專利名稱：抗炎組合物及其使用方法
聯(lián)邦贊助研究或開發(fā)防御高級(jí)研究項(xiàng)目代理(DARPA)基金No.N65236-99-1-5420。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及包含活性化合物及其藥物可接受的鹽的藥物組合物，其對(duì)于不同的趨化因子，例如MIP-1α和RANTES與CCR1受體的結(jié)合具有抑制作用。本發(fā)明還涉及應(yīng)用上述藥物組合物治療炎性和免疫調(diào)節(jié)性紊亂與疾病的方法。
人體健康有賴于身體發(fā)現(xiàn)、消滅外來的有可能侵占個(gè)體有用資源和/或誘發(fā)疾病的病原體的能力。免疫系統(tǒng)，其包括白細(xì)胞(白細(xì)胞(WBCs)T和B淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，嗜酸性細(xì)胞，嗜堿性細(xì)胞，和中性粒細(xì)胞)、淋巴組織和淋巴管，是人體的防御系統(tǒng)。為了抵御感染，B和T淋巴細(xì)胞在身體內(nèi)循環(huán)，與抗原呈遞細(xì)胞相互作用，檢測(cè)病原體。一旦檢測(cè)到侵入物，T淋巴細(xì)胞聚集在感染部位，消滅病原體。趨化因子作為T淋巴細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集和激活的分子指向標(biāo)，標(biāo)志病原體方位。
當(dāng)保護(hù)人體免受病原體侵襲時(shí)，免疫系統(tǒng)也會(huì)產(chǎn)生故障。趨化因子發(fā)出不適當(dāng)?shù)男盘?hào)將導(dǎo)致產(chǎn)生炎性紊亂，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥及其他疾病。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，骨關(guān)節(jié)中未調(diào)節(jié)的趨化因子吸引并活化浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞和T-細(xì)胞。這些細(xì)胞的活動(dòng)誘發(fā)滑膜細(xì)胞增殖，導(dǎo)致炎癥以及最終的骨和軟骨損耗(De Vries，Ran et al.1999)。某些脫髓鞘性病例如多發(fā)性硬化癥的一個(gè)標(biāo)志就是趨化因子-介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞聚集至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Kennedy和Karpus 1999)。聚集至移植物的破壞性WBCs的趨化因子涉及其隨后的排異反應(yīng)(DeVries，Ran et al.1999)。由于趨化因子在炎癥和淋巴細(xì)胞發(fā)展過程中扮演了極其重要的角色，特異性操縱其活性的能力對(duì)于改善和阻斷目前還沒有令人滿意的治療方法的疾病將產(chǎn)生巨大的影響。另外，在沒有昂貴的免疫抑制劑藥物的全身和并發(fā)作用的情況下，移植排斥可能能減至最小。
趨化因子，一組大于40的小肽(7-10kD)，連接在WBCs表達(dá)的受體上，通過G-蛋白-偶聯(lián)的信號(hào)級(jí)聯(lián)發(fā)出信號(hào)調(diào)節(jié)它們的化學(xué)趨化和化學(xué)刺激劑功能。受體可能連接一個(gè)以上的配體；例如，受體CCR1連接RANTES(活化時(shí)受調(diào)節(jié)的正常T細(xì)胞表達(dá)的因子)，MIP-1α(巨噬細(xì)胞炎性蛋白)和MIP-1β趨化因子。迄今為止，已知24種趨化因子受體。趨化因子的絕對(duì)數(shù)目，多配體結(jié)合受體，和WBCs的不同受體特性保證可嚴(yán)格控制的和特異性的免疫應(yīng)答(Rossi和Zlotnik 2000)。趨化因子活性可通過調(diào)節(jié)其相應(yīng)的受體而加以控制，治療相關(guān)的炎性和免疫性疾病，有利于器官和組織移植。
受體CCR1及其趨化因子配體，包括，例如MIP-1α，MIP-1β，和RANTES，是有希望的治療靶點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兩婕邦愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，移植排斥(均綜述于(De Vries，Ran et al.1999))，和多發(fā)性硬化癥(Fischer，Santambrogio et al.2000；Izikson，Klein et al.2000；Rottman，Slavin et al.2000)。事實(shí)上，已發(fā)現(xiàn)功能-阻斷性抗體，修飾的趨化因子受體配體和小分子有機(jī)化合物，并成功地證明了其中一些具有預(yù)防或治療某些趨化因子—介導(dǎo)的疾病的作用(綜述于(Rossi和Zlotnik 2000))。特別是，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，?dāng)給予一種信號(hào)-阻斷性、修飾的-RANTES配體時(shí)，疾病的發(fā)展得到減弱(Plater-Zyberk，Hoogewerf et al.1997)。盡管使用功能-阻斷性抗體和小分子肽治療是有前景的，其缺點(diǎn)是有降解的危險(xiǎn)，給藥時(shí)半衰期極短，并且大多數(shù)蛋白開發(fā)和制造費(fèi)用昂貴。小分子有機(jī)化合物比較合適，因?yàn)樗鼈冊(cè)隗w內(nèi)半衰期較長(zhǎng)，產(chǎn)生作用所需劑量較小，能夠經(jīng)?？诜o藥，因此較為便宜。某些CCR1有機(jī)拮抗物在前已經(jīng)進(jìn)行了描述(Hesselgesser，Ng et al.1998；Ng，May et al.1999；Liang，Mallariet al.2000；Liang，Rosser et al.2000)。由于這些化合物已顯示出在某些動(dòng)物模型中治療疾病是有效的(Liang，Mallari et al.2000)，本領(lǐng)域中需要更多可用于藥物中的化合物。申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)CCR1的有效有機(jī)拮抗物，有望成為本領(lǐng)域重要的工具。
