專利名稱：Ee3蛋白家族及相應(yīng)的dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及(i)DNA序列，(ii)含本發(fā)明DNA序列的表達(dá)載體，(iv)含本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，(v)本發(fā)明DNA序列編碼的基因產(chǎn)物，(vi)關(guān)于本發(fā)明DNA序列的轉(zhuǎn)基因動物，(vii)抗本發(fā)明基因產(chǎn)物的抗體，(viii)表達(dá)和/或分離本發(fā)明基因產(chǎn)物的方法，(ix)本發(fā)明DNA序列和/或基因產(chǎn)物作為藥物的用途，(x)藥用活性化合物以及制備和使用這類本發(fā)明化合物的方法和(xi)本發(fā)明DNA序列和/或基因產(chǎn)物的非治療用途。
目前已知許多蛋白屬于G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)。它們構(gòu)成涉及信號傳導(dǎo)的膜結(jié)合分子的超家族。它們由眾多的配體和其他的刺激激活，比如光(視紫質(zhì))、氣味(氣味受體)、鈣、氨基酸或生物胺、核苷酸、肽、脂肪酸和脂肪酸衍生物和各種多肽。估計在哺乳動物中GPCRs超家族包含約1500種不同的蛋白，其中大約1200種編碼嗅覺、味覺或犁鼻受體。孤兒GPCRs(即，至今為止未發(fā)現(xiàn)與任何功能相關(guān)的受體)的總數(shù)估計有200-500(Howard AD，McAllister G，F(xiàn)eighner SD，Liu Q，Nargund RP，Van der Ploeg LH，PatchettAA(2001)孤兒G-蛋白偶聯(lián)受體和天然配體的發(fā)現(xiàn)，TrendsPharmacol Sci.22132-140.)。在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中，GPCR序列約占基因組的5％和大約編碼1000種GPCR受體蛋白(BargmannCI(1998)秀麗隱桿線蟲基因組的神經(jīng)生物學(xué)，Science 2822028-2033和Bargmann CI，Kaplan JM(1998)秀麗隱桿線蟲神經(jīng)系統(tǒng)中的信號傳導(dǎo)，Annu Rev Neurosci 21279-308)。
現(xiàn)有技術(shù)中已知約有200種黑腹果蠅GPCR序列(Brody T，Cravchik A(2000)黑腹果蠅G-蛋白偶聯(lián)受體．J Cell Biol.15083-88)。這一系列構(gòu)象相似的分子被認(rèn)為以會聚形式形成，目的是與G蛋白偶聯(lián)。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，GPCRs可分為3或4個家族。其中，A家族至今為止包含最多的成員，它包括比如嗅覺受體(Buck L，Axel R(1991)一個新的多基因家族可能編碼嗅覺受體氣味識別分子，Cell 65175-187)。B家族包括分泌素、VIP和降鈣素受體。C家族包括的受體比如有代謝性的谷氨酸受體、鈣受體、GABA-B受體、味覺受體和信息素受體。但是，幾乎所有的孤兒GPCR序列都屬于A家族。
GPCR家族的一個特點就是通過G蛋白來進(jìn)行信號傳導(dǎo)。與細(xì)胞外的配體結(jié)合引起傳導(dǎo)信號的G蛋白激活。大約有200種不同的G蛋白，而且每種細(xì)胞可能都有不同的一套。G蛋白的激活形式是G蛋白結(jié)合形式，所述的G蛋白在失活狀態(tài)與GDP相連。因為G蛋白是一GTP激酶(GTPase)，在與GTP結(jié)合后G-蛋白自身失活。因為這個原因，通過G蛋白的信號傳導(dǎo)總是瞬間的事件。每種G蛋白包含3個亞單位，α、β和γ。α亞單位可與GTP結(jié)合，因此能充分地控制下游的信使(“第二信使”系統(tǒng))。比如G蛋白Gs激活腺甘酸環(huán)化酶，導(dǎo)致胞內(nèi)信使cAMP的濃度升高。G蛋白Gi抑制腺甘酸環(huán)化酶和Gq激活磷酸激酶C(第二信使肌醇三磷酸酯和二?；视?。其他經(jīng)常涉及的第二信使系統(tǒng)例如有鈣、K、cGMP等。也存在嵌合G蛋白。Gβ和γ亞單位在三聚蛋白復(fù)合體形成后同樣可導(dǎo)致信號傳導(dǎo)，比如可能存在MAP激酶激活信號傳導(dǎo)途徑。特定GPCR的G蛋白偶聯(lián)的特異性是一個重要的藥理特征，特別是這可用于建立分析體系，典型的是測定下游信使?jié)舛鹊淖兓热玮}、cAMP或IP3。最近，文獻(xiàn)資料的初步結(jié)論認(rèn)為MAP激酶信號傳導(dǎo)途徑同樣可傳導(dǎo)GPCR信號(Marinissen MJ，Gutkind JS(2001)G蛋白偶聯(lián)受體和信號網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)變化．Trends Pharmacol Sci.22368-376.)。
