專利名稱：楊樹(shù)皮類脂佐劑及其制備方法和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種天然免疫佐劑，尤其涉及一種楊樹(shù)皮類脂用作免疫佐劑，以及這種佐劑的制備方法和使用方法。
背景技術(shù)：
運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)疫苗進(jìn)行研究，成為解決和預(yù)防眾多疾病的關(guān)鍵所在。減毒疫苗的出現(xiàn)曾經(jīng)給醫(yī)學(xué)界帶來(lái)驚喜，但是，其在免疫力持續(xù)期方面卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了人們的期望值；滅活苗具有不散布活毒，不會(huì)變異返強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而日益受到重視，因此許多國(guó)內(nèi)外專家力主生產(chǎn)并推廣滅活疫苗取代活苗。近二十年來(lái)開(kāi)始研究的基因工程疫苗則是為了使抗原在機(jī)體中持續(xù)表達(dá)而設(shè)計(jì)的。
由于佐劑能提高疫苗的免疫原性，促進(jìn)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，因此選擇合適的佐劑和開(kāi)發(fā)新型佐劑也是當(dāng)前疫苗研究中的一個(gè)重要部分。上個(gè)世紀(jì)30年代佐劑的研究達(dá)到了第一個(gè)高潮，以白油為佐劑的研究風(fēng)靡全世界，但是，隨之而來(lái)的是副作用之強(qiáng)烈、致癌物質(zhì)的危害。目前廣泛應(yīng)用的滅活疫苗主要是油佐劑疫苗，但油苗存在保護(hù)率低、產(chǎn)生免疫力時(shí)間晚、難保存、難注射、注射局部易發(fā)生腫脹、膿腫、肉芽腫、甚至壞死等一系列缺點(diǎn)。另外，從公共衛(wèi)生的角度看，用于制苗的白油系苯環(huán)類化學(xué)物質(zhì)，有致癌的可能，在動(dòng)物體內(nèi)殘留，對(duì)人體有害。
20世紀(jì)80年代后期及90年代，由于在應(yīng)用生物合成、基因重組及其它現(xiàn)代生物技術(shù)制備大量免疫原性較弱的純化亞單位疫苗或合成疫苗的過(guò)程中，必須利用佐劑才能發(fā)揮其有效的免疫原性，因而再一次推動(dòng)了佐劑的研究。這些研究包括用控制釋放的投遞系統(tǒng)一次免疫、免疫刺激復(fù)合體(ISCOM)、細(xì)胞因子、天然物質(zhì)等，盡管這些佐劑由于種種原因沒(méi)能推廣開(kāi)來(lái)，但是，這些努力卻推動(dòng)了生物制品研究領(lǐng)域最重要內(nèi)容之一的佐劑研究進(jìn)入了新時(shí)代。
以天然免疫增強(qiáng)劑為免疫佐劑的研究方興未艾，以蜂膠為代表的新型佐劑盡管能全面啟動(dòng)細(xì)胞免疫系統(tǒng)，減少應(yīng)激，但存在著免疫期較短，在常溫下保存易發(fā)生變色、沉淀、形成結(jié)塊、副作用大等一系列缺點(diǎn)。
楊樹(shù)皮類脂是從楊樹(shù)皮中提取的一種純天然物質(zhì)(楊樹(shù)皮類脂萃取中試報(bào)告，林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，1992第一期)，具有高度的生物學(xué)活性，富含大量的磷脂、不飽和甾醇、固醇、糖脂、維生素E、胡蘿卜素以及大量的具有維生素PP功能的不飽和脂肪酸、多種常量、微量元素、18種必需氨基酸等。楊樹(shù)皮類脂在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用前景也處于不斷的深入研究中，但到目前為止還沒(méi)有楊樹(shù)皮類脂用作畜禽用疫苗佐劑的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種楊樹(shù)皮類脂作為佐劑的新用途，以及楊樹(shù)皮類脂用作佐劑的制備方法和使用方法。
