專利名稱：聚乙二醇-干擾素α凍干制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚乙二醇-干擾素凍干制劑，以氨基酸作為保護(hù)劑，特別是精氨酸和/或谷氨酸作為保護(hù)劑，以及其凍干方法。
背景技術(shù)：
干擾素是由細(xì)胞分泌的一類誘生蛋白質(zhì)，具有廣普的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能，是目前世界上公認(rèn)的最為有效的抗病毒藥物之一。在國(guó)內(nèi)外已廣泛用于治療多種病毒性、腫瘤性疾病。但干擾素結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生抗體；相對(duì)分子量小，在體內(nèi)易經(jīng)腎小球?yàn)V過而排泄，體內(nèi)半衰期短。利用一些無(wú)毒但水溶性好的免疫惰性大分子聚合物(如聚乙二醇)對(duì)其進(jìn)行修飾，在臨床上表現(xiàn)出更大的臨床效力。主要優(yōu)點(diǎn)為在體外，有較好的物理及熱穩(wěn)定性，抗酶解能力提高，可溶性增加；在體內(nèi)，循環(huán)半衰期明顯延長(zhǎng)，免疫原性下降，生物利用度提高等。
干燥是保持物質(zhì)不致腐敗變質(zhì)的方法之一。然而一些干燥方法是在0℃以上或更高的溫度下進(jìn)行。干燥后產(chǎn)品的理化和生物學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生很大的變化。而凍干(即冷凍干燥)是發(fā)生在0℃以下，是指通過升華從凍結(jié)的物料中去除水分或其他溶劑的過程。升華指的是溶劑，比如水，象干冰一樣，不經(jīng)過液態(tài)，從固態(tài)直接變?yōu)闅鈶B(tài)的過程。冷凍干燥得到的產(chǎn)物稱作凍干物(lyophilizer)，該過程稱作凍干(lyophilization)。在冰凍干燥過程中樣品的結(jié)構(gòu)不會(huì)被破壞，因?yàn)楣腆w成份被在其位置上的堅(jiān)冰支持著。在冰升華時(shí)，它會(huì)留下孔隙在干燥的剩余物質(zhì)里。這樣就保留了產(chǎn)品的生物和化學(xué)結(jié)構(gòu)及其活性的完整性。目前此技術(shù)是常用來(lái)長(zhǎng)期保存生物材料及藥品等。
冷凍干燥可以自然發(fā)生。在自然情況下，這一過程緩慢而且不可預(yù)測(cè)。通過冷凍干燥系統(tǒng)，人們改進(jìn)、細(xì)分了很多步驟，加速了這一過程。凍干過程分為冷凍、升華、解析干燥三個(gè)階段，每一個(gè)階段都有相應(yīng)的要求，不同的物料其要求各不相同，各階段工藝設(shè)計(jì)及控制手段的差異直接關(guān)系凍干產(chǎn)品的質(zhì)量和凍干設(shè)備的性能。
如上所述，冷凍干燥(凍干)法常用于許多生物活性材料(包括蛋白質(zhì))的保存。但是，凍干法也有其自身的局限性，如在冷凍和除水過程中，蛋白過濃，可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的不穩(wěn)定。因此，除了在凍干狀態(tài)以及液態(tài)都可以發(fā)生的脫酰胺作用以及氧化反應(yīng)外，凍干法可能導(dǎo)致交聯(lián)(生成共價(jià)寡聚物)以及非共價(jià)聚合物比例的升高。為了增強(qiáng)生物活性材料的穩(wěn)定性，經(jīng)常需要一些保護(hù)劑。
目前，大多注射用蛋白類生物制品的保護(hù)劑通常選用人血白蛋白，而人血白蛋白價(jià)格昂貴，致使該凍干產(chǎn)品成本高；另外人血白蛋白具有攜帶病毒的危險(xiǎn)。為了解決這個(gè)問題，許多人正致力于蛋白類凍干制劑的研究，嘗試以其他物質(zhì)代替人血白蛋白作為凍干保護(hù)劑。如中國(guó)專利CN1260171A中選用右旋糖苷作為重組干擾素的凍干保護(hù)劑。