最后，從原理上講，還可能存在一種G蛋白非依賴性信號傳導(dǎo)，即，比如β-2-腎上腺素能受體與NHERF直接作用調(diào)節(jié)Na/H交換器的活性(Hall RA，Premont RT，Chow CW，Blitzer JT，Pitcher JA，Claing A，Stoffel RH，Barak LS，Shenolikar S，Weinman EJ，GrinsteinS，Lefkowitz RJ(1998)β-2-腎上腺素能受體與Na+/H+-交換器調(diào)節(jié)因子作用控制Na+/H+交換，Nature 392626-630)。
大部分并不是全部GPCR受體都有的另一個特征是寡聚化。在此特別感興趣的是不同GPCRs之間的異源二聚體，這可能改變藥理特性和配體特異性(Bouvier M.(2001)G蛋白偶聯(lián)傳遞受體的寡聚化，NatRev Neurosci 2274-286)。因此，比如GABA-B受體只有形成GBR1和GBR2的異源二聚體才能起作用(Kuner R，Kohr G，Grunewald S，Eisenhardt G，Bach A，Kornau HC(1999)，異源體形成在GABAB受體功能中的作用，Science，28374-77)。自此已報道許多這樣的GPCRs的異源二聚合，比如mGluR5、δ-阿片樣物質(zhì)受體等。最近，證據(jù)顯示在驚厥之前GPCR異源二聚體中一種成分的過量表達(dá)導(dǎo)致發(fā)病。緩激肽II受體的增強表達(dá)導(dǎo)致緩激肽II-血管緊張素II受體異源二聚體的增加，它可改變藥理學(xué)應(yīng)答，這可解釋高張性表型(AbdAlla，Lother，Massiery和Quitterer，Nat.Medicine(2001)，7，1003-1009)。
最后，GPCR類蛋白是優(yōu)選的藥理靶分子。在銷售最好的100種藥物中超過25％的藥物藥理性作用于GPCR類蛋白(Flower等人，1999，Biochim.Biophys.Acta，1422，207-234)。因而特別是下列受體的拮抗劑和激動劑具有重要的藥理作用腎上腺素受體組、血管緊張素II受體、5-HT受體、多巴胺受體、組胺受體、白三烯/前列腺素受體。作用于所述受體的藥物涉及治療眾多的疾病范圍，從精神病癥狀(精神分裂癥、抑郁)、影響高血壓到心搏停止的急救藥物。已知的作用于這些受體的傳統(tǒng)藥物，比如是α-腎上腺素受體激動劑(去甲苯福林)、β-腎上腺素受體激動劑(異丙腎上腺素、非諾特羅)、α-腎上腺素受體阻斷劑(哌唑嗪)、β-腎上腺素受體阻斷劑(萘心安)、5-HT拮抗劑(賽庚啶)、H2受體阻斷劑(西咪替丁)、H1受體阻斷劑(特非那定)、多巴胺受體激動劑(溴隱亭)等。
盡管已付出了許多努力，然而所述受體影響的信號傳導(dǎo)途徑還是沒有完全闡明清楚。除此之外，對于各種GPCR系統(tǒng)相互影響的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)和對下游胞內(nèi)過程的作用，特別是與外表生理狀態(tài)的關(guān)系缺乏進(jìn)一步的了解。
本發(fā)明的一個目的是發(fā)現(xiàn)GPCR蛋白的新成員和相應(yīng)的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個目的是根據(jù)已鑒定的蛋白提供能研制治療性干預(yù)病理生理學(xué)的治療有效物質(zhì)的方法，所述病理生理學(xué)是由比如表達(dá)失調(diào)和/或無活性變異體的表達(dá)導(dǎo)致的，但在生理表達(dá)情況下也可能出現(xiàn)。對此，提供相應(yīng)的物質(zhì)也是本發(fā)明的一個目的。
本發(fā)明的這些目的通過權(quán)利要求1、5、6、8、11、12、15、16、17、20、23、26和27的主題實現(xiàn)。有利的實施方案描述于相關(guān)的從屬權(quán)利要求中。
本發(fā)明的一個主題涉及核苷酸序列，特別是DNA序列，它包括編碼具有氨基酸序列AA10-AA45(附

圖13中的序列5，都是從氨基端到羧基端)，優(yōu)選為AA10-65、AA10-AA45(附圖14中的序列6)，更優(yōu)選為AA10-75、AA10-AA45(附圖15A中的序列7A)，更優(yōu)選為AA10-60、AA10-AA45(附圖15B中的序列7B)，更優(yōu)選為AA10-60，更進(jìn)一步優(yōu)選為AA10-AA100、AA10-AA45(附圖15C中的序列7C)，更優(yōu)選為AA10-60，更進(jìn)一步優(yōu)選為AA10-AA100、AA10-AA45(附圖15B中的序列7B)，更優(yōu)選為AA10-60，更進(jìn)一步優(yōu)選為AA10-AA70、AA10-AA45(附圖16中的序列8)，更優(yōu)選為AA10-60，更進(jìn)一步優(yōu)選為AA10-AA100或AA10-AA45(附圖18中的序列11)，更優(yōu)選為AA10-60，更進(jìn)一步優(yōu)選為AA10-AA100的序列區(qū)，包括任何功能性同源衍生物、片段或等位基因。更進(jìn)一步優(yōu)選為那些核苷酸序列，特別是DNA序列，它包括編碼具有ee3家族蛋白的氨基酸序列的多肽，特別是包括本發(fā)明蛋白的C-端胞內(nèi)區(qū)或相應(yīng)片段(優(yōu)選為至少25個氨基酸長度)。特別是包括公開的可與本發(fā)明序列雜交的任何核苷酸序列，包括在各種情況下雙鏈中的互補鏈序列。
