專利名稱：用脈沖電場進行顆粒輔助的多核苷酸免疫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及在個體中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法和組合物。具體的說，本發(fā)明涉及通過電輔助遞送編碼抗原的多核苷酸以達到在個體中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的目的。
背景技術(shù)：
現(xiàn)已開發(fā)了許多疫苗制劑，包括減毒后的病原體或亞單位蛋白質(zhì)抗原。常規(guī)的疫苗組合物常包括免疫佐劑以增強免疫應(yīng)答。例如，貯存佐劑(depotadjuvant)是經(jīng)常被使用的，它吸附和/或沉淀所施用的抗原并將抗原保持在注射位置。典型的貯存佐劑包括鋁化合物和油包水乳劑。不過，盡管貯存佐劑提高了抗原性，但當(dāng)它通過皮下或肌肉注射時常常引起嚴(yán)重持久的局部反應(yīng)，諸如肉芽腫、膿腫和疤痕。其它的佐劑，諸如脂多糖之類，注射時能引起發(fā)熱反應(yīng)和/或Reiter癥狀(類流行性感冒的癥狀，全身性關(guān)節(jié)不適及有時候的前葡萄膜炎、關(guān)節(jié)炎和尿道炎)。諸如Quillaja saponaria之類的皂苷也已在抗多種疾病的疫苗組合物中用作免疫佐劑。
更具體地說，完全弗氏佐劑(CFA)是一種在實驗基礎(chǔ)上已成功地與許多抗原一起使用的強免疫刺激劑。CFA包括三個組分礦物油、乳化劑和滅活的分枝桿菌，諸如肺結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之類。將抗原水溶液與這些組分混合產(chǎn)生油包水的乳劑。盡管CFA作為佐劑是有效的，但主要由于分枝桿菌組分的存在，CFA會引起嚴(yán)重的副作用，包括痛感、膿腫形成和發(fā)熱。因此，CFA不用于人和牲畜的疫苗中。
盡管存在這些佐劑，常規(guī)的疫苗仍經(jīng)常不能提供足夠抗靶病原體的保護。在這方面，越來越多的證據(jù)顯示抗細胞內(nèi)病原體諸如許多病毒的疫苗接種應(yīng)靶向于免疫系統(tǒng)的細胞和體液免疫兩方面。
更具體地說，細胞毒性T-淋巴細胞(CTL)在抗細胞內(nèi)病原體諸如病毒和惡性細胞產(chǎn)生的腫瘤特異抗原的細胞介導(dǎo)的免疫防衛(wèi)中起了重要的作用。CTL通過識別被感染細胞上展示的與I類MHC分子結(jié)合的病毒決定簇來介導(dǎo)對受病毒感染的細胞的細胞毒性。蛋白質(zhì)的胞質(zhì)表達是I類MHC加工和抗原肽呈遞給CTL的先決條件。不過，用滅活或減毒病毒進行免疫經(jīng)常不能產(chǎn)生抑制細胞內(nèi)感染所必需的CTL。此外，常規(guī)的疫苗接種技術(shù)當(dāng)應(yīng)用于呈現(xiàn)明顯遺傳異質(zhì)性及/或快速突變率的病毒諸如HIV或流感病毒等時是成問題的，因為這會有利于免疫逃逸變體的選擇。因此，研究者開發(fā)了可供選擇的接種技術(shù)。
攜帶被吸附或被俘獲抗原的顆粒載體已試用于引發(fā)足夠的免疫應(yīng)答。這樣的載體通常向免疫系統(tǒng)呈遞多拷貝的被選抗原并促進抗原在局部淋巴結(jié)的俘獲和停留。顆?？杀痪奘杉毎淌刹⒛芡ㄟ^細胞因子的釋放而增強抗原的呈遞。顆粒載體的例子包括金屬顆粒和來自諸如聚甲基丙烯酸甲酯聚合物之類的多種聚合物的顆粒，以及來自聚(丙交酯)和聚(丙交酯共乙交酯)的顆粒(稱作PLG)。PLG顆粒可通過非酶催化的隨機酯鍵水解而生物降解成能通過正常代謝途徑排泄的乳酸和乙醇酸，而聚甲基丙烯酸甲酯聚合物是不可降解的。
最近的研究已顯示帶被俘獲抗原的PLG顆粒在口服時能引起細胞介導(dǎo)的免疫和/或粘膜IgA應(yīng)答。此外，通過用PLG俘獲的肺結(jié)核分枝桿菌進行接種已在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)抗體和T細胞應(yīng)答。此外，用微囊化的合成短肽在小鼠體內(nèi)也誘導(dǎo)了抗原特異的CTL應(yīng)答。
另一最近關(guān)于疫苗的進展是將編碼抗原的多核苷酸施用于個體從而由個體在體內(nèi)產(chǎn)生期望的抗原。這樣的“DNA疫苗”可以以“裸”DNA或載體制劑形式，吸附或化學(xué)結(jié)合于顆粒表面(或內(nèi)部)，包含于表達載體或質(zhì)粒等中，通過施用途徑如粘膜暴露、注射入組織(通常是肌肉注射)來施用。
還已知可以通過多種類型的電極將多種形式的電脈沖施加于皮膚或諸如肌肉之類的其它組織，以此方式運送藥物、核酸或免疫原性劑至個體。例如，通過選擇合適的電參數(shù)，對DNA疫苗或其它類型免疫誘導(dǎo)劑所施用或注射的組織中細胞進行電穿孔可以用于增強疫苗向個體的遞送，從而達到增加保護性免疫應(yīng)答的目的。
不過，本領(lǐng)域需要有新的、更好的方法來遞送編碼抗原的多核苷酸，從而達到增加個體中保護性免疫應(yīng)答的目的。為此目的將生物可降解的或惰性的顆粒佐劑和脈沖電場聯(lián)合施用于靶組織——其中顆粒和多核苷酸互相之間基本上不化學(xué)結(jié)合——迄今為止仍未有描述。
發(fā)明簡述個體對施用于其皮膚、肌肉或粘膜中的DNA疫苗的免疫應(yīng)答可以通過將生物可降解的或惰性的顆粒佐劑及脈沖電場共施用于靶組織來增強，其中的顆粒和多核苷酸互相之間基本上不化學(xué)結(jié)合——這一驚人的、未預(yù)期到的發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明的基礎(chǔ)。此聯(lián)合的使用為增強多種抗原的免疫原性提供了一個安全有效的方法。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過將編碼抗原的多核苷酸施用于個體以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。在本發(fā)明的方法中，將免疫原性有效量的至少一種編碼抗原的多核苷酸引入個體靶組織中，所用的途徑選自肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下和粘膜內(nèi)；基本上在引入多核苷酸的同一時間在靶組織處產(chǎn)生足夠強度的脈沖電場，從而使多核苷酸進入靶組織的細胞以便在其中表達，并使得個體產(chǎn)生對多核苷酸所編碼之抗原的免疫應(yīng)答；在引入多核苷酸和產(chǎn)生電場的數(shù)天內(nèi)將佐劑有效量的顆粒引入靶組織，其中多核苷酸和顆粒在引入前相互之間基本上不化學(xué)結(jié)合。與涉及施用編碼抗原的多核苷酸的其它免疫方式所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相比，這種方法所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是被增強了的。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了通過將編碼抗原的多核苷酸施用于個體以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括將免疫原性有效量的至少一種編碼抗原的多核苷酸通過肌內(nèi)注射引入個體靶組織中；在引入多核苷酸的基本上同一時間在靶組織處產(chǎn)生足夠強度的脈沖電場，從而使多核苷酸進入靶組織的細胞以在其中表達，并導(dǎo)致在個體中產(chǎn)生對多核苷酸編碼之抗原的免疫應(yīng)答；在引入多核苷酸和產(chǎn)生電場的數(shù)天內(nèi)將佐劑有效量的顆粒引入靶組織，其中的多核苷酸和顆粒在引入前相互之間基本上不化學(xué)結(jié)合。與涉及施用編碼抗原的多核苷酸的其它免疫方式所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相比，本發(fā)明方法所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是被增強了的。
從此處所公布的內(nèi)容，本發(fā)明的這些或其它實施方案對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是容易的。
附圖簡述

圖1顯示了當(dāng)以以下聯(lián)合方式將DNA注射入脛骨肌后進行無毛小鼠中分泌型胚胎堿性磷酸酶(SEAP)基因表達檢測的對比試驗的結(jié)果與金顆粒和電穿孔一起(柱1)；與金顆粒一起，不經(jīng)電穿孔(柱2)；與電穿孔一起，無顆粒(柱3)；或單獨的DNA(柱4)。□表示0天時的基因表達；■表示注射后第3天的基因表達；帶斜條紋的柱子表示注射后7天的基因表達。在此實例中，“與金顆粒一起”表示DNA與顆粒相互之間基本上不化學(xué)結(jié)合。
