專(zhuān)利名稱(chēng)：胸腺素β15促進(jìn)傷口愈合及血管生成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有促進(jìn)組織修復(fù)及血管生長(zhǎng)作用的活性小分子多肽胸腺素β15，其藥物組合物可用于促進(jìn)傷口的組織修復(fù)及愈合，改善缺血組織的血液供應(yīng)。
背景技術(shù)：
皮膚是身體最暴露的部分，特別容易受到各種損傷，常見(jiàn)的原因有機(jī)械性損傷(破裂，切割，摩擦)、物理及化學(xué)性損傷(燒燙傷、凍傷及強(qiáng)酸強(qiáng)鹼損傷)、手術(shù)刀口、褥瘡、以及某些疾病導(dǎo)致的慢性皮膚潰瘍。由于皮膚重要的屏障和生理作用，皮膚的完整性對(duì)每個(gè)人的正常生存至關(guān)重要，任何裂口和撕裂都需要機(jī)體做出保護(hù)性反應(yīng)。除了皮膚的損傷外，各種軟組織及粘膜也易受到損傷，如胃腸粘膜，眼角膜等。
重癥損傷和接受了激素或細(xì)胞毒藥物治療的患者，常出現(xiàn)免疫防御機(jī)能和修復(fù)機(jī)能低下，不僅使其傷口感染率增加和病情加重，而且還造成組織修復(fù)的延遲甚至難以愈合，修復(fù)質(zhì)量也較差，復(fù)發(fā)率較高，給患者帶來(lái)極大的不便和痛苦，嚴(yán)重的還會(huì)引發(fā)其它并發(fā)癥，如感染性休克、消化道穿孔、癌變等，可危及生命。另外，組織器官的衰竭或代謝障礙也是造成一些組織病理性損傷的重要原因，如消化道潰瘍、糖尿病性潰瘍、血液循環(huán)障礙性潰瘍等，治療的關(guān)鍵是增強(qiáng)修復(fù)機(jī)能，提高這些組織的新陳代謝水平，改善微循環(huán)，促進(jìn)組織再生愈合。
正常情況下，傷口可以自然修復(fù)及愈合。傷口自然愈合的過(guò)程包括封閉傷口以限制血液流失并阻止感染；去除受損的組織及血凝塊；繼之周?chē)M織中各種類(lèi)型的細(xì)胞侵入傷口部位并形成肉芽和瘢痕；最后重建瘢痕組織并改變細(xì)胞群體，以導(dǎo)致傷口的完全愈合。一般情況下，如傷口范圍較小或損傷較輕，自然愈合過(guò)程是有效的。但傷口往往因受病人身體素質(zhì)、創(chuàng)傷大小及嚴(yán)重程度和有無(wú)并發(fā)感染等因素的影響，多數(shù)情況下的傷口愈合需要醫(yī)療干預(yù)。而且，一些疾病所導(dǎo)致的慢性皮膚潰瘍，很難醫(yī)治，如糖尿病所致的頑固性皮膚潰瘍。糖尿病是一種常見(jiàn)的疾病，主要是由于胰島素絕對(duì)或相對(duì)缺乏所引起的糖代謝障礙，出現(xiàn)血糖增高和尿糖。目前糖尿病的發(fā)病率，在我國(guó)已經(jīng)高達(dá)2％。患糖尿病后，有30％-50％的病人有皮膚損害，發(fā)生部位多在血液供應(yīng)較差的下肢。許多糖尿病患者因?yàn)樾⌒〉膫诓荒苡?，最后?dǎo)致截肢，甚至因感染而死亡。
傷口的愈合主要由肉芽組織及皮膚組織再生來(lái)完成。大約從第三天開(kāi)始，傷口底部長(zhǎng)出肉芽組織，并向傷口內(nèi)深入。肉芽組織在傷口愈合中有以下重要作用(1)抗感染及保護(hù)創(chuàng)面；(2)機(jī)化血凝快、壞死組織及其他異物；(3)填補(bǔ)傷口或其他缺損。因此，肉芽組織在組織損傷修復(fù)中具有重要意義。肉芽組織的主要成分是旺盛增生的新生毛細(xì)血管以及增生的纖維母細(xì)胞，其中還有多少不等的中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞。最初由血小板發(fā)生聚集反應(yīng)而分泌許多生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，然后由巨噬細(xì)胞對(duì)低氧和乳酸中毒反應(yīng)而分泌，這些因子能夠刺激血管生成。早在傷后2或3天，新的毛細(xì)血管即開(kāi)始從業(yè)已存在的小靜脈抽芽并向受傷處生長(zhǎng)，大約第4天在顯微鏡水平變得清晰可見(jiàn)，新生的毛細(xì)血管連接成網(wǎng)狀。血管生成是組織損傷修復(fù)的一個(gè)重要特征。
表皮及其組織的再生修復(fù)是通過(guò)上皮細(xì)胞遷移、細(xì)胞分裂和上皮分化三個(gè)過(guò)程來(lái)完成的。上皮受損后，缺損周?chē)掀喽说幕讓蛹?xì)胞向創(chuàng)面移動(dòng)，上皮細(xì)胞分裂活躍，逐漸覆蓋傷口表面，上皮進(jìn)一步分化，重建失去的組織結(jié)構(gòu)和功能，如皮膚可以出現(xiàn)上皮的角化等。