另一個優(yōu)選的實施方案披露了DNA序列，其基因產(chǎn)物編碼如附圖13、14、15A、15B、15C、16和18中的相應(yīng)序列5、6、7A、7B、7C、8和11所示的多肽，包括這些DNA序列中任一個的任何功能性同源衍生物、等位基因或片段，以及可抑制生理功能如凋亡信號級聯(lián)的非功能性衍生物、等位基因、類似物或片段(比如DN變異體)。也披露了可與本發(fā)明所述的DNA序列雜交的任何DNA序列(包括互補DNA鏈序列)。優(yōu)選地，具有序列5-8，或其他的ee3家族的天然成員的本發(fā)明的氨基酸序列的衍生物、等位基因、片段或類似物，至少保留一種生物特性。通過標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人1989和2001，Molecular Cloning實驗手冊，Cold Spring Harbor，NY)制備這種變異體、類似物、片段或等位基因。在屬于ee3家族的本發(fā)明的DNA序列比如根據(jù)附圖9、10、11A、11B、11C或12中的一個或多個密碼子的插入、缺失或取代，以在轉(zhuǎn)錄和翻譯后獲得不同于相應(yīng)的天然ee3蛋白，特別是如附圖13、14、15A、15B、15C、16或18中所示的序列的多肽，所述不同至少為一個氨基酸。
本申請也涉及本發(fā)明天然ee3序列，比如附圖9、10、11A、11B、11C或12所示的序列的部分DNA序列。典型地，這些部分序列包括附圖9、10、11A、11B、11C或12中所示核苷酸序列的片段，這些片段包含有至少60個，更優(yōu)選為至少150個，更進(jìn)一步優(yōu)選為至少250個核苷酸。優(yōu)選的部分序列編碼特別是延伸自下列的多肽AA20(SEQ.5)、AA20(SEQ.6)、AA20(SEQ.7A)、AA20(SEQ.7B)、AA10(SEQ.7C)和AA20(SEQ.8)，至C端至少20AA，優(yōu)選為至少40AA，最優(yōu)選為延伸至C端(相應(yīng)于如附圖13、14、15A、15B、15C、16或18中所示的序列)。另一方面，編碼至少20AA的部分序列也可起始于上述提到的點附近或有一定的距離的密碼子。也公開了上述部分序列的任何衍生物、類似物或等位基因。也公開了本發(fā)明所述的DNA部分序列編碼的AA序列其本身或作為較大的重組蛋白的一部分。特別是本申請公開的本發(fā)明序列組成部分的任何可想到的或天然的剪接變異體。
更優(yōu)選的為核苷酸序列，特別是DNA序列，它編碼與本發(fā)明的序列5、6、7和8至少60％同源，優(yōu)選為至少80％同源，更優(yōu)選為至少95％同源的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的核苷酸序列，例如附圖9、10、11A、11B、11C或12中所示核苷酸序列，或其功能性或非功能性等價變異體如等位基因變異體或異構(gòu)體可在分離和測序后獲得。等位基因變異體在本發(fā)明意義上是指在氨基酸水平上60-100％同源，優(yōu)選70-100％，更優(yōu)選為90-100％同源的變異體。等位基因變異體特別是包括那些功能性或非功能性變異體，其可由天然ee3序列的核苷酸，例如根據(jù)附圖9、10、11A、11B、11C或12中所示核苷酸序列通過缺失、插入或替代得到，仍保留至少一種基本的生物特性。
按一般方法通過與本發(fā)明核苷酸序列的樣品或其部分雜交、同源篩選可以從任何哺乳動物或其他物種包括人體中分離同源物或序列相關(guān)的DNA序列。功能等價物也是指天然ee3序列的同源物，例如附圖9、10、11A、11B、11C或12中所示核苷酸序列的同源物，例如來自其他哺乳類的它們的同源物、截斷的序列、編碼和非編碼DNA序列的單鏈DNA或RNA。這些功能等價物可通過比如由附圖9、10、11A、11B、11C或12中所示的DNA-序列或這些序列的一部分，從其他脊椎動物如哺乳類中通過一般的雜交方法或PCR技術(shù)獲得。根據(jù)本發(fā)明，這包括與天然ee3序列雜交的任何序列，特別是與附圖9、10、11A、11B、11C或12中所示核苷酸序列雜交的序列。這些DNA序列與本發(fā)明序列在標(biāo)準(zhǔn)的條件下進(jìn)行雜交。有利地是可將由本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲知的保守區(qū)的短的寡核苷酸用于雜交。然而，也可以用本發(fā)明核苷酸的更長的片段或完整的序列來進(jìn)行雜交。
