專利名稱:含有生物活性物質的組合物及其制備和處理方法
技術領域:
本發(fā)明涉及含有生物活性物質的組合物及其使用方法。
背景技術:
生物活性物質,可能具有強烈的生理效應,往往對于不利的環(huán)境,例如哺乳動物胃的環(huán)境、高溫環(huán)境或高濕度環(huán)境,非常敏感。這往往限制了它們的使用,也即意味著,它們不便于口服使用,也不便于存儲,也不便于在暖和的生產(chǎn)線上實施。
生物活性物質可以選自由以下物質組成的群組生長促進劑、抗腫瘤制劑、口服疫苗、吸入劑、活的微生物(例如原生生物,諸如乳酸菌)、肽、多肽、核苷酸、聚核苷酸、核苷、蛋白質、糖蛋白、糖和碳水化合物復合物、抗感染劑、抗菌劑、消毒劑、殺菌劑、抗抑郁劑、心理活性劑、基因改造的生物體和感染性制劑,所述基因改造的生物體和感染性制劑用作其它生物活性物質的載體,例如細菌載體(包括大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌、乳酸菌、桿菌、分枝桿菌、志賀氏菌)、病毒載體(包括腺病毒、痘病毒、桿狀病毒、皰疹病毒、腸道病毒、副粘病毒和正粘病毒)、植物載體(包括煙草、土豆、香蕉)、酵母載體、免疫球蛋白或親和純化免疫球蛋白,包括抗疾病和疾病致病劑(例如,幽門螺旋桿菌、大腸桿菌、桿菌、致病的耶爾森氏菌和過敏原)的抗體和含有上述任何生物活性物質的片斷、衍生物和復合物。
對生物活性物質的功能有害的不利環(huán)境例如高酸環(huán)境或高堿環(huán)境、含有蛋白水解酶的環(huán)境、會發(fā)生脫水的環(huán)境、高濕度的環(huán)境、高溫環(huán)境、高壓導致變性的環(huán)境例如壓片機,和含有DNA酶的環(huán)境。
一個特殊的損害生物活性物質功能的不利環(huán)境是哺乳動物的胃環(huán)境,它含有高酸性條件,高溫、高濕度、高濃度的蛋白水解酶和碳水化合物消化酶。
本發(fā)明的一個特殊的應用就是保護生物活性制劑,它們的生物功能在哺乳動物的胃環(huán)境中會受到損害。
現(xiàn)有技術中已經(jīng)知道有許多用于在哺乳動物胃環(huán)境中保持生物功能的方法。這些方法包括腸衣包裹、緩沖液保護、福爾馬林穩(wěn)定、添加抑制分泌的藥物、將生物活性物質與膳食相結合以及改變奶牛的免疫化學反應以使其將生物活性物質分泌到初乳中。
Feichel OL和Lippold BC(《國際藥理學雜志》,2001年3月23日,216(1-2)165-169)建議使用腸衣包裹,包括甲羥基乙基纖維素和羥丙基甲基纖維素醋酸琥珀酸酯,以提供包衣來保護哺乳動物胃中活性物質的含量。
Tacket C等(《新英格蘭藥物雜志》,1986年5月12日,1240-1243)使用碳酸氫鈉緩沖液以降低人體胃中的蛋白水解作用。
Paliwal R和London E(《生物化學》,1996年2月20日,35(7)2374-2379)描述了使用福爾馬林處理以穩(wěn)定白喉類毒素的結構。
Asad M等(《生命科學》,2001年11月21日,70(1)17-24)分別使用后葉催產(chǎn)素和雷替尼丁來降低哺乳動物胃酸的分泌,以提高胃潰瘍治愈率。
McClead和Gregory(《感染與免疫》44474-478)已經(jīng)證明奶牛分泌在初乳中的特定的蛋白質在胃環(huán)境中的穩(wěn)定性比那些通過替代的方式生產(chǎn)的同等級蛋白所預期的更高。Abbot在美國專利5260037中使用了這個保持生物活性功能的原理,他在收獲牛初乳之前,先對奶牛進行了免疫處理。免疫處理使得特定的抗體(如直接抗幽門螺旋桿菌)分泌到了牛初乳(這被稱為超免疫初乳)中。
國際專利申請PCT/AU94/00562中也指出在高壓環(huán)境下,例如壓片機,超免疫牛初乳在生物功能方面是穩(wěn)定的。以下的文獻也指導了超免疫牛初乳的使用·Mitra等,Acta Paediatrica,84996-101,1995.Hyper immune cow colostrums reducesdiarrhea due to rotavirusa double blind,controlled clinical study.
·Nord等,AIDS,4,581-584,1990,Treatment with bovine hyperimmune colostrums ofcryptosporidial diarrhea in AIDS patients.
·Tacket等,New England Journal of Medicine.Ma7 12,1988.Protection by milkimmunoglobulin concentrate against oral challenge with enterotoxigenic E.coli.
·Tacket等,American Journal of Tropical Medical Hygiene.47(3),276-283.1992.Efficacy of Bovine milk immunoglobulin concentrate in preventing illness after Shigella flexerichallenge.
在上述現(xiàn)有技術中,超免疫初乳是生物活性物質的來源,接下來的操作(如果有)包括除去不需要的組分,如水、脂肪、細胞物質、細菌和乳糖。然而其中沒有提及添加初乳或初乳提取物或初乳組分以增強對處于不利環(huán)境中的生物活性物質的功能的保護。
與保持哺乳動物胃環(huán)境中的生物活性物質功能的方法相關的問題如下使用腸衣包裹的方法不適合用于那些在胃中作用的藥物的給藥。這特別限制了通過口服疫苗和/或使用以被動免疫方式直接針對幽門螺旋桿菌的抗體控制幽門螺旋桿菌感染(導致胃炎的主要原因)。
如果生物活性物質功能的喪失是由于酶(例如,肽酶、淀粉酶)的作用而造成的,則使用緩沖液以降低哺乳動物胃中的蛋白水解作用的方法是不適合的。這些酶往往與蛋白療法和活體生物療法中功能的喪失相關。而且,常規(guī)的緩沖液如碳酸氫鈉的使用是不利的。
如果交聯(lián)反應會破壞底物的結構和功能,則使用福爾馬林處理(或其它的交聯(lián)處理)來保持處于不利環(huán)境下的生物活性功能往往是沒有效果的。因為這個原因這種技術很少使用,除非為了保存表面抗原以刺激免疫反應(例如,Petre等,Developmental BiologicalStandards,1996;87125-134所討論的白喉毒素)。
使用刺激奶牛向牛初乳中分泌生物活性物質的方法具有許多局限性。
有些生物活性物質由奶牛分泌到初乳中是非常困難,甚至是不可能的。
生物活性物質的量不穩(wěn)定,而這在質量控制期間是不能接受的。
特定生物活性物質的最大量也是很低的,典型的是初乳中免疫球蛋白小于5%。一個療程的藥片中可接受的最大體積為每片0.5立方厘米(每天2至3片是可接受的)。特定抗體的低濃度嚴重限制了療法的選擇。
而且,被免疫的用以生產(chǎn)初乳的奶牛也生產(chǎn)供人們食用的牛奶,這給調節(jié)和食物安全性的問題帶來了困難。
此外,初乳只能每年一次從奶牛產(chǎn)犢中收獲,這對于后勤和生產(chǎn)成本造成了困難,特別是對于生物活性組分由奶牛向初乳中分泌的情況。
發(fā)明內容
我們驚奇地發(fā)現(xiàn),通過將不穩(wěn)定的生物活性物質與哺乳動物的初乳或其組分在體外(身體之外)進行混合可以保持生物活性物質的功能。哺乳動物初乳可以是加工形式的哺乳動物初乳。
相應地,本發(fā)明公開了一種藥用的不穩(wěn)定生物活性物質的組合物,該組合物包含不穩(wěn)定生物活性物質和哺乳動物初乳的混合物。
不穩(wěn)定生物活性物質是一種在其使用環(huán)境中功能容易損傷的生物活性物質,特別是在不利的環(huán)境下,例如哺乳動物的胃和瘤胃、高溫環(huán)境或高濕環(huán)境。
