接與冠心病風(fēng)險(xiǎn)的增加相關(guān)。(Anderson等人，1987)。盡管總膽固醇和LDL的高水平在發(fā)展動(dòng)脈粥樣硬化和血管疾病中是危險(xiǎn)因素，高密度脂蛋白膽因醇(“HDL”)最近也被認(rèn)為是發(fā)展這些狀況的附加危險(xiǎn)因素。幾個(gè)臨床試驗(yàn)支持HDL針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)性作用的理論。一種這樣的研究已經(jīng)證明在女性中，血液中每增加1-mg/dl的HDL，就降低3％的冠狀動(dòng)脈血管的疾病風(fēng)險(xiǎn)。(Gordon等人，1989)。
研究已經(jīng)表明在人類中飲食的變化可以減少膽固醇。在此中，特殊的研究已經(jīng)表明所攝取蛋白質(zhì)的質(zhì)量以及數(shù)量極大地影響了血清膽固醇水平。(Carol和Hamilton，1975；Nagaoka等人，1992；Potter，1995)。在日常飲食中攝取植物蛋白物質(zhì)代替動(dòng)物性蛋白質(zhì)與心血管疾病的較低風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，其可反映為血清膽固醇水平的降低。特別地，大豆蛋白質(zhì)，一種植物蛋白，已經(jīng)顯示相對(duì)于動(dòng)物蛋白酪蛋白能降低血清膽固醇的水平(Nagaoka等人，1999)。更近的關(guān)于大豆蛋白質(zhì)攝取對(duì)人類中血清脂類影響的變化分析已經(jīng)顯示規(guī)定飲食的大豆蛋白質(zhì)與人類中總膽固醇和LDL血清濃度的降低顯著相關(guān)，并且不顯著影響HDL-膽固醇濃度(Anderson等人，1995)。
擔(dān)負(fù)大豆蛋白質(zhì)能夠降低膽固醇職責(zé)的一種因子是高分子量級(jí)分(HMF)。HMF組成了在蛋白水解消化后仍保持完整的大豆蛋白質(zhì)的不易消化的部分。因此該級(jí)分由許多不同的肽或肽片段組成。大豆蛋白質(zhì)的HMF實(shí)際上已經(jīng)在動(dòng)物和人類研究中顯示顯著地減少血清膽固醇。相信不易消化的HMF通過防止經(jīng)刷緣膜的膽固醇被動(dòng)攝取或通過防止蛋白質(zhì)介導(dǎo)的膽固醇攝取而防止膽固醇的攝取。相比之下，低分子量級(jí)分、大豆蛋白質(zhì)的可消化級(jí)分，已經(jīng)事實(shí)上顯示增加血清膽固醇(Sugano等人，1988)。
盡管大豆蛋白質(zhì)和特別是HMF的潛在治療價(jià)值是作為降低膽固醇的因子，但是還沒有確定擔(dān)負(fù)其非消化和膽汁過少活性的特異組分。因此仍然需要致力于鑒定這些活性組分，以提供更有效地減少膽固醇和其他與心血管疾病相關(guān)的危險(xiǎn)因素的治療劑。
發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明提供制備食品的方法，包括下列步驟(a)獲得所選擇的食品；以及(b)向該食品添加分離的油體締合蛋白質(zhì)，其中消耗有效量的該食品降低了需要該食品的受試個(gè)體的血清膽固醇。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括添加至少一種選自基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物的化合物。油體締合蛋白質(zhì)可以包括脂蛋白和/或油質(zhì)蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，食品是以大豆為基礎(chǔ)的。該組合物可能在添加的步驟之前缺乏或包括油體締合的本體蛋白質(zhì)。食品的實(shí)例包括，但不具體限于，大豆細(xì)粉、大豆粒、大豆粗粉、大豆片、豆奶粉、大豆蛋白質(zhì)濃縮物、大豆蛋白質(zhì)分離物和分離的大豆多肽。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，大豆蛋白質(zhì)分離物是用蛋白酶處理的大豆物質(zhì)的高分子量級(jí)分。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，分離的大豆多肽包括β-伴大豆球蛋白或其片段，和/或是大豆球蛋白或其片段。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防高膽固醇血癥的組合物，包括(a)大豆球蛋白和/或β-伴大豆球蛋白或其片段；和(b)油體締合蛋白質(zhì)，其中大豆球蛋白和/或β-伴大豆球蛋白和油體締合蛋白質(zhì)是以在需要其的受試個(gè)體中提供治療或預(yù)防高膽固醇血癥的協(xié)同效應(yīng)的有效量存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，大豆球蛋白或β-伴大豆球蛋白至少部分地受到酶或酶混合物的水解。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組合物包含大豆球蛋白或其片段和純化的油體締合蛋白質(zhì)，而在另一個(gè)實(shí)施方案中包括β-伴大豆球蛋白或其片段和純化的油體締合蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該組合物可以包括大約1％-大約5％，大約5％-大約10％，大于大約10％，或大約30％-大約50％重量的油體締合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供的組合物可以進(jìn)一步包括至少一種添加化合物，包括基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物。植物雌激素的實(shí)例包括異黃酮。異黃酮的實(shí)例包括染料木黃酮、二分體玉米醇溶蛋(diadzein)、牛尿酚、雞豆黃素A、芒柄花黃素及其各自天然存在的糖苷和糖苷共軛物。碳水化合物的實(shí)例包括高直鏈淀粉、低聚果糖和大豆子葉纖維。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，磷脂選自卵磷脂、溶血卵磷脂和具有改進(jìn)的脂肪酸組分的卵磷脂。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，皂角苷選自大豆皂角苷A、皂角苷B、皂角苷E、皂草精醇A、皂草精醇B和皂草精醇E。油體締合蛋白質(zhì)可以包括脂蛋白，包括哺乳動(dòng)物脂蛋白、蛋黃脂蛋白或脂肪球膜蛋白質(zhì)。油體締合蛋白質(zhì)也可以是油質(zhì)蛋白，包括油質(zhì)蛋白的低分子量級(jí)分。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，油體締合蛋白質(zhì)包括包含兩親性序列的多肽片段。其中該組合物包括大豆球蛋白，可以包括大豆球蛋白的堿性亞基，包括B-lb亞基。該組合物也可包括β-伴大豆球蛋白，包括其α’亞基或片段。該組合物可進(jìn)一步被定義為包含40％以上的β-伴大豆球蛋白或其片段。該組合物可進(jìn)一步被定義為包括一種或多種多肽序列，選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10和SEQ ID NO11。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防高膽固醇血癥的方法，包括步驟(a)向所選擇的食品中添加油體締合蛋白質(zhì)；以及(b)將該食品以足夠治療或預(yù)防高膽固醇血癥的數(shù)量提供給需要其的受試個(gè)體。該方法可進(jìn)一步包括向食品中添加至少一種選自基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，油體締合蛋白質(zhì)包括例如油質(zhì)蛋白的脂蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，食品是以大豆為基礎(chǔ)的。食品的實(shí)例包括，大豆細(xì)粉、大豆粒、大豆粗粉、大豆片、豆奶粉、大豆蛋白質(zhì)濃縮物、大豆蛋白質(zhì)分離物和分離的大豆多肽。在添加的步驟前食品可能缺乏或包括油體締合的本體蛋白質(zhì)。大豆蛋白質(zhì)分離物可包括用蛋白酶處理的大豆材料的高分子量級(jí)分。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，分離的大豆多肽包括β-伴大豆球蛋白或其片段，和/或是大豆球蛋白或其片段。
另一方面，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防高膽固醇血癥的方法，包括對(duì)需要其的受試個(gè)體施用包括治療有效量的純化的油體締合蛋白質(zhì)的藥物組合物。藥物組合物可以任何方式給藥，包括作為丸劑或膠囊劑或作為營養(yǎng)增補(bǔ)劑給藥。在該方法中，心血管疾病可通過降低總的血清和/或肝的膽固醇或甘油三酯的濃度而預(yù)防。血清膽固醇濃度可通過降低低密度脂蛋白的濃度，以及增加高密度脂蛋白的濃度而下降。
在另一方面，提供具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，或具有與其有至少95％的序列同源性并具有與其相同的生物活性的氨基酸序列的多肽。
附圖簡述本發(fā)明的這些和其他細(xì)節(jié)、方面以及優(yōu)勢(shì)將在下列說明書、所附的權(quán)利要求和附圖方面進(jìn)行更透徹地理解，其中

圖1描繪來自大豆的油質(zhì)蛋白蛋白質(zhì)P24油質(zhì)蛋白同工型A(P89)的序列，登記號(hào)P29530，并相應(yīng)于SEQ ID NO12。
圖2描繪來自大豆的油質(zhì)蛋白蛋白質(zhì)P24油質(zhì)蛋白同工型B(P91)的序列，登記號(hào)P29531，并相應(yīng)于SEQ ID NO13。
圖3描繪來自玉米(Zea mays)的油體締合蛋白質(zhì)17kDa油質(zhì)蛋白(oleo17)的氨基酸序列(登記號(hào)AAA68066)，并相應(yīng)于SEQ ID NO14。
圖4描繪來自玉米(玉米屬)的油體締合蛋白質(zhì)16kDa油質(zhì)蛋白(oleo16)的氨基酸序列(登記號(hào)AAA68065)，并相應(yīng)于SEQ ID NO15。
圖5描繪來自玉米(玉米屬)的油質(zhì)蛋白KD18(KD18；L2)的氨基酸序列(登記號(hào)AAA67699)，并相應(yīng)于SEQ ID NO16。
圖6描繪向日葵油質(zhì)蛋白的氨基酸序列(登記號(hào)CAA55348)，并相應(yīng)于SEQ ID NO17。
圖7描繪包含來自稱為OBAP(+)的大豆蛋白質(zhì)分離物的HMF，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的凝膠條帶的5種多肽。
圖8描繪在聚丙烯酰胺凝膠上純化和分離的油體締合蛋白質(zhì)(P34和油質(zhì)蛋白)。
圖9描繪包含來自由缺乏G1大豆球蛋白的大豆產(chǎn)生的用胃蛋白酶消化的大豆蛋白質(zhì)分離物的HMF的凝膠。
圖10描繪的圖表說明，對(duì)照OBAP(-)大豆蛋白質(zhì)分離物，從OBAP(+)分離的HMF對(duì)Caco-2細(xì)胞中膽固醇攝取的劑量依賴性抑制。
圖11描繪的圖表說明，在二氫谷甾醇存在下的膽固醇吸收與在大豆球蛋白-無效的和α/α’β-伴大豆球蛋白-無效的HMF存在下的膽固醇吸收之間的差異，從而證明機(jī)理上的差異。
圖12描繪的凝膠說明在每一樣品中存在油質(zhì)蛋白。
圖13描繪的凝膠說明在標(biāo)明的樣品中存在或缺少油質(zhì)蛋白。
發(fā)明詳述本發(fā)明通過鑒定具有心血管健康益處的組合物來克服現(xiàn)有技術(shù)的限制。特別地，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及發(fā)現(xiàn)能夠降低膽固醇水平的油體締合蛋白質(zhì)。同時(shí)，植物成分，例如大豆蛋白質(zhì)，已經(jīng)公知具有低血膽固醇活性，但負(fù)責(zé)該活性的特定成分先前沒有表征。因此，現(xiàn)在的發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)油體締合蛋白質(zhì)，包括油質(zhì)蛋白和蛋黃脂蛋白能夠賦予植物蛋白質(zhì)降低膽固醇的特征性能力。同樣地，本發(fā)明涉及這些特定成分與例如大豆食品的植物材料的協(xié)同組合。沒有結(jié)合任何特別的理論，相信油體締合蛋白質(zhì)預(yù)防存在于大豆物質(zhì)中的生理活性肽的消化并從而協(xié)同增加該組合物的低血膽固醇活性。另外，本發(fā)明涉及與大豆物質(zhì)結(jié)合成分的協(xié)同組合以及選自基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂、以及碳水化合物，或其任何組合的添加劑成分，以進(jìn)一步增加該組合的低血膽固醇活性。本發(fā)明也包括這些肽單獨(dú)的或與其他化合物結(jié)合的治療用途，可用于降低血液中的總膽固醇濃度，并且特別地減少LDL-膽固醇濃度，抑制心血管疾病的發(fā)展。
油體是包裹儲(chǔ)藏的三?；视王サ男〉?、球形的亞細(xì)胞器，是許多植物所使用的能量儲(chǔ)備。盡管在大多植物和不同的組織中發(fā)現(xiàn)，它們?cè)诤头N子的種子中特別豐富，但是它們通常的大小范圍為直徑1微米-幾微米。油體一般由三?；视王ズ椭車闹鞍缀偷鞍踪|(zhì)組成?！坝腕w締合蛋白質(zhì)”包括與油體物理上相關(guān)的任何以及所有的這些蛋白質(zhì)和脂蛋白。在植物中，主要的油體締合蛋白質(zhì)是油質(zhì)蛋白。已經(jīng)從許多植物來源，包括谷物、油菜籽、胡蘿卜和棉花克隆并且測(cè)序了油質(zhì)蛋白。來自不同種屬的油質(zhì)蛋白一般是高度保守的。
I.縮寫和定義為了有助于理解本發(fā)明，在此所使用的許多術(shù)語和縮寫如下定義HMF＝高分子量級(jí)分如在此所使用的，“高分子量級(jí)分”是指水解或化學(xué)性消化該分離物后的保留的植物蛋白質(zhì)分離物的級(jí)分，其可通過于pH 6-7在4,000-10,000×g離心15-20分鐘而分離。
如在此所使用的，“添加化合物”總體地是指被加入本發(fā)明的組合物的單個(gè)化合物或一組化合物。這些化合物選自皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物。
如在此所使用的，使用術(shù)語“氨基酸”的廣義，并且包括天然存在的氨基酸以及非天然存在的氨基酸，包括氨基酸類似物和衍生物。后者包括包含氨基酸部分的分子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到，鑒于該廣闊的定義，在此所參考的氨基酸包括，例如天然存在的蛋白質(zhì)性的L-氨基酸；D-氨基酸；化學(xué)上修飾的氨基酸，例如氨基酸類似物和衍生物；天然存在的非蛋白質(zhì)性的氨基酸，例如正亮氨酸，(β-丙氨酸，鳥氨酸等；以及具有本領(lǐng)域已知的表現(xiàn)氨基酸特征特性的化學(xué)上合成的化合物。如在此所使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)性的”表明氨基酸可能在細(xì)胞中通過代謝途徑被整合到肽、多肽，或蛋白質(zhì)中。
如在此所使用的，術(shù)語“藥物學(xué)上可接受的鹽”包括通常用于形成堿金屬鹽和游離酸或游離堿的加成鹽的鹽。如果它是藥物學(xué)上可接受的，鹽的特性不是決定性的。
如在此所使用的，“分泌序列”或“信號(hào)肽”或“信號(hào)序列”是指，指導(dǎo)重新合成分泌蛋白或膜蛋白到達(dá)并且通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜，或穿過細(xì)菌內(nèi)膜從胞質(zhì)到周質(zhì)，或從線粒體基質(zhì)到內(nèi)部空間，或從葉綠體基質(zhì)到囊片中的序列。這種序列與將在異源宿主中表達(dá)的基因的融合體確保該重組蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞分泌出來。