已知在某些狀態(tài)下氨基酸可以作為凍干蛋白產(chǎn)品的保護(hù)劑。據(jù)報(bào)道，谷氨酸鈉和賴氨酸鹽，對(duì)一種蛋白，乳酸脫氫酶，的冷凍變性具有防凍作用(Seguro，et al.，Cryobiology2770-79(1990))等。其他種類的分子，包括單糖和二糖，以及聚合物比如PVP，也有報(bào)道作為凍干蛋白的保護(hù)劑。但是，對(duì)任一給定的蛋白產(chǎn)品，它們的效用是無(wú)法預(yù)測(cè)的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種聚乙二醇-干擾素α凍干制劑，該制劑中的蛋白，性能穩(wěn)定，適于保存。
本發(fā)明另一目的是提供一種聚乙二醇-干擾素α凍干制劑的制備方法。
本發(fā)明的其他目的，體現(xiàn)于本文對(duì)本發(fā)明的描述中。
根據(jù)本發(fā)明，一種聚乙二醇-干擾素α凍干制劑，含有聚乙二醇-干擾素α和一種保護(hù)劑，該保護(hù)劑為精氨酸和/或谷氨酸。
本發(fā)明的保護(hù)劑，能保持聚乙二醇-干擾素α在凍干過程中和之后的生物活性和穩(wěn)定性。精氨酸和/或谷氨酸保護(hù)聚乙二醇-干擾素α的機(jī)制，可能是在冷凍過程中與蛋白共濃縮，從而起到稀釋和保護(hù)蛋白的作用。還有一種可能是在冷凍和/或凍干過程中，兩性的氨基酸分子與蛋白分子之間發(fā)生特異的相互作用，保護(hù)蛋白不變性。
本發(fā)明的制劑在凍干前，每ml含有谷氨酸1-50mmol，優(yōu)選為5-20mmol，更優(yōu)選為10mmol，和/或精氨酸5-100mmol，優(yōu)選為5-30mmol，更優(yōu)選為15mmol。
本發(fā)明的保護(hù)劑，優(yōu)選精氨酸和谷氨酸共用，其中精氨酸和谷氨酸含量的比值為0.5-2.5，優(yōu)選的比值為1-2，更優(yōu)選的比值為1.5。
本發(fā)明的制劑還包括一種可藥用緩沖液。這種可藥用緩沖液可以是常用緩沖液，如乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽等緩沖液，優(yōu)選乙酸鹽。本制劑在凍干前，可以含有5-20mM緩沖液，如乙酸鹽，優(yōu)選10mM緩沖液，如乙酸鹽。本發(fā)明制劑在凍干前，用緩沖液將pH調(diào)節(jié)到pH5.5-6.5之間，優(yōu)選pH6.0。
本發(fā)明制劑中所用的干擾素，可使用任何干擾素α，例如，歐洲專利No.43980中公開的干擾素α(其中稱為成熟人白細(xì)胞干擾素A，也參見J.Pharm.Biomed，Ahalysis Vol.7，No.2，233-238(1989))。
用于本發(fā)明的優(yōu)選干擾素α是聚乙二醇-干擾素α2a、聚乙二醇-干擾素α2b或聚乙二醇-干擾素α1b，尤其優(yōu)選聚乙二醇-干擾素α2b。
本發(fā)明的制劑在凍干前，每ml含有106-108IU、特別是1-18×106(IU)的聚乙二醇-干擾素α。
本發(fā)明中采用的干擾素α結(jié)合到聚合物上，例如聚亞烷基二醇(取代的或未取代的)如聚乙二醇上，形成PEG-干擾素α?？捎帽绢I(lǐng)域中已知的各種接頭完成這種結(jié)合，諸如歐洲專利申請(qǐng)EP-A-0510356和A-0593868中公開的那些接頭。聚乙二醇的分子量可在300至60000道爾頓之間變化，一種或多種接頭、優(yōu)選一至三種接頭結(jié)合到干擾素α上。
雖然本發(fā)明并不限于特定的聚乙二醇-干擾素α，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，與干擾素α化學(xué)結(jié)合的聚乙二醇的平均分子量是40000，其中所述的優(yōu)選的聚乙二醇-干擾素α分子是單一聚乙二醇分子與單一干擾素α分子化學(xué)結(jié)合的分子。優(yōu)選的連結(jié)方式為通過酰胺鍵使所述的PEG分子與干擾素α分子連結(jié)。
本發(fā)明的制劑還可以包括任選的穩(wěn)定劑，如單糖類及其衍生物和/或二糖類。常用的單糖類有，例如，葡萄糖、果糖、甘露醇等，優(yōu)選甘露醇；本發(fā)明的制劑在凍干前，單糖類的含量為0.1-3％(w/v)，優(yōu)選0.5％(w/v)。常用的二糖類有，例如，蔗糖、乳糖、海藻糖等，優(yōu)選海藻糖；本發(fā)明的制劑在凍干前，二糖類的含量為0.1-3％(w/v)，優(yōu)選0.5％(w/v)。
