專利名稱：淀粉樣β肽的特異性抗體、其藥物組合物及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療患有阿爾茨海默氏癥(Alzheimer’s Disease)的患者的方法，包含施用靶向淀粉樣β肽或其片段的抗體分子的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療以淀粉樣蛋白β沉積為特點(diǎn)的疾病或紊亂的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗體分子，其對(duì)于淀粉樣β肽的N端或C端的游離端具有特異性，并涉及它的一種藥物組合物。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏癥(Alzheimer’s Disease，AD)的一個(gè)主要的組織病理學(xué)特征是在杏仁核、海馬和新皮層的實(shí)質(zhì)的神經(jīng)炎性和彌散性蝕斑(plaque)中存在淀粉樣蛋白沉淀(Glenner和Wong，1984；Masters et al.，1985；Sisodia和Price，1995)。淀粉樣蛋白(Amyloid)是一個(gè)一般性的名詞，用來描述具有共同的β-褶狀(β-pleated)結(jié)構(gòu)的纖維狀聚集體。這些聚集體在剛果紅和偏振光的存在下表現(xiàn)出雙折射的性質(zhì)(Glemer和Wong，1984)。彌散性蝕斑被認(rèn)為比神經(jīng)炎性蝕斑相對(duì)良性，后者表現(xiàn)出與反應(yīng)性和退化性過程強(qiáng)烈相關(guān)(Dickson et al.，1988；Tagliavini et al.，1988；Yamaguchi et al.，1989；Yamaguchi et al.，1992)。神經(jīng)炎性蝕斑的一種主要的成分是含有42個(gè)氨基酸殘基的淀粉樣β(Aβ)肽(Miller et al.，1993；Roher et al.，1993)，其是從較大的β淀粉樣蛋白前體蛋白-βAPP(或APP)衍生的(Kang et al.，1987)。Aβ1-42產(chǎn)生的量大大少于1-40Aβ肽(Haass et al.，1992；Seubert et al.，1992)，但是Aβ1-42的優(yōu)先沉積源于這種COOH延伸的形式比1-40Aβ更加難溶解，且更易于沉積形成反平行的β-褶狀折疊(Joachim et al.，1989；Halverson et al.，1990；Barrow et al.，1992；Burdick et al.，1992；Fabian et al.，1994)。Aβ1-42能夠促進(jìn)Aβ1-40的聚集。
APP基因已被測(cè)序并發(fā)現(xiàn)被編碼定位在染色體21上(Kang et al.，1987)。APP基因的表達(dá)產(chǎn)生了幾種包含Aβ的有695、751和770個(gè)氨基酸的同工型，后兩個(gè)APP包含一個(gè)同Kunitz蛋白酶抑制劑具有結(jié)構(gòu)和功能同源性的結(jié)構(gòu)域(Kang et al.，1987；Kitaguchi et al.，1988；Ponte et al.，1988；Tanzi et al.，1988；Konig et al.，1992)。盡管有越來越多的證據(jù)表明APP在介導(dǎo)神經(jīng)元的粘附和生長(zhǎng)(Schubert et al.，1989；Saitoh et al.，1994；Roch，1995)以及可能在G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著作用(Nishimoto et al.，1993)，但APP在神經(jīng)系統(tǒng)的功能仍有待于定義。在培養(yǎng)的細(xì)胞中，APP通過固有分泌途徑成熟(Weidemann et al.，1989；Haasset al.，1992；Sisodia 1992)，一些細(xì)胞表面結(jié)合的APP通過一種酶，叫做α-分泌酶(secretase)(Esch et al.，1990)，在Aβ結(jié)構(gòu)域內(nèi)被切割，這一事件阻止Aβ淀粉樣蛋白產(chǎn)生(Amyloidogenesis)。一些研究描述了另外兩條產(chǎn)生Aβ淀粉樣蛋白的加工APP的途徑第一條是內(nèi)體的(endosomal)/溶酶體的途徑，產(chǎn)生了一種APP相關(guān)的膜包裹的片段復(fù)雜系列，其中一些含有完整的Aβ序列(Haass et al.，1992；Golde et al.，1992)；第二條是Aβ1-40通過并未完全了解的機(jī)制被分泌到條件培養(yǎng)基中并存在于體內(nèi)的腦脊髓液中(Haass et al.，1992；Seuber te al.，1992；Shoji et al.，1992；Busciglioet al.，1993)。溶酶體的降解不再被認(rèn)為對(duì)Aβ的產(chǎn)生有顯著的貢獻(xiàn)(Sisodia和Price，1995)。在Aβ的NH2和COOH端的切割負(fù)責(zé)的蛋白水解酶分別被稱為β(BACE)和γ分泌酶。直到最近，Aβ被廣泛的認(rèn)為是通過其前體的異常代謝產(chǎn)生的。然而，Aβ在許多種培養(yǎng)細(xì)胞條件培養(yǎng)基以及在人類腦脊髓液中的存在暗示Aβ是作為細(xì)胞的正常功能產(chǎn)生的。
研究人員的主要焦點(diǎn)和與AD藥物開發(fā)相關(guān)的研究者的主要目的是降低Aβ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的沉積。這些研究可以分為幾個(gè)主要的方面影響Aβ產(chǎn)生的因素，Aβ的清除，以及預(yù)防不溶性Aβ纖維形成。另外一個(gè)治療的目的是減低Aβ神經(jīng)毒性所引發(fā)的炎癥反應(yīng)。
由于神經(jīng)毒性表現(xiàn)為與Aβ的β-褶狀聚集體相關(guān)，一種治療的方法是抑制或延遲Aβ的聚集。該方法的優(yōu)點(diǎn)是引發(fā)Aβ過量產(chǎn)生或Aβ在細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)的效果的機(jī)制不需要被完全理解。能夠結(jié)合Aβ的各種物質(zhì)能夠在體外抑制Aβ的神經(jīng)毒性，例如，結(jié)合Aβ的染料剛果紅能夠在培養(yǎng)的神經(jīng)元中完全抑制Aβ誘導(dǎo)的毒性(Yankner et al.，1995)。同樣地，抗生素利福平也可以防止Aβ的聚集及隨后的神經(jīng)毒性(Tomiyama et al.，1994)。其它正在開發(fā)的一些化合物可作為這個(gè)過程的抑制劑，或通過直接結(jié)合Aβ，例如溴化十六烷基-N-甲基哌啶鎓(hexadecyl-N-methylpiperidinium(HMP)bromide)(Wood et al.，1996)；或通過防止Aβ與其它有助于形成Aβ沉積的分子的相互作用。一個(gè)這樣的分子的例子是硫酸乙酰肝素或乙酰肝素蛋白聚糖，基底膜聚糖，其已經(jīng)在所有的淀粉樣蛋白中被鑒定并被暗示存在于淀粉樣蛋白誘發(fā)相關(guān)的炎癥反應(yīng)的早期。
硫酸乙酰肝素與Aβ相互作用，并賦予其特征性的二級(jí)和三級(jí)淀粉樣蛋白的結(jié)構(gòu)特征。最近，小分子的陰離子硫酸鹽被示為能與該反應(yīng)相互作用以防止或阻止(arrest)淀粉樣蛋白形成(Kisilevsky，1999)，盡管這些化合物能否進(jìn)入CNS并不明顯。基于基底膜聚糖結(jié)合域序列的一種肽表現(xiàn)為能夠抑制Aβ和基底膜聚糖的相互作用，具有抑制自我聚合的能力的Aβ衍生肽被研究作為一種潛在的先導(dǎo)化合物來開發(fā)對(duì)AD的治療性的方法。然而，這些化合物在體內(nèi)的作用可能因?yàn)樵S多種原因是適中的，最顯著的需要是對(duì)于血腦屏障的慢性滲透。
基于多肽的治療方法的一個(gè)選擇是用來解釋Aβ的神經(jīng)毒性的細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制并開發(fā)以這些細(xì)胞內(nèi)靶為目標(biāo)的治療方法。焦點(diǎn)已經(jīng)集中在自由基介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的鈣離子功能紊亂的調(diào)控上。假設(shè)Aβ結(jié)合到細(xì)胞表面的RAGE(晚期糖基化終末產(chǎn)物的受體)，進(jìn)而引起能夠產(chǎn)生細(xì)胞毒性的氧化刺激物的反應(yīng)(Yan et al.，1996)。阻斷Aβ與細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)的通路可以延遲AD中神經(jīng)元損傷的進(jìn)行。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)阻斷Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的特異的藥理學(xué)物質(zhì)。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及治療患有阿爾茨海默氏癥或以β淀粉樣蛋白沉積為特征的疾病(disease)或紊亂(disorder)的患者的方法，包含施用靶向β淀粉樣肽或其片段的抗體分子的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗體分子，其對(duì)于一種淀粉樣蛋白的N端或C端的游離端具有特異性，并涉及一種包含該抗體分子的藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗體分子，其靶向N和/或C端截短的淀粉樣β肽片段的游離C或N端，并涉及一種包含該抗體分子的藥物組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種靶向淀粉樣β肽或其片段的抗體在制備一種治療患有阿爾茨海默氏癥的患者的藥物中的用途。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種靶向淀粉樣β肽或其片段的抗體在制備一種治療患有以淀粉樣蛋白沉積為特征的疾病或紊亂的患者的藥物中的用途。這種紊亂的例子包括輕度認(rèn)知損害(MCI)，淀粉樣腦血管病變，congiophylic血管病，唐氏綜合征相關(guān)的阿爾茨海默氏癥和包涵體肌炎(inclusion-body myositis)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種靶向淀粉樣β肽或其片段的抗體在制備一種用于延遲(delaying)、抑制(inhibiting)或壓制(suppressing)淀粉樣β肽或其片段在腦中積聚的藥物中的用途。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種靶向淀粉樣β肽或其片段的抗體在制備一種用于延遲、抑制或壓制淀粉樣β肽或其片段的神經(jīng)毒性的藥物中的用途。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗體，其對(duì)游離端具有特異性，并靶向淀粉樣β肽的游離N端。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗體，其對(duì)游離端具有特異性并靶向淀粉樣β肽的游離N端，其中淀粉樣β肽的游離N端的第一個(gè)氨基酸是天冬氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗體，其對(duì)游離端具有特異性并靶向N和/或C端截短的淀粉樣β肽片段的游離N端。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗體，其對(duì)游離端具有特異性并靶向淀粉樣β肽Aβ1-39，Aβ1-40，Aβ1-41或Aβ1-43的游離C端。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗體，其對(duì)游離端具有特異性并靶向N和/或C端截短的淀粉樣β肽片段的游離C端。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單鏈抗體，其對(duì)游離端具有特異性并靶向淀粉樣β肽Aβ1-42的游離C端。
