專利名稱：抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗體及其衍生物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗體及其衍生物與應(yīng)用，特別涉及一種特異于CD22的嵌合抗體及其衍生物和以它們?yōu)榛钚猿煞值乃幬铩?br> 背景技術(shù)：
非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)是一組多相(heterogeneous)的淋巴組織腫瘤。在美國，有百分之六到八的癌癥被診斷為NHL，每年約有5.5萬新病例。根據(jù)美國癌病協(xié)會(The American Cancer Society)估計，NHL男性發(fā)病率略高于女性，每年約有2.6萬人死于此病(Cancer Statistics，CACancer J.forClinicians，Jan/Feb 2000，Vol.50，No.1)。雖然現(xiàn)存很多有效的化療藥物可治療NHL，但NHL仍然是美國第五大殺手。最常用的治療方法包括高劑量化療，放射治療，及自我骨髓移植等。但這些療法都未能使大部分患者獲得較為持久的疾病緩解。
一般來說，被確診患上輕度濾泡(low grade follicular)NHL的患者，平均存活時間大概有五到七年(Dana et al.1990.J.Clin.Oncol.81155-1162)。但是，除了I期還未擴散(Stage I localized)的淋巴瘤患者外，對大部分患者來說，常規(guī)的化療手段并不能達到治愈的目的。多項研究指出，不同常規(guī)化療方法和手段未能延長濾泡淋巴瘤患者的壽命(Klimo et al.1987.Semin.Hemat.2426-34；Fisheret al.1993.N.Eng.J.Med.3281002-1006；Longo et al.1991.J.Clin.Oncol.925-38)。
也有報告指出，用多種不同化療組合的手段治療患有廣泛擴散NHL的患者具有60-80％的初步完全反應(yīng)(initial complete response)(Dana et al.1990.J.Clin.Oncol.81155-1162；Klimo et al.1987.Semin.Hemat.2426-34； Fisher et al.1993.N.Eng.J.Med.3281002-1006)。盡管如此，但仍有20-40％的患者未能獲得初步完全反應(yīng)，而獲得初步完全反應(yīng)患者中有20-40％會復(fù)發(fā)。這些復(fù)發(fā)的患者仍可用傳統(tǒng)搶救性的化療方法(conventional salvage chemotherapy)醫(yī)治，其中30-40％這類患者會達到初步完全反應(yīng)；但大部分有第二次反應(yīng)的患者會于短期內(nèi)復(fù)發(fā)(Velasquez et al.1988.Blood 71117-122；Cabanillas et al.1982.Blood60693-697；Cabanillas et al.1987.J.Clin.Oncol.5407-412)。
通過高劑量化療(high-dose chemotherapy)，再加上自體骨髓移植(autologousbone marrow transplantation)或外圍干細胞移植(ABMT/PSCT)，能使25-40％的復(fù)發(fā)或高危NHL患者達到長期免于病態(tài)的存活狀態(tài)(Velasquez et al.1988.Blood71117-122；Cabanillas et al.1982.Blood 60693-697；Cabanillas et al.1987.J.Clin.Oncol.5407-412)。但余下的60-75％的上述患者在接受過高劑量化療及ABMT/PSCT治療后還會復(fù)發(fā)。對嘗試過傳統(tǒng)搶救性的化療方法及/或高劑量化療及ABMT/PSCT但卻無效的復(fù)發(fā)性NHL患者來說，極其缺乏嶄新有效的治療方法。
單克隆抗體的出現(xiàn)，提供了另一種治療手段。自Milstein & Kohler在1975年發(fā)明了雜交瘤技術(shù)，單克隆抗體在臨床診斷，治療和預(yù)防方面的運用價值和開發(fā)前景已獲得普遍的肯定。例如，單克隆抗體-放射性偶聯(lián)物被用作治療T細胞淋巴瘤(Rosenet al.1989.Nucl.Med.Biol.16667-668)，惡性黑色素肉瘤(Larson et al.1983.J.Clin.Invest.722102-2114)，卵巢癌(Epenetos et al.1987.J.Clin.Oncol.51890-1899)，和何杰金病(Lenhard et al.1985.J.Clin.Oncol.31296-1300)。但是，單克隆抗體的臨床應(yīng)用，主要問題在于大部分的單克隆抗體都是來自小鼠的B細胞雜交瘤。這些鼠源的抗體不單會在人體內(nèi)引發(fā)“人抗小鼠抗體”免疫反應(yīng)(HAMA)，而且，也缺乏能引導(dǎo)人體自身免疫功能如以補體為媒介的細胞毒作用(CMC)或抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞 毒作用(ADCC)等。直至二十世紀九十年代中期，美國藥品監(jiān)督管理局(FDA)才第一次批準一種治療性的單克隆抗體，為NHL患者帶來新的希望。1997年獲準在美國上市的“利妥昔”(Rituxan)，是一個嵌合單克隆抗體(chimericantibody)，也是有史以來第一個被獲準以裸抗體的形式治療癌癥的抗體，其特異標靶為CD20抗原。CD20抗原只在正常B細胞及惡性B細胞表面上找到。利妥昔用于治療復(fù)發(fā)或?qū)鹘y(tǒng)治療失去反應(yīng)的輕度(low grade)NHL最為有效。標準治療NHL的方法對輕度NHL，復(fù)發(fā)性的中級別(intermediate)及高級別(high-grade)淋巴瘤并沒有治愈的功效(Czuczman et al.1992.Contemporary Oncology，Septemberp.45-52)。約有80％的NHL是B細胞腫瘤，而超過95％的這類B癌細胞表面都表達區(qū)別性的CD20抗原。CD20抗原只在成熟的B細胞表面表達；大/小前B細胞，早/晚期組B細胞，造血的干細胞，一般的漿細胞，或非淋巴的正常組織等都不會表達CD20。所以，在免疫治療的范疇里，CD20是一個非常吸引研究者注意的靶點。而且，CD20抗原并不會從細胞表面脫落，也不會與抗體結(jié)合后而調(diào)節(jié)其表達量。在適當?shù)臈l件下，試管實驗證明，利妥昔可以誘發(fā)ADCC，CDC等功能效應(yīng)(Reff et al.1994.Blood83435-445)。另外，利妥昔在試管實驗里對B淋巴細胞株有生長抑止的作用，也可將已對化療藥產(chǎn)生抵抗力的癌細胞變得對化療藥，如白喉毒素，蓖麻毒素，順式鉑氨(cisplatinum)，鹽酸阿霉素(doxorubicin)，和依托泊甘(etoposide)等，更為敏感，及引起劑量反應(yīng)(dose-response)的細胞凋亡作用(Demidem et al.1997.Cancer Biother.Radiopharmacol.12177-185)。