發(fā)明詳述除非另外提及，本發(fā)明的實際操作中將應(yīng)用本領(lǐng)域的常規(guī)化學(xué)、生化、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)方法。這些技術(shù)在文獻中有充分的解釋。參閱，如Remington制藥科學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第18版(Easton，PA.Mack出版公司，1990)；酶學(xué)方法(Methods InEnzymology)(S.Colowick和N.Kaplan編輯，Academic Press，Inc.)；和實驗免疫學(xué)手冊(Handbook of Experimental Immunology)，第1-4卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編輯，1986，Blackwell ScientificPublication)；和Sambrook和Russell，分子克隆實驗室手冊(MolecularCloningA Laboratory Manual)(第3版，2000)。
本文所引用的所有出版物、專利和專利申請都特此全文引入作為參照。
除非內(nèi)容中明確提及，本說明書和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)的形式。
在本發(fā)明的描述中，以下術(shù)語將被應(yīng)用并按如下所示定義。
“惰性”指當(dāng)被引入生物體時自身不會與活體產(chǎn)生任何可察覺的化學(xué)反應(yīng)的穩(wěn)定組合物。
“多核苷酸”指諸如DNA、cDNA、mRNA和RNA之類的核酸聚合物，它可以是線性的、松馳的、環(huán)狀的、超螺旋的或凝聚的單鏈或雙鏈。多核苷酸還可包含一個或多個與自然發(fā)生部分相比進行了化學(xué)修飾的部分。多核苷酸可以不用放入遞送載體中(如作為“裸”多核苷酸)提供，或可以在表達質(zhì)?；虮绢I(lǐng)域已知的其它適宜類型的載體中提供。本發(fā)明范圍內(nèi)明確認為多核苷酸可以是寡核苷酸。除了以“裸露”形式施用多核苷酸外，多核苷酸還可以以配制的形式或修飾的形式施用。例如，可通過與保護性的、相互作用的、非縮聚的(protective，interactive，non-condensingpolymer，PINC)聚合物混合配制多核苷酸(Fewell，J.G.等，用電穿孔將PINC配制的質(zhì)粒運送入肌肉治療血友病B的基因療法，分子治療(Molecular Therapy)，3574-583(2000))或可將肽或其它化學(xué)實體諸如標(biāo)記分子之類附著于多核苷酸上對多核苷酸進行修飾(Zelphati，O.等，PNA依賴型基因化學(xué)肽和寡核苷酸與質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定偶聯(lián)(生物技術(shù)(Biotechniques)28304-310；312-314；316(2000)))。
“化學(xué)結(jié)合的”指化學(xué)復(fù)合、化學(xué)附著、包被、吸附、或其它的化學(xué)結(jié)合方式。例如，包于或吸附于顆粒上的核酸是與顆粒化學(xué)結(jié)合的。結(jié)合可通過共價或非共價鍵實現(xiàn)。在本發(fā)明的上下文中，顆粒不與編碼目的抗原的多核苷酸或多核苷酸的運送工具諸如含多核苷酸的質(zhì)?；蜉d體“化學(xué)結(jié)合”。因此，顆粒和多核苷酸或含多核苷酸的質(zhì)?；蜉d體不發(fā)生顯著程度地相互吸附、結(jié)合或鍵合或結(jié)合于復(fù)合物中。相反地，即使出現(xiàn)于同一溶液、懸浮液或載體中，多核苷酸或含多核苷酸的質(zhì)?；蜉d體仍保持與顆?；旧戏蛛x和區(qū)分。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方式可確定顆粒和多核苷酸相互間是否為基本上不化學(xué)結(jié)合。例如，為施用于個體而制備的多核苷酸和顆粒的溶液的樣品可通過離心分離成顆粒和多核苷酸，且結(jié)合的程度可通過凝膠電泳顯示。或者，可將樣品進行凝膠電泳并從而可探測化學(xué)結(jié)合的缺乏。此外，DNA疫苗可存在于溶液，通常是1xPBS鹽水或水中，它也可防止DNA和顆?；瘜W(xué)結(jié)合。
“皮膚組織”是指角質(zhì)層之下的表皮和真皮。
“抗原呈遞細胞”或“APC”指單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、郎氏細胞等等，它可起始細胞過程，使APC收繳抗原并在遷移到濾過性淋巴結(jié)之后向T細胞呈遞抗原或其部分。
“皮內(nèi)的”或“通過皮內(nèi)”指施用入皮膚的真皮層，而不是施用于皮膚表面。例如，皮內(nèi)途徑包括，但不局限于，真皮細胞的腫瘤。
“肌內(nèi)施用”和“通過肌內(nèi)”指施用入肌肉物質(zhì)中，即施用入肌層。
“粘膜內(nèi)施用”和“粘膜內(nèi)”指施用入襯有各種管狀結(jié)構(gòu)，包括但不局限于上皮、固有層及在消化道內(nèi)平滑肌層的粘膜層或粘液組織。
“皮下施用”和“皮下”指施用入皮膚下的組織中。
“免疫”指引起個體免疫應(yīng)答或形成免疫應(yīng)答的過程。
“抗體”指抗原在包括人在內(nèi)的動物體內(nèi)引起的免疫或保護性蛋白質(zhì)，其特征在于免疫蛋白與抗原的特異反應(yīng)。
“基本上同一時間”當(dāng)涉及共施用多核苷酸和脈沖電場的時間選擇時，指兩者同時施用或相互間在約數(shù)分鐘至數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)施用。顆?？稍谑┯枚嗪塑账岷兔}沖電場之前或之后數(shù)天內(nèi)施用。例如，在一優(yōu)選的實施方案中，首先引入多核苷酸，然后施加脈沖電場并引入顆粒，后兩者可以一起進行或順序進行，發(fā)生在引入多核苷酸后不超過約3小時。在另一實施方案中，引入多核苷酸和施加脈沖電場在一起或在幾小時之內(nèi)相繼地進行，而顆粒在顆粒引入和電穿孔之前或之后不超過約3天，例如不超過2天或不超過1天一次或多次引入。再一實施方案是引入顆粒和多核苷酸的混合物，其中顆粒和多核苷酸相互之間不發(fā)生化學(xué)結(jié)合，而其中脈沖電場在引入顆粒和配制的或未配制的(即“裸露的”)多核苷酸后不超過約5小時施加。目前優(yōu)選的實施方案是那些其中多核苷酸、顆粒和電脈沖同時施加或相互之間間隔不超過5分鐘的實施方案。技術(shù)人員可以通過進行數(shù)次本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的及實施例5所提出的簡單實驗確定引入顆粒和多核苷酸及施加電場的最佳次序，在這些實驗中各組分的時間選擇和次序進行變化。
“抗原”指包含一個或多個表位的分子，所述表位可刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生體液抗體應(yīng)答或在抗原呈遞后引起細胞抗原特異性免疫應(yīng)答。正常的情況下，表位將包括約3-15個氨基酸，通常約為5-15個。為了達到本發(fā)明的目的，抗原可來自許多已知的病毒、細菌、寄生蟲和真菌。此術(shù)語還意圖包括多種腫瘤抗原。此外，為了達到本發(fā)明的目的，“抗原”包括那些對天然序列進行了修飾的分子，所述修飾為諸如缺失、添加和替代(通常在性質(zhì)上是保守性的)，只要蛋白質(zhì)、多肽或多糖保持引起免疫學(xué)應(yīng)答的能力就行。這些修飾可以是有意的，如通過定點誘變，或可以是意外造成的，如由產(chǎn)生抗原的宿主的突變造成。
對抗原或組合物的“免疫應(yīng)答”是在個體體內(nèi)對目的組合物中存在的分子產(chǎn)生體液的和/或細胞的免疫應(yīng)答。為本發(fā)明目的，“體液免疫應(yīng)答”指抗體分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而“細胞免疫應(yīng)答”指T淋巴細胞和/或其它白細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。細胞免疫的一個重要方面涉及溶細胞性T細胞(“CTL”)引起的抗原特異性應(yīng)答。CTL對與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)所編碼的蛋白質(zhì)相結(jié)合而呈遞并展現(xiàn)于細胞表面的肽抗原有特異性。CTL協(xié)助誘導(dǎo)和促進細胞內(nèi)微生物的細胞內(nèi)破壞或這些微生物所感染的細胞的裂解。細胞免疫的另一方面涉及通過輔助T細胞而產(chǎn)生的抗原特異性應(yīng)答。輔助T細胞用于幫助刺激非特異性效應(yīng)細胞的功能或使其活性集中以對抗表面展示有肽抗原與MHC分子的結(jié)合物的細胞?！凹毎庖邞?yīng)答”還指產(chǎn)生細胞因子、趨化因子和其它產(chǎn)生自活化T細胞和/或其它白細胞的此類分子，包括那些來自CD4+和CD8+T細胞的分子。