目前臨床上用于傷口愈合的新藥主要是生長(zhǎng)因子類(lèi)蛋白，如表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的其它蛋白，例如蛋白轉(zhuǎn)化因子-B家族(TGF-B)?；蛑亟M牛鹼性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Recombinant bovine bFGF)及基因重組人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Recombinant human EGF)已經(jīng)獲得批準(zhǔn)用于臨床治療傷口愈合。目前正在進(jìn)行臨床三期實(shí)驗(yàn)的還有四種基因重組蛋白，包括人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。在傷口愈合療法中使用的這類(lèi)治療蛋白昂貴，儲(chǔ)存不穩(wěn)定并且使用麻煩，蛋白的不穩(wěn)定性(蛋白分解產(chǎn)物)可能導(dǎo)致意外的對(duì)宿主有毒的炎癥性反應(yīng)。
胸腺素是正常情況下存在于人體及動(dòng)物體內(nèi)的一組小分子多肽，可分成α型及β型蛋白家族。α家族的主要代表是胸腺素α1，具有增強(qiáng)免疫功能作用，已用于臨床治療肝炎。β型家族是一組呈酸性的氨基酸序列具有高度同源性的小分子多肽，由43到45個(gè)氨基酸組成，到目前已發(fā)現(xiàn)有15個(gè)成員，其中含量和組織分布最多的是胸腺素β4，其次是胸腺素β10，它們能與肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合，從而抑制肌動(dòng)蛋白的聚合。胸腺素β15最初是從前列腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，它也存在于正常的神經(jīng)組織、腮腺組織、睪丸組織及角化上皮細(xì)胞中。胸腺素β15能結(jié)合到肌動(dòng)蛋白單體上，從而抑制肌動(dòng)蛋白的聚合。
我們經(jīng)過(guò)系列研究發(fā)現(xiàn)胸腺素β15具有明顯的促進(jìn)上皮細(xì)胞角化、促進(jìn)新血管形成的功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示這種多肽小分子能使皮膚上皮細(xì)胞遷移到傷口，刺激傷口形成新生的毛細(xì)血管，刺激成纖維細(xì)胞及真皮細(xì)胞在傷口愈合過(guò)程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白及其它連接組織成分，加強(qiáng)肉芽組織的形成，從而促進(jìn)組織再生，促進(jìn)傷口愈合，并縮短愈合時(shí)間。具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
胸腺素β15不同于市場(chǎng)上應(yīng)用的或正在開(kāi)發(fā)中的治療傷口愈合的藥物。胸腺素β15不是生長(zhǎng)因子，與各種生長(zhǎng)因子相比在治療傷口愈合上有以下幾方面優(yōu)點(diǎn)1)特異性地刺激上皮細(xì)胞移動(dòng)，促進(jìn)上皮細(xì)胞角化；2)特異性地刺激內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)，促進(jìn)血管形成；3)分子量很小，只有45個(gè)氨基酸(生長(zhǎng)因子屬大分子蛋白)，易在組織內(nèi)擴(kuò)散；4)無(wú)副作用，可局部反復(fù)應(yīng)用；5)不易被蛋白水解酶所降解，作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可減少用藥次數(shù)；6)胸腺素β15能直接作用于細(xì)胞骨架系統(tǒng)，具有支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用。因此，胸腺素β15在細(xì)胞再生修復(fù)，傷口愈合中具有非常特殊的重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明起始于研究胸腺素β15對(duì)細(xì)胞分化及對(duì)細(xì)胞遷移的影響。離體試驗(yàn)證明胸腺素β15作為一個(gè)細(xì)胞遷移促進(jìn)因子可刺激人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的定向遷移。用Boyden Chomber方法測(cè)試了多種不同類(lèi)型的細(xì)胞，證明胸腺素β15能夠特異性地刺激人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及表皮細(xì)胞的遷移。在體內(nèi)，胸腺素β15能促進(jìn)細(xì)胞遷移，而且將胸腺素β15局部用于小鼠受傷模型的傷口時(shí)，觀察到有完整的表皮再生，傷口愈合加速。