雖然利妥昔被廣泛證實對非何杰金淋巴瘤有效，但大部分的患者最終都會復(fù)發(fā)。其中一部分復(fù)發(fā)的患者對利妥昔已失去反應(yīng)。而且，并不是每一個患有非何杰金淋巴瘤的患者都對利妥昔有反應(yīng)。對這些不幸的患者來說，他們急需一種象利妥昔般有效和同樣安全的另一種抗體的出現(xiàn)。其實，除了抗CD20抗體外，還有很多能針對不同特性而又特異于B細胞的抗體。就以抗CD22的抗體為例，這些抗體除了與正常B細胞有特異結(jié)合外，與其它正常組織并沒有交叉反應(yīng)。由于B細胞在人體內(nèi)急速地更新代謝，而B細胞的特異抗體并不影響始祖干細胞，所以這些抗體在人體內(nèi)的毒性只會是短暫并是過渡性質(zhì)的，不會構(gòu)成臨床的問題(Stein et al.1993.Cancer Immunol.Immunother.371293-298)。
CD22抗原可在所有的B細胞內(nèi)找到，包括前B細胞和祖B細胞(Dorkin et al.1989.InLeukocyte Typing IVWhite Cell Differentiation Antigens，Knapp etal.，Eds.P.63-64.Oxford University Press，New York，New York)。但CD22的表面表達，只有在不同分階段的成熟B細胞的表面上找到。CD22對調(diào)節(jié)B細胞因抗原而引起的反應(yīng)起著一定的作用(Tedder et al.1997.Annu.Rev.Immunol.15481；Law et al.1994.Immunol.Today 15442)。Sherbina等(Sherbina et al.1996.J.Immunol.1574390-4398)證明了當B細胞抗原受體感應(yīng)到刺激，細胞體內(nèi)的CD22會急速的從細胞質(zhì)移動至質(zhì)膜處，從而使其在細胞受到刺激后5分鐘內(nèi)表面表達增長50-100％。而且，表面表達的CD22也不斷地以t1/2小于一小時的速度急速的內(nèi)化(Shanet al.1995.J.Immunol.1544466)。與CD22在細胞表面結(jié)合的抗體也會以同樣的速度被帶進細胞體內(nèi)(Shan et al.1995.J.Immunol.1544466；Shih et al.1994.Int.J.Cancer 56538；Leung et al.1995.Mol.Immunol.321413)。而抗NHL的鼠源母抗體對惡性B細胞的親合力(avidity)比正常的B細胞明顯要大。
科學(xué)界對治療癌癥有效的非偶聯(lián)抗體(裸抗體)的作用機理并不清楚。一般來說，建議的作用機理是(1)細胞凋亡(apoptosis)；(2)細胞生長抑制效果(growtharrest)；(3)抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)；(4)補體介導(dǎo)的細胞毒作用(CDC)等。由于缺乏一個合理的人NHL的動物模型，要證明或找出抗CD22抗體治療淋巴瘤的作用機理非常困難。
抗CD22的人源化抗體hLL2(epratuzumab)曾在臨床I，II期實驗中應(yīng)用，以治療NHL患者。用法是以裸抗體的形式，用類似利托昔的方法用藥(一星期一次，以靜脈輸液的方法用藥，共四星期)，療效非常顯著。約有一半的患者對藥物有客觀療效反應(yīng)(objective response)，而其中一半有反應(yīng)的患者病情都獲得完全緩解(complete remission)(Leonard et al.2000.Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.1917a；Leonard et al.2000.Blood 96578a；Leonard et al.2002.Semin Oncol 2981-86；Press et al.2001.Hematology 221-240)。值得注意的是，這種抗CD22的人源化抗體用于人體非常安全。在美國紐約的New York Weil Cornell Medical Center所進行的臨床I/II期實驗，患者被輸液120-1000毫克/平方米/星期，共四次，基本上毒性反應(yīng)都是與輸液的過程而非與藥物有關(guān)，而且只屬Grade I毒性。癥狀包括發(fā)熱，發(fā)冷，和低血壓等。跟利妥昔一樣，其作用機理到現(xiàn)在還未能被證實。
抗NHL的鼠源抗體(Campana et al.1985.J.Immunol.1341524-1530)，曾被廣泛應(yīng)用作為免疫毒素，并取得一定程度的抗NHL及毛細胞白血病(hairy cellleukemia)臨床前和臨床療效(Amlot et al.1993.Blood 822624-2633；Sausvilleet al.1995.Blood 853457-3465；Mansfield et al.1996.Bioconjugate Chem.7557-563；Mansfield et al.1997.Blood 902020-2026)。由于免疫毒素內(nèi)毒素部分都是從細菌或非人源的生物提取，本身的免疫原性非常高，在這種情況下，無論抗體部分是否人源化或嵌合化，對免疫毒素的整體免疫原性影響不大。所以，從來沒有將抗NHL的鼠源母抗體嵌合化或人源化的嘗試或報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能保持原來的特異性與親和力，低免疫原性的抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗體及其衍生物。
本發(fā)明提供的抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗體是特異于CD22的嵌合抗體SM03，其人源恆定區(qū)為同種型(isotype)人IGg1/人Kappa。其輕鏈(VK)及重鏈(VH)可變區(qū)氨基酸序列(variable region sequences)衍生于鼠源母抗體可變區(qū)氨基酸序列，如圖1所示，其中鼠源母抗體的輕鏈可變區(qū)為SEQ ID №1；鼠源母抗體的重鏈可變區(qū)為SEQ ID №2；圖中，框內(nèi)的序列為CDR；所述SM03的輕鏈為序列表中SEQ ID №7的氨基酸殘基序列；所述SM03的重鏈為序列表中SEQ ID №8的氨基酸殘基序列。
所述SM03的輕鏈(VK)及重鏈(VH)可變區(qū)氨基酸序列(variable regionsequences)包括了在N-端及/或C-端引入與鼠源母抗體不同的人源抗體氨基酸殘基，如圖2所示，其中嵌合抗體SM03的輕鏈可變區(qū)為SEQ ID №3；嵌合抗體SM03的重鏈可變區(qū)為SEQ ID №4；劃線部分的氨基酸殘基是與鼠源母抗體可變區(qū)序列不同的序列，框內(nèi)的序列為CDR。所述SM03的輕鏈為序列表中SEQ ID №9的氨基酸殘基序列；所述SM03的重鏈為序列表中SEQ ID №10的氨基酸殘基序列。
本發(fā)明所提供的嵌合抗體SM03的衍生物為SM03片段(Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，等)、單鏈抗體(scFv，diabodies)、抗體/抗體片段-因子(如，抗體/抗體片段-白細胞介素，抗體/抗體片段-干擾素，抗體/抗體片段-毒素)融合蛋白、抗體/抗體片段-化學(xué)偶聯(lián)物(如，抗體/抗體片段-化學(xué)毒藥，抗體/抗體片段-放射核素)等。