楊樹(shù)皮類脂用于佐劑是通過(guò)如下方法制備得到的以下操作均為無(wú)菌操作(1)粗提類脂液在20-40℃加熱，同時(shí)按100-1000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速攪拌20-30分鐘；(2)將上述攪拌獲得的物質(zhì)過(guò)80-120目銅網(wǎng)，得到濾液；(3)將步驟(2)得到的濾液在20-40℃水浴加熱均勻，同時(shí)按1500-3000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速攪拌10-20分鐘；(4)將步驟(3)得到的液體在50-70℃水浴加熱均勻，并過(guò)100-120目銅網(wǎng)，將此濾液冷卻至室溫，得到楊樹(shù)皮類脂佐劑，保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明進(jìn)一步提供這種楊樹(shù)皮類脂佐劑的使用方法(1)500-1000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枰环N抗原和/或抗原組合物，同時(shí)緩緩加入楊樹(shù)皮類脂佐劑，使楊樹(shù)皮類脂佐劑在混合物中的終濃度達(dá)到4-6％(W/V)；(2)將上述混合物通過(guò)乳化壓力為10-15MPa，剪切壓力為45-60MPa的均質(zhì)機(jī)內(nèi)乳化，乳化溫度在20-30℃之間，制得含楊樹(shù)皮類脂佐劑的疫苗。
楊樹(shù)皮類脂作為免疫佐劑，既可以保持抗原的特性，又能成為良好的免疫增強(qiáng)劑和刺激劑，這是其他常規(guī)的佐劑如羊毛脂、弗氏佐劑等無(wú)可比擬的。
以楊樹(shù)皮類脂為免疫佐劑制備的疫苗具有以下優(yōu)特點(diǎn)(1)產(chǎn)生免疫力時(shí)間早注射雞體后7-10天即可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)免疫力，比油佐劑疫苗提前10天左右。
(2)保存運(yùn)輸方便無(wú)需特殊冷藏設(shè)備，0-8℃下可保存18個(gè)月，常溫下可保存12個(gè)月，冷凍保存可達(dá)到2年之久。
(3)應(yīng)激性小，吸收良好給7-10日齡的雞注射，在機(jī)體內(nèi)被很好得吸收，不產(chǎn)生殘留，因此不影響肉雞出口。由于應(yīng)激性小，因此在產(chǎn)蛋高峰期注射不會(huì)影響產(chǎn)蛋率。
(4)提高產(chǎn)蛋率本疫苗由于含有大量的維生素E等提高產(chǎn)蛋率的營(yíng)養(yǎng)成分，注射后會(huì)不同程度地提高產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋率。
以礦物油為佐劑加入雞新城疫抗原制備的油苗、以蜂膠為佐劑加入雞新城疫抗原制備的蜂膠苗與以楊樹(shù)皮類脂為佐劑加入雞新城疫抗原制備的類脂苗三者的比較


本發(fā)明楊樹(shù)皮類脂用作佐劑的制備方法特點(diǎn)如下由于粗提的類脂液中雜質(zhì)較多，因此，通過(guò)攪拌，可將大的粗顆粒沉淀；并且由于類脂在低溫下為半固體，通過(guò)熱過(guò)濾，一方面過(guò)濾沉淀物質(zhì)，另一方面容易過(guò)濾；多次過(guò)濾，溫度逐步提升，可有效保護(hù)生物活性物質(zhì)不至于突然變性失活。
本發(fā)明楊樹(shù)皮類脂用作佐劑的使用方法中，類脂含量的確定(終濃度為4-6％(W/V))，一方面可使本產(chǎn)品規(guī)程化，另一方面也是因?yàn)橛糜谧魟r(shí)免疫效果的限制，即，使用本含量免疫效果最好；壓力的選擇，取決于類脂本身的特性和制備疫苗的要求，高速乳化，可使抗原與佐劑更加充分乳化，分散系更為均勻，制備的疫苗形狀更為穩(wěn)定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1制備楊樹(shù)皮類脂佐劑和疫苗以下操作均為無(wú)菌操作。楊樹(shù)皮粗提類脂(購(gòu)自山東莒縣林產(chǎn)化工廠)500克置于25℃水浴鍋中，100轉(zhuǎn)/分緩慢攪拌30分鐘。過(guò)80目銅網(wǎng)，得到濾液。濾液再經(jīng)過(guò)30℃水浴，1500轉(zhuǎn)/分中速攪拌20分鐘。再經(jīng)過(guò)50℃水浴，過(guò)120目銅網(wǎng)，濾液冷卻至室溫，得到楊樹(shù)皮類脂佐劑。