所述的雜交的標(biāo)準(zhǔn)條件根據(jù)使用的核苷酸序列(寡核苷酸，更長的片段或完整的序列)和/或核苷酸種類(DNA或RNA)而變化。因而，比如DNADNA雜交體的解鏈溫度比相同長度的DNARNA要低10度。根據(jù)所用核苷酸，標(biāo)準(zhǔn)條件為含濃度0.1-5xSSC(1xSSC＝0.15MNaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7.2)的水緩沖溶劑中的溫度為42-58℃，或者另外在50％的甲酰胺存在下，如42℃在5xSSC，50％甲酰胺中。DNA:DNA雜交的有利條件為0.1xSSC，溫度約為20-45℃，優(yōu)選為約30-45℃。而對于DNARNA雜交的有利條件為0.1xSSC，溫度約為30-55℃，優(yōu)選為約45-55℃。所述的雜交溫度比如是對于具有約100個核苷酸長度，G+C含量為50％的核酸，不存在甲酰胺的條件下的解鏈溫度計算值。DNA雜交的實驗條件在遺傳學(xué)的有關(guān)教科書中都有記載，如Sambrook等人所著的書(“分子克隆”，Cold SpringHarbor Laboratory，1989)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)已知公式計算得出，如根據(jù)核酸的長度、雜交的類型或G+C含量計算。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從下面的教科書中獲得雜交的進(jìn)一步信息Ausübel等人(eds)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York；Hames and Higgins(eds)，1985，Nucleic AcidsHybridizationA Practical Approach，IRL Press at Oxford UniversityPress，Oxford；Brown(ed)，1991，Essential Molecular BiologyAPractical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
本發(fā)明的核酸序列的等價物特別是還包括如附圖9、10、11A、11B、11C或12中所示序列的衍生物，比如像啟動子變異體。一起或單獨連接在所述核苷酸的上游的啟動子可通過一個或多個核苷酸的替換。通過插入和/或缺失而改變，這樣就可以根據(jù)要求保留或者改變啟動子的功能或活性。因而可以通過改變其序列提高其活性或者用其他更有效的啟動子甚至是其他物種的啟動子整個替換。根據(jù)本發(fā)明，衍生物也包括其核苷酸序列起始密碼子的上游1-1000范圍內(nèi)的改變從而改變，優(yōu)選提高基因表達(dá)和/或蛋白表達(dá)的變體。
此外，衍生物也包括優(yōu)選在3’-端修飾過的變異體。如本領(lǐng)域熟知的“標(biāo)記”，例如六組氨酸錨定或可被各種抗體識別的抗原的表位(如flag標(biāo)記)(Studier等人，Meth.Enzymol.，185，199060-89和Ausubel等人(eds.)1998，分子生物學(xué)手冊(Current Protocols inNolecular Biology)，John Wiley&Sons，New York)，和/或至少一個轉(zhuǎn)運翻譯蛋白的信號序列如運輸至特定細(xì)胞器官或胞外空間。
除此之外，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的核酸，如附圖9、10、11A、11B、11C或12中所示、或其衍生物、變異體、同源物或者特別是片段也可被表達(dá)成適于治療或診斷的形式。為了產(chǎn)生重組蛋白可應(yīng)用載體系統(tǒng)或者寡核苷酸，它們將所述核酸或核酸構(gòu)建體加長特定的核苷酸序列并由此編碼改變了的多肽，所述載體系統(tǒng)或寡核苷酸使純化簡化，特別是，由此也將上述標(biāo)記序列加長。
此外優(yōu)選包括或相當(dāng)于本發(fā)明基因組DNA序列的(c)DNA序列的DNA序列。
此外本發(fā)明還特別公開了編碼與本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列5、6、7A、7B、7C、8或11基本相同的蛋白質(zhì)的任何DNA序列。這些DNA序列與上述附圖所示的序列相比只有小部分序列作了修飾，比如也可以是異構(gòu)體。所做修飾的序列長度一般不超過10個。與編碼蛋白質(zhì)序列5、6、7A、7B、7C、8和/或11的DNA序列基本相同的且同樣編碼生物活性蛋白質(zhì)的這樣的DNA序列可通過已知的突變方法獲得，突變體編碼蛋白的生物活性可通過篩選方法確定的，如與神經(jīng)元處理或凋亡相關(guān)的結(jié)合試驗或表達(dá)生物功能的能力。相應(yīng)的突變方法包括定點突變，它包括自動合成至少一個堿基修飾的引物。PCR后，將異源雙鏈核酸分子的載體轉(zhuǎn)入合適的細(xì)胞系統(tǒng)(如E.coli)和分離合適的轉(zhuǎn)化的克隆。