如在此所使用的，“多肽”和“寡肽”是可互換使用的，并且指至少2個(gè)氨基酸通過肽鍵連接在一起的聚合體。
如在此所使用的，“序列”指線性序列，其中單體存在于聚合體中，例如，多肽中氨基酸的順序或多核苷酸中核苷酸的順序。
如在此所使用的，“粉碎的完整大豆”包括，例如，由薄片或磨碎的完整大豆形成的大豆物質(zhì)，包括大豆的外皮和胚。粉碎的完整大豆物質(zhì)可包含大豆固有的脂肪或可能是脫脂的。
如在此所使用的，“大豆細(xì)粉”包括，例如，在無水分基礎(chǔ)上，包含小于65％重量的大豆蛋白質(zhì)含量的大豆物質(zhì)，其由去皮的大豆組成并且具有150微米或更小的平均顆粒大小。術(shù)語“大豆細(xì)粉”可包括，例如，豆奶粉。大豆細(xì)粉可包含大豆固有的脂肪或可能是脫脂的。
如在此所使用的，“大豆?！卑?，例如，在無水分基礎(chǔ)上包含小于65％重量的大豆蛋白質(zhì)含量的大豆物質(zhì)，其由去皮的大豆組成并且具有150微米-1000微米的平均顆粒大小。大豆?？砂蠖构逃械闹净蚩赡苁敲撝摹?br> 如在此所使用的，“大豆粗粉”包括，例如，在無水分基礎(chǔ)上包含小于65％重量的大豆蛋白質(zhì)含量的大豆物質(zhì)，其由去皮的大豆組成，其不屬于大豆細(xì)粉或大豆細(xì)粒的定義內(nèi)。大豆粗粉可包含大豆固有的脂肪或可能是脫脂的。
如在此所使用的，“大豆片”包括，例如，大豆蛋白質(zhì)物質(zhì)是在無水分基礎(chǔ)上包含小于65％重量的大豆蛋白質(zhì)含量的由薄片去皮大豆形成的薄片狀大豆物質(zhì)。大豆片可能包含大豆固有的脂肪或可能是脫脂的。
如在此所使用的，“大豆蛋白質(zhì)濃縮物”包括，例如，從高質(zhì)量完整的、干凈去皮的大豆種子制備的大豆蛋白質(zhì)物質(zhì)。大豆蛋白質(zhì)濃縮物可通過除去大部分的油和水可溶解的非蛋白成份來制備并且在無水分基礎(chǔ)上一般包含不少于65％的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“大豆蛋白質(zhì)濃縮物”也可以被解釋成另外包括大豆蛋白質(zhì)和磷脂的混合物，其中在無水分基基礎(chǔ)上的總的蛋白質(zhì)在大約65-大約90％的蛋白質(zhì)之間。一般地，這由去皮的脫脂大豆通過3個(gè)基本的步驟制備酸浸泡(大約pH 4.5)，用醇提取(大約55-80％)，并且在用水提取前用濕熱變性蛋白質(zhì)。低水溶性的(含水醇提取法)大豆蛋白質(zhì)濃縮物受到加熱(蒸汽注入或噴氣蒸煮)和機(jī)械加工(均化作用)以提高溶解度和功能性。當(dāng)涉及大豆蛋白質(zhì)和磷脂的混合物，其中在無水分基礎(chǔ)上的總的蛋白質(zhì)是65-90％蛋白質(zhì)，這種物質(zhì)可通過組合大豆蛋白質(zhì)分離物和磷脂或通過分餾來自大豆的磷脂蛋白質(zhì)復(fù)合物而制備(即，油體蛋白質(zhì)和締合的磷脂)。術(shù)語“大豆蛋白質(zhì)濃縮物”可包括，例如，豆奶粉。
如在此所使用的，“大豆蛋白質(zhì)提取物”包括，例如，在某些大豆蛋白質(zhì)中富集的大豆蛋白質(zhì)濃縮物或分離物。從完整的大豆蛋白質(zhì)物質(zhì)分餾的大豆蛋白質(zhì)物質(zhì)可例如從大豆蛋白質(zhì)配料廢物或乳清流(醇或酸性水提取步驟)制備。
如在此所使用的，“大豆蛋白質(zhì)分離物”包括，例如，大豆蛋白質(zhì)物質(zhì)，它是從去皮大豆通過除去大部分非蛋白質(zhì)的化合物而制備的大豆的主要蛋白質(zhì)級(jí)分，優(yōu)選地在不含水分基礎(chǔ)上不包含小于90％蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，“大豆蛋白質(zhì)分離物”也可被解釋成另外包括某些類型的大豆蛋白質(zhì)例如，例如，β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白和油質(zhì)蛋白，或備選地缺乏某些類型的大豆蛋白質(zhì)，例如油質(zhì)蛋白中富集的大豆蛋白質(zhì)物質(zhì)。一般從未加熱的脫脂大豆片用水或溫和的堿，在8-9的pH范圍內(nèi)提取蛋白質(zhì)，然后通過離心除去不溶的纖維狀殘基；調(diào)節(jié)所得到的提取物到pH 4.5，其中大部分的蛋白質(zhì)沉淀物是凝塊；通過離心從可溶解的低聚糖分離凝塊，然后是多次洗滌，用氫氧化鈉或氫氧化鉀中和(以使其更易溶解和更有功能)，加熱處理(例如利用噴氣-蒸煮)和噴霧干燥。在熱處理步驟前加入蛋白酶也可用于部分水解蛋白質(zhì)并且增加大豆蛋白質(zhì)分離物的溶解度。
如在此所使用的，“肽”和“蛋白質(zhì)”是可互換使用的，并且指由通過肽鍵方式連接的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的化合物。
如在此所使用的“重組蛋白質(zhì)”指不管是否包括天然或突變的主要氨基酸序列的蛋白質(zhì)，是通過在除了其中基因和/或蛋白質(zhì)是天然存在的細(xì)胞中表達(dá)攜帶重組DNA分子的基因獲得的。換言之，該基因是與其表達(dá)的宿主異源的。應(yīng)該注意到基因的任何變化，包括加入編碼基因的親合純化部分的多核苷酸，使得基因相對(duì)于該定義的目的是非自然的，并且因此該基因不是在任何細(xì)胞中“天然地”存在的。
如在此所使用的，“靶序列”指在蛋白質(zhì)或肽的范圍內(nèi)，“靶序列”指編碼氨基酸序列的核苷酸序列，其存在導(dǎo)致蛋白質(zhì)導(dǎo)向細(xì)胞內(nèi)特定的目的地。
短語“治療-有效的”表明該試劑能夠預(yù)防或改善疾病的嚴(yán)重度，同時(shí)避免一般與替代療法相關(guān)的不良副作用。可以理解短語“治療-有效的”相當(dāng)于短語“有效用于治療或預(yù)防的”，并且都是用來限定，例如，用于本發(fā)明方法的組合物的數(shù)量，其可實(shí)現(xiàn)降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)防所述的疾病，同時(shí)避免一般與替代療法相關(guān)的不良副作用的目的。
II.本發(fā)明的多肽申請(qǐng)人已經(jīng)鑒定分離了來自大豆物質(zhì)，更具體地來自具有低血膽固醇活性的大豆物質(zhì)的HMF的多肽的序列。這些序列編碼來自大豆球蛋白或β-伴大豆球蛋白的肽。蛋白質(zhì)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是種子貯藏的蛋白質(zhì)。大豆球蛋白具有320千道爾頓(“kDa”)的近似分子量并且由6個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基由酸性的和堿性的亞基組成。此外，β-伴大豆球蛋白具有150kDa的近似分子量，并且由3個(gè)不同的亞基(α，α′，和β)以不同的比例組成。大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白類型的蛋白質(zhì)在不同的植物品種中是高度保守的。
因此本發(fā)明的一個(gè)方面，包括來自大豆球蛋白蛋白質(zhì)的一個(gè)到幾個(gè)分離的多肽或多肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離多肽的序列在SEQID NO 1中提供并且相應(yīng)于VFDGELQEGRVLIVPQNFVVAARSQSDNFEYVSFK。
本發(fā)明的又一個(gè)方面提供來自β-伴大豆球蛋白蛋白質(zhì)的一個(gè)到幾個(gè)分離的多肽或多肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離多肽的序列在SEQ ID NO2中提供，并且相應(yīng)于LRMITLAIPVNKPGRFESFFL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離多肽的序列在SEQ ID NO3中提供，并且相應(yīng)于IFVIPAGYPVVVNATSHLNFFAIGI。在另一實(shí)施方案中，分離多肽的序列在SEQ ID NO4中提供，并且相應(yīng)于LQESVIVEISKK。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離多肽的序列在SEQ ID NO5中提供，并且相應(yīng)于QQQEEQPLEVRK。在另一實(shí)施方案中，分離多肽的序列在SEQ ID NO6中提供，并且相應(yīng)于NQYGHVR。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離多肽的序列在SEQ ID NO7中提供，并且相應(yīng)于AIVILVINEGDANIELVGL。在另一實(shí)施方案中，分離多肽的序列在SEQ ID NO8中提供，并且相應(yīng)于NILEASYDTKFEEINK。在另一實(shí)施方案中，分離多肽的序列在SEQ ID NO11中提供，并且相應(yīng)于IFVIPAGYPVVVNATSDLNFFAFGI。
申請(qǐng)人也已經(jīng)鑒定了表明有低血膽固醇活性的油質(zhì)蛋白的序列。油質(zhì)蛋白主要是在植物油體的膜成分中發(fā)現(xiàn)的。油質(zhì)蛋白蛋白質(zhì)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成；蛋白質(zhì)的2個(gè)末端，N-和C-末端，基本上是親水的并且保留在油體暴露于細(xì)胞液的表面上，同時(shí)油質(zhì)蛋白高度疏水的中部核心穩(wěn)固地錨定在膜和三?；视王?nèi)。油質(zhì)蛋白在C-末端或其附近也包含兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)域。來自不同種屬的油質(zhì)蛋白代表蛋白質(zhì)的一個(gè)小家族，其顯示相當(dāng)多的氨基酸序列保守區(qū)，特別是在蛋白質(zhì)的中心區(qū)域。在個(gè)別的種屬內(nèi)可能存在少量不同的同工型。
因此本發(fā)明的另一個(gè)方面，包括來自油質(zhì)蛋白蛋白質(zhì)的一個(gè)到幾個(gè)分離的多肽或多肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，油質(zhì)蛋白是來自大豆的P24同工型A(P89)(登記號(hào)P29530；SEQ ID NO12)，其相應(yīng)于圖1。在另一實(shí)施方案中，油質(zhì)蛋白是來自大豆的P24同工型B(P91)(登記號(hào)P29531；SEQ ID NO13)，其相應(yīng)于圖2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，油質(zhì)蛋白是來自玉米(玉米屬)的油體締合蛋白質(zhì)17kDa油質(zhì)蛋白(oleo17)(登記號(hào)AAA68066；SEQ ID NO14)，其相應(yīng)于圖3。在另一實(shí)施方案中，油質(zhì)蛋白是來自玉米(玉米屬)的油體蛋白質(zhì)16kDa油質(zhì)蛋白(oleo16)(登記號(hào)AAA68065；SEQ ID NO15)，其相應(yīng)于圖4。在另一實(shí)施方案中，油質(zhì)蛋白是來自玉米(玉米屬)的油質(zhì)蛋白KD18(KD18；L2)(登記號(hào)AAA67699；SEQ ID NO16)，其相應(yīng)于圖5。在另一個(gè)實(shí)施方案中，油質(zhì)蛋白是向日葵油質(zhì)蛋白(向日葵)(登記號(hào)CAA55348；SEQ ID NO17)，其相應(yīng)于圖6。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，分離的油質(zhì)蛋白多肽的序列在SEQ ID NO9中提供，并且相應(yīng)于VKFITAATIGITLLLL。在另一實(shí)施方案中，分離的油質(zhì)蛋白多肽的序列在SEQ ID NO10中提供，并且相應(yīng)于YETNSSLNNPPSR。
本發(fā)明也包括與油質(zhì)蛋白和SEQ ID NOs12、13、14、15、16、17的序列具有90％，優(yōu)選95％，更優(yōu)選97％，以及更優(yōu)選99％的序列同源性的多肽。本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案提供與SEQ ID NO1-11的任何一個(gè)序列具有90％，優(yōu)選95％，更優(yōu)選97％，以及更優(yōu)選99％的序列同源性的多肽。
“同源性”，如本領(lǐng)域中所很好理解的，是通過比較序列所確定的兩個(gè)或多個(gè)多肽序列或兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同源性”也指通過這種序列符號(hào)串之間的匹配所確定的多肽或多核苷酸序列之間序列相關(guān)的程度?！巴葱浴笨赏ㄟ^已知的方法輕易地計(jì)算，包括但不限于在Computational Molecular Biology，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，1993；Computer Analysis of Sequence Data，部分I，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology，1987；Sequence AnalysisPrimer，1991；以及Carillo和Lipman，1988中所描述的方法。確定同源性的方法是設(shè)計(jì)成能給出待測(cè)試序列之間的最大匹配。此外，確定同源性的方法編集成公眾可利用的程序。可用于確定2個(gè)序列之間的相同性/同源性的計(jì)算機(jī)程序包括但不限于，GCG(Devereux等人，1984)；一套5個(gè)的BLAST程序，3個(gè)設(shè)計(jì)用于核苷酸序列查詢(BLASTN，BLASTX和TBLASTX)以及2個(gè)設(shè)計(jì)用于蛋白質(zhì)序列查詢(BLASTP和TBLASTN)(Coulson，1994；Birren等人，1997)。BLASTX程序是公眾可從NCBI和其他來源得到的(BLAST Manual；Altschul等人，1990)。還可使用公知的Smith Waterman算法確定同源性。
本發(fā)明也涉及分離的蛋白質(zhì)。如在此所使用的，術(shù)語蛋白質(zhì)包括大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白或油質(zhì)蛋白蛋白質(zhì)的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是天然的蛋白質(zhì)、重組蛋白質(zhì)或合成蛋白或多肽。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道改變肽、多肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列可導(dǎo)致同等物或可能改進(jìn)的子二代肽等，當(dāng)與原始的氨基酸序列相比時(shí)，其顯示同等的或更高的功能特性。本發(fā)明因此包括這種改變的氨基酸序列。改變可包括氨基酸插入、缺失、替換、截短、融合體、亞基序列的重組等，條件是通過這種改變產(chǎn)生的肽序列具有與在此所公開的天然存在的對(duì)應(yīng)序列基本上相同的功能特性。生物活性或功能可通過例如，如在下列實(shí)施例中所表明的蛋白質(zhì)降低總的血清膽固醇的能力而確定。
在產(chǎn)生這種變化時(shí)可考慮的一個(gè)因素是氨基酸的親水指數(shù)。在賦予蛋白質(zhì)相互作用的生物功能中，親水的氨基酸指數(shù)的重要性已經(jīng)由Kyte和Doolittle(1982)論述。公認(rèn)氨基酸的相對(duì)親水特性促進(jìn)合成的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。這依次影響蛋白質(zhì)與例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等分子的相互作用。
