專利名稱：制備皮膚移植物的方法和裝置以及由此制備的移植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于組織的微器官領(lǐng)域，如基于組織的治療微器官。
背景技術(shù)：
已知多種遞送治療劑的方法。例如，治療劑可以口服、經(jīng)皮、通過吸入、通過注射、通過貯存緩釋而遞送。在各種情況中，遞送方法受到接受藥物的機(jī)體處理、需要頻繁給藥，及對(duì)可使用的分子大小的限制的限制。在一些方法中，給藥間治療劑的量變化。
本文描述了用于制備和使用治療微器官的方法和裝置，治療微器官(therapeutic micro-organ)在本文中稱為TMO，其用于產(chǎn)生和/或給予治療劑。
一般而言，微器官和治療微器官的一些方法及用途在美國(guó)專利5,888,720、PCT申請(qǐng)PCT/IL01/00979、歐洲申請(qǐng)01 204 125.7和美國(guó)專利申請(qǐng)09/589,736中有描述，這些文獻(xiàn)引入本文作參考。這些文獻(xiàn)也包括現(xiàn)有技術(shù)綜述，本文不再對(duì)其進(jìn)行重復(fù)。它們還包括有關(guān)TMO可能的用途以及可能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的類型的信息。
授予Mitrani的美國(guó)專利5,888,720和6,372,482以及未公布的專利申請(qǐng)09/589,736、PCT/IL01/00979和EP 01 204 125.7提供了有關(guān)制備和保持微器官以及制備和保持經(jīng)遺傳修飾的微器官的一些信息，這些文獻(xiàn)引入本文作參考。這些信息的一部分，包括關(guān)于保持所需的營(yíng)養(yǎng)物及氣體的信息和遺傳修飾可能性的信息可應(yīng)用于本發(fā)明的一些實(shí)施方案中。由于本發(fā)明主要涉及制備、保持和使用微器官和治療微器官的改進(jìn)的技術(shù)，因此沒有重復(fù)這些文獻(xiàn)中描述的細(xì)節(jié)。
作為一般原則，按照?qǐng)D1所示的方法產(chǎn)生試劑。首先，小規(guī)模制備治療分子并測(cè)試其功效(10)。然后，開發(fā)用于大量制備可能是蛋白質(zhì)的治療分子的方法(12)。這些分子必需被分送(14)、貯存(16)，然后注射(18)，或者以其他方式引入患者中(20)。

發(fā)明內(nèi)容
本文描述用于制備和使用微器官和治療微器官的方法和裝置。
本文所用定義本文中使用的術(shù)語(yǔ)“外植塊”指來自個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)器官的活組織的移取部分。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“微器官”指來源于外植塊的組織結(jié)構(gòu)，所述外植塊以對(duì)細(xì)胞活力和功能有益，同時(shí)保持至少一些體內(nèi)相互作用的方式制備。微器官由兩個(gè)或多個(gè)鄰接的組織層構(gòu)成，保留了它們所來源于的一個(gè)或多個(gè)器官的微結(jié)構(gòu)，使足夠的營(yíng)養(yǎng)物和氣體能夠被動(dòng)擴(kuò)散至其細(xì)胞，并且使細(xì)胞排泄物能夠被動(dòng)擴(kuò)散出所述細(xì)胞，以便使細(xì)胞毒性減至最低并且使因營(yíng)養(yǎng)不足和代謝物積聚引起的細(xì)胞死亡減至最低。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“供體”指從其移取該外植塊的個(gè)體，所述外植塊用于形成一個(gè)或多個(gè)微器官。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“治療微器官”指已經(jīng)遺傳改變，以產(chǎn)生治療劑，如蛋白質(zhì)的微器官。該治療劑可以是或可以不是天然存在的機(jī)體物質(zhì)。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“植入”指將一個(gè)或多個(gè)微器官或TMO引入受者中，其中所述微器官或TMO可以來源于該受者的組織，也可以來源于另一個(gè)體或動(dòng)物的組織。該微器官或TMO可以通過移植入該受者的皮膚、通過皮下植入或通過置于該受者中的其他理想的位置而植入。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“受者”指將一個(gè)或多個(gè)微器官或TMO植入其中的個(gè)體。
盡管為了使表達(dá)清楚完整，本文描述了制備和使用TMO的所有方面，并且從過程的開始至結(jié)束描述了本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，但應(yīng)理解，本文所描述的每一方面均可用其他方法和/或設(shè)備以實(shí)現(xiàn)其他方面，并且均可用于其他目的，它們中的一些在本文中有描述。本發(fā)明包括關(guān)于制備和保持用于轉(zhuǎn)化為TMO的部分的微器官。應(yīng)理解，根據(jù)本發(fā)明的這些方面制備的微器官除用于轉(zhuǎn)化為TMO外，還可用于其他目的。
一般而言，TMO的制備包括(1)從要治療的患者或動(dòng)物，或者從相同或不同類型的另一個(gè)人或動(dòng)物獲取組織樣品；(2)從該組織制備有活力的微器官或微器官結(jié)構(gòu)；(3)對(duì)該微器官進(jìn)行遺傳改變；和(4)優(yōu)選地，驗(yàn)證由經(jīng)改變的微器官(TMO)產(chǎn)生理想的藥物(例如蛋白質(zhì))。TMO的應(yīng)用包括在患者或動(dòng)物自己體內(nèi)產(chǎn)生治療物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，用于治療。例如，可以將TMO植入受者的皮膚內(nèi)或移植至受者的皮膚上，以在體內(nèi)產(chǎn)生該藥物。在來自另一個(gè)體的組織的情況下，任選地保護(hù)該移植物免受受者免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，例如，通過將TMO封閉于免疫保護(hù)膠囊或外殼中。例如，將膜置于該TMO周圍，這通過在移植前將該TMO置于膠囊中，或以其他方式進(jìn)行。該膜的孔徑應(yīng)足夠大，以允許營(yíng)養(yǎng)物、排泄物和該治療劑通過，同時(shí)，該孔徑應(yīng)足夠小，以使免疫系統(tǒng)的細(xì)胞不能通過。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)主要方面涉及采集適合制備微器官的組織樣品的裝置和方法。在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，將皮膚組織用作TMO的基礎(chǔ)?；蛘?，該組織可以是肺、腸、肌肉或肝組織。任何組織都可能使用。已證明多種組織類型，例如皮膚、肺、肝均適于制備微器官?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的任何移取組織的方法從機(jī)體移取要采集的組織，如活檢程序。優(yōu)選地，采集程序保持來源組織的微結(jié)構(gòu)的完好。
例如，在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，當(dāng)皮膚是被采集的組織時(shí)，通過提升該組織表面、切割皮膚切片達(dá)特定的深度而采集組織樣品。該切片足夠厚，以包括所有理想的皮膚層。任選地，理想的層包括整個(gè)表皮和至少部分真皮下層(一直到并且包括皮膚的完整厚度)，相當(dāng)于0.3至3毫米厚，取決于切取樣品的皮膚所在的位置。當(dāng)使用包括表皮和部分真皮(包括全部細(xì)胞層、基質(zhì)和組成真皮的真皮基質(zhì)結(jié)構(gòu))的皮膚結(jié)構(gòu)，并將其加工成微器官時(shí)，所采集的組織的活力在體內(nèi)和體外均可保持較長(zhǎng)時(shí)間，然后用于移植。本文中使用的動(dòng)詞“切”和“切片”用于表示使用鋒利的刀片或刀片樣物體使組織的一部分與另一部分分離。
采集后，必需從所采集的樣品制備適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)，使其在體外具有活力，并且優(yōu)選在再植入時(shí)在體內(nèi)具有活力。此樣品優(yōu)選包括全部活的層，并且足夠薄以使來自保存樣品的培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)物能夠擴(kuò)散到該樣品的所有部分，而排泄物能夠擴(kuò)散到培養(yǎng)液中使其可被任選地從其除去(或在更新培養(yǎng)液時(shí)除去)。從外表面到每個(gè)細(xì)胞的距離優(yōu)選為100到400微米，但距離小些或者稍微大些也可以保持活力。實(shí)際上，在某些情況下，能夠成功使用大至500、600甚至1000微米的距離。當(dāng)然，切片本身的厚度是最大距離的兩倍。
本文背景技術(shù)部分描述的現(xiàn)有技術(shù)方法有其局限性，因?yàn)樗鼈儧]有提供在切取過程中穩(wěn)定組織的方法。因此，通過這些方法獲得的組織切片通常在寬度和形狀上不均勻。另外，該微器官的長(zhǎng)度也有限，只有簡(jiǎn)單的平行六面體形狀的片能夠形成，這使加工和應(yīng)用該微器官更加困難。而且，皮膚的上皮層堅(jiān)韌，切片時(shí)鋒利的刃趨于使樣品變形。另外，皮膚趨于粘附到其接觸的任何表面上，使切取過程更復(fù)雜。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面涉及從組織樣品制備微器官。根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，使用一個(gè)組裝設(shè)備的多個(gè)切割刀片，在支持基板上使用沖壓操作作用于皮膚樣品，從而將所采集的皮膚樣品切成微器官，而不是采用簡(jiǎn)單的切割操作。在一個(gè)實(shí)施方案中，刀片排列成兩組。兩組刀片互相交錯(cuò)，但沿刀片的長(zhǎng)度有輕度位移。當(dāng)用這種切割器沖壓組織樣品時(shí)，樣品交替的端如同在手風(fēng)琴中那樣地相連。當(dāng)將樣品拉出時(shí)，產(chǎn)生寬度和厚度(進(jìn)入皮膚的深度)基本均勻的長(zhǎng)的樣品。如本文所描述的，這種樣品相對(duì)容易處理、具有相對(duì)大的組織體積，并且在準(zhǔn)備使用時(shí)可以切成任意合適的長(zhǎng)度。由于它是均勻的，每一部分的產(chǎn)生治療物質(zhì)的能力基本相同，因此可以根據(jù)整個(gè)樣品在體外產(chǎn)生治療物質(zhì)的能力確定，例如用于植入個(gè)體中所需的樣品長(zhǎng)度。盡管以上描述了制備線性結(jié)構(gòu)的一般方法，其也可以修改以用于制備網(wǎng)或其他有用的微器官結(jié)構(gòu)。
通過上述方法或任何其他方法使該樣品形成合適的微器官結(jié)構(gòu)后，任選地對(duì)該微器官進(jìn)行遺傳改變?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任意方法對(duì)該組織進(jìn)行遺傳改變。一個(gè)代表性方法是用重組病毒載體將基因插入該組織的細(xì)胞中。如本領(lǐng)域所知，可以使用多種不同載體中的任意一種，如病毒載體、質(zhì)粒載體、線性DNA等，以將編碼治療劑的外源核酸片段導(dǎo)入靶細(xì)胞和/或靶組織中。例如，可以使用以下任意方法插入這些載體感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、二乙氨乙基葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、生物粒子基因傳遞(biolistic gene delivery)、使用fusogenic和陰離子脂質(zhì)體(它們是陽(yáng)離子脂質(zhì)體使用的替代)的脂質(zhì)體基因傳遞、直接注射、受體介導(dǎo)的攝取、磁穿孔及其他本領(lǐng)域已知的方法。通過將該載體導(dǎo)入該微器官周圍而使該載體能夠與該微器官的細(xì)胞反應(yīng)，完成基因的插入。一旦將外源核酸片段引入該細(xì)胞中，由此核酸片段編碼的治療劑的產(chǎn)生速度就可以得到定量。
如上所述，在加工過程中該微器官與營(yíng)養(yǎng)液相接觸。因此，由該微器官產(chǎn)生的治療劑被分泌入溶液中，在該溶液中其濃度可以得到測(cè)量。
經(jīng)過或未經(jīng)遺傳改變的微器官可以幾中方式使用。其一是將其(或者是所制備的總量的一部分)植入個(gè)體中。在本發(fā)明的重要的代表性實(shí)施方案中，將該TMO植入其所來源于的同一個(gè)體中。例如，可以將遺傳改變的皮膚植入該個(gè)體的皮膚下或移植到該個(gè)體的皮膚上。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明，這種移植物將在體內(nèi)在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生該治療劑。
或者，可以將該TMO在體外保存，并且可以將保留在該TMO周圍的上清培養(yǎng)液中或從中分離的治療劑注射或施用于同一或不同的個(gè)體。
或者或進(jìn)一步地，可以通過本領(lǐng)域已知的方法低溫保存該微器官或TMO，例如，從組織樣品形成遺傳改變后立即在含10％DMSO的DMEM中逐步冷凍(0℃、-20℃、-80℃、-196℃)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，所植入的TMO的量由以下之一或多個(gè)條件確定依據(jù)針對(duì)相似個(gè)體已制定的使用方法、特定的臨床方案或人口統(tǒng)計(jì)學(xué)，通常給予這種個(gè)體的相同治療蛋白的相應(yīng)量；和在該同一個(gè)體以前曾通過注射或其他途徑接受同一治療蛋白時(shí)，對(duì)該同一個(gè)體特定的同一治療蛋白的相應(yīng)量。
個(gè)體數(shù)據(jù)，如體重、年齡、身體狀況、臨床狀況；來自以前對(duì)其他相似個(gè)體TMO給藥的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)以前對(duì)該個(gè)體TMO給藥的反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，從微器官/TMO的獲取至植入中，使用密閉模塊裝置負(fù)載、支持和改變之。理想地，使用密閉、任選地?zé)o菌的模塊完成整個(gè)過程，在無菌、受控的環(huán)境下在模塊之間傳送該微器官/TMO，而不手工處理該微器官/TMO。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，各模塊有匹配的端口，從而可以容易地在各模塊之間傳送微器官/TMO，并且使各模塊可以配合來完成該過程。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，將該模塊裝置安裝于一個(gè)或多個(gè)系列的對(duì)接站(docking station)中，在其中完成該過程和/或在其中保持該微器官/TMO。這一過程可任選地用計(jì)算機(jī)根據(jù)協(xié)議控制。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，僅將一部分所制備的TMO用于給定的治療階段。剩余的TMO部分返回以保存(或者低溫貯存、或者以其他方式保存)，以后使用。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案的特點(diǎn)是將大量微器官一起加工成TMO。這使確定TMO的分泌及確定劑量更加容易并且更加準(zhǔn)確。
因此，根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，提供了從個(gè)體采集組織樣品的方法，所述方法包括將該組織樣品的一部分的外表面貼附至基本平的表面區(qū)；提升該表面區(qū)和組織的部分；和于所述部分的表面以下以給定距離切片組織，以分離該組織部分和該個(gè)體。任選地，所述的貼附由真空吸引器提供。或者或進(jìn)一步地，所述貼附包括給所述基本平的區(qū)提供粘合表面。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，提升包括于平的表面區(qū)的延伸部分之間放置支持元件，使得該部分的表面基本升起到高于周圍組織表面水平的所述給定距離。任選地，切片包括在與從所述組織表面看的支持元件遠(yuǎn)端表面基本相同的水平上切片。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該組織是皮膚，而該組織表面是皮膚的外表面。任選地，該給定距離為0.3至3毫米。任選地，該距離為0.5至1.5毫米。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，所采集的組織的尺寸為3至150毫米。任選地，最小尺寸為5至20毫米?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，最大尺寸為20至60毫米。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，提供了切皮刀(dermatome)，其包括適于將組織表面粘附至其表面的組織負(fù)載器；適于提升所述組織表面的一部分的提升器；和裝配的切割刀片，其用于基本平行于所述表面，在所述表面下以受控的距離切割組織。任選地，該負(fù)載器表面形成有孔，并且進(jìn)一步包括真空源，其在所述孔處提供真空，從而提供所述的粘附功能?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，運(yùn)送器表面是粘附表面，由此提供所述的適于粘附。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，所述切割刀片在推進(jìn)的同時(shí)從一側(cè)向另一側(cè)移動(dòng)，以提供切片作用?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，在所述切割過程中，該切割刀片與該負(fù)載器表面相距受控的距離?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，在所述切割過程中，該切割刀片與該皮膚表面相距受控的距離。任選地，該切皮刀包括導(dǎo)軌，其用以將所述刀片以受控的距離設(shè)置。
