專利名稱：知母總皂苷用于制備防治腦卒中藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是將知母總皂苷用于制備防治腦卒中(腦中風(fēng))的藥物或食品的用途。
知母的化學(xué)成分主要為皂苷、黃酮類成分，其中已經(jīng)報道的皂苷類成分有二十多種，例如知母皂苷AI、知母皂苷AIII、知母皂苷B、知母皂苷BI、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷BIV、知母皂苷BV、知母皂苷BVI、西陵皂苷B、知母皂苷C、知母皂苷C1、知母皂苷C2、知母皂苷D、知母皂苷D1、知母皂苷D2、知母皂苷E1、知母皂苷E2、知母皂苷F、知母皂苷G、知母皂苷H1、知母皂苷H2、知母皂苷I1、知母皂苷I2、知母皂苷Ia、薩爾薩皂苷元、嗎爾考皂苷元、新吉托皂甙元等。(1.藥學(xué)學(xué)報，1992；27(1)26-32；2.藥學(xué)學(xué)報，1996，31(4)271-277；3.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，1996；13(1)34-40；4.藥學(xué)學(xué)報，1997；32(6)473-475；5.中國藥物化學(xué)雜志，1998；8(2)135-136，140；6.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，1998；15(4)254-256；7.藥學(xué)學(xué)報，1998；33(9)693-696；8.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，1998；15(2)130-131；9.中國藥物化學(xué)雜志，1999；9(4)294-298；10.藥學(xué)學(xué)報，1999；34(7)514-517；11.藥學(xué)學(xué)報，1991；26(8)619-21；12.PlantaMedica，1991；5726-32；13.Chem Pharm Bull，1994；42(11)2342-5；14.PlantaMed，1997；63(4)376-9；15.Planta Med，1999；65(7)661-3；16.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001；13(5)18-21)。
有的知母皂苷類成分的藥理作用已有報道，主要有
1、知母皂甙元(ZMS)、知母皂苷B能顯著改善老齡大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能(中藥藥理與臨床，1995；11(3)18-21；現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000；9(18)1755-6；中國老年學(xué)雜志，21(5)379-80；發(fā)明專利申請公開說明書，公開號CN 1301166，申請?zhí)?9806158.1)；知母中甾體皂苷具有防治老年性癡呆作用(發(fā)明專利申請公開說明書，公開號CN 1212966，申請?zhí)?7119680.X)。
2、知母皂苷D具有保護(hù)心肌I/R損傷的作用，這一作用可能與其抗PAF、抗血小板聚集和清除自由基等機(jī)理有關(guān)(首都醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1994；15(2)138)；知母皂苷Ia、知母皂苷B-I、知母皂苷B-II、知母皂苷B-III、知母皂苷A-III具有顯著的抗人血小板聚集及延長凝血時間的活性(Clin Chim Acta，1999；289(1-2)79-88)。
3、知母甾體總皂苷具有雌激素樣抗骨質(zhì)疏松作用、抗炎、抑制中性粒細(xì)胞過氧化物產(chǎn)生的作用(發(fā)明專利申請公開說明書，公開號CN 1370537，申請?zhí)?1 106195.2)。
至今未見知母總皂苷用于防治腦卒中的報道。
心腦血管疾病已成為我國人口的重要死亡原因。我國心腦血管病的特點是腦卒中發(fā)病率高于冠心病，腦卒中患者約有1/3在發(fā)病不久后死亡，幸存者則由于偏癱、失語等后遺癥致殘喪失工作甚至生活自理能力。與腦卒中的高發(fā)病率及高致死率、致殘率相比，目前用于預(yù)防治療腦卒中的藥物品種較少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需要。經(jīng)研究表明，知母總皂苷可明顯改善大鼠腦缺血再灌注損傷引起的行為癥狀、縮小腦梗塞體積、降低腦缺血大鼠腦水腫。因此，知母總皂苷可用于制備防治腦卒中的藥物或食品。
具體實施例方式本發(fā)明知母總皂苷的制備方法為按常規(guī)將粉碎的知母藥材用20～95％乙醇熱提，首次溶媒用量約為生藥量的4～8倍；或?qū)⒎鬯榈闹杆幉挠?0～95％乙醇滲漉提取，溶媒用量約為生藥量的4～12倍；提取液濃縮，濃縮液離心或過濾；濃縮液的離心上清液或過濾液通過大孔樹脂吸附(大孔樹脂為以苯乙烯為架橋材料的聚苯乙烯型多孔性吸附樹脂，如D101、D201、ZTC-1、AB-8、1300-1型大孔樹脂等)，用水及20％以下的乙醇淋洗除去雜質(zhì)；再用含水低級醇洗脫，低級醇為甲醇、乙醇或丙醇等C1～C5醇類，其濃度為30～95％，用量為生藥量的5～15倍，收集低級醇洗脫液，濃縮至無醇，干燥粉碎或噴霧干燥，即為本發(fā)明的知母總皂苷，成品收率為生藥量的1.5％以上。