術(shù)語“顆?！庇糜诖颂幨侵付栊院?或生物可降解材料或組合物的顆粒，其中顆粒具有足以被抗原呈遞細胞內(nèi)在化的剛性并可任選地為中性或帶負電荷。顆粒可以是固體或半固體。顆粒的最大平均尺寸是直徑在約0.05微米至約20微米范圍內(nèi)，優(yōu)選約0.1微米至約3微米范圍內(nèi)。優(yōu)選尺寸范圍內(nèi)的顆粒容易被抗原呈遞細胞內(nèi)在化。優(yōu)選的顆粒是微粒，諸如那些來自貴重金屬的微粒，尤其是金微粒以及鋁、鈦、鎢和碳微粒。盡管純的金屬顆粒是優(yōu)選的，尤其是純金顆粒，但含99.5％-95％體積的該金屬的合金也可用于本發(fā)明方法的實踐中。這些金屬微粒是容易購買到的。其它顆粒材料的例子是脂質(zhì)體、其它小泡、聚合物等等。
當(dāng)發(fā)明方法加快免疫應(yīng)答的出現(xiàn)(即增強免疫應(yīng)答的動力學(xué))或與不存在顆粒/脈沖電場輔助效應(yīng)情況下的等量多核苷酸相比具有更強的引起免疫應(yīng)答的能力時，發(fā)明方法就“增強”了編碼抗原的多核苷酸的“免疫原性”。因此，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法可以因為如下原因而呈現(xiàn)“增強的免疫原性”所產(chǎn)生的抗原具有更強的免疫原性，或需要較低劑量的編碼抗原的多核苷酸就可在所施用個體體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，或施用后更迅速地達到有效的免疫應(yīng)答，如由抗體效價(但并不局限于此)所證明的。在本發(fā)明中，被增強的免疫應(yīng)答優(yōu)選包括如下優(yōu)勢免疫應(yīng)答在動力學(xué)上加快，表現(xiàn)為與其它免疫方案相比免疫應(yīng)答的出現(xiàn)，如抗體效價的上升加快?？梢酝ㄟ^將多核苷酸組合物和脈沖電場、或多核苷酸和顆粒作為對照施用于動物，并用諸如放射免疫試驗和ELISA之類的標(biāo)準(zhǔn)試驗與本發(fā)明方法比較免疫應(yīng)答，從而確定所說的被增強了的免疫原性，所說的標(biāo)準(zhǔn)試驗是如本領(lǐng)域已知的并在本文實施例中以ELISA為例作了描述。
術(shù)語“佐劑有效量”應(yīng)用于本發(fā)明方法中的顆粒時指顆粒量足以為期望的免疫學(xué)應(yīng)答提供佐劑效應(yīng)及相應(yīng)的治療效應(yīng)。不同的個體所要求的確切數(shù)量是不同的，取決于個體的種屬、年齡和總體條件、被治療疾病的嚴(yán)重性、編碼目的抗原的具體的多核苷酸、施藥方式(如是否通過肌肉或皮膚)、顆粒的大小和類型，等等。在任何個案中，合適的“有效”量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用常規(guī)實驗確定。
含編碼抗原的多核苷酸的組合物將包含“免疫原性有效量”的目的多核苷酸。即，包括在組合物中的多核苷酸的量將使得當(dāng)所編碼抗原產(chǎn)生于個體體內(nèi)時，其與顆粒和脈沖電場的聯(lián)合將引起個體產(chǎn)生足夠的免疫學(xué)應(yīng)答以預(yù)防、減少或消除癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定合適的有效量。因此，“免疫原性有效量”將落入通過常規(guī)試驗可確定的相對寬的范圍內(nèi)。
用于此處時，“誘導(dǎo)免疫應(yīng)答”指以下之任一(i)如同在傳統(tǒng)疫苗中一樣，防止感染或再感染，(ii)減輕或消除癥狀，和(iii)基本上或完全消除所關(guān)心的病原體。因此，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法可預(yù)防性的(感染前)或治療性的(感染后)實行。
“制藥學(xué)可接受的”或“藥學(xué)可接受的”是指不具有生物學(xué)或其它方面的不良性質(zhì)的材料，即，該材料可與顆粒佐劑制劑一起施用于個體，不會引起任何不良的生物學(xué)效應(yīng)或與含有其的組合物中的任何組分產(chǎn)生有害的相互作用。
“生理學(xué)上的pH”或“生理學(xué)范圍內(nèi)的pH”指pH在約7.2-8.0的范圍內(nèi)(包括端值)，更典型的是在約7.2-7.6的范圍內(nèi)(包括端值)。
“個體”是指任何哺乳動物，包括但不局限于，人和其它靈長類，包括非人的靈長類動物，諸如黑猩猩和其它猿和猴種屬；諸如牛、綿羊、豬、山羊和馬之類的農(nóng)畜；諸如狗和貓之類的馴養(yǎng)哺乳動物；包括諸如小鼠、大鼠和豚鼠之類嚙齒動物在內(nèi)的實驗室動物、馴養(yǎng)的寵物、諸如雞之類的農(nóng)場飼養(yǎng)動物，等等。該術(shù)語不表示具體的年齡。因此，成年和新生的個體都包括在可按本發(fā)明方法進行處理的對象中。此處所述之本發(fā)明的方法意圖用于任何上述哺乳動物物種，因為所有這些哺乳動物的免疫系統(tǒng)的運轉(zhuǎn)都是相似的。
引起細胞免疫應(yīng)答的發(fā)明方法可通過抗原與MHC結(jié)合呈遞于細胞表面而用于使哺乳動物個體致敏。細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答對準(zhǔn)呈遞抗原于其細胞表面的細胞。此外，為了對被免疫宿主產(chǎn)生未來的保護作用，還可產(chǎn)生抗原特異的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。
一個具體的發(fā)明方法刺激細胞介導(dǎo)之免疫學(xué)應(yīng)答的能力可通過許多試驗來確定，諸如淋巴細胞增殖(淋巴細胞活化)試驗、CTL細胞試驗、或用于測定致敏后個體中的抗原特異性T淋巴細胞的試驗。這樣的試驗是本領(lǐng)域眾所周知的。參閱，如Erickson等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)(1993)1514189-4199；Doe等，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)(1994)242369-2376；以及以下實施例。
因而，此處所用的免疫學(xué)應(yīng)答可以是刺激CTL產(chǎn)生和/或輔助T細胞產(chǎn)生或活化的免疫應(yīng)答。目的抗原還可引起抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，免疫學(xué)應(yīng)答可包括一個或多個以下效應(yīng)B細胞產(chǎn)生抗體和/或抑制性T細胞活化。這些應(yīng)答可以用于中和感染性和/或介導(dǎo)抗體補體或抗體依賴性的細胞毒性(ADCC)，從而為被免疫的宿主提供保護，如抵抗引起疾病的生物體或腫瘤細胞的攻擊。這樣的應(yīng)答可用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)免疫試驗和中和試驗進行測定。
發(fā)明實施方式本發(fā)明是以以下發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的，即，當(dāng)將與DNA疫苗不化學(xué)結(jié)合的佐劑顆粒和DNA疫苗組合施用于組織并在組織處產(chǎn)生脈沖電場時，在個體體內(nèi)會可靠地產(chǎn)生對所編碼抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的方法提供了另外的有利之處，即，與所測試的其它類型免疫方法相比，在個體體內(nèi)產(chǎn)生了增強的免疫應(yīng)答，如更快的免疫應(yīng)答。在一些情況中，如以下實施例2的結(jié)果所示，可見到協(xié)同效應(yīng)，以致用本發(fā)明方法獲得的免疫應(yīng)答大于(如按效價測定)佐劑顆?；蛎}沖電場單獨與多核苷酸疫苗組合使用時所產(chǎn)生的加性增強效應(yīng)。當(dāng)觀察到這樣的協(xié)同效應(yīng)時，它通常出現(xiàn)于施用最初的疫苗接種方案后約6周，與其它方案處理的個體體內(nèi)的抗體效價相比，此時間點在用本發(fā)明方法處理的個體體內(nèi)可觀察到更高的抗體效價。
