專利名稱：Fgfr激動劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及成纖維細胞生長因子受體(FGFR)激動劑用于診斷、預防和/或治療病理情況的用途，所述的病理情況包括但不限于過度增生性病癥、骨病和血管疾病。尤其是，描述了FGFR-4激動劑，如抗FGFR-4抗體的用途。此外，本發(fā)明涉及包含如上所述的激動劑的藥物組合物和篩選方法。
WO99/37299公開了FGFR抑制劑治療和/或預防與FGFR功能過度(overfunction)相關(guān)的病癥的用途，尤其是癌癥。
令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)在很多情況下，不是FGFR抑制劑而是選擇性FGFR活化劑適合預防和/或治療過度增生性病癥，因為這些激動劑刺激細胞分化過程。
因此，本發(fā)明涉及能夠刺激FGFR類活性的化合物制備治療或診斷劑的用途，如預防和/或治療病理情況如過度增生性病癥，尤其是腫瘤疾病的試劑。
目前，已知四種結(jié)構(gòu)相關(guān)的FGFR基因，它們編碼四種不同的蛋白，即FGFR-1，F(xiàn)GFR-2，F(xiàn)GFR-3和FGFR-4。FGFR蛋白具有由三個免疫球蛋白環(huán)和酸性部分組成的細胞外結(jié)構(gòu)域、疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和具有酪氨酸激酶活性的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。已知FGFR-1、FGFR-2和FGFR-3的不同同工型，它們可以由如可變剪接產(chǎn)生。存在FGFR-4的至少兩個等位基因變體，它們在氨基酸位置388處不同(cf.WO99/37299)，即FGFR-4Gly388和FGFR-4 Arg388。
FGFR激動劑化合物優(yōu)選刺激選自FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3和FGFR-4的FGFR類的活性。更優(yōu)選，F(xiàn)GFR類是FGFR-4。優(yōu)選，該刺激是選擇性的，即，如上所述的FGFR類的刺激不引起其它FGFR類的明顯刺激。在本文中“明顯刺激”意思是在生理學相關(guān)方面，該激動化合物不能刺激其它FGFR分子的生物活性。然而應該注意對于有些實施方案，可能不需要僅對一種FGFR類的特異性，即該激動劑可能刺激兩種或甚至多種FGFR類，其中對各個類刺激的程度可以大致相同或不同。
在第一個實施方案中，該化合物通過結(jié)合FGFR類顯示出其刺激活性，即它結(jié)合選自FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3和尤其是FGFR-4的FGFR類或其同工型或等位基因變體，并因此增加FGFR活性。特別優(yōu)選FGFR-4Gly388的活性增加。優(yōu)選該化合物顯示出FGFR類的選擇性刺激。更優(yōu)選，該化合物不與其它FGFR類交叉反應，即它選擇性結(jié)合給定的FGFR類。然而應該注意對于有些實施方案，可能不需要選擇性。
結(jié)合化合物可以是天然或合成的FGFR配體，它具有所需結(jié)合選擇性。例如FGF-19(Xie等)具有結(jié)合FGFR-4的高度選擇性。在另一方面，該結(jié)合化合物可以是抗FGFR抗體，它特異性結(jié)合FGFR類，如FGFR-4并且對其它FGFR類沒有明顯的交叉反應性。實施例類描述了合適的抗體。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“抗體”包括單克隆抗體和通過已知技術(shù)從其衍生的嵌合或人源化抗體、人抗體、重組抗體如單鏈抗體或抗體片段如Fab、F(ab)2、Fab′抗體片段或重組抗體片段如scFv片段，只要它們顯示選擇性和激動性結(jié)合如上所述的FGFR。此外，該結(jié)合化合物可以是具有抗體樣結(jié)合特征的支架蛋白。
通過結(jié)合FGFR類，該化合物增加受體的生物活性，如酪氨酸激酶活性，與其它蛋白的相互作用能力，如促進細胞-細胞接觸和/或與FGFR“下游靶”如蛋白的其它相互作用。更特別地，F(xiàn)GFR類的酪氨酸磷酸化增加?？梢酝ㄟ^如實施例所述的FGFR類的免疫沉淀和隨后使用合適的抗磷酸酪氨酸抗體測定來確定酪氨酸激酶活性的增加。