當(dāng)單糖類和二糖類一起使用時(shí)，它們的總含量仍為0.1-3％(w/v)，單糖和二糖含量的比值為0.3-1，優(yōu)選0.5。
這些單糖和二糖的保護(hù)作用，也可能是由于其在冷凍狀態(tài)下與聚乙二醇-干擾素α共濃縮，起到稀釋和保護(hù)聚乙二醇-干擾素α的作用，從而防止了聚合；另外，聚乙二醇-干擾素α包含結(jié)合的水分子，這些水分子被多元醇置換后可以提高蛋白的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的制劑也還可以包括任選的填充劑和/或滲透性調(diào)節(jié)劑。
填充劑和/或滲透性調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選甘露醇，但也可以是具有相同作用的其它試劑，如NaCl，甘氨酸，葡聚糖，PVP，羧甲基纖維素等。
本發(fā)明的制劑在凍干前，填充劑和～或滲透性調(diào)節(jié)劑的含量為3-8％(w/v)，優(yōu)選4.5(w/v)％。
該制劑在凍干前還含有水，如無(wú)菌水，生理鹽水等等。優(yōu)選生理鹽水。
按照本發(fā)明，一種可凍干的聚乙二醇-干擾素α溶液，用于制備本發(fā)明凍干制劑。該溶液每ml含有106-108IU、特別是1-18×106(IU)的聚乙二醇-干擾素α；含有谷氨酸1-50mmol，優(yōu)選為5-20mmol，更優(yōu)選為10mmol和/或精氨酸5-100mmol，優(yōu)選為5-30mmol，更優(yōu)選為15mmol；5-20mM可藥用緩沖液，優(yōu)選乙酸鹽緩沖液，優(yōu)選10mM緩沖液，如乙酸鹽緩沖液。
該溶液的pH為pH5.5-6.5之間，優(yōu)選pH6.0。
該溶液中還含有水，如無(wú)菌水，生理鹽水等等。優(yōu)選生理鹽水。
優(yōu)選精氨酸和谷氨酸共用，其中精氨酸和谷氨酸含量的比值為0.5-2.5，優(yōu)選的比值為1-2，更優(yōu)選的比值為1.5。
該溶液每ml還可以含有0.1-3％(w/v)，優(yōu)選0.5％(w/v)的單糖類，優(yōu)選甘露醇，更優(yōu)選0.5％(w/v)甘露醇；和/或0.1-3％(w/v)，優(yōu)選0.5％(w/v)，二糖類，優(yōu)選海藻糖，更優(yōu)選0.5％(w/v)海藻糖。
該溶液每ml還可以含有3-8％(w/v)，優(yōu)選4.5％(w/v)，填充劑和/或滲透性調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選甘露醇，更優(yōu)選4.5％(w/v)甘露醇。
本發(fā)明還涉及一種聚乙二醇-干擾素α凍干制劑的制備方法。本發(fā)明的凍干制劑，可采用常規(guī)方法，通過凍干本發(fā)明的聚乙二醇-干擾素α溶液得到?？梢允褂贸Ｒ?guī)凍干裝置冷凍干燥保護(hù)劑體系和聚乙二醇-干擾素α所共同組成的溶液，其中所使用的冷凍干燥條件是于-35℃至-55℃低溫條件預(yù)冷凍2-6小時(shí)，然后于-35℃至30℃條件下真空干燥12至24小時(shí)。
本發(fā)明還涉及一種聚乙二醇-干擾素α凍干制劑的應(yīng)用方法，包括用水，優(yōu)選抑菌水，使該凍干制劑溶解生成溶液后再使用。
以下實(shí)施例用于進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1取谷氨酸、精氨酸、甘露醇分別用10mM乙酸鹽緩沖液配制，調(diào)pH6.0，經(jīng)過濾除菌，分別配制2-4號(hào)保護(hù)劑，各濃度如下，其中每號(hào)樣品均含有1-18×106(IU)，充分混勻后，分裝為1ml/瓶，進(jìn)行凍干保存。冷凍干燥條件是-35℃預(yù)冷凍4小時(shí)，然后于-35℃至-7℃條件下真空干燥20小時(shí)，然后逐漸升溫至10℃保持3小時(shí)。所使用凍干機(jī)是德國(guó)Christ ALPHA I6。