所述化學(xué)毒藥為阿霉素(doxorubicin)，irinotecan，順式鉑氨(cisplatin)，等；所述放射核素為I125，I131，Y90，In111，Re188等。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種構(gòu)建嵌合抗體SM03表達載體的方法。
本發(fā)明所提供的構(gòu)建嵌合抗體SM03表達載體的方法是將SM03的輕鏈及重鏈可變區(qū)的DNA序列連接到各自相應(yīng)的人源輕鏈與重鏈表達載體的恆定區(qū)，得到嵌合抗體SM03的輕鏈和重鏈表達載體。具體的說，它可以包括以下步驟(1)克隆SM03的VK與VH的DNA序列；(2)將克隆后的SM03的VK與VH的DNA序列插入階段載體；(3)將階段載體中的VK與VH的DNA序列分別插入各自相應(yīng)的人源輕鏈(CK)與重鏈(IgG1)表達載體的恆定區(qū)，得到SM03的輕鏈和重鏈表達載體。
所述階段載體為VKpSTAGE和VHpSTAGE。
所述輕鏈和重鏈表達載體分別為SM03pEkappa和SM03 pEgamma1。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種有效治療與CD22表達有關(guān)疾病的藥物，該藥物源自母免疫球蛋白的免疫原性較低。
本發(fā)明所提供的治療與CD22表達有關(guān)疾病的藥物，它的活性成分是嵌合抗體SM03或其衍生物。
本發(fā)明提供的藥物為嵌合抗體SM03的裸抗體，也可以是嵌合抗體SM03的抗體偶聯(lián)物，可以注射的方式用于人體。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述藥物的用量一般為100-400mg/m2(注射)，療程為四星期，每星期用藥一次。
由于嵌合抗體SM03也是抗CD22(B表位)的抗體，跟epratuzumab一樣，也是人IgG1/kappa同種型，而且其鼠源母抗體已廣泛地以免疫毒素的形式進行臨床前及臨床測試，證明了它只特異地與成熟B細胞或B癌細胞結(jié)合。以裸抗體，或與偶聯(lián)物(如放射核素，毒素等)結(jié)合的方式應(yīng)用于NHL患者身上，尤其對于那些對抗CD20抗體如利托昔等失去療效反應(yīng)的患者，是安全有效的治療方法。
嵌合抗體SM03除了可以用裸抗體的形式作為治療藥物，其衍生物還可用于治療不同的與CD22表達有關(guān)疾病(如，NHL，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡，及其它的自身免疫病等)。
本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)其鼠源母抗體可變區(qū)內(nèi)的序列，用基因合成的方法，將VL與VH的DNA序列連接到各自相應(yīng)的人源輕鏈(CK)與重鏈(IgG1)恆定區(qū)。帶有嵌合抗體SM03的輕鏈(VK-CK)和重鏈(VH-CH1-hinge-CH2-CH3)的載體通過電穿孔法(electroporation)轉(zhuǎn)染到SP2/0骨髓瘤細胞(myeloma cell line)及表達后，分離出的嵌合抗體有2/3的氨基酸序列是人源的IgG1/k同種型(isotype)。類似的IgG1/k同種型嵌合抗體，如利妥昔(rituximab)(IDEC/Genentech，CA，USA)，Reopro(Centocor，PA，USA)，Remicade(Centocor，PA，USA)，Simulect(Novartis，NJ，USA)等，已被廣泛應(yīng)用，并證實了其安全性和極少副作用。所以，嵌合抗體SM03的免疫原性極低。其中的IgG1人源Fc段，亦會加強抗體引發(fā)的免疫療效。純化后的嵌合抗體SM03經(jīng)實驗證明具有跟其鼠源母抗體一樣的特異性和親和力。
帶有人源恆定區(qū)的嵌合抗體SM03具有生物效應(yīng)活性如抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)，或補體介導(dǎo)的細胞毒作用(CMC)等。
嵌合單克隆抗體SM03可識別CD22抗原并與其作特異性之結(jié)合。嵌合單克隆抗體SM03與B細胞有特異性的結(jié)合，因而提供了一個對B細胞NHL有醫(yī)療潛力的工具/手段。
以本發(fā)明的免疫球蛋白為活性成分的藥物可以在治療患有CD22高度表達量的癌癥或免疫系統(tǒng)疾病引起的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中得到廣泛應(yīng)用。


圖1為嵌合抗體SM03鼠源母抗體的VK與VH的氨基酸序列圖2為嵌合抗體SM03的VK與VH的氨基酸序列圖3為嵌合抗體SM03的VK與VH的DNA序列圖4A為可變區(qū)序列未經(jīng)修改的嵌合抗體SM03人Kappa恆定區(qū)嵌合輕鏈(VK-CK)免疫球蛋白的氨基酸序列圖4B為可變區(qū)序列未經(jīng)修改的嵌合抗體SM03人IgG1重鏈(VH-CH1-hinge-CH2-CH3)免疫球蛋白的氨基酸序列圖5A為可變區(qū)序列經(jīng)修飾后的嵌合抗體SM03人Kappa恆定區(qū)嵌合輕鏈(VK-CK)免疫球蛋白的氨基酸序列圖5B為可變區(qū)序列經(jīng)修飾后的嵌合抗體SM03人IgG1重鏈(VH-CH1-hinge-CH2-CH3)免疫球蛋白的氨基酸序列圖6A為VK階段載體的物理圖譜圖6B為VH階段載體的物理圖譜圖7A為輕鏈表達載體的物理圖譜圖7B為重鏈表達載體的物理圖譜圖8為典型的3公升Celligen生物反應(yīng)器生產(chǎn)數(shù)據(jù)圖表圖9為表達并純化后的抗體的SDS-PAGE分析圖10為嵌合抗體SM03的流式細胞術(shù)(flow cytometry)分析圖11為嵌合抗體SM03與鼠源抗體的競爭性流式細胞術(shù)分析圖12A為嵌合抗體SM03在玻管實驗誘發(fā)的細胞毒性作用圖12B為嵌合抗體SM03在玻管實驗誘發(fā)的細胞滯生作用圖13為克隆后的嵌合抗體SM03的鼠源母抗體VK與VH的DNA序列具體實施方式
實施例1、克隆嵌合抗體SM03的鼠源母抗體的VK與VH的DNA序列嵌合抗體SM03的鼠源母抗體的制造方法是先在Balb/c小鼠腹腔注射5×106人扁桃體淋巴細胞。八天之后，追加5×106人扁桃體淋巴細胞的靜脈注射。四天后，小鼠的脾細胞與P3-NSI/1-Ag4-1骨髓瘤細胞融合。其后按照傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)，找到一株細胞株，其分泌的嵌合抗體SM03的鼠源母抗體經(jīng)過冰凍切片篩選，證實只與B淋巴細胞有反應(yīng)性，與其它的正常組織如腎等并沒有反應(yīng)性(Campana D，Janossy G，Bofill M，et al.1985.J.Immunol.1341524-1530)。利用Track mRNA IsolationKit(Invitrogen，San Diego，CA)，從3×107雜交瘤細胞分離出PolyA+RNA，再用cDNA cycle kit(Invitrogen)提取cDNA。簡單的說，1微克的polyA+RNA配合一個特異鼠免疫球蛋白重鏈IgG的CH1部分的引物CH1B(5’-ACA GTC ACT GAG CTG G-3’)，或是一個特異鼠免疫球蛋白輕鏈Ck部分的引物Ck3BH1(5’-GCC GGA TCC TCA CTG GATGGT GGG AAG ATG GAT ACA-3’)用逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)將相關(guān)的輕重鏈第一鏈(first-stranded)cDNA提取出來，然后再用常規(guī)RACE加PCR的方法分別以polyG oligos+Ck3BH1或polyG oligos+CH1B將相關(guān)的輕重鏈雙鏈(double-stranded)cDNA擴增提取出來。擴增后的VH和VK DNA片段按照常規(guī)方法被克隆到TA Cloning Vector(Invitrogen)載體內(nèi)。克隆后的DNA片段用Sanger的方法去解碼VK與VH的DNA序列，克隆后的VK與VH的DNA序列如圖13所示，圖中，劃線部分為限制酶切位點，其中克隆后的輕鏈可變區(qū)DNA序列為SEQ ID №11；重鏈可變區(qū)DNA序列為SEQ ID №12。
