專利名稱：防御素變體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗病原菌活性的多肽以及編碼該多肽的多核苷酸。本發(fā)明的方法利用這些抗病原菌多核苷酸和多肽控制植物病原體并且增強(qiáng)植物的病原抗性。
背景技術(shù)：
植物病害通常嚴(yán)重限制了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力，因此影響了農(nóng)耕作業(yè)的歷程和發(fā)展。多種病原體導(dǎo)致植物病害，包括真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲。然而，在農(nóng)作物傳染病的致病病原中，真菌是經(jīng)濟(jì)上最重要的植物病原體群，它們每年造成大批適銷食物、纖維和飼料損失。在傳統(tǒng)上是通過農(nóng)耕作業(yè)，包括輪作、使用農(nóng)用化學(xué)品以及常規(guī)的繁育技術(shù)，來控制植物病害的發(fā)生。然而，使用化學(xué)品控制植物病原體會增加農(nóng)民的成本，并且對生態(tài)系統(tǒng)造成有害影響。消費者和政府管理者等越來越關(guān)切生產(chǎn)和使用保護(hù)植物免受病原體侵害的合成農(nóng)用化學(xué)品相關(guān)的環(huán)境危害。由于這些關(guān)切，管理者已禁止或限制使用更具危害性的化學(xué)品中的一些。通過繁育抗性作物在一定程度上控制了真菌病害的發(fā)生。然而，傳統(tǒng)繁育方法是耗時的，且隨著病原體的進(jìn)化需要連續(xù)的努力來維持病害抗性。參見(例如)Groverand Gowthaman (2003) Curr.Sc1.84:330-340 (Grover 和 Gowthaman, 2003 年，《現(xiàn)代科學(xué)》，第84卷，第330-340頁)。因此，研究人員對于開發(fā)用于控制植物病原體的新型替代方法表現(xiàn)出極大的興趣，該方法與基于傳統(tǒng)農(nóng)用化學(xué)品的方法特性相比具有更低污染和環(huán)境危害風(fēng)險，并且與常規(guī)繁育技術(shù)相比繁瑣性更低。最近，農(nóng)業(yè)科學(xué)家通過對植物進(jìn)行基因工程操作使之表達(dá)抗病原蛋白，培育出了病原抗性增強(qiáng)的農(nóng)作物。目前正不斷努力，進(jìn)行抗病原菌藥劑的鑒別以及病害抗性植物的基因工程操作。因此，鑒于植物病原體，尤其是真菌病原體對作物產(chǎn)量和質(zhì)量的顯著影響，需要保護(hù)植物免受病原體侵害的新組合物和方法。

發(fā)明內(nèi)容
提供了保護(hù)植物免受病原體侵害的組合物和方法。該組合物包含抗病原菌(尤其是抗真菌)多肽的新型核苷酸和氨基酸序列。本發(fā)明所公開的多肽顯示出對植物真菌病原體的抗病原菌活性。還提供了包含編碼本發(fā)明所公開的抗病原菌多肽的核苷酸序列的多核苷酸。通過使用DNA改組鑒別多肽和編碼該多肽的核苷酸序列。在一些實施例中，與用于產(chǎn)生新型抗病原菌多肽編碼序列的DNA改組事件的親本多肽相比時，抗真菌多肽顯示出具有改善的抗病原菌活性。組合物還包含表達(dá)盒，其包含編碼本文所公開的抗病原菌多肽的多核苷酸。還提供了包含本發(fā)明所公開的多核苷酸和多肽的植物、植物細(xì)胞、種子和微生物。該組合物用于涉及在植物中誘導(dǎo)病原抗性，尤其是真菌抗性的方法。在特定實施例中，該方法包括將編 碼抗病原多肽的至少一種多核苷酸引入植物。因此，抗病原多肽在植物中表達(dá)，并且病原體暴露于病原體攻擊位點的優(yōu)選蛋白質(zhì)，從而增強(qiáng)病原抗性。組織優(yōu)選的啟動子可用于驅(qū)動抗病原菌蛋白在尤其易受病原體攻擊的特定植物組織，例如根、葉、莖、維管組織和種子中的表達(dá)。病原體誘導(dǎo)型啟動子也可用于驅(qū)動病原體感染位點處或附近抗病原菌蛋白的表達(dá)。還提供了抗病原菌組合物和制劑，以及將它們用于保護(hù)植物免受病原體，尤其是真菌病原體侵害的方法。在一些實施例中，組合物包含抗病原菌多肽，或包含具有編碼抗病原菌多肽的多核苷酸與載體組合的微生物。使用這些組合物保護(hù)植物免受病原體侵害的方法包括通過(例如)噴霧、噴粉、撒播或種子包衣將抗病原菌組合物施用至植物病原體的環(huán)境。本發(fā)明所公開的方法和組合物可用于保護(hù)植物免受病原體，包括真菌病原體、病毒、線蟲等等的侵害。本發(fā)明涵蓋以下實施例:1.一種分離的多肽，所述多肽包含選自以下的氨基酸序列:(a) SEQ ID NO: 6、8、10或12中示出的氨基酸序列；以及(b)與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有抗病原菌活性。 2.實施例1的分離的多肽，其中所述多肽具有與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列具有選自如下的氨基酸殘基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基。3.實施例1或?qū)嵤├?的分離的多肽，其中所述多肽具有抗真菌活性。4.實施例3的分離的多肽，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。5.實施例2的分離的多肽，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌(Colletotrichum graminocola)和禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)中至少一者的改善的抗真菌活性。6.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列:(a) SEQ ID NO: 3、5、7或9中示出的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQ ID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽；以及(d)編碼與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。7.實施例6的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有選自如下的氨基酸殘基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；