1號(hào)1％人血白蛋白；2號(hào)15mmol精氨酸+0.5％甘露醇+4.5％甘露醇；3號(hào)10mmol谷氨酸+0.5％甘露醇+4.5％甘露醇；4號(hào)15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+0.5％甘露醇+4.5％甘露醇；將樣品以水再溶解，同時(shí)測(cè)定聚乙二醇-干擾素α2b生物活性的和單個(gè)聚乙二醇-干擾素α2b的純度。結(jié)果見表1-1和表1-2。表1-1為不同保護(hù)劑聚乙二醇-干擾素α2b在4℃保存的穩(wěn)定性，單位為106IU。表1-2為不同保護(hù)劑聚乙二醇-干擾素α2b在25℃保存的穩(wěn)定性，單位為106IU。
表1-1不同保護(hù)劑下聚乙二醇-干擾素α2b在4℃的穩(wěn)定性


表1-2不同保護(hù)劑下聚乙二醇-干擾素α2b在25℃的穩(wěn)定性

從以上兩表可以看出，四種保護(hù)劑在4℃保存二年，聚乙二醇-干擾素α2b的生物學(xué)活性不降低，2、3、4號(hào)保護(hù)劑與1號(hào)保護(hù)劑比無(wú)明顯差別，可以完全替代后者。在25℃保存12個(gè)月時(shí)各號(hào)保護(hù)劑聚乙二醇-干擾素α2b的生物學(xué)活性開始有不同程度下降，4號(hào)保護(hù)劑稍好于2、3號(hào)保護(hù)劑。另外，單聚乙二醇-干擾素α2b的純度是沒有改變的。
實(shí)施例2谷氨酸與精氨酸組合與不同二糖類組合作為凍干保護(hù)劑的比較分別配制以下幾種保護(hù)劑，制備方法見實(shí)施例1。
2-1號(hào)15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+0.5％海藻糖+4.5％甘露醇；
2-2號(hào)15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+0.5％蔗糖+4.5％甘露醇；2-3號(hào)15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+0.5％甘露醇+0.5％乳糖+4.5％甘露醇。
測(cè)定方法同實(shí)施例1。結(jié)果見表2。表2為不同保護(hù)劑聚乙二醇-干擾素在40℃加速試驗(yàn)凍干保存的穩(wěn)定性，單位為106IU。
表2不同保護(hù)劑下聚乙二醇-干擾素在40℃加速試驗(yàn)的穩(wěn)定性

從上表可以看出，海藻糖與谷氨酸、精氨酸組合的凍干保護(hù)效果好于蔗糖或乳糖與谷氨酸、精氨酸組合的保護(hù)效果。同樣，單聚乙二醇-干擾素α2b的純度也是是沒有改變的。
從上述實(shí)例可清楚地看出，本發(fā)明所提供的制劑，能保持聚乙二醇-干擾素α在凍干過程中和儲(chǔ)藏過程中的生物活性和穩(wěn)定性。
實(shí)施例3按照實(shí)施例1中的方法配制以下不同濃度的保護(hù)劑，其中每號(hào)樣品均含有1-18×106(IU)，充分混勻后，分裝為1ml/瓶，進(jìn)行凍干保存。
3-1號(hào)15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+0.5％海藻糖+4.5％甘露醇；3-2號(hào)45mmol精氨酸+30mmol谷氨酸+0.5％海藻糖+4.5％甘露醇；
將樣品以水再溶解，同時(shí)測(cè)定聚乙二醇-干擾素α2b生物活性的和單個(gè)聚乙二醇-干擾素α2b的純度。結(jié)果見表3。表3為不同濃度保護(hù)劑聚乙二醇-干擾素在40℃加速試驗(yàn)凍干保存的穩(wěn)定性，單位為106IU。
表3不同濃度保護(hù)劑下聚乙二醇-干擾素在40℃加速試驗(yàn)的穩(wěn)定性

從上表可以看出，高濃度的保護(hù)劑與低濃度保護(hù)劑相比，保護(hù)效果稍好，但影響不大。
實(shí)施例4按照實(shí)施例1中的方法配制以下不同濃度的保護(hù)劑，其中每號(hào)樣品均含有1-18×106(IU)，充分混勻后，分裝為1ml/瓶，進(jìn)行凍干保存。
