專利名稱：Sars抗原肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兩種嚴重急性呼吸窘迫綜合征(SARS)病毒的抗原肽，及其在制備SARS疫苗、制備預(yù)防、治療SARS藥物中的用途。
背景技術(shù)：
嚴重急性呼吸窘迫綜合征(以下簡稱SARS)是一種新發(fā)現(xiàn)的急性傳染病。截止目前為止，全球已經(jīng)有8450人染病，810人死亡?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，引起SARS的病原體是一種新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒，該病毒被命名為SARS病毒。
在這次SARS流行以前，人們發(fā)現(xiàn)可以感染人類的冠狀病毒只有HCV-229E和HCV-OC43兩種，15-30％的人類感冒是由這兩種冠狀病毒引起的。通過基因同源性比較，人們發(fā)現(xiàn)SARS病毒與HCV-229e及HCV-OC43的同源性均為30％左右。
實驗證明，冠狀病毒一般為單鏈正鏈RNA病毒，其編碼的S蛋白(spike蛋白)可以與相應(yīng)的受體結(jié)合，從而介導病毒進入宿主細胞。不同的冠狀病毒編碼的S蛋白不同，因此可以識別特定物種細胞的相應(yīng)受體，繼而選擇性的感染特定物種的細胞，是所有冠狀病毒的特點。病毒的基因組必須在宿主細胞內(nèi)被S蛋白等病毒編碼蛋白包裝后，才能形成完整的具有感染性的病毒顆粒。在SARS病毒的包裝過程中，其編碼的S蛋白可以存在于宿主細胞的細胞質(zhì)中。
已知人體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，包括體液免疫與細胞免疫，尤其是T細胞免疫對感染病毒細胞的殺傷對機體清除病毒起著重要的作用，也是機體維持抗病毒感染免疫應(yīng)答的重要方式。隨著對免疫應(yīng)答反應(yīng)本質(zhì)的認識，人們發(fā)現(xiàn)不管免疫應(yīng)答的過程多么復雜，最終導致人體T細胞活化而產(chǎn)生殺傷效應(yīng)的就是與主要組織相容性復合體MHC相結(jié)合形成抗原肽復合物和共刺激信號，即細胞毒性T細胞(CTL)通過自身表面的T細胞受體(TCR)，識別表達于病毒感染細胞表面的病毒基因編碼抗原蛋白質(zhì)/肽與主要組織相容性復合體(MHC)I類抗原相結(jié)合形成的復合體，從而攻擊殺傷腫瘤細胞。
病毒感染宿主細胞以后，其編碼的抗原蛋白質(zhì)/肽在細胞內(nèi)由各種蛋白酶分解成8～10個氨基酸大小的抗原肽，這些抗原肽與同時在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中產(chǎn)生MHCI類分子(如人類細胞的HLA-A2分子)結(jié)合，通過高爾基復合體表達于細胞的表面，最終提呈給腫瘤抗原特異的CTL，從而誘發(fā)免疫應(yīng)答，殺傷并清除病毒感染細胞。因此，可以用含有這些抗原肽的多肽或蛋白質(zhì)片段誘導機體產(chǎn)生只針對這種病毒感染細胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而特異殺傷并清除體內(nèi)的病毒而達到治療或者預(yù)防病毒感染的作用。
抗原肽疫苗是一種既可以用于預(yù)防病毒感染又可以用于治療病毒感染性疾病的新型疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于SARS治療和預(yù)防的抗原肽。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一種SARS抗原肽，由SARS病毒編碼的S蛋白在人體細胞內(nèi)分解產(chǎn)生，并且該多肽能與人類白細胞抗原HLA-A2分子相結(jié)合，在結(jié)合狀態(tài)能被T細胞所識別，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val所示的氨基酸序列，其為SARS病毒S蛋白978～987位的氨基酸序列；(b)含有(a)中的氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)分子，且該多肽或蛋白質(zhì)分子具有與(a)中多肽相同的功能。
本發(fā)明提供上述SARS抗原肽作為SARS病毒抗原及在制備SAPS疫苗中的用途。
本發(fā)明提供上述SARS抗原肽在制備治療SARS藥物中的用途。
本發(fā)明提供上述SARS抗原肽在制備預(yù)防SARS藥物中的用途。
本發(fā)明提供另一種SAPS抗原肽，由SARS病毒編碼的S蛋白在人體細胞內(nèi)分解產(chǎn)生，并且該多肽能與人類白細胞抗原HLA-A2分子相結(jié)合，在結(jié)合狀態(tài)能被T細胞所識別，其具有如下(c)或(d)所述的氨基酸序列(c)具有Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu所示的氨基酸序列，其為SARS病毒S蛋白1203～1212位的氨基酸序列；