(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基。8.實施例6的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有抗真菌活性的多肽。9.實施例8的分離的多核苷酸，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時具有改善的抗真菌活性。10.實施例8的分離的多核苷酸，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。11.包含實施例6-10中任一項的多核苷酸的表達(dá)盒。12.實施例11的表達(dá)盒，其中所述多核苷酸有效連接至驅(qū)動在植物中表達(dá)的啟動子。13.實施例11的表達(dá)盒，其中所述多核苷酸有效連接至驅(qū)動在微生物中表達(dá)的啟動子。14.包含實施例6-10中任一項的多核苷酸的宿主細(xì)胞。15.包含實施例11的表達(dá)盒的宿主細(xì)胞。16.包含有效連接至驅(qū)動在植物中表達(dá)的啟動子的異源多核苷酸的植物，其中所述異源多核苷酸包含選自如下的核苷酸序列:(a) SEQ ID N0:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQ ID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽；以及(d)編碼與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。17.實施例16的植物，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有選自如下的氨基酸殘基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基。18.實施例16的植物，其中所述多核苷酸編碼具有抗真菌活性的多肽。
19.實施例18的植物，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。20.實施例18的植物，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。21.實施例16-20中任一項的植物，其中所述核苷酸序列經(jīng)過優(yōu)化，以便在植物中表達(dá)。22.實施例16-20中任一項的植物，其中所述植物是選自細(xì)胞、種子和籽粒的植物部分。23.實施例16-20中任一項的植物，其中所述植物是單子葉植物。24.實施例23的植物，其中所述單子葉植物是玉米、甘蔗、小麥、水稻、大麥、高粱或裸麥。

25.實施例16-20中任一項的植物，其中所述植物是雙子葉植物。26.實施例25的植物，其中所述雙子葉植物是大豆、蕓苔、向日葵、棉花或苜蓿。27.實施例16-20中任一項的植物，其中所述多核苷酸穩(wěn)定整合到植物的基因組。28.實施例16-20中任一項的植物，其中所述植物顯示出增強(qiáng)了對植物病原體的抗性。29.實施例28的植物，其中所述植物病原體是真菌。30.實施例29的植物，其中所述真菌為禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中的至少一者。31.實施例16-20中任一項的植物，其中所述啟動子是組織優(yōu)選的啟動子。32.實施例31的植物，其中所述組織優(yōu)選的啟動子選自葉優(yōu)選的啟動子、根優(yōu)選的啟動子、種子優(yōu)選的啟動子、莖優(yōu)選的啟動子和維管組織優(yōu)選的啟動子。33.實施例16-20中任一項的植物，其中所述啟動子是病原體誘導(dǎo)型啟動子。34.實施例16-33中任一項的植物的轉(zhuǎn)化種子。35.增強(qiáng)植物中植物病原抗性的方法，所述方法包括為所述植物提供選自如下的多肽:(a)包含SEQ ID NO: 6、8、10或12中示出的氨基酸序列的多肽；以及(b)包含與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有抗病原菌活性。36.實施例35的方法，其中所述多肽具有與SEQ ID NO: 6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列具有選自如下的氨基酸殘基中的至少
一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基。37.實施例35的方法，其中所述多肽具有抗真菌活性。38.實施例37的方法，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。39.實施例37的方法，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