本文公開類型的哌嗪衍生物是已知的抗炎劑(參見例如，WO 98/56771，WO97/44329，WO 99/37651，WO 99/37619，WO 00/53600)。本文公開的特定的哌嗪衍生物以前從未認(rèn)定被為CCR1拮抗物。
發(fā)明概述在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了包含藥物可接受的載體和可抑制各種趨化因子與CCR1受體結(jié)合的活性化合物的組合物，該趨化因子包括例如MIP-1α和RANTES。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種阻斷CCR1受體的方法，包括給予一種抑制多種趨化因子活性的化合物，該趨化因子包括例如MIP-1α和RANTES。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供治療炎性和免疫調(diào)節(jié)性紊亂和疾病的方法，包括給予本發(fā)明所述組合物。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了包括藥物可接受的載體和抑制多種趨化因子與CCR1受體結(jié)合的活性化合物的組合物，該趨化因子包括例如主要配體MIP-1α，MIP-1β，MIP-1γ，骨髓祖細(xì)胞抑制因子-I(XIF-I)，血液濾過物(hemofiltrate)C-C-I(HCC-1)，白細(xì)胞誘素和RANTES。
本發(fā)明組合物可用于治療炎性紊亂。
定義“烷基”是指一種飽和脂肪族基團(tuán)，包括直鏈烷基，支鏈烷基，或環(huán)烷基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，直鏈或支鏈烷基主鏈上碳原子數(shù)目為10或更少，更優(yōu)選的是6或更少，最優(yōu)選的是4或更少。同樣，優(yōu)選的環(huán)烷基在其環(huán)結(jié)構(gòu)上有3-10個(gè)碳原子，更優(yōu)選在環(huán)結(jié)構(gòu)上有3-6個(gè)碳原子。烷基的實(shí)例包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、異丙基、環(huán)丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、環(huán)丁基、戊基、己基、環(huán)己基等等。優(yōu)選甲基和乙基。
“烷氧基”是指通過氧原子連接在母體分子部分上的如前述定義的烷基。烷氧基的實(shí)例包括，但不限于，甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正-丁氧基、叔丁氧基、新戊氧基和正-己氧基。
“芳基”是指任何含有5-10個(gè)碳原子的單價(jià)芳香碳環(huán)基團(tuán)。芳基可以是二環(huán)(即苯基(或Ph))或多環(huán)(即萘基)，也可以是非取代或取代的。優(yōu)選的芳基包括苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、吲哚基、喹啉基或異喹啉基。
“鹵代烷基”是指被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代的如上述定義的烷基。鹵代烷基的實(shí)例包括，但不限于，三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、氯乙基、溴丁基、2-三氟乙基、1-氟甲基-2-氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1-溴甲基-2-溴乙基等等。特別優(yōu)選三氟甲基。
“鹵素”是指氟、氯、溴和碘。
“雜環(huán)基”是指穩(wěn)定的、飽和的、部分不飽和或芳族基團(tuán)，包含5-10個(gè)環(huán)原子，優(yōu)選5或6個(gè)環(huán)原子。環(huán)可被取代基取代一次或多次。環(huán)可以是單、雙或多環(huán)。雜環(huán)基由碳原子和1-3個(gè)雜原子組成，雜原子可獨(dú)立地選自氮、氧和硫。雜環(huán)基的實(shí)例包括吖啶、苯并噻唑啉、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并吡喃、苯并噁唑啉、苯并噻吩、苯并噻唑、苯并噻吩基、咔唑、噌啉、呋喃、咪唑、1H-吲唑、吲哚、異吲哚、異喹啉、異噻唑、嗎啉、噁唑(即1，2，3，-噁二唑)、吩嗪、吩噻嗪、吩噁嗪、酞嗪、哌啶、哌嗪、喋啶、嘌呤、吡嗪、吡唑、噠嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、噻唑啉、喹啉、喹噁啉、四氫呋喃、四氫喹啉基、1，2，3，4-四氫異喹啉基、四氫噻吩基及其亞砜和砜衍生物、硫嗎啉、噻唑、1，3，4-噻二唑、噻吩(thiene)、噻吩、1，3，5-三嗪、三唑(即1，2，3，-三唑)等等。
“取代的”是指包含至少一個(gè)，優(yōu)選1-3個(gè)取代基的部分。合適的取代基包括氫(H)和羥基(-OH)、氨基(-NH2)、氧(-O-)、羰基(-CO-)、巰基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、鹵素、腈、硝基、芳基和雜環(huán)基。這些取代基任選地被1-3個(gè)取代基進(jìn)一步取代。取代的取代基的例子包括，酰胺、烷基巰硫、烷基磺基、烷氨基、二烷氨基、羧化物、烷氧羰基、烷芳基、芳烷基、烷雜環(huán)基等等。
抑制趨化因子、MIP-1α和RANTES活性的化合物在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明活性化合物是式(1)化合物 其中n是0、1、或2；Y是氧或硫；R1、R2、和R3各自獨(dú)立地為氫、烷基、烷氧基、鹵素、鹵代烷基或硝基。優(yōu)選的，活性化合物是式(2)
其中n是0、1、或2；Y是氧或硫；并且R1、R2、和R3各自獨(dú)立地為氫、烷基、烷氧基、鹵素、鹵代烷基或硝基。
特別優(yōu)選的，化合物(1)中R1和R2是氫，R3是鹵素(特別優(yōu)選的是氯或氟)或氫。
本發(fā)明應(yīng)用的化合物可通過商業(yè)途徑購得，也可根據(jù)已知方法制備(參見例如FR 1,441,071和JP 63041907)。
測(cè)試要證明本發(fā)明化合物是CCR1受體拮抗劑，如果它們可以抑制趨化因子MIP-1α和RANTES的活性即可確定。優(yōu)選的所述化合物具有以下特性(1)可有效地抑制趨化因子MIP-1α或RANTES與CCR1受體結(jié)合；(2)顯著抑制對(duì)于CCR1的Ca2+應(yīng)答；和(3)有限的非特異性Ca2+應(yīng)答。