在第二個實施方案中，通過間接相互作用刺激FGFR活性。該化合物可以結(jié)合“上游靶”或否則與之相互作用，如不同于FGFR的蛋白，但它可能刺激FGFR活性。
在第三個實施方案中，增加基因劑量刺激FGFR活性，如通過給予和/或過度表達靶細胞或靶生物中的FGFR基因，尤其是FGFR-4基因和更特別是FGFR-4 Arg388基因。這個實施方案優(yōu)選包括基因治療方法，其中依靠合適載體，如本領(lǐng)域已知的病毒或非病毒基因轉(zhuǎn)移載體將FGFR基因?qū)氚屑毎?br> Ballinger等(Nature Biotech 17(1999)，1199-1204)；WO98/21237；FR-A-2796073；和WO00/39311描述了FGFR激動劑的設(shè)計和刺激FGFR活性的其它方法，此處引入作為參考。然而，這些文件無一提示FGFR活化導致致瘤性降低。
本發(fā)明基于驚奇的發(fā)現(xiàn)，即FGFR活性的刺激導致小鼠模型中體內(nèi)的腫瘤大小減小。所以，F(xiàn)GFR活性的刺激可以用于預防和/或治療FGFR相關(guān)病癥如過度增生性病癥，如瘤形成病癥，如結(jié)腸、腎臟、膀胱、胰腺、前列腺、胃、乳房、肺、甲狀腺、垂體、腎上腺和卵巢腫瘤或成膠質(zhì)細胞瘤、白血病，以及甲狀腺增生、色素性視網(wǎng)膜炎、青春期早熟(precocious puberty)、肢端肥大癥和哮喘。更多實例是骨病如骨質(zhì)疏松癥和血管疾病如restinosis、artherosclerosis和高血壓。
因此，本發(fā)明涉及預防和/或治療與FGFR功能障礙(dysfunction)相關(guān)的病癥，尤其是與至少部分缺乏FGFR活性相關(guān)的病癥，包括給需要其的受試者施用刺激FGFR活性有效量的化合物。尤其是，本發(fā)明也涉及預防和/或治療與FGFR功能障礙相關(guān)的病癥，尤其是與至少部分缺乏FGFR活性相關(guān)的病癥，包括給需要其的受試者施用選擇性結(jié)合FGFR類和通過與其結(jié)合能夠刺激FGFR活性的有效量的化合物。該受試者優(yōu)選是哺乳動物和更優(yōu)選人。對于醫(yī)學目的，該化合物通常以藥物可接受組合物給予，它可以含有合適稀釋劑、載體和/或助劑。該化合物也可以含有更多藥物活性試劑，如治療癌癥的細胞毒性試劑。
適合用于本發(fā)明的藥物組合物包括其中含達到期望目的，如治療或診斷目的有效量的活性成分的組合物。治療有效量劑量是指導致患者癥狀改善或存活延長的化合物的量。這種化合物的毒性和治療功效可以在細胞培養(yǎng)或試驗動物中通過標準藥學方法來確定，如確定LD50(群體50％致死劑量)和ED50(群體50％治療有效劑量)。對于本發(fā)明方法中使用的任何化合物，可以從細胞培養(yǎng)試驗初步估計治療有效量。例如，可以配制在動物模型中的劑量達到循環(huán)濃度范圍，包括細胞培養(yǎng)中確定的IC50(即達到生長因子受體活性最大值一半抑制的測試化合物的濃度)。這種信息可以用于更精確確定在人中有效的劑量。毒性和治療效果之間的劑量比率是治療指數(shù)且它可以以LD50和ED50之間的比率來表達。優(yōu)選顯示出高治療指數(shù)的化合物。精確配方、給藥途徑和劑量可以由各個醫(yī)師根據(jù)患者的情況選擇(見如Fingl等，1975，in″The Pharmacological Basis of Therapeutics″，Ch.1，p.1)。
可以分別調(diào)節(jié)劑量和間隔以提供足以維持受體調(diào)節(jié)作用的活性部分的血漿水平或最低有效濃度(MEC)。對于每個化合物MEC將變化，但可以從體外數(shù)據(jù)來估計，如使用這里所述試驗達到受體50-90％抑制所需的濃度。應該使用10-90％的時間，優(yōu)選30-90％之間和最優(yōu)選50-90％之間，維持血漿水平超過MEC的方案給予化合物。達到MEC所需的劑量將依賴于個體特征和給藥途徑。在局部給藥或選擇性攝入的情況下，藥物的有效局部濃度可能與血漿濃度無關(guān)。
給予的化合物的真實劑量當然可以依賴正治療的受試者、受試者的體重、罹患疾病的嚴重性、給藥方式和指定醫(yī)師的判斷。