制備雞新城疫病毒抗原取8日SPF雞胚(購(gòu)自濟(jì)南SPF雞場(chǎng))，用碘酒消毒，無(wú)菌操作，按照每枚雞胚0.2ml劑量將稀釋10000倍的新城疫種毒(購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所)注射到雞胚的尿囊腔內(nèi)，而后將針孔用無(wú)菌膠布密封，將封好的雞胚置于37-38℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵化至13日齡。孵化結(jié)束將雞胚置于2-10℃冷庫(kù)內(nèi)冷卻24小時(shí)后，取出，碘酒消毒，無(wú)菌收集雞胚尿囊腔內(nèi)的含毒液體，將含毒液體按照0.05-0.1％(V/V)比例加入甲醛滅活劑(購(gòu)自萊陽(yáng)化工廠)，37℃滅活12小時(shí)，其間振搖6次。滅活完畢，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)。合格者的雞新城疫病毒抗原即可用于制備疫苗。
制備疫苗時(shí)，可將上述制得的滅活的雞新城疫病毒抗原10000ml以500轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢瑁瑫r(shí)緩緩加入上述制得的楊樹(shù)皮類脂佐劑，使類脂液在混合物中的終濃度達(dá)到5％(W/V)。然后將上述混合物通過(guò)乳化壓力為15MPa，剪切壓力為45MPa的均質(zhì)機(jī)內(nèi)乳化，乳化溫度要求20℃，乳化時(shí)間20秒。乳化完畢，得到雞新城疫類脂滅活疫苗。將上述疫苗進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)(檢驗(yàn)方法如下)、安全檢驗(yàn)(檢驗(yàn)方法如下)，合格后分裝。
無(wú)菌檢驗(yàn)取上述方法制備的疫苗1ml，接種于高壓滅菌的馬丁固體培養(yǎng)基，置入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24-48小時(shí)，無(wú)菌生長(zhǎng)，則無(wú)菌檢驗(yàn)合格。
安全檢驗(yàn)取10日齡和30日齡健康易感雞各5只，分別頸部皮下注射疫苗0.5ml，1.0ml，連續(xù)觀察14天，注苗局部無(wú)嚴(yán)重反應(yīng)，雞全部健活，則安全檢驗(yàn)合格。
實(shí)施例2制備楊樹(shù)皮類脂佐劑和疫苗以下操作均為無(wú)菌操作。將楊樹(shù)皮粗提類脂1200g(購(gòu)自山東莒縣林產(chǎn)化工廠)置于40℃水浴鍋中，800轉(zhuǎn)/分緩慢攪拌20分鐘。過(guò)120目銅網(wǎng)，得到濾液。濾液再經(jīng)過(guò)40℃水浴，2500轉(zhuǎn)/分中速攪拌10分鐘。再經(jīng)過(guò)70℃水浴，過(guò)100目銅網(wǎng)，濾液冷卻至室溫，得到楊樹(shù)皮類脂佐劑。