本發(fā)明序列的功能直接與鑒定本發(fā)明蛋白引起的信號級聯(lián)反應(yīng)的末梢元件相關(guān)。對此，根據(jù)本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的受體激活MAP激酶。除使用合適的報道分子分析(見實施例)確定所述的MAP激酶以外，對此目的也可以使用預(yù)制的試劑盒(如Clontech的Mercury體內(nèi)激酶分析試劑盒)。這涉及與磷酸化靶(轉(zhuǎn)錄因子，如Jun)的反式激活蛋白區(qū)融合的tet抑制蛋白的表達(dá)。tet抑制蛋白元件調(diào)控的熒光素酶構(gòu)建體的活化只有在反式激活蛋白區(qū)被激酶特異性磷酸化以后才發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明，由此方式可確定本發(fā)明ee3家族的受體或本發(fā)明的變異體在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑中的活性。
此外，本發(fā)明序列的鑒定也是基于在一個具有高EPO表達(dá)的動物模型中本發(fā)明的鼠源ee3-1-m的正調(diào)節(jié)引起涉及所述受體的病理生理的過程的功能性認(rèn)識，所述病理生理過程影響在這種狀態(tài)下細(xì)胞存活或細(xì)胞適應(yīng)。因此，本發(fā)明的受體對伴隨氧供給減少特別是大腦氧供給減少的疾病有特別的藥理學(xué)重要性。
除此之外，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的本發(fā)明DNA序列的制備、修飾和/或檢測的方法都適用，在體內(nèi)、原位或體外的都可以(PCR(Innis等人PCR手冊方法和應(yīng)用指南)或化學(xué)合成)。合適的PCR引物可例如賦予本發(fā)明DNA序列新的功能，如限制性酶切位點、終止密碼子。對此，可以設(shè)計將本發(fā)明序列轉(zhuǎn)入相應(yīng)的克隆載體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及表達(dá)載體或包含本發(fā)明核酸序列，如上所述，一般是DNA序列的重組核酸構(gòu)建體。此處的本發(fā)明的核苷酸序列在功能上與至少一個遺傳調(diào)控元件如轉(zhuǎn)錄和翻譯信號相連是有利的，這種連接根據(jù)需要可導(dǎo)致與天然表達(dá)效率相同或增強或減少天然基因的表達(dá)。用這種方法制備的表達(dá)載體可用于轉(zhuǎn)化宿主有機體或宿主細(xì)胞如哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。
在本發(fā)明的表達(dá)載體中，一般可以使用天然調(diào)控元件如本發(fā)明ee3家族蛋白，特別是序列5、6、7A、7B、7C、8和11的蛋白的基因的啟動子和/或增強子，例如來源于哺乳類特別是相應(yīng)的人源的調(diào)控序列。上面所述的天然調(diào)控序列可根據(jù)要求進(jìn)行基因修飾以改變表達(dá)效率。除了上述提到的天然調(diào)控序列或代替這些天然調(diào)控序列，也可以將其它基因的天然調(diào)控序列連接在本發(fā)明DNA序列的下游和/或上游(5’或3’調(diào)控序列)并任選進(jìn)行基因修飾，以切斷由上述天然調(diào)控序列控制的天然調(diào)控。
本發(fā)明方法的有利的調(diào)控序列包含在啟動子，比如cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，1-PR或1-PL啟動子中，這些啟動子用在革蘭氏陰性菌中比較好。其它有利的調(diào)控序列包含在革蘭氏陽性的啟動子例如amy和SPO2，酵母啟動子如ADC1，MFa，AC，P-60，CYC1，GAPDH或哺乳動物啟動子如CaM激酶II，CMV，Nestin，L7，BDNF，NF，MBP，NSE，beta-globin，GFAP，GAP43，酪氨酸羥化酶，kainate-受體亞基1，谷氨酸-受體亞基B中。原則上，任何帶有調(diào)控序列的天然啟動子例如上述提到的都可以用于本發(fā)明的表達(dá)載體。
另外，有利的是也可以使用合成的啟動子。這些調(diào)控序列的目的是使得本發(fā)明的核酸序列能夠表達(dá)。根據(jù)宿主有機體的不同，也就是說，基因是在誘導(dǎo)后表達(dá)和/或過量表達(dá)或者直接表達(dá)和/或過量表達(dá)。因此，優(yōu)選這些調(diào)控序列或因子有利地影響并因此增強表達(dá)。因而通過使用強轉(zhuǎn)錄信號如啟動子和/或增強子可在轉(zhuǎn)錄水平上有利地增強調(diào)控序列。另外，例如也可以通過提高mRNA的穩(wěn)定性來增強翻譯。