40.實施例35-39中任一項的方法，其中所述植物是選自細(xì)胞、種子和籽粒的植物部分。41.實施例35-39中任一項的方法，其中所述植物是單子葉植物。42.實施例41的方法，其中所述單子葉植物是玉米、甘蔗、小麥、水稻、大麥、高粱或裸麥。43.實施例35-39中任一項的方法，其中所述植物是雙子葉植物。44.實施例43的方法，其中所述雙子葉植物是大豆、蕓苔、向日葵、棉花或苜蓿。45.實施例35-39中任一項的方法，其中所述植物病原體是真菌。46.實施例45的植物，其中所述真菌是禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中的至少一者。47.實施例35的方法，其中所述植物種植在耕作區(qū)，其中所述耕作區(qū)具有所述植物病原體，或其中所述種植區(qū)的環(huán)境條件有利于所述植物病原體的生長。48.實施例35的方法，其中提供多肽包括將包含選自如下核苷酸序列的異源多核苷酸引入所述植物:(a) SEQ ID N0:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQ ID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性 的多肽；以及(d)編碼與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。49.實施例48的方法，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有選自如下的氨基酸殘基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基。50.實施例48的方法，其中所述多核苷酸編碼具有抗真菌活性的多肽。51.實施例50的方法，其中所述多肽與包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。52.實施例50的方法，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。53.實施例48-52中任一項的方法，其中所述多核苷酸穩(wěn)定整合到植物的基因組。54.實施例48-52中任一項的方法，其中所述異源多核苷酸有效連接至所述植物中具有活性的啟動子。55.實施例54的方法，其中所述啟動子是組織優(yōu)選的啟動子。56.實施例55的方法，其中所述組織優(yōu)選的啟動子選自葉優(yōu)選的啟動子、根優(yōu)選的啟動子、種子優(yōu)選的啟動子、莖優(yōu)選的啟動子和維管組織優(yōu)選的啟動子。
57.實施例54的方法，其中所述啟動子是病原體誘導(dǎo)型啟動子。
58.包含根據(jù)實施例1-5中任一項的至少一種多肽的抗病原菌組合物。59.實施例58的組合物，還包含載體。60.保護(hù)植物免受植物病原體侵害的方法，該方法包括將根據(jù)實施例58的組合物施用至植物病原體的環(huán)境。61.實施例60的方法，其中所述組合物通過選自噴霧、噴粉、撒播和種子包衣的方法施用。62.實施例60的方法，其中所述植物病原體是真菌。63.實施例62的方法，其中所述真菌為禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中的至少一者。64.包含有效連接至驅(qū)動在微生物中表達(dá)的啟動子的至少一種異源多核苷酸的微生物，其中所述多核苷酸包含選自如下的核苷酸序列:(a) SEQ ID N0:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQ ID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽；以及(d)編碼與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。65.實施例64的微生物，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQ ID N0:4、6、8或10具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有選自如下的氨基酸殘基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基。66.實施例64的微生物，其中所述多核苷酸編碼具有抗真菌活性的多肽。67.實施例66的微生物，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。68.實施例66的微生物，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。69.包含根據(jù)實施例64-68中任一項的至少一種微生物的抗病原菌組合物。70.實施例69的組合物，還包含載體。71.保護(hù)植物免受病原體侵害的方法，該方法包括將根據(jù)實施例69的組合物施用至植物病原體的環(huán)境。72.實施例71的方法，其中所述組合物通過選自噴霧、噴粉、撒播和種子包衣的方法施用。73.實施例71的方法，其中所述植物病原體是真菌。74.實施例73的方法，其中所述真菌為禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中的至少一者。