本發(fā)明進(jìn)一步確定了胸腺素β15能夠在體內(nèi)有效地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的移動(dòng)，促進(jìn)血管形成，以及促進(jìn)傷口的愈合。小鼠眼角膜血管形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，胸腺素β15促進(jìn)血管形成的效果與作為陽(yáng)性對(duì)照的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的效果相當(dāng)、或更好，而且動(dòng)物傷口試驗(yàn)顯示胸腺素β15具有加速傷口愈合的效應(yīng)。傷口局部用胸腺素β15處理后，觀察到有更多更廣泛的新血管的形成及明顯的組織再生。用胸腺素β15后，傷口處膠原合成也增加，說(shuō)明胸腺素β15也能夠加速傷口攣縮。
促進(jìn)組織再生、傷口愈合本發(fā)明提供了一種通過(guò)將含有效劑量的胸腺素β15多肽的藥物組合物用于局部傷口來(lái)加速傷口愈合的方法。胸腺素β15對(duì)加快傷口自然愈合的速度以及促進(jìn)難以治愈的傷口愈合提供了一種有特殊價(jià)值的治療方法。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明單獨(dú)使用具有生物活性的胸腺素β15可加速傷口愈合。此外，胸腺素β15還可以藥物組合物的形式給藥，包括胸腺素β15及其衍生物或其鹽與一種或多種可藥用載體和任選的其它治療成分在一起。載體指的是可藥用的藥物輸送系統(tǒng)，它能與藥物成分相容并且對(duì)受治療者沒(méi)有損害作用。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供含有胸腺素β15或其可藥用鹽或其生理功能衍生物與可藥用的載體在一起的藥物組合物。
胸腺素β15是正常機(jī)體內(nèi)固有的一種多肽成分。因此，使用高度純化的胸腺素β15，或者使用合成或表達(dá)的胸腺素β15是安全可靠的，任何具有能夠誘發(fā)或刺激機(jī)體產(chǎn)生胸腺素β15的生物活性物質(zhì)也可以加進(jìn)組合物中。
本發(fā)明可局部用于表層傷口組織治療皮膚的擦傷、創(chuàng)傷、燒傷、燙傷、凍傷，眼角膜損傷，感染性潰瘍，營(yíng)養(yǎng)障礙性潰瘍，堵塞性潰瘍，眼角膜潰瘍，及其它形式的表面損傷，也可用于某些疾病造成的粘膜損傷，如由胃酸和胃蛋白酶引起的胃或十二指腸的粘膜潰瘍等。另外，胸腺素β15可直接用于外科手術(shù)造成的傷口，或者選用本發(fā)明的組合物處理以加快愈合，例如在手術(shù)皮膚傷口上涂布活性藥劑。
本發(fā)明可以用來(lái)刺激器官組織的再生和修復(fù)。例如手術(shù)切除部分結(jié)腸或其它組織后，在手術(shù)的器官組織部位涂上本發(fā)明藥物組合物以促進(jìn)器官組織的新生血管形成和組織再生，加快器官的愈合過(guò)程。
另一方面，本發(fā)明能減少疤痕組織的形成并促進(jìn)由各種原因?qū)е碌陌毯劢M織的改建及吸收。導(dǎo)致疤痕組織的各種因素包括手術(shù)過(guò)程，輻射，破傷，化學(xué)毒素，病毒及細(xì)菌感染或創(chuàng)傷。本文使用的“疤痕組織”是指?jìng)^(guò)程中和其它病理過(guò)程中形成纖維和膠原組織。例如，將胸腺素β15制成混合劑并投放在損傷組織附近，進(jìn)而促進(jìn)組織再生，血管增生及微循環(huán)系統(tǒng)形成，加速組織的改建，減少疤痕組織的形成。
本發(fā)明還可作為有效成分用于化妝品組合物，可增強(qiáng)肌膚的新陳代謝和防護(hù)機(jī)能，使肌膚柔嫩、豐滿(mǎn)、光澤和健美，具有保健應(yīng)用價(jià)值。
在本發(fā)明的藥物組合物中，可以加入其它具有促進(jìn)傷口愈合的活性成分，這些成分包括各種生長(zhǎng)因子，如類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-1)，血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-Beta)和basic成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等等。