另一方面,本發(fā)明提供了一種使用不穩(wěn)定生物活性物質(例如在哺乳動物胃或其它不利條件下功能容易損傷的生物活性物質)的方法,包括制備生物活性物質和哺乳動物初乳的混合物的方法,以及在生物活性物質通常不穩(wěn)定的環(huán)境,例如胃環(huán)境或其它不利環(huán)境中使用該混合物的方法。
優(yōu)選的,該組合物是口服的。
本發(fā)明進一步提供了一種使用不穩(wěn)定生物活性物質的方法,包括將治療物質與哺乳動物初乳或其組分進行混合,所述不穩(wěn)定生物活性物質在哺乳動物胃或其它不利環(huán)境中,以及在治療或預防疾病的可吸收的藥物的生產(chǎn)中功能容易受到損傷。
盡管許多工人已經(jīng)注意到,上述組合物比奶牛分泌到初乳中的物質的預期的穩(wěn)定性更高,但是,并沒有人建議可以將初乳或加工的初乳加入到生物活性物質中,以保護它們在胃或瘤胃或其它不利環(huán)境中的功能。
優(yōu)選的,所述生物活性物質是一種能夠使生物體的生理或藥理參數(shù)發(fā)生可測量的變化的物質。
在一個特別優(yōu)選的實施例中,所述生物活性物質是一種抗生素。相應地,本發(fā)明提供了一種抗生素組合物,包括一種抗生素、哺乳動物初乳和選擇性的賦型劑。
另一方面,本發(fā)明提供了一種原生生物的組合物,包括原生菌如乳酸菌,和哺乳動物初乳。
本發(fā)明優(yōu)選的使用一種生物活性物質,其在37℃條件下,在含有0.32%的豬胃蛋白酶溶液的0.03M的NaCl溶液(使用HCl調節(jié)pH至1.2)中培養(yǎng)60分鐘后顯示,功能至少降低20%。
優(yōu)選的,哺乳動物初乳是母牛分娩后的頭4天內收獲的牛初乳;更優(yōu)選的,是母牛分娩后的頭2天內收獲的牛初乳;更優(yōu)選是母牛分娩后的第一天收獲的牛初乳,最優(yōu)選的,是母牛分娩后第一次擠奶所收獲牛初乳。
這里所使用的術語“初乳”包括初乳、加工的初乳(例如經(jīng)過加工部分或全部去除一種或多種脂肪、細胞碎片、乳糖和酪蛋白的初乳)、經(jīng)干燥的初乳或加工的初乳,比如經(jīng)過冷凍干燥、噴霧干燥或其它現(xiàn)有技術已知的方法干燥的初乳或加工的初乳。初乳通常取自分娩后五天內的哺乳動物例如奶牛。
哺乳動物初乳優(yōu)選的是經(jīng)過脫脂工藝加工的,更優(yōu)選的,是經(jīng)過脫脂和脫除細胞碎片工藝加工的,更優(yōu)選的,是經(jīng)過脫脂、脫除細胞碎片和脫除鹽分、糖類、其它低分子量物質和部分水的工藝加工的。
初乳和/或生物活性物質可以是干燥的形式。組合物可以是在干燥過程之前、之中或之后進行徹底地混合。
優(yōu)選的,生物活性物質和哺乳動物初乳是相互混合的,且混合物是水相混合物,可以進行干燥,優(yōu)選的是采用凍干法。
在一個優(yōu)選的實施例中,生物活性物質和初乳提取物的混合物予以凍干,并且至少一半重量的凍干物為所添加的初乳或加工的初乳。在另一個優(yōu)選的實施例中,至少四分之三重量的凍干物為初乳或加工的初乳。
優(yōu)選的,從奶牛身上收集的牛初乳含有至少4%(重量百分比)的總蛋白,更優(yōu)選的是5%;更優(yōu)選的是至少8%;更優(yōu)選的是至少10%。
優(yōu)選的,從奶牛身上收集的初乳中,IgG占總蛋白的比例至少為10%,更優(yōu)選的為20%。
優(yōu)選的,所述生物活性物質選自以下物質組成的群組生長促進劑、抗腫瘤制劑、口服疫苗、吸入劑、活的微生物(例如原生生物,諸如乳酸菌)、肽、多肽、核苷酸、聚核苷酸、核苷、蛋白質、糖蛋白、糖和碳水化合物復合物、抗感染劑、抗菌劑、消毒劑、殺菌劑、抗抑郁劑、心理活性劑、基因改造的生物體和感染性制劑,所述基因改造的生物體和感染性制劑用作其它生物活性物質的載體,例如細菌載體(包括大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌、乳酸菌、桿菌、分枝桿菌、志賀氏菌)、病毒載體(包括腺病毒、痘病毒、桿狀病毒、皰疹病毒、腸道病毒、副粘病毒和正粘病毒)、植物載體(包括煙草、土豆、香蕉)、酵母載體、免疫球蛋白或親和純化免疫球蛋白,包括抗疾病和疾病致病劑(例如,幽門螺旋桿菌、大腸桿菌、桿菌、致病的耶爾森氏菌和過敏原)的抗體和含有上述任何生物活性物質的片斷、衍生物和復合物。
特別優(yōu)選的,所述生物活性物包括單克隆或多克隆免疫球蛋白,或嵌合單克隆抗體,或人源的單克隆抗體,或具有免疫活性片斷的樹枝狀體,或免疫活性片斷例如F(ab)和F(ab)2片斷,重組免疫活性片斷,或親和純化的免疫球蛋白,或它們的免疫活性片斷。這些免疫球蛋白或它們的片斷可以結合致病生物體,這致病生物體包括幽門桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、鼠疫桿菌、腸道病毒71。
本發(fā)明的組合物中的初乳和生物活性物質的比例取決于活性物質的性質,以及其對胃環(huán)境的敏感程度。典型的初乳與活性物質的重量比是大于0.5∶1,更好的是大于2∶1,更好的是大于5∶1。所加入的初乳組分的上限受到治療物質能夠方便地給藥的實際限量的限制。
本發(fā)明的組合物的給藥形式可以是如膠囊、粉末壓片的片劑、噴劑、糖漿、液體或其它現(xiàn)有技術已知的形式。組合物可以進一步包括適合于腸胃使用的載體或賦型劑。載體和賦型劑的例子包括硅土、滑石、二氧化鈦、礬土、淀粉、高嶺土、粉末狀的纖維素、微晶纖維素、支鏈淀粉N、蔗糖、乳糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、羥基丙基纖維素、甲基纖維素、羥基乙基纖維素、羧甲基纖維素、檸檬酸、碳酸氫鈉、硬脂酸鎂、蟲膠、醋酸纖維素、醋酸十六烷酯、枸櫞酸三乙酯、聚乙二醇。
在另一個特定的優(yōu)選實施例中,生物活性物質包括免疫原性蛋白質、糖蛋白或疫苗組分或表達疫苗組分的生物體。疫苗可以是針對致病生物體,例如幽門螺桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、鼠疫桿菌。
在一個特別的優(yōu)選的實施例中,生物活性物質選自以下群組(a)抗致病性生物體幽門螺旋桿菌、腸毒性大腸桿菌(ETEC)、細小核糖核酸病毒,特別是腸道病毒、輪狀病毒、炭疽和鼠疫桿菌的抗體或其片斷;(b)抗幽門螺旋桿菌、腸毒性大腸桿菌、炭疽、鼠疫桿菌所分泌的毒素的抗體或其片斷和抗蓖麻毒的抗體;和(c)抗幽門螺旋桿菌、腸毒性大腸桿菌、細小核糖核酸病毒,特別是腸道病毒、輪狀病毒、炭疽和鼠疫桿菌的口服疫苗和吸入疫苗。
在一個特定的優(yōu)選實施例中,本發(fā)明提供了一種治療或預防病人的胃腸疾病的方法,包括對病人使用一種組合物,該組合物包括(a)直接作用于選自幽門螺桿菌和大腸桿菌的致病微生物的疫苗和(b)哺乳動物初乳。通常使用足夠量的初乳以提高疫苗在胃環(huán)境中的活性。
在另一個特定的優(yōu)選實施例中,本發(fā)明提供了一種治療或預防病人的胃潰瘍或幽門螺桿菌感染的方法,包括對病人使用一種組合物,該組合物包括一種直接作用于幽門螺桿菌的結合蛋白并進一步包括哺乳動物初乳。
在一個優(yōu)選實施例中,免疫球蛋白或其片斷源于雞蛋,優(yōu)選的是以滅活的對抗病原的疫苗免疫的母雞的雞蛋。
本發(fā)明對于在胃中起作用的生物活性藥物的給藥特別有用。例如對于抗幽門螺旋桿菌感染的藥物。然而,當置于模擬胃液或其它不利環(huán)境中時,即使是吸入噴劑形式的用于控制呼吸道病原體的生物活性物質,也會喪失活性。初乳或加工初乳可以保護它們以免功能喪失,當生物活性物質以吸入噴劑給藥時,這種保護效果預期是有利的。
本發(fā)明對于保護生物活性物質防止酶作用引起的蛋白水解和低pH條件引起的蛋白水解是有用的。