因此，根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，提供了由組織形成的微器官結(jié)構(gòu)，其包括至少兩個(gè)微器官部分，其中所述至少兩個(gè)微器官通過連接點(diǎn)互相連接，所述連接點(diǎn)由形成該微器官的所述組織形成。任選地，至少三個(gè)微器官通過同一連接點(diǎn)互相連接，所述連接點(diǎn)由與形成所述微器官相同的組織形成。在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，提供了由上述微器官的連接點(diǎn)形成的微器官網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中多個(gè)所述連接點(diǎn)由微器官互相連接，其中至少一個(gè)這樣的微器官在該微器官的一端連接至所述連接點(diǎn)之一，并且在所述微器官的另一端連接至另一個(gè)連接點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，還提供了分段線性微器官結(jié)構(gòu)，其具有互連連接點(diǎn)，其中至少一些互連連接點(diǎn)有兩個(gè)線性微器官與之相連。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，還提供了分段線性微器官結(jié)構(gòu)，其具有互連連接點(diǎn)，其中至少一些所述互連連接點(diǎn)有多于兩個(gè)的線性微器官與之相連。任選地，每個(gè)互連連接點(diǎn)有四個(gè)線性微器官結(jié)構(gòu)與之相連。任選地，該線性微器官結(jié)構(gòu)與該連接點(diǎn)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該線性微器官與該連接點(diǎn)形成超線性結(jié)構(gòu)，所述超線性結(jié)構(gòu)包括一串交替的微器官與連接點(diǎn)。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該微器官由多個(gè)組織層構(gòu)成，并且其中該連接點(diǎn)包括相同的層。任選地，該連接點(diǎn)是微器官。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，提供了微器官結(jié)構(gòu)，其中該微器官由多個(gè)組織層構(gòu)成，并且其中該連接點(diǎn)包括較該微器官少的層。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，微器官用人皮膚組織作為該作組織。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，還提供了用于通過切割而從大塊組織制備微器官的裝置，其包括a)包括多個(gè)鄰接的切割刀片的切割陣列，所述切割刀片沿其各自長(zhǎng)度的至少一段彼此間非常接近且互相平行地配置，并且沿所述段彼此間保持大致相等的距離，使得所述鄰接的切割刀片的刀刃沿所述段以約200微米至約2000微米的切片距離分開；b)組織樣品負(fù)載器，其適于固定組織切片，使得當(dāng)被固定在所述負(fù)載器上的所述組織被按壓于所述切割陣列上時(shí)，所述組織被所述切割刀片切割。任選地，該裝置包括可移出護(hù)罩，所述可移出護(hù)罩包括至少一個(gè)插入物，所述插入物與切割刀片的平行的段間相適應(yīng)，而不妨礙刀片的切割作用。任選地，該至少一個(gè)插入物包括多個(gè)所述插入物。任選地，所述多個(gè)插入物連接在一起，以便它們可以一起插入切割刀片之間或一起從切割刀片之間移出?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，多個(gè)線性插入物在其末端連接在一起。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該裝置包括用于在所述樣品負(fù)載器和所述切割陣列之間施加壓力的工具。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，全部切割刀片有相同的長(zhǎng)度，使得它們從組織樣品切下多個(gè)線性微器官。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，切割刀片具有基本上相同的長(zhǎng)度，但縱向地彼此偏移，使得它們切下多個(gè)線性微器官，所述線性微器官在其交替的末端通過連接點(diǎn)微器官結(jié)構(gòu)連接于鄰接的線性微器官。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該切割陣列包括至少三組在以給定的間隔隔開的刀片的線性陣列中各自首尾相接排列的多個(gè)刀片，其中所述線性陣列并排排列，一個(gè)陣列的間隔位于鄰接陣列的間隔之間。任選地，該給定的間隔是切片間隔的0.5至2倍。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，全部切割刀片有相同的長(zhǎng)度，且無彼此偏移，并且其中在鄰接刀片的交替末端，刀片的刀刃低于刀片的其余部分的刃，使得刀片從組織切下多個(gè)線性微器官，所述線性微器官通過連接點(diǎn)相連，所述連接點(diǎn)較組織的完整厚度薄。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，全部切割刀片有相同的長(zhǎng)度，且無彼此偏移，并且其中形成在相應(yīng)于鄰接刀片的交替末端的位置具有凹陷的組織固定器，使得刀片從組織切下多個(gè)線性微器官，所述線性微器官通過連接點(diǎn)相連，所述連接點(diǎn)較組織的完整厚度薄。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該切割陣列包括至少三個(gè)刀片，所述刀片在其上周期性隔開地具有低于該刀片的其余部分的切削表面的表面的刀刃，其中所述線性陣列并排排列，一個(gè)刀片的較低切削表面位于鄰接刀片的較低切削表面之間，使得在較低切削表面形成一系列連接點(diǎn)，所述連接點(diǎn)的厚度小于該組織樣品的厚度。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該切割陣列包括至少三個(gè)刀片，并且其中形成在其上具有周期性隔開的凹陷的多個(gè)平行陣列的組織負(fù)載器，所述凹陷相應(yīng)于所述切割刀片的位置，一個(gè)陣列的凹陷位于鄰接陣列的凹陷之間，使得在凹陷處形成一系列連接點(diǎn)，所述連接點(diǎn)的厚度小于該組織樣品的厚度。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，所述刀片呈一系列同心圓排列，以所述切片間隔隔開，使得多個(gè)環(huán)形的微器官?gòu)脑摻M織產(chǎn)生。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，如上述，所述刀片具有連續(xù)螺旋的形式，所述連續(xù)螺旋被所述切片間隔隔開，使得螺旋形式的微器官得以產(chǎn)生。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，所述組織負(fù)載器適于通過真空固定所述組織?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，所述組織負(fù)載器適于通過將所述組織粘附于該負(fù)載器的表面而固定之。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，還提供了通過切割而從組織制備易裝卸的(accessible)微器官或微器官結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括a)提供合適厚度的形成該微器官的組織；b)提供上述的裝置；c)將該組織置于所述裝置的樣品負(fù)載器上；d)使該負(fù)載器上的組織與所述裝置的切割刀片緊密接觸；和e)將所述組織按壓于所述刀片，直到已將所述組織的至少一部分切透其厚度，從而產(chǎn)生至少一個(gè)微器官或微器官結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，還提供了通過切割而從組織制備易裝卸的微器官或微器官結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括a)提供合適厚度的形成該微器官的組織；b)提供上述的裝置，使得所述插入物被置于所述刀片之間；c)將該組織置于所述裝置的組織負(fù)載器上；d)使該負(fù)載器上的組織與所述裝置的切割刀片緊密接觸；e)將所述組織按壓于所述刀片，直到已將所述組織的至少一部分切透其厚度，從而產(chǎn)生至少一個(gè)微器官或微器官結(jié)構(gòu)；和f)通過從所述切割刀片之間移出該罩而從該切割刀片之間移出該至少一個(gè)微器官或微器官結(jié)構(gòu)，從而在移出的罩的表面上處理該切下的微器官。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，按壓包括從該負(fù)載器的一端向另一端轉(zhuǎn)動(dòng)圓柱狀滾筒，在其轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)切割該組織。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，還提供了從組織樣品制備微器官的方法，所述方法包括提供薄組織樣品，所述樣品具有一定厚度和方向垂直于該厚度的長(zhǎng)度；和在該樣品的至少一部分上切透該樣品的厚度，產(chǎn)生微器官，所述微器官至少一維小于2000微米，并且至少另一維大于長(zhǎng)度的最大尺寸。任選地，該切割包括沖壓作用?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，該薄組織樣品是薄的，基本上為矩形的組織樣品，并且其中該切割為一系列基本上直的切器的形式，其基本上平行于一端，所述切割具有相似的長(zhǎng)度，并且于縱向上彼此偏移，以便在該切器的交替末端的交替組織條之間留下所述組織的連接點(diǎn)。任選地，該方法包括展開如此形成的切割樣品以產(chǎn)生伸展的微器官，所述微器官包括由所述連接點(diǎn)連接的組織條。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，切割包括以螺旋形切割。任選地，該方法包括解開該螺旋以提供伸展的細(xì)長(zhǎng)微器官。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，切割包括用一系列同心圓切器切割組織。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，還提供了從組織樣品制備微器官的方法，所述方法包括提供薄組織樣品，所述樣品具有一定厚度和方向垂直于該厚度的長(zhǎng)度；和用多個(gè)切器同時(shí)切透其厚度，所述切器在該切器的縱向排列形成，每一列有多個(gè)被螺距隔開，并且被間隔分開的隔開的切器，交替的列中的切器沿該切器的方向偏移，以便給定列的間隔與鄰接列的切器部分相鄰。任選地，該偏移約等于該螺距的一半，并且每一列的切器基本上以鄰接列的間隔為中心。或者或進(jìn)一步地，鄰接切器之間的距離為200至2000微米。任選地，該距離為500至1500微米。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，鄰接切器之間的距離為鄰接列之間的距離的五分之一至五倍?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，鄰接切器之間的距離為鄰接列之間的距離的一半至兩倍。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該間隔約等于鄰接列之間的距離。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該方法包括拉伸所述切割組織樣品以便其形成網(wǎng)。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，切割包括沖壓作用。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該薄組織樣品是皮膚組織，其至少包括表皮的基底層和部分真皮。任選地，該組織樣品包括整個(gè)表皮?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，該組織樣品包括角質(zhì)層?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，該組織樣品包括大部分真皮。或者或進(jìn)一步地，該樣品包括基本上整個(gè)真皮。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該薄組織樣品厚0.3至3毫米。任選地，該組織樣品厚0.5至1.5毫米。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該切器之間的距離為200至2000微米。任選地，切器之間的距離為500至1500微米。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該刀片的長(zhǎng)度與該刀片之間的間隔的比為1∶1至100∶1。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，提供了用于在微器官的保持和任選的遺傳修飾過程中或者在運(yùn)輸過程中將微器官固定于生物反應(yīng)器中的定位器，該定位器包括
固定器體，其具有一個(gè)或多個(gè)孔，在該孔上固定該微器官；和多個(gè)微器官固定元件，所述元件固定相對(duì)于所述一個(gè)或多個(gè)孔并列的所述微器官，使得所述微器官的超過70％的兩側(cè)得以暴露。任選地，該微器官的兩側(cè)的超過80％得以暴露。任選地，該微器官的兩側(cè)的超過90％得以暴露。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，所述微器官具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且其中所述固定元件包括適于在所述網(wǎng)和所述孔的周圍固定該網(wǎng)的元件。任選地，該固定器包括釘或桿，其通過部分或完全拉伸的網(wǎng)中的開口放置，從而將該網(wǎng)固定于該孔上。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，所述的微器官具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且其中所述固定元件包括適于在其非微器官的周圍固定該網(wǎng)的元件。任選地，該固定器包括釘或桿，其適于穿透或通過其非微器官周圍中的開口放置，從而將該網(wǎng)固定于該孔上。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，所述固定器體是具有圓周槽的環(huán)，所述槽包括所述孔。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該槽的軸向長(zhǎng)度為300至2000微米。任選地，該槽的軸向長(zhǎng)度大于500微米。任選地，該槽的軸向長(zhǎng)度為1毫米或更高。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該固定元件沿該環(huán)的圓周放置，并且適于將長(zhǎng)的微器官以其長(zhǎng)度沿圓周固定，使得在該固定元件之間該微器官得以暴露。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，提供了在微器官的保持和任選的遺傳修飾過程中以及在運(yùn)輸過程中固定微器官的方法，所述方法包括提供具有至少兩個(gè)微器官固定元件的固定定位器；將該微器官固定于所述固定元件中，使得至少該微器官的表面介于各元件之間，并且該表面的所有側(cè)均得以暴露。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，提供了確定要植入患者中的治療微器官的量的方法，所述方法包括通過微器官的體外定量而確定治療劑的分泌水平；評(píng)估該治療劑的體外分泌與體內(nèi)血清水平的關(guān)系；和基于所確定的分泌水平和所評(píng)估的關(guān)系，確定要植入的治療微器官的量。任選地，基于選自下組因素的一個(gè)或多個(gè)因素評(píng)估該關(guān)系a)個(gè)體數(shù)據(jù)，如體重、年齡、身體狀況、臨床狀況；b)來自以前對(duì)其他相似個(gè)體TMO給藥的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)；和c)來自以前對(duì)該個(gè)體TMO給藥的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。
任選地，基于所述因素的至少兩個(gè)來評(píng)估該關(guān)系。任選地，基于所述因素的三個(gè)來評(píng)估該關(guān)系。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，確定要植入患者中的治療微器官的量還基于以下一點(diǎn)或兩點(diǎn)依據(jù)針對(duì)相似個(gè)體已制定的使用方法、特定的臨床方案或人口統(tǒng)計(jì)學(xué)，通常給予這種個(gè)體的同一治療蛋白的相應(yīng)量；和在同一個(gè)體以前曾通過注射或其他給藥途徑接受同一治療劑的情況下，對(duì)同一個(gè)體特定的同一治療劑的相應(yīng)量。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該方法包括依據(jù)所確定的量制備一定量的用于移植的治療微器官。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，還提供了將微器官植入患者中的方法，所述方法包括制備具有已知的皮膚表面方向的微器官；在患者皮膚中形成切口；和將該微器官植入該切口中，其方向相應(yīng)于與皮膚相同的方向。任選地，形成包括形成具有預(yù)定大小和形狀的切口。或者或進(jìn)一步地，所述微器官是皮膚組織微器官。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，植入包括