制備雞產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒抗原取10日SPF鴨胚(購(gòu)自濟(jì)南SPF雞場(chǎng))，用碘酒消毒，無(wú)菌操作，按照每枚鴨胚0.2ml劑量將稀釋100倍的產(chǎn)蛋下降綜合癥種毒(購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所)注射到鴨胚的尿囊腔內(nèi)，而后將針孔用無(wú)菌膠布密封，將封好的鴨胚置入37-38℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵化至15日齡。孵化結(jié)束將鴨胚置入2-10℃冷庫(kù)內(nèi)冷卻24小時(shí)后，取出，碘酒消毒，無(wú)菌收集鴨胚尿囊腔內(nèi)的含毒液體，將含毒液體按照0.05-0.1％(V/V)比例加入甲醛滅活劑(購(gòu)自萊陽(yáng)化工廠)，37℃滅活12小時(shí)，其間振搖6次。滅活完畢，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)(方法通上)。合格者即可用于制備疫苗。
制備疫苗時(shí)，可將滅活的雞新城疫病毒抗原(制備方法見(jiàn)實(shí)施例1)和滅活的雞產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒抗原(制備方法如上)混合(各10000ml)后以1000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?，同時(shí)緩緩加入上述楊樹(shù)皮類脂佐劑，使類脂液在混合物中的終濃度達(dá)到6％(W/V)。然后將上述混合物通過(guò)乳化壓力為15MPa，剪切壓力為45MPa的均質(zhì)機(jī)內(nèi)乳化，乳化溫度要求在25℃之間，乳化時(shí)間30秒。乳化完畢，將上述的乳化液進(jìn)行檢驗(yàn)(檢驗(yàn)方法同實(shí)施例1)，合格后分裝，得到雞新城疫與產(chǎn)蛋下降綜合癥二聯(lián)類脂滅活疫苗。
實(shí)施例3雞新城疫類脂滅活疫苗的免疫使用實(shí)施例1制得的雞新城疫類脂滅活疫苗，免疫程序如下10日齡雛雞頸部皮下注射0.3ml/只，40-60日齡第二次免疫，頸部皮下注射0.5ml/只，免疫兩次，即可保護(hù)整個(gè)生長(zhǎng)期不受雞新城疫病毒的侵襲。采集第二次免疫后14天雞群的血液，分離血清，采用血清學(xué)中的微量血凝抑制(HI)方法(參考農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局《獸醫(yī)生物制品規(guī)程》)對(duì)血清抗體進(jìn)行評(píng)估，本實(shí)施例的類脂疫苗免疫效果與蜂膠作為佐劑的同種疫苗的免疫效果相比，同期抗體平均高2-3個(gè)滴度，并且應(yīng)激性小，不影響雞產(chǎn)蛋率。
測(cè)定免疫雞新城疫(ND)類脂滅活疫苗后雞血清抗體的方法(1)材料雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)4單位抗原(購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所)待檢血清(采集免疫類脂疫苗7天以后的雞群)0.01M PH7.2的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)或0.85％的生理鹽水0.8％的雞紅細(xì)胞懸液96孔V型血凝板、微量加樣器、吸頭、微量振蕩器等(2)操作1)0.8％雞紅細(xì)胞懸液的制備無(wú)菌采取健康雞血4ml于4ml阿氏液中，2500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去析出的血清和白細(xì)胞，再加入4ml阿氏液洗滌紅細(xì)胞，然后2500轉(zhuǎn)/分離心，重復(fù)上述操作3-4次，最后吸取紅細(xì)胞0.8ml加到10ml生理鹽水中即得0.8％雞紅細(xì)胞懸液。
2)在每孔加入PBS或生理鹽水0.05ml，然后在第一孔加入待檢血清，混勻，從中吸取0.05ml加入第二孔，混勻從中再吸取0.05ml加入第三孔，依次稀釋到第11孔，吸出0.05ml棄去。第12孔作抗原對(duì)照(陽(yáng)性對(duì)照)。然后每孔都加入稀釋好的4單位抗原0.05ml。另取4孔只加PBS或生理鹽水0.05ml(陰性對(duì)照)。放入微量振蕩器上振蕩1分鐘，于20-30℃環(huán)境中作用10分鐘，然后每孔加上0.8％的雞紅細(xì)胞0.05ml。放在37℃溫箱中孵育，15分鐘后觀察。