在過去的十年中,原生生物領域發(fā)展迅速。原生生物包括有益菌,它們可以徹底驅除胃腸道中的有害菌。有益菌的消化不良抑制了乳酸菌的存在。并且在澳大利亞,雙歧桿菌是重要的用于市售原生生物的細菌。這些細菌生產(chǎn)的乳酸抑制了在酸性條件下不能迅速繁殖有害菌。乳酸菌也可以用來生產(chǎn)特定的抗生素。例如嗜酸乳酸菌生產(chǎn)嗜酸菌素,保加利亞乳酸菌生產(chǎn)保加利亞菌素。雙歧桿菌也可以用作原生生物體。據(jù)報道,原生生物能夠幫助消化,協(xié)助腸的清潔,促進腸的經(jīng)常性運動,破壞霉菌、病毒和寄生蟲,并平衡腸道的pH。
原生生物用于治療和預防由于胃腸道中酸的積累和內毒素的產(chǎn)生而引發(fā)酸腸綜合癥也是有效的。
口服原生生物將導致嚴重的活性喪失,因為原生生物要經(jīng)歷胃中苛刻的條件。我們發(fā)現(xiàn),如果按照本發(fā)明的方法服用,原生生物的活性能夠保持在更高的水平。
原生生物可以含有賦型劑和佐劑,可以是片劑、粉末、膠囊或液體形式。本發(fā)明進一步提供了一種治療和預防胃腸功能紊亂的方法,包括使用一種由生物活性物質如乳酸菌和哺乳動物初乳組成的組合物。
細菌的劑量依賴于病人的情況和功能紊亂的性質,但是,典型的是每天最少105CFU乳酸菌。
本發(fā)明對于保持非交聯(lián)生物活性物質的功能是有效的。
本發(fā)明提供了治療藥物的配方,其在以下各個方面顯著優(yōu)于超免疫初乳 生物活性物質的數(shù)量可以控制在嚴格的限制內。
生物活性物質是獨立于初乳制備的,生物活性物質的量不再受制于奶牛免疫活性物質生產(chǎn)的變化。從質量控制的觀點來看,這是非常有利的。
與超免疫初乳可能產(chǎn)生的量相比,在給定體積內可產(chǎn)生的生物活性物質的量能夠提高的倍數(shù)大于4。例如,從鳥類的蛋,特別是免疫母雞的蛋黃,中得到的超免疫免疫球蛋白可以被親和純化,并得到F(ab)2片斷。這顯著的擴展了治療的選擇。
本發(fā)明可以允許生產(chǎn)治療藥而無需破壞供人們食用的奶制品的完整性。例如生物活性物質可以在實驗室制備,而初乳則在正常奶牛身上收獲。
牛初乳提取物是藥用物品管理局名列上的物品,在澳大利亞作為補充藥品使用,因此以口服治療方式使用初乳非常方便。
以下結合具體實施例對本發(fā)明進行描述。應該明白,這些實施例是用于說明本發(fā)明,并非用于限制本發(fā)明的范圍。
許多所討論的實施例參考附圖中所示的結果,其中
圖1為實施例1中初乳保護的脲酶活性的示意圖。
圖2為實施例3中初乳保護的抗體活性的示意圖。
圖3為實施例4中初乳保護的植物乳酸菌存活示意圖。
圖4為實施例6中初乳保護的紅霉素活性的示意圖。
圖5為實施例7中初乳保護的干酪乳酸菌的存活示意圖。
圖6為實施例8中初乳保護的霍亂毒素活性的示意圖。
圖7為實施例9中初乳保護的植物乳酸菌的示意圖。
具體實施例方式
實施例1以胃環(huán)境中初乳保護的酶的活性作為生物活性蛋白保護的例子介紹使用脲酶研究了在胃環(huán)境中,牛初乳作為生物活性蛋白活性的保護劑所起的作用。為了研究初乳的保護特性,分別在有牛初乳和無牛初乳存在的條件下比較了模擬胃液對脲酶活性的作用。
材料和方法試劑脲酶以Sigma公司的III型刀豆脲酶(Cat No U-1500)作為酶的來源。將凍干的脲酶(標示的酶活為16u/mg;在pH7.0和25℃條件下,1u每分鐘從尿素釋放1.0μmol的氨)溶解于MilliQ水至濃度為0.3u/μl(約21mg/ml),冰凍保存?zhèn)溆谩?br>
模擬胃液(SGF)(根據(jù)Hilger等2001的方法修改)。在0.03M的NaCl溶液中制備0.32%的Sigma公司的豬胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液,以HCl調節(jié)pH至1.2。
初乳脫脂、凍干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)來源于非免疫的奶牛,以MilliQ水重新配成300mg/ml貯備。見實施例2關于牛初乳提取物的制備方法。
以模擬胃液(SGF)處理脲酶通過將等分的脲酶溶液與等體積的重新配制的初乳或MilliQ水混合,制備培養(yǎng)混合物一式四份。同時制備對照的初乳和水的混合物(一式兩份)。
培養(yǎng)混合物1-4100μl脲酶+100μlMilliQ水培養(yǎng)混合物5-8100μl脲酶+100μl初乳培養(yǎng)混合物9-10100μl初乳+100μlMilliQ水混合物在37℃的水浴中預熱5分鐘,然后向1,2,5,6和9號試管中加入50μl SGF。向3,4,7,8和10號試管中加入50μl 0.03M的NaCl以啟動模擬實驗。樣品在37℃培養(yǎng)15分鐘,然后向每個試管中加入0.25體積冷凍的160mM Na2CO3終止反應。然后試管在Eppendorf離心機5417C中以20,800g的離心力離心3分鐘,然后冰凍保存。上清液用于脲酶的活性測定。
脲酶測定脲酶活性的測定使用耦合酶測定法以提高靈敏度(對1966年的Kaltwasser和Schlegel方法的修改)。在這個反應中,脲酶催化尿素的水解
通過氨產(chǎn)物與谷氨酸脫氫酶的耦合反應進行測定
這個反應伴隨著NADH氧化為NAD的反應。
最終的1ml測試體積中含有在50mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中終濃度為1.6mM的α-酮戊二酸(Beohringer Mannheim公司,Cat No.127 205),1.5mM NADH(Sigma公司,CatNo.G-4387)、10mM尿素(BeohringerMannheim公司、CatNo.100 164)和1mM的硫化鈉(Sigma公司,CatNo.S-4766)。這些試劑在路徑長度為1cm的聚苯乙烯池(Sarstedt公司,Cat No.67.742)中混合,接著在室溫下于Beckman DU70記錄分光光度計中平衡數(shù)分鐘。在加入樣品前,使用上述混合物將分光光度計調零。
從每一培養(yǎng)混合物中取10μl上清液樣品加入到測試混合物中開始測試。在室溫下于340nm波長每10秒鐘記錄一次反應率,直至4分鐘。反應率通過曲線的線性部分(通常為反應1-2分鐘以后)計算,脲酶活性以每毫克蛋白每分鐘水解的尿素的微摩爾數(shù)表示。
結果
由上表的結果以及圖1所示,將模擬胃液加入至稀釋后的脲酶溶液中,導致了酶的不可逆的變性,隨之而來的是活性的喪失。加入模擬胃液后所剩余的酶活性與對照的單獨的初乳(沒有脲酶)中的酶活性相當。注“模擬實驗”處理是在實驗的處理中使用生理鹽水而不是人工胃液。
相比之下,向脲酶溶液中加入初乳為脲酶提供了保護,使之免受胃蛋白酶和酸的作用。在初乳存在的條件下,受保護的脲酶保留了約80%的模擬實驗處理的脲酶/初乳混合物的活性。使用這種酶模式,牛初乳被證明能夠在模擬胃環(huán)境中為蛋白活性提供保護。
參考文獻Hilger C,Grigioni F,De Beaufort,Michel G,F(xiàn)reilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgGand IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin,Clin Exp Immunol,123389-394.Kaltwasser H and Schelgel HG(1966).NADH-dependent coupled enzyme assay for urease and otherammonia-producing systems.Analytical Biochem,16132-138.Scott DR,Weeks D,Hong C,Postius S,Melchers K and Sachs S(1998).The role of internal urease in acidresistance of Helicobacter pylori.Gastroenterology,11458-70.