本發(fā)明的藥物組合物中還可以入進(jìn)具有抗感染作用的各種抗菌素，具有抗感染作用的中藥配方，以及具有抗感染作用的其它天然物質(zhì)。
在本文中，“有效量”是指含有胸腺素β15成分的需要量。在組織修復(fù)過(guò)程中這種成分使用到治療劑量時(shí)就會(huì)促進(jìn)組織再生效應(yīng)。胸腺素β15能夠促進(jìn)及調(diào)理組織修復(fù)過(guò)程。組織修復(fù)過(guò)程常常發(fā)生在損傷性疾病之后。組織修復(fù)過(guò)程出現(xiàn)障礙往往是由于在傷口處的各種細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、組織細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)的反映不足而造成的。因此，加入能誘導(dǎo)或刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的活性劑會(huì)有利于組織的修復(fù)。本文使用的“促進(jìn)”一詞是指對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制或過(guò)程具有激活作用，刺激作用，增強(qiáng)作用，起始作用及維持作用。這些細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制或發(fā)生過(guò)程是組織形成，修復(fù)或發(fā)育所必須的。
含有活性胸腺素β15的基質(zhì)或輔料可以充當(dāng)藥物輸送系統(tǒng)。在本發(fā)明中，“藥物輸送系統(tǒng)”指當(dāng)藥物組合物(藥物配制品或劑型)被使用時(shí)，可以將活性胸腺素β15呈遞給人或動(dòng)物的機(jī)體。因此術(shù)語(yǔ)“藥物輸送系統(tǒng)”包括普通的藥物組合物所能使用的所有形式的基質(zhì)或輔料，如固體、半固體、和流體組合物。特殊相關(guān)的組合物是，例如，軟膏、親水軟膏、乳膏、糊劑、霜、凝膠、水凝膠、溶液、乳液、懸浮液、洗液、擦劑、洗發(fā)劑、皂劑、粘貼物、噴霧劑、粉末、薄膜、墊料、敷劑、繃帶、膏藥等。
傷口局部應(yīng)用本發(fā)明藥物組合物優(yōu)選是含有活性成分的軟膏或霜。當(dāng)制成軟膏時(shí)，活性成分可以使用石蠟基或水混溶性軟膏基，或者，制成活性成分含水相油霜基的霜?jiǎng)?。制備涂液、軟膏等外用型組合物的例子，包括將有效劑量的和所需量的添加劑混合而成。這些添加劑通常選自外用藥物或化妝品的常用基質(zhì)或輔料，例如凡士林、液體石蠟、羊毛脂、硬脂酸單甘油脂、聚乙二醇、十六醇、甘油、乙醇和水等。
如果需要，霜的水相可以包括，例如，至少30％W/W的多元醇，即含有兩個(gè)或多個(gè)基的醇，如丙二醇、丁-1，3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇以及它們的混合物。局部用制劑可以根據(jù)需要而增加或減少所含活性成分。
本發(fā)明的藥物組合物還可以是口服液組合物。制備口服液組合物的例子包括將有效劑量的胸腺素β15或其衍生物和所需量的液體基質(zhì)混合制作而成，該基質(zhì)的例子包括水或生理鹽水，其中還可添加其它有益成分或輔料。
本發(fā)明的藥物組合物還可以是口服膠囊、片劑、粉劑等固體劑型組合物的例子，包括將有效劑量的胸腺素β15或其衍生物干粉和所需量的藥用輔料混合制作而成。
本發(fā)明還可以用可控制釋放混合劑的方式使用。本文中的“可控制釋放混合劑”是指任何一種復(fù)合物。這種復(fù)合物可以用來(lái)緩慢釋放包含其中的有效胸腺素β15成分。這種復(fù)合物含有生物有效成分可以是固狀的，滲透性的，半固狀的，膠性的或液狀的。
調(diào)節(jié)血管增生過(guò)程血管增生過(guò)程是一種新血管尤其是毛細(xì)血管生長(zhǎng)的生物過(guò)程，包括內(nèi)皮細(xì)胞增生，轉(zhuǎn)移及遷移，內(nèi)皮細(xì)胞深入組織及內(nèi)皮細(xì)胞的成熟。所述過(guò)程可從三條途徑中的任意一條發(fā)展而成1)新生血管從原已存在的脈管中以發(fā)芽的形式出現(xiàn)；2)由前體細(xì)胞發(fā)生、分化、發(fā)展成新血管；3)現(xiàn)存的小血管直徑增大。血管增生過(guò)程在一系列生物現(xiàn)象中起關(guān)鍵作用。這些生物現(xiàn)象包括生理性的和病理性的，如胚胎發(fā)育，女性的生理繁殖周期，傷口愈合，視網(wǎng)膜病變，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，血管瘤及實(shí)體腫瘤等。