附圖簡(jiǎn)述

圖1示出了淀粉樣前體蛋白(APP)和α，β，γ-分泌酶切割產(chǎn)物的示意圖。各種結(jié)構(gòu)域和分泌酶切割位點(diǎn)(α，β，γ)的定位同時(shí)指明。
圖2示出了βAPP區(qū)域的氨基酸序列(SEQ ID NO1)及其衍生的β淀粉樣肽(Aβ)。箭頭指出α，β，γ-分泌酶的切割位點(diǎn)?？梢杂米髅庖咴暮铣呻膶?duì)應(yīng)的氨基酸殘基由序列下面的線段指明。
圖3A-3D用示意圖示出了一個(gè)完整抗體(圖3A)以及可變結(jié)構(gòu)域重鏈(VH)和輕鏈(VL)、輕(CL)和重(CH1 CH2，CH3)鏈的恒定域的結(jié)構(gòu)，F(xiàn)ab片段(圖3B)、Fv片段(圖3C)和單鏈Fv片段(scFv)(圖3D)。圖3B所示的Fab片段由一個(gè)重鏈VH和輕鏈VL的可變結(jié)構(gòu)域通過二硫橋和第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH1和CL)相接。圖3C中所示的Fv片段代表了由非共價(jià)鍵連接的可變區(qū)復(fù)合物(VH-VL)形成的一種抗體的抗原結(jié)合部分，圖3D中所示的單鏈Fv應(yīng)用可變鏈VL通過肽連接和可變重鏈VH相接。
圖4A-C圖4A示出了淀粉樣前體蛋白(APP)的示意代表圖及其功能域；圖4B是Aβ肽及它N端序列的放大圖，給出了A肽和C肽衍生的位置。圖4C是APP序列和實(shí)驗(yàn)肽A和C的單個(gè)字母的氨基酸代碼。
圖5給出了表位特異性抗體的產(chǎn)生。在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的ELISA試驗(yàn)中，樣品1與免疫原(肽A)特異的結(jié)合可以被同一個(gè)肽所抑制，也可被Aβ1-40肽和跨越前體分子APP內(nèi)Aβ的切割位點(diǎn)的肽C所抑制。
圖6示出了表位特異性的游離端抗體的產(chǎn)生。在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的ELISA試驗(yàn)中，樣品2與免疫原(肽A)特異的結(jié)合可以被同一個(gè)肽所抑制，但不能被跨越前體分子APP內(nèi)Aβ的切割位點(diǎn)的肽C所抑制。
圖7和圖8示出了表位特異性的游離端雜交瘤細(xì)胞的產(chǎn)生?？寺?D12和2A10是雜交瘤細(xì)胞的兩個(gè)樣品，它們識(shí)別陽性對(duì)照的致免疫肽比識(shí)別陰性對(duì)照的跨越肽強(qiáng)的多。
發(fā)明詳述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療患有阿爾茨海默氏癥的患者的方法，包含施用靶向β淀粉樣肽或其片段的抗體分子的步驟，由此治療患有阿爾茨海默氏癥的患者。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療以β淀粉樣蛋白沉積為特征的疾病或紊亂的患者的方法，包含施用靶向β淀粉樣肽或其片段的抗體分子的步驟，由此治療以β淀粉樣蛋白沉積為特征的疾病或紊亂。
其它的以β淀粉樣蛋白沉積為特征的疾病或紊亂是，例如但不限于，輕度認(rèn)知損害(MCI)，淀粉樣腦血管病變，congiophylic血管病，唐氏綜合征相關(guān)的阿爾茨海默氏癥和包涵體肌炎。
術(shù)語“淀粉樣蛋白β”或“Aβ”或“β淀粉樣蛋白”在文中是指β淀粉樣蛋白中的任何一種，各種表述方式之間可以互相替換。這種蛋白典型地是大約4kDa。在對(duì)來自阿爾茨海默氏癥的組織和培養(yǎng)的細(xì)胞的淀粉樣β肽鑒定的基礎(chǔ)上觀察到幾種不同的氨基端和異源的羧基端序列。(Glemer和Wong(1984)Biochem Biophys Res Commun 120885-890；loaclim et al.，(1988)Brain Res 474100-111；Prelli et al.，(1988)JNeurochem 51648-651；Mori et al.，(1992)J Biol Chem 26717082-17806；Seubert et al.(1992)Nature 359325-327；Naslund et al.(1994)Proc NatlAcad Sci USA 918378-8382；Roher et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 9010836-10840；Busciglio et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 902092-2096；Haass et al.(1992)Nature 359322-325)。特別地，對(duì)于羧基端，淀粉樣β肽被示出是在39，40，41，42，43，或44位結(jié)束，位置1如Glenner和Wong(1984)Biochem Biophys Res Commun 120885-890所定義的淀粉樣蛋白β序列，是天冬氨酸。
盡管認(rèn)識(shí)到全長(zhǎng)Aβ肽的顯著作用，本發(fā)明并不只限于這些形式。因此，盡管全長(zhǎng)Aβ肽作為主要的治療靶點(diǎn)是非常重要的，本發(fā)明也注意使用對(duì)具有神經(jīng)毒性和/或能形成纖維狀沉積的Aβ衍生片段的游離端具有特異性的抗體。重要的是，能夠識(shí)別N或C端截短的Aβ肽類的游離端的特異性抗體不能和它們所衍生的淀粉樣前體蛋白起作用。
術(shù)語“淀粉樣蛋白β片段”或“異源淀粉樣蛋白β”或“截短的淀粉樣蛋白β”是指衍生在如上定義的全長(zhǎng)淀粉樣β肽的片段，各種表述方式之間可以互相替換。生物化學(xué)研究證明在位置1除了是L-天冬氨酸外，Aβ肽也可以以外消旋的或異構(gòu)化的天冬氨酸開始。重要的N端截短的Aβ同工型在3位開始于環(huán)化的天冬氨酸(焦谷氨酸)殘基，在11位是焦谷氨酸，在17位是亮氨酸(Geddes et al 1999)。對(duì)這些同工型導(dǎo)致阿爾茨海默氏癥的發(fā)病的事實(shí)的支持是基于這樣的研究1)證實(shí)N端截短的形式更容易聚集，在體內(nèi)比Aβ1-40或Aβ1-42毒性更強(qiáng)(Pike et al.1995)；2)N端截短的形式是在蝕斑中檢測(cè)到的最早的同工型之一，并且可以對(duì)蝕斑的形成形成病灶(Theo et al 1995)。例如Aβ17-42(p3肽)，在AD的腦中普遍存在，但在老化的非AD的腦中是缺失或稀少的(Higgins et al.1996)。利用高效反向液相色譜和質(zhì)譜對(duì)AD的研究證實(shí)總是存在另外的N端截短的形式，包括Aβn-42(n＝1-11)和Aβ3-40(Larner 1999)。在各種各樣培養(yǎng)的細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染了不同的APP構(gòu)建體的細(xì)胞系所分泌的Aβ的研究已經(jīng)鑒定Aβ類開始于位置2，3，4，5，6，9，11，16，17，18，19，20，24(Busciglio et al 1993，Haas et al 1992，Haas et al 1994)?！胺堑矸蹣拥鞍桩a(chǎn)生的(nonamyloidogenic)”p3片段(淀粉樣蛋白β)是唐氏綜合癥小腦的前淀粉樣蛋白(preamyloid)的主要組分(Lalowski M et al.，J BiolChem 1996 Dec 27；271(52)33623-3)。去除這種主要形式或限制它的神經(jīng)毒性，能夠如預(yù)料的減緩唐氏綜合癥相關(guān)的阿爾茨海默氏癥并延遲其在意感個(gè)體的發(fā)作。因此，本發(fā)明的抗體在一個(gè)實(shí)施方案中是針對(duì)淀粉樣β肽的N或C端，以及在一個(gè)實(shí)施方案中是針對(duì)淀粉樣β肽衍生的任何片段的N或C端。
“抗體”的意思是免疫球蛋白，能夠結(jié)合抗原。文中所用的抗體意指能夠結(jié)合感興趣的表位、抗原或抗原片段的整個(gè)抗體以及任一抗體片段(如F(ab′)2，F(xiàn)ab′，F(xiàn)ab，F(xiàn)v)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體，人源化的抗體，嵌合抗體，雙特異性抗體，scFv抗體，或F(ab)抗體，或它們的片段。
文中術(shù)語“單克隆抗體”是指免疫學(xué)有效的片段和單鏈形式。
上文中術(shù)語“人源化抗體”是指小鼠或其它非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體框架上。這里人抗體框架是指除了CDR外的整個(gè)人抗體。
上文中的術(shù)語“嵌合抗體”是指小鼠或大鼠抗體的可變區(qū)同人的恒定區(qū)一同表達(dá)的抗體。
上文中的術(shù)語“人工抗體”指如美國(guó)專利US Pat No.5,630,978使用分子拓印(molecular imprinting)技術(shù)制得的抗體。簡(jiǎn)單的說，人工抗體的制備方法如下所述(i)在生物活性分子，在此是淀粉樣β肽或其片段的周圍聚合功能性單體(模板)；(ii)去除模板分子；然后(iii)在模板的空的左邊聚合第二層單體，以提供一種表現(xiàn)出與模板類似的一種或多種期望性質(zhì)的新的有機(jī)分子。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及能夠選擇性識(shí)別淀粉樣β肽及其片段的并作為抗體的分子拓印聚合物(MIP)的人工抗體，以及它們?cè)谥委煱柎暮Ｄ习Y和其它以β淀粉樣蛋白沉積為特征的疾病中的應(yīng)用。
文中的術(shù)語“治療”是指延遲或防止發(fā)病，減緩進(jìn)程，或改善阿爾茨海默氏癥或其它以β淀粉樣蛋白沉積為特征的疾病相關(guān)的癥狀。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種延遲、抑制或壓制淀粉樣β肽或其片段在腦中積聚的方法，包括施用靶向淀粉樣β肽或其片段的抗體的步驟，由此延遲、抑制或壓制淀粉樣β肽或其片段在腦中積聚。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種延遲、抑制或壓制淀粉樣β肽或其片段的神經(jīng)毒性的方法，包括施用靶向淀粉樣β肽或其片段的抗體的步驟，由此延遲、抑制或壓制淀粉樣β肽或其片段的神經(jīng)毒性。
因此，本發(fā)明涉及使用淀粉樣β肽的抗體作為一種方法來選擇性抑制淀粉樣β肽類的積聚和/或中和它們相關(guān)的細(xì)胞毒性。應(yīng)用具有末端特異性的抗體來治療阿爾茨海默氏癥的最有效的靶點(diǎn)可能是Aβ1-40，它是形成循環(huán)的淀粉樣β肽的大部分(人的CSF，血漿和尿)，或者是毒性更強(qiáng)但量更少的Aβ1-42和Aβ1-43類，它們能夠引發(fā)淀粉樣蛋白沉積。神經(jīng)炎性蝕斑和血管中的淀粉樣蛋白沉積包含大量的這些形式，對(duì)人的組織和轉(zhuǎn)基因小鼠的模型，從遺傳學(xué)和生化分子中得出的一致意見是全長(zhǎng)形式的淀粉樣β肽在阿爾茨海默氏癥的發(fā)病機(jī)制中扮演者最重要的角色。