調(diào)控序列是指任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的元件，它可以影響本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)錄水平和/或翻譯水平。除了啟動子序列外，特別強調(diào)“增強子”序列，它通過提高RNA聚合酶和DNA的作用而增強表達(dá)。另外一些作為例子提到的調(diào)控序列有“基因座控制區(qū)”，“沉默基因”或其各自的部分序列。這些序列可用于組織特異性表達(dá)。本發(fā)明的表達(dá)載體也包括“終止子序列”，根據(jù)本發(fā)明它也包括在術(shù)語“調(diào)控序列”中。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案就是連接本發(fā)明的核酸序列和一個啟動子，所述的啟動子典型地位于本發(fā)明的DNA序列的5’上游。另外一些調(diào)控信號比如3’終止子，多腺苷酸化信號或增強子都可在表達(dá)載體中起作用。另外，依照本發(fā)明的基因構(gòu)建體或可能的話是分離的基因構(gòu)建體中可以存在本發(fā)明核酸序列的一個或多個拷貝，特別是如附圖9、10、11A、11B、11C或12中所示核苷酸序列或相應(yīng)的蛋白。
術(shù)語“表達(dá)載體”包括如前所述的重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體和除了本發(fā)明的DNA序列和可能的調(diào)控序列以外還含有另外的元件的完整的載體構(gòu)建體。這些載體構(gòu)建體或載體用于在合適的宿主有機體中表達(dá)。有利的是將至少一種本發(fā)明的DNA序列，如人源ee3家族基因，特別是ee3_1或ee3_2或這些基因的一部分插入到宿主特異性載體中，它可以保證基因在所選的宿主中最優(yōu)的表達(dá)。載體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的和比如可在“克隆載體(Cloning Vectors)”(Eds.Pouwels P.H.等Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN0444904018)中找到。載體除了質(zhì)粒外也指本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其他載體，舉例來說有噬菌體，病毒比如SV40、CMV、桿狀病毒、腺病毒、辛德比斯病毒、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、線性或環(huán)狀DNA。所述載體可在宿主有機體中或染色體上自主復(fù)制。對于在哺乳類中的整合一般用線性DNA。
通過增加基因的拷貝數(shù)和/或通過有利于基因表達(dá)的調(diào)控因子的增強可有利地提高本發(fā)明核酸序列的表達(dá)。因而，這使得通過增強的轉(zhuǎn)錄信號比如啟動子和增強子在轉(zhuǎn)錄水平上增強調(diào)控元件成為可能。然而除了這些也可以例如通過提高mRNA的穩(wěn)定性或增強核糖體上所述mRNA的閱讀效率來提高翻譯水平。將核酸序列或同源基因例如構(gòu)建到核酸片段或載體中來提高基因拷貝數(shù)，其中的載體優(yōu)選含有分配各種基因的調(diào)控基因序列或類似作用的啟動子活性。特別是使用那些可提高基因表達(dá)的調(diào)控序列。
可將本發(fā)明的核酸序列與編碼相互作用或者潛在地相互作用的蛋白的序列克隆到一個單個的載體中，然后在體外宿主細(xì)胞或體內(nèi)宿主有機體中表達(dá)。或者，也可以將每種潛在的相互作用的核酸序列和本發(fā)明的ee3家族的編碼序列導(dǎo)入單個載體并將所述載體通過一般的方法轉(zhuǎn)入各種有機體中，所述一般方法如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、電穿孔或粒子槍。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，至少一個標(biāo)記基因(比如抗體抑制基因和/或編碼熒光蛋白的基因特別是編碼GFP的基因)存在于本發(fā)明的表達(dá)載體中，特別是在完全載體構(gòu)建體中。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及的是用本發(fā)明DNA序列和/或本發(fā)明的表達(dá)載體特別是載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞原則上是任何允許本發(fā)明的DNA序列(對此包括衍生物、等位基因或功能等價物)單獨表達(dá)或與其他序列特別是調(diào)控序列一起表達(dá)的細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞可以是所有原核或真核細(xì)胞，如細(xì)菌、真菌、酵母、植物或動物細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是細(xì)菌如大腸桿菌、鏈霉菌、桿狀菌或假單胞菌，真核微生物如曲霉菌或啤酒酵母或普通的面包酵母(Stinchcomb等，Nature，28239，(1997))。甲基營養(yǎng)酵母特別是畢赤酵母(Pichiapastoris)有利于制備相對大量的本發(fā)明蛋白。為了這個目的，將受體克隆到合適的表達(dá)載體中，所述的表達(dá)載體也可表達(dá)帶適用于純化的標(biāo)記序列的融合蛋白。最后，酵母電穿孔后，挑選穩(wěn)定的克隆。Invitrogen公司提供一種很好的方法的說明和對此所需的所有試劑。表達(dá)產(chǎn)物可根據(jù)功能表征，合適的話可用于本發(fā)明的篩選方法。