根據(jù)其疏水性和電荷特性，各個(gè)氨基酸的親水指數(shù)已經(jīng)指定如下異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷氨酸鹽/天冬氨酸/天冬酰胺酸(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
如本領(lǐng)域已知的，肽或蛋白質(zhì)中的某些氨基酸可被其他具有相似親水指數(shù)或積分的氨基酸置換，并且產(chǎn)生具有相似生物活性的合成肽或蛋白質(zhì)，即仍然保持生物功能。在產(chǎn)生這種變化時(shí)，優(yōu)選親水指數(shù)為±2之內(nèi)的氨基酸彼此置換。更優(yōu)選置換是其中氨基酸親水指數(shù)在±1之內(nèi)的氨基酸。最優(yōu)選置換是其中氨基酸親水指數(shù)在±0.5之內(nèi)的氨基酸。
類似的氨基酸還可根據(jù)親水性被置換。美國專利號(hào)4,554,101公開了蛋白質(zhì)的最大的局部平均親水性取決于其鄰近氨基酸的親水性，與蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)有關(guān)。下列親水性的值已經(jīng)指定到氨基酸精氨酸/賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸鹽/谷氨酸鹽(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸/異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。因此，肽、多肽或蛋白質(zhì)中的一種氨基酸可被另一個(gè)具有相似親水性積分的氨基酸置換并且仍然產(chǎn)生具有相似生物活性，即仍然保持正確的生物功能的合成蛋白質(zhì)。在產(chǎn)生這種變化時(shí)，親水指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸優(yōu)選相互置換，親水指數(shù)在±1之內(nèi)的氨基酸是更優(yōu)選的，而親水指數(shù)在±0.5之內(nèi)的氨基酸是最優(yōu)選的。
如上述所論述的，本發(fā)明的肽中氨基酸的置換可取決于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。為了產(chǎn)生導(dǎo)致所提供的肽內(nèi)沉默變化的保守氨基酸變化，考慮到多種上述特征的例證性的置換可選自天然存在的氨基酸所屬分類的其他成員。氨基酸可被分成下列四組(1)酸性氨基酸；(2)堿性氨基酸；(3)中性的極性氨基酸；和(4)中性的非極性氨基酸。這些各個(gè)組內(nèi)的代表性氨基酸包括但不限于(1)酸性(帶負(fù)電荷的)氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性(帶正電荷的)氨基酸，例如精氨酸、組氨酸和賴氨酸；(3)中性的極性氨基酸，例如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天門冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性的非極性氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。應(yīng)該注意到不被預(yù)期為有益的變化，如果其可導(dǎo)致生產(chǎn)功能性的序列，也可以是有用的。
術(shù)語蛋白質(zhì)也包括已經(jīng)加入了一種或多種取代基團(tuán)的蛋白質(zhì)形式。取代是通過置換另一個(gè)原子或原子團(tuán)而被引入分子的原子或原子團(tuán)。這種基團(tuán)包括但不限于脂類、磷酸基、糖和碳水化合物。因此，術(shù)語蛋白質(zhì)包括，例如脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白和磷脂蛋白。
III.本發(fā)明的組合物和方法本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用于治療或預(yù)防心血管疾病的組合物。一個(gè)實(shí)施方案中的組合物包括已經(jīng)加入了分離的油體締合蛋白質(zhì)的以植物為基礎(chǔ)的食品。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，食品是以大豆為基礎(chǔ)的。在另一實(shí)施方案中，組合物包括分離的大豆物質(zhì)、分離的油體締合蛋白質(zhì)和至少一種選自由基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物組成的添加化合物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，分離的油體締合蛋白質(zhì)可以是分離自植物蛋白的純化級(jí)分。例如，分離的油體締合蛋白質(zhì)可以相對(duì)于天然的植物蛋白富集1、10、100、200、1000或以上倍。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以富集分離的油體締合蛋白質(zhì)，為的是相對(duì)于，例如純化級(jí)分如HMF油體締合蛋白質(zhì)被富集1、5、10、50或100以上倍。
用于本發(fā)明的分離大豆物質(zhì)可從任何大豆植物制備和分離，達(dá)到分離的大豆物質(zhì)包含為了使該分離大豆物質(zhì)顯示所需要的低血膽固醇活性所必需的成分的程度。分離的大豆物質(zhì)可包括，例如，粉碎的完整大豆、大豆細(xì)粉、豆奶粉、大豆粒、大豆粗粉、大豆片、大豆?jié)饪s物、大豆蛋白質(zhì)分離物和大豆蛋白質(zhì)提取物。在一個(gè)實(shí)施方案中，大豆物質(zhì)是大豆?jié)饪s物。在另一實(shí)施方案中，大豆物質(zhì)是大豆蛋白質(zhì)的分離物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，大豆物質(zhì)是大豆蛋白質(zhì)的提取物。本領(lǐng)域已知的任何方法，包括在此詳述的方法，可用于分離特定的大豆物質(zhì)。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供富含某些大豆蛋白質(zhì)或肽，例如β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白和油質(zhì)蛋白的分離的大豆物質(zhì)。這些大豆物質(zhì)可從分離物、濃縮物或從分離物和濃縮物產(chǎn)品的廢液制備。它們還可從具有改進(jìn)的蛋白質(zhì)組成的大豆制備，例如具有兩倍于正常水平的β-伴大豆球蛋白和低水平的大豆球蛋白的大豆(例如在美國專利號(hào)6,171,640中所描述的)。
食物制品對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是眾所周知的。就大豆來說，常見的食品用途包括但不限于，例如種子、豆芽、烘焙大豆的產(chǎn)品，用于各種烘焙產(chǎn)品的全脂大豆細(xì)粉，用作糕餅、大豆果仁醬、大豆咖啡的烘烤大豆，以及其他東方食品的大豆衍生物。大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)物(例如，粗粉)，可分為兼?zhèn)涫称?飼料以及工業(yè)用途的大豆細(xì)粉濃縮物和分離物。大豆細(xì)粉和顆粒經(jīng)常用于肉類補(bǔ)充劑和類似物、寵畜食品、焙烤食品配料和其他食品產(chǎn)品的制造。從大豆細(xì)粉和分離物制備的食品產(chǎn)品包括嬰兒食品、糖果產(chǎn)品、谷類、食品飲料、面條、發(fā)酵粉、啤酒、麥芽酒等。
在本發(fā)明的某些方面，向缺乏、或包含低量的某些種類，例如油質(zhì)蛋白的大豆蛋白質(zhì)的分離的大豆物質(zhì)，添加例如油質(zhì)蛋白的油體締合蛋白質(zhì)，從而改善或恢復(fù)大豆蛋白質(zhì)或大豆蛋白質(zhì)組合物的低血膽固醇特性。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，加入油體締合蛋白質(zhì)達(dá)到大約0.5％、1％、3％、5％、10％、20％以上重量的終濃度，包括在這些濃度內(nèi)的所有中間范圍。根據(jù)特定的應(yīng)用，沒有油質(zhì)蛋白或具有降低量的油質(zhì)蛋白的大豆物質(zhì)可能是高度有益的。例如，油質(zhì)蛋白可能被認(rèn)為是不合需要的，因?yàn)樗鼈兿拗屏孙L(fēng)味，導(dǎo)致大豆食品的風(fēng)味品質(zhì)相對(duì)較差。此外，油質(zhì)蛋白也是不易溶解的，并且當(dāng)脫脂豆奶分散在水中時(shí)導(dǎo)致較大的顆粒級(jí)分。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過讓包含油質(zhì)蛋白的大顆粒級(jí)分在槽中沉淀或通過利用超濾膜而除去油質(zhì)蛋白。備選地，可在pH 2.8，在存在硫酸鈉和氯化鈣時(shí)從大豆蛋白質(zhì)分離物中沉淀油質(zhì)蛋白(Samoto等人，1998)。
本發(fā)明也包括包含分離的大豆物質(zhì)和分離的油體締合蛋白質(zhì)的組合物，其中分離的大豆物質(zhì)是大豆蛋白質(zhì)分離物的高分子量級(jí)分(“HMF”)。用于本發(fā)明的任何組合物的HMF可從任何植物蛋白的分離物制備和分離，其中該植物蛋白分離物天然存在，達(dá)到該級(jí)分具有所需要的低血膽固醇活性的程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，HMF從大豆蛋白質(zhì)來源制備。可從中制備HMF的一般的大豆物質(zhì)包括大豆、去皮大豆、大豆粗粉、大豆細(xì)粉、大豆粒、豆奶粉、大豆片(全脂和脫脂的)、大豆糖漿、大豆蛋白質(zhì)濃縮物、大豆乳清、大豆乳清蛋白和大豆蛋白質(zhì)分離物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HMF是從大豆蛋白質(zhì)分離物制備的。
為了制備HMF，所選擇的植物蛋白分離物受到水解性或化學(xué)性的消化。用于該消化過程的一般試劑包括胃蛋白酶或微生物的蛋白酶。一般地，例如，將大豆蛋白質(zhì)與胃蛋白酶一起孵育13-17hrs，(水相中的0.2％NaCl，38℃，pH 1.1)，胃蛋白酶是大豆蛋白質(zhì)分離物的0.5-5％)，于90℃熱處理20分鐘使胃蛋白酶失活，在冰上冷卻，用Na2CO3調(diào)節(jié)pH為6-7，并且于4,500g離心20分鐘。然后可用水洗滌該沉淀顆粒3次并鑒定。使用胃蛋白酶的其他方法是本領(lǐng)域公知的。
微生物的蛋白酶，例如可以是Sumizyme FP(黑曲霉(Aspergillusniger)蛋白酶，酶活性48800U/gm，ShinNippon Kagaku KabushikiKaisha)并且與大豆蛋白質(zhì)于60℃孵育5hrs。當(dāng)使用這種溶液，不用調(diào)節(jié)pH，而是用水稀釋溶液。然后于10,000×g進(jìn)行離心10分鐘。再收集沉淀物并鑒定。附加的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Hori等人(1999)。
然后通過本領(lǐng)域通常已知的任何方式從消化的植物蛋白分離物中分離HMF。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過離心分離HMF。一般地，可例如通過干燥(例如，冷凍干燥)用微生物蛋白酶或胃蛋白酶(蛋白酶是總蛋白的0.5-6％)處理并且于30-70℃孵育大豆蛋白質(zhì)分離物的水懸浮物離心后的級(jí)分1-20小時(shí)，進(jìn)行分離步驟。附加的方法是本領(lǐng)域公知的。參見，Nagoako等人，(1999)。
此外，分離自HMF的任何肽都可用于本發(fā)明的組合物并達(dá)到該肽具有所需的低血膽固醇活性的程度。然而一般地，用于組合物的肽是至少10個(gè)氨基酸殘基的長度，更一般地是大約10至大約100個(gè)氨基酸殘基長度，并且最一般地是大約30-80個(gè)氨基酸殘基的長度。一般說來，在自然界中肽是基本上疏水的，具有大約超過30的重量百分?jǐn)?shù)到優(yōu)選大約超過35的重量百分?jǐn)?shù)的疏水氨基酸組成成分。此外，所使用的肽可具有0、1或更多個(gè)兩親性的區(qū)域。另外，所使用的肽可具有疏水性表面或疏水性的區(qū)域，其不是由于一系列疏水的氨基酸，而是由于肽的螺旋結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供包括分離自大豆物質(zhì)的分離大豆多肽的組合物，其中大豆多肽包括β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白。β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的結(jié)構(gòu)在上面有詳細(xì)描述，并且關(guān)于它們結(jié)構(gòu)的詳述由Utsumi等人(1997)提供。申請(qǐng)人不受限于單個(gè)理論，相信這些肽具有低血膽固醇活性，因?yàn)樗鼈兡軌蛎庥谙⑶冶晃盏窖髦谢蚪Y(jié)合膽汁酸。同樣是有益的，盡管是不需要的，在β-伴大豆球蛋白內(nèi)存在兩親性的α-螺旋區(qū)域。不限制于應(yīng)用任何單個(gè)理論，相信兩親性α-螺旋區(qū)域的存在是有益的，因?yàn)樗纬纱龠M(jìn)與各種賦予低血膽固醇活性的重要受體位點(diǎn)相互作用的疏水性表面。
另外，并且申請(qǐng)人不限制于任何單個(gè)的理論，本發(fā)明的鑒定的多肽也可作為結(jié)腸中有益細(xì)菌的氮源。這些細(xì)菌能因此產(chǎn)生短鏈脂肪酸，例如正面影響脂類代謝的丙酸。短鏈脂肪酸抑制肝中脂肪酸的合成，降低甘油三酯分泌的比率以及減少肝性膽固醇的合成。本發(fā)明的一方面是利用大豆蛋白質(zhì)多肽促進(jìn)結(jié)腸中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生并且減少血清膽固醇和甘油三酯。未消化的大豆多肽促進(jìn)結(jié)腸中有益細(xì)菌生長的有效性可能在存在未消化的碳水化合物，例如為人類結(jié)腸的微生物群提供重要燃料的高直鏈玉米淀粉時(shí)是最顯著的。因此本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是大豆多肽配料與未消化的碳水化合物源的組合以優(yōu)化多肽對(duì)血清膽固醇和甘油三酯的有益作用。
因此本發(fā)明的一個(gè)方面，提供具有分離自β伴大豆球蛋白的特異多肽的組合物。一般說來，這些多肽序列相應(yīng)于SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ IDNO11的氨基酸序列中的任何一個(gè)。這些序列可通過一種方法從β-伴大豆球蛋白中分離，例如該方法包括(1)大豆物質(zhì)的酶促水解，然后是例如通過離心分離高分子量的級(jí)分，或(2)大豆物質(zhì)的酶解，然后進(jìn)一步通過超濾膜、離子交換樹脂柱和凝膠過濾柱色譜法進(jìn)行純化，給出大約200至大約5,000千道爾頓分子量范圍的肽(參見，例如，在Yamauchi和Suetsuna(1993)中詳述的方法)。肽可進(jìn)一步通過使用離子交換色譜(Chen等人，1995)分級(jí)。備選地，不是從特定的β-伴大豆球蛋白亞基中分離個(gè)別的序列，而是利用具有兩倍于正常水平的β-伴大豆球蛋白的大豆和僅僅從大豆分離的β-伴大豆球蛋白分離序列也是可能的。同樣地，利用其中只表達(dá)特定的β-伴大豆球蛋白亞基以獲得該亞基的天然制品的相同胚質(zhì)也是可能的。然后在腸道中通過胃蛋白酶和胰酶水解消耗該天然制品后產(chǎn)生活性肽，或使用微生物酶在成分制造期間獲得活性肽。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中提供包括與油質(zhì)蛋白制品組合的β伴大豆球蛋白的特定亞基的粗制品的組合物。