實施例2加工的牛初乳粉末的制備方法以下的流程圖顯示了獲得初乳以及將其轉化為加工的形式的原理。
最優(yōu)選的未加工初乳是牛奶場的奶牛在產(chǎn)犢以后第一次擠奶所收獲的初乳。初乳在農場以4℃保存,然后保存于-20℃長途運輸或直接送至牛奶加工。
初乳粗品被加熱至約37℃,然后使用旋轉牛奶脫脂器除去脂肪。得到的液體進行巴氏消毒或用7-10微米的陶瓷過濾系統(tǒng)進行微濾(除去細菌和碎片)。然后將液體進行超濾(例如使用Abcor 10m2超濾設備)以除去大部分的水、乳糖和電解質,留下高蛋白的濃縮物。得到的高蛋白濃縮物進行進一步的加工,優(yōu)選的為凍干(冷凍干燥)或噴霧干燥。
通過上述方法得到具有以下特性的加工的牛初乳粉末。以下所描述的產(chǎn)品屬于澳大利亞藥用物品管理局所列的適用于包含在藥用物品內的物質。
表觀散粒,淺黃色粉末。
性質在水中可分散,受潮后有淡淡的牛奶味。
濕度范圍在2-5%m/m AS 2300.1.1(1988)脂肪范圍在1-4%m/m AS 2300.1.3(1988)灰分(在550℃條件下) 不大于8%m/m AS 2300.1.5(1988)總氮含量(TN)用于報告**AS 2300.1.2(1991)非蛋白的氮含量(NPN)用于報告**AS 2300.1.2.2(1988)純粹蛋白質不少于60%m/m(TN-NPN)%×6.38蛋白質不少于60%m/m AS 2300.1.2(1991)乳糖(一水合物)不大于15%m/m依據(jù)酶解和氧化進行的紫外測定(Boehringer Mannheim)總免疫球蛋白不少于20%m/m放射性免疫擴散測定(m/m代表組合物的總質量中組分的質量)微生物限制符合TGA的指導方針殘留物重金屬 農業(yè)和獸用化學品符合奶制品的ANZFA食品標準規(guī)則。如沒有可適用的食品標準,則使用用于重金屬的BP試驗(2ppm,以鉛計算)和用于殺蟲劑殘留的BP要求。
**用于計算純粹蛋白質的值‘AS’指的是澳大利亞標準組織系列的‘澳大利亞標準’的文獻—在此處指的是用于奶制品質量和組分測試的標準化的方法。
實施例3酸/胃蛋白酶處理過程中初乳對抗體活性的保護使用抗體模型研究了牛初乳作為保護劑對處于胃環(huán)境中的蛋白質活性的作用。為了研究初乳的保護特性,比較了在牛初乳存在和不存在的條件下,模擬胃液對流感病毒特異性單克隆抗體的生物活性的影響。
材料和方法試劑流感病毒和特異性單克隆抗體本研究中所使用的A型流感病毒是Mem71H-BelN(H3N3)。所使用的抗體是Mem71H-BelN特異性IgG2a單克隆(Mab 36/2),以1∶10稀釋于磷酸鹽緩沖液。
模擬胃液(SGF)(根據(jù)2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制備0.32%的Sigma公司的豬胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液,以HCl調節(jié)pH至1.2。
初乳脫脂、凍干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)來源于非免疫的奶牛,以MilliQ水重新配成300mg/ml貯備。
用模擬胃液處理單克隆抗體36/2將等分試樣的抗體以磷酸緩沖液1∶10稀釋,然后與等體積的重新配制的初乳或MilliQ水進行混合以制備培養(yǎng)混合物。同時制備對照的初乳和水的混合物。
培養(yǎng)混合物1-2100μl Mab 36/2+100μl MilliQ水培養(yǎng)混合物3-4100μl Mab 36/2+100μl 初乳培養(yǎng)混合物5-6100μl 初乳+100μl MilliQ 水混合物在37℃的水浴中預熱5分鐘,然后向1,3和5號試管中加入50μl的SGF。向2,4和6號試管中加入50μl 0.03M的NaCl以啟動模擬實驗。所有樣品在37℃培養(yǎng)15分鐘,然后向每個試管中加入0.25體積冷凍的160mM的Na2CO3以終止反應。然后試管在Eppendorf離心機5415D中以16,100g的離心力離心3分鐘,冰凍保存。上清液抗體活性的測定。
血細胞凝集抑制測試以血細胞凝集抑制(HI)測試對抗體的活性進行測定。血細胞凝集滴定和HI測試以96孔U型底的微孔板(SarstedtGroup公司,SA,澳大利亞)和1%(v/v)小雞紅血球按<p>表9.蘇拉明組合物的抗微生物活性的概述
可以認為這是第一次報告蘇拉明顯示抗細菌活性。蘇拉明顯示對沙眼衣原體和淋病奈瑟氏球菌有抑制活性,這是兩種最流行的性傳播病原體。根據(jù)已知的抗病毒或殺錐蟲活性無法預測蘇拉明的這種抗細菌活性。
實施例3局部毒性陰道細胞毒性陰道細胞毒性通過3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)試驗和細胞因子試驗測定,這兩種方法均如Fichorova R.N.等人,J.Infect.Dis.184(4)418-28,2001所述。在暴露于化合物之前通<p>實施例4在酸/胃蛋白酶處理過程中,初乳對植物乳酸桿菌存活力的保護介紹使用乳酸桿菌的活菌平板計數(shù)分析,研究了在胃環(huán)境中牛初乳對細菌存活的保護作用。為了研究初乳的保護特性,在牛初乳存在和不存在的條件下比較了模擬胃液對植物乳酸桿菌的影響。
材料和方法試劑植物乳酸桿菌本研究所使用的植物乳酸桿菌菌株是在原生生物中所使用的菌株,該菌株取至于維多利亞派克維爾的皇家兒童醫(yī)院微生物研究室的培養(yǎng)收集物,并根據(jù)16S測序(對核糖體亞基的DNA測序)進行分類。該菌株在馬血瓊脂(HBA)平板上,在37℃條件下于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48至72小時。從HBA平板上挑取至少2個菌落制備乳酸桿菌接種體,并接種2ml生理鹽水以達到與0.5McFarland標準相同的濁度。然后在所有的處理中使用這個接種體。
模擬胃液(SGF)(根據(jù)2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制備0.32%的Sigma公司的豬胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液,以HCl調節(jié)pH至1.2。
初乳脫脂、凍干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)來源于非免疫的奶牛并經(jīng)過輻射處理。以MilliQ水重新配成300mg/ml貯備。
使用模擬胃液處理乳酸桿菌將等分試樣的植物乳酸桿菌接種體與等體積的重新配制的初乳或MilliQ水進行混合制備培養(yǎng)混合物。同時制備對照的初乳和水的混合物。