(d)含有(c)中的氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)分子，且該多肽或蛋白質(zhì)分子具有與(c)中多肽相同的功能。
本發(fā)明提供上述SARS抗原肽作為SARS病毒抗原及在制備SARS疫苗中的用途。
本發(fā)明提供上述SARS抗原肽在制備治療SARS藥物中的用途。
本發(fā)明提供上述SARS抗原肽在制備預(yù)防SARS藥物中的用途。
本發(fā)明提供的SARS抗原肽可為人工方法合成的化合物、聚合物或復合物，也可通過常規(guī)的重組技術(shù)合成。
本發(fā)明提供的SARS抗原肽的優(yōu)益之處在于本發(fā)明首次將如Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val和Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu所示的多肽鑒定為能與HLA-A2分子相結(jié)合的、在結(jié)合狀態(tài)能被T細胞所識別的肽片段；并在SARS康復患者的機體中，發(fā)現(xiàn)了能識別這兩種多肽序列的特異性T細胞；在使用免疫方法治療SARS時，可以用這些抗原肽誘導機體產(chǎn)生只針對病毒感染細胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而在不殺傷正常細胞的同時，特異殺傷體內(nèi)的病毒感染細胞而達到治療或者預(yù)防SARS病毒感染的作用；同時，也可以通過對能特異性識別該抗原肽的T細胞檢測，對SARS病毒感染的發(fā)生、發(fā)展以及是否能好轉(zhuǎn)進行診斷。


圖1是本發(fā)明的SARS抗原肽與HLA-A2分子結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)圖，其中圖1-1和圖1-2分別代表如序列1和序列2所示的SARS抗原肽與HLA-A2分子形成的復合物；圖2是本發(fā)明SARS抗原肽對T2細胞系表達HLA-A2分子穩(wěn)定性的影響的流式細胞儀分析圖，圖中的陰影部分為陰性對照，圖2-1和圖2-2分別代表如序列1和序列2所示的SARS抗原肽加入培養(yǎng)體系后HLA-A2分子的表達；圖3是通過ELISPOT方法檢測本發(fā)明的SARS抗原肽對SARS康復者外周血單個核細胞分泌IFN-γ的促進作用，圖中斑點的多少反應(yīng)了IFN-γ分泌細胞多少，S1和S2分別代表了如序列1和序列2所示的SARS抗原肽，H1和H2分別代表其同源對照肽；圖4是通過ELISPOT方法檢測本發(fā)明的SARS抗原肽對SARS康復者和正常人外周血單個核細胞分泌IFN-γ的影響作用，圖中黑色條形圖代表SARS康復者的外周血單個核細胞形成的斑點數(shù)目，白色條形圖代表正常人外周血單個核細胞形成的斑點數(shù)目，S1和S2分別代表了如序列1和序列2所示的SARS抗原肽，H1和H2分別代表其同源對照肽。
具體實施例方式
實施例1、抗原肽序列的預(yù)測和分析SYFPEITHI和EpitopePredict都是將不同的抗原肽分子與人HLA-A2分子結(jié)合能力自動進行分析的網(wǎng)絡(luò)工具。這兩種工具都是通過對抗原肽中不同位置和不同種類氨基酸殘基進行積分計算，計算出其與HLA-A2分子是否結(jié)合以及結(jié)合的緊密程度。CLUSTAL W(1.82)是由歐洲生物信息學研究所開發(fā)的專門分析不同生物編碼蛋白質(zhì)同源性的網(wǎng)絡(luò)工具，其通過將氨基酸殘基進行分組和分類，比較不同蛋白質(zhì)中同源性的區(qū)域。Hyperchem release和Autodock都是分析多肽或蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的軟件，它們通過計算多肽或蛋白質(zhì)中各種原子之間的相互作用，計算得到多肽或蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明過程中，三個標準被用來篩選候選抗原肽，以期望獲得目的的抗原肽①候選抗原肽必須是在網(wǎng)絡(luò)工具分析中能與HLA-A2分子結(jié)合且結(jié)合力較強的，但它必須與到目前為止的任何已知抗原肽無關(guān)。②在本發(fā)明過程中的CLUSTAL W(1.82)軟件分析中，候選抗原肽必須位于與SARS病毒感染細胞有關(guān)的S蛋白編碼區(qū)內(nèi)。③在本發(fā)明過程中的Hyperchem release和Autodock軟件分析中，候選抗原肽必須具有能與HLA-A2結(jié)合的結(jié)構(gòu)，且其與HLA-A2分子形成的復合物結(jié)構(gòu)基本穩(wěn)定。基于上述分析，認為如Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val和Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu所示的多肽有可能是本發(fā)明中欲尋找的目的抗原肽。如Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val和Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu所示的多肽與HLA-A2復合物的空間結(jié)構(gòu)見圖1，下一步將設(shè)計實驗予以證明。