將該微器官置于該切口中，以便皮膚表面和相應(yīng)的微器官表面處于基本相同的水平。任選地，該方法包括該微器官在所述的水平、適當(dāng)?shù)奈恢脮r(shí)關(guān)閉切口，以便將該微器官固定于適當(dāng)?shù)奈恢谩?br> 在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該微器官是經(jīng)遺傳改變的治療微器官，其分泌治療劑。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，還提供了將微器官植入患者中的方法，所述方法包括刺穿組織表面；從所述孔于皮膚表面下推進(jìn)導(dǎo)管；將細(xì)長(zhǎng)的負(fù)載器插入并穿過該導(dǎo)管，使之穿出該組織的表面，在所述負(fù)載器上的已知位置連接有微器官；定位該負(fù)載器，使得該微器官位于該組織的表面下的導(dǎo)管中的已知位置；和保持該微器官于合適的位置的同時(shí)移出該導(dǎo)管。任選地，該微器官是經(jīng)遺傳改變的分泌治療劑的治療微器官。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，還提供了調(diào)整由植入個(gè)體中的分泌治療劑的治療微器官產(chǎn)生的治療劑的劑量的方法，所述方法包括(a)監(jiān)測(cè)該個(gè)體中的治療劑水平；(b)將該治療劑的水平與理想的水平相比較；(c)如果該水平低于最低水平，則植入追加的治療微器官；和(d)如果該水平高于最高水平，則滅活或移出部分已植入的微器官。任選地，該方法包括周期性地重復(fù)(a)-(d)?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，滅活或移出由移出部分已植入的微器官組成。任選地，移出包括外科手術(shù)移出?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，滅活或移出包括滅活。任選地，滅活包括殺死部分已植入的微器官。任選地，滅活包括消融部分已植入的微器官。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，提供了微器官加工系統(tǒng)，其包括
多個(gè)操作模塊，每個(gè)所述模塊完成從組織樣品制備所述微器官的方法的全部或一部分；和在該方法中，通過該模塊中的端口，不將該組織樣品從該模塊中移出而將該組織樣品或微器官?gòu)囊粋€(gè)模塊傳送至下一模塊的工具。任選地，模塊之一是組織采集器模塊，將其按壓至組織并采集受控厚度的組織表面切片。任選地，所述采集器采集受控長(zhǎng)度和寬度的組織表面切片。或者或進(jìn)一步地，模塊之一是微器官模塊，在其中將該組織樣品切割成一個(gè)或多個(gè)微器官。任選地，該組織樣品固定于樣品負(fù)載器上，并沖壓至切割器上，同時(shí)仍被固定在所述負(fù)載器上，形成微器官。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，模塊之一是微器官模塊，在其中將該組織樣品切成一個(gè)或多個(gè)微器官。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，以迂曲切器切割該組織，使得這樣形成的微器官具有未展開的手風(fēng)琴形狀。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該微器官被傳送至另一模塊，同時(shí)將該微器官展開為長(zhǎng)的超線性形狀，其長(zhǎng)度長(zhǎng)于組織樣品。任選地，該微器官的前沿被傳送至該另一模塊，并且其中展開的微器官被傳送至其中的固定器上。任選地，固定器固定該微器官，使得該微器官僅在其有限的部分接觸表面。任選地，該部分相當(dāng)于小于該微器官的10％。任選地，該部分相當(dāng)于小于該微器官的5％。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該另一模塊安裝有營(yíng)養(yǎng)物入口和排泄物出口，使得該微器官可以保持在其中?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，另一模塊安裝有用于提供轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的入口，使得該微器官可以在其中被遺傳改變?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，該另一模塊安裝有取樣出口，所述取樣出口用于對(duì)其中的周圍液體進(jìn)行取樣?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，該另一模塊安裝有切割裝置，所述切割裝置適于將其中的該微器官切成一個(gè)或多個(gè)更小的塊。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括傳送模塊，所述傳送模塊具有臂，所述臂適于進(jìn)入所述另一模塊的端口并從其中移出至少選定的微器官部分，以傳送至所述傳送模塊。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該模塊具有匹配的端口和連接的機(jī)械裝置，使得材料可以在它們之間傳送而不暴露于外界環(huán)境?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，從引入該組織樣品開始，所述模塊在無菌條件下完成該方法。
根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，提供了用于控制微器官的保持和任選的遺傳改變的微器官加工站，其包括至少一個(gè)用于對(duì)接模塊或多個(gè)相連的模塊的端口；流控(fluidics)控制系統(tǒng)，其用于控制一種或多種液體和排泄物流向至少一個(gè)模塊和從至少一個(gè)模塊流出；和動(dòng)力控制系統(tǒng)，其用于為至少一些模塊中的元件提供動(dòng)力。任選地，該加工站包括真空控制系統(tǒng)，其用于為至少一個(gè)模塊提供受控的真空，用以將材料固定在至少一個(gè)模塊中。任選地，該流控控制系統(tǒng)用于控制至少一種材料的引入，所述材料在一個(gè)模塊中引起微器官的遺傳改變。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該加工站包括包括用于從至少一個(gè)模塊中取液體樣品的取樣機(jī)械裝置?；蛘呋蜻M(jìn)一步地，該加工站包括用于分析液體的一個(gè)或多個(gè)加工參數(shù)的分析器，所述參數(shù)包括葡萄糖、乳酸鹽、溶解氧、溶解二氧化碳、氨、谷氨酰胺、pH、污染物或分泌的治療劑。任選地，該分析器分析液體的由該微器官分泌的治療劑。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該站包括控制器，所述控制器監(jiān)控治療劑的量，并且在該微器官適于植入時(shí)提供指示。任選地，該站包括用于增強(qiáng)該微器官的遺傳改變的工具。任選地，該用于增強(qiáng)的工具包括機(jī)械或聲學(xué)振動(dòng)。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，所述動(dòng)力控制系統(tǒng)控制將組織切割成一個(gè)或多個(gè)微器官。


以下參照附圖描述了本發(fā)明的代表性非限制性實(shí)施方案。在附圖中，出現(xiàn)在多張附圖中的其相同和相似的結(jié)構(gòu)、元件或部分通常用相同或相似的標(biāo)記標(biāo)注在其出現(xiàn)的圖中。圖中所示的組件的大小和特征的選擇主要是為了表達(dá)的方便和清晰，不一定按照比例。附圖是圖1是用于生產(chǎn)和使用藥物的代表性現(xiàn)有技術(shù)“藥物”范例的示意圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案用于生產(chǎn)和使用遺傳改變的微器官(TMO)的代表性方法的示意框圖；圖3A和3B示意根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案從個(gè)體采集皮膚樣品的代表性方法；圖4A-4D顯示在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，用于從組織樣品，例如使用圖3中所示的方法采集的皮膚組織樣品制備微器官的代表性裝置；圖5A-5B顯示在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，從組織樣品，例如使用圖3中所示的方法采集的皮膚組織樣品制備微器官的代表性刀片結(jié)構(gòu)，以及所得的微器官；圖6A-6C顯示根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案的網(wǎng)型微器官結(jié)構(gòu)；圖7顯示根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案的以如下方式切割后的皮膚樣品，該方式使得可以從其形成網(wǎng)型微器官；圖8示意性地顯示根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案的用于切割圖7的式樣的工具；圖9A和9B示意性地顯示根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，用于固定超線性和網(wǎng)型微器官的定位器在其傳送、保持和遺傳修飾之一或多個(gè)的過程中各自的結(jié)構(gòu)；圖10顯示根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案用于加工微器官以制備TMO的簡(jiǎn)單生物反應(yīng)器；圖11顯示根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案用于植入TMO或微器官的工具；圖12A-D顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案在第一皮下植入程序中的連續(xù)步驟；圖13A-E示意根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案在第二皮下植入程序中的連續(xù)步驟；圖14A顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案mINFα-TMO植入前的體外分泌與其植入后的體內(nèi)血清水平之間的相關(guān)分析；圖14B表述根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，在患者中各種注射的重組治療蛋白和在SCID小鼠中由人皮膚TMO產(chǎn)生并遞送的mIFNα的藥代動(dòng)力學(xué)；圖15顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，在不同時(shí)間加工的不同患者的皮膚樣品體外分泌水平的改變程度；圖16顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，移植后SCID小鼠中紅細(xì)胞生成素的升高的水平；圖17顯示作為植入的TMO的不同數(shù)目的函數(shù)的被植入小鼠中紅細(xì)胞生成素的體外反應(yīng)；圖18A和18B分別顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，在小型豬中自體TMO植入后通過ELISA測(cè)定法測(cè)定的升高的血清hEPO水平，以及網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)升高；圖19A-C顯示根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案轉(zhuǎn)導(dǎo)后檢測(cè)的hEPO蛋白體外分泌；圖20顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案密閉無菌微器官加工盒的主要模塊，該模塊被分開以便于目視觀察；
圖21和22顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的組織采集器模塊的操作和細(xì)節(jié)；圖23-25顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案從皮膚組織樣品形成微器官；圖26-28顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的TMO生物加工模塊的一些細(xì)節(jié)和將微器官傳送至其；圖29顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的加工站，其具有多個(gè)盒，每個(gè)盒由多個(gè)模塊組成，并裝入其中；圖30-32顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案將超線性微器官切成片段；圖33示意性地顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的傳送模塊；圖34-37示意性地顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，從生物加工模塊移出微器官/TMO的片段和將它們傳送至傳送模塊；圖38示意性地顯示將微器官/TMO的片段傳送至移植固定器。
具體實(shí)施方案該系統(tǒng)的概述圖2以框圖形式顯示根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，用于制備和使用微器官和遺傳改變的微器官(TMO)的方法200的概況。在202中，從個(gè)體采集組織外植塊。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，該外植塊采集自將在以后接受治療的同一個(gè)體。在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，該樣品是皮膚樣品。任選地，以類似于以下描述的用于皮膚樣品的方式采集和使用其他組織。以下描述的方法是代表性的，其他采集組織樣品的方法，如去除中心部份(coring)、打孔(punching)等可以用于本發(fā)明的一些實(shí)施方案中。此外，一般而言，可以使用任何可商購(gòu)的切皮刀。任選地檢查所采集的樣品以確定其狀況，然后任選地使用以下描述的方法將其傳送至微器官形成裝置。如果需要，可以將該組織外植塊低溫貯存以備后用(即，在該方法的同一階段引入)。
在204中，從該外植塊制備有活力的微器官。為了有活力，該微器官必須至少有一維足夠小，以使?fàn)I養(yǎng)物能夠從與該微器官接觸的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液擴(kuò)散到該微器官的所有細(xì)胞，并且使排泄物能夠擴(kuò)散出該微器官并擴(kuò)散到到該培養(yǎng)液中。這使該微器官在體外能夠在足夠長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)有活力，以便進(jìn)行下述的進(jìn)一步加工，并且任選地進(jìn)一步應(yīng)用該微器官作為治療劑，如蛋白質(zhì)的來源。從該微器官的外表面到保持活力的任意組織的最大距離優(yōu)選應(yīng)小于約1000微米，但更大的距離也可能制備有活力的結(jié)構(gòu)。如下述，從組織樣品制備微器官的方法通常得到有數(shù)月體外壽命的微器官。
制備該微器官后，任選地目視檢測(cè)以確定其正確形成并具有期望的尺寸。檢測(cè)也可以通過光學(xué)進(jìn)行。然后，任選地將其安放至固定器上并傳送(206)到在其中可對(duì)其進(jìn)行遺傳改變的裝置中。準(zhǔn)備合適的遺傳修飾劑(208)。準(zhǔn)備該試劑的另一代表性方法包括使用病毒顆粒的預(yù)定稀釋緩沖液制備具有期望效價(jià)的等分試樣，可能的低溫貯存和在受控的溫度下(0-4℃)將該病毒等分試樣解凍，并且驗(yàn)證該病毒載體的活性。所有這些方法均為本領(lǐng)域所熟知。此時(shí)，可以將微器官低溫貯存，以備以后在此方法的同一位置引入。這可以使用已知的逐步冷凍組織和細(xì)胞的方案進(jìn)行，使用例如，含10％DMSO的DMEM培養(yǎng)基。
在210中，對(duì)該微器官進(jìn)行遺傳改變。如發(fā)明內(nèi)容中所述，已知多種遺傳改變的方法，它們可以在本發(fā)明中使用。例如，以下描述基于使用病毒載體將基因插入至該微器官的細(xì)胞中。這一方法是眾所周知的，除非有關(guān)將病毒導(dǎo)入至微器官所用的特殊方法和裝置，將不再進(jìn)一步描述。
在212中，任選地測(cè)試遺傳改變的微器官(TMO)的治療劑分泌速度。有各種測(cè)定分泌量的方法，例如ELISA、其他免疫測(cè)定、光譜分析等。另外，任選地測(cè)試分泌物的質(zhì)量，例如分泌的蛋白質(zhì)的無菌度和活性。這可以周期性地進(jìn)行或聯(lián)機(jī)連續(xù)進(jìn)行。
此時(shí)，該TMO可以低溫貯存，以備后用。
在214和216中，確定產(chǎn)生所期望的治療效果所需的TMO的量。如以下所示，可以依據(jù)所評(píng)估或已知的體外分泌與體內(nèi)血清水平之間的關(guān)系，從測(cè)量的分泌速度、患者參數(shù)和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)估計(jì)所需的治療劑量。
在218中，將TMO的選定部分傳送至植入工具。代表性的執(zhí)行工具描述如下。如果需要，對(duì)于同種異體移植物或異種移植物而言?；蛞?yàn)槠渌?，將TMO包封。如果經(jīng)裝載的執(zhí)行工具(或該TMO)必需被運(yùn)輸，任選地將其置于(220)保存戰(zhàn)中，運(yùn)輸過程中其中的溫度、濕度等保持于允許該TMO生存的水平。任選地，將剩余TMO材料于體外保存，以備后用。這可以于溫暖的培養(yǎng)箱條件(37℃)下、在上述條件下或在冷的培養(yǎng)箱條件(4℃)下，它們可以延長(zhǎng)其體外生存力。