本發(fā)明的另一方面提供具有分離自大豆球蛋白的特異多肽的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中該組合物包含分離自大豆球蛋白堿性亞基的多肽。在另一實(shí)施方案中，該組合物包括分離自大豆球蛋白B-lb亞基的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包括分離自大豆球蛋白，相應(yīng)于SEQID NO1的氨基酸序列的肽。一般地大豆球蛋白利用本領(lǐng)域公知的分離方法分離自蛋白質(zhì)源。這些分離方法的實(shí)例是用于分離如上述列出的其他蛋白分離物的方法。
本發(fā)明的組合物一般也包含油體締合蛋白質(zhì)。如在此所使用的，術(shù)語“油體締合蛋白質(zhì)”包括與油體結(jié)構(gòu)或胞內(nèi)脂類顆粒物理上相關(guān)的任何蛋白質(zhì)、脂蛋白或肽。一般說來，來自例如植物、哺乳動(dòng)物、非哺乳動(dòng)物細(xì)胞、藻類和酵母種屬的大多數(shù)真核細(xì)胞包含胞內(nèi)脂類顆粒。這些顆粒被稱為脂質(zhì)體、脂質(zhì)小滴或，特別是在植物中根據(jù)種屬的不同，被稱為油體、油質(zhì)體或圓球體。真核細(xì)胞的脂類顆粒由中性脂類的高度疏水核心，主要為甘油三酯和/或固醇酯，由磷脂單細(xì)胞層與少量包埋的蛋白質(zhì)圍繞組成。分離自玉米的油體的典型組合物是三酰基甘油(95％)、二?；视?4％)、磷脂(0.9％)和蛋白質(zhì)(1.4％)。
可在本發(fā)明的組合物中使用的一般的油體締合蛋白質(zhì)包括油體蛋白質(zhì)，例如脫輔基蛋白形式的油質(zhì)蛋白，或脂蛋白以及與油體締合的34-kD的大豆種子貯藏液泡蛋白質(zhì)。因此本發(fā)明的一個(gè)方面提供包括分離的大豆物質(zhì)和分離自油體締合蛋白質(zhì)的肽的組合物，其中該肽是油質(zhì)蛋白或來自油質(zhì)蛋白的肽片段。油質(zhì)蛋白可由P24油質(zhì)蛋白同工型A(P89)，登記號(hào)P29530的序列表示，如SEQ ID NO12所提供的，并且相應(yīng)于圖1；P24油質(zhì)蛋白同工型B(P91)，登記號(hào)P29531，如SEQID NO13所提供的，并且相應(yīng)于圖2；油體締合蛋白質(zhì)17kDa油質(zhì)蛋白(oleo17)，登記號(hào)AAA68066，如SEQ ID NO14所提供的，并且相應(yīng)于圖3；油體蛋白質(zhì)16kDa油質(zhì)蛋白(oleo16)，登記號(hào)AAA68065，如SEQ ID NO15所提供的，并且相應(yīng)于圖4；油質(zhì)蛋白KD18(KD18；L2)登記號(hào)AAA67699，如SEQ ID NO 16所提供的，并且相應(yīng)于圖5；以及向日葵油質(zhì)蛋白，登記號(hào)CAA55348，如SEQ ID NO17所提供的，并且相應(yīng)于圖6。更一般地，用于組合物的肽來自于分子量近似為17千道爾頓的低分子量油質(zhì)蛋白。在某些實(shí)施方案中，肽來自于油質(zhì)蛋白，并且相應(yīng)于SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的氨基酸序列。
用于本發(fā)明組合物的油質(zhì)蛋白肽可分離自完整的油體。因此，完整的油體可從作為油體締合蛋白質(zhì)源的種子分離。例如在WO 00/30602中，提供了所能使用的方法和種子類型的列表。用于制備油體的方法也在日本專利申請(qǐng)公開號(hào)2002-101820中有描述。油可用二乙醚從油體中提取，使分界面物質(zhì)(油質(zhì)蛋白和磷脂)留在含水的級(jí)分中。磷脂可利用氯仿/甲醇(2∶1，vol/vol)或其他合適的有機(jī)溶劑提取。特別地，油質(zhì)蛋白以聚集的級(jí)分形式分離(Tzen和Huang 1992)。此外，如果存在高pH提取法，則可用于除去P34蛋白質(zhì)。P34蛋白質(zhì)具有低于6.5的等電點(diǎn)pH，因此，可在高pH中溶解，其中油質(zhì)蛋白具有其自己的等電點(diǎn)pH并且沉淀下來。
油質(zhì)蛋白也可分離自浸水的完整大豆或來自脫脂大豆粉。油質(zhì)蛋白可利用本領(lǐng)域公知的分離方法分離自蛋白質(zhì)源。這些分離方法的實(shí)例是如上述所列出的，用于從脫脂大豆粉分離油質(zhì)蛋白的方法。另一個(gè)實(shí)例是從完整的大豆分離油質(zhì)蛋白(JP 2002-101820)。油質(zhì)蛋白的另外來源包括植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞(Leber等人，1994)、細(xì)菌細(xì)胞(Pieper-Fürst等人，1994)和藻類細(xì)胞(Roessler，1988)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，油質(zhì)蛋白是從植物細(xì)胞獲得的，包括來自花粉、孢子、種子和營養(yǎng)體植物器官的細(xì)胞，其中存在油質(zhì)蛋白或油體類細(xì)胞器(Huang，1992)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的油質(zhì)蛋白從植物種子獲得，并且最優(yōu)選地植物品種包括油菜籽(蕓苔屬Brassicaspp)、大豆(Glycine max)、向日葵(Helianthus annuus)、油棕(Elaeis guineeis)、棉籽(Gossypium spp)、落花生(Arachishypogaea)、椰子(Cocus nucifera)、蓖麻(Ricinus cummunis)、紅花(Carthamus tinctorius)、芥菜(蕓苔屬和白芥sinapis alba)、芫荽(Coriandrum sativum)、squach(筍瓜Cucurbita maxima)、lineseed/亞麻(Lihum usitatissumum)、巴西果(Bertholletiaexcelsa)、希蒙德木(Simmondsia chinensis)、玉米(Zea mays)、海甘藍(lán)(Crambe abyssinica)，以及毛蟲(Eruca sativa)。
本發(fā)明的另一方面包括包含分離的大豆物質(zhì)和分離自其中肽是脂蛋白的油體締合蛋白質(zhì)的肽的組合物。脂蛋白是在動(dòng)物和植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的中性脂類、磷脂和蛋白質(zhì)的非共價(jià)的、非化學(xué)計(jì)量的顆粒復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂蛋白是哺乳動(dòng)物脂蛋白。在另一實(shí)施方案中，脂蛋白是蛋黃脂蛋白(關(guān)于蛋黃結(jié)構(gòu)的評(píng)述，參見實(shí)施例，Bringe(1997)，其內(nèi)容由此引入作為參考)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脂蛋白包含脂肪球蛋白的膜蛋白。
脂蛋白可利用本領(lǐng)域公知的方法分離自油體締合蛋白質(zhì)來源。這些分離方法的實(shí)例是如上述所列出的，用于從脫脂大豆粉分離油體蛋白質(zhì)或油質(zhì)蛋白的方法。此外，蛋黃脂蛋白可利用本領(lǐng)域公知的分離方法分離自油體締合蛋白質(zhì)來源。
這些分離方法的實(shí)例是，蛋黃脂蛋白可通過利用超臨界狀態(tài)的二氧化碳提取甘油三酯和膽固醇而分離(參見實(shí)施例，Bringe和Cheng，1995)。本發(fā)明進(jìn)一步的方面提供包含與油體締合蛋白質(zhì)和添加化合物結(jié)合的大豆物質(zhì)的組合物。添加化合物可包括治療性地增強(qiáng)該組合物的任何化合物。然而一般地，添加化合物選自基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物。一般說來，不受任何特別的理論的約束，相信這些添加化合物基本上通過預(yù)防分離的大豆物質(zhì)中降低膽固醇的多肽的消化而增強(qiáng)組合物的低血膽固醇活性。由于這些特性，本發(fā)明的添加化合物增加組合物的治療能力。因此在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可具有上述鑒定的特異添加成分與分離大豆物質(zhì)和分離油體締合蛋白質(zhì)組合的任何組合。
因此在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可包括一種到幾種皂角苷作為添加化合物。皂角苷可通過任何已知的方法分離自其天然存在的植物來源，例如Gurfinkel等人(2002)的方法，或可通過任何已知的方法合成制備。皂角苷適合用于本發(fā)明，達(dá)到使所選擇的化合物能增強(qiáng)組合物用作為低血膽固醇試劑的特性的程度。然而一般地，所使用的皂角苷分離自例如紫花苜?；虼蠖怪参锏亩诡?，或來自燕麥或其他植物的種子。更一般地，皂角苷分離自大豆種子，以及具體地可分離自大豆胚。皂角苷的來源包括，例如，大豆、皂樹屬、苜蓿和皂樹soapwart。大豆皂角苷包括例如，皂角苷A、B、E，和皂草精醇A、B和E。
此外本發(fā)明的組合物可包括一種到幾種植物雌激素作為添加化合物。植物雌激素可通過任何已知的方法分離自其天然存在的植物來源，例如美國專利號(hào)5,855,892或WO 00/30663中所詳述的方法，或可通過任何已知的方法合成制備。任何植物雌激素適合于在本發(fā)明中使用，達(dá)到所選擇的化合物增強(qiáng)該組合物用作低血膽固醇試劑的特性的程度。一般地，用于組合物的植物雌激素是異黃酮。更一般地，異黃酮是染料木黃酮、大豆黃酮(包括其代謝物o-去甲安格拉紫檀素、二氫claidzein和牛尿酚)、雞豆黃素A、芒柄花黃素及其各自天然存在于大豆或三葉草中的糖苷和糖苷共軛物。
本發(fā)明的組合物也可包括一種到幾種磷脂作為添加化合物。磷脂可來自各種來源，但一般分離自例如種子，并且更一般地來自大豆植物的含油種子。這些磷脂包括卵磷脂和溶血卵磷脂。另外，可使用具有改進(jìn)的脂肪酸成分的磷脂。這種磷脂可以是酶改進(jìn)的大豆磷脂。酶改進(jìn)的磷脂可例如從大豆磷脂(SLP；真卵磷脂，Mie，日本)通過用磷脂酶A2(Novo工業(yè)，Bagsvaerd，丹麥)處理而制備(Nagaoka，等人，1999)。另外，具有改進(jìn)的脂肪酸成份的磷脂可從已經(jīng)被遺傳改變以產(chǎn)生具有改進(jìn)脂肪酸成份的磷脂的植物或植物種子獲得。具有改進(jìn)的脂肪酸成份的磷脂的實(shí)例是具有改進(jìn)的脂肪酸成份的卵磷脂。本領(lǐng)域公知的其他方法也可用于改進(jìn)磷脂的脂肪酸成份。
另外，本發(fā)明的組合物也可包括一種到幾種碳水化合物。任何碳水化合物可在本發(fā)明的組合物中使用，達(dá)到使所選擇的化合物增強(qiáng)該組合物用作低血膽固醇試劑的特性的程度。然而一般地，所使用的碳水化合物是基本上抗消化的碳水化合物。如在此所使用的，當(dāng)用于描述碳水化合物時(shí)，“基本上抗消化”在本領(lǐng)域中定義為，一般是指例如，碳水化合物大于大約70％抗消化，優(yōu)選大于大約80％抗消化，以及更優(yōu)選大于大約90％抗消化。一般說來，直鏈淀粉或纖維中富含的碳水化合物是特別適用于該組合物的。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，組合物中所使用的碳水化合物是高直鏈淀粉、低聚果糖或大豆子葉纖維。此外，實(shí)施方案是例如，物理上難接近的淀粉(部分碾碎的谷粒和種子)、抗性的顆粒(生的馬鈴薯、未成熟的香蕉、一些豆類和高直鏈淀粉)、退行性淀粉(蒸煮并冷卻的馬鈴薯、面包和玉米片)，以及化學(xué)上改性的淀粉(醚化的、酯化的或交聯(lián)的淀粉(用于加工食品))(Topping和Clifton，2001)。
在存在或缺少至少一種添加化合物時(shí)，分離大豆物質(zhì)和分離油體締合蛋白質(zhì)的任何組合可組合形成本發(fā)明的組合物。下列表1，例如說明用于組合物的不同實(shí)施方案的許多一般配方。
表1.組合物的配方
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物具有的分離大豆物質(zhì)的含量不少于組合物重量的50％，并且油體締合蛋白質(zhì)含量不少于組合物重量的0.5％。然而更優(yōu)選地，組合物具有的分離大豆物質(zhì)含量不少于組合物重量的大約70-大約90％，并且油體締合蛋白質(zhì)含量占組合物重量的大約1至大約5％。當(dāng)出現(xiàn)時(shí)，添加化合物例如異黃酮或皂角苷化合物一般包含不少于10mg/100g組合物，并且可進(jìn)一步包含大約30-300mg的添加化合物/100g組合物。此外，當(dāng)出現(xiàn)時(shí)，添加化合物例如基本上抗消化的磷脂或碳水化合物一般占不少于組合物重量的2％并且可進(jìn)一步占組合物重量的大約10-50％。
本發(fā)明的組合物可作為預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化和血管疾病的試劑而施用于哺乳動(dòng)物。更具體地說，本發(fā)明的組合物可施用于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地用于人類，以降低總的血清膽固醇濃度，降低低密度脂蛋白的濃度，提高高密度脂蛋白的濃度，降低肝中膽固醇的濃度，并且降低血清甘油三酯的濃度。一般說來，不結(jié)合任何特別的理論，相信本發(fā)明的組合物通過預(yù)防膽固醇的吸收，基本上抑制膽汁酸的再吸收和/或可用作哺乳動(dòng)物結(jié)腸中細(xì)菌的氮源而發(fā)揮它們的低血膽固醇活性。
IV.藥物組合物和給藥可以把本發(fā)明的任何組合物配制為藥物或營養(yǎng)組合物。這種組合物可通過口服、非腸胃方式，通過吸入噴霧、直腸、皮內(nèi)地方式、透過皮膚或局部給藥，以包含所需要的常規(guī)無毒性的藥物學(xué)上可接受的載體、輔劑和載體的劑量單位劑型給藥。局部的給藥也可包括使用透過皮膚起作用的給藥，例如透過皮膚起作用的小塊或離子電滲裝置。如在此所使用的，術(shù)語非腸胃方式的包括皮下的、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)的、或胸骨內(nèi)的注射或輸注技術(shù)。藥物的劑型在例如Remington′sPharmaceutical Sciences，(1975)，以及Liberman和Lachman(1980)中有論述。
可注射的制劑，例如，無菌可注射的含水或油質(zhì)的懸浮體，可根據(jù)本領(lǐng)域已知的，利用合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑配制。無菌可注射的制劑也可以是在無毒性的非腸胃方式的可接受的稀釋劑或溶劑，例如，1，3-丁二醇溶液中的無菌可注射溶液或懸浮液?？墒褂玫目山邮茌d體和溶劑是水、Ringer′s溶液和等滲的氯化鈉溶液。此外，通常使用無菌的固定油類作為溶劑或懸浮介質(zhì)。為此目的，可使用任何溫和的固定油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于可注射的制劑中。可使用二甲基乙酰胺、表面活性劑包括離子的和非離子的洗滌劑，以及聚乙二醇。例如上述討論到的溶劑和潤濕劑的混合物也是有用的。
在此論述的用于化合物的直腸給藥的栓劑可通過混合活化劑和合適的無刺激性賦形劑，例如可可脂、合成的單、二或三酸甘油酯、脂肪酸或聚乙二醇而制備，它們?cè)诔叵率枪腆w，但在直腸溫度下是液體，并且因此能在直腸中融化并釋放藥物。