在傷口部位，有膠原、基質(zhì)和含豐富血管的肉芽組織沉積，在組織修復(fù)期間提供傷口強(qiáng)度。已知各種各樣的細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)新血管的形成，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和侵潤(rùn)。已經(jīng)鑒定出具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性的幾種生長(zhǎng)因子包括酸性和鹼性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和胎盤(pán)衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)等。
本發(fā)明確定了胸腺素β15在體外能夠有效地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的移動(dòng)，在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)小鼠眼角膜血管形成。胸腺素β15促進(jìn)血管形成的效果與作為陽(yáng)性對(duì)照的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子的效果相當(dāng)、或更好。而且動(dòng)物傷口試驗(yàn)顯示胸腺素β15具有加速傷口愈合的功能。動(dòng)物傷口局部用胸腺素β15處理后，與對(duì)照組相比較，有更多更廣泛的新血管形成，傷口處膠原合成也增加，說(shuō)明胸腺素β15能夠加速傷口攣縮和促進(jìn)傷口愈合。
本發(fā)明可以用來(lái)治療由糖尿病引起的皮膚潰瘍。血管的循環(huán)障礙是長(zhǎng)期患糖尿病患者中常見(jiàn)的病理變化。糖尿病患者由于血糖持續(xù)偏高而導(dǎo)致血脂升高，小動(dòng)脈出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化及血管阻塞，使得流至下肢的血液量減少。血液的功能是把營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)送到身體的各部組織，同時(shí)也把各組織中產(chǎn)生的廢物運(yùn)送出體外，血液循環(huán)功能降低之后，首先受到影響的便是腳部，因?yàn)槟_部距離心臟最遠(yuǎn)，血液最不容易到達(dá)。因此，下肢的皮膚及軟組織容易缺血壞死，形成難以愈合的皮膚潰瘍。胸腺素β15可用于下肢皮膚潰瘍處，促進(jìn)損傷局部血管形成，改善血液供應(yīng)，促進(jìn)傷口愈合。
本發(fā)明可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及生長(zhǎng)，刺激血管的增殖，增加組織的血流量，從而治療心血管疾病。心血管疾病的特征是心臟或其它靶器官的血液供應(yīng)受到損害。此處所用“心血管疾病”是指心臟及血管由于供血不足而導(dǎo)致的疾病，包括但不局限于，冠狀動(dòng)脈疾病，充血性心力衰竭和外周性血管病。心臟病是指由于冠狀動(dòng)脈的狹窄或阻塞而引起的心臟病變，特點(diǎn)是心臟所需的營(yíng)養(yǎng)成分和氧不足而導(dǎo)致心肌梗死。有效劑量的胸腺素β15可以通過(guò)促進(jìn)血管增生，誘導(dǎo)出額外的毛細(xì)血管，建立側(cè)枝循環(huán)，從而增加心肌組織的血流量，提供心臟所需的營(yíng)養(yǎng)成分，改善氧不足，使心肌組織的氧和作用增加，起到預(yù)防和治療由于冠狀動(dòng)脈的部分或完全栓塞而引起的心肌缺血造成的組織損傷。
本發(fā)明為血液供應(yīng)不足的某些組織提供了一種促進(jìn)新血管增生的方法。例如，因各種原因?qū)е碌拿已汗?yīng)減少、毛囊營(yíng)養(yǎng)不良(但無(wú)毛囊結(jié)構(gòu)破壞)而引起的脫發(fā)。有效劑量的胸腺素β15可以通過(guò)促進(jìn)毛囊組織的血管增生，誘導(dǎo)出額外的毛細(xì)血管，從而增加毛囊組織的血流量，改善血液供應(yīng)，為缺血的毛囊組織提供營(yíng)養(yǎng)，毛囊組織的營(yíng)養(yǎng)改善可促進(jìn)毛發(fā)再生。