在224中，將該TMO的一部分(或前面步驟制備的TMO的一部分)植入個(gè)體中。本文描述了用于此植入程序的多種方法。完成其的其他方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且主要取決于所使用的微器官的特定幾何形狀。動(dòng)物研究已證明，該微器官和TMO在體內(nèi)保持活力，其依據(jù)是植入后該TMO繼續(xù)產(chǎn)生和分泌該治療劑達(dá)數(shù)月的時(shí)間。在動(dòng)物研究中，治療量產(chǎn)生達(dá)120天(或更長(zhǎng))的時(shí)間。盡管該微器官或TMO的組織似乎整合入接受植入的個(gè)體的組織中(特別是如果將該組織植入至與其采集部位相同種類的組織中)，構(gòu)成該微器官或TMO的細(xì)胞繼續(xù)產(chǎn)生并分泌該治療劑。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，從體外TMO采集治療劑并經(jīng)純化以去除營(yíng)養(yǎng)質(zhì)和排泄物。該經(jīng)純化的試劑通過注射或其他方式給予個(gè)體。
在任一情況下，任選地測(cè)定該TMO的體內(nèi)性能(228)。如以下所述，然后可以基于這種評(píng)價(jià)例如和/或以前的患者數(shù)據(jù)(226)，通過增加植入物的量或移出部分植入物來調(diào)節(jié)患者劑量(230)。隨著植入物的功效改變，追加植入TMO片段。
以下的部分更詳細(xì)地描述以上的一些操作和它的變化。
采集外植塊圖3A和3B示意性地顯示根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，從個(gè)體采集皮膚樣品的代表性方法。將底盤314放置于個(gè)體311的供體部位上，皮膚樣品將從該供體部位采集。任選地將底盤用輕微的壓力壓至皮膚上，例如通過環(huán)繞手臂的帶313或通過其他方法。該底盤有剪切窗口，其限定要采集的組織的長(zhǎng)度和寬度，并且還起穩(wěn)定供體部位周圍皮膚的作用。樣品負(fù)載器310位于該底盤上表面以上已知的距離(要采集的組織的深度)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，樣品負(fù)載器310具有小孔或槽溝，并且將真空頭312置于樣品負(fù)載器310的背后，用以在真空源320激活時(shí)將皮膚表面吸引至樣品負(fù)載器，并將其緊緊固定在底盤上方的預(yù)定高度位置上。可以提供多種孔結(jié)構(gòu)用于以下所示的不同形狀的微器官結(jié)構(gòu)。真空用于穩(wěn)定將要采集的皮膚樣品并且在組織脫離人后將所采集的皮膚樣品保持貼附于該負(fù)載器?；蛘?，將粘合劑置于樣品負(fù)載器上，以使皮膚貼附于其。例如，將雙面膠置于樣品負(fù)載器310的底面。如果使用粘合劑，作好準(zhǔn)備工作，以使該樣品負(fù)載器在被提升離開周圍皮膚之前接觸皮膚。
沿底盤的上表面拉動(dòng)薄的鋒利刀片316以采集皮膚樣品318。樣品負(fù)載器310上的樣品的厚度由底盤的上表面至樣品負(fù)載器310的底面的距離決定。任選地使刀片在向前推進(jìn)時(shí)從一側(cè)向另一側(cè)移動(dòng)，以推動(dòng)將樣品切片。從一側(cè)向另一側(cè)的移動(dòng)可以是機(jī)動(dòng)的或全部運(yùn)動(dòng)通過手動(dòng)完成。另外，刀片的向前運(yùn)動(dòng)可以是機(jī)動(dòng)的。以下過程開始的過程中，真空頭可以保持連接于樣品負(fù)載器上，以防止皮膚樣品318脫離樣品負(fù)載器310。
通常，皮膚樣品寬6毫米、長(zhǎng)35毫米、厚1毫米。然而，其他的長(zhǎng)、寬、厚也是有用的。無論如何，側(cè)面的尺寸并不重要。然而，在通過下述方法制備一致的微器官時(shí)，獲取標(biāo)準(zhǔn)大小的外植塊是有用的。
制備和安裝微器官圖4A和4B顯示在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，從組織樣品，例如使用圖3中所示方法采集的皮膚組織樣品制備微器官的代表性裝置410。
在圖4A中，皮膚樣品318置于樣品負(fù)載器310(未顯示)上并通過真空頭312固定，將該皮膚樣品接觸并按壓至安裝于基座414上的一系列刀片412上。刀片平行、等長(zhǎng)，并且比樣品的長(zhǎng)度稍長(zhǎng)。在組織切割前，將微器官罩416置于刀片412之間。當(dāng)將樣品負(fù)載器用足夠的力按壓至刀片上時(shí)，組織被切透成片并且皮膚樣品(現(xiàn)在是微器官418)被固定于刀片之間。如果微器官在刀片之間固定情況極好，可將負(fù)載器及相連的真空源一起移出。否則，將真空或粘附力去除。這在圖4B和4C中分別顯示，圖4B和4C是切片后微器官的等角和截面圖。刀片間間隔W決定切割微器官的寬度。然后從刀片提升微器官罩416(圖4D)，然后可移出微器官切片用于進(jìn)一步加工。以上描述的按壓作用可通過壓制固定器輔助，或者通過在樣品負(fù)載器頂部上滾動(dòng)桿輔助。
圖5A顯示用于切割不同形狀微器官的結(jié)構(gòu)的等角圖。如圖所示，在該結(jié)構(gòu)中，刀片512被分為彼此軸向偏移的兩組。與罩416相似的微器官罩安裝于刀片512之間。當(dāng)皮膚樣品與刀片接觸并被按壓至刀片時(shí)，皮膚樣品被切成圖5B所示的式樣，此處將切割的皮膚樣品(在下文中稱作微器官)標(biāo)記為518。將微器官罩416抬起，移出微器官罩416上的微器官518。如圖5B所示，當(dāng)切割時(shí)，微器官518呈迂曲形狀。
在上述方法中，在線性結(jié)構(gòu)之間的連接點(diǎn)端保留有樣品的完整厚度，一般而言，在以下加工中，實(shí)際上只需要足夠?qū)⒕€性片固定的結(jié)構(gòu)即可。例如，對(duì)于皮膚樣品，僅留下上皮層可能已足夠。一種方法是使刀片排成一行且等長(zhǎng)。在組織樣品負(fù)載器中形成有適當(dāng)?shù)陌枷?如在圖3E中)，使得在這些位置刀片不將組織完整厚度切透。這得到僅有組織部分深度的“連接點(diǎn)”。
當(dāng)展開該結(jié)構(gòu)(即伸展至其全長(zhǎng))時(shí)，該微器官是極長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)，幾乎呈平行六面體的形式。由于它與最初樣品的長(zhǎng)度相比極長(zhǎng)的長(zhǎng)度，本文中有時(shí)將這種結(jié)構(gòu)稱為“超線性”結(jié)構(gòu)。其他形狀也是可能的。例如，如果在外植塊中切割螺旋形，則結(jié)果類似于參照?qǐng)D5描述的方法的產(chǎn)物。也可以通過壓制或切割制備環(huán)形結(jié)構(gòu)或矩形薄壁結(jié)構(gòu)。巨大微器官結(jié)構(gòu)的另一變體是兩個(gè)相鄰的線性微器官在兩端通過連接點(diǎn)相連，使得該結(jié)構(gòu)可以被打開以形成微器官組織環(huán)。
圖6A中顯示代表性網(wǎng)形微器官600的示意圖，該網(wǎng)的細(xì)節(jié)在圖6B和6C中顯示。
觀看圖6時(shí)，應(yīng)理解，圖中所見的表面是皮膚層的外表面(角質(zhì)層)或相對(duì)的皮膚內(nèi)表面(真皮下層)。設(shè)計(jì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)600，使得該網(wǎng)結(jié)構(gòu)的每一部分距表面的距離都允許其接受營(yíng)養(yǎng)物并將排泄物排出至周圍的營(yíng)養(yǎng)浴中，另外，該距離保持整個(gè)組織樣品真正地固定在一起以簡(jiǎn)化組織處理和加工。此外，該結(jié)構(gòu)允許不斷鑒定皮膚的哪一面是哪一面，以便能夠以正確的方向?qū)⒃撐⑵鞴倩騎MO植入，如下所述。
如圖6B所示，如果使該網(wǎng)的兩個(gè)元件之間的連接點(diǎn)604的寬度602等于網(wǎng)中的臂608的厚度606(圖6C)(如圖所示)，比臂608的最內(nèi)部組織更遠(yuǎn)離營(yíng)養(yǎng)物的區(qū)域非常小。而且，其僅輕微遠(yuǎn)離營(yíng)養(yǎng)物源等。使寬度602更小進(jìn)一步減小該區(qū)域和距離。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使寬度等于厚度606。在其他實(shí)施方案中，它大于或小于厚度606。如圖6B中可見，該網(wǎng)的每一段都基本上與線性微器官相同。
制備網(wǎng)，如圖6A-C所示的網(wǎng)，的一種方式是在組織樣品的一部分中壓出樣式700，如圖7中所示?？梢岳斫猓锌陂L(zhǎng)度與連接點(diǎn)長(zhǎng)度的比可以是1∶1至1∶100的寬的數(shù)值范圍。該比值控制網(wǎng)的緊密性和拉伸開時(shí)可被擴(kuò)展的程度。圖8中顯示用于壓制切割的代表性刀片盒排列800(相應(yīng)于圖4A的裝置414)?；蛘?，如以上就超線性結(jié)構(gòu)而言所述的，可以使用特別設(shè)計(jì)的負(fù)載器上的未更改的等長(zhǎng)刀片，其將產(chǎn)生足以將該結(jié)構(gòu)固定在一起成網(wǎng)的部分厚度連接點(diǎn)。
應(yīng)該理解，上述超線性和網(wǎng)微器官結(jié)構(gòu)均可被視為線性微器官在連接點(diǎn)處連接在一起的結(jié)構(gòu)，所述連接點(diǎn)可以是微器官本身或非微器官組織的部分。壓制組織形成結(jié)構(gòu)后，如圖7所示，將該組織橫向拉伸形成圖6A中所示的網(wǎng)。圖7上的標(biāo)記數(shù)字相當(dāng)于圖6中上同一數(shù)字所標(biāo)記的特征。該網(wǎng)可被拉伸直至切口張開呈鉆石形狀?；蛘撸梢允乖摼W(wǎng)張開小于該最大程度。
圖9A顯示用于在加工過程中固定該“超線性”微器官的代表性結(jié)構(gòu)900。根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，結(jié)構(gòu)900的另一功能是促進(jìn)將該微器官引入和移出生物反應(yīng)器。
如圖9A所示，結(jié)構(gòu)900包括形成有與該組織樣品的寬度相同或稍寬的狹槽912的基本上矩形(但彎曲)的體910。狹槽使液體能夠自由通過到達(dá)該微器官的兩面。
沿體910的長(zhǎng)度周期性地形成有夾子914或其他用于將該微器官固定于適當(dāng)位置的工具。當(dāng)將微器官518裝載至體910上時(shí)，夾子關(guān)閉以固定該微器官。如本領(lǐng)域中已知，可以通過用真空拾取工具抓住該微器官的末端而實(shí)現(xiàn)在最開始將該微器官放入該夾子中。第一個(gè)夾子(標(biāo)識(shí)為914’)顯示為關(guān)閉并固定該微器官。當(dāng)將該微器官固定在體910上時(shí)，由于該微器官的一側(cè)上自由暴露的表面，而另一側(cè)上有狹槽，所以其表面區(qū)域的大部分得以暴露。這使該微器官與其周圍的液體或試劑有良好的物理接觸。這提高了該微器官在體外期間的生存力。或者，夾子(第一個(gè)和最后一個(gè)之間)未在該微器官上關(guān)閉。相反，它們打開，而打開的夾子防止該微器官?gòu)囊粋?cè)向另一側(cè)移動(dòng)?；蛘?，中間的夾子被垂直于固定器表面，防止微器官向一側(cè)滑動(dòng)的元件代替。
圖9B顯示用于在加工過程中固定網(wǎng)微器官的代表性結(jié)構(gòu)960。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，結(jié)構(gòu)960的另一功能是促進(jìn)將該微器官引入和移出生物反應(yīng)器。
如圖9B所示，將網(wǎng)型微器官600安裝于固定器962上，固定器962在其中央部具有孔964。圍繞孔964的邊緣形成有多個(gè)釘966。如上所述，拉伸網(wǎng)結(jié)構(gòu)600，并由釘966固定在孔中。雖然顯示了釘或棒型固定器，但也可以使用其他固定該網(wǎng)的邊緣的固定器(如夾子)。另外，雖然顯示了正方形孔，但也可以使用矩形、圓形或多于四個(gè)邊的形狀。雖然顯示了完全打開的網(wǎng)，但不同的微器官尺寸和大小可以得到僅部分打開的網(wǎng)。
微器官生物反應(yīng)器和遺傳改變一旦微器官得到制備和安裝，就已準(zhǔn)備好將微器官遺傳改變以形成TMO。
一般而言，遺傳改變包括將選定的一個(gè)或多個(gè)基因?qū)爰?xì)胞，其導(dǎo)致該細(xì)胞產(chǎn)生和任選地分泌所期望的治療劑，如蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，如上所述，在遺傳改變期間保持該微器官的方法的至少部分和該遺傳改變本身在生物反應(yīng)器中進(jìn)行。
理想地，這樣的生物反應(yīng)器具備下列性質(zhì)的一部分或全部1)允許向該微器官表面供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物和氣體，以便它們能夠擴(kuò)散進(jìn)入該微器官，并且該微器官可以保持有活力。因此，該微器官的大部分區(qū)域和體積不應(yīng)被阻斷與周圍液體的接觸。
2)允許將該微器官保持于理想的溫度。
3)允許在該微器官的周圍保持理想的pH和氣體組成。
4)允許從該微器官和該生物反應(yīng)器中移出排泄物。
5)允許用簡(jiǎn)單方法插入遺傳修飾的載體而沒有插入載體污染周圍環(huán)境的實(shí)際危險(xiǎn)。
6)允許移出過多的未使用的載體。
7)允許測(cè)量所產(chǎn)生的治療劑的量。
8)允許移出基本上無菌的治療劑。
9)允許微器官的容易插入及移走全部或測(cè)定量的TMO。
圖10顯示根據(jù)本發(fā)明的代表性實(shí)施方案的生物反應(yīng)器1000的主要截面示意圖。盡管生物反應(yīng)器1000未具備最終生物反應(yīng)器的全部理想的品質(zhì)，但它例示了簡(jiǎn)單有用的生物反應(yīng)器模型。盡管所示的結(jié)構(gòu)最適用于圖9中所示的固定在固定器上的網(wǎng)型微器官，但該結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單變體能夠用于超線性結(jié)構(gòu)和現(xiàn)有技術(shù)的短線性結(jié)構(gòu)。
塑料或其他非反應(yīng)性材料的容器1002于其底部形成有凹陷1004。凹陷1004適于固定微器官，如固定器962中的微器官600(圖6A和9B)。任選地在該容器的最低部分的排水管1006由閥1008控制。
該容器中形成有輸入端口1010。將任選地具有維持該微器官所需的溶解氣體的營(yíng)養(yǎng)液，例如包含谷氨酰胺和抗生素的最低DMEM從營(yíng)養(yǎng)物貯器1012由泵1014泵入該容器中。
容器1002中還形成有溢流出口1016，使得容器1002中過多的營(yíng)養(yǎng)液溢流入溢流容器1018中。穩(wěn)態(tài)液體水平得以保持，使得從該生物反應(yīng)器排出的平均流速等于入口流速。容器1002被蓋子1020覆蓋，蓋子1020裝有合適的墊圈系統(tǒng)(未顯示)，以使其密封并保持無菌。容器1002、營(yíng)養(yǎng)物貯器1012和溢流容器1018還裝有任選的空氣入口1021(或出口)，經(jīng)過濾以保持容器內(nèi)無菌。裝備空氣入口的主要原因是保持壓力平衡。然而，任選地在容器1002中營(yíng)養(yǎng)液水平以上提供氣體流動(dòng)系統(tǒng)，以控制氧和/或其他氣體的濃度。任選地，可以通過將氣體通入貯器1012或容器1006中的營(yíng)養(yǎng)液而使氣體溶解于該營(yíng)養(yǎng)物液體中。
如圖2中的206所示，在操作中，將微器官600插入容器1002中。在一個(gè)任選的實(shí)施方案中，微器官固定器可以通過一個(gè)或多個(gè)棒連接于蓋子1020的內(nèi)側(cè)，所述棒在蓋上蓋子時(shí)使該微器官在容器1002內(nèi)正確定位。該容器部分填充有營(yíng)養(yǎng)液1030并保持于接近體溫的適當(dāng)溫度。不斷將新的營(yíng)養(yǎng)液泵入該容器中，而溢流營(yíng)養(yǎng)液(通過出口1016流出)攜帶部分由該微器官產(chǎn)生的排泄物。任選地，通過機(jī)械或聲學(xué)方法攪拌該營(yíng)養(yǎng)液，或通過液流混合而混合營(yíng)養(yǎng)液，以使新鮮的營(yíng)養(yǎng)液穩(wěn)定流至該微器官，并使排泄物不在該生物器官附近濃縮。
或者，營(yíng)養(yǎng)液泵入容器1002的速度與通過排水管1006移出的速度相同。由于排水管1006接近該微器官，并且由于液流總是從該微器官流向該排水管，因此新鮮的營(yíng)養(yǎng)液始終被傳送至該微器官，而排泄物被有效地移出。入口和出口流速應(yīng)足以保持所需要的營(yíng)養(yǎng)物和氣體濃度，但流速不能大到?jīng)_走有該微器官天然生成的、當(dāng)在最低培養(yǎng)基中保持時(shí)維持其生存力所需的生長(zhǎng)因子。
在任一情況下，任選地周期性或連續(xù)檢測(cè)離開容器1006的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以確定葡萄糖、乳酸鹽、氨、溶解氧、溶解二氧化碳和其他營(yíng)養(yǎng)物如氨基酸的水平。如果該水平超出理想的范圍，則采取校正措施。
在通常是24小時(shí)的量級(jí)的特定的潛伏期之后，(或者，任選地，在將該微器官插入容器1002后立即)通過排水管1006移出營(yíng)養(yǎng)液1030，并且替換以新的含有病毒載體的營(yíng)養(yǎng)液，已發(fā)現(xiàn)該潛伏期輔助微器官的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。僅需提供足夠的營(yíng)養(yǎng)液以覆蓋該微器官，但可以使用更多的營(yíng)養(yǎng)液。任選地，通過單獨(dú)的隔膜端口1023將病毒載體注射加入?；蛘?，將其通過端口1010和通向端口1010的線中的三向連接輸入。任選地，僅移出部分營(yíng)養(yǎng)液，而剩余營(yíng)養(yǎng)液用于在基因插入過程中提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
任選地，在遺傳修飾過程中不改變營(yíng)養(yǎng)液。此過程結(jié)束后，將含有病毒的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從容器1002中排出，并將容器充滿和排空一次或多次以去除痕量病毒。
添加新的營(yíng)養(yǎng)液并持續(xù)灌注特定時(shí)間，通常是數(shù)天的量級(jí)。這任選地允許精確表征分泌水平并測(cè)定無菌度等。