培養(yǎng)混合物1-2100μl植物乳酸桿菌+100μl MilliQ水培養(yǎng)混合物3-4100μl植物乳酸桿菌+100μl 初乳培養(yǎng)混合物5-6100μl初乳+100μl MilliQ水混合物在37℃的水浴中預熱5分鐘,然后向1,3和5試管中加入50μl的SGF。向2,4和6號試管中加入50μl 0.03M的NaCl啟動模擬實驗。所有樣品在37℃培養(yǎng)15分鐘,向每個試管中加入0.25體積的冷凍的160mM的Na2CO3終止反應。
乳酸桿菌活菌平板計數(shù)使用活菌平板計數(shù)技術測定處理后的乳酸桿菌的存活情況。處理后立即在生理鹽水中制備10倍稀釋的培養(yǎng)混合物。每種稀釋物取100μl涂布在一式雙份的平板上。平板培養(yǎng)48小時,計算每個平板上菌落的數(shù)量。將稀釋系數(shù)乘以稀釋后懸浮液的cfu/ml的數(shù)目,計算培養(yǎng)混合物中每毫升的菌落形成單位(cfu)的數(shù)目。測試以雙份重復兩次。
結果
如上表的結果和圖3所示,以模擬胃液處理乳酸桿菌的接種體,處理后乳酸桿菌的存活率降低了1000倍。
相比之下,在乳酸桿菌的接種體中加入初乳能夠保護細菌免受胃蛋白酶和酸的作用。在初乳存在的情況下,被保護的乳酸桿菌存活率沒有降低。使用這種活菌平板計數(shù)技術,牛初乳被證明能夠保護模擬胃環(huán)境中原生生物的存活率。
參考文獻Hilger C,Grigioni F,De Beaufort C,Michel G,F(xiàn)reilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgGand IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol,123387-394.Miles A,Misra S(1938).The estimation ofthe bactericidal power of the blood.J Hyg,38732-749.
實施例6在酸/胃蛋白酶處理過程中,初乳對紅霉素活性的保護介紹使用抗生素模型研究了牛初乳對處于胃環(huán)境中的生物活性分子的活性的保護作用。為了研究初乳的保護特性,在牛初乳存在和不存在的條件下,比較了模擬胃液對紅霉素活性的影響。
材料和方法試劑紅霉素使用Boehringer Mannheim公司的紅霉素(C37H57NO13)作為抗生素的來源,以95%的乙醇溶解紅霉素,配成1mg/ml的貯存溶液,于4℃貯存。對于本研究,以MilliQ水稀釋紅霉素貯存溶液至100μg/ml,冰凍保存直至使用。
模擬胃液(SGF)(根據(jù)2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制備0.32%的Sigma公司的豬胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液,以HCl調節(jié)pH至1.2。
初乳脫脂、凍干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)來源于非免疫的奶牛,以MilliQ水重新配成300mg/ml貯備。
以模擬胃液處理紅霉素將等分試樣的紅霉素與等體積的重新配制的初乳或MilliQ水進行混合制備培養(yǎng)混合物。同時制備對照的初乳和水的混合物。
培養(yǎng)混合物1-2100μl紅霉素+100μl MilliQ 水培養(yǎng)混合物3-4100μl紅霉素+100μl 初乳培養(yǎng)混合物5-6100μl初乳+100μl MilliQ 水混合物在37℃的水浴中預熱5分鐘,然后向1,3和5號試管中加入50μl的SGF。向2,4和6號試管中加入50μl 0.03M的NaCl啟動模擬實驗。所有樣品在37℃孵育15分鐘,然后向每個試管中加入0.25體積冷凍的160mM的Na2CO3終止反應。試管在Eppendorf離心機5415D中以16,100g的離心力離心3分鐘,冰凍保存。上清液用于紅霉素活性的測定。
紅霉素的敏感性測定使用枯草芽孢桿菌的圓片擴散敏感性實驗對紅霉素的活性進行測定。從在馬血瓊脂上(HBA)培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)物上挑取至少2個菌落以制備枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)的接種體,并接種2ml生理鹽水以達到與0.5McFarland標準相同的濁度。使用滅菌的接種針對需要測試的HBA平板進行劃線接種,將接種針蘸入標準溶液中,然后在整個平板的表面上在三個方向上均勻地劃線,以獲得均勻的接種。在使用圓片之前,將平板干燥3至5分鐘。
每次處理是以MilliQ水1∶2連續(xù)稀釋,每個稀釋6次。從每一稀釋液取20μl加在一式雙份的空白敏感性圓片上(英國漢普郡Oxoid公司產(chǎn)品)。在置于一式雙份的平板上之前,這些圓片至少干燥30分鐘。對應于單個處理的六次稀釋,每個平板含有六片平均分隔的圓片。將未處理的紅霉素以MilliQ水稀釋至與處理樣品相同的濃度以作為對照,用以獲得標準曲線。平板在37℃培養(yǎng)16-18小時。
培養(yǎng)16-18小時后,通過測定圓片周圍出現(xiàn)的抑菌圈的直徑以測定枯草芽孢桿菌對紅霉素的敏感度。這些抑菌圈是由于圓片中的抗生素擴散進入周圍的瓊脂中而產(chǎn)生。依據(jù)作為對照的未處理的連續(xù)稀釋的紅霉素的抑菌圈的直徑,繪制標準曲線。依據(jù)測試樣品抑菌圈的直徑可以獲得處理后的紅霉素相對未處理的紅霉素的殘留活性的百分比。測試一式雙份重復三次。
結果
如上表的結果和圖4所示,向100μg/ml的紅霉素溶液中加入模擬胃液,導致紅霉素的活性降低92%。
相比之下,向紅霉素溶液中添加初乳可以保護紅霉素免受胃蛋白酶和酸的作用。在初乳存在的條件下,被保護的紅霉素保留了100%活性,與未處理的空白對照(見圖1和圖2)相比,其實際上提高了紅霉素的活性。這提高了的活性也可以從模擬實驗的紅霉素溶液和初乳得到證明。單獨的初乳顯示沒有背景抗生素活性,所以加入初乳帶來的增強的活性不能解釋為初乳中背景紅霉素的活性。使用這種抗生素模型,牛初乳被證明出可以在模擬胃環(huán)境中保護抗生素的活性。
參考文獻Hilger C,Grigioni F,De Beaufort C,Michel G,F(xiàn)reilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgGand IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol,123387-394.Barry AL and Thornsberry C(1991).Susceptibility of testsdiffusion test procedures.In Balos A,Hauser WU,Herman KL,Isenberg HD,and Shadomy HJ.Manual of Clinical Microbiology 5thEdition,American Societyfor Microbiology,Washington,pp1177-1125.