抗體或包含該抗體的藥物組合物將會(huì)被施用到外周，或者一種包含抗原的藥物組合物用來引起這些抗體的產(chǎn)生，或者在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以通過顱內(nèi)注射直接加入腦中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體會(huì)穿過血腦屏障，并將與淀粉樣β蛋白或片段在腦中形成一種復(fù)合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用抗體的外周施用來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的方法。在癲癇的治療中使用的IV Ig的有效性由Engelen BG等進(jìn)行評(píng)價(jià)(J.Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 Nov 57 Supp 21-5)。這些作者對(duì)于癲癇病人在IV Ig治療前后腦脊液中IgG的濃度的研究的結(jié)論是IV Ig制劑的主要成分穿過了血液的CSF屏障并且顯著提高了CSF IgG的濃度，并可以到達(dá)腦中在中樞系統(tǒng)作用。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)中IgG的存在由免疫細(xì)胞化學(xué)所證實(shí)，并發(fā)現(xiàn)該蛋白的分布與血腦屏障之間有緊密的解剖學(xué)的關(guān)系。通過使用IgG及其亞類的單克隆和多克隆抗體，IgG被免疫定位于正常大鼠的腦中。
靜脈內(nèi)的免疫球蛋白通過CNS及與之的相互作用在Wurster等的綜述中得到總結(jié)(J.Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 Nov 57 Supp21-5)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體通過使用方法或載體通過血腦屏障(BBB)滲透進(jìn)入大腦細(xì)胞，該方法或載體的細(xì)節(jié)如下所述優(yōu)選的加入配方以提高抗體溶解度的化合物是環(huán)糊精的衍生物，優(yōu)選的是羥基丙基-γ-環(huán)糊精。含有環(huán)糊精衍生物的以轉(zhuǎn)運(yùn)多肽到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)賦形劑已在Bodor，N.，et al.(1992)Science 2571698-1700中描述。
因此，本發(fā)明的抗體和環(huán)糊精衍生物聯(lián)合使用與單獨(dú)使用調(diào)制劑(modulator)相比可對(duì)β淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性產(chǎn)生更大的抑制作用。環(huán)糊精的化學(xué)修飾在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的(Hanessian，S.，et al.(1995)J.Org.Chem.604786-4797)。除了在含有本發(fā)明的調(diào)制劑的藥物組合物中作為添加劑使用外，環(huán)糊精的衍生物也可以用作修飾基團(tuán)，并且因此也可以共價(jià)偶聯(lián)到對(duì)游離端具有特異性的β淀粉樣蛋白抗體上形成本發(fā)明的一種調(diào)制劑化合物。
Low等在美國(guó)專利5,108,921中綜述了通過受體介導(dǎo)的胞吞活性機(jī)制進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)如蛋白和核酸等分子的可行方法。這些受體系統(tǒng)包括那些識(shí)別半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、去唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)、運(yùn)鈷胺素蛋白(維生素B12)、α-2巨球蛋白、胰島素和其它的肽生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。Low等也認(rèn)識(shí)到營(yíng)養(yǎng)素的受體，如生物素和葉酸的受體，由于生物素和葉酸的受體在大多數(shù)細(xì)胞膜的表面的定位和多重性，并且相關(guān)受體介導(dǎo)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，因此可以方便的用來提高跨細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，一個(gè)在要轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)的化合物和如生物素或葉酸的配體之間形成的復(fù)合物引發(fā)了受體介導(dǎo)的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制并因此使得所要轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物進(jìn)入細(xì)胞。
一個(gè)生物素配體可以被結(jié)合到一個(gè)DM分子上，例如，通過引入商品化的生物素化的三磷酸脫氧核苷酸，如購(gòu)自Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA的使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶所做的生物素-14-MTP或生物素-14-dCTP(Karger，B.D.，1989)。生物素-14-dATP是一個(gè)在嘌呤堿基的6位通過14個(gè)原子的連接體(linker)結(jié)合生物素的MTP類似物，生物素-14-dCTP是一個(gè)在嘧啶堿基的N4位也通過14個(gè)原子的連接體結(jié)合生物素的dCTP類似物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)，其在科學(xué)文獻(xiàn)和專利申請(qǐng)中廣泛應(yīng)用。
在另一個(gè)提高通過BBB的轉(zhuǎn)運(yùn)的方法中，一種多肽的或多肽模擬物的調(diào)制劑被結(jié)合到第二個(gè)多肽或蛋白上，因而形成了一種嵌合蛋白，其中第二種多肽或蛋白通過吸收劑介導(dǎo)的或受體介導(dǎo)的通過BBB的胞轉(zhuǎn)作用。因此，通過將調(diào)制劑偶聯(lián)到第二種多肽或蛋白上，嵌合蛋白可以通過BBB而進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。第二種多肽或蛋白可以是一種腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞受體的配體。例如，一種優(yōu)選的配體是能夠特異結(jié)合到腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體上的單克隆抗體(參見如美國(guó)專利No.5,182,107和5,154,924以及PCT出版物WO 93/10819和WO 95/02421，這些均由Friden等申請(qǐng))。其它適合的通過BBB介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽或蛋白包括組蛋白(參見如Pardridge和Schimmel等，美國(guó)專利No.4,902,505)和配體，如生物素、葉酸、煙酸、泛酸、核黃素、硫胺、pryridoxal和抗壞血酸(參見如美國(guó)專利No.5,416,016和5,108,921，二者均由Heinstein申請(qǐng))。另外，葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT-1已被報(bào)道能轉(zhuǎn)運(yùn)糖肽(L-絲氨酸-β-D-葡糖苷[Met5]腦啡肽類似物)穿過BBB(Polt，R.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 917114-1778)。因此，一種調(diào)制劑化合物可以偶聯(lián)到這樣的糖肽上，以靶向該調(diào)制劑到GLUT-1葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上。例如，一種在氨基端用修飾基團(tuán)Aic(3-(O-aminoethyl-iso)-cholyl，一種有自由氨基基團(tuán)的膽酸的衍生物)修飾的調(diào)制劑化合物能夠用標(biāo)準(zhǔn)方法通過Aic的氨基基團(tuán)偶聯(lián)到糖肽上。嵌合蛋白可以通過重組DNA的方法形成(如通過編碼融合蛋白的嵌合基因形成)，或通過化學(xué)連接將調(diào)制劑連接到第二個(gè)多肽或蛋白上以形成嵌合蛋白。許多化學(xué)交聯(lián)劑是已知的(如來自Pierce，Rockford III，是商品化的)。選擇一種交聯(lián)劑需使得調(diào)制劑偶聯(lián)到第二種多肽或蛋白有高的收益，而且隨后使得連接體切割以釋放出生物活性的調(diào)制劑。例如，可以使用以生物素-抗生物素蛋白為基礎(chǔ)的連接體系統(tǒng)。
在另一個(gè)為提高通過BBB的轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)施方案中，調(diào)制劑被包裹在一種可以介導(dǎo)通過BBB轉(zhuǎn)運(yùn)的載體介質(zhì)中，例如，將調(diào)制劑包裹在脂質(zhì)體中，如正電荷單層脂質(zhì)體(參見如PCT出版物WO 88/07851和WO88/07852，二者均由Faden申請(qǐng))或聚合微球(參見Khan等，美國(guó)專利No.5,413,797，Mathiowitz等，美國(guó)專利No.5,271,961和Gombotz等，5,019,400)。而且，載體介質(zhì)可以被修飾使之靶向地穿過BBB轉(zhuǎn)運(yùn)。例如，載體介質(zhì)(如脂質(zhì)體)可以用活性轉(zhuǎn)運(yùn)穿過BBB的分子或用一種腦內(nèi)皮細(xì)胞受體的配體，如能特異性結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體，共價(jià)修飾(參見如Collins等，PCT出版物WO 91/04014和Greig等WO94/02178)。
本發(fā)明的抗體可以按配方制備成一種藥物組合物，其中抗體是唯一的活性化合物，或者，藥物組合物也可以包含其它的活性化合物。例如，兩種或更多的抗體化合物可以聯(lián)合使用。而且，本發(fā)明的抗體可以和一種或更多的其他的具有抗淀粉樣蛋白產(chǎn)生性質(zhì)的物質(zhì)組合。例如，抗體可以和非特異性的膽堿脂酶抑制劑他克林(tacrine)(COGNEX.RTM.，Parke-Davis)。
本發(fā)明也預(yù)期其它的可以可以時(shí)時(shí)開發(fā)的方法。