體外標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)試可用于證實(shí)化合物與CCR1受體的親和力(從而通過與受體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制MIP-1α和RANTES的活性)。見下述文實(shí)施例。優(yōu)選地，活性化合物IC50值＜10μM，更優(yōu)選地，＜5μM，最優(yōu)選地＜1μM。
抑制MIP-1α和RANTES的活性的化合物影響MIP-1α和RANTES刺激的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。配體與CCR1受體的結(jié)合導(dǎo)致G-蛋白誘導(dǎo)的磷脂酶C活化，其導(dǎo)致磷脂酰肌醇磷酸轉(zhuǎn)化為磷酸肌醇和二?；视?。磷酸肌醇接著與細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合，將Ca2+釋放至細(xì)胞質(zhì)中。除Ca2+從細(xì)胞內(nèi)貯庫釋放使Ca2+濃度升高外，磷酸肌醇與其受體的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞外鈣離子穿過膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的流量增大。因此，由MIP-1α和RANTES引起的CCR1受體的激活，以及隨后由本發(fā)明化合物產(chǎn)生的活化抑制，均可通過測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+水平的增加確定。代表性地，也可以通過使用鈣-敏感的熒光探針例如quin-2、fura-2和indo-1完成。參見下文實(shí)施例?；钚曰衔镒钄郈a2+應(yīng)答的作用依賴于存在的活性化合物和趨化因子的數(shù)量。一般而言，當(dāng)趨化因子為10nM時(shí)，10μM活性化合物能夠產(chǎn)生20-100％的Ca2+應(yīng)答抑制作用。
測(cè)定活性化合物是否產(chǎn)生了非特異性Ca2+應(yīng)答，可以通過下述方法進(jìn)行加入活性化合物，按照上述方法測(cè)量所述的Ca2+應(yīng)答，隨后加入一種已知的其他趨化因子受體拮抗劑(例如緩激肽或SDF-1，一種CXCR4配體)。比較應(yīng)答結(jié)果表明活性化合物是非特異性結(jié)合。
藥物組合物用于給予活性化合物的藥物組合物可以常規(guī)地以劑型單位的形式存在，可以以藥物領(lǐng)域公知的任一種方法制備。所有的方法均包括下述步驟，將活性化合物與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體混合。一般而言，藥物組合物如下述制備將活性化合物與液態(tài)載體或精細(xì)分割的固態(tài)載體或二者混合，然后，如果需要，將產(chǎn)物加工成希望的制劑。在藥物組合物中，活性化合物的含量足以對(duì)疾病的過程或狀況產(chǎn)生預(yù)期的作用。
包含活性化合物的藥物組合物可以是適合口服的劑型，例如，片劑、含片、錠劑、含水或油性混懸液、分散性粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。用于口服的組合物可通過任何生產(chǎn)藥物組合物領(lǐng)域已知的方法制備，這些組合物還可包括一種或多種選自甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑的試劑，以提供藥學(xué)上美觀和可口的制劑。片劑包括活性成分并混合以無毒的藥物可接受的適于制備片劑的賦形劑。賦形劑例如為惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；成粒劑或崩解劑，例如玉米淀粉、或海藻酸；粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；及潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以不包衣或通過已知的技術(shù)包衣，以達(dá)到延遲崩解、在胃腸道吸收從而在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)提供持續(xù)作用。例如，緩釋材料可使用單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它們還可以通過美國(guó)專利4,256,108、4,166,452、和4,265,874公開的技術(shù)包衣以形成可控制釋放的滲透性治療片劑。
口服制劑也可為硬明膠膠囊，其中活性組份與惰性固態(tài)稀釋劑混合，例如，碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土；或軟明膠膠囊，其中活性組份與水或油介質(zhì)混合，例如花生油、液態(tài)石蠟或橄欖油。
水性混懸液包括活性物質(zhì)，它們與適合制備水性混懸液的賦形劑混合。這些賦形劑是懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基-丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、西黃蓍膠和阿拉伯膠；分散劑或濕潤(rùn)劑可以是天然磷脂，例如卵磷脂、或烯化氧與脂肪酸的縮合物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯、或環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合物，例如十七烯氧鯨蠟醇、或環(huán)氧乙烷與脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合物，例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯、或環(huán)氧乙烷與脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的縮合物，例如聚乙烯去水山梨糖醇單油酸酯。水性混懸液還可包括一種或多種防腐劑，例如乙基、或正-丙基對(duì)-羥苯甲酸酯，一種或多種著色劑，一種或多種矯味劑，和一種或多種甜味劑，例如蔗糖或糖精。