任選地，在加工過程的全部階段，具體而言是在潛伏、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)導(dǎo)后保持的過程中，可以通過以上所列的任何方法(振動(dòng)、搖動(dòng)、旋轉(zhuǎn)、液流混合、聲學(xué)攪拌等)完成微器官的攪拌。然后周期性地檢測(cè)治療劑分泌的發(fā)展，例如，通過測(cè)量通過排水管1006或出口1016移出的物質(zhì)中的治療劑濃度。任選地，可以根據(jù)分泌數(shù)據(jù)采取糾正措施，例如可以進(jìn)行追加的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
另外，一旦知道了期望的試劑從該微器官的分泌水平，該信息可以與適當(dāng)?shù)乃幋鷦?dòng)力學(xué)模型和/或人口統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)一起使用以確定為了實(shí)現(xiàn)期望的體內(nèi)治療效果所需返回該個(gè)體中的微器官/TMO的量。將該TMO植入患者的皮膚中或皮下或任何其他組織中，使其保持有活力、血管化并且保持活躍的生理功能，同時(shí)在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生和遞送用于安全和有效治療的理想水平的試劑。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將該微器官/TMO植入最初組織樣品所來源于的同一個(gè)體中(自體)。在另一任選的實(shí)施方案中，可以將該微器官/TMO植入不同個(gè)體中(非自體)。在以下部分中給出有關(guān)植入的更多信息。
微器官/TMO的移植根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，已證實(shí)TMO的移植相對(duì)簡(jiǎn)單和有效。
移植前，必須將該TMO的一部分從生物反應(yīng)器中移出，并為移植做準(zhǔn)備。對(duì)于圖9A和9B的實(shí)施例，將TMO固定其上的固定器962(或900)從該生物反應(yīng)器中移出，并將所需的TMO部分取出用于移植。任選地，依據(jù)生物反應(yīng)器中分泌水平的測(cè)定值決定取出材料的量。
通過將TMO植入需要治療蛋白的個(gè)體而最佳地實(shí)現(xiàn)TMO的完全治療潛能。移植的過程對(duì)功效及使用TMO治療的可能副作用有重要影響。
為了使TMO的功效最大化，應(yīng)該以使該TMO分泌的治療蛋白的益處最優(yōu)化的方式將該組織引入患者中。例如，可以將該TMO植入需要局部蛋白質(zhì)遞送的區(qū)域，或者可以將它們植入以提供(或最優(yōu)化)全身遞送。最佳地，在該過程中被移植的組織應(yīng)不以任何方式被改變或損傷，因?yàn)檫@種損傷可能影響該治療的療效。另外，在一些實(shí)施方案中，理想地，植入程序簡(jiǎn)單易于執(zhí)行，優(yōu)選不需要整形外科專家、皮膚科醫(yī)生或其他專家。該過程還應(yīng)快速完成，并且對(duì)所治療的患者產(chǎn)生最小的痛苦。
植入的TMO的數(shù)量和大小可以控制治療劑量?？梢灾踩牖蛞瞥?消除全部或部分TMO以調(diào)節(jié)患者中的分泌水平。也可以植入多個(gè)各自產(chǎn)生不同治療劑的TMO。
以下描述移植線性TMO的一種方法和皮下植入TMO的兩種方法。
線性TMO移植圖11顯示用于將一段TMO植入皮膚表面1106中的切口1104的工具1102。如圖11所示，工具1102上形成有多個(gè)孔1108，孔1108通過管1110與真空源(未顯示)相連?？坠潭ㄒ欢蜹MO 1112，其角質(zhì)層邊緣被真空固定。該真空拾取工具用于將TMO引導(dǎo)入切口1104中。
可以如下將線性TMO移植到患者的皮膚上在受體部位做適當(dāng)深度和長(zhǎng)度的切口，將該線性TMO置入該切口中并重新封閉傷口，使該TMO處于適當(dāng)?shù)奈恢谩Ｒ浦驳腡MO在受體部位成為皮膚整體的一部分。為了得到最好的結(jié)果，TMO方向應(yīng)該使該TMO的角質(zhì)層、上皮和真皮層與周圍皮膚組織的相應(yīng)層排列在一起。任選地，用于做切口的手術(shù)刀固定在控制切割深度的結(jié)構(gòu)上。這個(gè)用于做切口的手術(shù)刀工具應(yīng)具有基板，基板具有限定切口長(zhǎng)度的窗口，并且提供使切割前周圍皮膚在輕度牽力下的工具。將該手術(shù)刀工具置于基板上，并且允許該手術(shù)刀尖伸出基板底面下約1毫米，使得切口深度得以精確控制。一旦做好切口，則可以移開該手術(shù)刀工具并替換為引導(dǎo)，其用于將真空拾取工具下降至正確的方向，使得該工具上的TMO被正確地定位至該切口中。一旦處于合適的位置，則放松被拉緊的周圍組織，使得該線性TMO移植物周圍的切口閉合，并且任選地施加輕微的壓力以保持傷口閉合。在這個(gè)階段，可解除真空，真空工具與基板可以一起移開。
傷口包扎應(yīng)確保在愈合期間移植物不被擠出或暴露于環(huán)境中。任選地，包扎將施加適度的壓力至移植物以保持其位于適當(dāng)?shù)奈恢貌⑶逸o助其整合。由移植的TMO產(chǎn)生的蛋白質(zhì)被分泌入皮膚組織中并進(jìn)入真皮和皮下空間(subcutaneous space)。由于該TMO是自體皮膚樣品，所以沒有移植物排斥的擔(dān)心。
皮下線性TMO植入皮下移入的TMO將保持于合適的位置(不會(huì)被擠出)并且保護(hù)其免受小創(chuàng)傷。這種執(zhí)行與移植過程相比涉及更少的對(duì)皮膚的外部損傷，因此疼痛輕且更美觀。皮下移入過程更類似于注射而不是外科切割過程。
在皮下植入程序中，使導(dǎo)管穿過皮膚、皮下空間的一部分，使得鋒利的尖端任選地在對(duì)面穿出皮膚表面。為了確保導(dǎo)管在皮下穿過已知的長(zhǎng)度，可以通過一些機(jī)械裝置，如通過真空源或通過提升雙面膠帶的粘條而將受體部位的患者皮膚提起，而導(dǎo)管可以穿過該皮膚隆起的基部?？梢酝ㄟ^使用的產(chǎn)生真空的工具的大小或雙面膠帶的粘條的大小限定該基部的長(zhǎng)度。
一旦植入皮下后，TMO即已接近皮下空間中的細(xì)胞內(nèi)液并且分泌的蛋白質(zhì)全部進(jìn)入皮下空間，此空間與許多快速注射治療蛋白的注射部位相同。
圖12A-D顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的皮下植入程序的連續(xù)步驟。在這一過程中，為了準(zhǔn)備用于植入，首先將TMO 1202貼附于外科手術(shù)縫線1204或使用例如鈦夾或其他固定工具的其他相似類型的縫線上。將導(dǎo)管1206插入皮膚1208以下，以使其末端沒有穿出另一側(cè)(圖12A)?？p線可以是硬的或柔韌的，可吸收或不可吸收的，由任何生物相容的材料制成，并且具有較寬的直徑范圍?？p線具有前端縫合針1203或其他連接在其前端的針樣物體，它比導(dǎo)管的長(zhǎng)度長(zhǎng)。將該針和相連的縫線以及夾于其上的TMO一起導(dǎo)入上述導(dǎo)管中(圖12B)，并且穿透超過導(dǎo)管前端的皮膚，然后被拉出，直到該TMO被正確定位于上述皮膚下的皮下空間中(圖12C)。撤走導(dǎo)管時(shí)，醫(yī)生握住縫針和/或縫線，使縫線和TMO保持在合適的位置(圖12D)?？梢詫⒖p線于一端平齊于皮膚剪斷，使其僅在一端有輕微突出，或者可以使其在兩端都輕微突出。
縫線幫助標(biāo)記該TMO的位置，因此便于其識(shí)別以及以后如果需要，為了調(diào)整或停止蛋白治療而移出。更重要的是，縫線提供了通道，由TMO的皮膚產(chǎn)生的角蛋白通過這個(gè)通道可以排出該皮下區(qū)域。從該TMO皮膚的角質(zhì)層脫落的角蛋白可能積聚于該皮下植入物區(qū)域，導(dǎo)致形成包涵囊腫。縫線的存在可以使角蛋白沿縫線的縱軸流動(dòng)并流出體外。在一些情況下，該TMO的上皮將圍繞縫線產(chǎn)生上皮細(xì)胞，使圍繞縫線形成穩(wěn)定的角蛋白通道。
在以上過程的一個(gè)變體中，將導(dǎo)管置于皮下空間中，使得鋒利的尖端在對(duì)面穿出皮膚表面。然后將縫合針連接于外科縫線的前端，然后將縫線連接至TMO。其余的過程如上所示。
在另外一種設(shè)計(jì)中，可以使縫線具有鉤狀突出。不用針，將連接有TMO的該縫線在將導(dǎo)管置入皮下空間之前裝入該導(dǎo)管中。如上所述，將導(dǎo)管適當(dāng)定位，但不穿出對(duì)側(cè)的皮膚表面。當(dāng)導(dǎo)管得到適當(dāng)定位后，立即將其撤走，而縫線上的鉤阻止縫線與導(dǎo)管一起被撤走。
一般而言，對(duì)于皮下程序，TMO可以未包封或者其可以被包封或封閉于膜中。該膜應(yīng)具有這樣的孔徑，其足夠大以允許營(yíng)養(yǎng)物、排泄物和治療劑通過，但足夠小以使免疫系統(tǒng)的細(xì)胞不通過。
圖13A-E顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的第二皮下植入程序的連續(xù)步驟。
該程序類似于第一皮下植入程序，但在這本例中，縫線被消除。在該程序中，如上所述使空導(dǎo)管1302穿過皮下空間，使得鋒利的末端在另一端穿出皮膚表面。是真空拾取工具1304穿過該導(dǎo)管并在該導(dǎo)管的出口末端與TMO 1306的一端相連(圖13A)。另一真空拾取工具1308用于固定該TMO的另一末端。然后同時(shí)移開兩個(gè)真空拾取工具，使得TMO 1306在導(dǎo)管內(nèi)定位(圖13B和13C)。工具仍然固定TMO的同時(shí)，撤走導(dǎo)管，使得只有該TMO定位于皮下空間中(圖13D)。在該位置，TMO的兩個(gè)末端任選地伸展至皮膚表面以外。然后可以使用手術(shù)刀在受體部位的皮膚上做短的切口，TMO的每個(gè)末端一個(gè)并與之鄰接。然后關(guān)閉真空、解除拾取工具。然后將該TMO的突出末端移植入患者皮膚上鄰接的切口中(圖13E)，類似于以上描述的線性TMO移植程序。
在該程序中，在兩個(gè)末端的移植的TMO部分作為該TMO位置的標(biāo)記。另外，該TMO皮膚的角質(zhì)層自身形成角蛋白流出體外的通道。當(dāng)用縫線時(shí)，該TMO的表皮將圍繞角質(zhì)層的角蛋白產(chǎn)生上皮細(xì)胞，使得圍繞該TMO角質(zhì)層形成穩(wěn)定的角蛋白通道。角蛋白將通過此通道分泌，并防止與該TMO鄰接地形成包涵囊腫。
未植入的微器官/TMO材料可于低溫條件下貯存，以備后用，例如，在植入材料功效下降至低于所需的量時(shí)。
或者，可以從營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中回收試劑，經(jīng)純化并注射或以其他方式給予個(gè)體。
TMO移出或消除用于治療的微器官/TMO的優(yōu)點(diǎn)是分泌治療劑的組織位于體內(nèi)明確的位置。因此，如果由于任何原因需要終止治療，簡(jiǎn)單的移出該組織就會(huì)停止蛋白遞送?；蛘?，如下所述，可以將該移植組織消融或使之停止工作。
在移植的情況下，使該微器官/TMO的位置可視化的參考點(diǎn)由該TMO自身提供，或者在皮下植入的情況下，由縫線提供，或者由為該目的與該TMO一起植入的任何材料提供。例如，可以將熒光珠植入該TMO的每個(gè)末端，使得可以將熒光來源用于定位該珠以實(shí)現(xiàn)移出該TMO的目的。類似地，可以使用在超聲、X射線、MRI或其他可視化源下可見的材料以及具有磁性的材料。
移植時(shí)，可以用手術(shù)刀切皮刀或其他切割工具手術(shù)移出該微器官/TMO。代替移出，該TMO可以保留在原位，但通過使用外部能量源消融該TMO的部分至全部細(xì)胞，所述外部能量源例如但不限于激光、低溫、射頻和微波能量。該消除程序的實(shí)施方案包括，在皮膚上沿移植物的路徑在該微器官/TMO的旁邊引入探針。該探針可以將RF或微波輻射帶到該TMO區(qū)域，或者可以將該探針冷卻至低溫以殺死該TMO的細(xì)胞，可能還殺死其周圍的少量組織。
當(dāng)皮下植入時(shí)，也可以采用手術(shù)刀或其他切割工具手術(shù)移出該TMO。例如，可以使用去除中心部份的裝置找到該TMO的通路，以除去該植入的組織和最少量的周圍宿主組織。也可以通過用上述能量來源消融而消除該皮下TMO。在一個(gè)實(shí)施方案中，沿該移植物的通路引入探針。該探針可以用于遞送，例如，RF能量，以引起該TMO附近的過熱。這將導(dǎo)致TMO細(xì)胞的大多數(shù)受到重大損傷，使得蛋白質(zhì)分泌停止。
實(shí)施例實(shí)施例1植入SCID小鼠中，表達(dá)小鼠干擾素α(mIFNα)的人皮膚TMO通過腹部整形(tummy-tuck)手術(shù)取得新鮮的皮膚組織樣品，制備人皮膚微器官。切取皮膚厚度(深度)1.4-1.5毫米的切片并用次氯化物(hypochloride)溶液(10％Milton溶液)沖洗。使用組織切片機(jī)(TC-2chopper，Sorval，Du-pont instruments)將沖洗后的皮膚樣品于無菌條件下切片，制成450微米的切片(寬度)。所得的微器官被置于48孔培養(yǎng)板，每孔一個(gè)切片，每個(gè)孔中含有400微升無血清的DMEM培養(yǎng)液(Biological Industries-Beit Haemek)于5％CO2、37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。此后，使用攜帶鼠干擾素α基因的腺病毒載體(Adeno-mIFNα)(1×109IP/ml)對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)以產(chǎn)生治療微器官(TMO)。此后，TMO再次保存在每孔400微升的DMEM培養(yǎng)液中。每2-3天更換培養(yǎng)液一次并使用特異的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Cat.#CK2010-1，Cell Science Inc.)分析分泌的鼠干擾素α(mINFα)的濃度。將以上所述的人皮膚mINFαTMO皮下植入數(shù)只SCID(重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠體內(nèi)。經(jīng)移植的小鼠顯示血清干擾素α的水平升高達(dá)數(shù)周。經(jīng)病毒細(xì)胞病變抑制檢測(cè)法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在這些SCID小鼠血清中檢測(cè)到的分泌的mINFα具有生物學(xué)活性(數(shù)據(jù)未顯示)。圖14A顯示鼠干擾素α-治療微器官(mIFNα-TMOs)植入前體外分泌與其植入后體內(nèi)血清水平間的相關(guān)分析。此相關(guān)數(shù)據(jù)表明植入前檢測(cè)到的體外分泌水平可被用于計(jì)算和配制需要植入的TMO的量，以獲得一個(gè)理想的治療效果。
圖14B描述患者體內(nèi)各種注射的重組治療用蛋白質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)，以及重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠體內(nèi)人皮膚TMO產(chǎn)生并釋放的鼠干擾素α的藥代動(dòng)力學(xué)。數(shù)值表示進(jìn)行比較的蛋白的血清水平，蛋白質(zhì)包括帶標(biāo)記的注射的蛋白質(zhì)及采用TMO技術(shù)的SCID小鼠血清中的蛋白質(zhì)，數(shù)值表示為每種蛋白質(zhì)各自最大濃度的百分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例2表達(dá)小鼠干擾素α(mIFNα)的人皮膚TMO在蛋白質(zhì)產(chǎn)量方面顯示患者間的高度再現(xiàn)性制備微器官并且應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的(非最佳化)方案，如上所述，包括腺病毒效價(jià)1×109IP/ml，采用Ad5/CMV-mINFα載體轉(zhuǎn)導(dǎo)生成TMO。制備微器官24小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。使用特異的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Cat.#CK2010-1，Cell Science Inc.)分析轉(zhuǎn)導(dǎo)后第6天培養(yǎng)液中體外分泌mINFα的水平。圖15顯示不同時(shí)間處理的、來源于不同患者的皮膚樣品之間的差異程度非常小。人類患者之間的差異小表明在實(shí)際應(yīng)用中，可以通過來源于患者的標(biāo)準(zhǔn)大小的皮膚樣品確定蛋白質(zhì)的分泌水平標(biāo)準(zhǔn)，用以確定所需移植的TMO的量，以達(dá)到理想的治療療效。
實(shí)施例3植入SCID小鼠中，包括再次植入的表達(dá)人紅細(xì)胞生成素(hEPO)的人皮膚線性TMO通過腹部整形(tummy-tuck)手術(shù)取得新鮮的皮膚組織樣品，制備線性(20毫米長(zhǎng)、0.4微米寬)人皮膚微器官。切取移出0.85-1.1毫米皮膚厚度(深度)的組織樣品并且在皮氏培養(yǎng)皿(90mm)中用含有谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液沖洗。
為制備線性微器官，使用具有上述刀片裝置的壓制設(shè)備將上述的組織樣品切割成理想的尺寸20毫米×400微米。所得的線性微器官被置于24孔培養(yǎng)板，每孔一個(gè)切片，每個(gè)孔中含有500微升無血清的DMEM培養(yǎng)液(Biological Industries-Beit Haemek)于5％CO2、37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)板振蕩條件下，使用攜帶人紅細(xì)胞生成素基因的腺病毒載體(Adeno-hEPO)(1×1010IP/ml)對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)以產(chǎn)生治療微器官(TMO)。每2-4天更換培養(yǎng)液一次并使用特異的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Cat.#DEP00，QuantikineIVD，R&D Systems)分析分泌的人紅細(xì)胞生成素(hEPO)的濃度。