結(jié)果判定在陽(yáng)性對(duì)照孔完全凝集、陰性對(duì)照孔完全沉集的情況下，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋度為該血清的(抗體滴度)HI滴度。按照上述方法對(duì)雞群進(jìn)行免疫后的待測(cè)新城疫抗體滴度平均為8-9log2，(各種佐劑的新城疫疫苗抗體測(cè)定方法及判定標(biāo)準(zhǔn)均相同，按照目前測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)抗體水平維持在4log2以上時(shí)就具有保護(hù)力。當(dāng)抗體在5-6log2以上時(shí)具有堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)力)。
實(shí)施例4使用實(shí)施例2中的雞新城疫與產(chǎn)蛋下降綜合癥二聯(lián)類脂滅活疫苗，免疫程序如下120日齡雛雞頸部皮下注射0.5ml/只，230日齡第二次免疫，頸部皮下注射0.5ml/只，免疫兩次，即可保護(hù)整個(gè)生長(zhǎng)期不受新城疫、產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒的侵襲。采集免疫雞群的血液，分離血清，采用血清學(xué)中的微量血凝抑制(HI)方法(參考農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局《獸醫(yī)生物制品規(guī)程》)對(duì)血清抗體進(jìn)行評(píng)估，本實(shí)施例的類脂疫苗的免疫效果與蜂膠作為佐劑的同種疫苗的免疫效果相比，同期抗體平均高2-3個(gè)滴度，并且應(yīng)激性小，不影響雞產(chǎn)蛋率。
具體試驗(yàn)方法及結(jié)果一、測(cè)定ND的抗體方法同實(shí)施例3，具體的測(cè)定結(jié)果為采集第二次免疫免14天的雞群血清測(cè)定抗體水平，滴度平均為8-9Log2。
二、測(cè)定的減蛋綜合癥抗體的方法如下材料1、雞產(chǎn)蛋下降綜合癥標(biāo)準(zhǔn)4單位抗原(購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所)2、待檢血清(采集免疫類脂疫苗7天以后的雞群)
3、0.01M PH7.2的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)或0.85％的生理鹽水4、0.8％的雞紅細(xì)胞懸液5、96孔V型血凝板、微量加樣器、吸頭、微量振蕩器等(2)操作1)0.8％雞紅細(xì)胞懸液的制備無(wú)菌采取健康雞血4ml于4ml阿氏液中，2500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去析出的血清和白細(xì)胞，再加入4ml阿氏液洗滌紅細(xì)胞，然后2500轉(zhuǎn)/分離心，重復(fù)上述操作3-4次，最后吸取紅細(xì)胞0.8ml加到10ml生理鹽水中即得0.8％的雞紅細(xì)胞懸液。
2)在每孔加入PBS或生理鹽水0.05ml，然后在第一孔加入待檢血清，混勻，從中吸取0.05ml加入第二孔，混勻從中再吸取0.05ml加入第三孔，依次稀釋到第11孔，吸出0.05ml棄去。第12孔作抗原對(duì)照(陽(yáng)性對(duì)照)。然后每孔都加入稀釋好的4單位抗原0.05ml。另取4孔只加PBS或生理鹽水0.05ml(陰性對(duì)照)。于微量振蕩器上振蕩1分鐘，于20-30℃環(huán)境中作用10分鐘，然后每孔加上0.8％的雞紅細(xì)胞0.05ml。放在37℃溫箱中孵育，15分鐘后觀察。