實施例2、VK與VH階段載體(Staging Vector)的構(gòu)建要表達嵌合抗體SM03，其鼠源母抗體編碼的VK和VH段DNA必先插入到植有人類輕鏈和重鏈區(qū)域編碼DNA的表達載體中。為此，先將VK或VH段DNA插入適當?shù)碾A段載體。合成后的階段載體在VK或VH段DNA的上游接上一個IgG的表達啟動子(Promoter)，及一段信號肽(Signal Peptide)序列。
VK階段載體來自于改良的M13VKPCR1(Orlandi et al.1989.PNAS863833-3837)。將其中載有IgG表達啟動子(Promoter)序列和一段信號肽(SignalPeptide)序列的BamH1/HindIII段克隆到pBR322(ΔPvuII)載體內(nèi)。pBR322(ΔPvuII)原為一pBR322載體(Strategene，La Jolla，CA，USA)，用限制酶Acc1/Bal1把載體中唯一的PvuII酶切點刪除后，便成pBR322(ΔPvuII)載體。含有M13VKPCR1中的BamH1/HindIII段的pBR322(ΔPvuII)為VK階段載體(VKpSTAGE)，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖6A所示。嵌合抗體SM03的鼠源母抗體的VK段連接到相應(yīng)的表達啟動子/信號肽序列上是通過以下步驟完成的(1)以嵌合抗體SM03的鼠源母抗體的VK DNA序列為模板，以5’-GAC ATC CAG CTG ACC CAG ACT ACA TCC-3’及5’TTA GAT CTC CAGCTT GGT GCC TCC-3’為引物，通過標準的PCR方法，引入了一個PvuII和一個BglII限制酶切點，(2)用PvuII/BglII酶切嵌合抗體SM03的鼠源母抗體的VK基因的PCR產(chǎn)物，(3)將PvuII/BglII酶切過的嵌合抗體SM03的鼠源母抗體的VK基因的PCR產(chǎn)物克隆到VKpSTAGE相應(yīng)的位置上。經(jīng)過Sanger的方法證明克隆到VKpSTAGE的嵌合抗體SM03 PCR產(chǎn)物序列跟原來設(shè)計的一樣，結(jié)果如圖3所示，圖中，粗體堿基表示與原來鼠源母抗體不同的DNA序列，劃線的堿基為酶切位點。表達后的嵌合抗體在VK段中的N-端及C-端的氨基酸序列(如圖5A)與原來鼠源的VK段(如圖4A)有差異，圖5A中，粗體氨基酸殘基表示修飾后的氨基酸殘基。
VH階段載體是改良自M13VHPCR1(Orlandi et al.1989.PNAS 863833-3837)。將其中載有IgG表達啟動子(Promoter)序列和一段信號肽(Signal Peptide)序列的BamH1/HindIII段克隆到pBS載體(Stratagene)內(nèi)，得到VH階段載體(VHpSTAGE)，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖6B所示。SM03抗體的鼠源母抗體的VK段連接到相應(yīng)的表達啟動子/信號肽序列上是通過以下步驟完成的(1)以嵌合抗體SM03的鼠源母抗體的VH DNA序列為模板，以5’-CAG GTC CAA CTG CAG GAG TCT GGG GGA GGC-3’及5’-TGA GGAGAC GGT GAC CAG AGT CCC TTG GCC CCA GTA-3’為引物，通過標準的PCR方法，引入了一個PstI和一個BstEII限制切點，(2)用PstI/BstEII酶切嵌合抗體的SM03鼠源母抗體的VK基因的PCR產(chǎn)物，(3)將PvuII/BglII酶切過的嵌合抗體的SM03鼠源母抗體的VK基因的PCR產(chǎn)物克隆到VHpSTAGE相應(yīng)的位置上。經(jīng)過Sanger的方法證明克隆到VHpSTAGE的嵌合抗體SM03 PCR產(chǎn)物序列跟原來設(shè)計的一樣，結(jié)果如圖3所示。表達后的嵌合抗體在VH段中的N-端及C-端的氨基酸序列(如圖5B)與原來鼠源的VH段(如圖4B)有差異，圖5B中，粗體氨基酸殘基表示修飾后的氨基酸殘基。
實施例3、嵌合抗體SM03表達載體的構(gòu)建嵌合抗體SM03的輕鏈表達載體pEkappa是一個約10kb的表達載體。它包含了一個上游的IgG增強子(Enhancer)，一個用來插入VK段的HindIII/BamH1克隆位點，和連著內(nèi)含子(intron)的人Kappa輕鏈恆定區(qū)的基因序列(genomic sequence)。在輕鏈恆定區(qū)基因序列的下游，放置了一個用SV40啟動子表達的hygromycin選擇標記(selection marker)，其結(jié)構(gòu)如圖7A所示。從SM03VKpSTAGE用HindIII/BamH1限制性內(nèi)切核酸酶把IgG啟動子/信號肽/SM03 VK序列提取出來，再插入pEkappa的HindIII/BamH1克隆位點，便成為嵌合抗體SM03輕鏈表達載體(SM03pEkappa)(如圖7A)。
重鏈表達載體pEgamma1是一個約10kb的表達載體。它包含了一個上游的IgG增強子(Enhancer)，一個用來插入VH段的HindIII/BamH1克隆位點，和連著內(nèi)含子(intron)的人IgG1重鏈恆定區(qū)的基因序列(genomic sequence)。在重鏈恆定區(qū)基因序列的下游，插入了一個用SV40啟動子表達的gpt選擇標記(selection marker)，其結(jié)構(gòu)如圖7B所示。從SM03VHpSTAGE用HindIII/BamH1限制性內(nèi)切核酸酶把IgG啟動子/信號肽/SM03 VH序列提取出來，再插入pEgamma1的HindIII/BamH1克隆位點，便成為SM03重鏈表達載體(SM03 pEgamma1)(如圖7B)。