另外，本發(fā)明闡述的方法也可以應(yīng)用于誘導(dǎo)性組織再生工程。目前，醫(yī)療技術(shù)人員在進(jìn)行創(chuàng)傷性手術(shù)時(shí)采用誘導(dǎo)性組織再生工程技術(shù)來(lái)促進(jìn)和加快傷口愈合。方法是將具有促進(jìn)組織細(xì)胞遷移、分化的生物活性物質(zhì)殖入傷口處，使形成組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞在傷口處大量聚集。本發(fā)明可以用于幫助人或動(dòng)物肉芽組織的再生。方法是將含有生物可吸收性的多聚體，可溶性的溶劑和胸腺素β15的復(fù)合物放置于人或動(dòng)物肉牙組織再生處。該復(fù)合物通過(guò)釋放有效劑量的胸腺素β15促進(jìn)人或其它哺乳動(dòng)物的肉芽組織再生。
實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)血管生成。新生血管為腫瘤細(xì)胞提供充分的氧氣和營(yíng)養(yǎng)，新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種生長(zhǎng)因子，刺激腫瘤細(xì)胞增殖。腫瘤血管缺乏周細(xì)胞，基底膜不完整，因此，腫瘤細(xì)胞易于進(jìn)入血液循環(huán)。由于新血管形成在腫瘤生長(zhǎng)中起重要作用，所以抑制腫瘤組織的血管生成是優(yōu)選的腫瘤治療實(shí)施方案之一。如果腫瘤組織中沒(méi)有新血管形成，腫瘤組織就不會(huì)得到所需的營(yíng)養(yǎng)，腫瘤生長(zhǎng)緩慢或停止生長(zhǎng)，退化并最終壞死。本發(fā)明中胸腺素β15具有促進(jìn)血管生成作用。因此，胸腺素β15的抑制劑可用于抑制腫瘤組織的血管生成，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。


圖1小鼠皮膚傷口愈合實(shí)驗(yàn)。胸腺素β15處理組的傷口面積比對(duì)照組明顯縮小。胸腺素β15具明顯的促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移，加速傷口愈和的作用。
圖2小鼠皮膚傷口愈合實(shí)驗(yàn)。將小鼠分成胸腺素β15治療組和生理鹽水對(duì)照組，每組各8只小鼠。第7天測(cè)量傷口面積。胸腺素β15治療組的面積明顯小于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有極其顯著性差異(P＜0.001)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1細(xì)胞培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECS)，用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基內(nèi)含有5％牛血清，100單位/毫升青/鏈酶素，50微克/毫升慶大酶素，2-7微克/毫升兩性酶素B，5單位/毫升肝素及200單位/毫升血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等補(bǔ)充劑。人表皮角化細(xì)胞及前額纖維母細(xì)胞用DMEM及10％小牛血清培養(yǎng)，人體乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB435細(xì)胞，用RPMI1640及10％小牛血清培養(yǎng)。中性粒細(xì)胞從新鮮的人外周血中分離而來(lái)。人體血管平滑肌細(xì)胞用平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。