實施例2、如Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val和Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu所示的多肽的合成本發(fā)明使用的兩種抗原肽(Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val 和Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu)是由香港科技大學化學系合成，經(jīng)高壓液相層析系統(tǒng)純化獲得，純度＞99.5％。
也可通過常規(guī)的重組技術(shù)合成。
實施例3、用T2細胞結(jié)合實驗的方法來分析本發(fā)明提供的兩種抗原肽與HLA-A2的結(jié)合能力本發(fā)明中使用的T2細胞系是由美國ATCC提供的，經(jīng)篩選的TAP缺失的HLA-A2表達細胞系。由于T2細胞缺失。TAP，不能加工內(nèi)源性的抗原肽分子，因此其表面的HLA-A2分子均無抗原肽結(jié)合。
由于該HLA-A2分子在細胞表面的穩(wěn)定性與是否結(jié)合抗原肽分子密切相關(guān)，所以當加入能與HLA-A2分子結(jié)合的抗原肽(如流感病毒基質(zhì)蛋白抗原肽)后，通過流式細胞儀檢測，可以看到T2細胞系由原有的HLA-A2低表達細胞系，轉(zhuǎn)變?yōu)镠LA-A2分子數(shù)量明顯增加。
應(yīng)用文獻[Cancer Research 61，5145-5152，July 1，2001]提供的方法，使用流式細胞儀檢測，來分析本發(fā)明提供的兩種抗原肽與HLA-A2的結(jié)合能力。得到的實驗結(jié)果如圖2所示，圖中的陰影部分為陰性對照，圖2-1和圖2-2分別代表如序列1和序列2所示的SARS抗原肽加入培養(yǎng)體系后HLA-A2分子的表達。此結(jié)果表明這兩種抗原肽均可以明顯地增加T2細胞表面的HLA-A2分子數(shù)量。因而可以證明實施例1中分析預(yù)測的結(jié)果，序列為Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val和Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu的多肽均是人HLA-A2可以識別的抗原肽。
實施例4、用ELISPOT的方法來分析人外周血單個核細胞對抗原肽Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val和Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu的免疫應(yīng)答用Ficoll從SARS康復者與正常人外周血中，分離純化單個核細胞，將單個核細胞按文獻[Cancer Research 61，5145-5152，July 1，2001]介紹的方法與抗原肽共培養(yǎng)。用ELISPOT試劑盒(DIACLONE)檢測分泌IFN-γ的單個核細胞數(shù)目(即形成的斑點數(shù)目)，結(jié)果如圖3和圖4所示。圖3是通過ELISPOT方法檢測本發(fā)明的SARS抗原肽對SARS康復者外周血單個核細胞分泌IFN-γ的促進作用，圖中斑點的多少反應(yīng)了IFN-γ分泌細胞多少，S1和S2分別代表了如序列1和序列2所示的SARS抗原肽，H1和H2分別代表其同源對照肽。圖4是通過ELISPOT方法檢測本發(fā)明的SARS抗原肽對SARS康復者和正常人外周血單個核細胞分泌IFN-γ的影響作用，圖中黑色條形圖代表SARS康復者的外周血單個核細胞形成的斑點數(shù)目，白色條形圖代表正常人外周血單個核細胞形成的斑點數(shù)目，S1和S2分別代表了如序列1和序列2所示的SARS抗原肽，H1和H2分別代表其同源對照肽。
從圖3和圖4的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的抗原肽能被SARS康復者的外周血細胞特異性的識別，并釋放的IFN-γ，但SARS康復者的外周血細胞不能識別其同源對照序列，且本發(fā)明的抗原肽也不能被未接觸SARS病毒的正常人外周血細胞所識別。這表明如序列1和序列2所示的SARS抗原肽具有SARS病毒感染的特征抗原肽序列，SARS的康復與機體識別上述抗原肽序列有關(guān)。