結(jié)果判定在陽(yáng)性對(duì)照孔完全凝集、陰性對(duì)照孔完全沉集的情況下，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋度為該血清的(抗體滴度)HI滴度。按照上述方法對(duì)雞群進(jìn)行免疫后的待測(cè)產(chǎn)蛋下降綜合癥抗體滴度平均為8-9log2，(各種佐劑的產(chǎn)蛋下降綜合癥疫苗抗體測(cè)定方法及判定標(biāo)準(zhǔn)均相同，按照目前測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)抗體水平維持在4log2以上時(shí)就具有保護(hù)力。當(dāng)抗體在5-6log2以上時(shí)具有堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)力)。
實(shí)施例5對(duì)產(chǎn)蛋率的影響試驗(yàn)將雞新城疫類脂滅活疫苗制品20001批在某種雞養(yǎng)雞場(chǎng)進(jìn)行了試驗(yàn)，共免疫羅曼商品蛋雞雛雞1000羽，免疫后進(jìn)行了產(chǎn)蛋量、產(chǎn)蛋率測(cè)定和臨床觀察，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。
1、材料與方法1.1材料 雞新城疫類脂滅活疫苗20001批、新城疫滅活油苗00102批(購(gòu)自農(nóng)業(yè)部定點(diǎn)企業(yè)齊魯動(dòng)物保健品廠)。試驗(yàn)雞共計(jì)2000羽份，分2組，A組免疫類脂疫苗、B組免疫油苗。
1.2免疫程序與免疫方法A組7日齡雛雞每只頸部皮下注射雞新城疫類脂滅活疫苗0.3ml，同時(shí)以LaSota疫苗滴鼻點(diǎn)眼，100日齡、195日齡分別胸肌注射類脂疫苗1.0ml/只。
B組7日齡雛雞每只頸部皮下注射雞新城疫類脂滅活疫苗0.3ml，同時(shí)以LaSota疫苗滴鼻點(diǎn)眼，100日齡、195日齡分別胸肌注射類脂疫苗1.0ml/只。
1.3日糧 按照羅曼公司推薦的日糧配方，統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)一配方，同一飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼喂。
1.4觀察產(chǎn)蛋情況，從200日齡收集每天產(chǎn)蛋數(shù)量，計(jì)算產(chǎn)蛋率。
結(jié)果2批疫苗免疫的雞群均正常開(kāi)產(chǎn)見(jiàn)蛋，保持了正常的產(chǎn)蛋高峰期，但免疫類脂疫苗的雞群產(chǎn)蛋高峰期比油苗提前10天左右。第3次免疫在195日齡，到達(dá)200日齡時(shí)開(kāi)始統(tǒng)計(jì)產(chǎn)蛋量，計(jì)算產(chǎn)蛋率，具體產(chǎn)蛋率統(tǒng)計(jì)如下結(jié)果見(jiàn)表疫苗 雞數(shù)(個(gè)) 第一周 第二周 第三周 第四周產(chǎn)蛋數(shù)(個(gè)) 產(chǎn)蛋數(shù)(個(gè)) 產(chǎn)蛋數(shù)(個(gè)) 產(chǎn)蛋數(shù)(個(gè))20001類脂疫苗 1000 62796188 6132616700102油苗 1000 59785817 56145719四周的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，免疫類脂疫苗的雞群產(chǎn)蛋量(24766)比免疫油苗的雞群產(chǎn)蛋量(23128)多1638枚，免疫類脂疫苗的雞群產(chǎn)蛋率(88.45％)比免疫油苗的雞群產(chǎn)蛋率(82.6％)高5.85％個(gè)百分點(diǎn)。
實(shí)施例6制備楊樹(shù)皮類脂佐劑和疫苗以下操作均為無(wú)菌操作。將楊樹(shù)皮粗提類脂(購(gòu)自山東莒縣林產(chǎn)化工廠)800克置于20℃水浴鍋中，1000轉(zhuǎn)/分緩慢攪拌25分鐘。過(guò)100目銅網(wǎng)，得到濾液。濾液經(jīng)過(guò)20℃水浴，3000轉(zhuǎn)/分中速攪拌15分鐘；再經(jīng)過(guò)60℃水浴，過(guò)120目銅網(wǎng)，濾液冷卻至室溫，得到楊樹(shù)皮類脂佐劑。