實施例4、嵌合抗體SM03表達細胞的制備及其生產(chǎn)約10微克被BstXI限制性內(nèi)切核酸酶線化(linearized)的SM03pEkappa，加上約30微克被PvuI限制性內(nèi)切核酸酶線化的SM03 pEgamma1，用電穿孔法(electroporation)去轉(zhuǎn)染5×106SP2/0細胞。轉(zhuǎn)染后的細胞，在正常培養(yǎng)液中經(jīng)過兩天的復(fù)原期，便開始在培養(yǎng)液中加上0.5g/L的hygromycin(Calbiochem，SanDiego，CA)。受轉(zhuǎn)染而存活的細胞株會于2-3星期后出現(xiàn)。存活的細胞株被分別培養(yǎng)，擴大后，可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法去檢測培養(yǎng)液中的人源重鏈Fc段的濃度。陽性結(jié)果而Fc濃度最高的三株克隆細胞會被擴增，儲存。陽性細胞經(jīng)過約500毫升的自殺性組培后，可用Protein A層析柱將培養(yǎng)液中的人源化抗體提純。細胞株的抗體生產(chǎn)量是按照“可提純抗體量÷用于提純的培養(yǎng)液的總體積的方式計算”(以下抗體生產(chǎn)量的計算方法均以此為標準)。選擇最高生產(chǎn)量，最穩(wěn)定，生長速率最快的SM03生產(chǎn)細胞株用作生物反應(yīng)器的生產(chǎn)。采用New Brunswick Scientific的三公升Celligen發(fā)酵罐。約2×109的SM03生產(chǎn)細胞株接入發(fā)酵罐作為種子培養(yǎng)(seedculture)。嚴密檢測細胞生長情況，如氧氣消耗量，pH值，葡萄糖消耗量，抗體濃度等。當培養(yǎng)液里的葡萄糖含量低于1克/升，新鮮的培養(yǎng)液便以灌流的方式輸入發(fā)酵罐，等量的舊培養(yǎng)液亦會以灌流的方式同時輸出。由于Celligen發(fā)酵罐是利用纖維小薄片(fiber disc)去鎖住細胞，細胞不會隨灌流輸出的舊培養(yǎng)液大量流失。灌流率的快慢視培養(yǎng)液里的葡萄糖含量而定。目標是要保持培養(yǎng)液里的葡萄糖含量在1克/升左右。圖8表示一個標準發(fā)酵的抗體生產(chǎn)量。培養(yǎng)好的培養(yǎng)液會以Protein A層析柱的方法提純。提純后的抗體用SDS-PAGE電泳法質(zhì)控，電泳結(jié)果如圖9所示，圖中，泳道1為重量標記，泳道2為人源抗體標準對照，泳道3為SM03試產(chǎn)第一批，泳道4為SM03試產(chǎn)第二批，從圖中可以看出，抗體的純度很高。
實施例5、用流式細胞儀(flow cytometry)分析SM03的穩(wěn)定性為保證不同生產(chǎn)批量的SM03仍保持其特異性(specificity)和親和力(affinity)，將四批不同生產(chǎn)及儲存時間(最長一年，最短兩星期)的純化SM03用流式細胞術(shù)分析，測試其與Raji人淋巴瘤細胞的特異結(jié)合。結(jié)果如圖10所示，表明四批SM03與Raji人淋巴瘤細胞結(jié)合后所產(chǎn)生的熒光強度一致，說明不同生產(chǎn)及儲存時間都不會影響SM03的特異性和親和力。
實施例6、SM03與鼠源母抗體親和力的比較本實施例用競爭性流式細胞術(shù)去分析比較鼠源母抗體與SM03的親和力。作法是用固定濃度的FITC-鼠源母抗體偶聯(lián)物，跟不同濃度的競爭抗體(鼠VS SM03試產(chǎn)第一批抗體)混合后，再與Raji細胞反應(yīng)。然后，用熒光活化細胞分類掃描器(FACScan)分析在競爭抗體影響下，還有多少殘留的FITC-鼠源母抗體能與Raji細胞結(jié)合。結(jié)果如圖11所示，表明鼠源母抗體跟嵌合抗體SM03作為競爭抗體有相近的親和力，嵌合化后的抗體SM03特異性與親和力并未因嵌合化的過程中改動V段小量的氨基酸序列(圖5A和圖5B中的粗體氨基酸殘基)而減弱。雖然，嵌合抗體SM03的競爭力看似略高于鼠源母抗體，其分別甚為輕微，在正常實驗誤差之內(nèi)，可能源于抗體濃度評估的細微分別。總的來說，嵌合抗體的SM03親和力并不低于，或基本相同于鼠源母抗體。
實施例7、SM03在玻管實驗誘發(fā)的細胞毒性/細胞滯生作用(cytostatic effect)在粘附有SM03或粘附有不相關(guān)的對照人源化抗體的96-孔板(96-well plate)內(nèi)，加入4×105Raji細胞培養(yǎng)，再在不同時段用Trypan Blue色素評估壞死細胞與健康細胞的比率。結(jié)果如圖12A所示，表明嵌合抗體SM03能誘導(dǎo)細胞毒性，尤以孵化24小時后，細胞的死亡率達百分之三十。同樣地，在黏附有嵌合抗體SM03或黏附有不相關(guān)的對照人源化抗體的96-孔板(96-well plate)內(nèi)，加入1×105Ramos人淋巴癌細胞培養(yǎng)，再在不同時段評估細胞的總數(shù)量。結(jié)果如圖12B所示，表明嵌合抗體SM03能抑止細胞生長。
序列表<160>12<210>1<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu15 10 15Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser20 25 30Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys35 40 45Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile65 70 75Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln80 85 90Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu95 100 105Ile Lys107<210>2<211>123<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly15 10 15Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser20 25 30Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Trp Pro Glu Lys Arg Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr50 55 60Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp80 85 90Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly Ser Ser95 100 105Tyr Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr110 115 120Val Ser Ala123<210>3<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>3Asp Ile Gln Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu15 10 15Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