4-1號(hào)15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+0.5％海藻糖+4.5％甘露醇；4-2號(hào)15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+1.5％海藻糖+3.5％甘露醇。
結(jié)果見表4。表4為不同濃度保護(hù)劑聚乙二醇-干擾素在40℃加速試驗(yàn)凍干保存的穩(wěn)定性，單位為106IU。
表4不同濃度保護(hù)劑下聚乙二醇-干擾素在40℃加速試驗(yàn)的穩(wěn)定性

從上表可以看出，不同濃度的海藻糖對(duì)聚乙二醇-干擾素α2b均有保護(hù)效果。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇-干擾素α凍干制劑，含有聚乙二醇-干擾素α，一種保護(hù)劑，該保護(hù)劑為精氨酸和/或谷氨酸。
2.權(quán)利要求1的凍干制劑，其中該制劑的pH為pH5.5-6.5，優(yōu)選pH6.0，用藥用緩沖液調(diào)節(jié)。
3.權(quán)利要求1的凍干制劑，其中該保護(hù)劑為谷氨酸和精氨酸。
4.權(quán)利要求3的凍干制劑，其中該精氨酸和谷氨酸含量的比值為0.5-2.5，優(yōu)選的比值為1-2，更優(yōu)選的比值為1.5。
5.權(quán)利要求1-4的凍干制劑，其中所述的制劑含有，單糖或其衍生物，如葡萄糖、果糖、甘露醇等和/或二糖類，如蔗糖、乳糖、海藻糖等；在凍干前，優(yōu)選的單糖類和/或二糖類的含量為0.1-3％(w/v)，特別優(yōu)選0.5％(w/v)海藻糖；當(dāng)單糖類和二糖類一起使用時(shí)，它們的總含量為0.1-3％(w/v)，單糖和二糖含量的比值為0.3-1，優(yōu)選0.5。
6.權(quán)利要求1-5的凍干制劑，其中在凍干前，聚乙二醇-干擾素α的濃度為1-18×106IU/ml；谷氨酸濃度為1-50mmol，優(yōu)選為5-20mmol，更優(yōu)選為10mmol；精氨酸濃度為5-100mmol，優(yōu)選為5-30mmol，更優(yōu)選為15mmol。
7.權(quán)利要求1-6的凍干制劑，其中在凍干前，該緩沖液為5-20mM乙酸鹽緩沖液，優(yōu)選10mM乙酸鹽緩沖液。
8.權(quán)利要求1-7的凍干制劑，其中聚乙二醇-干擾素α的化學(xué)結(jié)合物，優(yōu)選單一聚乙二醇分子與單一干擾素α分子化學(xué)結(jié)合物，所述的聚乙二醇的平均分子量?jī)?yōu)選為40000。
9.權(quán)利要求1-8的凍干制劑，其中所述的干擾素α可以是干擾素α2a，干擾素α2b，干擾素α2c或干擾素α1b，優(yōu)選所述的干擾素α是干擾素α2b。
10.權(quán)利要求1-6的凍干制劑，其中該制劑包括填充劑，優(yōu)選3％-8％(w/v)的甘露醇，更優(yōu)選4.5％(w/v)的甘露醇。
11.權(quán)利要求8的凍干制劑，其中所述的化學(xué)結(jié)合物優(yōu)選通過酰胺鍵使干擾素α2b分子與PEG分子連結(jié)的結(jié)合物。
12.一種聚乙二醇-干擾素α凍干制劑的使用方法，包括用水，優(yōu)選抑菌水，使凍干制劑溶解生成溶液后使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的凍干的聚乙二醇—干擾素α制劑。本發(fā)明的特點(diǎn)在于選用谷氨酸和/或精氨酸作為保護(hù)劑。本制劑可以包括任選附加的穩(wěn)定劑如單糖類和/或二糖類。本制劑也可以包括任選的填充劑和/或滲透性調(diào)節(jié)劑如甘露醇。本發(fā)明優(yōu)選的聚乙二醇—干擾素α是聚乙二醇(40000)－干擾素α。
文檔編號(hào)A61K9/19GK1513549SQ0314095
公開日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月2日
發(fā)明者盛軍, 劉麗軍, 張雪梅, 朱迅, 張春麗, 王志武, 郭橋, 郭立君, 程曉耕, 盛 軍 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春生物制品研究所