一旦轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腦中，特異性的抗體分子將會(huì)被轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞外的空間、間隙液和腦脊髓液中。然后特異性的抗體分子將會(huì)與Aβ肽形成可溶性的復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些可溶性的特異的Aβ肽-抗體復(fù)合物會(huì)降低Aβ肽在淀粉樣蝕斑內(nèi)的沉積，通過從中樞神經(jīng)系統(tǒng)中清除Aβ肽削弱其誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，Aβ肽會(huì)從細(xì)胞外空間、間隙液和腦脊髓液排泄到常規(guī)的血液循環(huán)中，并在此被蛋白酶消化清除。因此，對(duì)淀粉樣蛋白沉積負(fù)責(zé)的新分泌的可溶性Aβ肽的聚集以及Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性會(huì)被抑制。
進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的可溶性淀粉樣β肽的清除預(yù)期可以降低在阿爾茨海默氏癥中所觀察到的炎癥反應(yīng)過程，這可以通過抑制如淀粉樣β誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活和細(xì)胞因子釋放以及阻斷Aβ和細(xì)胞表面受體如RAGE受體相互作用來實(shí)現(xiàn)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，一旦本發(fā)明的抗體結(jié)合到淀粉樣β肽上，它們就會(huì)引起細(xì)胞免疫反應(yīng)(即，通過激活Fc受體)。Fc受體能夠區(qū)別一個(gè)結(jié)合到抗原上的抗體和一個(gè)游離抗體。結(jié)果是Fc受體將會(huì)使得通常不能識(shí)別靶抗原的佐細(xì)胞去靶向和吞噬淀粉樣β肽。在這種情況下，對(duì)抗原和抗體之間的化學(xué)計(jì)量的關(guān)系的需求可被消除。結(jié)果是只需要更少的游離末端的抗體來滲透過BBB并清除淀粉樣β肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的加入將會(huì)降低Aβ與APOE4基因產(chǎn)物之間的相互作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或包含抗體的藥物組合物會(huì)阻斷外周的Aβ肽進(jìn)入CNS，進(jìn)而降低淀粉樣蝕斑在腦中的沉積。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物和本發(fā)明的抗體會(huì)通過外周效應(yīng)延遲阿爾茨海默氏癥的發(fā)作和抑制或壓制其進(jìn)程。從外周清除或去除淀粉樣蛋白β會(huì)改變血液中的淀粉樣蛋白β的平衡，并在腦中產(chǎn)生類似的結(jié)果。最近的研究表明淀粉樣蛋白β能夠從腦脊髓液中轉(zhuǎn)運(yùn)到血漿中，其腦清除的半衰期大約是一個(gè)小時(shí)。因此，抗體能夠影響血漿中淀粉樣蛋白β的水平，導(dǎo)致中樞的淀粉樣蛋白β在血漿中的聚集，結(jié)果使得淀粉樣蛋白β在腦中的降低。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抗體分子，其對(duì)淀粉樣β肽和/或其片段的N端或C端的游離端具有特異性，其能夠區(qū)別Aβ肽和淀粉樣蛋白前體。術(shù)語“對(duì)游離端具有特異性”意思是指能夠特異性結(jié)合到Aβ肽或其片段的游離端/末端的分子，其能夠減緩或防止淀粉樣β肽在細(xì)胞外空間、細(xì)胞間隙液和腦脊髓液中的聚集，并阻斷Aβ肽和其它的有助于Aβ的神經(jīng)毒性的分子的相互作用。
沒有限制之意，檢測(cè)的方法提供了一種抗體分子，其對(duì)淀粉樣β肽和/或其片段的N端或C端的游離端具有特異性，也就是“跨越肽的ELISA的檢測(cè)方法”，過程如下結(jié)合淀粉樣β肽N端區(qū)域序列，(例如肽A殘基1-5或Asp-Ala-Glu-Phe-Arg；見圖4)，同時(shí)能夠結(jié)合與淀粉樣前體蛋白(APP)的序列對(duì)應(yīng)的跨越肽C中的一致的氨基酸序列的抗體，在篩選中被清除。只有能夠結(jié)合擁有游離N端的(NH2)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg(例如，全長(zhǎng)Aβ1-40的七聚體肽)，但不能結(jié)合跨越肽的抗體，從檢測(cè)系統(tǒng)中被選擇。這些選擇的抗體被描述為“對(duì)游離的N末端具有特異性”，是因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)合表位除了識(shí)別特別的淀粉樣β肽N端氨基酸殘基，并插入到游離氨基(NH2)基團(tuán)高親和力的識(shí)別片段中。設(shè)想了一個(gè)類似的選擇對(duì)C末端具有特異性的抗體的檢測(cè)系統(tǒng)，其使用相應(yīng)于APP中C端切割位點(diǎn)的兩邊的持續(xù)的氨基酸序列的跨越肽。對(duì)游離端具有特異性抗體需要有高度的敏感性，以致于不影響跨膜受體類似的APP分子的正常生物功能，這些分子已經(jīng)涉及幾種重要的生理學(xué)功能(如介導(dǎo)粘附、促生長(zhǎng)效應(yīng)、神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)炎性贅疣、突觸囊泡的循環(huán)、絲氨酸蛋白酶的凋亡抑制的調(diào)節(jié)、受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能、鈣代謝和核酸轉(zhuǎn)錄)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明應(yīng)用對(duì)游離端具有特異性的抗體去抑制淀粉樣β肽的聚集，去改善或防止淀粉樣蛋白沉積的神經(jīng)毒性作用，去減緩阿爾茨海默氏癥或以淀粉樣β肽沉積過程為特點(diǎn)的其他疾病或延遲它們的發(fā)作。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及對(duì)游離端具有特異性的抗體并且靶向淀粉樣β肽的游離N端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及對(duì)游離末端具有特異性的抗體并且靶向淀粉樣β肽的游離N端，其中淀粉樣β肽游離N端的第一個(gè)氨基酸是天冬氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及對(duì)游離末端具有特異性的抗體并且靶向N和/或C端截短的淀粉樣β肽片段的游離N端。
在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)游離端具有特異性的抗體對(duì)于N端截短的淀粉樣β肽的除游離氨基(NH2)基團(tuán)外的氨基酸1-3是特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)游離端具有特異性的抗體對(duì)于N端截短的淀粉樣β肽的除游離氨基(NH2)基團(tuán)外的氨基酸1-4是特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)游離端具有特異性的抗體對(duì)于N端截短的淀粉樣β肽的除游離氨基(NH2)基團(tuán)外的氨基酸1-5是特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)游離端具有特異性的抗體對(duì)于N端截短的淀粉樣β肽的除游離氨基(NH2)基團(tuán)外的氨基酸1-6是特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)游離端具有特異性的抗體對(duì)于N端截短的淀粉樣β肽的除游離氨基(NH2)基團(tuán)外的氨基酸1-7是特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)游離端具有特異性的抗體對(duì)于N端截短的淀粉樣β肽的除游離氨基(NH2)基團(tuán)外的氨基酸1-8是特異性的。
正如在實(shí)施例中所看到的，“跨越肽ELISA檢測(cè)方法”也可以用于任何一個(gè)在阿爾茨海默氏癥的發(fā)病機(jī)制中非常重要的N端截短的淀粉樣β肽類的游離N端(Masters CL et al 1985，Haass et al 1993，Miller DL et al1993，Vigo-Pelfrey C et al 1993，Naslund et al 1994，Theo TC et al 1995)。本發(fā)明的說明書描述了在一個(gè)實(shí)施方案中使用對(duì)應(yīng)于開始于位置1(Asp)的淀粉樣β肽的N端的氨基酸序列如SEQ ID NO2(Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Cys)和SEQ ID NO3(Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Cys)的短肽作為免疫原的例子來生產(chǎn)對(duì)游離端具有特異性的抗體。當(dāng)使用這些免疫原時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)了與在“跨越肽ELISA檢測(cè)方法”中的跨越肽的反應(yīng)性的缺乏。類似的，使用對(duì)應(yīng)于N端截短的如Aβ1-40/42的淀粉樣β肽類序列的免疫作用或選擇，以及隨后用適宜的跨越肽的篩選，也可以在本發(fā)明中使用。文中被包括的例子如SEQ IDNO9 Glu-Val-His-Gln-Sys，對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)的Aβ肽11-15殘基，并含有一個(gè)額外的絲氨酸殘基是為結(jié)合的目的，這是一個(gè)起免疫作用的肽；SEQ IDNO10 Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln是一個(gè)跨越肽的例子，其可以在“跨越肽ELISA檢測(cè)方法”中用于分離末端特異性的抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種對(duì)游離端具有特異性的抗體，其靶向淀粉樣β肽Aβ1-39，Aβ1-40，Aβ1-41或Aβ1-43的游離C端。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種對(duì)游離端具有特異性的單鏈抗體，其靶向淀粉樣β肽Aβ1-42的C端。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種對(duì)游離端具有特異性的且靶向淀粉樣β肽Aβ1-40的游離C端的抗體，該抗體不結(jié)合經(jīng)蛋白水解衍生淀粉樣β肽的淀粉樣β前體蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種對(duì)游離端具有特異性的且靶向淀粉樣β肽Aβ1-43的游離C端的抗體，該抗體不結(jié)合經(jīng)蛋白水解衍生淀粉樣β肽的淀粉樣β前體蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種對(duì)游離端具有特異性的抗體，其靶向于N和/或C端截短的淀粉樣β肽片段的游離C端。因此，本發(fā)明也涉及C端的異質(zhì)性，在此較長(zhǎng)的形式，即Aβx-42/3，更傾向于作為纖維狀聚集并導(dǎo)致更大量的Aβ1-40的聚集。例如但不作限定，本發(fā)明設(shè)想了對(duì)于Aβx-39、Aβx-40、Aβx-41、Aβx-42和Aβx-43的每種形式的C端游離端具有特異性的抗體用作治療的用途。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，Aβ42有如下的序列H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-LeuVal-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-ValGly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH。