給藥的合適途徑可以例如包括口服、直腸、經(jīng)粘膜或腸道給藥；腸胃外傳遞，包括肌肉內(nèi)、皮下、髓內(nèi)，以及鞘內(nèi)注射、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。
可供選擇地，可以局部而不是全身方式給予化合物，例如，通過化合物直接注射到實體腫瘤，通常以貯庫(depot)或持續(xù)釋放制劑。
此外，可以以靶向藥物傳遞系統(tǒng)給予藥物，例如以腫瘤特異性抗體包裹的脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體可以靶向腫瘤和被腫瘤選擇性吸收。
在一個優(yōu)選實施方案中，該藥物組合物可以是診斷組合物。在優(yōu)選實施方案中，診斷組合物、包含確定FGFR類在靶細胞或靶生物中表達的診斷試劑?？梢栽诘鞍姿酱_定該表達，如通過使用抗FGFR抗體和/或通過確定FGFR活性。在另一方面，可以在核酸水平上確定FGFR表達，如通過確定FGFR mRNA，例如通過RT-PCR方案或本領(lǐng)域已知的另一種合適的檢測方案。
本發(fā)明的另一方面是鑒定病理情況的新抑制劑的方法，如細胞或生物中過度增生過程，尤其是哺乳動物細胞或生物，如人細胞或生物，包括檢測該化合物(1)結(jié)合FGFR類和優(yōu)選(2)通過與其結(jié)合刺激FGFR活性的能力。
可以用高通量篩選方法實施該方法，它可以是使用FGFR表達或過度表達細胞的基于細胞的試驗或使用基本上或特別純化的FGFR蛋白的無細胞試驗。該試驗適合從生物學或合成化合物文庫中鑒定具有期望特性的新化合物或化合物類。此外，本發(fā)明包括該公開方法鑒定的任何新抑制劑。
可以如實施例所述確定測試顯示出期望特性的化合物的能力。
最后，本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生如上所述激動性抗FGFR抗體的細胞系。該細胞系可以是真核或原核細胞系，如哺乳動物細胞系，尤其是淋巴細胞系，如雜交瘤細胞系，或CHO細胞系。此外，該細胞可以是昆蟲細胞系、植物細胞系、真核單細胞生物，如酵母，或細菌，尤其是革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌。該細胞系適合制備如上所述的激動性抗FGFR抗體。


圖1在傷口試驗(wound test)中，表達人FGFR-4 Gly388的MDA-MB-231乳癌細胞(ATCC HTB-26)顯示轉(zhuǎn)移減少。用塑料尖刮擦含載體對照(A，B)，F(xiàn)GFR-4 Arg388(C，D)或FGFR-4Gly388 cDNA(E，F(xiàn))的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的融合單層細胞并用0％FCS(A，C，E)或0.5％FCS(B，D，F(xiàn))培養(yǎng)。24小時后，與FGFR-4 Gly388相比，很多單個對照和FGFR-4 Arg388細胞遷移到傷口(B，D)，F(xiàn)GFR-4 Gly388顯示在傷口(F)中僅少數(shù)單個細胞。
圖2
用1μg/ml和10μg/ml 4FA6D3C10或相同量對照抗體(α-C)刺激表達人FGFR-4的L6成肌細胞(ATCC CRL-1458)10分鐘。使用多克隆抗FGFR-4(α-FGFR-4)抗體使細胞溶解產(chǎn)物進行免疫沉淀(IP)。用單克隆抗磷酸酪氨酸抗體(α-PY)(上板)通過western印跡(WB)分析酪氨酸磷酸化水平。用α-FGFR-4抗體(下板)通過再次印跡檢查等負荷的蛋白。
圖3用aFGF和bFGF配體處理可降低異位表達人FGFR-4(MCF7/FGFR4-克隆1和-克隆2)的活力MCF7乳癌細胞數(shù)量。
圖4用aFGF和bFGF配體處理可降低異位表達人FGFR-4(BT549/FGFR4-克隆1和-克隆2)的活BT549乳癌細胞數(shù)量。