制備疫苗時(shí)，可將實(shí)施例1的方法制備的滅活的雞新城疫病毒抗原10000ml以800轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?，同時(shí)緩緩加入上述制得的楊樹(shù)皮類脂佐劑，使類脂液在混合物中的終濃度達(dá)到4％(W/V)。然后將上述混合物通過(guò)乳化壓力為10MPa，剪切壓力為60MPa的均質(zhì)機(jī)內(nèi)乳化，乳化溫度為30℃，乳化時(shí)間20秒。乳化完畢，得到雞新城疫類脂滅活疫苗。將上述疫苗進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)(檢驗(yàn)方法如下)、安全檢驗(yàn)(檢驗(yàn)方法如下)，合格后分裝。
無(wú)菌檢驗(yàn)取上述方法制備的疫苗1ml，接種于高壓滅菌的馬丁固體培養(yǎng)基，置入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24-48小時(shí)，無(wú)菌生長(zhǎng)，則無(wú)菌檢驗(yàn)合格。
安全檢驗(yàn)取10日齡和30日齡健康易感雞各5只，分別頸部皮下注射疫苗0.5ml，1.0ml，連續(xù)觀察14天，注苗局部無(wú)嚴(yán)重反應(yīng)，雞全部健活，則安全檢驗(yàn)合格。
權(quán)利要求
1.一種楊樹(shù)皮類脂在制備佐劑中的應(yīng)用。
2.一種將楊樹(shù)皮類脂用于佐劑的制備方法，包括如下步驟(1)粗提類脂液在20-40℃加熱，同時(shí)按100-1000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速攪拌20-30分鐘；(2)將上述攪拌獲得的物質(zhì)過(guò)80-120目銅網(wǎng)，得到濾液；(3)將步驟(2)得到的濾液在20-40℃水浴加熱均勻，同時(shí)按1500-3000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速攪拌10-20分鐘；(4)將步驟(3)得到的液體在50-70℃水浴加熱均勻，并過(guò)100-120目銅網(wǎng)，將此濾液冷卻至室溫，得到楊樹(shù)皮類脂佐劑，保存?zhèn)溆?；以上操作均為無(wú)菌操作。
3.一種楊樹(shù)皮類脂佐劑的使用方法，包括如下步驟(1)500-1000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枰环N抗原和/或抗原組合物，同時(shí)緩緩加入楊樹(shù)皮類脂佐劑，使楊樹(shù)皮類脂佐劑在混合物中的終濃度達(dá)到4-6％(W/V)；(2)將上述混合物通過(guò)乳化壓力為10-15MPa，剪切壓力為45-60MPa的均質(zhì)機(jī)內(nèi)乳化，乳化溫度在20-30℃之間，制得含楊樹(shù)皮類脂佐劑的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫佐劑，尤其涉及一種楊樹(shù)皮類脂用作免疫佐劑，以及這種佐劑的制備方法和使用方法。該佐劑是通過(guò)將粗提類脂液在無(wú)菌環(huán)境中，按一定條件攪拌、過(guò)濾，冷卻制得。該佐劑保存運(yùn)輸方便，無(wú)需特殊冷藏設(shè)備；該佐劑和抗原以一定比例混合免疫動(dòng)物，其產(chǎn)生免疫力時(shí)間早，且應(yīng)激性小，易保存運(yùn)輸，免疫雞后，還可提高產(chǎn)蛋率。
文檔編號(hào)A61K39/39GK1531970SQ0314255
公開(kāi)日2004年9月29日 申請(qǐng)日期2003年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者張興曉 申請(qǐng)人:張興曉