用于口服的固體劑型可包括膠囊劑、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。在這種固體劑型中，本發(fā)明的化合物通常與一種或多種適于指明給藥途徑的輔劑混和。如果口服給藥，該化合物可與乳糖、蔗糖、淀粉、鏈烷酸的纖維素酯、纖維素烷基酯、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉鹽和鈣鹽、白明膠、阿拉伯樹膠、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、和/或聚乙烯醇混合，然后壓成片劑或裝入膠囊用于方便的給藥。這種膠囊劑或片劑可包含可控制釋放的劑型，例如可以以活性化合物在羥丙基甲基纖維素中的分散相體形式提供。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，劑型還可以包括例如檸檬酸鈉或碳酸鈣或碳酸鎂或碳酸氫鹽的緩沖劑。片劑和丸劑可另外用腸溶衣制備。
為了治療的目的，用于非腸胃方式給藥的劑型可以是含水的或無水的等滲無菌注射溶液或懸浮液的形式。這些溶液和懸浮液可從無菌的粉末或具有一種或多種所提到的供口服劑型之用的載體或稀釋劑的顆粒劑制備?；衔锟扇苡谒?、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化鈉和/或各種的緩沖液。其他的輔劑和給藥模式是藥物學(xué)領(lǐng)域中非常普遍已知的。
用于口服的液體劑型可包括藥物學(xué)上可接受的包含本領(lǐng)域通常所使用的，惰性稀釋劑例如水的乳劑、溶液、懸浮液、糖漿以及酏劑。這種組合物還可包括輔劑，例如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑，以及甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑。
所施用的治療性活性化合物的數(shù)量和使用本發(fā)明的化合物和/或組合物治療心血管疾病狀況的劑量方案取決于多種因素，包括受試個(gè)體的年齡、重量、性別和醫(yī)學(xué)狀況、疾病的嚴(yán)重程度、給藥的途徑和頻率，以及所使用的特定化合物并因此可廣泛地變化。通?？山邮艿暮陀行У拿咳談┝靠梢允敲咳沾蠹s0.1-大約6000mg/Kg體重，更一般地為每日大約100-大約2500mg/Kg，以及最優(yōu)選地為每日大約200-大約1200mg/Kg。
提供上面的發(fā)明詳述是為了幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。即使如此，該發(fā)明詳述不應(yīng)被視為不適當(dāng)?shù)南拗票景l(fā)明，正如在此所論述的實(shí)施方案中的改變和變化可通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員產(chǎn)生，而不背離本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)的精神或范圍。
在本申請(qǐng)中所引用的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)和其他參考文獻(xiàn)在此全部引入作為參考，正如單獨(dú)的出版物、專利、專利申請(qǐng)或其他參考文獻(xiàn)被具體地并且分別地指明引入作為參考。
不用進(jìn)一步地詳細(xì)描述，相信本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠利用在前的說明書，最大程度地應(yīng)用本發(fā)明。因此下列優(yōu)選的具體實(shí)施方案僅僅被認(rèn)為是例證性的，而不是以任何方式限制所公開的其余內(nèi)容。
V.實(shí)施例實(shí)施例1來自大豆蛋白質(zhì)的HMF的鑒定存在于大豆蛋白質(zhì)HMF中的多肽具有有效降低膽固醇的特性(參見實(shí)施例2)。進(jìn)行研究以鑒定這些多肽的源點(diǎn)和部分序列。所使用的方法如下A.聚丙烯酰胺凝膠電泳。
根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳方法。本發(fā)明使用幾種不同的方法，如下進(jìn)行B.Tris-甘氨酸十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)通過冷凍完整的或磨碎的大豆制備用于分析的大豆蛋白質(zhì)樣品，將其在研缽中粉碎(粉碎不是為大豆蛋白質(zhì)分離物所必需的)，并且利用0.03M Tris，0.01M 2-巰基乙醇在pH＝8.0，于室溫下提取蛋白質(zhì)1hr。制備這些蛋白質(zhì)的4mg/ml的SDS溶解溶液(0.0625M Tris，2.3％SDS，5％β-巰基乙醇，10％甘油，pH6.8，微量的溴酚藍(lán)作為示蹤染料)。在70℃加熱樣品10分鐘，冷卻5分鐘，然后離心沉淀不溶的物質(zhì)。將5μL(20μg)的各個(gè)樣品上清液加載到10-20％總的丙烯酰胺凝膠上(如Laemmli(1970)所描述的)并通過在每凝膠15-30mA(恒定電流)或60-100伏(恒電壓)下電泳分離。當(dāng)示蹤染料在凝膠底部的2mm內(nèi)時(shí)終止電泳。SYPRO橙可代替Malone等人，(2001)中的第2種方法后的考馬斯。
C.通過NuPAGE凝膠電泳分析SDS-PAGE利用4×NuPAGE LDS樣品緩沖液(NOVEX目錄號(hào)NP0003，以1/4的樣品體積和1/10樣品體積的500mM二硫蘇糖醇，如Tris甘氨酸SDS-PAGE小節(jié)中所詳述的制備樣品。將4μL(16μg)的各個(gè)樣品上清液加載到Novex 4-12％丙烯酰胺Bis-Tris凝膠上。用NuPAGE MES電泳緩沖液(50mM MES，50mM Tris，3.5mM SDS，1.025mM EDTA，pH＝7.7)充滿Novex Xcell2小凝膠槽，并通過在200伏(恒壓)下電泳直到示蹤染料到達(dá)凝膠底部的齒縫而分離蛋白質(zhì)。如在Tris-甘氨酸SDS-PAGE方案中所詳述的對(duì)凝膠染色。
D.大豆蛋白質(zhì)的2-D PAGE如在Tris-甘氨酸SDS-PAGE小節(jié)中所詳述的提取大豆蛋白質(zhì)。補(bǔ)充樣品使其包含8M尿素，2％CHAPS，0.35％二硫蘇糖醇，0.2％兩性電解質(zhì)和15％異丙醇，達(dá)到包含0.6-1.05mg總蛋白的450μL的終體積。利用430μL的該溶液使18cm的pH3-10固定的pH梯度(IPG)的干膠條再溶脹24-30小時(shí)(再溶脹時(shí)用礦物油覆蓋膠條)。利用水浸的電極膠條，使用下列電壓斜線上升的方法聚焦IPG膠條(用礦物油覆蓋)50,000-70,000伏-小時(shí)。從在100伏(v)1hr開始，然后在200v 1hr，在400v 2hrs，在400-10000伏的線性斜坡電壓中14hrs，然后達(dá)到在10000伏48hrs以達(dá)到最后的伏-小時(shí)總數(shù)。在1.5mL的樣品平衡溶液(62.5mM Tris，2.3％SDS，5％ 2-巰基乙醇，pH6.8，以及微量的溴酚藍(lán)作為示蹤染料)中浸泡各個(gè)IPG膠條3.5分鐘。排干膠條，然后將每個(gè)放置在10-20％的丙烯酰胺Tris甘氨酸凝膠上，利用平衡溶液中的熱的1％瓊脂糖將其原位封閉。進(jìn)行第二維的凝膠電泳，并且如Tris-甘氨酸SDS-PAGE小節(jié)中所詳述的對(duì)其染色。
E.蛋白質(zhì)在丙烯酰胺凝膠中的原位胰酶消化切下凝膠條帶或斑點(diǎn)，將其放置在1500μl硅化的微離心管中。用50％的甲醇洗滌兩次(每次洗滌30分鐘)以除去染料。在50％的乙腈(在200mM乙酸銨pH＝8.0中)中平衡凝膠片段15分鐘。重復(fù)洗滌兩次。100％乙腈洗滌15分鐘，然后在Speedvac中蒸干。利用20μg/mL測(cè)序級(jí)的改進(jìn)的胰蛋白酶(Promega目錄號(hào)V5111)在200mM乙酸銨pH-8.0的10％乙腈中，于37℃胰蛋白酶作用16-20hrs。用50％的乙腈、0.1％的三氟乙酸(TFA)，用Nutator攪動(dòng)提取肽20分鐘。利用乙酸銨中的80％乙腈0.1％TFA重復(fù)提取20分鐘。重復(fù)最后的提取30分鐘。合并所有的上清液并在Speed-vac中干燥提取物。
F.胰酶消化條帶以提供存在于給定條帶中的多肽的胰蛋白酶化多肽。
為了提供存在于給定條帶中的多肽的胰蛋白酶化多肽，根據(jù)下列方法在凝膠中進(jìn)行胰蛋白酶消化條帶1)切下凝膠斑點(diǎn)，使得任何片段的最大尺寸小于1mm。將凝膠塊放置在1500μl硅化的微離心管中。
2)用50％的甲醇洗滌凝膠塊(每管200μl)2次以上(每次洗滌30分鐘)以除去染色劑。考馬斯染色的凝膠可能要附加洗滌次數(shù)以除去染色劑。凝膠塊可保存在該溶液中。使用Nutator攪動(dòng)試管。
3)在200μl 50％的乙腈(在200mM乙酸銨中，pH＝8.0-用NH40H調(diào)節(jié))中洗滌凝膠塊兩次，每次洗滌15分鐘，然后另外洗滌一次30分鐘。使用Nutator攪動(dòng)。
4)用100％的乙腈洗滌15分鐘。
5)從凝膠塊除去溶液并且在Speedvac中蒸干(15分鐘)。
6)通過加入1ml的10％乙腈(在200mM NH4OAc中，pH7.8-8.3-用NH4OH調(diào)節(jié))到20μg胰蛋白酶的小瓶中來制備胰蛋白酶的保存液。(使用Promega測(cè)序級(jí)改進(jìn)的胰蛋白酶-目錄號(hào)V5111)。
7)通過加入剛好足夠覆蓋各個(gè)試管中的凝膠塊的胰蛋白酶溶液消化蛋白質(zhì)。一般地，20μl是足夠的。
8)于37℃孵育凝膠塊16-20小時(shí)。
9)冷卻試管到室溫，并且微離心試管以使水分到達(dá)底部。
10)用200μl 50％的乙腈、0.1％的三氟乙酸(TFA)，用Nutator攪動(dòng)，提取肽20分鐘。
11)分別保留各個(gè)試管的上清液，然后使用200μl的80％乙腈、0.1％的TFA，用Nutator攪動(dòng)，再提取15分鐘。
12)保留上清液，加入先前保留的各個(gè)試管，然后使用200μl 80％的乙腈、0.1％ TFA，在Nutator上攪動(dòng)，最后一次提取30分鐘。
13)保留上清液，并且加入先前保留的各個(gè)試管。在Speed-vac中干燥提取物。
G.MALDI-TOF分析將來自條帶的胰蛋白酶化多肽利用激光解吸(用于MALDI)或電噴射(用于LC/MS和LC/MS/MS)電離以產(chǎn)生質(zhì)譜。利用MALDI作為混合物對(duì)肽的質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量；沒有胰蛋白酶化肽的分離。利用略有改進(jìn)的已發(fā)表的方法(Shevchenko等人，1996)制備樣品用于MALDI分析。通過向各個(gè)包含干燥肽的試管加入10μl的0.1％TFA恢復(fù)樣品。通過將10mg/ml的硝化纖維素和20mg/ml的α-氰基-4-羥基肉桂酸溶解于1∶1(v∶v)的丙酮與異丙醇的混合物制備基質(zhì)。通過將0.5μl的基質(zhì)溶液遞送到MALDI平板上使基質(zhì)成點(diǎn)。類似地，將來自各個(gè)樣品的1μl樣品放置到成點(diǎn)的基質(zhì)上。容許樣品在基質(zhì)上干燥大約10分鐘以保證肽結(jié)合硝化纖維素。最后，通過將5μl的5％甲酸沉淀到各個(gè)斑點(diǎn)上并且立即使用真空管吸除該溶液進(jìn)行3次水性洗滌。然后將MALDI樣板移動(dòng)到質(zhì)譜儀用于MALDI質(zhì)譜分析。利用Voyager DE-STR(Perseptive生物系統(tǒng)，F(xiàn)ramingham，MA)以反射的模式收集數(shù)據(jù)。利用已知的胰蛋白酶自溶峰值內(nèi)部校準(zhǔn)該譜。產(chǎn)生胰蛋白酶化肽的質(zhì)量的峰值列表，并且針對(duì)NCBI非冗余的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫利用MS-Fit搜索工具搜索以鑒定該蛋白質(zhì)(Clauser等人，(1999)。
有時(shí)，匹配是“不明確的”并且需要證實(shí)，或數(shù)據(jù)是微弱的或根本沒有顯著的匹配。在這些情況下，使用納LC/MS/MS。在該方法中，將消化的混合物注射到反相柱上以使得肽分離并且一次一個(gè)(或至少一次一對(duì)偶聯(lián))地被引入質(zhì)譜儀(在該情況下為電噴射的串聯(lián)質(zhì)譜儀)。質(zhì)譜儀測(cè)量肽的質(zhì)量，通過濾掉一切別的東西分離最多量的物質(zhì)，并且將肽發(fā)送到碰撞測(cè)定池中，其中該肽碰撞氬氣。肽趨向于在酰胺鍵附近破裂成碎片，所以該片段能表現(xiàn)出氨基酸序列。裂解數(shù)據(jù)可被送到數(shù)據(jù)庫搜索工具，其將該數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫相匹配。它使用胰蛋白酶化肽的部分序列和初始質(zhì)量來得到匹配?？衫酶咧眯哦鹊膯我灰鹊鞍酌富牡腗S/MS數(shù)據(jù)鑒定蛋白質(zhì)。
H.納HPLC使用納HPLC從純化的蛋白質(zhì)(通過電泳純化)分離胰蛋白酶化片段，以使得一次只將一個(gè)(或一些)肽引入電噴射的串聯(lián)質(zhì)譜儀。將樣品注入到裝備有自動(dòng)取樣器、梯度和輔助泵的CapLC(Waters，Milord，MA)系統(tǒng)。將5微升經(jīng)“微升撿拾”模式注射并且通過300μm×5mm的C18截留柱(LC Packings，San Francisco，CA)即時(shí)脫鹽。樣品在高流速(30μL/min)下脫鹽3分鐘。在引入質(zhì)譜儀前，在100μm×150mm的Magic C18柱(Michrom BioResources，Auburn，CA)上分離肽。使用一般從低到高有機(jī)的反相梯度超過大約30分鐘。流動(dòng)相A是0.1％的甲酸而B是100％的乙腈，0.1％的甲酸。流速也隨有機(jī)的流動(dòng)相線性增加。該系統(tǒng)使用小的分流，產(chǎn)生大約300-700nL/min的柱流速。
I.MS/MS分析和數(shù)據(jù)處理對(duì)于LC/MS/MS，有分離的步驟(反相LC)，以使得胰蛋白酶的肽一次一個(gè)地被引入質(zhì)譜儀(理論上)。它被稱為MS/MS，或串聯(lián)的MS，因?yàn)槭紫葴y(cè)量肽的質(zhì)量，其次測(cè)量該肽的片段的質(zhì)量。胰蛋白酶化的肽通過與穩(wěn)態(tài)的氣體(Ar)碰撞而成碎片并且測(cè)量片段的質(zhì)量。這可能經(jīng)常給出至少部分的肽序列。在Q-Tof質(zhì)譜儀(Micromass，Beverly，MA)上進(jìn)行數(shù)據(jù)依賴的MS/MS研究。入口是被設(shè)計(jì)成能保持兆分之一尖的改進(jìn)的納噴射源(New Objective，劍橋，MA)。根據(jù)肽的質(zhì)量和電荷狀態(tài)確定用于CAD的碰撞能量。通過ProteinLynx版本3.4(Micromass，Beverly，MA)處理數(shù)據(jù)以產(chǎn)生峰值列表文件。利用搜索引擎MASCOT(Matrix Science，倫敦，英國)針對(duì)NCBI非冗余的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫搜索數(shù)據(jù)。搜索引擎報(bào)告上端的20個(gè)記錄。將不與該數(shù)據(jù)庫中的任何條目相配的序列數(shù)據(jù)針對(duì)NCBI的dbEST數(shù)據(jù)庫以及內(nèi)部生成序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索。
J.研究1利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離來自被稱為富含OBAP的大豆蛋白質(zhì)分離物的HMF。將包含多肽的5個(gè)條帶或凝膠區(qū)域進(jìn)行胰蛋白酶作用并且利用質(zhì)譜法分析氨基酸序列(圖7)。鑒定了條帶的起源如Table 2中所示
表2.