實施例1為了研究FGFR-4表達在腫瘤細胞遷移中的作用，我們在人乳癌細胞中異位表達人FGFR-4 Gly388和FGFR-4 Arg388。分別從MDA-MB-453細胞(ATCC HTB-131)和K562細胞(ATCC CCL-243)擴增適當?shù)腇GFR-4 cDNA，并根據(jù)標準方案(目前方案)亞克隆到Bluescript I KS載體(Stratagene)。兩種DNA都克隆到pLXSN載體(Stratagene)。使用磷酸鈣DNA共沉淀法，用這些載體轉(zhuǎn)染產(chǎn)生兼嗜性病毒的包裝細胞系Phoenix A(Prof.Nolan惠贈，StanfordUniversity)。收集轉(zhuǎn)染的Phoenix A細胞上清并通過0.45μm過濾器過濾。載體pLXSN單獨感染的細胞用作對照。
對于人乳癌細胞系MDA-MB-231的感染，它不表達可檢測量的FGFR-4，細胞與病毒上清培養(yǎng)24小時。48小時后，用含400μg/ml G418的培養(yǎng)基取代培養(yǎng)基并在G418下進一步選擇14天。有限稀釋產(chǎn)生了克隆細胞系。用western印跡分析確定FGFR-4表達。對于每個FGFR-4同工型，F(xiàn)GFR-4 Gly388和FGFR-4 Arg388，分別選擇顯示類似FGFR-4表達水平的兩個克隆細胞系進行進一步分析。以類似方式，用來自產(chǎn)外生(ectotrophic)病毒的細胞系GF+E 86(Markowitz等，1988)的上清感染小鼠NIH-3T3(ATCC CRL-1658)和大鼠L6成肌細胞分別產(chǎn)生細胞系NIH-3T3/huFGFR-4和L6/huFGFR-4。
我們接下來使用刮擦傷口方法(Hutenlochner等，1998)檢測了MDA-MB-231乳癌細胞的遷移。在用塑料尖輕輕刮擦傷口后，細胞以融合單層生長并且研究傷口閉合過程中的遷移。除去培養(yǎng)基并用PBS洗滌細胞兩次。添加不含胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基或含0.5％FCS的培養(yǎng)基，并允許細胞分散/遷移到澄清區(qū)域24小時。驚奇的是，與對照MDA-MB-231細胞相比，過度表達FGFR-4Gly388的細胞培養(yǎng)物中，傷口閉合率降低(圖1)。相比之下，對照病毒感染的細胞或表達FGFR-4 Arg388的細胞以分散模式遷移到傷口。因此表達FGFR-4Gly388的MDA-MB-231細胞顯示細胞遷移抑制。
為了確定FGFR-4對體外腫瘤表型的作用是否轉(zhuǎn)變成對致瘤性的體內(nèi)作用，我們評估了小鼠中FGFR-4的表達對腫瘤生長的作用。在Max-Planck-Institut，Martinsried，德國的動物廠中飼養(yǎng)的七至十周齡雌性Balb/c nu/nu小鼠用于該試驗。它們保持在無特殊病原體的條件下。它們的護理和居室是根據(jù)德國法律并由被許可的研究員監(jiān)督。表達FGFR-4Gly388或FGFR-4 Arg388或?qū)φ盏男迈r胰蛋白酶作用的半融合MDA-MB-231細胞克隆以2.8×107個細胞/ml的濃度懸浮于磷酸緩沖鹽水(PBS)中。每只小鼠在頸部區(qū)域皮下接種四百萬個細胞(140μl細胞懸液+60μl Matrigel；13μg/ml)。對于FGFR-4Gly388和FGFR-4 Arg388，選擇兩個單個克隆細胞系并注射到如上所述的5-8只動物組。腫瘤形成監(jiān)測達六周。其后，或不論何時，殺死腫瘤直徑達到1cm3大小的動物。使用測徑規(guī)每周測定三次腫瘤大小，使用公式長度×寬度2/2來估計腫瘤體積。
如表1總結(jié)，注射既不表達FGFR-4 Gly388也不表達FGFR-4Arg388受體的對照細胞的小鼠一周內(nèi)形成的腫瘤和四周后平均腫瘤大小是1cm3。驚奇的是，注射表達FGFR-4 Gly388的細胞的13只小鼠中有12只沒有觀察到腫瘤生長，提示FGFR-4 Gly388引起腫瘤形成的完全抑制，因此起腫瘤抑制劑的作用。在六周的監(jiān)測期中沒有檢測到腫瘤。有趣的是，表達FGFR-4 Arg388同工型的細胞使80％和62.5％的被注射小鼠產(chǎn)生腫瘤。然而，由這些細胞所形成的腫瘤大小顯著小于由pLXSN載體單獨感染的對照細胞形成的腫瘤大小。此外，注射表達FGFR-4 Arg388的克隆產(chǎn)生的腫瘤全部比對照細胞得到的腫瘤生長慢得多。因此，盡管FGFR-4 Arg388抑制腫瘤生長的活性低于FGFR-4 Gly388，但與缺乏FGFR-4表達相比，它仍提供了顯著的優(yōu)點。