油性混懸液可通過將活性組份懸浮于植物油中配制，例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油，或懸浮于礦物油中例如液態(tài)石蠟。油性混懸液可以包括一種增稠劑，例如蜂蠟、固體石蠟或鯨蠟醇。甜味劑如上述列舉，可加入矯味劑以制得口感良好的制劑。這些組合物可加入抗氧化劑例如抗壞血酸進(jìn)行保存防腐。
通過加入水而適于制備水性混懸液的分散性粉末和顆粒提供了與分散劑或濕潤(rùn)劑、助懸劑和一種或多種防腐劑混合的活性組份。合適的分散劑或濕潤(rùn)劑和助懸劑的例子如上文所述。其他賦形劑，例如甜味劑、矯味劑和著色劑，也可使用。
本發(fā)明藥物組合物還可為水包油乳液的形式。油相可以是植物油，例如橄欖油或花生油，或礦物油，例如液態(tài)石蠟或其混合物。合適的乳化劑可以是天然樹膠例如阿拉伯膠或西黃蓍膠，天然磷脂例如大豆磷脂、卵磷脂、和脂肪酸和己糖醇酐的酯或部分酯，例如去水山梨糖醇單油酸酯，和所述部分酯與環(huán)氧乙烷的縮合物，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。乳劑還包括甜味劑和矯味劑。
糖漿和酏劑可與甜味劑配制，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。這種制劑還可包括濕潤(rùn)劑、防腐劑、矯味劑和著色劑。
藥物組合物可為無菌可注射水性或油性混懸液形式?；鞈乙嚎墒褂蒙衔乃龅暮线m的分散劑或濕潤(rùn)劑和助懸劑，根據(jù)已知技術(shù)配制。無菌可注射制劑也可以是在無毒胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或混懸液，例如在1，3-丁二醇中的溶液?？山邮艿妮d體和溶劑中能夠應(yīng)用的是水、林格溶液、和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌非揮發(fā)油通常作為溶劑或混懸介質(zhì)而使用。基于此目的，任何非刺激性非揮發(fā)性油均可使用，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。另外，發(fā)現(xiàn)脂肪酸例如油酸可用于制備可注射制劑。
本發(fā)明化合物還可以栓劑形式給藥，用于直腸給藥。這些組合物可通過混合藥物與合適的非刺激性賦形劑制備，賦形劑常溫下是固態(tài)但在直腸溫度下是液態(tài)，從而在直腸中熔化釋放出藥物。這些材料是可可油和聚乙二醇。
對(duì)于局部應(yīng)用，可以使用包含本發(fā)明化合物的霜、軟膏、膠凍、溶液或混懸液等。(針對(duì)本申請(qǐng)的目的，局部應(yīng)用包括口洗劑和漱口劑。)本發(fā)明藥物組合物和方法可以進(jìn)一步包括本文中記載的其他治療活性化合物，它們通常用于治療上文所述的病理狀況。
在治療或預(yù)防需要調(diào)節(jié)趨化因子受體的狀況中，適當(dāng)?shù)膭┝克揭话闶谴蠹s0.01-500mg/kg患者體重/天，可以以單劑或多劑給藥。優(yōu)選的，劑量水平為約0.1至約250mg/kg/天；更優(yōu)選，約0.5至約100mg/kg/天。適當(dāng)?shù)膭┝克娇蔀榧s0.01至250mg/kg/天，約0.05至100mg/kg/天，或約0.1至50mg/kg/天。在此范圍內(nèi)劑量可以是0.05-0.5，0.5-5或5-50mg/kg/天。對(duì)于口服給藥，優(yōu)選組合物為片劑形式，包含1.0-1000mg活性組份，特別是根據(jù)治療的病人的癥狀調(diào)節(jié)劑量為1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0、和1000.0mg活性組份?；衔锩刻旖o藥1-4次，優(yōu)選每天一次或兩次。
可以理解的是，對(duì)于任何特定患者，特定劑量水平和給藥頻率都是不同的，其依賴于包括使用的特殊化合物的活性、代謝穩(wěn)定性、化合物作用時(shí)間、年齡、體重、一般健康、性別、飲食、給藥方式和時(shí)間、排泄率、聯(lián)合用藥、特定狀況的嚴(yán)重性，和接受治療的宿主等各種因素。
阻斷CCR1受體的方法本發(fā)明還提供了一種抑制MIP-1α或RANTES與CCR1受體結(jié)合的方法，通過在適合抑制趨化因子和CCR1受體結(jié)合的條件下使上文所述組合物與表達(dá)CCR1受體的細(xì)胞接觸而實(shí)現(xiàn)。
治療炎性和免疫調(diào)節(jié)紊亂和疾病的方法本發(fā)明還提供了一種治療炎性疾病的方法，包括給予需要的患者治療有效量的上文所述的組合物足夠治療炎性疾病的時(shí)間?！爸委煛笔侵割A(yù)防、抑制或緩解紊亂或癥狀。
CCR1提供了一個(gè)在哺乳動(dòng)物，例如人體內(nèi)干擾或促進(jìn)嗜酸性細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞功能的靶點(diǎn)。抑制CCR1的化合物對(duì)于出于治療目的的調(diào)節(jié)嗜酸性細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞功能尤其有效。相應(yīng)地，本發(fā)明涉及對(duì)于預(yù)防和/或治療各種炎性和免疫調(diào)節(jié)性紊亂和疾病有效的化合物。
例如，一種可抑制一項(xiàng)或多項(xiàng)CCR1功能的化合物可用于抑制(即減少或預(yù)防)炎癥。結(jié)果是，可抑制一種或多種炎癥過程，例如白細(xì)胞遷移、趨化性、胞吐(例如酶、組胺的)或炎性介質(zhì)釋放。例如，可根據(jù)本發(fā)明方法抑制對(duì)于炎性位點(diǎn)的嗜酸細(xì)胞性浸潤(rùn)(如哮喘)。
同樣地，一種可促進(jìn)一項(xiàng)或多項(xiàng)CCR1功能的化合物可用于刺激(誘導(dǎo)或增強(qiáng))炎癥應(yīng)答，例如白細(xì)胞遷移、趨化性、胞吐(如酶、組胺的)或炎性介質(zhì)釋放，造成炎癥過程的有益刺激。例如，會(huì)聚集嗜酸性細(xì)胞以用于抵抗寄生蟲感染。
除靈長(zhǎng)類，例如人之外，各種其他的哺乳動(dòng)物可根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行治療。例如，哺乳動(dòng)物，包括，但不限于，牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、豚鼠、老鼠或其它牛類、羊類、馬類、犬類、貓科、嚙齒動(dòng)物、鼠類物種均可被治療。而且，該方法還可用于治療其他物種，例如鳥類物種(如雞)。