The British Society for Antimicrobial Chemotherapy(1991)A Guide to Sensitivity Testing.The BritishSociety for Antimicrobial Chemothreapy,San Diego.
實施例7初乳對處于酸/胃蛋白酶處理過程中的養(yǎng)樂多代田菌存活的保護介紹通過使用乳酸菌活菌平板計數(shù)測試,研究了牛初乳對于處于胃環(huán)境中的原生生物存活力的保護作用。為了研究初乳的保護作用,在牛初乳存在和不存在的條件下,比較了模擬胃液對于從Yakult發(fā)酵液中分離的養(yǎng)樂多代田菌的影響。
材料和方法試劑養(yǎng)樂多代田菌本研究所使用的養(yǎng)樂多代田菌是從原生生物產(chǎn)品-Yakult中分離得到的。將該菌株在馬血瓊脂(HBA)平板上,于37℃條件二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48至72小時。從HBA培養(yǎng)板上挑取至少2個菌落制備乳酸菌接種體,并接種2ml生理鹽水以達到與0.5McFarland標準相同的濁度。然后這個接種體用于所有處理。
模擬胃液(SGF)(根據(jù)2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制備0.32%的Sigma公司的豬胃蛋白酶(CatNo P-7012源自胃粘膜)溶液,以HCl調節(jié)pH至1.2。
初乳脫脂、凍干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)來源于非免疫的奶牛,以MilliQ水重新配成300mg/ml貯備。
以模擬胃液處理乳酸菌將等分試樣的養(yǎng)樂多代田菌與等體積的重新配制的初乳或MilliQ水進行混合制備培養(yǎng)混合物。同時制備對照的初乳和水的混合物。
培養(yǎng)混合物1-2100μl乳酸菌+100μl MilliQ 水培養(yǎng)混合物3-4100μl乳酸菌+100μl 初乳培養(yǎng)混合物5-6100μl初乳+100μl MilliQ 水混合物在37℃的水浴中預熱5分鐘,然后向1,3和5號試管中加入50μl的SGF。向2,4和6號試管中加入50μl 0.03M的NaCl啟動模擬實驗。所有樣品在37℃培養(yǎng)15分鐘,然后向每個試管中加入0.25體積冷凍的160mM的Na2CO3終止反應。
乳酸菌活菌平板計數(shù)使用活菌平板計數(shù)技術測定處理后的乳酸菌的存活情況。處理后立即在生理鹽水中制備10倍稀釋的培養(yǎng)混合物。每種稀釋物取100μl涂布在一式雙份的平板上。平板培養(yǎng)48小時,計算每個平板上菌落的數(shù)量。將稀釋系數(shù)乘以稀釋后懸浮液的cfu/ml的數(shù)目,計算培養(yǎng)混合物中每毫升的菌落形成單位(cfu)的數(shù)目。測試以雙份重復兩次。
結果
如上表的結果和圖5所示,以模擬胃液處理干酪乳酸菌的接種體,處理后乳酸菌的存活率至少降低了10000倍。
相比之下,在乳酸菌的接種體中加入初乳可以保護原生細菌免受胰蛋白酶和酸的作用。在初乳存在的情況下,被保護的乳酸菌存活率顯示沒有降低。使用這種活菌平板計數(shù)技術,牛初乳被證明能夠保護模擬胃環(huán)境中的原生生物的存活力。
參考文獻Hilger C,Grigioni F,De Beaufort C,Michel G,F(xiàn)reilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgGand IgA antibodies to antigenic determinants ofbovine serum albumin Clin Exp Immunol,123387-394.Miles A,Misra S(1938).The estimation ofthe bactericidal power ofthe blood.J Hyg,38732-749.
實施例8酸/胃蛋白酶處理過程中,初乳對霍亂毒素活性的保護介紹通過使用黏膜輔劑,研究了牛初乳對于處于胃環(huán)境中的輔劑活性的保護作用。為了研究初乳的保護作用,在牛初乳存在和不存在的條件下,比較了模擬胃液對于霍亂毒素的活性的影響。
材料與方法試劑霍亂毒素和Y1腎上腺細胞以Sigma公司的霍亂弧菌的霍亂毒素(Cat No C-8052)作為輔劑的來源。以MilliQ水將霍亂毒素稀釋至3.12μg/ml,冰凍保存直至使用。將Y1鼠腎上腺細胞以每孔2×104個細胞的濃度接種在96孔微孔板中,孔中的培養(yǎng)基為添加了10%胎牛血清(FCS)和慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基。
模擬胃液(SGF)(根據(jù)2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制備0.32%的Sigma公司的豬胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液,以HCl調節(jié)pH至1.2。
初乳脫脂、凍干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)來源于非免疫的奶牛,以MilliQ水重新配成300mg/ml貯備。
以模擬胃液處理霍亂毒素將等分試樣的3.12μg/ml的霍亂毒素貯存液與等體積的重新配制的初乳或MilliQ水進行混合制備培養(yǎng)混合物。同時制備對照的初乳與水的混合物。
培養(yǎng)混合物1-2100μl霍亂毒素+100μl MilliQ 水培養(yǎng)混合物3-4100μl霍亂毒素+100μl 初乳培養(yǎng)混合物5-6100μl 初乳+100μl MilliQ 水混合物在37℃的水浴中預熱5分鐘,然后向1,3和5號試管中加入50μl的SGF。向2,4和6號試管中加入50μl 0.03M的NaCl啟動模擬實驗。所有樣品在37℃培養(yǎng)15分鐘,然后向每個試管中加入0.25體積冷凍的160mM的Na2CO3終止反應。試管在Eppendorf離心機5415D中以16,100g的離心力離心3分鐘,冰凍保存。上清液過濾除菌后用于霍亂毒素的活性測定。
Y1腎上腺細胞的生物學測定使用Y1腎上腺細胞生物學測定法測定霍亂毒素的活性。Y1鼠腎上腺細胞以2×104個細胞的濃度接種在96孔微孔板中。48小時后,細胞用PBS沖洗三次。生長培養(yǎng)基以含有1%FCS和慶大霉素(100μl)的DMEM培養(yǎng)基替代,其中含有經(jīng)過處理的試管的一式雙份的樣品,樣品在最初的1∶10稀釋后,連續(xù)地被2倍稀釋?;魜y毒素使得Y1腎上腺細胞從通常的伸展形態(tài)轉變?yōu)楦鼒A的形態(tài)。這些變化是濃度依賴型的。細胞培養(yǎng)18小時后,用相差顯微鏡檢查典型的細胞成圓。測試的終點是最高稀釋的樣品,其顯示的細胞成圓率超過50%。測試以兩份重復兩次。以同樣的微孔板對起始濃度為10ng/ml的霍亂毒素的兩倍稀釋液進行測試,所得到的結果用于檢查測定的靈敏度。
結果
如上表的結果和圖6所示,以模擬胃液處理霍亂毒素導致霍亂毒素的生物活性完全喪失。
相比之下,向霍亂毒素中添加初乳可以保護霍亂毒素免受胃蛋白酶和酸的作用。在初乳存在的情況下,被保護的霍亂毒素沒有顯示活性的降低。使用這種霍亂毒素測定,牛初乳被證明能夠在模擬胃環(huán)境中為黏膜輔劑提供保護。
參考文獻Hilger C,Grigioni F,De Beaufort C,Michel G,F(xiàn)reilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgGand IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol,123387-394.Taushek M,Gorrell R,Strugnell R,Robins-Browne R(2002).Identification of a protein secretorypathway forthe secretion of het-labile enterotoxin by an enterotoxigenic strain of Escherichia coli.Proc Natl Acad SciUSA,997066-7071.