這些結(jié)果證明FGFR-4的特殊活性具有阻斷和/或抑制腫瘤進展的潛力。因此，我們接下來的研究集中在抗FGFR-4細胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體的產(chǎn)生及其在FGFR-4活化中的用途。為了這點，制備包含F(xiàn)GFR-4細胞外結(jié)構(gòu)域(FGFR-4 ex)重組谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)(Smith & Johnson，1988)融合蛋白。我們使用克隆載體pSj26(mod)(Seiffert等，1999)，它是為重組融合蛋白的真核表達和分泌而設(shè)計的，并且通過在pCDNA3的Xho1和Apa1位點中插入編碼日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)完全DNA序列(Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，Germany)，而由pCDNA3克隆載體(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)得到的。
使用下列引物有義AAGAATTCGCCACCATGCGGCTGCTGCTGGCCCTGTTG(SEQID NO.1)，反義CGAGGCCAGGTATACGGACATCATCCTCGAGTT(SEQ ID NO.2)PCR擴增FGFR-4的細胞外結(jié)構(gòu)域。用EcoRI和XhoI消化PCR產(chǎn)物并克隆到pSj26(mod)。所得pSj26(mod)-FGFR-4ex表達質(zhì)粒通過磷酸鈣DNA共沉淀方法轉(zhuǎn)染293細胞(ATCCCRL-1573)。細胞在補充了10％FCS的Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中生長。用1mg/ml G418(Sigma，Deisenhofen，Germany)選擇兩周后，用抗GST抗體通過western印跡分析測試存活克隆的融合蛋白的表達和分泌。高表達細胞用于產(chǎn)生FGFR-4 ex。每隔兩天從融合培養(yǎng)物中收集培養(yǎng)基。無菌過濾一升收集的培養(yǎng)基并與1ml谷胱苷肽瓊脂糖(Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，Germany)4℃孵育過夜。分離瓊脂糖并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌。用5ml 10mmol/l谷胱苷肽在20℃實施洗脫。洗脫的融合蛋白在PBS/10％甘油中以1∶106(體積/體積)透析。使用MicroBCA蛋白確定試劑盒(Pierce，Rockford，IL)確定蛋白濃度。
通過用如前述含F(xiàn)GFR-4完整細胞外結(jié)構(gòu)域的純化重組FGFR-4-GST融合蛋白免疫四至八周齡雌性Balb/c小鼠來產(chǎn)生單克隆抗體。給小鼠以14天間隔肌肉內(nèi)注射3次1∶2稀釋于ABM-2佐劑(PanSystems，Aidenbach，Germany)的50μg蛋白。最后注射4天后取出脾與SP2/0骨髓瘤細胞系融合。所得雜交瘤生長在含10％FCS、抗生素和次黃嘌呤、氨基喋呤、和胸腺嘧啶(HAT)(Sigma)的RPMI1640培養(yǎng)基中。用流式細胞儀對NIH-3T3/huFGFR-4細胞(見上)篩選細胞上清，有限稀釋克隆分泌選擇性識別上清的抗體但不是親代NIH-3T3細胞的陽性雜交瘤。在補充1％Nutridoma(Roche，Germany)的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)FGFR-4-反應性克隆(4FA6D3C10)，使用蛋白G-瓊脂糖柱(Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，Germany)從上清純化抗體。