盡管此處所述的本發(fā)明方法中的各個組分都是已知的，但令人驚奇和意想不到的是，與這些組分單獨使用或按不同于本發(fā)明所述之三方方案的任何組合方式使用時相比，按本發(fā)明方法進行的聯(lián)合施用可以增強體內(nèi)產(chǎn)生的抗原的免疫原性。
在許多不同的情況中，增強免疫應(yīng)答是有利的。例如，當(dāng)急需要進行保護性免疫時，如當(dāng)軍隊在緊急情況下向外地部署或當(dāng)病原體(如炭疽)出乎意料地爆發(fā)時，用本發(fā)明方法在較短時間內(nèi)達到保護性免疫將是有利的。類似地，當(dāng)急需要保護性免疫來處理急性疾病或爆發(fā)時，本發(fā)明增強的免疫同樣可解決這樣的需要。
本發(fā)明方法涉及基本上在多核苷酸和顆粒引入組織的相同時間在靶組織中產(chǎn)生脈沖電場，其中電脈沖強度足以使多核苷酸疫苗進入靶組織的細胞并以吸引APC及免疫系統(tǒng)其它有關(guān)細胞的方式干擾組織。脈沖電場的強度足以引起多核苷酸經(jīng)電轉(zhuǎn)運進入靶組織的細胞。
電轉(zhuǎn)運的一種類型是電穿孔。例如，為了在肌肉組織中引起細胞的電穿孔，本發(fā)明方法中所用的脈沖電場將具有約50V/cm-約400V/cm的低額定電場強度，優(yōu)選約100V/cm-約200V/cm。遞送至肌肉的脈沖電場中所用的脈沖長度將在約1-100毫秒(msec)范圍內(nèi)，優(yōu)選20-60msec，并應(yīng)用約1-6個脈沖。電脈沖的波形可以是單極的或雙極的。對于將DNA遞送至皮膚的本發(fā)明方法來說，形成脈沖電場，具有1-約12個脈沖，每個50V-80V，每個脈沖持續(xù)時間約為100微秒-100毫秒。另一在皮膚中產(chǎn)生適宜電場的替代方案是向真皮組織應(yīng)用例如約70V-約100V持續(xù)數(shù)百微秒的單一短高電壓脈沖以破壞角質(zhì)層，隨后用1-約3個低電壓長脈沖(例如，50V-約80V持續(xù)1-100msec)以驅(qū)使DNA疫苗進入細胞。
本發(fā)明方法實施中所用的電穿孔可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的任何類型的合適電極。例如，為了基本上在引入DNA疫苗和顆粒的同一時間在肌肉中產(chǎn)生電場，優(yōu)選使用由2、4、或6個電極組成的針電極?？梢钥紤]將電極安成成對的、對置的對、平行的排、三角形、矩形、正方形或任何其它合適幾何形狀。除了侵入式電極外，可以向DNA和顆粒遞送位點上方的皮膚施用非侵入式或最低程度的侵入式電極以在肌肉內(nèi)產(chǎn)生電場。為了基本上在引入DNA疫苗和顆粒的同一時間在皮膚中產(chǎn)生電場，可使用多種侵入式電極或非侵入式電極。優(yōu)選非侵入式電極，諸如卡鉗電極(caliperelectrode)、彎電極(meander electrode)、微片電極(micropatch electrode)和微針電極及其變體。這樣的電極都是可購買到的且在本領(lǐng)域中有充分的描述。對于應(yīng)用于皮膚表面的電穿孔來說，優(yōu)選諸如彎曲電極之類的非侵入式電極或長度不超過數(shù)毫米的短針電極以刺入角質(zhì)層。相反，對于應(yīng)用于肌肉的電穿孔來說，優(yōu)選較長的針電極。
在實施本發(fā)明方法時用于提供電穿孔的幾個目前優(yōu)選的條件如下表1所示
表1
本發(fā)明方法可以以粘膜組織作為靶組織進行，諸如口腔和鼻粘膜。電荷應(yīng)用參數(shù)基本上與本文中應(yīng)用于皮膚組織的相同。通過將裸露的、配制的或修飾形式的多核苷酸注射入粘膜層，隨后用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的諸如卡鉗電極或彎電極之類非侵入性表面電極進行電穿孔，可將多核苷酸運送至粘膜組織和細胞、或粘膜層以下的細胞。表面電極可設(shè)計成適合預(yù)期應(yīng)用的位點(如中空的器官或腔)的形狀?；蛘撸蓱?yīng)用最低程度的侵入型電極，如由多個短針電極組成的電極(美國專利5,810,762；Glasspool-Malone，J.等，有效的非病毒的皮膚轉(zhuǎn)染。分子治療(MolecularTherapy)2140-146(2000))或鋸齒形電極。鋸齒形電極的形狀如其名稱所暗示，可以以交替極性的平行排應(yīng)用，電極齒尖端比鋸齒上方較寬部分刺入粘膜更深。顆粒也可以通過中空的針或液體注射方式注射進入粘膜，或可通過彈道學(xué)的方法引入。技術(shù)人員可進行簡單的實驗來確定將DNA疫苗運送至特定粘膜組織的最適條件。
本發(fā)明的方法提供了細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和/或體液或抗體應(yīng)答。因此，除了常規(guī)的抗體應(yīng)答外，通過本文所述系統(tǒng)還可提供，如，所表達抗原與I類MHC分子的結(jié)合，從而使體內(nèi)對目的抗原的細胞免疫應(yīng)答可以發(fā)生，包括產(chǎn)生CTL以便未來識別靶細胞上的抗原。此外，這些方法還可通過輔助T細胞引起抗原特異性應(yīng)答。因此，任何抗原，如果期望產(chǎn)生針對其的細胞和/或體液免疫應(yīng)答，都可應(yīng)用于本發(fā)明的方法中，所述抗原包括來自病毒、細菌、真菌和寄生病原體并能誘導(dǎo)抗體的抗原、T輔助細胞表位和T細胞細胞毒性表位。這樣的抗原包括，但不局限于，人和動物病毒編碼的抗原、腫瘤細胞表面表達增強的抗原，并可相應(yīng)于結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。
如果佐劑顆粒與多核苷酸疫苗分開引入個體的組織，則佐劑顆粒與多核苷酸疫苗運送至基本上相同的位置。佐劑顆粒也可與多核苷酸疫苗混合以便同時運送至相同位點。優(yōu)選地，DNA疫苗與1xPBS或水混合，然后加入顆粒。在此實施方案中，顆粒帶負電荷或為中性。因為DNA是在溶液中，所以顆粒和DNA不會有任何實質(zhì)程度的化學(xué)結(jié)合。
本發(fā)明方法實踐中所用的編碼抗原的多核苷酸和顆粒(或含此類藥劑的制品)經(jīng)皮下引入，通常用針注射或用無針壓力輔助注射系統(tǒng)進行無針注射，如系統(tǒng)可以提供具一定力量的小的液流或射流(通常通過使諸如二氧化碳之類的壓縮氣體膨脹并在幾分之一秒內(nèi)穿過微孔而產(chǎn)生)使藥劑穿透組織表面并進入下面的真皮組織、粘膜層和/或肌肉。這些制劑可以通過粘膜、皮內(nèi)、皮下或肌內(nèi)注射，但不應(yīng)用于皮膚表面(如，作為局部用溶液、膏或洗液)。
本發(fā)明方法可用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以抵抗核苷酸序列已知且在人和其它哺乳動物中引起疾病的任何抗原。例如，已知來自一些細胞內(nèi)致病病毒的抗原，諸如來自皰疹病毒家族的抗原，包括類型1和2單純皰疹病毒(HSV)來源的蛋白質(zhì)中所含的抗原，諸如HSV-1和HSV-2糖蛋白gB、gD和gH；來自水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)和巨細胞病毒(CMV)的抗原，包括CMVgB和gH；以及來自諸如HHV6和HHV7之類的其它人類皰疹病毒的抗原。(參閱，如Chee等，巨細胞病毒(J.K.McDougall編輯，Springer-Verlag 1990)第125-169頁，是有關(guān)巨細胞病毒的蛋白編碼內(nèi)容的綜述；McGeoch等，遺傳病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)(1988)691531-1574，是關(guān)于各種HSV-1編碼蛋白的討論；美國專利5,171,568，是關(guān)于HSV-1和HSV-2gB和gD蛋白質(zhì)及其編碼基因的論述；Baer等，自然(Nature)(1984)310207-211，涉及鑒定EBV基因組中的蛋白質(zhì)編碼序列；以及Davison和Scott，遺傳病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)(1986)671759-1816，是關(guān)于VZV的綜述)。