與炎癥或感染相關(guān)的疾病或狀況均可使用本發(fā)明的方法進(jìn)行治療。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，疾病或狀況是指其中的嗜酸性細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞的功能被抑制或增強(qiáng)，以達(dá)到調(diào)節(jié)炎性應(yīng)答的目的。
可用CCR1抑制劑治療的人或其他物種的疾病或狀況包括，但不限于炎性或變應(yīng)性疾病和狀況，包括呼吸系統(tǒng)變應(yīng)性疾病例如哮喘、過敏性鼻炎、過敏性肺部疾病、過敏性肺炎、嗜酸細(xì)胞性肺炎(如呂弗勒(氏)綜合征，慢性嗜酸性細(xì)胞性肺炎)，遲發(fā)型過敏性間質(zhì)性肺病(ILD)(如特發(fā)性肺纖維化、或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的ILD、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性硬化癥、斯耶格倫(氏)綜合征、多發(fā)性肌炎或皮肌炎)；全身性過敏反應(yīng)或超敏反應(yīng)，藥物變態(tài)反應(yīng)(如對(duì)于盤尼西林、頭孢菌素類)，昆蟲螫傷變態(tài)反應(yīng)；自身免疫性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、腦白質(zhì)病、腦脊髓炎、阿耳茨海默(氏)病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、青少年型糖尿病；腎小球性腎炎、自身免疫性甲狀腺炎、貝切特(氏)??；Guillian-Barre綜合征、急性細(xì)胞介導(dǎo)的移植排斥(例如腎移植排斥)、移植排斥(如在移植術(shù)中)，包括同種異體移植物排斥或移植物抗宿主病；uricaria、皮膚血管炎、炎性腸病，例如克隆(氏)病和潰瘍性結(jié)腸炎；脊柱關(guān)節(jié)??；硬皮??；銀屑病(包括T-細(xì)胞介導(dǎo)的銀屑病)和炎性皮膚病例如皮炎、濕疹、特應(yīng)性皮炎、過敏性接觸皮炎、蕁麻疹；血管炎(如引起壞死的，表皮的，和過敏性脈管炎)；嗜酸細(xì)胞性肌炎，嗜酸細(xì)胞性筋膜炎；白細(xì)胞浸潤(rùn)皮膚或器官的癌癥。其中不良炎癥應(yīng)答能夠被抑制的其他疾病或狀況也可進(jìn)行治療，包括但不限于，再灌注損傷、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、某些血液惡性腫瘤、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中毒(如膿毒性休克、內(nèi)毒素性休克)、多肌炎、皮肌炎。因此本發(fā)明化合物可用于預(yù)防或治療多種炎性和免疫調(diào)節(jié)性紊亂和疾病。
體外標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試可用于證實(shí)本發(fā)明組合物治療炎性紊亂的有效性，包括多發(fā)性硬化癥實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的動(dòng)物模型和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型。
本發(fā)明組合物可通過口服、胃腸外(如肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、ICV、腦池內(nèi)注射或輸注，皮下注射或植入)、吸入噴霧、鼻、陰道、直腸、舌下、或局部給藥途徑給藥，可單獨(dú)或共同配制成合適的劑量單位制劑，其中含有適于每種給藥途徑的無毒的藥物可接受的載體，佐劑和賦形劑。除了治療溫血?jiǎng)游?，例如大鼠、小鼠、馬、牛、羊、狗、貓、猴子等，本發(fā)明組合物對(duì)于治療人也有效。
聯(lián)合治療如上所述調(diào)節(jié)趨化因子受體活性從而預(yù)防和治療炎性和免疫調(diào)節(jié)性紊亂和疾病的聯(lián)合治療，通過本發(fā)明化合物和其他已知具有同樣作用的化合物聯(lián)合進(jìn)行舉例說明。
例如，在治療或預(yù)防炎癥時(shí)，本發(fā)明化合物可與抗炎或止痛劑結(jié)合，例如阿片激動(dòng)劑；脂加氧酶抑制劑，例如5-脂加氧酶抑制劑；環(huán)加氧酶抑制劑，例如環(huán)加氧酶-2抑制劑；白介素抑制劑，例如白介素-1抑制劑；NMDA拮抗劑；氧化氮抑制劑或氧化氮合成抑制劑；非甾體抗炎劑；或細(xì)胞因子抑制性抗炎劑，例如撲熱息痛，阿司匹林，可待因，芬太尼，布洛芬，吲哚美辛，痛力克，嗎啡，萘普生，非那西汀，吡羅昔康；甾體鎮(zhèn)痛藥，舒芬太尼，sunlindac，替尼達(dá)普等。同樣地，本發(fā)明的化合物可與下述藥物聯(lián)合給藥疼痛緩解劑；增效劑例如咖啡因，H2-拮抗劑，二甲硅油，氫氧化鋁或氫氧化鎂；解充血藥例如苯福林，n-去甲麻黃堿，偽麻黃堿，氧甲唑啉，腎上腺素，萘唑啉，丁芐唑啉，環(huán)己丙甲胺，或左旋-脫氧-麻黃素；止咳藥例如可待因，二氫可待因酮，卡拉美芬，咳必清，或右旋甲嗎喃；利尿劑；和鎮(zhèn)靜或非鎮(zhèn)靜抗性組胺劑。
下述實(shí)施例用于舉例說明本發(fā)明，并不限于此。
實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法A.化合物樣本此處使用的化合物樣本包括商業(yè)途徑購得的小分子。源培養(yǎng)板包括在二甲基亞砜(DMSO)中的1或5mg/ml各個(gè)化合物。根據(jù)這些CLIP(化合物庫)，制作培養(yǎng)板，其中每孔加入10種化合物，用20％DMSO稀釋至5-50μg/ml的濃度。向檢驗(yàn)板上滴加一等分20μl的每種混合物，在-20℃條件下儲(chǔ)存直至使用。
B.細(xì)胞CCR1轉(zhuǎn)染子CCR1-NSO細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子細(xì)胞系的CCR1(CCR1-NSO)在Iscove′s改良的Dulbecco′s培養(yǎng)基(IMDM)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基含有4.5g/L葡萄糖，5％胎牛血清(FBS)，10mN HCl，250μg/l黃嘌呤(來自于0.1N NaOH中100X黃嘌呤貯存液)，15μg/l次黃嘌呤(來自于0.1N NaOH中100X次黃嘌呤貯存液)，10mg/L胸苷(來自于H2O中100X胸苷貯存液)，50μM β-巰基乙醇(BME)(來自于H2O中1000X BME貯存液)，和1.5mg/L霉酚酸(來自于乙醇中2.5mg/ml霉酚酸貯存液)。細(xì)胞在5％CO2/95％空氣，100％濕度，37℃條件下生長(zhǎng)，當(dāng)濃度為0.5-1.0×106細(xì)胞/ml時(shí)進(jìn)行收集。細(xì)胞以1∶4每周傳代培養(yǎng)兩次。