20 25 30Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys35 40 45Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile65 70 75Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln80 85 90Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu95 100 105Ile Lys107<210>4<211>123<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly15 10 15Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser20 25 30Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Trp Pro Glu Lys Arg Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr50 55 60Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp
80 85 90Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly Ser Ser95 100 105Tyr Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr110 115 120Val Ser Ser123<210>5<211>321<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5gacatccagc tgacccagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60attagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaatat tacactcagg agtcccatca 180aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240gaagattttg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300ggcaccaagc tggagatcaa a 321<210>6<211>369<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6caggtccaac tgcaggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt atctatgaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gtggtggtac cacctactat180ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac240ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacatagt300ggctacggta gtagctacgg ggttttgttt gcttactggg gccaagggac tctggtcacc360gtctcctca369<210>7<211>213<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>7Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu15 10 15Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser20 25 30Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys35 40 45Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile65 70 75Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln80 85 90Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu95 100 105Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro110 115 120Ser Asp Glu Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu125 130 135Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp140 145 150
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Gln Gln155 160 165Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu170 175 180
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val185 190 195Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg200 205 210Gly Glu Cys213<210>8<211>452<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>8Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly15 10 15Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser20 25 30Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Trp Pro Glu Lys Arg Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr50 55 60Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp80 85 90Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly Ser Ser95 100 105Tyr Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