所編碼抗原來自肝炎病毒家族的多核苷酸也可方便地用于本文所述的技術(shù)中，包括甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、δ肝炎病毒(HDV)、E肝炎病毒(HEV)和G肝炎病毒(HGV)。舉例說來，HCV的病毒基因組序列和獲得該序列的方法是已知的。參閱，如，國際公布號WO89/04669、WO90/11089和WO90/14436。HCV基因組編碼數(shù)個病毒蛋白，包括E1(也稱作E)和E2(也稱作E2/NSI)和N末端核殼蛋白質(zhì)(稱“核心”)(參閱，Houghton等，肝臟學(xué)(Hepatology)(1991)14381-388，論述了HCV蛋白質(zhì)，包括E1和E2)。編碼這些蛋白質(zhì)中任一個及其抗原性片段的多核苷酸都能在本發(fā)明方法中得到應(yīng)用。
所編碼抗原來自其它病毒的多核苷酸也可用于本申請所要求的方法中，例如但不局限于，來自以下科的成員的蛋白質(zhì)小RNA病毒科(如脊髓灰質(zhì)炎病毒等)；杯狀病毒科；披膜病毒科(如，風(fēng)疹病毒、登革病毒，等)；黃病毒科；冠形病毒科、呼腸孤病毒科；雙RNA病毒科；彈狀病毒科(如狂犬病毒等)；線狀病毒；副粘病毒科(如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等)；正粘病毒科(如流行性感冒病毒A、B和C等)；布尼亞病毒科；沙粒病毒科；逆轉(zhuǎn)錄病毒科(如HTLV-I；HTLV-II；HIV-1(也稱作HTLV-III、LAV、ARV、hTLR等))，包括但不局限于來自分離株HIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLA1、HIVMN、HIV-1CM235、HIV-1US4、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)等的抗原。此外，抗原還可來自人乳頭瘤病毒(HPV)和蜱傳腦炎病毒。參閱，如病毒學(xué)(Virology)，第三版(W.K.Joklik編輯，1988)；基礎(chǔ)病毒學(xué)(Fundamental Virology)，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe編輯，1991)，是關(guān)于這些病毒和其它病毒的描述。
更特別地，來自任何上述HIV分離株，包括多種HIV遺傳亞型成員的gp120包膜蛋白是已知并報道了的(參閱，如Myers等，Los Alamos數(shù)據(jù)庫，Los Alamos國家實驗室，Los Alamos，N.M.(1992)；Myers等，人逆轉(zhuǎn)錄病毒和輔助物(Human Retroviruses and Aids)，1990，LosAlamos，N.M.Los Alamos國家實驗室；和Modrow等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)(1987)61570-578，比較了各種HIV分離株的包膜蛋白序列)，而來自任何這些分離株的抗原都可用于本發(fā)明的方法中。
流行性感冒病毒是本發(fā)明對其特別有用的病毒的另一實例。具體地，流行性感冒病毒A的包膜糖蛋白HA和NA對于產(chǎn)生免疫應(yīng)答尤其有意義。流行性感冒病毒A的許多HA亞型已被鑒定(Kawaoka等，病毒學(xué)(Virology)(1990)179759-767；Webster等，“A類流行性感冒病毒中的抗原性變異”，第127-168頁，P.Palese和D.W.Kingsbury(編輯)，流行性感冒病毒的遺傳學(xué)，springer-Verlag，紐約)。因此，來自任何這些分離株的蛋白質(zhì)也可用于本文所述的免疫技術(shù)中。
本文所述方法還可用于抗許多細菌抗原，諸如那些其來源生物體會引起白喉、霍亂、結(jié)核病、破傷風(fēng)、百日咳、腦膜炎及其它發(fā)病情形的抗原，這些生物體包括但并不局限于腦膜炎球菌(Meningococcus)A、B和C、流感嗜血桿菌B(Hemophilus influenza type B，HIB)和幽門螺旋菌(Helicobacter pylori)。寄生抗原的例子包括那些其來源生物體可引起瘧疾和Lyme氏疏螺旋體病的抗原。
此外，本文所述方法為治療各種惡性腫瘤提供了一條途徑。例如，本發(fā)明方法可用于對特異于所關(guān)心的癌癥的特定蛋白質(zhì)引起體液和細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，所述蛋白為諸如活化的癌基因、胎兒抗原或活化的標(biāo)記。這些腫瘤抗原包括但不局限于，各種MAGE(黑素瘤相關(guān)抗原E)中的任一種，包括MAGE1、2、3、4等(Boon，T.科學(xué)美國人(Scientific American)(1993年三月)第82-89頁)；各種酪氨酸酶中的任一種；MART1(T細胞所識別的黑素瘤抗原)、突變ras；突變p53；p97黑素瘤抗原；CEA(癌胚抗原)及其它。很顯然本發(fā)明可用于預(yù)防或治療廣泛種類的疾病。
劑量治療可以是單劑量給藥的時間表或多劑量給藥的時間表。所謂多劑量給藥的時間表是指最初的接種過程可用單一劑量進行，然后間隔地給予其它劑量——劑量的選擇是為了維持和/或加強免疫應(yīng)答，例如在初次免疫接種后4周施用第二劑量，且如果需要的話，在數(shù)周后施用隨后的劑量，例如在初次免疫后不超過6個月。加強劑量可以使用與引起初次免疫應(yīng)答時所用相同類型的顆粒、含核苷酸的組合物及脈沖電場來給予，或可以用不同的制劑或不同的免疫步驟組合來施用和/或引入。下表2舉例闡明了可用于本發(fā)明實踐中的治療步驟的多種組合表2
劑量方案還將取決于，至少部分取決于個體的需要，并依賴于醫(yī)師的判斷。此外，如果是期望達到預(yù)防疾病的目的，通常在初次感染目的病原體前應(yīng)用本發(fā)明方法。如果是為了治療的目的，如減輕癥狀或降低復(fù)發(fā)，通常在初次感染后施用本發(fā)明的方法。
組合物通常將包括一種或多種“制藥學(xué)可接受的賦形劑或賦形藥”，諸如水、鹽水、甘油、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、乙醇等。此外，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等輔助物也可存在于所說的賦形藥中。
適用于本發(fā)明的顆粒還可來自，如聚(丙交酯)(“PLA”)之類的聚α羥酸或諸如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”或“PLGA”)之類的D，L-丙交酯和乙交酯或羥基乙酸的共聚物，或D，L-丙交酯和己內(nèi)酯的共聚物。顆粒可來自各種單體起始材料，具有各種各樣分子量并且對于諸如PLG之類的共聚物，可有各種各樣的丙交酯∶乙交酯的比率，其選擇主要是抉擇的問題，而部分取決于共同施用的多核苷酸或含多核苷酸的組合物。
或者，當(dāng)顆粒是脂質(zhì)體(如水包油乳劑)時，該顆粒可以來自如兩親性脂類等形成泡囊的脂類，它具有疏水部分和極性頭部基團，并且(a)能在水中自發(fā)地形成雙層泡囊(以磷脂為例)，或(b)可以穩(wěn)定摻入脂雙層，疏水部分與雙層膜內(nèi)部的疏水區(qū)接觸，而極性頭部基團部分則朝向膜的外部極性表面。盡管可以使用不帶電或帶負電且平均大小在期望的0.2-2微米范圍內(nèi)的任何類型脂質(zhì)體，但優(yōu)選的脂質(zhì)體是單層脂質(zhì)體和多層脂質(zhì)體。
這種形成泡囊的脂類典型地包括一個或兩個疏水酰基碳氫鏈或類固醇基團，且可以在極性頭部基團處包含化學(xué)反應(yīng)基團，諸如胺、酸、酯、醛或醇。包括于此類別內(nèi)的有磷脂，如磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)，其中的兩條碳氫鏈通常長度在約為14-22個碳原子，并具有不同程度的不飽和。其它形成泡囊的脂類包括諸如腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂之類的糖脂和諸如膽固醇之類的固醇。
本發(fā)明中用于制備微顆粒的生物可降解性聚合物可方便地購自以下公司如德國的Boehringer Ingelheim和美國阿拉巴馬州伯明翰的Birmingham Polymers，Inc.。例如，此處用于形成顆粒的聚合物包括來自如下的那些聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐；以及聚(α-羥酸)，諸如聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)(此處都稱為“PLA”)、聚(羥基丁酸)，DL-丙交酯和乙交酯的共聚物，諸如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(此處稱“PLG”或“PLGA”)，或D，L-丙交酯和己內(nèi)酯的共聚物。此處特別優(yōu)選使用的聚合物是PLA和PLG聚合物。這些聚合物可以以各種各樣的分子量獲得，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定對于給定的應(yīng)用而言合適的分子量。因此，如，對于PLA，合適的分子量約為2000-250000。對于PLG，合適的分子量范圍通常約為10000-200000，優(yōu)選約15000-約150000，最優(yōu)選約50000-約100000。