CCR1-293細(xì)胞用人CCR1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胚腎腺病毒-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系293(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；Manassas，VA)。pIRESpuro載體(Clontech；Palo Alto，CA)被工程化以包含一個(gè)促乳素信號(hào)序列，F(xiàn)LAG-表位克隆至EcoRV-Not I限制位點(diǎn)。人CCR1 cDNA克隆被亞克隆至Not I位點(diǎn)，這樣插入片段就可操作性連接到強(qiáng)pCMV啟動(dòng)子上。細(xì)胞在Dubecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基中的2 μg/ml嘌呤霉素選擇下，在5％CO2/95％空氣，100％濕度，37℃條件下成長(zhǎng)，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充了2mML-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，0.1mM非必需氨基酸，1.0mM丙酮酸鈉，10％胎牛血清。細(xì)胞以1∶5每周傳代培養(yǎng)兩次，在1×106細(xì)胞/ml時(shí)進(jìn)行收集。
THP-1細(xì)胞THP-1細(xì)胞得自ATCC，在RPMI-1640培養(yǎng)基中作為懸浮液培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，4.5g/L葡萄糖，10mMHEPES，1mM丙酮酸鈉，0.05％2-巰基乙醇和10％FBS進(jìn)行補(bǔ)充。細(xì)胞在5％CO2/95％空氣，100％濕度，37℃條件下成長(zhǎng)，以1∶5每周傳代培養(yǎng)兩次，在1×106細(xì)胞/ml時(shí)進(jìn)行收集。
C.測(cè)定CCR1配體結(jié)合抑制離心表達(dá)CCR1的細(xì)胞，在分析緩沖液中(20mM HEPES pH7.1，140mMNaCl，1mM CaCl2，5mM MgCl2，和0.2％牛血清白蛋白)再懸浮，達(dá)到濃度為5.6×106細(xì)胞/ml(CCR1-NSO)或2.2×106細(xì)胞/ml(CCR10293)。如下述方法進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)。首先，將0.09ml細(xì)胞(5×105CCR1-NSO細(xì)胞/孔或2×105CCR1-293細(xì)胞/孔)加入含有化合物的測(cè)試培養(yǎng)板中，得到的每種化合物的最終濃度為約2-10μM。然后加入0.09ml用測(cè)試緩沖液稀釋至最終濃度為約50pM，收率約30,000cpm每孔的125I標(biāo)記的MIP-1α(購自Amersham；Piscataway，NJ)，密封培養(yǎng)板，4℃條件下在振蕩平臺(tái)中溫育約3小時(shí)。抽吸反應(yīng)物至在真空細(xì)胞收集器(Packard Instruments；Meiden，CT)上預(yù)先浸漬在0.3％聚乙烯亞胺(PEI)溶液中的GF/B玻璃濾器。在每孔中加入閃爍液(50μl；Microscint 20，Packard Instruments)，密封培養(yǎng)板，在一個(gè)高計(jì)數(shù)閃爍計(jì)數(shù)器(Packard Instruments)中進(jìn)行放射性測(cè)量。只包含稀釋劑(用于總計(jì)數(shù))或過量的MIP-1α或MIP-1β(1μg/ml，用于非特異性結(jié)合)的對(duì)照孔用于計(jì)算每組化合物的占抑制總量的百分比。完成CLIP培養(yǎng)板測(cè)試后，證實(shí)了抑制率為40％或更高的孔。一經(jīng)證實(shí)，CLIP的各個(gè)化合物就要接受反應(yīng)性(解褶積步驟)測(cè)試。IC50值是能夠減少標(biāo)記的MIP-1α與受體結(jié)合的50％的所需濃度。
鈣動(dòng)員為了探測(cè)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的鈣的釋放，培養(yǎng)的細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中與3μMINDO-1AM染料(分子探針；Eugene，OR)在室溫下溫育45分鐘，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌。加入INDO-1AM后，細(xì)胞在流通緩沖液(Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)和1％FBS)中再懸浮。使用國(guó)際光子技術(shù)分光光度計(jì)(國(guó)際光子技術(shù)；NewJersey)測(cè)量鈣動(dòng)員，在350nm激發(fā)，在400nm和490nm處雙重同步記錄熒光發(fā)射。相對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣水平表示為400nm/490nm發(fā)射比。37℃條件下進(jìn)行試驗(yàn)，在樣品杯中連續(xù)混合，每個(gè)樣品杯含有106細(xì)胞/2ml流通緩沖液。使用的趨化因子配體范圍為1-100nM。根據(jù)時(shí)間標(biāo)繪發(fā)射比(代表性地，2-3分鐘)。在10秒時(shí)加入候選的配體阻斷性化合物(10-20μM)，然后在60秒時(shí)加入趨化因子(MIP-1α；R&D系統(tǒng)；Minneapolis，MN)，在150秒時(shí)加入對(duì)照趨化因子(緩激肽；ICN制藥公司，Costa Mesa，CA)。在某些實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)加入候選的阻斷化合物和細(xì)胞，40秒后再加入MIP-1α。