實(shí)施例2細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)為了測(cè)試胸腺素β15刺激以后是否能引起特異性的細(xì)胞游走，我們使用Boyden Chomber方法對(duì)多種細(xì)胞株進(jìn)行了測(cè)試。先將Boyden Chamber兩室間隔的硝膜(孔徑0.8mm)兩側(cè)均覆蓋Fibronection，濃度為15微克/毫升，37℃下放置60分鐘。上室加入細(xì)胞懸液，下室為完全培養(yǎng)液，5％CO2孵箱內(nèi)靜置4小時(shí)，取出濾膜，將上室面細(xì)胞刮除，經(jīng)固定染色后，在顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)。每組3張膜。統(tǒng)計(jì)變量以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。結(jié)果表明胸腺素β15能特異性的引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及人表皮角化細(xì)胞的游走，游走細(xì)胞的數(shù)量明顯增多(結(jié)果見(jiàn)表1)。實(shí)驗(yàn)證明胸腺素β15在10到1000毫微克/毫升的濃度范圍內(nèi)均明顯加速人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的游走，并呈量-效關(guān)系。相反，胸腺素β15未引起中性粒細(xì)胞，MDA-MB435人體乳腺癌細(xì)胞株和人體血管平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞的明顯游走，實(shí)施例3“擦破”傷口關(guān)閉實(shí)驗(yàn)用一毫升吸管尖頭將貼壁生長(zhǎng)的單層人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞劃開(kāi)一道擦痕，用PBS緩沖液洗凈脫落的細(xì)胞。加不同濃度的胸腺素β15后繼續(xù)培養(yǎng)，觀察破痕關(guān)閉情況。1000毫微克/毫升的胸腺素β15處理4小時(shí)以后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞向擦痕處移動(dòng)的數(shù)量明顯多于只加胚養(yǎng)基的對(duì)照組，擦痕關(guān)閉的時(shí)間也明顯加快。
實(shí)施例4促進(jìn)血管增生實(shí)驗(yàn)胸腺素β15對(duì)血管生成的促進(jìn)作用采用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，在孵育7天的受精雞胚蛋殼上開(kāi)一1cm2左右窗口，將不同濃度的化學(xué)合成胸腺素β15蛋白加樣于滅菌濾紙片上，并放置于CAM，然后在恒溫恒濕培養(yǎng)箱37℃下繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，觀察血管生長(zhǎng)情況。本實(shí)驗(yàn)以生理鹽水為測(cè)試對(duì)照，phorbol myristate acetate(PMA)0.5微克/10微升為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明胸腺素β15蛋白加樣組雞胚絨毛尿囊膜血管生長(zhǎng)明顯旺盛，管徑粗且分支多，呈葉狀分布。以生理鹽水組血管生長(zhǎng)程度作為對(duì)照，胸腺素β155微克/10微升的血管增生程度比生理鹽水組顯著增多，10微克/1(微升的血管增生程度與PMA陽(yáng)性對(duì)照組血管增生程度相當(dāng)或略多。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胸腺素β15具有明顯促進(jìn)血管增生作用。
實(shí)施例5傷口愈合實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉后，用4毫米的組織取樣器除去小鼠背部的皮膚，造成直徑約為4毫米大小的傷口，隨后隨機(jī)將動(dòng)物分成胸腺素β15治療組和對(duì)照組(每組8只動(dòng)物)。50微升(含有5微克胸腺素β15)的藥液滴于傷口上，對(duì)照組使用生理鹽水。動(dòng)物每隔一天接收一次治療，連續(xù)觀察7天后處死小鼠。傷口面積用于評(píng)估胸腺素β15的療效。傷口皮膚固定于10％福爾馬林溶液內(nèi)。H&E和膠原染色法用于觀察皮膚的病理學(xué)變化。重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。結(jié)果顯示，胸腺素β15處理組的傷口面積比對(duì)照組縮小一倍，傷口局部有完整的表皮再生，廣泛的新血管形成，膠原合成也明顯增加。傷口愈合時(shí)間比對(duì)照組明顯縮短，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有極其顯著性差異(P＜0.001)。這些結(jié)果表明胸腺素β15具有明顯的促進(jìn)傷口愈合作用(見(jiàn)附圖1和圖2)。