為了評估4FA6D3C10對FGFR-4活化的功能作用，L6/huFGFR-4細胞保留不處理或用10和20μg/ml 4FA6D3C10在37℃刺激10分鐘。在冰上裂解緩沖液(50mM HEPES pH 7.5，含150mM NaCI，1mMEDTA，10％(v/v)甘油，1％(v/v)Triton X-100，1mM氟化鈉，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原釩酸鈉，1mMβ-甘油磷酸酯，10μg/ml抑酶肽)中裂解細胞。粗裂解產(chǎn)物在12500g，4℃離心20分鐘。多克隆FGFR-4抗體(Santa Cruz)和30μl添加到澄清裂解產(chǎn)物的蛋白A-瓊脂糖(Pharmacia)來免疫沉淀過度表達的FGFR-4并在4℃孵育3小時。用洗滌緩沖液(20mM HEPES pH 7.5，含150mM NaCl，1mM EDTA，1mM氟化鈉10％(v/v)甘油，1％(v/v)TritonX-100)洗滌免疫沉淀物。添加含SDS和2-巰基乙醇的樣品緩沖液并在95℃加熱4分鐘變性該樣品。
SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。為了確定FGFR-4的酪氨酸磷酸化水平，硝酸纖維素濾膜與磷酸酪氨酸特異性小鼠單克隆抗體4G10(Upstate Biotechnology)在4℃孵育。接下來，添加HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠或山羊抗兔第二抗體，隨后是增強化學發(fā)光(ECL)底物反應(Amersham，Germany)。在Kodak X-Omat膜上檢測底物反應。為了確保等量免疫沉淀的FGFR-4蛋白，根據(jù)制造商的方案(Amersham，Germany)剝脫膜，用多克隆FGFR-4抗體封閉和再探測。
4FA6D3C10對L6/huFGFR-4細胞的處理導致FGFR-4酪氨酸磷酸化顯著增加，如圖2所示。這些數(shù)據(jù)證明了單克隆抗體和尤其是4FA6D3C10可用于FGFR-4受體活化。
表1

表1每只小鼠頸部區(qū)域皮下接種4×106個細胞(140μl細胞懸液+60μlMatrigel；13μg/ml)。每隔2-3天檢測腫瘤生長。六周后或無論何時腫瘤直徑達到1cm3大小，殺死動物。a這些細胞形成的腫瘤大小顯著小于pLXSN載體單獨感染的對照細胞形成的腫瘤大小。plx對照細胞，WTFGFR-4 Gly388；MTFGFR-4 Arg388。
實施例2盡管FGFR-4及其配體在很多人癌細胞系中表達，但是尚未完全研究FGFR-4在人腫瘤發(fā)展調(diào)節(jié)中的作用。為了分析FGFR-4在人癌細胞的腫瘤生長調(diào)節(jié)中的作用，我們利用了異位表達人FGFR-4的人乳癌細胞系BT549和MCF7。
乳癌細胞MCF7細胞一式三份鋪在12孔板中，以5000個細胞/500μl補充了10％FCS的培養(yǎng)基中并孵育24小時。用含10ng/ml aFGF和bFGF或25ng/mlβ-Heregulin的1％FCS刺激細胞并生長超過6天的時間。在乳癌細胞BT549的情況下，細胞以一式六份鋪在96孔皿中，以1000個細胞/100μl正常生長培養(yǎng)基(DMEM，10％FCS；0,065％胰島素40U/ml)并孵育24小時。除去培養(yǎng)基并在無FCS和胰島素的情況下，用10ng/ml aFGF、bFGF或25ng/mlβ-Heregulin處理72小時。使用無放射活性的AlamarBlue試驗(Biosource)檢測增殖。簡言之，添加等于10％培養(yǎng)基體積的量的AlmarBlue并在37℃孵育2小時。在544nm激發(fā)波長和580nm發(fā)射波長下測定熒光。為了比較目的，計算值并以對照(未刺激的細胞)的百分比表示。
如圖3所示，aFGF或bFGF刺激空載體感染的MCF7細胞導致活細胞明顯增加。此外，用β-Heregulin或β-Heregulin和bGFG同時處理活化細胞增殖。然而異位表達FGFR-4的MCF7細胞(MCF7FGFR4-克隆1，-克隆2)接觸aFGF或bFGF導致細胞生長降低。此外，當用aFGF、bFGF或β-Heregulin刺激時，表達FGFR-4的乳癌細胞的增殖降低(圖4)，而BT549對照細胞的細胞增殖不受影響。因此，F(xiàn)GFR-4起著MCF7和BT549乳癌細胞抑制劑的作用。