Aβ41、Aβ40和Aβ39與Aβ42不同在于在C端分別省略了Ala、Ala-Ile和Ile-Val。Aβ43與Aβ42的不同在于在C端存在一個(gè)蘇氨酸。
作為例子，在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于淀粉樣β肽的C端的短區(qū)域的特定抗原序列如SEQ ID NO4 Cys-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val(Aβx-40)和SEQ ID NO11 Cys-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr(Aβx-43)所述。用于在“跨越肽ELISA檢測(cè)方法”可以用來檢測(cè)C端末端特異性抗體的跨越肽是SEQ ID NO12(Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val)和SEQ IDNO13(Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr)，分別是Aβx-40和Aβx-43。類似的肽可以設(shè)計(jì)用來靶向Aβx-42類。因此，例如，但不限定，在一個(gè)使用淀粉樣蛋白β1-40的代表性例子中，在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)游離端具有特異性的抗體靶向C端截短的淀粉樣β肽除游離的羧基(COOH)基團(tuán)外的氨基酸33-40。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)游離端具有特異性的抗體靶向C端截短的淀粉樣β肽除游離的羧基(COOH)基團(tuán)外的氨基酸34-40。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)游離端具有特異性的抗體靶向C端截短的淀粉樣β肽除游離的羧基(COOH)基團(tuán)外的氨基酸36-40。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)游離端具有特異性的抗體靶向C端截短的淀粉樣β肽除游離的羧基(COOH)基團(tuán)外的氨基酸37-40。請(qǐng)注意淀粉樣β肽1-40可以作為代表性的樣品；相同的片段可以衍生自淀粉樣β肽1-39，1-41，1-42和1-43。
如圖1所示(見Schehr，1994)，以及在背景領(lǐng)域部分所討論的那樣，淀粉樣蛋白前體(APP)也被認(rèn)為是蛋白水解產(chǎn)物可溶性淀粉樣蛋白前體(sAPP)的前體，被認(rèn)為具有促進(jìn)生長(zhǎng)和神經(jīng)保護(hù)的作用。容易為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的是對(duì)游離端具有特異性的抗體的引入和施用不會(huì)對(duì)與Aβ肽形成無關(guān)的APP或sAPP的正常生物學(xué)功能存在影響。
單鏈抗體作為對(duì)游離端具有特異性的分子也可以通過本發(fā)明產(chǎn)生。這些單鏈抗體可以使單鏈組成的多肽，其擁有對(duì)游離端具有特異性的Aβ肽結(jié)合能力，并包含一對(duì)與免疫球蛋白輕和重鏈(連接的VH-VL，或單鏈Fv)同源或類似的氨基酸序列。VH和VL可以拷貝天然抗體序列，或者一條或兩條鏈包含在美國(guó)專利5,091,513中所述的類型的CDR構(gòu)建體。輕和重鏈的可變區(qū)類似的獨(dú)立多肽通過一個(gè)肽的連接體接在一起。在生產(chǎn)這種單鏈抗體，如單鏈Fv(scFv)，特別是編碼VH和VL鏈的多肽結(jié)構(gòu)的DNA被鑒定或容易的通過序列分析被確定的方法可以根據(jù)在下列所描述的方法來完成美國(guó)專利4,946,778，美國(guó)專利5,091,513，美國(guó)專利5,096,815，Biocca et al.，1993，Duan et al.，1994，Mhashilkar et al.，1995，Marasco et al.，1993，和Richardson et al.，1995。圖3A-3D(Biocca et al.，1995)用示意圖表示出一個(gè)完整的抗體(圖3A)，一個(gè)Fab片段(圖3B)，一個(gè)由非共價(jià)連接可變區(qū)復(fù)合物(V，-V，和組成的Fv片段(圖3C)；一個(gè)單鏈Fv抗體(圖3D)。
設(shè)計(jì)產(chǎn)生免疫的肽用于免疫動(dòng)物和產(chǎn)生生成抗體的雜交瘤細(xì)胞是建立在類似的肽的基礎(chǔ)上的，這些肽在以前被幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室用來產(chǎn)生識(shí)別Aβ類的游離端并在體外應(yīng)用的多克隆抗體(Harrington et al.，1993；Iwatsuboet al.，1994；Konig et al.，1996；Murphy et al.，1994；Gravina et al.，1995)。盡管長(zhǎng)度較長(zhǎng)的肽在一些例子中已經(jīng)成功地被用來產(chǎn)生Aβ末端特異性的抗體，Theo和他的同事(1993；1994)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于任何一個(gè)給定的多肽，其保證在N端特異性的游離氨基基團(tuán)組成一個(gè)由新抗體識(shí)別的表位的基本部分，其有5個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。因此，一個(gè)針對(duì)免疫原性的肽產(chǎn)生的抗體，其抗體的選擇性通過在識(shí)別Aβ肽游離的N或C端中被衡量。一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性的試驗(yàn)，使用對(duì)應(yīng)于Aβ不同區(qū)域以及βAPP的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的β-分泌酶切割位點(diǎn)前的直接區(qū)域的肽，做酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)或免疫沉淀法，能夠測(cè)定抗體的選擇性。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解一個(gè)半胱氨酸殘基可以被加到上述的免疫原性肽的末端，該末端與對(duì)應(yīng)于Aβ肽的游離的N端或C端的末端相反，以便于偶聯(lián)上一載體蛋白。鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)、卵清蛋白和牛血清白蛋白(BSA)是能夠用作免疫原的載體的非限定性的蛋白例子。合成的免疫原性的肽的N端或C端的半胱氨酸殘基的存在提供了游離的巰基基團(tuán)，使之能夠共價(jià)偶聯(lián)到馬來酰亞胺激活的蛋白上。其他的雙功能的試劑，如N-馬來酰亞胺-6-氨基辛酯酯(N-maleimido-6-aminocaproylester)或m-馬來酰亞胺苯基N-羥基琥珀酰亞胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester，MBS)，可以用來共價(jià)的偶聯(lián)合成的免疫原性肽到受體蛋白上(參見例如Hartlow，E.et al.，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.1988)。商業(yè)化的試劑盒也可以用作將多肽抗原偶聯(lián)到馬來酰亞胺激活的大的載體蛋白上。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種產(chǎn)生單克隆抗體或單鏈抗體的雜交瘤細(xì)胞，該抗體對(duì)于淀粉樣β肽或其片段的N端或C端的游離端具有特異性，并且能區(qū)別Aβ肽和經(jīng)蛋白水解衍生Aβ肽的淀粉樣蛋白前體。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞通過由Kohler和Milstein，Nature，256，p.495(1975)中所描述的一般程序產(chǎn)生。在這個(gè)程序中，雜交瘤通過使用身體細(xì)胞雜交程序融合抗體產(chǎn)生細(xì)胞(典型的是先前用淀粉樣蛋白β免疫過的小鼠的脾臟細(xì)胞)和來自永生化的腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞。
對(duì)于抗體的產(chǎn)生，各種各樣的宿主包括羊、兔、大鼠、消暑、人源化的小鼠、任何其他等可以通過注射帶有免疫原性性質(zhì)的相關(guān)表位或任意片段或其寡肽等進(jìn)行免疫。根據(jù)宿主的種類，不同的佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。這些佐劑包括，但不限于Freund′s，礦物膠乳氫氧化鋁，表面活性劑如溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、KLH和二硝基酚。
來自融合過程的雜交瘤允許生長(zhǎng)。隨后，所得的上清液通過免疫方法的程序進(jìn)行篩選，以檢測(cè)上清中存在的能夠結(jié)合特異性抗原的抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合抗體庫(kù)技術(shù)，即基于抗原的篩選來自于表達(dá)在M13絲狀噬菌體表面的抗體庫(kù)，其可用于產(chǎn)生單克隆抗體并且相對(duì)于雜交瘤方法具有許多的優(yōu)勢(shì)(Huse，et al.，1989；Barbas，et al.，1991；Clackson，et al.，1991；Burton和Barbas，1994)。本發(fā)明的抗體可以從噬菌體抗體庫(kù)中產(chǎn)生。在應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生的大組合文庫(kù)中涉及的一般方法在1993年1月29日發(fā)布的美國(guó)專利5,223,409中所描述和公開。
一旦單克隆抗體產(chǎn)生了，其選擇性和結(jié)合親和力(Kd)可以通過ELISA來衡量，抗體的體外生物試驗(yàn)可以通過檢驗(yàn)Aβ末端特異性抗體在阻斷Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的效力來衡量。體外的生物試驗(yàn)也可以通過檢驗(yàn)抗體對(duì)淀粉樣蛋白APP的功能干預(yù)的缺乏來檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果需要的話，抗體可以通過施用如淀粉樣β肽或其片段的抗原在患者體內(nèi)產(chǎn)生?？贵w的滴度將會(huì)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來測(cè)定，如需要其他的抗原可被施用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一個(gè)包含上述抗體的藥物組合物以及用該藥物組合物來抑制淀粉樣β肽在神經(jīng)元細(xì)胞外環(huán)境中的聚集的方法。在所需的患者中，淀粉樣β肽聚集的減少將進(jìn)一步延遲阿爾茨海默氏癥或以淀粉樣蛋白β沉積為特點(diǎn)的其他疾病的進(jìn)展。