實施例9小鼠體內模型中初乳對植物乳酸桿菌的保護介紹使用小鼠體內模型研究了在胃環(huán)境中牛初乳對原生生物存活力的保護。為了研究初乳的保護作用,對小鼠喂食含有初乳的植物乳酸桿菌和不含有初乳的植物乳酸桿菌,或作為陽性對照,喂食碳酸氫鈉。
材料與方法試劑植物乳酸桿菌本研究中使用的植物乳酸桿菌菌株是實施例4的菌株。該菌株在牛血瓊脂(HBA)平板上,于37℃、二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48至72小時。從至少兩塊平板上收獲匯合菌苔制備乳酸桿菌接種體,并接種50ml的生理鹽水以達到與McFarland 4標準相同的濁度。將細菌造粒,棄去上清液。然后,細菌顆粒在2.5ml的生理鹽水中重新懸浮。將接種體以1∶1的比例與生物保護物、碳酸氫鈉或生理鹽水混合以使細菌終濃度為1×109cfu/ml。
初乳提取物(也被稱為生物保護物)脫脂、凍干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)來源于非免疫的奶牛并經(jīng)紫外線照射。以MilliQ水重新配成20,40和100mg/ml的樣品。
碳酸氫鈉用MilliQ水將碳酸氫鈉也重新配成濃度為20,40和100mg/ml。
以乳酸桿菌感染小鼠在對小鼠接種乳酸桿菌之前,對小鼠禁食3小時以使小鼠的胃為空。以填喂法對小鼠接種100μl制備的樣品,接種量約為1×108cfu乳酸桿菌(每個樣品中乳酸桿菌的實際數(shù)量通過活菌平板計數(shù)法進行測定)。共7組小鼠,每組3只,對小鼠給予以下樣品乳酸桿菌+生理鹽水乳酸桿菌+20mg/ml生物保護物乳酸桿菌+40mg/ml生物保護物乳酸桿菌+100mg/ml生物保護物乳酸桿菌+20mg/ml碳酸氫鈉乳酸桿菌+40mg/ml碳酸氫鈉乳酸桿菌+100mg/ml碳酸氫鈉由于實驗的原因,小鼠被禁食但是允許隨意進食經(jīng)高壓滅菌的水。乳酸桿菌體內保護作用的測定通過計算3小時后對殖根在大腸的植物乳酸桿菌的數(shù)量來實現(xiàn)。在無菌條件下,割取小鼠的大腸(盲腸和結腸)轉入2ml無菌生理鹽水中。樣品被稱量并被勻化,然后在生理鹽水中十倍稀釋。從每一稀釋液取100μl涂布于乳酸桿菌的選擇性培養(yǎng)基上(含有10μg/ml萬古霉素和12.5μg/ml多粘菌素B的馬血瓊脂)。平板于5%二氧化碳條件下培養(yǎng)48小時,計算每個平板上的菌落數(shù)。由于植物乳酸桿菌的白色不透明的外觀,因而很容易將植物乳酸桿菌從小鼠的通常細菌群落中常見的其它的乳酸桿菌之中分辨出。計算每克腸體的菌落形成單元(cfu)的數(shù)目。
結果如圖7所示,在生物保護物和碳酸氫鈉共同存在的條件下,植物乳酸桿菌的存活率增加了。更高的生物保護物或碳酸氫鈉的濃度可以提高存活率,因而具有更好的保護作用。
實施例10潮濕環(huán)境中初乳對植物乳酸桿菌存活的保護介紹使用乳酸桿菌活菌平板計數(shù)法研究了在不同的濕度條件下,牛初乳提取物對原生生物存活力的保護作用。為了研究初乳提取物的保護特性,比較了在3種恒定濕度的環(huán)境中貯存14天后的植物乳酸桿菌的存活率。
材料與方法試劑植物乳酸桿菌本研究中使用的植物乳酸桿菌菌株是實施例4的菌株。該菌株在牛血瓊脂(HBA)平板上,于37℃、二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48至72小時。從HBA平板上挑取至少2個菌落制備乳酸桿菌接種體,并接種2ml生理鹽水以達到與0.5 McFarland標準相同的濁度。然后接種體在所有處理中使用。
凍干培養(yǎng)基本實驗所使用的凍干培養(yǎng)基(FDM)是衍生于Conrad等的方法(2002)。使用40%w/v的α,α-海藻糖二水合物(Sigma公司)和5.7%w/v的十水四硼酸鈉(Sigma)于無菌的0.6mM磷酸鉀中配制2×濃縮的FDM,pH7.2。開始時,使用固體檸檬酸(Sigma)調節(jié)FDM的pH到6.5,接著使用氫氧化銨(Sigma,29.5%)調節(jié)pH至8.5。然后用0.22μm的膜將這2×濃縮的FDM過濾除菌。
初乳脫脂、凍干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)來源于非免疫的奶牛,重新配制成在2×濃縮的FDM中40mg/ml貯存。
樣品制備冷凍干燥前,制備以下混合物的每種四份的等分樣品(a)植物乳酸桿菌+2×FDM(0.5ml+0.5ml)(b)植物乳酸桿菌+2×FDM中的40mg/ml初乳(0.5ml+0.5ml)將樣品混合后于室溫下培養(yǎng)1小時,然后使用干冰冷凍。然后樣品凍干過夜。
不同濕度下植物乳酸桿菌的穩(wěn)定性使用含有不同溶液的密閉的盒子建立三種恒定濕度的容器。LiCl(Sigma)飽和溶液維持相對濕度(RH)在11.3%(水活度aw=0.113)。80%w/w的丙三醇水溶液(BDH Analar)產(chǎn)生50%相對濕度(aw=0.50)和KCl飽和溶液(BDH Analar)維持85%相對濕度(aw=0.85)(參考Forney & Brandl 1992和Merck Index)。干燥后,使用研缽和杵輕柔地將每個樣品碾成細粉。每個容器中兩個樣品(植物乳酸桿菌+FDM和植物乳酸桿菌+FDM中的初乳),于敞開的廣口瓶中,20℃培養(yǎng)14天。每個混合物的對照樣品于20℃貯于閉口瓶中。
乳酸桿菌的活菌平板計數(shù)使用活菌平板計數(shù)技術測定在不同的相對濕度下培養(yǎng)后的乳酸桿菌的存活情況。在含有0.05%的表面活性劑吐溫-20的生理鹽水中制備10倍稀釋的培養(yǎng)混合物。從每一稀釋液取100μl涂布在兩塊平板上。平板培養(yǎng)48小時后計算每塊平板的菌落數(shù)。通過將稀釋懸浮液的cfu/ml數(shù)目與稀釋系數(shù)相乘,得到每毫升培養(yǎng)混合物的菌落形成單元(cfu)數(shù)目。這些計數(shù)的結果表示為占對照樣品的百分數(shù)。
結果
在暴露于培養(yǎng)基和高濕條件下,牛初乳提取物提高了被凍干的原生生物,植物乳酸桿菌,的存活率。
參考文獻Conrad PB,Miller DP,Cielenski PR and de Pablo JJ(2000).Stabilization and Preservation of Lactobacillusacidophilus in Saccharide Matrices.Cryobiology 4l17-24.
Fornery CF and Brandl DG(1992).Control of Humidity in Small Controlled-environment Chambers usingGlycerol-Water Solutions.HortTechnology Jan/Mar 2(1)52-54.
Merck IndexMisc-98”saturated Solutions”and Misc-103“Constant Humidity Solutions”.