*同時(shí)對(duì)齊大豆球蛋白序列以確定G1大豆球蛋白(72296，AlaBx前體)(SEQ ID NO1)的堿性亞基的殘基401-435(VFDGELQEGRVLIVPQNFVVAARSQSDNFEYVSFK)(SEQ ID NO1)A VFDGELQEGR和SQSDNFEYVSFKB 與A中的2個(gè)相同，加上VLIVPQNFVVAARK.研究2上述推定的油質(zhì)蛋白序列與已知的油質(zhì)蛋白序列不相配。低分子量的大豆油質(zhì)蛋白(～18kDa)的序列不是已知的。下列研究的目的是確定上述“推定的油質(zhì)蛋白”序列是否來自于18kDa的大豆油質(zhì)蛋白。在聚丙烯酰胺凝膠上純化和分離油體締合蛋白質(zhì)(p34蛋白質(zhì)和油質(zhì)蛋白)(圖8)。胰蛋白酶化該條帶并且通過MS分析。
在分離自HMF的12kDa條帶中證實(shí)存在胰蛋白酶化的肽，其從油質(zhì)蛋白右側(cè)緊鄰疏水結(jié)構(gòu)域的兩親性的N-末端區(qū)域釋放。每個(gè)氨基酸的平均質(zhì)量是111.1道爾頓。因此，12kDa肽中氨基酸的數(shù)目是大約108個(gè)氨基酸。因此，在HMF中發(fā)現(xiàn)的肽必須也包含油質(zhì)蛋白的一部分疏水結(jié)構(gòu)域。序列YETNNSSLNNPPSR(SEQ ID NO10)表示推定的油質(zhì)蛋白的殘基33-45，其剛好落在蛋白質(zhì)疏水核心區(qū)域的開始部分前。
結(jié)果證實(shí)序列YETNSSLNNPPSR(SEQ ID NO10)是在低分子量的大豆油質(zhì)蛋白中發(fā)現(xiàn)的。
表3.
L.研究3在研究1中表征的HMF由具有小的β-伴大豆球蛋白的大豆蛋白質(zhì)級(jí)分組成。這有助于鑒定存在于HMF中的大豆球蛋白亞基。進(jìn)行下列研究確定(如果有的話)可能在HMF中鑒定出什么β-伴大豆球蛋白序列。使用缺乏G1大豆球蛋白的大豆產(chǎn)生大豆蛋白質(zhì)分離物并且用胃蛋白酶消化該分離物以產(chǎn)生HMF。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離HMF(圖9)并且將該條帶用胰蛋白酶作用并且利用MS表征。
結(jié)果確定來自β-伴大豆球蛋白的多肽序列。
表4.
*前體α-主要的β-伴大豆球蛋白(121286)QNPSHNKCLR(SEQ ID NO18)，和下列4191814中的序列。
*β-伴大豆球蛋白(4191814)的α-主要的亞基NQYGHVR(SEQ ID NO6)，和下列7442025中的序列。
*β-伴大豆球蛋白的α亞基(7442025)NILEASYDTKFEEINK(SEQ ID NO8)，LQESVIVEISKK(SEQ ID NO4)，QQQEEQPLEVRK(SEQ ID NO5)實(shí)施例2HMF對(duì)膽固醇攝取的作用Caco-2細(xì)胞系來源于人結(jié)腸直腸癌并且通常用于研究腸內(nèi)上皮細(xì)胞的生理學(xué)。這些細(xì)胞已經(jīng)用于研究膽固醇、葡萄糖、氨基酸、維生素、脂肪酸、膽汁酸和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)過程(Hidalgo等人，1989)；Artursson，1990；Homan和Hamelehle，1998)。這些細(xì)胞表達(dá)脂類和固醇代謝酶以及調(diào)節(jié)類似于腸細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Levy等人，1995)。此外，已知它們表達(dá)SR-B1，最近鑒定的可能在膽固醇吸收中起作用的蛋白質(zhì)(Werder等人，2001)以及ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)家族中的多種蛋白質(zhì)，也在經(jīng)腸內(nèi)上皮細(xì)胞的膽固醇攝取的調(diào)節(jié)網(wǎng)中起一定作用(Taipalensuu等人，2001)。
大豆蛋白質(zhì)是HMF的來源。簡要地，將大豆蛋白質(zhì)與胃蛋白酶孵育17小時(shí)(在水相中0.2％NaCl，38℃，pH1.1，胃蛋白酶占大豆蛋白質(zhì)分離物的5％)，在90℃加熱處理20分鐘以使胃蛋白酶失活，在冰上冷卻，用0.2M的Na2CO3調(diào)節(jié)pH到6.21并在4,500g離心20分鐘。將該沉淀顆粒用水洗滌3次并且確定為HMF。
A.培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞用于膽固醇吸收分析1.用鼠尾膠原按如下方式預(yù)涂層96-孔Costar固體空白的組織-培養(yǎng)處理平板(Costar #_3917)a)在0.02N的乙酸中制備20μg/ml的鼠尾膠原溶液(BectonDickinson/Collaborative Biomedical產(chǎn)品目錄號(hào)40236)0.02N乙酸加入11.5ml的17.4N乙酸/10m無菌的H2O每10ml的0.02N乙酸加入60μl的膠原(3.32mg/ml)b)對(duì)于96孔平板，加入250μl的膠原溶液/孔，并且容許覆蓋薄層在室溫下保持過夜c)用1×250μl的DMEM漂洗各個(gè)孔，然后用100ml的DMEM漂洗2.用10ml無Ca2+和Mgt2+的Dulbeco′s磷酸鹽緩沖鹽水漂洗長到70-80％滿的2個(gè)T-150培養(yǎng)瓶(Costart #430825)的Caco-2細(xì)胞(使用傳代數(shù)目在41和60之間的細(xì)胞)。
3.向各個(gè)培養(yǎng)瓶加入6ml的0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液并且在37℃孵育5-10分鐘。
4.使用10ml移液管將細(xì)胞從T-150培養(yǎng)瓶上洗下并且打碎細(xì)胞凝塊。轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸浮物到50ml的試管中。
5.向細(xì)胞懸液中加入具有10％胎牛血清、1×非必需氨基酸、50mg/ml慶大霉素的12m1完全培養(yǎng)基DMEM，混合并且通過在2000rpm離心5分鐘(Sorvall RT7)沉淀細(xì)胞顆粒。
6.除去培養(yǎng)基并替換為20ml的完全培養(yǎng)基。使用10ml移液管分散細(xì)胞。[2×T 150培養(yǎng)瓶～80％長滿～10×106細(xì)胞]。
7.將細(xì)胞以每孔3200個(gè)細(xì)胞/100μl的密度接種到96孔包涂膠原的微量滴定板中。
8.隔日地用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。接種13天后細(xì)胞將表達(dá)為膽固醇吸收所必需的表面受體。
B.膽固醇吸收分析經(jīng)Caco-2細(xì)胞的微團(tuán)膽固醇的攝取是通過由Field等人(1991)所報(bào)道的改進(jìn)方法進(jìn)行的。我們的方法描述如下1.將待檢測(cè)的能夠在Caco-2細(xì)胞中抑制膽固醇吸收的化合物/肽溶解在DMSO中作為貯備原液。在戊醇中從貯備原液制備待測(cè)化合物的稀釋物。用于Caco-2膽固醇吸收抑制分析的稀釋化合物應(yīng)該比所需要分析的最后稀釋物高出10倍，即吸出孔中的2mM溶液最后可得到200μM用于分析。將二氫谷甾醇用作對(duì)照的膽固醇吸收抑制劑，其最大的抑制在200mM(0％膽固醇吸收調(diào)節(jié))。溶劑只用作100％膽固醇吸收(高dpm)。
2.將對(duì)照和待測(cè)試的化合物/肽的稀釋物一式三份地吸到聚丙烯淺孔的微量滴定板(Sigma M-4029)中。
3.平板在GeneVac儀器中于35℃-45℃的溫度下干燥過夜。在下一步前檢查平板是否完全干燥。
4.在具有隔膜襯里蓋子的Trace-Clean琥珀色小瓶(VWR產(chǎn)品目錄號(hào)15900-036)中如下制備3H-膽固醇微團(tuán)混合物
對(duì)于1.0ml的10×原液微團(tuán)溶液(10×原液微團(tuán)溶液＝50mM?；悄懰猁}、1mM油酸、1mM膽固醇)，加入37.5μl3H-膽固醇(NEN產(chǎn)品目錄號(hào)NET-725)(0.75hmol膽固醇)＝37.5μCi3H-膽固醇(溶液包含0.075％膽固醇作為放射性標(biāo)記＝示蹤)。對(duì)于每個(gè)微滴定分析平板制備1.8ml以供超出之用。
5.將15μl/孔的稀釋劑CH3Cl∶MeOH(1∶1)吸量到干燥平板的所有孔中以溶劑化干燥的殘留物。使用聚丙烯液槽達(dá)此目的并且在冰上保持液槽以最小化溶劑的蒸發(fā)。
6.對(duì)于相同的平板，利用冰上的聚丙烯液槽向各個(gè)孔加入15μl的3H-膽固醇混合物以包含放射性標(biāo)記的溶液。
7.在預(yù)加熱的37℃蒸發(fā)室(VWR)中用氮?dú)鉀_洗干燥平板大約20-30分鐘。
8.用50μl/孔的乙醚漂洗干燥的孔并且在蒸發(fā)室中再干燥。重復(fù)乙醚漂洗多于一次并且干燥。
9.將平板放置在真空干燥器中過夜。
10.利用Quadra 96操作裝置吸量150μl室溫的Hank′s平衡鹽液(HBSS)(Sigma H-8264)到各個(gè)干燥的孔中。微團(tuán)脂類的終濃度如下5mM?；悄懰猁}、100μM油酸、100μM膽固醇和3.75μCi/ml3H-膽固醇(或大約5μM)。
11.用粘性密封帶(Packard TopSeal-A粘合封帶或Sigma聚酯薄膜封帶T-2162)密封平板并且于室溫在Labline平板震蕩器，型號(hào)4625，(設(shè)置＝6)上搖動(dòng)至少30分鐘以溶解微團(tuán)。
12.用HBSS利用自動(dòng)細(xì)胞洗滌儀洗滌接種在96孔平板上的Caco-2細(xì)胞(如上所述)5次。剛好在步驟13前進(jìn)行。在下一步加入微團(tuán)前通過在紙巾上拍打平板除去任何過量的液體。
13.利用Quadra 96操作裝置將100μl溶解的微團(tuán)轉(zhuǎn)遞到適當(dāng)標(biāo)記的Caco-2細(xì)胞平板中。將平板放回37℃的恒溫箱4hr。
14.利用自動(dòng)的細(xì)胞洗滌儀，用冷的HBSS中的1mM?；悄懰猁}((1mM TC)洗滌細(xì)胞5次。
15.利用Quadra 96操作裝置吸量200μl/孔的閃爍混合物(Packard MicroScint 40，產(chǎn)品目錄號(hào)6013641)到細(xì)胞平板中。
16.用熱封帶密封平板(Packard TopSeal-S熱封薄膜)并且搖動(dòng)平板(設(shè)置至少＝6)至少20分鐘以混合發(fā)光物和細(xì)胞樣品。
17.在黑暗中保持平板過夜。
18.利用Packard TopCount NXT儀器計(jì)算dpm。
19.將結(jié)果計(jì)算為占對(duì)照(沒有抑制劑)的％，如下所示 多種來源的大豆HMF顯示出經(jīng)Caco-2細(xì)胞的膽固醇攝取的劑量依賴性抑制(例如，參見圖10)。除β-伴大豆球蛋白測(cè)試外(4.7mg/mL)，需要減少50％膽固醇攝取的HMF的濃度在1.2-2.9mg/mL之間。
實(shí)施例3HMF作用機(jī)理的分子藥理學(xué)表征.