75.控制耕作區(qū)中的病原體的方法，所述方法包括:a)評估耕作區(qū)的環(huán)境條件是否存在病原體或條件是否有利于病原體生長；b)選擇有效量的抗病原菌組合物，其中所述抗病原菌組合物為根據(jù)實施例58或?qū)嵤├?9的組合物；以及c)將所述抗病原菌組合物施用至作物、作物部分、種子或所述作物的耕作區(qū)。76.控制耕作區(qū)中的病原體的方法，所述方法包括:a)評估耕作區(qū)的環(huán)境條件是否存在病原體或條件是否有利于病原體生長；以及b)在耕作區(qū)種植包含有效連接至驅(qū)動在植物中表達(dá)的啟動子的異源多核苷酸的作物種子或植物，其中所述異源多核苷酸包含選自如下的核苷酸序列:(i)SEQ ID N0:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；(ii)編碼包含SEQ ID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；(iii)與SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽；以及(iv)編碼與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。77.實施例76的方法，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的 氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有選自如下的氨基酸殘基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應(yīng)位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應(yīng)位置處的絲氨酸(Ser)殘基。78.實施例76的方法，其中所述多核苷酸編碼具有抗真菌活性的多肽。79.實施例78的方法，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。80.實施例78的方法，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。81.實施例75-80中任一項的方法，其中所述病原體是真菌。82.實施例81的方法，其中所述真菌為禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中的至少一者。本發(fā)明的這些和其他方面在以下給出的本發(fā)明具體實施方式
中更詳細(xì)地公開。


圖1示出了本發(fā)明所公開的五雄苦木(Picramnia pentandra)植物防御素(Pp-PDFl)變體氨基酸序列與Pp-PDFl氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的序列比對。
具體實施例方式提供了涉及誘導(dǎo)植物中的病原抗性，尤其是真菌抗性的組合物和方法。該組合物包含抗病原菌多肽的新型核苷酸和氨基酸序列。具體地講，提供了具有SEQ ID N0:6、8、10和12中示出的氨基酸序列的分離的多肽及其變體和片段。還提供了包含編碼SEQ ID N0:6、
8、10和12中示出的氨基酸序列的核苷酸序列的分離的多核苷酸及其變體和片段。新型抗病原菌多肽和編碼該多肽的核苷酸序列通過已知植物防御素序列，包括五雄苦木植物防御素Pp-PDFl的DNA改組生成。參見美國專利N0.6，911，577和7，396，980，每個專利全文以引用的方式并入本文。植物防御素包括硫堇、富含半胱氨酸的小肽、蛋白酶抑制劑、淀粉酶抑制劑等等。按照蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類(SCOP)系統(tǒng)，它們被稱為防御素基因。防御素有防御作用，更具體地講植物對病原體的防御中發(fā)揮作用，并且它們的一級和二級結(jié)構(gòu)與昆蟲防御素具有相似性。本發(fā)明的防御素歸為蝎毒素樣蛋白超家族和植物防御素家族。雖然不受任何作用機(jī)制的限制，但序列和相關(guān)基因在病害引起的病斑周圍的表達(dá)可控制癥狀發(fā)展，如在過敏性反應(yīng)(HR)中，通過控制蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制來控制癥狀發(fā)展。組合物也可以通過抑制病原體產(chǎn)生的蛋白酶或通過結(jié)合病原體的細(xì)胞壁組分直接起到抗病原菌蛋白的作用。第三，它們也可以作為擾亂膜功能，導(dǎo)致病原體細(xì)胞毒性的兩親性蛋白。防御素通常為富含半胱氨酸的小肽，并且顯示出抗微生物活性。植物防御素通常包含約45-54個氨基酸，具有四個二硫鍵(Broekaert etal.(1995)Plant Physiol.(Bethesda) 108:1353-1358 (Broekaert 等 A, 1995 年，《植物生理學(xué)》，貝塞斯達(dá)，第108卷，第1353-1358頁))。本發(fā)明的防御素抑制一系列病原體的生長，包括(但不限于):微摩爾濃度的真菌、線蟲、細(xì)菌、昆蟲和病毒。防御素通過多種機(jī)制抑制病原體損傷，包括(但不限于):膜離子滲透性的改變以及真菌靶標(biāo)中菌絲分支的誘導(dǎo)(Garcia-Olmeda et al.(1998)Biopolymers, Peptide Science47:479-491(Garcia-Qlmeda等人，1998年，《生物聚合物(肽科學(xué))》，第47卷，第479-491頁)，以引用的方式并入本文)。此前公開的植物防御素(參見美國專利N0.6，911，577和7，396，980)根據(jù)序列同源性分為85組，并且用“CS”后面加三位數(shù)字來表示。用于產(chǎn)生本發(fā)明所公開的Pp-PDFl變體的DNA改組分析的Pp-PDFl多肽屬于第18組，也可以用CS164來表示。全長Pp-PDFl多肽的核苷酸和氨基酸序列分別在SEQ ID NO:1和2中示出，而成熟Pp-PDFl多肽的核苷酸和氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 3和4中示出。Pp-PDFl多肽及本發(fā)明所公開的其變體表現(xiàn)出至少對真菌禾谷鐮孢菌(FGR)、禾生炭疽菌(CGR)、輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioides)(FVE)和玉米色二孢(Diplodia maydis) (DMA)的抗真菌活性。表I示出了 Pp-PDFl和改組的變體的IC50數(shù)據(jù)。表1.