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序列表<110>MPI f.Biochemie<120>FGFR激動劑<130>27320PEP_RI<140>02002358.6<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明引物<400>1aagaattcgc caccatgcgg ctgctgctgg ccctgttg 38<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明引物<400>2cgaggccagg tatacggaca tcatcctcga gtt 3權(quán)利要求
1.能夠刺激成纖維細胞生長因子受體(FGFR)類的化合物制備診斷或治療試劑的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，用于制備預防和/或治療與FGFR功能障礙相關(guān)的病理情況的藥劑。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中FGFR類選自FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3和FGFR-4。
4.權(quán)利要求3的用途，其中FGFR類是FGFR-4。
5.權(quán)利要求4的用途，其中FGFR-4是FGFR-4 Gly388。
6.權(quán)利要求1-5任一項的用途，其中FGFR活性選自酪氨酸激酶活性和/或與其它蛋白相互作用的能力。
7.權(quán)利要求1-6任一項的用途，其中該化合物結(jié)合FGFR類。
8.權(quán)利要求1-7任一項的用途，其中該化合物是天然或合成的FGFR配體。
9.權(quán)利要求1-7任一項的用途，起中該化合物是抗FGFR抗體或支架蛋白。
10.權(quán)利要求1-6任一項的用途，其中該化合物與FGFR的上游靶相互作用。
11.權(quán)利要求1-6任一項的用途，其中該化合物是給予靶細胞或靶生物和/或在其中過度表達的FGFR基因。
12.權(quán)利要求2的用途，其中所述的病理情況是過度增生性病癥，如腫瘤疾病、骨病或血管疾病。
13.預防和/或治療與FGFR功能障礙相關(guān)的疾病的方法，包括給需要其的受試者施與足量的結(jié)合成纖維細胞生長因子受體(FGFR)類并且通過與其結(jié)合能夠刺激FGFR活性的化合物。
14.預防和/或治療與FGFR功能障礙相關(guān)的病癥的方法，包括給需要其的受試者施與足量的刺激FGFR活性的化合物。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中受試者是哺乳動物。
16.權(quán)利要求13或14的方法，其中受試者是人患者。
17.一種藥物組合物，包含作為活性試劑的結(jié)合成纖維細胞生長因子受體(FGFR)類并且通過與其結(jié)合能夠刺激FGFR活性的化合物，任選和藥物可接受載體、稀釋劑和/或助劑一起。
18.權(quán)利要求17的組合物用于預防和/或治療與FGFR功能障礙相關(guān)的病理情況，尤其是過度增生性病癥。
19.診斷與FGFR功能障礙相關(guān)的病理情況的方法，包括確定樣品中FGFR類的表達。
20.鑒定細胞或生物中與FGFR功能障礙相關(guān)的病理過程的新抑制劑的方法，包括測試化合物(1)結(jié)合FGFR類和優(yōu)選(2)通過與其結(jié)合刺激FGFR活性的能力。
21.權(quán)利要求20的方法，它是高通量試驗。
22.能夠表達結(jié)合FGFR類和能夠刺激所述FGFR類的活性的抗體的細胞系。
23.結(jié)合FGFR類和能夠刺激所述FGFR的活性的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及成纖維細胞生長因子受體(FGFR)激動劑診斷、預防和/或治療病理情況的用途，包括但不限于過度增生性病癥、骨病和血管疾病。尤其是，描述了FGFR－4激動劑的用途，如抗FGFR－4抗體。此外，本發(fā)明涉及包含如上所述的激動劑的藥物組合物和篩選方法。
文檔編號A61K38/18GK1638792SQ03804744
公開日2005年7月13日 申請日期2003年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月31日
發(fā)明者J·班格, A·烏爾里希 申請人:馬普科技促進協(xié)會