若用諸如PLG之類的共聚物形成顆粒，在此可用各種丙交酯∶乙交酯比率，此比率主要是一個選擇的問題，部分取決于共施用的多核苷酸或含多核苷酸的載體或質(zhì)粒以及期望的降解率。例如，含50％D，L-丙交酯和50％乙交酯的50∶50 PLG聚合物將提供一種快速再吸收的共聚物，而通過增加丙交酯成分，比率為75∶25的PLG將降解較慢，而85∶15和90∶10則降解更慢。此外，在配制中可使用具有不同丙交酯∶乙交酯比率的微顆粒的混合物來獲得所給抗原的期望釋放動力學(xué)并提供初次和再次免疫應(yīng)答。
顆?？梢杂帽绢I(lǐng)域眾所周知的數(shù)種方法中的任一種制備。例如，如美國專利號3,523,907和Ogawa等，藥物化學(xué)公告(Chem.Pharm.Bull.)(1988)361095-1103中所述的，雙乳劑/溶劑蒸發(fā)技術(shù)可用于此處形成顆粒。這些技術(shù)涉及形成由聚合物溶液小滴組成的初級乳劑，隨后將其與含顆粒穩(wěn)定劑/表面活性劑的連續(xù)水相混合。
更特別地，水包油包水(W/O/W)溶劑蒸發(fā)系統(tǒng)可用于形成顆粒，見文獻所述O’Hagan等，疫苗(Vaccine)(1993)11965-969和Jeffery等，藥學(xué)研究(Pharm.Res.)(1993)10362。在此技術(shù)中，特定的聚合物與有機溶劑混合，如乙酸乙酯、dimethylchloride(也稱二氯甲烷)、乙腈、丙酮、氯仿等等。聚合物以溶于有機溶劑中的溶液形式提供，濃度約為2-15％，更優(yōu)選約4-10％，最優(yōu)選6％的溶液。加入水溶液并用如勻漿器使聚合物/水溶液乳化。然后將乳劑與更大體積的諸如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮之類的乳劑穩(wěn)定劑的水溶液混合。通常提供的乳劑穩(wěn)定劑為約2-15％的溶液，更典型的是約4-10％的溶液。然后勻漿混合物產(chǎn)生穩(wěn)定的w/o/w雙乳劑。有機溶劑隨后被蒸發(fā)。
此處所用水包油乳劑諸如脂質(zhì)體之類包括無毒的可代謝油和商業(yè)乳化劑。無毒的可代謝油的例子包括但不局限于，植物油、魚油、動物油或合成制備油。優(yōu)選諸如鱈魚魚肝油、鯊魚魚肝油和鯨魚油之類的魚油。尤其優(yōu)選存在于鯊魚魚肝油中的鯊烯，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。魚油組分的存在量可以為約0.5％-約20％體積，優(yōu)選不超過約15％，更優(yōu)選約1％-約12％，最優(yōu)選的是1％-約4％的油。
顆粒佐劑的水溶液部分可以是緩沖鹽水或未攙雜的水。如果使用鹽水而非水，優(yōu)選緩沖鹽水以維持生理學(xué)范圍內(nèi)的pH。此外，在某些情況下，可能必須維持特定水平的pH以保證某些組合物成分的穩(wěn)定性。因此，組合物的pH通常是pH6-8，且pH可用生理學(xué)可接受的緩沖液來維持，諸如磷酸鹽、醋酸鹽、tris、重碳酸鹽或碳酸鹽緩沖液，等等。水性劑的存在量通?？梢詾槭菇M合物達到期望終體積所必需的量。
適用于水包油制劑的乳化劑包括但不局限于，以山梨聚糖為基礎(chǔ)的非離子表面活性劑(如可購買到的SPAN或ARLACEL表面活性劑)；聚氧乙烯山梨聚糖單酯和聚氧乙烯山梨聚糖三酯(可以以TWEEN表面活性劑購得)；聚氧乙烯脂肪酸(可以以MYRJ表面活性劑購得)；來自十二烷基、乙?；⑹送榛陀突嫉木垩跻蚁┲舅崦?，如已知名稱為BRIJ的表面活性劑；等等。這些乳化劑可單獨使用或聯(lián)合使用。乳化劑的存在量按重量(w/w)計通常為0.02％-約2.5％，優(yōu)選0.05％-約1％，最優(yōu)選0.01％-約0.5％。此存在量通常約為所用油重量的20-30％。
乳劑還可任選的包含其它免疫刺激劑，如胞壁酰肽，包括但不局限于，N-乙?；?胞壁?；?L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1’，2’-二棕櫚?；?sn-甘油-3-羥基磷?；趸?-乙胺(MTP-PE)，等。還可存在免疫刺激性細菌細胞壁組分，如單磷酸脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)。
關(guān)于制備用于本發(fā)明的各種合適的水包油乳劑制劑的方法，參閱，如，國際專利WO90/14837；RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第19版，1995；VanNest等，“與重組亞單位疫苗一起使用的改進佐劑制劑”，見《Vaccines 92，Modern Approaches to New Vaccines》(Brown等編輯)冷泉港實驗室出版社，第57-62頁(1992)；和Ott等，“MF59-設(shè)計和評估安全有效的人疫苗佐劑”，見《Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach》(Powell，M.F.和Newman，M.J.編輯)Plenum Press，紐約(1995)，第277-296頁。
為了生產(chǎn)直徑小于1微米的顆粒，許多技術(shù)都是可以應(yīng)用的。例如，可以使用商業(yè)乳化器，其運作原理是迫使流體在高壓下穿過小孔形成高剪切力。商業(yè)乳化器的例子包括但不局限于，110Y型微型流化床裝置(Microfluidics，Newton，Mass.)、Gaulin型號30CD(Gaulin，Ine.，Everett，Mass.)和Rainnie Minilab型8.30H(Miro Atomizer Food andDairy，ine.，Hudson，Wis.)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定用于各乳化器的合適壓力。
粒徑可用例如整合了氦-氖激光器的光度計通過如激光散射來測定。通常地，粒徑在室溫下測定，并涉及對待測樣品的多次分析(如5-10次)，從而得到顆粒直徑的平均值。粒徑還可用掃描電子顯微鏡(SEM)、光子相干分光術(shù)和/或激光衍射方法方便地測定。本文所用的顆粒是由惰性、可滅菌、無毒且優(yōu)選地生物可降解的材料制成的。
以下是實施本發(fā)明的具體實施方案的實施例。實施例只供舉例闡明目的，并未意圖以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1進行實驗測定編碼分泌型胚胎堿性磷酸酶(SEAP)的DNA在小鼠內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達水平，測定在與DNA不化學(xué)結(jié)合的顆粒存在或不存在的情況下進行，其中通過電穿孔(EP)增強DNA的遞送。在第一組中，質(zhì)粒pSEAP-2對照(Clontech實驗室有限公司，編號#6052-1)(GenBank登錄號U89938)包含編碼SEAP抗原的DNA，與1xPBS混合，以5μg于50μl中的劑量注射入無毛小鼠(n＝5只)兩腿的脛骨肌。
在第二組中是5只無毛小鼠，用與第一組相同的技術(shù)施用DNA，然后基本上在同一時間進行電穿孔，在此情況下，是在DNA注射后立即用兩針電極進行電穿孔，兩針間距為0.5cm，由ECM830脈沖發(fā)生器(Genetronics)提供如下電參數(shù)6個脈沖，50V，持續(xù)時間20ms，5Hz。
在第三組的5只無毛小鼠中，用與第一組相同的技術(shù)施用DNA，與之一起施用的是與DNA不化學(xué)結(jié)合的佐劑金顆粒。顆粒大小為直徑1.6μm。先稱重金顆粒(每個注射位點0.5mg)，然后與DNA的1xPBS溶液混合。恰在注射前將DNA與顆粒混合在一起。
在第四組的5只無毛小鼠中，用上述的同一技術(shù)施加DNA、電穿孔和金顆粒，但電穿孔是在注射后10-30秒內(nèi)進行的。
用SEAP報道基因檢測試劑盒(Roche)檢測小鼠血清中的基因表達。