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸,所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列: (a)SEQ ID N0:3、5、7或9中示出的核苷酸序列； (b)編碼包含SEQID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列； (c)與SEQID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽；以及 (d)編碼與SEQID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQIDN0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有選自如下的氨基酸殘基中的至少一者: (a)SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應(yīng)的位置處的精氨酸(Arg)殘基； (b)SEQID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應(yīng)的位置處的絲氨酸(Ser)殘基； (C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應(yīng)的位置處的精氨酸(Arg)殘基； (d)SEQID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應(yīng)的位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及 (e)SEQID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應(yīng)的位置處的絲氨酸(Ser)殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有抗真菌活性的多肽，其中所述抗真菌活性與包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時有所提聞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼的多肽與包含SEQID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
5.—種表達(dá)盒,所述表達(dá)盒包含權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
6.—種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求5所述的表達(dá)盒。
7.一種微生物,所述微生物包含權(quán)利要求5所述的表達(dá)盒。
8.一種植物或植物部分，所述植物或植物部分包含有效連接至驅(qū)動在所述植物中表達(dá)的啟動子的異源多核苷酸，其中所述異源多核苷酸包含選自如下的核苷酸序列: (a)SEQ ID NO:5、7、9或11中示出的核苷酸序列； (b)編碼包含SEQID N0:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列； (c)與SEQ ID NO:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽；以及 (d)編碼與SEQID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有選自如下的氨基酸殘基中的至少一者: (a)SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應(yīng)的位置處的精氨酸(Arg)殘基； (b)SEQID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應(yīng)的位置處的絲氨酸(Ser)殘基； (C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應(yīng)的位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應(yīng)的位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及 (e)SEQID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應(yīng)的位置處的絲氨酸(Ser)殘基。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物，其中所述多肽與包含SEQID NO: 2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物，其中所述多肽與包含SEQID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾谷鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物，其中所述植物是選自細(xì)胞、種子和籽粒的植物部分。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物，其中所述植物是單子葉植物。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
15.—種增強(qiáng)植物中植物病原抗性的方法，所述方法包括為所述植物提供選自如下的多肽: (a)包含SEQID N0:6、8、10或12中示出的氨基酸序列的多肽；以及 (b)包含與SEQID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有抗病原菌活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多肽具有與SEQID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列具有選自如下的氨基酸殘基中的至少一者: (a)SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應(yīng)的位置處的精氨酸(Arg)殘基； (b)SEQID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應(yīng)的位置處的絲氨酸(Ser)殘基； (C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應(yīng)的位置處的精氨酸(Arg)殘基； (d)SEQID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應(yīng)的位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及 (e)SEQID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應(yīng)的位置處的絲氨酸(Ser)殘基。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多核苷酸穩(wěn)定整合到所述植物的所述基因組。
18.一種抗病原菌組合物，所述抗病原菌組合物包含根據(jù)權(quán)利要求2所述的至少一種多肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，還包含載體。
20.一種保護(hù)植物免受病原體侵害的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物施用至植物病原體的所述環(huán)境。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述組合物通過選自噴霧、噴粉、撒播和種子包衣的方法施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及保護(hù)植物免受病原體，尤其是真菌病原體侵害的組合物和方法。組合物包括通過DNA改組生成的抗病原菌多肽的新型變體的氨基酸序列及其變體和片段，其表現(xiàn)出改善的抗病原菌活性。還提供了編碼所述抗病原菌多肽的多核苷酸。還提供了一種使用本文所公開的所述多核苷酸誘導(dǎo)植物中的病原抗性的方法。還提供了包含抗病原菌多肽或具有本發(fā)明的抗病原菌多核苷酸與載體組合的微生物的組合物，以及使用這些組合物保護(hù)植物免受病原體侵害的方法。還公開了包含本發(fā)明的抗病原菌多核苷酸或多肽的植物、植物細(xì)胞、種子和微生物。
文檔編號C12N15/82GK103154252SQ201180048727
公開日2013年6月12日 申請日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月23日
發(fā)明者J.J.恩格利什, S.L.格蘭特, J.S.波拉克, J.L.里特蘭德, G.A.桑達(dá)爾 申請人:先鋒國際良種公司