趨化性測(cè)試使用5μm孔聚碳酸酯、聚乙烯吡咯酮包被的過濾器在96-孔趨化室(Neuroprobe；Gaithersburg，MD)進(jìn)行趨化性測(cè)試。以基質(zhì)-衍生的因子(SDF-1)作為特異性對(duì)照品。下部的室含有29μl，0.1nM MIP-Iα和多種量的抑制劑，上部的室在20μl中含100,000THP-1細(xì)胞。趨化室在37℃溫育1-2小時(shí)，利用CyQuant測(cè)試試(Molecular Probes)、測(cè)量核酸含量的熒光染料方法和顯微鏡觀察確定下部的室中的細(xì)胞數(shù)量。
實(shí)施例2CCR1結(jié)合MIP-Iα的抑制劑的檢驗(yàn)A.測(cè)試為了檢驗(yàn)阻止受體CCR1與配體結(jié)合的小有機(jī)分子，進(jìn)行測(cè)試以探測(cè)在細(xì)胞表面與表達(dá)外源性CCR1的細(xì)胞結(jié)合的放射性配體(MIP-Iα)。如果一種化合物能夠抑制結(jié)合，不管其是否是競(jìng)爭(zhēng)性抑制，當(dāng)與未抑制的對(duì)照進(jìn)行比較時(shí)，將觀察到較少的放射性計(jì)數(shù)。
構(gòu)建在細(xì)胞表面組成型表達(dá)人CCR1的NSO鼠類骨髓瘤細(xì)胞系(CCR1-NSO)和人胚胎腎(HEK)癌細(xì)胞系(CCR1-293)；這些細(xì)胞缺少結(jié)合MIP-Iα的其他趨化因子受體。在CLIP培養(yǎng)板中向每個(gè)孔加入相同數(shù)量的細(xì)胞，其中每孔含有10種候選的有機(jī)化合物。用放射標(biāo)記的MIP-Iα溫育細(xì)胞。洗滌細(xì)胞以移除未結(jié)合的配體，通過定量放射性計(jì)數(shù)確定結(jié)合的配體。通過未用任何有機(jī)化合物溫育的細(xì)胞確定總計(jì)數(shù)；用未標(biāo)記配體和標(biāo)記的配體溫育細(xì)胞，確定非特異性結(jié)合。抑制百分比以下述公式計(jì)算％抑制＝1-[(樣品cpm)-(非特異性cpm)]/[(總cpm)-(非特異性cpm)]×100B.使用CCR1-NSO細(xì)胞從化合物庫中鑒定的抑制劑在測(cè)試化合物的第1組中，標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)準(zhǔn)差是19％；因此，確認(rèn)的顯著抑制是大于38％；40％抑制是選擇的閾值。在受試孔數(shù)目中，58個(gè)孔的內(nèi)容物抑制40％或更多的MIP-Iα結(jié)合。這58個(gè)孔的內(nèi)容物在CLIP中重新測(cè)試，其中6個(gè)抑制40％或更多的結(jié)合。這一結(jié)果表明6個(gè)孔中的每一個(gè)中的10種化合物至少有一種能夠抑制MIP-Iα與CCR1結(jié)合。為了確認(rèn)每個(gè)孔中究竟是10種化合物中的哪一種抑制了MIP-Iα的CCR1連接，測(cè)試每一種單獨(dú)的化合物在測(cè)試中的抑制活性以對(duì)合并物解褶積。由于某些化合物可能共同作用以抑制結(jié)合，而解褶積測(cè)試只適用于單獨(dú)檢測(cè)化合物，因此本試驗(yàn)中沒有找出聯(lián)合作用有效而單獨(dú)作用無效的化合物。鑒定三種候選化合物(1)CCX-469
(2)CCX-285 和(3)CCX-193 在第二組化合物的篩選中，標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)準(zhǔn)差是17％，表明34％或更多的抑制活性是顯著的此外，閾值為40％。這些CLIPs產(chǎn)生顯示出高于40％抑制的39個(gè)孔。當(dāng)再次作為CLIPs被篩選時(shí)，14個(gè)孔減少了超過40％的配體。單獨(dú)測(cè)試化合物以鑒定13個(gè)抑制性候選物
(4)CCX-6019 (5)CCX-2433 (6)CCX-2595
(7)CCX-3456 (8)CCX-682 (9)CCX-541
(10)CCX-238 (11)CCX-4425 (12)CCX-1513
(13)CCX-3493 (14)CCX-6530 (15)CCX-4462 (16)CCX-5119
C.使用CCR1-293細(xì)胞從化合物庫中鑒定的抑制劑使用CCR1-293細(xì)胞，其以更高水平表達(dá)CCR1，結(jié)果是提高了噪音與信號(hào)比標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)準(zhǔn)差，大約為10％。篩選第1組化合物，46個(gè)孔在初始篩選中顯示出大于20％的配體結(jié)合抑制，CLIP中的10個(gè)孔在第二次篩選中抑制配體結(jié)合。單獨(dú)測(cè)試化合物，鑒定出6個(gè)候選物(17)CCX-1611 (18)CCX-1307
(19)CCX02324 (20)CCX-1959
(21)CCX-1057 和(22)CCX-1080 至于使用CCR1-293細(xì)胞進(jìn)行的關(guān)于第1組化合物的測(cè)試，第2組化合物篩選的標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)準(zhǔn)差更小，很有可能是由于使用了這些細(xì)胞。在第1個(gè)試驗(yàn)中抑制結(jié)合的35個(gè)CLIP孔中，有8個(gè)孔得到驗(yàn)證?；衔锏膫€(gè)別檢驗(yàn)鑒定出3個(gè)候選物
(23)CCX-5062 (24)CCX-3345 和
(25)CCX-3343 實(shí)施例3劑量反應(yīng)曲線為了確定一種候選化合物對(duì)于CCR1的親和性，以及確定其抑制配體結(jié)合的能力，在1×10-8-1×10-4M范圍的化合物濃度滴定抑制活性。這項(xiàng)測(cè)試基本上等同于CLIP篩選，除了化合物用量發(fā)生了變化；細(xì)胞數(shù)量和配體濃度保持不變。只有本實(shí)驗(yàn)時(shí)可商業(yè)購得的化合物進(jìn)行了滴定。在鑒定的22個(gè)候選物中，下述16個(gè)進(jìn)行了劑量反應(yīng)試驗(yàn)CCX-3343、CCX-1057、CCX-1307、CCX-1513、CCX-238、CCX-3345、CCX-3493、CCX-4425、CCX-4462、CCX-4682、CCX-469、CCX-5062、CCX-5119、CCX-541、CCX-6019和CCX-6530。