這些實驗的結(jié)果以圖解形式總結(jié)于圖1和下表3中，顯示了與單獨注射DNA或注射DNA和顆粒但都未使用電穿孔的方式相比，佐劑顆粒和電穿孔的聯(lián)合使用導(dǎo)致了更高水平的可檢測基因表達。此外，第三天和第七天在接受佐劑顆粒和電穿孔聯(lián)合的小鼠中檢測到的基因表達水平可比得上或高于在第三和第七天從接受DNA和電穿孔但無顆粒佐劑施用的小鼠檢測到的表達水平。
表3
“DNA+顆粒+EP”和“DNA+EP”之間的t-檢驗p-值為獨立的(0.32)，成對的(0.467)。
“ng/ml”指每ml血清中SEAP抗原的ng數(shù)。
實施例2在進行電穿孔增強的DNA疫苗接種后顆粒對免疫應(yīng)答的影響進行進一步試驗以便(1)測定施用與DNA疫苗不化學(xué)結(jié)合的佐劑顆粒是否對使用電穿孔增強的DNA疫苗接種所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答具有加性效應(yīng)或不只是加性效應(yīng)，和(2)比較是否不同的靶組織(皮膚和肌肉)產(chǎn)生不同的免疫應(yīng)答。
試驗選擇了兩種靶組織肌肉和皮膚。對于各種靶組織來說，DNA疫苗都施用于四組小鼠(見下表4)。金顆粒和DNA一起同時經(jīng)肌內(nèi)(i.m.)或皮內(nèi)(i.d.)注射入小鼠，隨后進行電穿孔；金顆粒和DNA不是化學(xué)結(jié)合的。小鼠被致敏后，分別在免疫后的4周和8周加強注射兩次。在2、4、6、8和10周檢測血清中抗疫苗DNA所編碼的特異抗原的抗體；評估初次和再次抗體免疫應(yīng)答。
表4
材料和方法小鼠Balb/c，實驗組大小6只小鼠DNA編碼乙肝病毒表面抗原(HbsAg)的ElsAg表達載體。為了得到HbsAg表達構(gòu)建體，將pAMS(ATCC)的BamHI片段1.4kb插入真核表達載體pEF-BOS中，該真核表達載體在Puc119原核載體骨架中包含人延伸因子1α啟動子和第一內(nèi)含子及來自G-CSF cDNA的聚腺苷酸化信號(S.Mizushima等，核酸研究(Nucleic Acids Research)185322，1990)。pAM6(ATCC編號45020)是HBV血清型adw的基因組克隆，而1.4kb的BamHI片段被證實編碼“小”HBV表面抗原(HbsAG)(A.M.Moriarty等，美國國家科學(xué)進展(Proc.Natl.Acad.Sci.)(USA)782606-2620，1981)。
為進行免疫，對于每只小鼠，在兩個位點的每一個施用溶于50μl PBS的DNA 10μg(脛骨肌)，或溶于25μl PBS的DNA 10μg(皮膚位點)。金顆粒與DNA混合，但不化學(xué)結(jié)合，然后與DNA一起注射。在每一注射位點施用約0.5mg顆粒。
實驗(1)用具有定量板的ABBOTT AUSAB EIA測定抗HbsAg的抗體，單位mIU/ml。(2)用抗HbsAg的ELISA測定終點抗體效價。
顆粒BioRad Biolistic 1.6微米金顆粒；目錄號1652264免疫位點和模式(1)對于肌內(nèi)注射來說，注射位點是兩條后腿的脛骨前肌，(2)對于皮內(nèi)注射來說，注射位點是下背的背部皮膚上兩個位點，用針和注射器注射。用與初始或致敏免疫相同的方案分別在第4周和8周時進行第一和第二次加強免疫。
電穿孔條件(1)對于肌內(nèi)注射，用Genetronics 2針陣列電極在脛骨肌處進行電穿孔。針距5mm，電脈沖由ECM830脈沖發(fā)生器提供，設(shè)置如下50V，20msec，6個脈沖，5Hz。(2)對于皮內(nèi)注射，用Genetronics彎電極(電極寬度1mm)在背部皮膚處進行電穿孔，兩電極間絕緣(0.2mm)，電脈沖由ECM830脈沖發(fā)生器提供，設(shè)置如下70V，20msec，3個脈沖，5Hz。
結(jié)果下表5顯示了肌內(nèi)和皮內(nèi)施用多核苷酸和顆粒后ELISA測定抗HbsAg抗體終點效價的結(jié)果表5
下表6顯示了肌內(nèi)(i.m.)和皮內(nèi)(i.d.)施用多核苷酸和顆粒后AUSYME EIA測定抗HbsAg抗體效價的結(jié)果，單位為mIU/ml(GMT)。
表6
*GMT＝從應(yīng)答個體中計算得到的幾何平均效價。每組應(yīng)答個體的數(shù)目，適用時，顯示于括號中。
下表7顯示了對肌內(nèi)(i.m.)和皮內(nèi)(i.d.)施用多核苷酸和顆粒后細胞應(yīng)答的同種型研究結(jié)果。
表7
結(jié)論如表5和6所總結(jié)的，研究結(jié)果顯示使用與DNA疫苗不化學(xué)結(jié)合的佐劑顆?？梢栽鰪婋娸o助的DNA疫苗接種的免疫應(yīng)答。例如，正如初次免疫后產(chǎn)生的強抗體效價顯示的，與其它已描述的方法相比，利用本發(fā)明方法產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的動力學(xué)較快。此外，免疫應(yīng)答中免疫應(yīng)答量的增加明顯提前了在進行電穿孔的情況下，使用顆粒佐劑經(jīng)一次加強后獲得的效價與不使用顆粒佐劑經(jīng)兩次加強后獲得的效價相似。免疫應(yīng)答的性質(zhì)(例如，Th1應(yīng)答的出現(xiàn))不會由顆粒佐劑的存在而改變?nèi)缬伤^察到的主要IgG2同種型所顯示的，DNA疫苗接種引起主要的Th1應(yīng)答。
將與DNA疫苗不化學(xué)結(jié)合的佐劑顆粒和電輔助的疫苗遞送進行聯(lián)合，顯示出在DNA疫苗接種后的早期(初次免疫后及第一次加強免疫后)對免疫應(yīng)答具有協(xié)同效應(yīng)(比加性效應(yīng)好)。
實施例4檢測疫苗接種后細胞應(yīng)答(Th1型)的誘導(dǎo)的一種方法是，估計免疫接種為被治療個體在隨后用腫瘤細胞系攻擊時提供的保護水平，所說的腫瘤細胞系表達用于免疫接種的抗原。在被免疫的動物中，抗原修飾的腫瘤細胞將被CTL殺死，而未修飾的腫瘤細胞將不會被免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，從而使腫瘤得以生長。通過用CT26細胞克隆C12注射被免疫的小鼠來實現(xiàn)腫瘤攻擊，所說的CT26細胞已通過ElsAg表達載體的轉(zhuǎn)染而改造成表達HbsAg抗原(見上文實施例2)。作為對照，用未修飾的野生型細胞系(稱MDA)注射被免疫的小鼠。腫瘤攻擊測試的結(jié)果如下表8所示。
表8
“腫瘤負擔(dān)”是指在CT26細胞施加后的指定時間點顯示有任何腫瘤生長的動物數(shù)目。因為在用HbsAg表達細胞攻擊時大部分動物都得到保護，故存在腫瘤抗原特異性CTL細胞并該細胞由DNA免疫方案誘導(dǎo)。當(dāng)用不表達腫瘤抗原的相同細胞系注射動物時，除了兩只之外，所有其它動物都在遭受攻擊后3周死于腫瘤，剩下的兩只動物此后未存活1周。
如表8中的數(shù)據(jù)所示，所有模式的DNA疫苗接種在初次免疫和兩次加強免疫后都產(chǎn)生了足夠的細胞免疫應(yīng)答，從而為腫瘤細胞系的攻擊提供實質(zhì)的保護，其中所說的腫瘤細胞系表達用于免疫的抗原。野生型細胞系(MDA)的致瘤力為快速和致死的腫瘤生長所證實。因而，本發(fā)明的方法在不改變期望的細胞應(yīng)答的情況下增強了免疫原性作用。
實施例5進行進一步的測試來測定在施用DNA疫苗和產(chǎn)生電場后于不同時間施加佐劑顆粒是否會增強免疫應(yīng)答。在三組小鼠(每組10只)中進行DNA疫苗接種和電穿孔。在電穿孔的時候?qū)ζ渲幸唤M施加金顆粒。第二組在電穿孔后1天接受金顆粒，第三組不接受任何顆粒。小鼠接受致敏，然后在第四周，即第一次加強免疫的時間檢測血清中疫苗特異的抗體，在第6周，即加強免疫后2周測定再次抗體免疫應(yīng)答。
小鼠C57/B16實驗組大?。?0只小鼠。
DNA用25μg DNA于50μl PBS中在每一位點施加編碼乙肝病毒表面抗原(HbsAg)的ElsAg-表達載體。對1天組小鼠施加與DNA混合但不化學(xué)結(jié)合的金或于50μl PBS中的金顆粒，每肌肉施加1mg。
試驗用帶定量板的ABBOTT AUSAB EIA測定抗HbsAg的抗體，單位為mIU/ml。
顆粒BioRad Biolistic 1.6微米金顆粒；目錄號1652264免疫位點和模式兩條后腿的脛骨前肌，用針和注射器。
電穿孔條件用針距5mm的Genetronics 2針陣列電極，電脈沖由ECM830脈沖發(fā)生器提供，設(shè)置如下100V，25msec，6個脈沖，5Hz。
這些實驗的結(jié)果顯示于下表9中，表明了與不存在顆粒時DNA疫苗接種和電穿孔相比，將顆粒與DNA混合(但不化學(xué)結(jié)合)并基本上在電穿孔時施用，可導(dǎo)致增強的免疫應(yīng)答。在遞送DNA時施加佐劑顆粒獲得了更大的增強效果。當(dāng)佐劑顆粒于DNA遞送后一天給予時，與未接受佐劑顆粒的小鼠相比，仍能檢測到免疫應(yīng)答的增強。此外，此實驗顯示，在低應(yīng)答的小鼠株，如實施例5所用的C57/B16小鼠中，顆粒佐劑使小鼠能對所用DNA劑量產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