然而在一個優(yōu)選的實施方案中，選擇來源于多細(xì)胞有機體的細(xì)胞用于表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。這與傳統(tǒng)的編碼蛋白需要糖基化(N-和/或O-連接)相反。與原核細(xì)胞不同，高級真核細(xì)胞在合適的條件下可達(dá)到這個功能。原則上，任何高等真核細(xì)胞培養(yǎng)物都可以作為宿主細(xì)胞，但是特別優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞如猴子、大鼠、倉鼠或人的。已建立的細(xì)胞系的多樣性是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。下面所述的細(xì)胞系是其中的非限制性列舉的一部分293T(胚胎腎細(xì)胞系)，(Graham等，J.Gen.Virol.，3659(1997))，BHK(幼倉鼠腎細(xì)胞系)，CHO(倉鼠卵巢細(xì)胞)，(Urlaub和Chasin，P.N.A.S.(USA)774216，(1980))，HeLa(人子宮頸的癌細(xì)胞)和其他細(xì)胞系，特別是那些為實驗?zāi)康慕⒌募?xì)胞系比如CHO-，HeLa-，HEK293-，Sf9-或COS細(xì)胞。特別優(yōu)選的是人類細(xì)胞，特別是免疫系統(tǒng)或成人干細(xì)胞如造血系統(tǒng)的干細(xì)胞(來源于骨髓)。本發(fā)明的人類轉(zhuǎn)化細(xì)胞，特別是病人自體同源的細(xì)胞(特別在體外)在用本發(fā)明的DNA序列或本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后，特別適合作為藥物，比如用于基因治療等，即在進(jìn)行細(xì)胞采集、任選的體外擴增、轉(zhuǎn)化、篩選和最后的重新移植后。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點是在昆蟲細(xì)胞中異源制備本發(fā)明的ee3家族蛋白用于功能性表征和本發(fā)明的篩選方法。因為昆蟲細(xì)胞的內(nèi)源G蛋白的含量相對比較低，也就是說，例如在Western印跡中測不到Gi蛋白，而且昆蟲細(xì)胞通常并不表達(dá)所研究的受體，所以所述昆蟲細(xì)胞適用于體內(nèi)構(gòu)建本發(fā)明的ee3族受體的信號傳導(dǎo)途徑。在這種情況下，通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在各種昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)ee3家族受體，其中昆蟲細(xì)胞系例如Sf9、Sf21、Tn368或Tn High 5或MB細(xì)胞。為了這個目的，比如通過Pharmingen的BaculoGold試劑盒制備重組桿狀病毒并感染上述細(xì)胞系。為了研究本發(fā)明的G蛋白偶聯(lián)，進(jìn)行共感染。為了這個目的，用受體病毒并另外還用帶有能表達(dá)三種G蛋白亞基的病毒感染細(xì)胞，進(jìn)行相應(yīng)的分析比如cAMP分析。這樣可以研究不同G蛋白亞基對受體活性的影響。表達(dá)受體的昆蟲細(xì)胞或它們的膜都可以用于篩選分析。昆蟲細(xì)胞可在發(fā)酵槽或搖瓶中容易地大量繁殖，由此為篩選方法和受體純化提供重組細(xì)胞或膜原料的合適原料。
宿主細(xì)胞和適合宿主細(xì)胞的本發(fā)明的表達(dá)載體例如質(zhì)粒、病毒或噬菌體，比如含有RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)的質(zhì)粒、噬菌體1、Mu或其他溫和噬菌體或轉(zhuǎn)座子和/或其他適中的調(diào)控序列組合可產(chǎn)生本發(fā)明的宿主細(xì)胞，它也可以作為表達(dá)系統(tǒng)?；诒景l(fā)明宿主細(xì)胞的優(yōu)選的本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的例子是哺乳類動物細(xì)胞如CHO細(xì)胞和載體如pcDNA3neo載體或者是HEK293細(xì)胞和CMV載體的組合，后者特別適合于哺乳動物細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面涉及的是本發(fā)明DNA序列的基因產(chǎn)物。在本發(fā)明中，基因產(chǎn)物是指初級轉(zhuǎn)錄如RNA優(yōu)選為mRNA和蛋白質(zhì)和/或多肽，特別是純化形式的。