為了確定待測(cè)試化合物/肽是否影響3H-膽固醇在制備用于膽固醇吸收分析的微團(tuán)溶液中的溶解度(參見實(shí)施例2的方法)，進(jìn)行下列分析1.如實(shí)施例2的方法所描述的，至多到并且包括步驟#11來制備微團(tuán)。
2.利用Quadra 96操作裝置將20μl溶解的微團(tuán)轉(zhuǎn)送到不透明的Costar平板(Costar #3917)中。
3.利用Quadra 96操作裝置吸量200μl/孔的閃爍混合物(PackardMicroScint 40，產(chǎn)品目錄號(hào)6013641)到微量滴定板的孔中。
4.用熱封帶(Packard TopSeal-S熱封薄膜)密封平板并且搖動(dòng)平板(設(shè)置至少＝6)至少20分鐘以混合發(fā)光物和微團(tuán)樣品。
5.在黑暗中保持平板過夜。
6.利用Packard TopCount NXT儀器計(jì)算dpm。
7.將結(jié)果計(jì)算為占對(duì)照(沒有抑制劑)的％，如下所示 8.如果待測(cè)試的化合物/肽替代來自微團(tuán)的3H-膽固醇，對(duì)于較高濃度的待測(cè)試化合物/肽，將觀察到待測(cè)試化合物/肽dpm的減小。否則，溶解微團(tuán)中的dpms將在所測(cè)試的待測(cè)試化合物/肽的稀釋范圍內(nèi)保持相當(dāng)?shù)睾愣ā?br> 圖11說明這與經(jīng)二氫谷甾醇抑制膽固醇的主要機(jī)理形成對(duì)比。
實(shí)施例4大豆蛋白質(zhì)HMF的特性比較來自具有低量油體締合蛋白質(zhì)(OBAP(-))，富含油體締合蛋白質(zhì)的級(jí)分(OBAP(+))的大豆蛋白質(zhì)分離物級(jí)分和對(duì)照的HMF的產(chǎn)率。所有這些由相同的大豆(品種A2247)制成。
簡要地，將大豆蛋白質(zhì)的級(jí)分與胃蛋白酶孵育17小時(shí)(水相中的0.2％NaCl，38℃，pH1.4，胃蛋白酶占大豆蛋白質(zhì)分離物的5％)，在90℃熱處理20分鐘使胃蛋白酶失活，在冰上冷卻，用0.2M Na2CO3調(diào)節(jié)pH到6.21并且在4,500g離心20分鐘。用水洗滌沉淀顆粒2次并且冷凍干燥。將干燥的沉淀顆粒的重量與用于確定HMF產(chǎn)率分析的原始數(shù)量的大豆蛋白質(zhì)分離物的重量相比[(最后重量/起始重量)×100]。OBAP(+)和對(duì)照的大豆蛋白質(zhì)樣品都產(chǎn)生HMF。然而，OBAP(-)級(jí)分不產(chǎn)生任何HMF，表明油質(zhì)蛋白和或與油質(zhì)蛋白相關(guān)的成分(例如皂角苷、磷脂)控制大豆蛋白質(zhì)的可消化性。
下列是用于分級(jí)大豆蛋白質(zhì)成為大豆蛋白質(zhì)分離物(SPI)的方法A.方法1OBAP(-)1.將1kg脫脂大豆片(來自Cargill)加入到15kg的去離子水中。用1N的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.5。在室溫下混合1小時(shí)。
2.在10,000g離心混合物10分鐘并收集上清液。
3.將Na2SO4和CaCl2以30mM的濃度分別加入到上清液中。
4.用2N的HCl調(diào)節(jié)步驟3的上清液的pH到pH2.8。10,000g離心混合物10分鐘。收集上清液。
5.用4倍的去離子水(例如，從1L到4L)稀釋上清液(來自步驟4)。用2N的NaOH調(diào)節(jié)pH到4.5。在10,000g離心10分鐘。收集沉淀。
6.再溶解來自步驟5的沉淀物到去離子水中并且用2N的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.5。
7.在入口溫度＝200℃，出口溫度＝90-95℃下，噴霧干燥中和的蛋白質(zhì)混合物。
B.方法2OBAP(+)1.將1kg脫脂大豆片(來自Cargill)加入到15kg的去離子水中。用1N的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.5。在室溫下混合1小時(shí)。
2.在10,0008離心混合物10分鐘并且收集上清液。
3.將Na2SO4和CaCl2以30mM的濃度分別加入到上清液中。
4.用2N的HCl調(diào)節(jié)來自步驟3的上清液的pH到pH2.8。在10,0008離心混合物10分鐘。收集沉淀物。
5.再溶解來自步驟4的沉淀物到去離子水中并且用2N的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.5。
6.在入口溫度＝20O℃，出口溫度＝9O-95℃下，噴霧干燥中和的蛋白質(zhì)混合物。
C.方法3對(duì)照1.將1kg脫脂大豆片(來自Cargill)加入到15kg的去離子水中。用1N的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.5。在室溫下混合1小時(shí)。
2.在10,000g離心混合物10分鐘并收集上清液。
3.用4倍的去離子水(例如，從1L到4L)稀釋上清液(來自步驟2)。用2N的HCl調(diào)節(jié)pH到4.5。在10,000g離心10分鐘。收集沉淀。
4.再溶解來自步驟5的沉淀物到去離子水中并且用2N的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.5。
5.在入口溫度＝200℃，出口溫度＝90-95℃下，噴霧干燥中和的蛋白質(zhì)混合物。
在一個(gè)研究中，樣品的總蛋白質(zhì)含量是OBAP(-)(94.8％)、OBAP(+)(91.8％)以及對(duì)照(68％)(Official Methods of Analysis ofthe AOAC，第16版，1995，990.02，Locator #4.2.08)。確定來自各個(gè)級(jí)分的HMF的產(chǎn)量。結(jié)果證明沒有從OBAP(-)樣品產(chǎn)生HMF(參見表5)。該研究表明OBAP的重要性和/或磷脂的重要性，異黃酮和皂角苷與獲得HMF中的該級(jí)分相關(guān)，盡管油體締合蛋白質(zhì)不構(gòu)成HMF的大部分。
在相同的研究中，OBAP(-)、OBAP(+)和對(duì)照的大豆蛋白質(zhì)分離物的胰蛋白酶抑制劑活性分別是24、31.5和47.5TIU/mg(利用標(biāo)準(zhǔn)的AACC方法，1995，第9版，方法71-10)。這些活性不與樣品的HMF的產(chǎn)率有關(guān)；因此，消除了OBAP(-)分離物中缺乏胰蛋白酶抑制劑活性引起HMF形成的缺乏的可能性。
大豆蛋白質(zhì)樣品的胰凝乳蛋白酶抑制劑的活性不與樣品的HMF的產(chǎn)生有關(guān)(表5)(AACC，第10版，方法22-40)。
表5.每毫克樣品的胰凝乳蛋白酶抑制單位和HMF的產(chǎn)量。
其他的大豆級(jí)分(大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、中間產(chǎn)物)也是在愛荷華州立大學(xué)的中試工廠制備獲得的(15公斤實(shí)驗(yàn)植物方法#2；Wu等人，1999)。這些樣品中的油質(zhì)蛋白的數(shù)值也通過Western印跡利用油質(zhì)蛋白抗體(參見圖12)確定。此外，證實(shí)具有更高量油質(zhì)蛋白的樣品產(chǎn)生更高產(chǎn)量的HMF(表6)。
胃蛋白酶消化的SPI的樣品(OBAP和對(duì)照)、未消化的SPI樣品(對(duì)照、OBAP(-)、OBAP(+))、油體蛋白質(zhì)制劑和對(duì)照大豆IA-2032的磨碎的大豆樣品在18％Tris/甘氨酸凝膠上分辨，并且轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用油質(zhì)蛋白的抗血清探測(cè)這些印跡(圖13)。該抗血清是在兔中利用如QIAexpressionist(QIAGEN公司，Valencia，CA)所描述的在大腸桿菌中過表達(dá)并純化的全長油質(zhì)蛋白而開發(fā)的。這些印跡說明具有更高量油質(zhì)蛋白的樣品產(chǎn)生更高產(chǎn)量的HMF(表6)。
實(shí)施例5用乙醇提取對(duì)HMF產(chǎn)量的影響為了觀察來自磷脂、皂角苷和異黃酮的中間餾分達(dá)到的高產(chǎn)率的程度，利用70％的乙醇從該餾分提取這些成分并且重復(fù)測(cè)試該級(jí)分的HMF產(chǎn)量。結(jié)果是50％的低產(chǎn)量。將提取的級(jí)分加入低產(chǎn)率級(jí)分(大豆球蛋白)有助于改善那些級(jí)分的HMF產(chǎn)量(80％)。這些結(jié)果(參見表6)表明HMF多肽抗蛋白酶消化的能力可能部分地依賴于醇可提取成分，例如皂角苷、異黃酮和磷脂的存在。由上述實(shí)施例產(chǎn)生的結(jié)果也包括與表6一起的概要說明在內(nèi)。由此概要得出的結(jié)論是油質(zhì)蛋白、β-伴大豆球蛋白、醇可提取的物質(zhì)(磷脂、皂角苷、異黃酮)和堿性的大豆球蛋白亞基促進(jìn)HMF的高產(chǎn)量，其可能作為降低膽固醇的物質(zhì)而起作用。最重要的成分是脂蛋白(油質(zhì)蛋白和相關(guān)的磷脂)?？煽紤]到包含β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的大豆蛋白質(zhì)成分的降低膽固醇特性可通過加入植物的脂蛋白(例如，油質(zhì)蛋白相關(guān)的磷脂)或其他來源的脂蛋白(例如，蛋黃脂蛋白)而增強(qiáng)。
表6.源材料和HMF產(chǎn)量的比較
*************在此公開和所要求保護(hù)的所有組合物和方法可按照所公開的內(nèi)容不用過度的實(shí)驗(yàn)而被產(chǎn)生并且實(shí)行。同時(shí)本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng)按照優(yōu)選的實(shí)施方案描述，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的是，可將變化應(yīng)用于在此所描述的組合物和方法，以及方法的步驟或步驟的順序而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體地說，顯然某些化學(xué)上和生理學(xué)上都相關(guān)的因素可能被在此所描述的因素代替而同時(shí)獲得相同或相似的結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的是，所有這類相似的置換和改變被認(rèn)為是在如權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)的。
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<223>人工序列的說明合成的肽<400>1Val Phe Asp Gly Glu Leu Gln Glu Gly Arg Val Leu Ile Val Pro Gln1 5 10 15Asn Phe Val Val Ala Ala Arg Ser Gln Ser Asp Asn Phe Glu Tyr Val20 25 30Ser Phe Lys35<210>2<211>21<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>2Leu Arg Met Ile Thr Leu Ala Ile Pro Val Asn Lys Pro Gly Arg Phe1 5 10 15Glu Ser Phe Phe Leu20<210>3<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>3Ile Phe Val Ile Pro Ala Gly Tyr Pro Val Val Val Asn Ala Thr Ser1 5 10 15His Leu Asn Phe Phe Ala Ile Gly Ile20 25<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>4Leu Gln Glu Ser Val Ile Val Glu Ile Ser Lys Lys1 5 10
<210>5<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>5Gln Gln Gln Glu Glu Gln Pro Leu Glu Val Arg Lys1 5 10<210>6<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>6Asn Gln Tyr Gly His Val Arg1 5<210>7<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>7Ala Ile Val Ile Leu Val Ile Asn Glu Gly Asp Ala Asn Ile Glu Leu1 5 10 15Val Gly Leu
<210>8<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>8Asn Ile Leu Glu Ala Ser Tyr Asp Thr Lys Phe Glu Glu Ile Asn Lys1 5 10 15<210>9<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>9Val Lys Phe Ile Thr Ala Ala Thr Ile Gly Ile Thr Leu Leu Leu Leu1 5 10 15<210>10<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>10Tyr Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Asn Pro Pro Ser Arg1 5 10<210>11
<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>11Ile Phe Val Ile Pro Ala Gly Tyr Pro Val Val Val Asn Ala Thr Ser1 5 10 15Asp Leu Asn Phe Phe Ala Phe Gly Ile20 25<210>12<211>226<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>12Met Thr Thr Gln Val Pro Pro His Ser Val Gln Val His Thr Thr Thr1 5 10 15Thr His Arg Tyr Glu Ala Gly Val Val Pro Pro Gly Ala Arg Phe Glu20 25 30Thr Ser Tyr Glu Ala Gly Val Lys Ala Ala Ser Ile Tyr His Ser Glu35 40 45Arg Gly Pro Thr Thr Ser Gln Val Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Pro50 55 60Val Gly Gly Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Thr65 70 75 80Leu Thr Gly Leu Ala Val Ala Thr Pro Leu Phe Val Leu Phe Ser Pro85 90 95
Val Leu Val Pro Ala Thr Val Ala Ile Gly Leu Ala Val Ala Gly Phe100 105 110Leu Thr Ser Gly Ala Phe Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ser Phe Ser Trp115 120 125Ile Leu Asn Tyr Ile Arg Glu Thr Gln Pro Ala Ser Glu Asn Leu Ala130 135 140Ala Ala Ala Lys His His Leu Ala Glu Ala Ala Glu Tyr Val Gly Gln145 150 155 160Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Asp Ile165 170 175Gln Ser Lys Ala Gln Asp Thr Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg180 185 190Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Lys195 200 205Val Glu Ala Arg Asp Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala210 215 220Thr Ala225<210>13<211>223<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>13Met Thr Thr Val Pro Pro His Ser Val Gln Val His Thr Thr Thr His1 5 10 15Arg Tyr Glu Ala Gly Val Val Pro Pro Ala Arg Phe Glu Ala Pro Arg20 25 30
Tyr Glu Ala Gly Ile Lys Ala Pro Ser Ser Ile Tyr His Ser Glu Arg35 40 45Gly Pro Thr Thr Ser Gln Val Leu Ala Val Val Ala Gly Leu Pro Val50 55 60Gly Gly Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Thr Leu65 70 75 80Thr Gly Leu Val Val Ala Thr Pro Leu Phe Ile Ile Phe Ser Pro Val85 90 95Leu Ile Pro Ala Thr Val Ala Ile Gly Leu Ala Val Ala Gly Phe Leu100 105 110Thr Ser Gly Val Phe Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ser Phe Ser Trp Ile115 120 125Leu Asn Tyr Ile Arg Glu Thr Gln Pro Ala Ser Glu Asn Leu Ala Ala130 135 140Ala Ala Lys His His Leu Ala Glu Ala Ala Glu Tyr Val Gly Gln Lys145 150 155 160Thr Lys Glu Val Gly Gln Lys Thr Lys Glu Val Gly Gln Asp Ile Gln165 170 175Ser Lys Ala Gln Asp Thr Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg Asp180 185 190Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Asp Ala Arg Asp Ala Lys Val Glu Ala195 200 205Arg Asp Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala Thr Ala210 215 220<210>14<211>175<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽
<400>14Met Ala Asp Arg Asp Arg Ser Gly Ile Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Gly1 5 10 15Gln Gln Gln Gly Arg Pro Pro Met Gly Glu Gln Val Lys Gly Met Ile20 25 30His Asp Lys Gly Pro Thr Ala Ser Gln Ala Leu Thr Val Ala Thr Leu35 40 45Phe Pro Leu Gly Gly Leu Leu Leu Val Leu Ser Gly Leu Ala Leu Ala50 55 60Ala Ser Thr Val Gly Leu Ala Val Ala Thr Pro Val Phe Leu Leu Phe65 70 75 80Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Ala Leu Leu Ile Gly Thr Ala Val Ala85 90 95Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Ser Leu100 105 110Thr Cys Leu Ala Asn Thr Ala Arg Gln Ala Phe Gln Arg Thr Pro Asp115 120 125Tyr Val Glu Glu Ala Arg Arg Arg Met Ala Glu Ala Ala Ala His Ala130 135 140Gly His Lys Thr Ala Gln Ala Gly His Gly Ile Gln Ser Lys Ala Gln145 150 155 160Glu Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Gly Gly Gly Arg Thr Ser Ser165 170 175<210>15<211>156<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽
<400>15Met Ala Asp His His Arg Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly1 5 10 15Asp Leu Gln Arg Gly Gly Gly Met His Gly Glu Ala Gln Gln Gln Gln20 25 30Lys Gln Gly Ala Met Met Thr Ala Leu Lys Ala Ala Thr Ala Ala Thr35 40 45Phe Gly Gly Ser Met Leu Val Leu Ser Gly Leu Ile Leu Ala Gly Thr50 55 60Val Ile Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Val Leu Val lle Phe Ser Pro65 70 75 80Val Leu Val Pro Ala Ala Ile Ala Leu Ala Leu Met Ala Ala Gly Phe85 90 95Val Thr Ser Gly Gly Leu Gly Val Ala Ala Leu Ser Val Phe Ser Trp100 105 110Met Tyr Lys Tyr Leu Thr Gly Lys His Pro Pro Ala Ala Asp Gln Leu115 120 125Asp His Ala Lys Ala Arg Leu Ala Ser Lys Ala Arg Asp Val Lys Asp130 135 140Ala Ala Gln His Arg Ile Asp Gln Ala Gln Gly Ser145 150 155<210>16<211>187<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>16
Met Ala Asp Arg Asp Arg Ser Gly Ile Tyr Gly Gly Ala His Ala Thr1 5 10 15Tyr Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gly Gly Gly Gly Arg Pro Met Gly Glu20 25 30Gln Val Lys Lys Gly Met Leu His Asp Lys Gly Pro Thr Ala Ser Gln35 40 45Ala Leu Thr Val Ala Thr Leu Phe Pro Leu Gly Gly Leu Leu Leu Val50 55 60Leu Ser Gly Leu Ala Leu Thr Ala Ser Val Val Gly Leu Ala Val Ala65 70 75 80Thr Pro Val Phe Leu Ile Phle Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Ala Leu85 90 95Leu Ile Gly Thr Ala Val Met Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Leu Gly100 105 110Leu Gly Gly Leu Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Asn Thr Ala Arg Gln115 120 125Ala Phe Gln Arg Thr Pro Asp Tyr Val Glu Glu Ala Arg Arg Arg Met130 135 140Ala Glu Ala Ala Ala Gln Ala Gly His Lys Thr Ala Gln Ala Gly Gln145 150 155 160Ala Ile Gln Gly Arg Ala Gln Glu Ala Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly165 170 175Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Ala Ser Ser180 185<210>17<211>183<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明合成的肽
<400>17Met Ala Thr Thr Thr Tyr Asp Arg His His Val Thr Thr Thr Gln Pro1 5 10 15Gln Tyr Arg His Asp Gln His Thr Gly Asp Arg Leu Thr His Pro Gln20 25 30Arg His Glu Gln Gly Pro Ser Thr Gly Lys Ile Met Val Ile Met Ala35 40 45Leu Leu Pro Ile Thr Gly Ile Leu Phe Gly Leu Ala Gly Ile Thr Ser50 55 60Ser Asp Gly Tyr Arg Ala Ser Leu Ala Thr Pro Leu Phe Val Ile Phe65 70 75 80Ser Pro Val Ile Val Pro Ala Met Ile Ala Ile Gly Leu Ala Val Thr85 90 95Gly Phe Leu Thr Ser Gly Thr Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Leu100 105 110Ser Tyr Leu Phe Asn Met Val Arg Arg Ser Thr Met Ser Val Pro Asp115 120 125Gln Met Asp Tyr Val Lys Gly Lys Leu Gln Asp Val Gly Glu Tyr Thr130 135 140Gly Gln Lys Thr Lys Asp Leu Gly Gln Lys Ile Gln His Thr Ala His145 150 155 160Glu Met Gly Asp Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gly Gly Lys Glu165 170 175Gly Arg Lys Glu Gly Gly Lys180<210>18<211>10<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的說明合成的肽<400>18Gln Asn Pro Ser His Asn Lys Cys Leu Arg1 5 10
權(quán)利要求
1.一種制備食品的方法，包括下列步驟(a)獲得所選擇的食品；以及(b)向該食品中添加分離的油體締合蛋白質(zhì)，其中消耗有效量的該食品降低了需要該食品的受試個(gè)體的血清膽固醇。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括添加至少一種選自基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物的化合物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中油體締合蛋白質(zhì)包括脂蛋白。
4.權(quán)利要求1的方法，其中油體締合蛋白質(zhì)包括油質(zhì)蛋白。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述食品是以大豆為基礎(chǔ)的。
6.權(quán)利要求1的方法，其中在添加的步驟前所述食品缺乏油體締合的本體蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中在添加的步驟前所述食品包括油體締合蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述食品選自大豆細(xì)粉、大豆粒、大豆粗粉、大豆片、豆奶粉、大豆蛋白質(zhì)濃縮物、大豆蛋白質(zhì)分離物和分離的大豆多肽。
9.權(quán)利要求8的方法，其中大豆蛋白質(zhì)分離物是用蛋白酶處理的大豆物質(zhì)的高分子量級(jí)分。
10.權(quán)利要求8的方法，其中分離的大豆多肽包括β-伴大豆球蛋白或其片段。
11.權(quán)利要求8的方法，其中分離的大豆多肽是大豆球蛋白或其片段。
12.用于治療或預(yù)防高膽固醇血癥的組合物包括(a)大豆球蛋白和/或β-伴大豆球蛋白或其片段；和(b)油體締合蛋白質(zhì)，其中大豆球蛋白和/或β-伴大豆球蛋白和油體締合蛋白質(zhì)是以在需要其的受試個(gè)體中提供治療或預(yù)防高膽固醇血癥的協(xié)同效應(yīng)的有效量存在。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中大豆球蛋白或β-伴大豆球蛋白至少部分地受到酶或酶混合物的水解。
14.權(quán)利要求12的組合物，它被定義為包括大豆球蛋白或其片段和純化的油體締合蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求12的組合物，它被定義為包括β-伴大豆球蛋白或其片段和純化的油體締合蛋白質(zhì)。
16.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的組合物包括大約1％至大約5％的油體締合蛋白質(zhì)。
17.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的組合物包括大約5％至大約10％的油體締合蛋白質(zhì)。
18.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的組合物包括大于大約10％的油體締合蛋白質(zhì)。
19.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的組合物包括大約30％至50％的油體締合蛋白質(zhì)。
20.權(quán)利要求12的組合物，進(jìn)一步包括至少一種添加的化合物，其中該添加的化合物選自基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中植物雌激素包括異黃酮。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中異黃酮選自染料木黃酮、二分體玉米醇溶蛋白、牛尿酚、雞豆黃素A、芒柄花黃素及其各自的天然存在的糖苷和糖苷共軛物。
23.權(quán)利要求20的組合物，其中碳水化合物選自高直鏈淀粉、低聚果糖和大豆子葉纖維。
24.權(quán)利要求20的組合物，其中磷脂選自卵磷脂、溶血卵磷脂和具有改進(jìn)的脂肪酸組成的卵磷脂。
25.權(quán)利要求20的組合物，其中皂角苷選自大豆皂角苷A、皂角苷B、皂角苷E、皂草精醇A、皂草精醇B和皂草精醇E。
26.權(quán)利要求20的組合物，其中油體締合蛋白質(zhì)包括脂蛋白。
27.權(quán)利要求26的組合物，其中脂蛋白是哺乳動(dòng)物脂蛋白、蛋黃脂蛋白或脂肪球膜蛋白質(zhì)。
28.權(quán)利要求20的組合物，其中分離的油體締合蛋白質(zhì)是油質(zhì)蛋白。
29.權(quán)利要求20的組合物，其中分離的油體締合蛋白質(zhì)是油質(zhì)蛋白的低分子量級(jí)分。
30.權(quán)利要求20的組合物，其中油體締合蛋白質(zhì)包括包含兩親性序列的多肽片段。
31.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的大豆球蛋白是大豆球蛋白的堿性亞基。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述的大豆球蛋白的堿性亞基是B-1b亞基。
33.權(quán)利要求12的組合物，其中β-伴大豆球蛋白是α’亞基或其片段。
34.權(quán)利要求12的組合物，它進(jìn)一步被定義為包含40％以上的β-伴大豆球蛋白或其片段。
35.權(quán)利要求12的組合物，它進(jìn)一步被定義為包括一種或多種多肽序列，該多肽序列選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO11。
36.治療或預(yù)防高膽固醇血癥的方法，包括下列步驟(a)向所選擇的食品中添加油體締合蛋白質(zhì)；以及(b)向需要該食品的受試個(gè)體提供足夠治療或預(yù)防高膽固醇血癥的數(shù)量的該食品。
37.權(quán)利要求36的方法，進(jìn)一步包括向所述的食品中添加至少一種選自基本上抗消化的皂角苷、植物雌激素、磷脂和碳水化合物的化合物。
38.權(quán)利要求36的方法，其中油體締合蛋白質(zhì)包括脂蛋白。
39.權(quán)利要求36的方法，其中油體締合蛋白質(zhì)包括油質(zhì)蛋白。
40.權(quán)利要求36的方法，其中所述的食品是以大豆為基礎(chǔ)的。
41.權(quán)利要求36的方法，其中在添加的步驟前所述的食品缺乏油體締合的本體蛋白質(zhì)。
42.權(quán)利要求36的方法，其中在添加的步驟前所述的食品包括油體締合蛋白質(zhì)。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述的食品選自大豆細(xì)粉、大豆粒、大豆粗粉、大豆片、豆奶粉、大豆蛋白質(zhì)濃縮物、大豆蛋白質(zhì)分離物和分離的大豆多肽。
44.權(quán)利要求43的方法，其中大豆蛋白質(zhì)分離物是用蛋白酶處理的大豆物質(zhì)的高分子量級(jí)分。
45.權(quán)利要求43的方法，其中分離的大豆多肽包括β-伴大豆球蛋白或其片段。
46.權(quán)利要求43的方法，其中分離的大豆多肽是大豆球蛋白或其片段。
47.用于治療或預(yù)防高膽固醇血癥的方法，包括對(duì)需要其的受試個(gè)體施用包含治療有效量的純化的油體締合蛋白質(zhì)的藥物組合物。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述的藥物組合物以丸劑或膠囊劑形式給藥。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述的藥物組合物作為營養(yǎng)增補(bǔ)劑給藥。
50.權(quán)利要求47的方法，其中通過減少總的血清膽固醇的濃度而預(yù)防所述的心血管疾病。
51.權(quán)利要求50的方法，其中通過減少低密度脂蛋白的濃度而降低血清膽固醇濃度。
52.權(quán)利要求50的方法，其中通過增加高密度脂蛋白的濃度而降低血清膽固醇濃度。
53.權(quán)利要求47的方法，其中通過減少血清甘油三酯的濃度而預(yù)防心血管疾病。
54.權(quán)利要求47的方法，其中通過降低肝膽固醇的濃度來治療心血管疾病。
55.具有SEQ ID NO1的氨基酸序列或具有與該序列有至少95％的序列同源性并具有與該序列相同的生物活性的氨基酸序列的多肽。
全文摘要
提供用于減少高膽固醇血癥并因此減少心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的組合物和方法。該組合物可以包括分離的油體締合蛋白質(zhì)。另外提供已經(jīng)添加了一種或多種油體締合蛋白質(zhì)的食品。本發(fā)明所使用的組合物可以進(jìn)一步包括例如基本上抗消化的皂角苷、異黃酮、磷脂、碳水化合物或其組合的添加化合物。本發(fā)明的方法和組合物可用于降低受試個(gè)體中膽固醇和其他脂類的水平以減少心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1662142SQ03814015
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2003年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月18日
發(fā)明者N·A·布林格, K·卡魯納南達(dá) 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司