表9GMT抗HbsAg抗體效價(mIU/ml)
在加強免疫后抗體效價的獨立t-檢驗DNA/電穿孔加顆粒相對于DNA/僅電穿孔p＝0.0069DNA/電穿孔加顆粒相對于DNA/電穿孔加第1天金顆粒p＝0.059DNA/電穿孔加第1天顆粒相對于DNA/僅電穿孔p＝0.040
權(quán)利要求
1.通過給個體施用編碼抗原的多核苷酸來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所說的方法包括a)將免疫原性有效量的至少一種編碼抗原的多核苷酸引入個體靶組織中，施用途徑選自肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下和粘膜內(nèi)途徑；b)基本上在引入多核苷酸的同一時間在靶組織處產(chǎn)生足夠強度的脈沖電場，從而導(dǎo)致多核苷酸進入靶組織細胞中以在其中表達，并導(dǎo)致個體體內(nèi)產(chǎn)生對多核苷酸所編碼抗原的免疫應(yīng)答；及c)在多核苷酸引入和電場產(chǎn)生的數(shù)天內(nèi)將佐劑有效量的顆粒引入靶組織中，其中，多核苷酸和顆粒在引入之前相互之間基本上是不化學(xué)結(jié)合的；其中，與涉及施用編碼抗原的多核苷酸的其它免疫方式所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相比，此方法增強編碼抗原的多核苷酸的免疫原性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中多核苷酸在顆粒之前被引入。
3.權(quán)利要求1的方法，其中多核苷酸在顆粒之后被引入。
4.權(quán)利要求1的方法，其中多核苷酸與顆粒在同一時間被引入。
5.權(quán)利要求1的方法，其中免疫應(yīng)答包括細胞免疫應(yīng)答。
6.權(quán)利要求1的方法，其中免疫應(yīng)答包括體液應(yīng)答。
7.權(quán)利要求1的方法，其中免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生抗多核苷酸所編碼抗原的抗體。
8.權(quán)利要求1的方法，其中免疫應(yīng)答是T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
9.權(quán)利要求1的方法，其中抗原是腫瘤相關(guān)抗原。
10.權(quán)利要求9的方法，其中腫瘤相關(guān)抗原是細胞表面抗原。
11.權(quán)利要求10的方法，其中腫瘤相關(guān)抗原是蛋白質(zhì)、多肽或多糖。
12.權(quán)利要求1的方法，其中多核苷酸是選自以下的形式線性、松弛、環(huán)狀、超螺旋、凝聚和化學(xué)修飾形式。
13.權(quán)利要求1的方法，其中多核苷酸是DNA。
14.權(quán)利要求12的方法，其中多核苷酸包含于載體或質(zhì)粒中。
15.權(quán)利要求1的方法，其中個體是哺乳動物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中哺乳動物是人類。
17.權(quán)利要求15的方法，其中脈沖電場足以引起多核苷酸電轉(zhuǎn)運進入組織細胞。
18.權(quán)利要求17的方法，其中顆粒選自聚合物、脂質(zhì)體、生物相容性材料的微球體和微粒。
19.權(quán)利要求18的方法，其中顆粒選自金、鋁、鈦、鎢和碳微粒。
20.權(quán)利要求19的方法，其中脈沖電場通過在至少兩個電極上施加至少一個電脈沖而產(chǎn)生于靶組織中，所述至少兩個電極位于個體的組織表面或表面以內(nèi)。
21.權(quán)利要求1的方法，其中脈沖電場是引起電穿孔的電場。
22.權(quán)利要求21的方法，其中脈沖電場具有約50V/cm-400V/cm的額定電場強度。
23.權(quán)利要求22的方法，其中脈沖電場具有約100V/cm-200V/cm的額定電場強度。
24.權(quán)利要求1的方法，其中脈沖電場中的脈沖長度約為100μsec-100msec。
25.權(quán)利要求1的方法，其中電脈沖的波形是單極或雙極的。
26.權(quán)利要求1的方法，其中脈沖頻率為0.1-約10KHz。
27.權(quán)利要求1的方法，其中顆粒選自生物相容性材料的微球體和微粒。
28.權(quán)利要求27的方法，其中顆粒是金微?；蚱渌F重金屬微粒。
29.權(quán)利要求27的方法，其中顆粒是鈦、鎢、鋁或碳微粒。
30.權(quán)利要求1的方法，其中顆粒是聚合物或脂質(zhì)體。
31.權(quán)利要求1的方法，其中顆粒的最大平均尺寸在約0.05微米-約20微米的范圍內(nèi)。
32.權(quán)利要求31的方法，其中顆粒的最大平均尺寸在約0.1微米-約3微米的范圍內(nèi)。
33.權(quán)利要求1的方法，其中脈沖電場通過在至少兩個電極上施加至少一個電脈沖而產(chǎn)生于靶組織中，所述至少兩個電極位于個體組織上或組織內(nèi)。
34.權(quán)利要求1的方法，其中至少一個電極通過皮內(nèi)方式插入個體的靶組織中。
35.權(quán)利要求1的方法，其中靶組織是皮膚，而電極包含在彎電極中。
36.權(quán)利要求1的方法，其中靶組織是肌肉，而電極是針電極。
37.權(quán)利要求1的方法，其中該方法間隔地對個體進行重復(fù)以向個體施用加強劑量的抗原或編碼抗原的多核苷酸。
38.權(quán)利要求37的方法，其中加強劑量于選自起始施用后4周、6周和10周的一個或多個間隔時間點施用。
40.權(quán)利要求1的方法，其中多核苷酸編碼來自細菌或病毒病原體的抗原。
41.權(quán)利要求1的方法，其中顆粒在多核苷酸引入和電場產(chǎn)生之前或之后不超過3天引入。
42.通過給個體施用編碼抗原的多核苷酸來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所說的方法包括a)通過肌內(nèi)注射將免疫原性有效量的至少一種編碼抗原的多核苷酸引入個體靶組織中；b)基本上在引入多核苷酸的同一時間在靶組織處產(chǎn)生足夠強度的脈沖電場，從而導(dǎo)致多核苷酸進入靶組織細胞中以在其中表達，并導(dǎo)致在個體體內(nèi)產(chǎn)生對多核苷酸所編碼抗原的免疫應(yīng)答；及c)在多核苷酸引入和電場產(chǎn)生的數(shù)天內(nèi)將佐劑有效量的顆粒引入靶組織中，其中多核苷酸和顆粒在引入之前相互之間基本上是不化學(xué)結(jié)合的；其中，與涉及施用編碼抗原的多核苷酸的其它免疫方式所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相比，此方法增強編碼抗原的多核苷酸的免疫原性。
43.權(quán)利要求42的方法，其中顆粒在多核苷酸引入和電場產(chǎn)生之前或之后不超過3天引入。
44.權(quán)利要求43的方法，其中個體是哺乳動物。
45.權(quán)利要求44的方法，其中哺乳動物是人類。
46.權(quán)利要求44的方法，其中脈沖電場足以引起多核苷酸電轉(zhuǎn)運進入組織細胞。
47.權(quán)利要求46的方法，其中顆粒選自聚合物、脂質(zhì)體、生物相容性材料的微球體和微粒。
48.權(quán)利要求47的方法，其中顆粒選自金、鋁、鈦、鎢和碳微粒。
49.權(quán)利要求48的方法，其中脈沖電場通過在至少兩個電極上施加至少一個電脈沖而產(chǎn)生于靶組織中，所述至少兩個電極位于個體的肌肉內(nèi)或肌肉上。
全文摘要
本發(fā)明提供增強DNA疫苗施用所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法。在本發(fā)明的方法中，將編碼抗原的DNA疫苗及不化學(xué)結(jié)合的佐劑顆?；旧嫌谕粫r間注射入個體的肌肉、皮膚或粘膜組織，然后使該組織接受足夠強度的脈沖電場作用，從而導(dǎo)致DNA疫苗進入靶組織的細胞中。與DNA疫苗單獨施用或?qū)⑵浞謩e與脈沖電場或佐劑顆粒單獨聯(lián)合施用相比，本發(fā)明的方法使個體對抗原的免疫應(yīng)答得到了增強。
文檔編號A61K45/06GK1638780SQ02827127
公開日2005年7月13日 申請日期2002年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月14日
發(fā)明者L·張, G·維德拉, D·P·拉比賽 申請人:遺傳電子公司