110 115 120Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala125 130 135Pro Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu140 145 150Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser155 160 165Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln170 175 180Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser185 180 195Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys200 205 210Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys215 220 225Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu230 235 240Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr245 250 255Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp260 265 270Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp275 280 285Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln290 295 300Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His305 310 315Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn320 325 330Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys335 340 345Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg350 355 360Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly380 385 390Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser395 400 405Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser410 415 420Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu425 430 435Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro440 445 450Gly Lys452<210>9<211>213<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>9Asp Ile Gln Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu15 10 15Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser20 25 30Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys35 40 45Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile65 70 75Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln80 85 90Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
95 100 105Ile Lys-Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro110 115 120Ser Asp Glu Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu125 130 135Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp140 145 150Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Gln Gln155 160 165Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu170 175 180Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val185 190 195Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg200 205 210Gly Glu Cys213<210>10<211>452<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>10Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly15 10 15Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser20 25 30Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Trp Pro Glu Lys Arg Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr50 55 60
Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp80 85 90Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly Ser Ser95 100 105Tyr Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr110 115 120Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala125 130 135Pro Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu140 145 150Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser155 160 165Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln170 175 180Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser185 190 195Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys200 205 210Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys215 220 225Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu230 235 240Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr245 250 255Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp260 265 270Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp275 280 285Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln290 295 300Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His305 310 315Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
320 325 330Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys335 340 345Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg350 355 360Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys365 370 375Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly380 385 390Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser395 400 405Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser410 415 420Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu425 430 435Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro440 445 450Gly Lys452<210>11<211>321<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>11gatatccaga tgacccagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc60attagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca120gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaatat tacactcagg agtcccatca180aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa240gaagattttg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga300ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210>12<211>369<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>12gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt atctatgaca tgtcttgggt tcgccagact120ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gtggtggtac cacctactat180ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac240ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacatagt300ggctacggta gtagctacgg ggttttgttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact360gtctctgca369
權(quán)利要求
1.一種抗人非何杰金淋巴瘤的嵌合抗體SM03，其特異于CD22，它的人源恒定區(qū)為同種型人IGg1和/或人Kappa。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗體SM03，其特征在于所述SM03的輕鏈及重鏈可變區(qū)衍生于鼠源母抗體的可變區(qū)氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的嵌合抗體SM03，其特征在于所述SM03的輕鏈為序列表中SEQ ID №7的氨基酸殘基序列；所述SM03的重鏈為序列表中SEQ ID №8的氨基酸殘基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的嵌合抗體SM03，其特征在于所述SM03的輕鏈及重鏈可變區(qū)序列在N-端及/或C-端引入與鼠源母抗體不同的人源抗體氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嵌合抗體SM03，其特征在于所述SM03的輕鏈為序列表中SEQ ID №9的氨基酸殘基序列；所述SM03的重鏈為序列表中SEQ ID №10的氨基酸殘基序列。
6.抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗體SM03的衍生物，為嵌合抗體SM03的片段、單鏈抗體、抗體/抗體片段-因子融合蛋白或抗體/抗體片段-化學(xué)偶聯(lián)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的嵌合抗體SM03的衍生物，其特征在于所述抗體/抗體片段-化學(xué)偶聯(lián)物為抗體/抗體片段-化學(xué)毒藥或抗體/抗體片段-放射核素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的嵌合抗體SM03地衍生物，其特征在于所述化學(xué)毒藥為阿霉素，irinotecan，順式鉑氨；所述放射核素為I125，I131，Y90，In111，Re188。
9.嵌合抗體SM03及其衍生物在制備治療與CD22表達有關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述與CD22表達有關(guān)的疾病為自身免疫疾病，特別是NHL、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及紅斑狼瘡。
11.一種治療與CD22表達有關(guān)疾病的藥物，它的活性成分是嵌合抗體SM03或其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。目的是提供一種能保持原來的特異性與親和力，低免疫原性的抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗體及其衍生物。本發(fā)明提供的抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗體是特異于CD22的嵌合抗體SM03，其人源恒定區(qū)為同種型(isotype)人IGg1/人Kappa。本發(fā)明所提供的構(gòu)建嵌合抗體SM03表達載體的方法是將SM03的輕鏈及重鏈可變區(qū)的DNA序列連接到各自相應(yīng)的人源輕鏈與重鏈表達載體的恒定區(qū)，得到嵌合抗體SM03的輕鏈和重鏈表達載體。嵌合抗體SM03的免疫原性極低。其中的IgG
文檔編號A61P19/00GK1542019SQ0312305
公開日2004年11月3日 申請日期2003年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月29日
發(fā)明者梁瑞安, 楊蕾 申請人:中國抗體制藥有限公司