在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包括一個(gè)治療的或預(yù)防疾病的有效的足以抑制天然的β淀粉樣肽的神經(jīng)毒性的量的抗體，和一個(gè)藥學(xué)上可接受的載體?！爸委熡行Я俊笔侵敢粋€(gè)有效量，在必須的劑量和時(shí)間期間，達(dá)到所期望的治療效果，如阿爾茨海默氏癥進(jìn)程的減緩，延遲的發(fā)病，淀粉樣蛋白β沉積的減少或逆轉(zhuǎn)和/或Aβ神經(jīng)毒性的降低或逆轉(zhuǎn)。本發(fā)明的抗體的治療有效量根據(jù)如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和重量，以及調(diào)制劑在個(gè)體中激發(fā)期望的反應(yīng)的能力等因素而變化。劑量的狀況可以通過最佳的治療反應(yīng)來調(diào)節(jié)。治療有效量也可以是調(diào)制劑的毒性或惡性作用被其治療有效作用所超出。
“預(yù)防有效量”是指有效量，在必須的劑量和時(shí)間期間，達(dá)到所期望的預(yù)防效果，如阻止或抑制淀粉樣蛋白沉積的速率和/或在有淀粉樣蛋白β沉積傾向的患者中淀粉樣蛋白β的神經(jīng)毒性。預(yù)防有效量可以通過上述治療有效量的方法來測(cè)定。典型的，在疾病前或疾病的早期使用預(yù)防劑量，預(yù)防有效量要少于治療有效量。
當(dāng)確定淀粉樣蛋白β的抗體的有效治療或預(yù)防有效量時(shí)，應(yīng)該考慮的一個(gè)因素是患者中的生物區(qū)室，如患者的腦脊液(CSF)或血漿，的天然的淀粉樣蛋白β的濃度。應(yīng)該注意的是劑量值可以病情嚴(yán)重程度的減輕而變化。進(jìn)一步應(yīng)該理解的是對(duì)于任何特定的患者和特別的劑量服用方法都應(yīng)該根據(jù)個(gè)體的需要以及使用或管理組合物施用的人的專業(yè)判斷并通過時(shí)間來調(diào)整。例如，可以單劑施用，也可以在一段時(shí)間內(nèi)按幾個(gè)分開的劑量施用，或者劑量應(yīng)該根據(jù)治療狀況出現(xiàn)的緊急事件的預(yù)示來按比例減少或增加。
藥物組合物可以通過皮下、靜脈注射、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、腦內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、透皮、面頰、動(dòng)脈內(nèi)、顱內(nèi)或頭部?jī)?nèi)(intracephalically)給藥。更加有利的是將胃腸外的組合物以劑量單位的形式佩服易于施用和保持劑量的一致性。文中所用到的劑量單位形式是指形體上分散的并為治療的哺乳動(dòng)物患者的單一劑量形式匹配的單位；每個(gè)單位包含預(yù)先定量的計(jì)算好的以產(chǎn)生預(yù)期的治療效果的活性化合物以及所需的藥物學(xué)載體。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格規(guī)定于并直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特性質(zhì)及所要達(dá)到的治療效果；(b)為個(gè)體治療的敏感性混合該活性化合物的方案所固有的限制條件。
文中所用到的“藥物學(xué)可接受的載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌和抗真菌物質(zhì)、等滲和延遲吸收的物質(zhì)、以及生理相容的類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體適于胃腸外施用。更適合的，載體可以用于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)施用。作為選擇的，載體適于中樞神經(jīng)系統(tǒng)施用(脊髓內(nèi)或腦內(nèi))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體適于口服施用。藥學(xué)上可接受的載體包括滅菌水溶液或分散液以及適于臨時(shí)制備滅菌注射劑或分散劑的滅菌粉末。這種用于藥學(xué)上活性物質(zhì)的介質(zhì)和物質(zhì)的使用在本領(lǐng)域是公知的。除了與活性化合物不相容的常規(guī)介質(zhì)或物質(zhì)的范圍外，其在本發(fā)明的藥物組合物中的應(yīng)用已在預(yù)期之內(nèi)。輔助的活性化合物也可以被引入到本組合物中。
代表性的治療組合物在制備和儲(chǔ)存的條件下是無菌和穩(wěn)定的。組合物可以被配方成為溶液、微乳劑、脂質(zhì)體、或其它適于高藥物濃度的規(guī)定的結(jié)構(gòu)。載體可以是一種包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)的聚乙二醇等)的溶液或分散介質(zhì)及其適合的混合物。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可以通過例如使用如卵磷脂的包衣，在分散劑的情況下保持所需顆粒的大小以及使用表面活性劑來保持。在許多情況下，適宜在組合物中包括等滲物質(zhì)，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。注射組合物的延長(zhǎng)吸收可以通過在組合物中包含延遲吸收的物質(zhì)如一硬脂酸鹽和明膠等來實(shí)現(xiàn)。而且，抗體可以通過按時(shí)間釋放的例如在一個(gè)包含緩慢釋放聚合物的組合物中配方來施用?；钚曰衔锟梢耘c阻止化合物快速釋放的載體制備，如包含微膠囊化轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的控制釋放配方。可以使用生物可降解和生物相容性的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、聚原磷酯、聚乳酸、和聚羥基乙酸和聚乳酸共聚物(PLG)。許多制備這些配方的方法都已申請(qǐng)專利或?qū)Ρ绢I(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。
滅菌的注射溶液可以通過將活性化合物(如所需劑量的淀粉樣蛋白β的抗體)加入到一個(gè)適宜的溶劑中，如果需要的話，加入上述所列舉的成分的一種或組合物，然后進(jìn)行過濾除菌。一般說來，分散劑可以通過將活性化合物加入到一種滅菌的包含一個(gè)基本的分散介質(zhì)和所需的來自上述列舉的其它成分的滅菌載體。在制備滅菌注射溶液的滅菌粉末時(shí)，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分的粉末，加上其它所需的來自其先前過濾滅菌溶液的成分。
局部應(yīng)用可來自透皮(intransdermal)或皮內(nèi)應(yīng)用。局部施用可以通過共施用霍亂毒素或其去毒的衍生物或亞基而得以促進(jìn)。可供選擇的，透皮轉(zhuǎn)運(yùn)可以通過使用皮膚帖(skin patch)或使用轉(zhuǎn)移裝置(transferosome)而實(shí)現(xiàn)。
其它的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括時(shí)間釋放、延時(shí)釋放、或持續(xù)釋放轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)能夠避免本發(fā)明的活性化合物的反復(fù)施用，增加患者和醫(yī)生的便利。許多形式的釋放轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)本領(lǐng)域一般的技術(shù)人員十已知和可行的。這些包括基于聚合物的系統(tǒng)如聚乳酸和聚羥基乙酸、聚酐和聚已酸內(nèi)酯；非聚合物的系統(tǒng)是脂類，包括甾體如膽固醇、膽固醇酯和脂肪酸或中性脂類如單、二和甘油三酯；水凝膠釋放系統(tǒng)；硅橡膠系統(tǒng)；基于肽系統(tǒng)；蠟包衣，用常規(guī)的粘合劑和賦形劑壓片，部分融合的植入體等。另外，一種基于泵的硬件轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也可使用，其中一些適用于植入。
一種長(zhǎng)期持續(xù)釋放的植入體也可以使用。這里所用到的“長(zhǎng)期”釋放是指構(gòu)建和處理該植入體使之能轉(zhuǎn)運(yùn)治療水平的活性成分至少30天，優(yōu)選是60天。長(zhǎng)期持續(xù)釋放的植入體對(duì)本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員是已知的，并包括一些上述的釋放系統(tǒng)。這些植入體通過替換由淀粉樣β肽聚集物所影響的腦的區(qū)域附近的植入體，在治療以該聚集物為特點(diǎn)的病癥特別有用，由此影響了局部的、高劑量的本發(fā)明的化合物。
在充分描述本發(fā)明后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解同樣的技術(shù)方案可以在一個(gè)具有相當(dāng)?shù)膮?shù)、濃度和條件的，無需脫離本發(fā)明的精神和范圍且無需過度的實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)實(shí)行。
盡管本發(fā)明連同其相實(shí)施方案描述，可以理解的是它能夠做進(jìn)一步的修飾。本申請(qǐng)旨在覆蓋那些總體上遵從本發(fā)明的原則而對(duì)本發(fā)明做出的任何變更、使用或適應(yīng)，并覆蓋那些與在此所記載的內(nèi)容不同，但屬于本領(lǐng)域已知的或慣用的實(shí)踐且適用于如以下所附的權(quán)利要求書中所示的實(shí)質(zhì)特征的方案。
文中所有引用的參考文獻(xiàn)，包括雜志文章或摘要、發(fā)表或未發(fā)表的美國(guó)或國(guó)外的專利申請(qǐng)、公布的美國(guó)或外國(guó)專利或其它的參考文獻(xiàn)，包括引用文獻(xiàn)中的所有的數(shù)據(jù)、表格、圖片和文字，全部并入?yún)⒖肌Ａ硗?，文中所引用的參考文獻(xiàn)所引用的整個(gè)內(nèi)容也完全被并入?yún)⒖肌?br> 對(duì)于已知的方法步驟、常規(guī)的方法步驟、已知的方法或常規(guī)的方法的引用不應(yīng)以任何方式被認(rèn)為是本發(fā)明的任何方面、說明書或?qū)嵤┓桨冈谙嚓P(guān)領(lǐng)域已經(jīng)被公開、教授或暗示。
特定實(shí)施方案的先前描述將會(huì)如此全部的公開本發(fā)明的基本實(shí)質(zhì)，以至于其他人可以通過應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的知識(shí)(包括文中所引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)容易的修改和/或適應(yīng)這些特定的實(shí)施方案的各種應(yīng)用，不需要過度的實(shí)驗(yàn)，不需有偏離本發(fā)明的一般概念。因此，這種適應(yīng)或修飾傾向于在所公開的實(shí)施方案的同等物的意義和范圍內(nèi)?？梢岳斫獾氖俏闹械拇朕o或術(shù)語是為本發(fā)明的目的而不是限制，這樣本說明書的術(shù)語或措辭能夠被技術(shù)人員根據(jù)文中所呈現(xiàn)的教導(dǎo)或指導(dǎo)并結(jié)合本領(lǐng)域通常的知識(shí)來解釋。