本發(fā)明知母總皂苷成分分析經(jīng)硅膠、sephadexLH-20、ODS等反相色譜擔(dān)體柱色譜獲得了6個化合物，用化學(xué)、波譜法測定了結(jié)構(gòu)，分別為薩爾薩皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(知母皂苷AIII)、嗎爾考皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷、26-O-β-D-吡喃葡萄糖基呋甾-20(22)-烯-3 β，26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(知母皂苷B)、薩爾薩皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→3)-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(西陵皂苷B)、26-O-β-D-吡喃葡萄糖基呋甾-22，3 β，26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(知母皂苷BII)、薩爾薩皂苷元。經(jīng)HPLC檢測，知母總皂苷中知母皂苷BII、知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷AIII的含量之和≥50％。
藥理試驗知母總皂苷對SD(Sprague-Dawley)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用1.試驗方法將SD大鼠(中國科學(xué)院上海分院動物中心提供)隨機(jī)分為5組假手術(shù)組、陰性對照組、陽性對照組、知母總皂苷低劑量組及知母總皂苷高劑量組，每組30只，雌雄各半，體重200±22g。假手術(shù)組僅結(jié)扎單側(cè)頸總動脈，以排除手術(shù)本身對實驗結(jié)果的影響；陰性對照組即栓塞大鼠大腦中動脈，作為局灶性腦缺血2小時再灌注24小時損傷模型，給予等量的生理鹽水；陽性對照組用杏靈顆粒(上海，杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，批號20030201)作為知母總皂苷療效的對照，其推薦臨床劑量為3g/日，人按60kg體重計算，相應(yīng)劑量為50mg/kg，折算為大鼠的劑量為300mg/kg，設(shè)計陽性藥劑量相當(dāng)受試藥物的中劑量，故取1g/kg(相當(dāng)于銀杏酮酯40mg/kg)；知母總皂苷低劑量組為50mg/kg，知母總皂苷治療高劑量組為300mg/kg。各組均灌胃給藥。
根據(jù)新藥審評要求，用栓線法制備SD大鼠腦缺血再灌注模型(制備方法詳見《西藥新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》的藥理學(xué)部分，中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局，199373；《藥理實驗方法學(xué)》第二版，人民衛(wèi)生出版社，1982830、1113)，除假手術(shù)組外，其余各組均用該模型鼠試驗。各組在缺血1小時的時候，灌胃給藥；再缺血1小時后再灌注24小時，然后觀察以下指標(biāo)(1)對神經(jīng)病學(xué)的影響觀察存活鼠24小時后行為變化，進(jìn)行行為學(xué)評分，參考Zea Longa的5分制評分標(biāo)準(zhǔn)0分為正常，無神經(jīng)損傷癥狀；1分為不能完全伸展對側(cè)前爪；2分為向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。
(2)對腦組織含水量的影響每組取8只大鼠快速斷頭取大腦，分別稱左右腦半球濕重，置160℃烤箱內(nèi)烘干，24小時后稱干重，按以下公式計算腦組織含水量腦組織含水量(％)＝(濕重-干重)/濕重×100％。
(3)對腦梗塞體積的影響每組取8只大鼠，處死取大腦，切下厚約2mm冠狀腦片，立刻置于2％氯化三苯基四氮唑溶液中，37℃孵育30分鐘。梗塞區(qū)呈現(xiàn)白色，非梗塞區(qū)呈現(xiàn)紅色。數(shù)碼相機(jī)拍攝記錄，用Medbrain 2.0軟件(南京美易科技公司)測腦片總體積及梗塞區(qū)體積，計算梗塞區(qū)占整個腦組織的百分比(％)。2.試驗結(jié)果2.1對神經(jīng)病學(xué)的影響各組隨機(jī)取10只大鼠，觀察存活鼠的行為，假手術(shù)組大鼠均無異常癥狀，陰性對照組大鼠出現(xiàn)不能完全伸展對側(cè)前爪或向外側(cè)轉(zhuǎn)圈或向?qū)?cè)傾倒的神經(jīng)損傷癥狀。腦缺血1小時即灌胃給予知母總皂苷藥液，低、高二劑量組均可顯著降低行為評分，結(jié)果詳見表1。表1 知母總皂苷對大鼠缺血2小時再灌注24小時的行為變化評分結(jié)果(x±s)組別 動物數(shù)(只)行為評分(分)假手術(shù)組 10 0陰性對照組10 1.5±0.7低劑量50mg/kg 10 0.8±0.6**高劑量300mg/kg10 0.3±0.5***杏靈顆粒1.0g/kg 10 0.6±0.5*與陰性對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