實施例5、HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠實驗測定抗原肽Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val和Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu的體內(nèi)免疫原性將用抗原肽Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val和Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu及相應(yīng)的對照抗原肽用生理鹽水溶解，按10mg/kg體重，分別經(jīng)皮下注射進入轉(zhuǎn)染了人類HLA-A2基因的C57/BL小鼠體內(nèi)。每隔3至4周，再次接種1次，共3次。在最后一次接種后的1天、3天、1周和3周以后，分別處死接種疫苗的小鼠，取脾臟，分離其中的CD8陽性的T淋巴細胞，按實施例4中介紹的ELISPOT的方法來分析，經(jīng)抗原肽免疫后的小鼠T淋巴細胞對抗原肽Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val和Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu的識別及免疫應(yīng)答能力。
應(yīng)用本發(fā)明的SARS病毒抗原肽序列可以提供治療SARS的醫(yī)藥、可提供SARS感染的診斷方法以及提供制備預(yù)防SARS的疫苗。應(yīng)用含有本發(fā)明序列的多肽或蛋白質(zhì)也可以應(yīng)用于上述各個方面。
序列表序列號1名稱SARS病毒抗原肽序列長度9序列類型氨基酸拓撲學線性序列種類肽來源生物名SARS病毒組織種類S蛋白序列特征特征的記號肽存在位置1..9序列Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val序列號2名稱SARS病毒抗原肽序列長度9序列類型氨基酸拓撲學線性序列種類肽來源生物名SARS病毒組織種類S蛋白序列特征特征的記號肽存在位置1..9序列Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu
FPI03102-sequence list.txtSEQUENCE LISTING<110>北京大學<120>SARS抗原肽<130>FPI03102<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9<212>PRT<213>Coronavirus<400>1Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>Coronavirus<400>2Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu1 權(quán)利要求
1.一種SARS抗原肽，由SARS病毒編碼的S蛋白在人體細胞內(nèi)分解產(chǎn)生，并且該多肽能與人類白細胞抗原HLA-A2分子相結(jié)合，在結(jié)合狀態(tài)能被T細胞所識別，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有Phe-Ile-Ala-Gly-Leu-Ile-Ala-Ile-Val所示的氨基酸序列；(b)含有(a)中所示氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)分子，且該多肽或蛋白質(zhì)分子具有與(a)中多肽相同的功能。
2.一種權(quán)利要求1所述SARS抗原肽作為SARS病毒抗原及在制備SARS疫苗中的用途。
3.一種權(quán)利要求1所述SARS抗原肽在制備治療SARS藥物中的用途。
4.一種權(quán)利要求1所述SARS抗原肽在制備預(yù)防SARS藥物中的用途。
5.一種SARS抗原肽，由SARS病毒編碼的S蛋白在人體細胞內(nèi)分解產(chǎn)生，并且該多肽能與人類白細胞抗原HLA-A2分子相結(jié)合，在結(jié)合狀態(tài)能被T細胞所識別其具有如下(c)或(d)所述的氨基酸序列(c)具有Leu-Ile-Thr-Gly-Arg-Leu-Gln-Ser-Leu所示的氨基酸序列；(d)含有(c)中的氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)分子，且該多肽或蛋白質(zhì)分子具有與(c)中多肽相同的功能。
6.一種權(quán)利要求5所述SARS抗原肽作為SARS病毒抗原及在制備SARS疫苗中的用途。
7.一種權(quán)利要求5所述SARS抗原肽在制備治療SARS藥物中的用途。
8.一種權(quán)利要求5所述SARS抗原肽在制備預(yù)防SARS藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種SARS抗原肽，由SARS病毒編碼的S蛋白在人體細胞內(nèi)分解產(chǎn)生，并且該多肽能與人類白細胞抗原HLA－A2分子相結(jié)合，在結(jié)合狀態(tài)能被T細胞所識別，其具有如下Phe－Ile－Ala－Gly－Leu－Ile－Ala－Ile－Val或Leu－Ile－Thr－Gly－Arg－Leu－Gln－Ser－Leu所示的氨基酸序列，或是含有這兩種多肽片段的、且具有相同功能的多肽或蛋白質(zhì)分子。本發(fā)明提供該SARS抗原肽作為SARS病毒抗原及在制備SARS疫苗中的用途，和在制備治療、預(yù)防SARS藥物中的用途。
文檔編號A61P31/00GK1600791SQ0316005
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月26日
發(fā)明者王月丹, 陳慰峰, 謝雍 申請人:北京大學