綜上所述，胸腺素β15具明顯的促進(jìn)上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，促進(jìn)新生血管形成，刺激肉芽組成生長(zhǎng)和加速傷口愈和的作用。
表1胸腺素β15對(duì)細(xì)胞游走的影響細(xì)胞種類(lèi) 胸腺素β15濃度(毫微克/毫升)1000 100 10 1 0陽(yáng)性對(duì)照人表皮角化細(xì)胞 77±2.1 63±1.2 52±1.4 18±1.0 8±0.3 51±1.3人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞71±2.4 58±1.4 46±1.5 14±1.3 11±0.6 54±1.6人中性粒細(xì)胞5.2±0.5 4.8±0.75.0±0.45.0±0.45.0±0.3 32.3±0.9血管平滑肌細(xì)胞 1.0±0.4 0.5±0.51.0±0.41.0±0.30.9±0.3 36±3.5人體乳腺癌細(xì)胞 0.9±0.4 1.3±0.71.8±0.42.4±0.82.0±0.5 66±3.7注表中例出的數(shù)據(jù)是三次實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞游走數(shù)的平均值
權(quán)利要求
1.胸腺素β15為一組小分子多肽，胸腺素β15最初是從前列腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，它也存在于正常的神經(jīng)組織、腮腺組織、睪丸組織及角化上皮細(xì)胞中。其藥物組合物可用于促進(jìn)傷口的組織修復(fù)及愈合，改善缺血組織的血液供應(yīng)。
2.本發(fā)明提供了一種通過(guò)將含有效劑量的胸腺素β15多肽的藥物組合物用于局部傷口來(lái)加速傷口愈合的方法；對(duì)加快傷口自然愈合的速度以及促進(jìn)難以治愈的傷口愈合提供了一種有特殊價(jià)值的治療方法。
3.胸腺素β15還可以藥物組合物的形式給藥，包括胸腺素β15及其衍生物或其鹽與一種或多種可藥用載體和任選的其它治療成分在一起。含有胸腺素β15或其可藥用鹽或其生理功能衍生物與可藥用的載體在一起的藥物組合物。
4.本發(fā)明可局部用于表層傷口組織治療皮膚的擦傷、創(chuàng)傷、燒傷、燙傷、凍傷，眼角膜損傷，感染性潰瘍，營(yíng)養(yǎng)障礙性潰瘍，堵塞性潰瘍，眼角膜潰瘍，及其它形式的表面損傷，也可用于某些疾病造成的粘膜損傷，如由胃酸和胃蛋白酶引起的胃或十二指腸的粘膜潰瘍等。另外，胸腺素β15可直接用于外科手術(shù)造成的傷口，或者選用本發(fā)明的組合物處理以加快愈合，例如在手術(shù)皮膚傷口上涂布活性藥劑。
5.本發(fā)明還可作為有效成分用于化妝品組合物，可增強(qiáng)肌膚的新陳代謝和防護(hù)機(jī)能，使肌膚柔嫩、豐滿(mǎn)、光澤和健美，具有保健應(yīng)用價(jià)值。
6.本發(fā)明的藥物組合物中還可以入進(jìn)具有抗感染作用的各種抗菌素，具有抗感染作用的中藥配方，以及具有抗感染作用的其它天然物質(zhì)。
7.含有活性胸腺素β15的基質(zhì)或輔料可以充當(dāng)藥物輸送系統(tǒng)。在本發(fā)明中，“藥物輸送系統(tǒng)”指當(dāng)藥物組合物(藥物配制品或劑型)被使用時(shí)，可以將活性胸腺素15呈遞給人或動(dòng)物的機(jī)體
8.本發(fā)明可以用來(lái)治療由糖尿病引起的皮膚潰瘍
9.本發(fā)明為血液供應(yīng)不足的某些組織提供了一種促進(jìn)新血管增生的方法。
10.本發(fā)明闡述的方法也可以應(yīng)用于誘導(dǎo)性組織再生工程。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有生物活性的胸腺素β15用于組織修復(fù)及傷口愈合的方法。胸腺素β15具有促進(jìn)血管增生及組織再生修復(fù)的作用。因此，含有效劑量的胸腺素β15、其生物活性變體或鹽的藥物組合物可用于治療各種原因?qū)е碌膫?，促進(jìn)其愈合，還可用于治療供血不足而導(dǎo)致的心血管疾病及其它缺血性疾病。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1579539SQ03146158
公開(kāi)日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者干春玉 申請(qǐng)人:干春玉