從表1看出，知母總皂苷低劑量組和高劑量組的行為評分同陰性對照組比較有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.001)，降低程度與藥物有劑量依賴關(guān)系。說明知母總皂苷可以明顯改善因缺血再灌注引起的神經(jīng)損傷癥狀。2.2對腦組織含水量的影響實驗結(jié)果見表2。
表2 知母總皂苷對大鼠缺血再灌注腦組織含水量的影響(％，x±s)組別 動物數(shù)(只)大腦左半球含水量 大腦右半球含水量假手術(shù)組 8 80.16±0.82 80.37±0.77陰性對照組 8 80.54±0.43 84.98±1.05ΔΔ低劑量50mg/kg 8 80.76±0.55 82.43±1.42Δa**高劑量300mg/kg 8 80.79±0.71 81.19±**杏靈顆粒1.0g/kg8 80.75±0.95 81.60±1.43**與陰性對照組比較，**P＜0.01與假手術(shù)組比較，ΔΔP＜0.01從表2看出，陰性對照組缺血側(cè)(大腦右半球)的腦組織含水量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，知母總皂苷低劑量組的腦組織含水量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，但低于陰性對照組，兩者間有顯著性差異(P＜0.01)；知母總皂苷高劑量組和杏靈顆粒組(陽性對照組)的腦組織含水量顯著低于陰性對照組(P＜0.01)，與假手術(shù)組無顯著性差異。實驗結(jié)果表明，知母總皂苷低劑量和高劑量組均可顯著降低缺血再灌注損傷腦組織的含水量，減輕缺血側(cè)腦半球水腫程度。2.3對腦梗塞體積的影響實驗結(jié)果見表3。
表3 知母總皂苷對大鼠腦缺血再灌注的腦梗塞體積的影響(％，x±s)組別動物(只)梗塞體積假手術(shù)組8 0陰性對照組 8 35.24±8.59低劑量50mg/kg 8 21.44±5.09**高劑量300mg/kg 8 2.93±3.88**杏靈顆粒1.0g/kg 810.23±10.11**與陰性對照組比較，**P＜0.01
從表3看出，假手術(shù)組腦組織無梗塞，陰性對照組缺血側(cè)腦組織有梗塞現(xiàn)象，梗塞區(qū)占整個腦組織的百分比為35.24±8.59％；知母總皂苷低、高二個劑量組和杏靈顆粒組均可顯著縮小缺血側(cè)腦組織梗塞體積，與陰性對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，分別降低了39.16％，91.69％及70.97％；尤其是高劑量組縮小缺血側(cè)腦組織梗塞體積作用強(qiáng)于杏靈顆粒組。結(jié)果表明，知母總皂苷低劑量、高劑量對大鼠腦缺血再灌注損傷引起的腦梗塞均有顯著保護(hù)作用。
以上試驗結(jié)果說明，知母總皂苷可明顯改善大鼠腦缺血再灌注損傷引起的行為癥狀、縮小腦梗塞體積、降低腦缺血大鼠腦水腫。另外，知母總皂苷還能顯著增加麻醉犬的腦血流量、抑制家兔血栓形成、降低家兔全血粘度。這些作用都有利于預(yù)防和治療腦卒中，因此，知母總皂苷可用于制備防治腦卒中的藥物或食品。
本發(fā)明對知母總皂苷拓展了新的醫(yī)藥用途，也為防治腦卒中提供了一種新的藥物來源。知母總皂苷安全低毒，藥理作用較強(qiáng)，其原料來源豐富、價廉，制備工藝簡單，可用于制備防治腦卒中的藥物或食品。
實施例1 制備知母總皂苷100公斤粉碎后的知母藥材，投入提取罐，在90～100℃依次用70％乙醇400升熱提3次，每次提取時間為90分鐘，合并3次提取液，濃縮至80升，過濾，將濾液用蒸餾水調(diào)節(jié)至100升。再緩緩?fù)ㄟ^裝有350升ZTC-1型大孔樹脂(天津正天成澄清技術(shù)有限公司生產(chǎn))的吸附柱，用500升蒸餾水、1000升20％乙醇洗脫除去雜質(zhì)，再用1000升45％乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，干燥粉碎后得黃色粉末，即為本發(fā)明的知母總皂苷，共重2.7公斤，按生藥量計得率為2.7％。
權(quán)利要求
1.知母總皂苷，用于制備防治腦卒中藥物或食品的用途。
2.權(quán)利要求1所述的知母總皂苷，其特征在于知母總皂苷中的知母皂苷BII、知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷AIII的含量之和≥50％。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。是將知母總皂苷用于制備防治腦卒中(腦中風(fēng))藥物或食品的用途。經(jīng)動物試驗，知母總皂苷可明顯改善大鼠腦缺血再灌注損傷引起的行為癥狀、縮小腦梗塞體積、降低腦缺血大鼠腦水腫。本發(fā)明拓展了知母總皂苷的用途，也為防治腦卒中提供了一種新的藥物來源。
文檔編號A61K31/58GK1451384SQ0311682
公開日2003年10月29日 申請日期2003年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月9日
發(fā)明者陳萬生, 邱彥, 殷學(xué)平, 陶朝陽, 李鐵軍, 婁子洋 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)