不能以劑量依賴性方式抑制MIP-Iα結(jié)合的測(cè)試化合物是CCX-238、CCX-4425、和CCX-4462。抑制活性根據(jù)其對(duì)于CCR1親合力的不同而變化的化合物如表1所示。
表1.CCR1-MIP-Iα結(jié)合的親和值，從最高往最低排列
化合物CCX-541和CCX-469顯示出的CCR1親和值低于1μM?；衔顲CX-5062、CCX-3345、和CCX-3343具有阻斷活性，但在最高測(cè)試濃度時(shí)不能夠完全抑制MIP-Iα結(jié)合；估計(jì)它們的親和值大約為2μM。雖然化合物CCX-6019、CCX-4682、CCX-1307和CCX-1057顯示出阻斷活性，它們的CCR1親和值較低，為18-45μM。雖然鑒定出很多化合物能夠抑制CCR1與MIP-Iα配體結(jié)合，只有兩個(gè)化合物具有高CCR1親和值CCX-541和CCX-469。鑒定出了其他的親和值較低的MIP-Iα結(jié)合抑制性化合物，但是由于抑制性質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性是未知的，所以不能夠清楚的得知這些化合物對(duì)于抑制其它CCR1配體結(jié)合例如RANTES是否更加有效。
實(shí)施例4CCR1功能性測(cè)定
CCR1是一種七次跨膜的G-蛋白連接的受體。由這些受體連接誘導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)級(jí)聯(lián)的標(biāo)志是鈣離子從細(xì)胞內(nèi)貯庫的類似于脈沖的釋放。進(jìn)行鈣動(dòng)員測(cè)試以確定候選MIP-Iα抑制性化合物是否也能阻斷CCR1信號(hào)傳遞。為了使用，希望候選化合物能夠抑制特異性配體結(jié)合以及發(fā)出傳遞。
響應(yīng)MIP-Iα結(jié)合的鈣離子釋放通過細(xì)胞可滲透的INDO-1/AM顯示劑測(cè)定，其在游離的而不是螯合的鈣離子存在下發(fā)出熒光。CCR1-293或THP-1細(xì)胞用INDO-1加載，對(duì)響應(yīng)加入MIP-Iα的鈣離子釋放進(jìn)行測(cè)試。對(duì)于特異性對(duì)照，加入另外一種非CCR1結(jié)合趨化因子、緩激肽，其也是通過一種七次跨膜受體發(fā)出信號(hào)。沒有化合物的情況下加入MIP-Iα?xí)r可以看到熒光信號(hào)脈沖。如果一種化合物特異性抑制CCR1-MIP-Iα信號(hào)傳遞，那么在加入MIP-Iα?xí)r將看不到任何信號(hào)脈沖，但在加入緩激肽時(shí)可看到一個(gè)脈沖。然而，如果一種化合物非特異性抑制信號(hào)傳遞，那么在加入MIP-Iα和緩激肽時(shí)將看不到任何脈沖。
如表.2所示，在測(cè)試的選擇的化合物，CCX-469、CCX-541、CCX-1513和CCX-3493之中，只有CCX-469能夠顯著地并且特異地抑制CCR1的信號(hào)傳遞。CCX-541和CCX-1513對(duì)于鈣離子水平具有非特異性作用，CCX-3493不能夠影響信號(hào)傳遞，無論是MIP-Iα還是緩激肽誘導(dǎo)的。
表2.鈣信號(hào)傳遞抑制
實(shí)施例5(推論)趨化因子主要功能之一是其能夠吸引WBCs至病原體侵入位點(diǎn)。為了證實(shí)化合物不僅能夠如鈣動(dòng)員試驗(yàn)確定的抑制MIP-Iα結(jié)合和CCR1信號(hào)傳遞；而且能夠抑制CCR1功能，進(jìn)行了趨化性測(cè)試。THP-1髓細(xì)胞單核細(xì)胞白血病細(xì)胞，其與單核細(xì)胞相似，可用作MIP-Iα化學(xué)吸引的靶點(diǎn)。THP-1細(xì)胞位于微孔遷移室的上部的室中，而MIP-Iα和濃度增加的化合物加樣于下部的室中。在無抑制劑時(shí)，THP-1細(xì)胞響應(yīng)MIP-Iα趨化因子遷移至下部的室中；如果一種化合物抑制CCR1功能，那么大多數(shù)TIP-1細(xì)胞保持在上部的室中。
根據(jù)上文詳述內(nèi)容，提示了本領(lǐng)域技術(shù)人員本發(fā)明的許多變化形式，這些顯而易見的變化包括在權(quán)利要求的保護(hù)范圍之中。
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權(quán)利要求
1.一種組合物，包括藥物可接受的載體和式(1)化合物 其中n是0、1、或2；Y是氧或硫；R1、R2、和R3分別獨(dú)立地為氫、烷基、烷氧基、鹵素、鹵代烷基或硝基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中化合物(3)是一種式(2)化合物 其中n是0、1、或2；Y是氧或硫；并且R1、R2、和R3分別獨(dú)立地為氫、烷基、烷氧基、鹵素、鹵代烷基或硝基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中R1和R2是氫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中R3是鹵素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中R3是氯或氟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中R3是氫。
7.一種組合物，包括藥物可接受的載體和式(1)化合物(1)CCX-469
8.一種抑制趨化因子與CCR1受體結(jié)合的方法，該趨化因子是指MIP-1α或RANTES，包括將權(quán)利要求1或2的組合物與表達(dá)CCR1受體的細(xì)胞接觸足夠抑制趨化因子與CCR1受體結(jié)合的時(shí)間。
9.一種治療炎性疾病的方法，包括給予需要的患者治療有效量的權(quán)利要求1或2的組合物足夠治療炎性疾病的時(shí)間。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含活性化合物的藥物組合物，其抑制趨化因子、MIP－1α和RANTES活性。本發(fā)明還涉及使用本藥物組合物治療炎性和免疫調(diào)節(jié)性紊亂和疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K31/55GK1658881SQ03813413
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月12日
發(fā)明者B·麥克馬斯特 申請(qǐng)人:坎莫森特里克斯公司