實(shí)施例如本發(fā)明一般描述的，下列實(shí)施例更加容易通過參考文獻(xiàn)理解，它們是以解釋的方式而沒有限制本發(fā)明的傾向。
實(shí)施例1證實(shí)“跨越肽”ELISA檢測(cè)方法可檢測(cè)對(duì)淀粉樣β肽游離端具有特異性的抗體肽H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-氨基己酸酯-Cys-酰胺(PeptideH2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-aminohexanoate-Cys-amide)通過SMCC連接體結(jié)合到BSA上。Swiss Webster小鼠用100μg在Freund′s完全佐劑中的這種結(jié)合物進(jìn)行免疫，進(jìn)而用100μg在Freund′s不完全佐劑中的這種結(jié)合物進(jìn)行兩次刺激?？寡逋ㄟ^使用說明書中所描述的“跨越肽ELISA檢測(cè)方法”進(jìn)行篩選。簡(jiǎn)單的說，Aβ1-40被包被在96孔的培養(yǎng)板上，然后在競(jìng)爭(zhēng)性肽A(免疫原)，C(跨越肽)或Aβ1-40存在的情況下與樣品進(jìn)行溫育。通常的結(jié)果如圖5中所示。正如所預(yù)料的，這些動(dòng)物所產(chǎn)生的抗體結(jié)合Aβ1-5殘基，這是用作免疫的肽，以及全長(zhǎng)Aβ1-40肽。然而，當(dāng)Aβ1-5表位在其N端(肽C)側(cè)翼有其它的序列時(shí)，正如在完整的淀粉樣前體蛋白APP中的一樣，這些抗體同樣能與Aβ1-5表位反應(yīng)。這些抗體被稱為是表位特異性的(AβN端的序列1-5)。
在實(shí)驗(yàn)樣品是一種更為稀少的結(jié)果在圖6中示出。這些抗體結(jié)合免疫的肽(Aβ1-5)和Aβ1-40序列，但是不識(shí)別從在全長(zhǎng)APP中跨越同樣的5個(gè)氨基酸序列的區(qū)域所衍生的肽(肽C)。這些抗體靈敏的選擇性在于其只能夠在所述1-5序列被置于該分子的游離N端時(shí)與其結(jié)合；這些抗體被稱為對(duì)游離端具有特異性。
實(shí)施例2證明“跨越肽”ELISA檢測(cè)方法選擇對(duì)淀粉樣β肽游離端具有特異性的雜交瘤肽H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-氨基己酸酯-Cys-酰胺通過MBS連接體結(jié)合到KLH上。Balb/c×C57B1/6 F1小鼠用50μg在Freund′s完全佐劑中的這種結(jié)合物進(jìn)行免疫，進(jìn)而用50μg在Freund′s不完全佐劑中的這種結(jié)合物進(jìn)行四次刺激?？寡宓臋z驗(yàn)和融合使用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行。雜交瘤使用如說明書中所述的“跨越肽ELISA檢測(cè)方法”進(jìn)行篩選。簡(jiǎn)單的說，陽性肽(H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His與BSA結(jié)合)或陰性對(duì)照跨越肽(乙?；?Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His)被包被在96孔板上，然后與雜交瘤上清溫育。正如在圖7和8中看到的那樣，一些雜交瘤以相似的方式(即克隆5E2，2A8和2F8)識(shí)別這兩種肽，而一些有非顯著性的差異(即克隆4H9，1C12，和3H3)。然而，一些克隆證明其具有末端特異性，因?yàn)樗鼈冏R(shí)別用于免疫的陽性肽比它們識(shí)別陰性對(duì)照跨越肽要強(qiáng)得多，該跨越肽實(shí)際上包含用于免疫的相同序列。例子示于克隆4D12和這個(gè)融合體的2A10。
實(shí)施例3預(yù)示性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Aβ末端特異性抗體在阻斷Aβ纖維形成和Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的效力的體外生物試驗(yàn)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性高級(jí)糖化末端產(chǎn)物(RAGE)的受體介導(dǎo)一些Aβ對(duì)神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)毒性效應(yīng)(Yan et al.，1996)。
通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方法檢測(cè)了具有末端特異性的抗體抑制受體介導(dǎo)的神經(jīng)毒性的能力?？贵w通過純化的RAGE受體制劑和檢測(cè)它們對(duì)于Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激的效應(yīng)進(jìn)行試驗(yàn)。
RAGE受體是從溶解于包含辛基-p-葡萄糖(1％)和苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride)(2nm)的tris緩沖鹽溶液的牛肺提取物中純化的，并放置于肝素hyperD柱子(Biosepra)上。柱子用梯度NaCl進(jìn)行洗脫，有最大結(jié)合125I-標(biāo)記的Aβ的部分被鑒定。該部分被匯集并上載于羥磷灰石Ultragel(Biosepra)上，然后用遞增濃度的磷酸鹽洗脫。
最大結(jié)合125I-標(biāo)記的Aβ的部分被用于制備性的非還原聚丙烯酰胺SDS凝膠(10％)。
RAGE受體蛋白Mr50,000由考馬斯亮藍(lán)染色來鑒定，臨近條帶的區(qū)域被切割和洗脫。末端特異性抗體結(jié)合125I-標(biāo)記的Aβ(1-40/1-42)到RAGE受體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制通過許多種方法測(cè)定(1)不同量(0-150μg)純化蛋白固定到微孔板上，并與100nM125I-標(biāo)記的Aβ(1-40/1-42)溫育；(2)不同量(0-250nM)的125I-標(biāo)記的Aβ(1-40/1-42)放在預(yù)先包被有5μg純化的RAGE受體的微孔板中并溫育；(3)不同量(0-500μg/ml)的125I-標(biāo)記的Aβ(1-40/1-42)固定到微孔板上，并與50nM的125I-標(biāo)記的RAGE受體溫育。在每一個(gè)試驗(yàn)中，配體在不同量抗體的存在下結(jié)合到板孔上的量通過用γ閃爍計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)板孔的放射性的量來測(cè)定。
為了衡量不同的末端特異性的Aβ抗體作為Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制劑的效力，培養(yǎng)的小鼠腦微脈管內(nèi)皮細(xì)胞(Breitner et al.，1994)在不同量的抗體的存在下與0.25μM的Aβ溫育，細(xì)胞氧化應(yīng)激使用先前所描述的TBARS試驗(yàn)，通過測(cè)定劑量依賴的硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)的產(chǎn)生來衡量(Demery et al.，1990；Yan et al.，1996)。在一個(gè)平行的試驗(yàn)系統(tǒng)(由Khoury et al.，1996所開發(fā))中，抗體的抑制效應(yīng)通過對(duì)Aβ誘導(dǎo)小鼠N9小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧(oxygen-reactive species)來測(cè)定。N9細(xì)胞(5×104)在37℃，在包含1μM的一種在包被有Aβ肽的多點(diǎn)載玻片上遇到氧化發(fā)出熒光(Wan et al.，1993)的染料H2DCF(2’，7’二氯熒光黃乙酰乙酸鹽)的50μl PD-BSA(缺乏二價(jià)陰離子、含有1mg/ml BSA的磷酸緩沖鹽溶液)中溫育。在不同的時(shí)間點(diǎn)，培養(yǎng)基的等份樣品被取出，熒光在一個(gè)熒光微孔板讀取儀上測(cè)定(Cytofluor II)。
與蛋白多糖相互作用的效應(yīng)血管細(xì)胞衍生的硫酸類肝素多糖蛋白，基底膜蛋白多糖，在所有的淀粉樣沉積中被鑒定，并且通過與Aβ高親和力的結(jié)合反應(yīng)(Snow et al.1989；1995)說明其存在于炎癥相關(guān)的淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的早期階段?；啄さ鞍锥嚯暮虯β的結(jié)合是淀粉樣蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)特征，這說明影響該相互作用的分子可以預(yù)防或延遲淀粉樣蛋白產(chǎn)生。
衡量了結(jié)合對(duì)應(yīng)于所述肽的N端的肽的具有游離端特異性的Aβ抗體阻斷基底膜蛋白結(jié)合到AβN端區(qū)域的基底膜結(jié)合位點(diǎn)(Snow et al.，1995)的能力。該評(píng)價(jià)基于使用從培養(yǎng)的自小牛胸主動(dòng)脈制備的內(nèi)皮細(xì)胞所分離的基底膜蛋白的固相結(jié)合試驗(yàn)，細(xì)節(jié)如(Snow et al.1995)所述。聚乙烯微孔板包被有100μl的硝酸纖維溶液并使之干燥?？准尤胛礃?biāo)記的基底膜蛋白并在室溫包被過夜，以使得每個(gè)孔結(jié)合有0.28μg的蛋白，然后在室溫用200μl的5％的脫脂牛奶進(jìn)行封閉。
不同量的125I Aβ(7000cpm/pM)在100μl TBS/0.05％Tween 20(TBST)中稀釋，并平行三份加入到孔中，然后在室溫在一個(gè)軌道搖床上溫育2.5h。在溫育階段的最后，游離的125I Aβ通過6次TBST洗去。結(jié)合的125I通過1N氫氧化鈉提取，然后“結(jié)合”對(duì)“游離”的放射性通過液體閃爍計(jì)數(shù)來定量。在增加的抗體的量的存在下，溫育125I Aβ并進(jìn)行斯卡查德分析(Scatchard analysis)。
對(duì)Aβ纖維形成的影響由動(dòng)態(tài)可溶性多肽如Aβ1-40形成的淀粉樣纖維可以被包含特別的C端殘基41(ILe)和42(Ala)的如Aβ1-42的肽成核或“接種”。C端或N端末端特異性的Aβ抗體阻斷Aβ1-42的接種或防止淀粉樣多肽聚集的能力通過標(biāo)準(zhǔn)聚集的試驗(yàn)來檢測(cè)(Wood et al.，1996)。Aβ1-40肽在1，1，1，3，3，3-六氟代-2-丙醇中可以溶解到5mg/ml。該肽濃縮至干燥并且重新溶解在pH7.4的磷酸緩沖液(PBS)中，得到最終濃度是230μm。Aβ1-42溶液(20μm)搖晃三天并超聲30min，以產(chǎn)生淀粉樣纖維。2nM的先聚集的Aβ1-42加入到pH7.4的上清中以種得Aβ1-40沉積。在存在和不存在每種Aβ末端特異性的抗體的情況下，聚集體的形成通過使用微孔板讀取儀在405nm監(jiān)測(cè)在微孔板中制得的樣品的濁度來測(cè)定。該反應(yīng)也可以通過硫代黃素-T熒光(thioflavin-T fluorescence)來監(jiān)測(cè)，如Wood et al.(1996)所描述的。對(duì)游離端具有特異性的抗體促進(jìn)淀粉樣肽纖維的解聚集的能力通過檢測(cè)從包含包被在96孔的微孔塑料包被板上的非聚集肽的膠原基質(zhì)中替換VI-標(biāo)記的淀粉樣聚集肽來測(cè)定。另外，對(duì)游離端具有特異性的抗體保護(hù)神經(jīng)元避免Aβ誘導(dǎo)的損害是通過錐蟲藍(lán)排除法、細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定、掃描和透射電子顯微鏡術(shù)以及共聚焦顯微鏡的方法來評(píng)價(jià)。