將以上所述的人皮膚hEPO線性TMO皮下植入數(shù)只SCID小鼠體內(nèi)。從圖16中可以看出，經(jīng)移植的小鼠顯示血清紅細(xì)胞生成素的水平升高達(dá)數(shù)周。紅細(xì)胞比容值的升高顯示在這些SCID小鼠血清中檢測(cè)到的分泌的hEPO具有生物學(xué)活性。植入后70天，對(duì)數(shù)只小鼠進(jìn)行第二次植入，植入追加的線性hEPO TMO，以獲得更長(zhǎng)時(shí)間的hEPO分泌并由此得到更持久的治療作用。
實(shí)施例4以幾個(gè)劑量植入SCID小鼠的，表達(dá)人紅細(xì)胞生成素(hEPO)的人皮膚線性TMO通過腹部整形(tummy-tuck)手術(shù)取得新鮮的皮膚組織樣品，制備線性(30.6毫米長(zhǎng)、0.6微米寬)人皮膚微器官。切取移出0.85-1.2毫米皮膚厚度(深度)的組織樣品并且在皮氏培養(yǎng)皿(90mm)中用含有谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液沖洗。
為制備線性微器官，使用具有上述刀片裝置的壓制設(shè)備將上述的組織樣品切割成理想的尺寸30.6毫米×600微米。所得的線性微器官被置于24孔培養(yǎng)板，每孔一個(gè)切片，每個(gè)孔中含有500微升無血清的DMEM培養(yǎng)液(Biological Industries-Beit Haemek)于5％CO2、37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)板振蕩條件下，使用攜帶人紅細(xì)胞生成素基因的腺病毒載體(Adeno-hEPO)(1×1010IP/ml)對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)以產(chǎn)生治療微器官(TMO)。每2-4天更換培養(yǎng)液一次并使用特異的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Cat.#DEP00，QuantikineIVD，R&D Systems)分析分泌的人紅細(xì)胞生成素(hEPO)的濃度。
將以上所述的人皮膚hEPO線性TMO以3種劑量(每只小鼠1、2、3個(gè)線性TMO)皮下植入數(shù)只SCID小鼠體內(nèi)。從圖17中可以看出，經(jīng)移植的小鼠顯示血清紅細(xì)胞生成素的水平升高達(dá)數(shù)周。而且，不同小鼠的血清水平與植入的線性TMO數(shù)量相關(guān)，由此獲得一個(gè)劑量相關(guān)的作用。紅細(xì)胞比容值的升高顯示在這些SCID小鼠血清中檢測(cè)到的分泌的hEPO具有生物學(xué)活性。
實(shí)施例5表達(dá)人紅細(xì)胞生成素(hEPO進(jìn)入免疫活性動(dòng)物)的小型豬皮膚線性TMO的自體移植在全身麻醉下，從活體動(dòng)物取得新鮮的皮膚組織樣品，制備線性(30.6毫米長(zhǎng)、0.6微米寬)小型豬(Sinclar豬)皮膚微器官。使用商品化的取皮刀(Aesculap GA630)切取移出0.9-1.1毫米皮膚厚度(深度)的組織樣品并且在皮氏培養(yǎng)皿(90mm)中用含有谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液沖洗。
為制備線性微器官，使用具有上述刀片裝置的壓制設(shè)備將上述的組織樣品切割成理想的尺寸30.6毫米×600微米。所得的線性微器官被置于24孔培養(yǎng)板，每孔一個(gè)切片，每個(gè)孔中含有500微升無血清的DMEM培養(yǎng)液(Biological Industries-Beit Haemek)于5％CO2、37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)板振蕩條件下，使用攜帶人紅細(xì)胞生成素基因的腺病毒載體(Adeno-hEPO)(1×1010IP/ml)對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)以產(chǎn)生小型豬皮膚治療微器官(豬皮膚-TMO)。每2-4天更換培養(yǎng)液一次并使用特異的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Cat.#DEP00，Quantikine IVD，R&D Systems)分析分泌的人紅細(xì)胞生成素(hEPO)的濃度。
以上所述的小型豬皮膚hEPO線性TMO通過皮下植入和皮膚移植兩種方法移植至數(shù)只具有免疫活性的小型豬體內(nèi)(兩只小型豬皮下植入TMOs-hEPO，在另外兩只小型豬中，TMOs-hEPO移植到其1毫米深的切器中)。在每只小型豬體內(nèi)植入充分?jǐn)?shù)量的TMOs-hEPO，使每只豬的移植物移植前總分泌水平達(dá)到約每天7微克。移植后，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定的血清hEPO水平的升高(圖18A)和網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的升高(圖18B)持續(xù)7天。圖18A和B顯示釋放至豬血清中的具有生理活性(紅細(xì)胞生成素效應(yīng))的hEPO的治療量。
實(shí)施例6體外表達(dá)人紅細(xì)胞生成素(hEPO)的人皮膚線性和網(wǎng)TMO使用商品化的取皮刀，通過腹部整形(tummy-tuck)手術(shù)取得新鮮的皮膚組織樣品，制備線性(28毫米長(zhǎng)、0.6微米寬)和網(wǎng)(每個(gè)網(wǎng)部分寬0.6微米)的人皮膚微器官。切取移出0.85-1.2毫米皮膚厚度(深度)的組織樣品并且在皮氏培養(yǎng)皿(90mm)中用含有谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液沖洗。
為制備線性和網(wǎng)狀微器官，使用具有圖4A所示的用于制備線性微器官的刀片盒或使用具有圖8所示的用于制備網(wǎng)狀微器官的刀片盒的壓制設(shè)備切割上述的組織樣品。所得的線性/網(wǎng)狀微器官被分別置于48/24孔培養(yǎng)板，每孔一個(gè)切片，每個(gè)孔中含有500/1000微升無血清的DMEM培養(yǎng)液(Biological Industries-Beit Haemek)于5％CO2、37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)板振蕩條件下，使用攜帶人紅細(xì)胞生成素基因的腺病毒載體(Adeno-hEPO)(1×1010IP/ml)對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)以產(chǎn)生治療微器官(TMO)。每3-4天更換培養(yǎng)液一次并使用特異的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Cat.#DEP00，Quantikine IVD，R&D Systems)分析分泌的人紅細(xì)胞生成素(hEPO)的濃度。從圖19A中可以看出，轉(zhuǎn)導(dǎo)后檢測(cè)hEPO蛋白質(zhì)的體外分泌31天。
實(shí)施例7體外表達(dá)人紅細(xì)胞生成素(hEPO)的人皮膚線性和超線性TMO通過腹部整形(tummy-tuck)手術(shù)取得新鮮的皮膚組織樣品，制備線性(20毫米長(zhǎng)、0.6微米寬)和部分超線性(15毫米長(zhǎng)、0.6微米寬)的人皮膚微器官。切取移出0.85-1.2毫米皮膚厚度(深度)的組織樣品并且在皮氏培養(yǎng)皿(90mm)中用含有谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液沖洗。
為制備線性和超線性微器官，使用具有圖4A所示的用于制備線性微器官的刀片盒或使用具有圖5A所示的用于制備超線性微器官的刀片盒的壓制設(shè)備切割上述的組織樣品。所得的線性/超線性微器官被置于每孔含有500微升無血清DMEM的培養(yǎng)板中，每孔一個(gè)切片(線性)，或置于含有3750微升無血清DMEM(Biological Industries-Beit Haemek)的皮氏培養(yǎng)皿中，于5％CO2、37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)板振蕩條件下，使用攜帶人紅細(xì)胞生成素基因的腺病毒載體(Adeno-hEPO)(1×1010IP/ml)對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)以產(chǎn)生治療微器官(TMO)。每3-4天更換培養(yǎng)液一次并使用特異的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Cat.#DEP00，Quantikine IVD，R&D Systems)分析分泌的人紅細(xì)胞生成素(hEPO)的濃度。從圖19B中可以看出，轉(zhuǎn)導(dǎo)后檢測(cè)hEPO蛋白質(zhì)的體外分泌14天。
實(shí)施例8體外表達(dá)人紅細(xì)胞生成素(hEPO)，來源于用新的切皮刀采集的皮膚樣品的人皮膚線性TMO通過腹部整形(tummy-tuck)手術(shù)取得新鮮的皮膚組織樣品，制備線性(30.6毫米長(zhǎng)、0.6微米寬)人皮膚微器官。使用圖3A-3E中描述的取皮刀切取移出0.9-1.1毫米皮膚厚度(深度)的組織樣品并且在皮氏培養(yǎng)皿(90mm)中用含有谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液沖洗。
為制備線性微器官，使用本發(fā)明中描述的具有圖4A所示的用于制備線性微器官的刀片盒的壓制設(shè)備切割上述的組織樣品。所得的線性微器官被置于每孔含有500微升無血清DMEM(BiologicalIndustries-Beit Haemek)的培養(yǎng)板中，每孔一個(gè)線性片段，于5％CO2、37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)板振蕩條件下，使用攜帶人紅細(xì)胞生成素基因的腺病毒載體(Adeno-hEPO)(1×1010IP/ml)對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)以產(chǎn)生治療微器官(TMO)。每3-4天更換培養(yǎng)液一次并使用特異的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Cat.#DEP00，QuantikineIVD，R&D Systems)分析分泌的人紅細(xì)胞生成素(hEPO)的濃度。從圖19C中可以看出，轉(zhuǎn)導(dǎo)后檢測(cè)hEPO蛋白質(zhì)的體外分泌23天。
密閉無菌的微器官處理盒圖20-39描述用于進(jìn)行從組織獲取到植入受體體內(nèi)的微器官/TMO處理全部過程的盒式模塊。在所述的盒式模塊中，各種以上描述的功能均在無菌環(huán)境中完成，微器官/TMO在模塊間的傳送通過有效的、無菌的、可控制的方式完成。
圖20顯示主要的盒式模塊2000，模塊被分離以便易于觀察。主要的模塊包括組織采集器2002、微器官模塊2010、生物加工模塊2020、流控模塊2040。每個(gè)模塊都具有一個(gè)塑料的或其他具有生物相容性的腔。一般而言，獲取組織時(shí)，組織采集器2002與盒的其余部分分離。獲取組織后，將其連接至微器官模塊2010并向后者傳送獲取的組織。每套模塊唯一地用于特定的個(gè)體和特定的樣品，通過例如條形碼的方法鑒別。使用之后，優(yōu)選的，將模塊丟棄。
圖21和22顯示獲取器2002的操作和詳圖在一個(gè)臨床無菌環(huán)境下，例如門診患者診所或手術(shù)室中，使用皮膚獲取器2002從供體獲取皮膚樣品。任選地，獲取器2002通過其上安裝的電池驅(qū)動(dòng)或通過單獨(dú)的動(dòng)力模塊(未顯示)驅(qū)動(dòng)，也可以通過例如醫(yī)療隔離電源的方法提供動(dòng)力。
依據(jù)以上所述的組織獲取設(shè)備的設(shè)計(jì)原理，參考圖3，獲取器2002使用一個(gè)真空源2102，可以是專用的便攜式真空源或者來源于非便攜式已安裝的真空源。在供體部位做標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)部位準(zhǔn)備，并且使用局部麻醉劑。
端口2116在基板2412上打開形成窗口2120，這是對(duì)無菌組織采集器的唯一的開放。然后，通過一種方法(未顯示)將其安裝至受體的理想部位，使有足夠的壓力導(dǎo)致皮膚表面2114向窗口2120凸起。
活塞2106根據(jù)需要沿密閉的腔2105中的無菌襯套2104降低以接觸皮膚，通過樣品負(fù)載器2108使用真空經(jīng)孔2110將皮膚平坦的表面固定于樣品負(fù)載器的表面上。
樣品負(fù)載器的接觸表面垂直于活塞并且保持于刀片刀刃上方理想的距離，以切割理想厚度的皮膚樣品。
任選地，刀片2118(視圖上顯示其末端)通過傳動(dòng)器2122的作用從一端向另一端擺動(dòng)以切割組織(例如皮膚)，傳動(dòng)器通過螺旋傳動(dòng)裝置2126驅(qū)動(dòng)。螺旋傳動(dòng)裝置2126被馬達(dá)(未顯示)驅(qū)動(dòng)。
圖22顯示所得的獲取的皮膚樣品2202貼附于負(fù)載器上，同時(shí)端口2116位于關(guān)閉位置。組織采集器現(xiàn)在再次以無菌的方式封閉，并準(zhǔn)備傳送微器官至微器官模塊。
圖23-25顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案利用皮膚樣品制備生成微器官。
如圖23所顯示，負(fù)載器上帶有皮膚樣品的關(guān)閉的獲取器2002通過空氣密封墊圈2304利用夾子2302可分離的固定安裝至微器官模塊2010上。圖20顯示的頂視圖中，獲取器模塊定位于2014。
在微器官模塊2010中，修整刀片盒2320含有特有的兩個(gè)平行的刀片2318，間隔距離是超線性微器官單個(gè)片段的理想長(zhǎng)度，一般距離在30毫米以內(nèi)，并與2321的刀片排列相應(yīng)。任選地，修整刀片盒2320含有四個(gè)排列成矩形的刀片，可以限定樣品的長(zhǎng)度和寬度。
修整刀片盒2320與獲取器上的樣品負(fù)載器對(duì)齊，并且獲取器上的端口2116和微器官模塊上的端口2306被打開。
用于使組織樣品在切割和傳送過程中保持潮濕的濕潤(rùn)劑通過一個(gè)分配器釋放至修整刀片盒和切割刀片盒(圖23中未顯示，圖29中的頂視圖中可見)。
活塞2106向刀片盒2320推進(jìn)，使刀片切割皮膚至負(fù)載器底部，由此修整皮膚樣品的兩個(gè)邊緣。
退回活塞2106至刀片2318上方的高度，保持真空，以固定修整的樣品和剪下的邊緣于負(fù)載器上。
依據(jù)以上所述的原理并參考圖4和5，切割刀片盒2321含有多個(gè)相互平行的切割刀片2330，刀片之間通過安裝于支持基座2322上的定位架2331相間隔，奇數(shù)刀片與相對(duì)應(yīng)的偶數(shù)刀片間縱軸上偏移，偏移距離等于微器官的寬度，一般在幾百微米范圍內(nèi)。
可移動(dòng)面板2328被插在刀片2330之間，并被托架2326固定于合適的位置，托架騎跨于支架(offset)2324上。任選地，托架2326由壓力，如被鎖鍵固定的壓縮彈簧的壓力固定于合適的位置(未顯示)。
用螺旋傳動(dòng)裝置2233推進(jìn)修整刀片盒2320和微器官刀片盒2321，使微器官刀片盒2321與負(fù)載器對(duì)齊。
活塞2106向刀片盒2330推進(jìn)，如圖24所示，直到刀片切割皮膚至負(fù)載器底部。
升高活塞2306，一般升至其安裝至2010前的初始位置，如圖25所示。
通過托架2326將面板2328升起高于刀片2330，升高托架的方法有多種，例如通過解除固定的鎖鍵使壓縮彈簧彈回(未顯示)。固定鎖鍵的解除可以在切割刀片盒切割時(shí)通過活塞的壓力完成或通過其他方法完成。
所得的超線性微器官2502保持在面板2328上，于一個(gè)已知的位置和方向準(zhǔn)備傳送。注意負(fù)載器2108現(xiàn)在固定修剪下的組織邊緣，超線性微器官保持在面板上。
圖26-28顯示生物加工模塊2020的一些詳圖，這些在圖20中也有顯示，現(xiàn)在對(duì)其作進(jìn)一步的說明，并且微器官被傳送至其中。生物加工模塊2020含有一個(gè)腔2021，其上具有端口2024。如以下所描述的，在腔2020內(nèi)部，安裝有可旋轉(zhuǎn)的固定機(jī)械裝置2602。腔2020上還具有多個(gè)流控端口2023，它從流控模塊2040傳導(dǎo)動(dòng)力至模塊2020中的元件。腔2020上還具有固定栓，它可以與模塊2010的腔上的相匹配的洞2013緊密結(jié)合，并且通過密封墊圈3037將兩個(gè)模塊密封。
圖20中還顯示了一個(gè)真空導(dǎo)槽2011，顯示的是其收回到模塊2010中的狀態(tài)。
圖26和27顯示固定機(jī)械裝置2602的詳圖。機(jī)械裝置2606含有一個(gè)內(nèi)部旋轉(zhuǎn)機(jī)械裝置2702(inner rotating mechanism)和旋轉(zhuǎn)微器官固定器2704。真空拾取器導(dǎo)線2604與內(nèi)部旋轉(zhuǎn)機(jī)械裝置相連，通過旋轉(zhuǎn)內(nèi)部旋轉(zhuǎn)機(jī)械裝置使其放松。
圖26示意性地顯示微器官在模塊2010和模塊2020之間的傳送。端口2025和2306已被打開(未顯示)。真空導(dǎo)槽2011的初始位置位于模塊間的端口區(qū)，真空拾取器導(dǎo)線2604置于真空導(dǎo)槽2011中使其拾取器2606的位置輕度偏離面板2328上的微器官2502。為了抓住微器官2502，順時(shí)針方向輕度旋轉(zhuǎn)內(nèi)部旋轉(zhuǎn)機(jī)械裝置2702使拾取器2604被推至鄰近微器官2502的一側(cè)，并且末端重疊。啟動(dòng)真空拾取器2606，逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)內(nèi)部機(jī)械裝置2702在真空導(dǎo)槽2011的引導(dǎo)下將拾取器導(dǎo)線收回至模塊2020，導(dǎo)線置于真空導(dǎo)槽后導(dǎo)槽有剛剛夠的真空壓力保持拾取器導(dǎo)線2604和微器官2502。當(dāng)微器官的前方末端到達(dá)旋轉(zhuǎn)微器官固定器2704時(shí)，它位于片段定位器2610上。片段定位器2610(在虛線的圓中顯示其放大的圖像)含有至少兩個(gè)關(guān)閉部分2608、一個(gè)任選的可伸展的橫桿2614(在以下描述)、還任選的含有一個(gè)環(huán)2612，其功能在以下描述。一旦微器官到達(dá)微器官固定器2704時(shí)，內(nèi)部旋轉(zhuǎn)機(jī)械裝置2702與外層旋轉(zhuǎn)機(jī)械裝置2703鎖定使兩者作為一個(gè)裝置同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)，結(jié)果出現(xiàn)微器官固定器2704逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)將微器官裝載于其上。