最后,容易理解,在不脫離本發(fā)明此處所描述的要義的基礎上,各種其它的變形和/或替換是可能的。
權利要求
1.一種提高在不利環(huán)境中給藥的不穩(wěn)定生物活性物質的存活能力的方法,其特征在于,該方法包括制成生物活性物質和哺乳動物初乳的混合物。
2.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物活性物質在37℃條件下、在含有0.32%的豬胃蛋白酶的0.03M的NaCl溶液中,以HCl調節(jié)pH至1.2,培養(yǎng)60分鐘后,其功能至少損失20%。
3.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述混合物是通過胃腸道或呼吸道給藥。
4.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述混合物是通過口服使用。
5.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述的生物活性物質選自以下物質組成的群組生長促進劑、抗腫瘤制劑、口服疫苗、吸入劑、活的微生物(例如原生生物,諸如乳酸菌)、肽、多肽、核苷酸、聚核苷酸、核苷、蛋白質、糖蛋白、糖和碳水化合物復合物、抗感染劑、抗菌劑、消毒劑、殺菌劑、抗抑郁劑、心理活性劑、基因改造的生物體和感染性制劑,所述基因改造的生物體和感染性制劑用作其它生物活性物質的載體,例如細菌載體(包括大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌、乳酸菌、桿菌、分枝桿菌、志賀氏菌)、病毒載體(包括腺病毒、痘病毒、桿狀病毒、皰疹病毒、腸道病毒、副粘病毒和正粘病毒)、植物載體(包括煙草、土豆、香蕉)、酵母載體、免疫球蛋白或親和純化免疫球蛋白,包括抗疾病和疾病致病劑(例如,幽門螺旋桿菌、大腸桿菌、桿菌、致病的耶爾森氏菌和過敏原)的抗體和含有上述任何生物活性物質的片斷、衍生物和復合物。
6.特別優(yōu)選的,所述的生物活性物質含有一種或多種免疫球蛋白、單克隆或多克隆抗體、嵌合抗體、人源單克隆抗體和具有免疫活性片斷的樹枝狀體或免疫活性片斷。
7.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物活性物質含有選自以下群組的免疫活性片斷F(ab)和F(ab)2片斷、重組免疫活性片斷、親和純化的免疫球蛋白和親和純化的免疫球蛋白的免疫活性片斷和它們的混合物。
8.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物活性物質至少包括一種原生生物。
9.如權利要求8所述的方法,其特征在于,所述生物活性物質包括一種或多種乳酸桿菌和雙歧桿菌。
10.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物活性物質選自以下物質組成的群組(a)抗致病性生物體幽門螺旋桿菌、腸毒性大腸桿菌(ETEC)、細小核糖核酸病毒,特別是腸道病毒、輪狀病毒、炭疽和鼠疫桿菌的抗體或其片斷;(b)抗幽門螺旋桿菌、腸毒性大腸桿菌、炭疽、鼠疫桿菌所分泌的毒素的抗體或其片斷和抗蓖麻毒的抗體;和(c)抗幽門螺旋桿菌、腸毒性大腸桿菌、細小核糖核酸病毒,特別是腸道病毒、輪狀病毒、炭疽和鼠疫桿菌的口服疫苗和吸入疫苗。
11.如權利要求10所述的方法,其特征在于,所述生物活性物質選自抗幽門螺旋桿菌或腸道病毒71的口服疫苗或抗體或抗體片斷。
12.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物活性物質包括源于初乳或鳥蛋的多克隆抗體或其片斷。
13.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物活性物質包括酸不穩(wěn)定的抗體。
14.一種治療或預防病人胃腸疾病的方法,包括讓病人口服一種組合物,該組合物包括(a)直接作用于選自幽門螺旋桿菌和大腸菌群的致病微生物的疫苗和(b)哺乳動物初乳組成的混合物。
15.如權利要求1所述的組合物,其特征在于,其中初乳與活性物質的重量比大于0.5∶1。
16.如權利要求15所述的組合物,其特征在于,所述重量比大于2∶1。
17.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述混合物置于組合物中使用,所述組合物包括一種或多種載體或適于口服或吸入使用的賦型劑。
18.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述的初乳包括取自于分娩后不超過2天的牛的初乳。
19.如權利要求18所述的方法,其特征在于,所述的牛初乳包括分娩后第一天所獲得的牛初乳。
20.如權利要求1所述的方法,其特征在于,制成初乳和生物活性物質的液體混合物,然后將液體混合物干燥為固體形式。
21.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述哺乳動物初乳是干燥的。
22.如權利要求7所述的方法,其特征在于,所述免疫球蛋白占所收集的初乳中總蛋白含量的比例不少于10%。
23.一種用于不穩(wěn)定生物活性物質給藥的組合物,該組合物包括一種由生物活性物質和哺乳動物初乳組成的混合物。
24.如權利要求23所述的組合物,其特征在于,所述的生物活性物質選自以下物質組成的群組生長促進劑、抗腫瘤制劑、口服疫苗、吸入劑、活的微生物(例如原生生物,諸如乳酸菌)、肽、多肽、核苷酸、聚核苷酸、核苷、蛋白質、糖蛋白、糖和碳水化合物復合物、抗感染劑、抗菌劑、消毒劑、殺菌劑、抗抑郁劑、心理活性劑、基因改造的生物體和感染性制劑,所述基因改造的生物體和感染性制劑用作其它生物活性物質的載體,例如細菌載體(包括大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌、乳酸菌、桿菌、分枝桿菌、志賀氏菌)、病毒載體(包括腺病毒、痘病毒、桿狀病毒、皰疹病毒、腸道病毒、副粘病毒和正粘病毒)、植物載體(包括煙草、土豆、香蕉)、酵母載體、免疫球蛋白或親和純化免疫球蛋白,包括抗疾病和疾病致病劑(例如,幽門螺旋桿菌、大腸桿菌、桿菌、致病的耶爾森氏菌和過敏原)的抗體和含有上述任何生物活性物質的片斷、衍生物和復合物。
25.如權利要求23所述的組合物,其特征在于,所述生物活性物質選自以下物質組成的群組(a)抗致病性生物體幽門螺旋桿菌、腸毒性大腸桿菌(ETEC)、細小核糖核酸病毒,特別是腸道病毒、輪狀病毒、炭疽和鼠疫桿菌的抗體或其片斷;(b)抗幽門螺旋桿菌、腸毒性大腸桿菌、炭疽、鼠疫桿菌所分泌的毒素的抗體或其片斷和抗蓖麻毒的抗體;和(c)抗幽門螺旋桿菌、腸毒性大腸桿菌、細小核糖核酸病毒,特別是腸道病毒、輪狀病毒、炭疽和鼠疫桿菌的口服疫苗和吸入疫苗。
26.如權利要求23所述的組合物,其特征在于,所述的生物活性物質選自抗生素、原生生物、免疫球蛋白、免疫球蛋白的片斷和它們的混合物。
27.如權利要求23所述的組合物,其特征在于,其中初乳與生物活性物質的重量比大于2∶1。
28.如權利要求23所述的組合物,其特征在于,所述哺乳動物初乳包括取自分娩后不超過2天的牛的初乳。
29.如權利要求23所述的組合物,其特征在于,所述混合物通過對最初的生物活性物質和哺乳動物初乳的混合物進行干燥制成。
30.哺乳動物初乳用于制備治病或預防疾病的藥物的用途,其特征在于,將牛初乳與用于治療疾病的不穩(wěn)定生物活性物質進行混合,以更完整地保存生物活性物質的活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高在不利環(huán)境中給藥的不穩(wěn)定生物活性物質的存活力的方法,該方法包括形成生物活性物質和哺乳動物初乳的混合物,也包括一種不穩(wěn)定生物活性物質的藥用組合物,該組合物包含生物活性物質和哺乳動物初乳的混合物。
文檔編號A61P1/12GK1642561SQ03806504
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月21日 優(yōu)先權日2002年3月21日
發(fā)明者格蘭特·托馬斯·羅林, 戈特弗里德·利希蒂, 羅伊·邁克爾·羅賓斯-布朗 申請人:阿納迪斯有限公司