確立Aβ抗體治療潛能的動(dòng)物模型動(dòng)物模型可以用來證實(shí)抗體的施用可以減緩或防止腦中AD類似的病理的發(fā)展。盡管AD是一類獨(dú)特的人類疾病，但許多過渡表達(dá)人類APP和PS1的轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)開發(fā)。阿爾茨海默氏癥的相關(guān)的行為、生化和病理性異常記憶在轉(zhuǎn)基因小鼠中出現(xiàn)，這為研究藥劑在減緩或防止Aβ誘導(dǎo)的該疾病的病理生理學(xué)上的效用提供了機(jī)會(huì)。
APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因的模型(Holcomb et al，Nat Med 1998，497-100)具有特別穩(wěn)定的、可重復(fù)的表型，其發(fā)生的非常快并在12周齡時(shí)表現(xiàn)出淀粉樣蛋白沉積和行為的病損。這些因素組合在一起產(chǎn)生了一個(gè)模型，可用來快速篩選和評(píng)價(jià)對(duì)阿爾茨海默氏癥的候選藥物。重要的是，PS1/APP的表型與幾種重要的人類阿爾茨海默氏癥的特征相一致，包括如氧化應(yīng)激標(biāo)記、反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生、炎癥、神經(jīng)變性、異常的神經(jīng)元生長(zhǎng)、膽堿能末梢的改組、以及出現(xiàn)作為形成混亂狀態(tài)的中間體的超磷酸化的tau。與許多其它的認(rèn)知損害的模型不同，PS1/APP有一個(gè)不與運(yùn)動(dòng)缺陷相伴隨的選擇性的“工作記憶”喪失。
一個(gè)典型的用來衡量抗體在阿爾茨海默氏癥的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的作用的實(shí)驗(yàn)方法如下治療開始于5-6周齡。轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為三個(gè)主要的組(對(duì)照和2個(gè)劑量的化合物)，每組10-12只動(dòng)物。每個(gè)組處理至多至8(在蝕斑沉積前)、12(當(dāng)蝕斑開始形成時(shí))和18-19周齡(當(dāng)?shù)矸蹣迂?fù)擔(dān)非常顯著時(shí))，如上所述。
在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，小鼠會(huì)被無痛致死并用生理鹽水或蔗糖進(jìn)行灌注，腦被收集，大腦半球被分開。一個(gè)半球會(huì)通過浸入多聚甲醛而固定、剖面、然后用Campbell-Switzer Alzheimer銀染的方法來檢測(cè)蝕斑，以及其它的染色步驟。另外一個(gè)半球?qū)?huì)被冷凍，然后進(jìn)行ELISA檢測(cè)，并定量可溶性與非可溶性的1-40和1-42β淀粉樣蛋白。
在處死之前，可以進(jìn)行行為試驗(yàn)如Y-迷宮、“空間放置”(place set)Morris水迷宮以及形跡訓(xùn)練(trace conditioning)。
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序列表<110>明德賽特生物制藥美國(guó)公司<120>淀粉樣β肽的特異性抗體、其藥物組合物及其應(yīng)用方法<130>ILATA0057<140>PCT/US02/31590<141> 2002-10-21<150>10/084,380<151>2002-02-28<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>59<212>PRT<213>human<400>1Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Ala His Asp Ser Gly Tyr Glu Val1 5 10 15His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys20 25 30Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val35 40 45Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys50 55<210>2<211>6<212>PRT<213>human<400>2Asp Ala Glu Phe Arg Cys1 5<210>3<211>8<212>PRT<213>human<400>3Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Cys1 5<210>4<211>8
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<211>12<212>PRT<213>human<400>10Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln1 5 10<210>11<211>8<212>PRT<213>human<400>11Cys Gly Gly Val Val Ile Ala Thr1 5<210>12<211>13<212>PRT<213>human<400>12Asn Lys Gly Ala Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val1 5 10<210>13<211>14<212>PRT<213>human<400>13Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr1 5 10
權(quán)利要求
1.一種靶向淀粉樣β肽或其片段的抗體在制備一種用于治療患有阿爾茨海默氏癥的患者的藥物中的用途。
2.一種靶向淀粉樣β肽或其片段的抗體在制備一種用于治療患有以淀粉樣蛋白β沉積為特征的疾病或紊亂的患者的藥物中的用途。
3.一種靶向淀粉樣β肽或其片段的抗體在制備一種用于延遲或抑制或壓制淀粉樣β肽或其片段在腦中聚集的藥物中的用途。
4.一種靶向淀粉樣β肽或其片段的抗體在制備一種用于延遲或抑制或壓制淀粉樣β肽或其片段的神經(jīng)毒性的藥物中的用途。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的用途，其中所述抗體針對(duì)淀粉樣β肽或其片段。
6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的用途，其中所述抗體針對(duì)N端截短的淀粉樣β肽片段。
7.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的用途，其中所述抗體針對(duì)C端截短的淀粉樣β肽片段。
8.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的用途，其中所述抗體針對(duì)淀粉樣前體蛋白或其片段。
9.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的用途，其中所述抗體是單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人工抗體、scFv抗體或F(ab)、或其片段。
10.權(quán)利要求2的用途，其中所述的以淀粉樣蛋白β沉積為特點(diǎn)的紊亂或疾病是輕度認(rèn)知損害(MCI)、淀粉樣腦血管病變或congiophylic血管病、唐氏綜合征相關(guān)的阿爾茨海默氏癥或包涵體肌炎。
11.一種抗體，其對(duì)游離端具有特異性并靶向淀粉樣β肽的游離N端。
12.一種抗體，其對(duì)游離端具有特異性并靶向淀粉樣β肽的游離N端，其中所述淀粉樣β肽的第一個(gè)氨基酸是天冬氨酸。
13.一種抗體，其對(duì)游離端具有特異性并靶向N和/或C端截短的淀粉樣β肽片段的游離N端。
14.一種抗體，其對(duì)游離端具有特異性并靶向淀粉樣β肽Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41或Aβ1-43的游離C端。
15.一種抗體，其對(duì)游離端具有特異性并靶向N和/或C端截短的淀粉樣β肽片段的游離C端。
16.一種單鏈或人工抗體，其對(duì)游離端具有特異性并靶向淀粉樣β肽Aβ1-42的游離C端。
17.權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人工抗體、scFv抗體或F(ab)、或其片段。
18.一種藥物組合物，其包含一定量的權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的抗體和一種藥學(xué)可接受的載體。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，其中所述組合物通過皮下、靜脈、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、腦內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、透皮、面頰、動(dòng)脈內(nèi)、顱內(nèi)或頭部?jī)?nèi)給藥。
20.權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的抗體在制備一種用于治療患有阿爾茨海默氏癥的患者的藥物中的用途。
21.權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的抗體在制備一種用于治療患有以淀粉樣蛋白β沉積為特征的疾病或紊亂的患者的藥物中的用途。
22.權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的抗體在制備一種用于延遲或抑制或壓制淀粉樣β肽或其片段在腦中聚集的藥物中的用途。
23.權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的抗體在制備一種用于延遲或抑制或壓制淀粉樣β肽或其片段的神經(jīng)毒性的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療患有阿爾茨海默氏癥的患者的方法，包含施用靶向淀粉樣β肽或其片段的抗體分子的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療以淀粉樣蛋白β沉積為特點(diǎn)的疾病或紊亂的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗體分子，其對(duì)于淀粉樣β肽的N端或C端的游離端具有特異性，并涉及它的一種藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗體分子，其靶向N和/或C端截短的淀粉樣β肽片段的游離的C或N端。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1649623SQ02828857
公開日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2002年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月28日
發(fā)明者丹尼爾·G.·錢恩 申請(qǐng)人:明德賽特生物制藥美國(guó)公司