真空導(dǎo)槽2011對(duì)微器官使用低水平真空，使器官在傳送過程中保持方向并且不會(huì)扭曲。任選地，它的形狀是一個(gè)矩形橫斷面的管(在插圖A-A中顯示)，沿其長(zhǎng)軸具有孔2630，通過孔應(yīng)用輕度的真空足以使微器官輕輕地貼附于其側(cè)壁并沿其長(zhǎng)軸滑動(dòng)。任選地，附加一個(gè)調(diào)整部件2632，調(diào)整微器官防止卷曲。其上的槽還可保持導(dǎo)線2604位于導(dǎo)槽2011中的正確位置。
旋轉(zhuǎn)微器官固定器2704具有一組片段定位器2610(在虛線的圓中顯示其放大的圖像)，每個(gè)片段定位器均具有微器官的單個(gè)片段的長(zhǎng)度且其兩端均有一個(gè)夾子。因此，微器官固定器旋轉(zhuǎn)時(shí)，微器官片段的一端位于片段定位器一端的夾子上，然后另一端位于片段定位器另一端的夾子上。當(dāng)片段定位器經(jīng)過一個(gè)閉合機(jī)械裝置2616時(shí)，此機(jī)械裝置旋轉(zhuǎn)使兩個(gè)輪翼升高以關(guān)閉片段定位器末端的夾子2608。一旦微器官被完全固定，就可以關(guān)閉真空拾取器和真空導(dǎo)槽的真空。微器官被安全地固定在微器官固定器2704上后，通過螺旋傳動(dòng)裝置推動(dòng)將導(dǎo)槽2011收回至微器官盒2010中，直到端口部位被清空，然后關(guān)閉端口。微器官模塊2010連同組織采集器模塊2202可以一起被丟棄。
圖28A顯示以上過程的側(cè)面觀，圖28B顯示微器官固定在片段定位器上。
升起生物反應(yīng)器的容器(bio-reactor base)2802直到超線性微器官固定器2704被封閉于容器2802的內(nèi)表面。容器2802的升起通過，例如，馬達(dá)2806驅(qū)動(dòng)的支持托板2805完成，馬達(dá)與支持托板間有連接器2808。在一個(gè)實(shí)施方案中，裝有超線性微器官的容器2802沒有被蓋子蓋住。任選地，如果需要，可以使用蓋子以防止由于振蕩導(dǎo)致的生物反應(yīng)器內(nèi)液體的濺出或減少蒸發(fā)。蓋子可以是松弛覆蓋的蓋子類似于有蓋培養(yǎng)皿或者是一個(gè)密封的蓋子以完全密封生物反應(yīng)器。蓋子可由硬的塑料材料或其他生物相容材料制成，或者由膜制成，例如能透過氣體不能透過液體的膜或其他類型的膜。能透過氣體的膜具有其他優(yōu)點(diǎn)，允許通過調(diào)節(jié)所述生物反應(yīng)器周圍附加的容器內(nèi)氣體的濃度來控制氣體環(huán)境。蓋子可在刀片組3220之下(以下描述)或位于其上。
圖29顯示一個(gè)加工站2900，具有一組模塊安裝于其中。在本發(fā)明的代表性實(shí)施方案中，參考圖23-28，以上描述的功能通過控制模塊2900左側(cè)的部分模塊完成，如圖所示。清楚的顯示是模塊2010、2020和2040。模塊2002連接在模塊2010的一個(gè)端口上，此端口在圖20和29中標(biāo)記為2014。操作過程中，模塊2002、2010、2020和2040掛接在真空調(diào)節(jié)器2923和流控控制器2921上，例如，通過快速斷開方式掛接。真空調(diào)節(jié)器2923和流控控制器2921受局部控制器2960控制，局部控制器2960受主控制器2940控制。局部控制器2960還控制開啟端口、旋轉(zhuǎn)固定器等操作所需的馬達(dá)，如上所述。應(yīng)該明白的是雖然對(duì)流控和電控都作了描述，但只能單獨(dú)使用流控或者電控。
利用獲取器模塊2002獲取組織樣品后，獲取器模塊2002通過端口2014被連接到模塊2010上。獲取的組織樣品被切割(圖23-25)，并且經(jīng)切割的微器官被傳送至模塊2020中，如上所述并參考圖26-28。此時(shí)，模塊2010連同仍與其相連的模塊2002已不再被需要，可以與模塊2020分離并被丟棄。
生物加工模塊2020和流控模塊2040被傳送至圖29中所示方位的右側(cè)的對(duì)接站。加工站2900可為含有不同組織樣品的盒式模塊提供多個(gè)對(duì)接站，這些組織樣品可能來源于多個(gè)患者/位置之一。多個(gè)對(duì)接站上的所有盒式模塊在其處理的開始階段都需要經(jīng)過左側(cè)的對(duì)接口。在圖的這一側(cè)，顯示模塊2020和2040連接至一個(gè)流控調(diào)節(jié)器2920(被流控控制器2932控制)和一個(gè)真空調(diào)節(jié)器2922(被真空控制器2934控制)。馬達(dá)2224、2226、2906和2912被馬達(dá)控制2936調(diào)節(jié)。
模塊2020和2040置于外殼2901中，通過加熱器2942保持理想的溫度，加熱器2942由溫度傳感器(未顯示)調(diào)節(jié)并由加熱器控制器2938控制?？刂破骺梢允菃为?dú)的控制器，也可以是大局部控制器2930的一部分。局部控制器2930還控制通過采樣器2912從TMO中采樣和分析。采樣器2912通過一個(gè)無菌的端口2943，例如一個(gè)隔膜，從生物反應(yīng)器2037中采集液體并將其注入分析器2996中。分析器2996傳送信息至主控制器2940。任選地，傳感器對(duì)多種參數(shù)敏感，如溫度、濕度、CO2、pH或其他生物反應(yīng)器中記錄或控制用的通常監(jiān)測(cè)的參數(shù)。
液體，例如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、排泄物、氣體等，通過流控模塊2040輸入輸出生物反應(yīng)器2037。
生長(zhǎng)介質(zhì)貯存在調(diào)劑容器2905中，在流控控制器2932的控制下釋放至生物反應(yīng)器2037中。
排泄物介質(zhì)在流控控制器2932的控制下排出到調(diào)劑容器2909中調(diào)劑容器2907可以釋放無菌氣體，例如氧氣、氮?dú)?、CO2、或它們的混合物?；蛘撸{(diào)劑容器2907可以被用于釋放抗生素、消毒劑或其他期望的液體。
如果在使用真空時(shí)需要平衡氣壓，可以在每個(gè)模塊上添加無菌空氣過濾器(未顯示)。
在主控制器2940執(zhí)行的主TMO處理程序(algorithm)的控制下，處理過程沿步驟的時(shí)間順序進(jìn)行，包括在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間注入或移除液體(包括基因轉(zhuǎn)染載體)，并且通過各種方法攪拌，例如固定在生物反應(yīng)器2037中的微器官的旋轉(zhuǎn)和平移運(yùn)動(dòng)、使用聲學(xué)能量作用于生物反應(yīng)器2037中的液體或者其他的方法。這些步驟的時(shí)間選擇和持續(xù)時(shí)間由預(yù)先設(shè)定的程序和/或測(cè)定的處理?xiàng)l件所決定，一般進(jìn)行選擇以適應(yīng)于特定基因或基因轉(zhuǎn)染載體的特性、應(yīng)用的目的、個(gè)體的特定數(shù)據(jù)。
基因轉(zhuǎn)染載體定量容器2950一般保存在低溫條件下，方法未顯示，在合適的時(shí)間被取出、解凍、通過一個(gè)無菌端口2929(例如一個(gè)隔膜)應(yīng)用，并注入調(diào)劑容器2911中。調(diào)劑容器2911在流控控制器2932的控制下依次注入生物反應(yīng)器2937中。
在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，一般是超線性微器官制成后24小時(shí)，基因轉(zhuǎn)染載體通過無菌端口2929被注入以充滿調(diào)劑容器2911，所述載體的第一部分釋放開始。
分析TMO的性能分析TMO的性能參數(shù)，例如蛋白質(zhì)生成率，可以在應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染載體之前、期間、之后的各種時(shí)間進(jìn)行，用于檢測(cè)和調(diào)節(jié)制備過程以得到具有期望性能的TMO，例如單位時(shí)間可生產(chǎn)出期望范圍的蛋白質(zhì)。進(jìn)行這種分析的一種方法是利用物理的方法從生物反應(yīng)器中獲取組織的樣品或者組織周圍的液體，應(yīng)用免疫分析或類似的化學(xué)或生物分析檢測(cè)樣品材料的一部分。另一種方法，可以代替第一種方法或與第一種方法聯(lián)合應(yīng)用，利用光學(xué)的方法、分子探針傳感器技術(shù)(例如DNA或蛋白質(zhì)分析)或其他本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)生物反應(yīng)器中TMO或它的培養(yǎng)液的性能參數(shù)，而不需要用物理的方法采樣分析?？梢匀芜x一種方法，在從微器官被引入生物反應(yīng)器到其被移出使用的期間上的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均可分析TMO的性能。
控制特定個(gè)體的微器官轉(zhuǎn)化成TMO的設(shè)計(jì)方案可以在制備TMO以達(dá)到期望的性能范圍的過程中應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)變量，這些變量的實(shí)施例包括但不限于1.載體處理的次數(shù)通過向含有微器官的生物反應(yīng)器介質(zhì)中添加基因轉(zhuǎn)染載體，利用載體一次或多次處理微器官2.每次處理的持續(xù)時(shí)間一般通過置換部分或全部介質(zhì)、從生物反應(yīng)器中移出剩余的載體的方法終止每一次的處理，還可簡(jiǎn)單的允許載體隨時(shí)間延長(zhǎng)失活或加熱失活或其他類似方法降低生物反應(yīng)器中載體的活性。處理之間的時(shí)間也是一個(gè)變量。
3.使用的載體的劑量每次處理應(yīng)用特定劑量或量的基因轉(zhuǎn)染載體，不同的處理可以選擇相同或不同的量。一般通過使用相同或不同特定效價(jià)的載體(使用病毒載體時(shí)是感染和非感染病毒粒子的效價(jià))或改變加入生物反應(yīng)器中的總?cè)萘恳愿淖兪褂玫妮d體量。
4.載體增強(qiáng)的方法可在載體存在于含有微器官的介質(zhì)中時(shí)或之前或之后，任選的采用一種或多種方法提高基因轉(zhuǎn)染的效率以增強(qiáng)載體的作用。這些方法包括添加各種已知具有增強(qiáng)載體的攝取或效應(yīng)作用的化學(xué)制劑；對(duì)微器官進(jìn)行物理的處理，例如組織(例如皮膚組織的角質(zhì)層或真皮)打磨或穿孔，以增加載體的進(jìn)入；在培養(yǎng)液中物理攪拌微器官；引起微器官或其培養(yǎng)液物理的振動(dòng)；將微器官或其培養(yǎng)液暴露于聲波或超聲波能量中；應(yīng)用各種電的方法增強(qiáng)載體的攝取或效應(yīng)，例如；電穿孔和應(yīng)用電磁場(chǎng)，等。
5.調(diào)節(jié)保存條件預(yù)定的培養(yǎng)液移除和置換的量和周期、氣體交換率、添加制劑如緩沖液或其他化學(xué)劑至生物反應(yīng)器培養(yǎng)液中，以保持生物反應(yīng)器中培養(yǎng)液的理想的條件。
6.步驟的時(shí)序安排從制備微器官直至TMO預(yù)備使用，微器官轉(zhuǎn)變成TMO的每一步的時(shí)間選擇和持續(xù)時(shí)間。
可以預(yù)設(shè)用于制備TMO的程序(algorithm)，固定已知時(shí)間選擇和持續(xù)時(shí)間的特定步驟的順序，包括固定上述變量的預(yù)設(shè)值和步驟的計(jì)劃表。或者，程序(algorithm)可被改編，設(shè)計(jì)成能夠依據(jù)測(cè)定的TMO在制備過程的各階段中的性能對(duì)一個(gè)或多個(gè)以上的變量進(jìn)行自我調(diào)整，以改變TMO的性能使其在用于治療一個(gè)個(gè)體時(shí)能夠達(dá)到理想范圍的值。
制備期間，通過采樣器2912對(duì)生物反應(yīng)器2937中的培養(yǎng)液進(jìn)行采樣并利用分析器2996分析樣品，一般是對(duì)生成的特定期望的蛋白質(zhì)定量分析，分析采用本領(lǐng)域已知的分析方法之一，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。還可以使用其他的測(cè)試檢測(cè)TMO產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的性質(zhì)，例如光譜分析或其他測(cè)試。
另外，一般通過采樣檢測(cè)TMO的安全性，例如無菌和不含特定的外來藥物。
當(dāng)處理結(jié)果表明TMO已制備完成并準(zhǔn)備應(yīng)用至一個(gè)個(gè)體時(shí)，容器2802被進(jìn)一步升起(如圖30所示)并推進(jìn)至刀片組3220，刀片組中的刀片2804與相鄰片段定位器之間預(yù)先形成的狹槽相匹配(圖32)。圖31顯示刀片的上面觀(與圖30的側(cè)面觀比較)。接觸容器后，刀片3804將超線性微器官切割成單獨(dú)的片段。
任選地，刀片組3220可被保留于原位，用于將液體和單獨(dú)的微器官/TMO充分分離成單獨(dú)的腔室。這樣就可以從每個(gè)分離的切割的微器官/TMO片段中單獨(dú)取樣。在這種實(shí)例中，在容器2802的底面和側(cè)面具有軟的、生物相容的、不能滲透的層3004，例如硅橡膠。刀片組3220具有一個(gè)相同材料的嵌于其底面的內(nèi)部盤(innerdisk)3012。刀片組3220與容器2802的內(nèi)徑緊密配合，隨著它的下降切入層3004中，此時(shí)盤3012與容器2802的底面緊密配合。結(jié)果每一個(gè)TMO片段形成一個(gè)單獨(dú)的腔室，與其他片段充分隔離，允許測(cè)量每個(gè)片段的單獨(dú)的分泌水平。
準(zhǔn)備TMO以應(yīng)用至一個(gè)個(gè)體時(shí)，應(yīng)估計(jì)所需使用的片段的數(shù)量，一般需要參考以下數(shù)據(jù)，但不限于此a)依據(jù)針對(duì)相似個(gè)體已制定的使用方法、特定的臨床方案或人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料，相同治療用蛋白質(zhì)常規(guī)應(yīng)用于同類個(gè)體的相應(yīng)的量。
b)在相同個(gè)體以前曾通過注射或其他途徑應(yīng)用相同的治療用蛋白質(zhì)時(shí)，相同治療用蛋白質(zhì)特定地應(yīng)用于相同個(gè)體的相應(yīng)的量。
c)個(gè)體的數(shù)據(jù)，例如體重、年齡、身體健康狀況、臨床狀況。
d)以前TMO應(yīng)用于其他相似個(gè)體所得到的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。
e)以前TMO應(yīng)用于此個(gè)體所產(chǎn)生的反應(yīng)。
將模塊從對(duì)接站移出，可拆分的一個(gè)TMO傳送模塊3300通過連接3304和密封墊圈3306密封地連接至生物加工器2020上并且被插回加工站2900左側(cè)的對(duì)接站(圖34)。(圖中顯示的3402是什么？它是對(duì)接站么？)如圖33和34所示，傳送模塊3300包括一個(gè)腔3302，腔上有端口3305；固定在x-y平臺(tái)(x-y stage)3311上的多個(gè)傳送釘3310，x-y平臺(tái)(x-y stage)含有兩個(gè)導(dǎo)螺桿3312和3314，由馬達(dá)3406驅(qū)動(dòng)(概略地顯示)。傳送釘3310適合選擇性地通過端口3305。
如圖34所示，模塊2020在保持與模塊2040相連的同時(shí)與模塊3300相連，形成組合體3402。模塊2020與模塊3300之間的端口被打開。非常概略地顯示兩個(gè)馬達(dá)3404和3406。運(yùn)轉(zhuǎn)這些馬達(dá)可以轉(zhuǎn)動(dòng)微器官固定器2704并且操作x-y平臺(tái)(x-y stage)3311。
圖35顯示一個(gè)釘3310伸入模塊2020中，與一個(gè)微器官片段定位器2610連接。圖37(在A中)顯示釘3310連接至片段定位器2610頂部的環(huán)2612上。輕微旋轉(zhuǎn)微器官固定器2704或者橫向移動(dòng)釘3310(通過x-y平臺(tái)(x-y stage))可導(dǎo)致片段定位器(連同一個(gè)微器官/TMO片段3702)與固定器2704分離，使微器官片段3702被釘3310固定(在B中)。環(huán)2612顯示為圓形結(jié)構(gòu)，但也可以是管狀或其他形狀，以協(xié)助抓住釘3310的引導(dǎo)部分。
然后，通過控制x-y平臺(tái)(x-y stage)可將釘3310和片段3702一起撤回至模塊3300中，如圖36所示?？梢詫⒘硗獾尼斞b入x-y平臺(tái)(x-ystage)并從模塊2020中抓取另外的微器官片段，此過程可以多次重復(fù)以獲得移植所需數(shù)量的片段。關(guān)閉端口，模塊2020與模塊2040一起可以返回圖29中右側(cè)的對(duì)接站以繼續(xù)保存剩余的微器官/TMO。
整個(gè)TMO傳送模塊3300從組合體上分離，并被輸送至處理中心，任選地，輸送時(shí)控制溫度、濕度、氣體和其他環(huán)境參數(shù)。任選地，模塊3300具有可手工操作取出想要的釘3310的功能。
當(dāng)微器官/TMO將要被移植時(shí)，從模塊3300中取出釘，并且傳送到工具1110上用于移植(圖38)，參考圖11的描述。當(dāng)然，本領(lǐng)域所描述的或本文中所描述的其他方法也可以被使用。
一般在一個(gè)臨床潔凈的房間中，例如門診患者診所或手術(shù)室中，應(yīng)用微器官/TMO。一般在處理室中在受體的面前手工使用模塊3300。
如圖38所示，每個(gè)取出的釘3310可能都需要經(jīng)過矯直處理。如左邊的圖所示，如果處理過程中微器官/TMO片段3702松弛，將導(dǎo)致在下一個(gè)步驟中片段不能充分伸直，通過矯直可獲得下圖的結(jié)果。
注意每個(gè)片段定位器包括一個(gè)共同的棘條3810上的三個(gè)部分，顯示為3802、3804和3806。通過將3802和/或3806部分向遠(yuǎn)離中心部分3804的方向牽拉，也可以使TMO片段緊張，得到伸直的片段3812。
伸直的微器官/TMO片段現(xiàn)在可以從片段定位器中以可靠的定向被移出。一般使用真空拾取工具1110完成這一步驟，以結(jié)合參考圖11所描述的方法使用。與真空源相連的工具1110與伸直的片段3812緊密接觸，以使其能夠固定住伸直的片段3812的角質(zhì)層3816一側(cè)并且通過其真空孔固定微器官/TMO。
重復(fù)此過程，直到所需數(shù)量的微器官/TMO應(yīng)用至受體。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器被保存在接近體溫的條件下(例如36-38℃；于高濕度下，優(yōu)選95％；含豐富CO2的空氣(3-10％CO2、90-97％空氣)。任選地，微器官保存條件中含有抗生素、抗真菌劑和/或其他藥物。準(zhǔn)確測(cè)量蛋白質(zhì)分泌所需的化學(xué)藥品或試劑可以冷凍保存以等待被使用。
輸入指令和接收數(shù)據(jù)的控制中心也是任選提供的。控制器2940具有軟件，以使程序自動(dòng)化或半自動(dòng)化并且提供數(shù)據(jù)給顯示器。
應(yīng)該明白的是，通過實(shí)施例提供的本發(fā)明代表性實(shí)施方案的非限制的細(xì)節(jié)描述對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，其目的不是為了限制本發(fā)明的范圍。特別是，所描述的系統(tǒng)顯示得非常詳細(xì)。很明顯，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員以上描述的許多操作可以通過其他方法完成，并且以上描述的許多過程和顯示的特征并非絕對(duì)必要。
例如，僅僅顯示了有限數(shù)量的遺傳改變。然而，依據(jù)本文中描述的方法活組織被移植到患者體內(nèi)并且移植后組織在體內(nèi)保持活力，很明顯實(shí)際上通過任意的已知方法誘導(dǎo)的組織任意的遺傳改變都將導(dǎo)致患者分泌目標(biāo)蛋白質(zhì)或其他治療劑。
本發(fā)明的實(shí)施方案可以產(chǎn)生變化，包括結(jié)合各種實(shí)施方案的特點(diǎn)。因此，本發(fā)明的范圍僅被權(quán)利要求的范圍所限制。另外，為避免有關(guān)權(quán)利要求的范圍的問題，在權(quán)利要求中使用的術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”、“具有”以及它們的同根詞的含義是“包括但不必限于”。
權(quán)利要求
1.由組織形成的微器官結(jié)構(gòu)，其包括至少兩個(gè)微器官部分，其中所述至少兩個(gè)微器官通過連接點(diǎn)互相連接，所述連接點(diǎn)由形成該微器官的所述組織形成。
2.權(quán)利要求1的微器官結(jié)構(gòu)，其中至少三個(gè)微器官通過同一連接點(diǎn)互相連接，所述連接點(diǎn)由與形成所述微器官相同的組織形成。
3.由權(quán)利要求1的微器官的連接點(diǎn)形成的微器官網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中多個(gè)所述連接點(diǎn)由微器官互相連接，其中至少一個(gè)這樣的微器官在該微器官的一端連接至所述連接點(diǎn)之一，并且在所述微器官的另一端連接至另一個(gè)連接點(diǎn)。
4.分段線性微器官結(jié)構(gòu)，其包括權(quán)利要求1的互連連接點(diǎn)，其中至少一些所述互連連接點(diǎn)有兩個(gè)線性微器官與之相連。
5.分段線性微器官結(jié)構(gòu)，其包括權(quán)利要求1的互連連接點(diǎn)，其中至少一些所述互連連接點(diǎn)有多于兩個(gè)的線性微器官與之相連。
6.權(quán)利要求5的分段線性微器官結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)互連連接點(diǎn)有四個(gè)線性微器官結(jié)構(gòu)與之相連。
7.權(quán)利要求6的分段線性微器官結(jié)構(gòu)，其中該線性微器官結(jié)構(gòu)與該連接點(diǎn)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
8.權(quán)利要求5的分段微器官結(jié)構(gòu)，其中該線性微器官與該連接點(diǎn)形成超線性結(jié)構(gòu)，所述超線性結(jié)構(gòu)包括一串交替的微器官與連接點(diǎn)。
9.權(quán)利要求1-8之任一項(xiàng)的微器官結(jié)構(gòu)，其中該微器官由多個(gè)組織層構(gòu)成，并且其中該連接點(diǎn)包括相同的層。
10.權(quán)利要求9的微器官結(jié)構(gòu)，其中該連接點(diǎn)是微器官。
11.權(quán)利要求1-8之任一項(xiàng)的微器官結(jié)構(gòu)，其中該微器官由多個(gè)組織層構(gòu)成，并且其中該連接點(diǎn)包括較該微器官少的層。
12.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的微器官結(jié)構(gòu)，其中該組織是人皮膚組織。
13.用于通過切割而從大塊組織制備微器官的裝置，其包括a)包括多個(gè)鄰接的切割刀片的切割陣列，所述切割刀片沿其各自長(zhǎng)度的至少一段彼此間非常接近且互相平行地配置，并且沿所述段彼此間保持大致相等的距離，使得所述鄰接的切割刀片的刀刃沿所述段以約200微米至約2000微米的切片距離分開；b)組織樣品負(fù)載器，其適于固定組織切片，使得被固定在所述負(fù)載器上的所述組織被按壓于所述切割陣列上，所述組織被所述切割刀片切割。
14.權(quán)利要求13的裝置，其包括可移出護(hù)罩，所述可移出護(hù)罩包括至少一個(gè)插入物，所述插入物與切割刀片的平行的段間相適應(yīng)，而不妨礙刀片的切割作用。
15.權(quán)利要求14的裝置，其中該至少一個(gè)插入物包括多個(gè)所述插入物。
16.權(quán)利要求15的裝置，其中所述多個(gè)插入物連接在一起，以便它們可以一起插入切割刀片之間或一起從切割刀片之間移出。
17.權(quán)利要求15的裝置，其中多個(gè)線性插入物在其末端連接在一起。
18.權(quán)利要求13-17之任一項(xiàng)的裝置，其包括用于在所述樣品負(fù)載器和所述切割陣列之間施加壓力的工具。
19.權(quán)利要求13-18之任一項(xiàng)的裝置，其中全部切割刀片有相同的長(zhǎng)度，使得它們從組織樣品切下多個(gè)線性微器官。
20.權(quán)利要求13-18之任一項(xiàng)的裝置，其中切割刀片具有基本上相同的長(zhǎng)度，但縱向地彼此偏移，使得它們切下多個(gè)線性微器官，所述線性微器官在其交替的末端通過連接點(diǎn)微器官結(jié)構(gòu)連接于鄰接的線性微器官。
21.權(quán)利要求13-18之任一項(xiàng)的裝置，其中該切割陣列包括至少三組在以給定的間隔隔開的刀片的線性陣列中各自首尾相接排列的多個(gè)刀片，其中所述線性陣列并排排列，一個(gè)陣列的間隔位于鄰接陣列的間隔之間。
22.權(quán)利要求21的裝置，其中該給定的間隔是切片間隔的0.5至2倍。
23.權(quán)利要求13-18之任一項(xiàng)的裝置，其中全部切割刀片有相同的長(zhǎng)度，且無彼此偏移，并且其中在鄰接刀片的交替末端，刀片的刀刃低于刀片的其余部分的刃，使得刀片從組織切下多個(gè)線性微器官，所述線性微器官通過連接點(diǎn)相連，所述連接點(diǎn)較組織的完整厚度薄。
24.權(quán)利要求13-18之任一項(xiàng)的裝置，其中全部切割刀片有相同的長(zhǎng)度，且無彼此偏移，并且其中形成在相應(yīng)于鄰接刀片的交替末端的位置具有凹陷的組織固定器，使得刀片從組織切下多個(gè)線性微器官，所述線性微器官通過連接點(diǎn)相連，所述連接點(diǎn)較組織的完整厚度薄。
25.權(quán)利要求13-18之任一項(xiàng)的裝置，其中該切割陣列包括至少三個(gè)刀片，所述刀片在其上周期性隔開地具有低于該刀片的其余部分的切削表面的表面的刀刃，其中所述線性陣列并排排列，一個(gè)刀片的較低切削表面位于鄰接刀片的較低切削表面之間，使得在較低切削表面形成一系列連接點(diǎn)，所述連接點(diǎn)的厚度小于該組織樣品的厚度。
26.權(quán)利要求13-18之任一項(xiàng)的裝置，其中該切割陣列包括至少三個(gè)刀片，并且其中形成在其上具有周期性隔開的凹陷的多個(gè)平行陣列的組織負(fù)載器，所述凹陷相應(yīng)于所述切割刀片的位置，一個(gè)陣列的凹陷位于鄰接陣列的凹陷之間，使得在凹陷處形成一系列連接點(diǎn)，所述連接點(diǎn)的厚度小于該組織樣品的厚度。
27.權(quán)利要求13-15之任一項(xiàng)的裝置，其中所述刀片呈一系列同心圓排列，以所述切片間隔隔開，使得多個(gè)環(huán)形的微器官?gòu)脑摻M織產(chǎn)生。
28.權(quán)利要求13的裝置，其中所述刀片具有連續(xù)螺旋的形式，所述連續(xù)螺旋被所述切片間隔隔開，使得螺旋形式的微器官得以產(chǎn)生。
29.權(quán)利要求13-28之任一項(xiàng)的裝置，其中所述組織負(fù)載器適于通過真空固定所述組織。
30.權(quán)利要求13-28之任一項(xiàng)的裝置，其中所述組織負(fù)載器適于通過將所述組織粘附于該負(fù)載器的表面而固定之。
31.通過切割而從組織制備易裝卸的微器官或微器官結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括a)提供合適厚度的形成該微器官的組織；b)提供權(quán)利要求13-30之任一項(xiàng)的裝置；c)將該組織置于所述裝置的樣品負(fù)載器上；d)使該負(fù)載器上的組織與所述裝置的切割刀片緊密接觸；和e)將所述組織按壓于所述刀片，直到已將所述組織的至少一部分切透其厚度，從而產(chǎn)生至少一個(gè)微器官或微器官結(jié)構(gòu)。
32.通過切割而從組織制備易裝卸的微器官或微器官結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括a)提供合適厚度的形成該微器官的組織；b)提供權(quán)利要求14-17及其從屬權(quán)利要求之任一項(xiàng)的裝置，使得所述插入物被置于所述刀片之間；c)將該組織置于所述裝置的組織負(fù)載器上；d)使該負(fù)載器上的組織與所述裝置的切割刀片緊密接觸；e)將所述組織按壓于所述刀片，直到已將所述組織的至少一部分切透其厚度，從而產(chǎn)生至少一個(gè)微器官或微器官結(jié)構(gòu)；和f)通過從所述切割刀片之間移出該罩而從該切割刀片之間移出該至少一個(gè)微器官或微器官結(jié)構(gòu)，從而在移出的罩的表面上處理該切下的微器官。
33.權(quán)利要求31或權(quán)利要求32的方法，其中按壓包括從該負(fù)載器的一端向另一端轉(zhuǎn)動(dòng)圓柱狀滾筒，在其轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)切割該組織。
34.從組織樣品制備微器官的方法，所述方法包括提供薄組織樣品，所述樣品具有一定厚度和方向垂直于該厚度的長(zhǎng)度；和在該樣品的至少一部分上切透該樣品的厚度，產(chǎn)生微器官，所述微器官至少一維小于2000微米，并且至少另一維大于長(zhǎng)度的最大尺寸。
35.權(quán)利要求34的方法，其中該切割包括沖壓作用。
36.權(quán)利要求34或權(quán)利要求35的方法，其中該薄組織樣品是薄的，基本上為矩形的組織樣品，并且其中該切割為一系列基本上直的切器的形式，其基本上平行于一端，所述切割具有相似的長(zhǎng)度，并且于縱向上彼此偏移，以便在該切器的交替末端的交替組織條之間留下所述組織的連接點(diǎn)。
37.權(quán)利要求36的方法，其包括展開如此形成的切割樣品以產(chǎn)生伸展的微器官，所述微器官包括由所述連接點(diǎn)連接的組織條。
38.權(quán)利要求34的方法，其中切割包括以螺旋形切割。
39.權(quán)利要求38的方法，其包括解開該螺旋以提供伸展的細(xì)長(zhǎng)微器官。
40.權(quán)利要求34的方法，其中切割包括用一系列同心圓切器切割組織。
41.從組織樣品制備微器官的方法，所述方法包括提供薄組織樣品，所述樣品具有一定厚度和方向垂直于該厚度的長(zhǎng)度；和用多個(gè)切器同時(shí)切透該樣品的厚度，所述切器在該切器的縱向排列形成，每一列有多個(gè)被螺距隔開，并且被間隔分開的隔開的切器，交替的列中的切器沿該切器的方向偏移，以便給定列的間隔與鄰接列的切器部分相鄰。
42.權(quán)利要求41的方法，其中該偏移約等于該螺距的一半，并且每一列的切器基本上以鄰接列的間隔為中心。
43.權(quán)利要求41的方法，其中鄰接切器之間的距離為200至2000微米。
44.權(quán)利要求43的方法，其中該距離為500至1500微米。
45.權(quán)利要求41-44之任一項(xiàng)的方法，其中鄰接切器之間的距離為鄰接列之間的距離的五分之一至五倍。
46.權(quán)利要求41-45之任一項(xiàng)的方法，其中鄰接切器之間的距離為鄰接列之間的距離的一半至兩倍。
47.權(quán)利要求41-44之任一項(xiàng)的方法，其中該間隔約等于鄰接列之間的距離。
48.權(quán)利要求41-46之任一項(xiàng)的方法，其包括拉伸所述切割組織樣品以便其形成網(wǎng)。
49.權(quán)利要求41-48之任一項(xiàng)的方法，其中切割包括沖壓作用。
50.權(quán)利要求34-49之任一項(xiàng)的方法，其中該薄組織樣品是皮膚組織，其至少包括表皮的基底層和部分真皮。
51.權(quán)利要求50的方法，其中該組織樣品包括整個(gè)表皮。
52.權(quán)利要求50或權(quán)利要求51的方法，其中該組織樣品包括角質(zhì)層。
53.權(quán)利要求50-52之任一項(xiàng)的方法，其中該組織樣品包括大部分真皮。
54.權(quán)利要求50-53之任一項(xiàng)的方法，其中該樣品包括基本上整個(gè)真皮。
55.權(quán)利要求34-54之任一項(xiàng)的方法，其中該薄組織樣品厚0.3至3毫米。
56.權(quán)利要求55的方法，其中該組織樣品厚0.5至1.5毫米。
57.權(quán)利要求34-56之任一項(xiàng)的方法，其中該切器之間的距離為200至2000微米。
58.權(quán)利要求57的方法，其中切器之間的距離為500至1500微米。
59.權(quán)利要求41-49之任一項(xiàng)的方法，其中該刀片的長(zhǎng)度與該刀片之間的間隔的比為1∶1至100∶1。
60.用于在微器官的保持和任選的遺傳修飾過程中或者在運(yùn)輸過程中將微器官固定于生物反應(yīng)器中的定位器，其包括固定器體，其具有一個(gè)或多個(gè)孔，在該孔上固定該微器官；和多個(gè)微器官固定元件，所述元件固定相對(duì)于所述一個(gè)或多個(gè)孔并列的所述微器官，使得所述微器官的超過70％的兩側(cè)得以暴露。
61.權(quán)利要求60的定位器，其中該微器官的兩側(cè)的超過80％得以暴露。
62.權(quán)利要求60的定位器，其中該微器官的兩側(cè)的超過90％得以暴露。
63.權(quán)利要求60-61之任一項(xiàng)的定位器，其中所述微器官具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且所述固定元件包括適于在所述網(wǎng)和所述孔的周圍固定該網(wǎng)的元件。
64.權(quán)利要求63的定位器，其中該固定器包括釘或桿，其通過部分或完全拉伸的網(wǎng)中的開口放置，從而將該網(wǎng)固定于該孔上。
65.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的定位器，其中所述微器官具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且其中所述固定元件包括適于在其非微器官的周圍固定該網(wǎng)的元件。
66.權(quán)利要求65的定位器，其中該固定器包括釘或桿，其適于穿透或通過其非微器官周圍中的開口放置，從而將該網(wǎng)固定于該孔上。
67.權(quán)利要求60的定位器，其中所述固定器體是具有圓周槽的環(huán)，所述槽包括所述孔。
68.權(quán)利要求65的定位器，其中該槽的軸向長(zhǎng)度為300至2000微米。
69.權(quán)利要求68的定位器，其中該槽的軸向長(zhǎng)度大于500微米。
70.權(quán)利要求68的定位器，其中該槽的軸向長(zhǎng)度為1毫米或更高。
71.權(quán)利要求67-70之任一項(xiàng)的定位器，其中該固定元件沿該環(huán)的圓周放置，并且適于將長(zhǎng)的微器官以其長(zhǎng)度沿圓周固定，使得在該固定元件之間該微器官得以暴露。
72.在微器官的保持和任選的遺傳修飾過程中以及在運(yùn)輸過程中固定微器官的方法，所述方法包括提供具有至少兩個(gè)微器官固定元件的固定定位器；將該微器官固定于所述固定元件中，使得至少該微器官的表面介于各元件之間，并且該表面的所有側(cè)均得以暴露。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由組織形成的微器官結(jié)構(gòu)，其包括至少兩個(gè)微器官部分，其中所述至少兩個(gè)微器官通過連接點(diǎn)互相連接，所述連接點(diǎn)由形成該微器官的所述組織形成。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1612717SQ02826777
公開日2005年5月4日 申請(qǐng)日期2002年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月5日
發(fā)明者安德魯·L.·珀?duì)柭? 斯蒂芬·F.·貝洛莫, 倫納德·I·加芬克爾, 吉列爾莫·A.·皮瓦, 梅納赫姆·D.·沙維特, 利奧爾·羅森貝格, 伊扎克·利平, 莫迪凱·布赫曼, 埃諾特·阿爾蒙, 諾姆·沙尼, 尼夫·謝爾 申請(qǐng)人:邁德詹尼克斯公司