特別是這些蛋白調(diào)控或傳輸?shù)蛲龌驂乃酪约翱赡艿难仔孕盘柣蚺c細(xì)胞生長或細(xì)胞可塑性相關(guān)的信號時。如果純化的基因產(chǎn)物包括該序列的功能同源物或抑制該功能(無活性)的等位基因、片段、類似物或衍生物，或典型地由這樣的氨基酸序列組成，那么該純化的基因產(chǎn)物是優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明，功能同源物在此定義為至少含有如附圖13-16和/或18所示具有序列5、6、7a、7b、7c、8和11的蛋白的一個基本功能特性。典型地，功能同源的本發(fā)明蛋白特別是與本發(fā)明的蛋白的生物功能片段(例如蛋白作用部位)相比具有特征的序列等同性，例如至少60％，優(yōu)選至少80％的序列等同性。根據(jù)本發(fā)明，特別是在實施例6中公開了也包括在染色體3、5、8和X上的同源序列，及相應(yīng)的變異體。
衍生物特別是指那些側(cè)鏈作了修飾的AA序列，比如將一種抗體、酶或受體連接到本發(fā)明的AA序列上。衍生物也可指連有糖基(通過N-或O-糖苷鍵)或脂肪(酸)殘基(如肉豆蔻酸)、一個或更多個磷酸基團和/或側(cè)鏈的任何修飾，特別是自由羥基或氨基或在本發(fā)明的寡-或多肽的N和C端。另外，術(shù)語“衍生物”也包括融合蛋白，也就是說在其中本發(fā)明氨基酸序列與任何寡-或多肽偶聯(lián)。
類似物是指與天然序列相比至少有一個AA作了改變(插入、取代)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，優(yōu)選是那些取代的氨基酸(極性氨基酸、長的脂肪鏈、短的脂肪鏈、帶正電荷或負(fù)電荷的氨基酸、帶芳香基團的氨基酸)的保守性取代，仍然保留原有的物理化學(xué)特征(大小、堿度、疏水性等)。取代可導(dǎo)致生物功能，特別是功能或生物無功能序列。比如，Arg可取代Lys、Ile可取代Val或Glu可取代Asp。也可通過加或減或改變一個或更多個氨基酸的位置或多種這些措施相互組合。用這種方法改變的蛋白與天然ee3蛋白相比，特別是與附圖13、14、15A、15B、15C、16或18中所示的相比，與上述附圖所示序列相比一般至少有60％同源，優(yōu)選至少70％和更優(yōu)選至少90％同源，根據(jù)Altschul等人(J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)的算法計算得到?？梢詮牟溉閯游锬X中分離蛋白和其功能變異體，哺乳動物比如有人、溝鼠或小鼠。功能變異體也可包括來源于其他哺乳動物的同源物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是那些保留天然序列二級結(jié)構(gòu)的類似物。根據(jù)本發(fā)明除了保守取代以外，也可以對天然序列進(jìn)行弱保守AA的取代。由此保留其生物功能，特別是作為凋亡或壞死信號的傳遞者或細(xì)胞繁殖、細(xì)胞可塑性或細(xì)胞生長的信號傳遞者?？梢酝ㄟ^合適的方法，例如結(jié)合分析或細(xì)胞毒性分析來檢驗取代或缺失的效果。
然而，本發(fā)明也包括可導(dǎo)致“顯性負(fù)性”效應(yīng)的序列，也就是改變了一級序列仍然有結(jié)合細(xì)胞外配體的活性，但是不能向下也就是胞內(nèi)繼續(xù)傳遞信號。在此舉的例子是C端截斷的ee3_1序列變異體，或者是如附圖11B或11C以及附圖15B或15C的兩個剪切變異體。這些類似物可作為生物功能的抑制劑，特別是抑制凋亡。這樣的類似物是通過基因工程制備的，特別是通過編碼本發(fā)明蛋白(序列5、6、7(b，c)、8和11)的DNA序列的定點突變。所產(chǎn)生的DNA序列(類似物就是建立在這樣DNA序列)可最終在重組細(xì)胞培養(yǎng)基中表達(dá)蛋白(Sambrook等，1989，見上面)。也公開了上述類似物的任何衍生物以及編碼上述AA序列的DNA序列。
本發(fā)明進(jìn)一步包括本發(fā)明天然AA序列的片段。片段以缺失(N-或C-端或其他內(nèi)部序列)為特征。它們可能具有顯性負(fù)性或顯性正性效應(yīng)。
然而，本發(fā)明的基因產(chǎn)物(蛋白)也包括那些附圖所示的DNA序列的DNA衍生物、DNA片段或DNA等位基因轉(zhuǎn)錄和翻譯后的基因產(chǎn)物(蛋白)。
另外，本發(fā)明的蛋白也可作化學(xué)修飾，如在N-端加保護(hù)基團。糖基可連接到羥基或氨基上，脂類可與本發(fā)明蛋白共價連接，也包括磷酸基或乙酰基等。任何化學(xué)物質(zhì)、化合物或基團都可以通過任何合成途徑與本發(fā)明蛋白相連。另外的氨基酸如游離氨基酸或肽形式或蛋白區(qū)域形式等，都可以與本發(fā)明蛋白的N-和/或C-端連接。
特別優(yōu)選本發(fā)明蛋白氨基酸序列的N-端的“信號”或“引導(dǎo)”序列，它可以將多肽在翻譯同時或者在翻譯之后引導(dǎo)至特定細(xì)胞器內(nèi)或胞外空間(或培養(yǎng)基)。作為抗原的氨基酸序列也可連接在C-端或N-端，其中的抗原可使得本發(fā)明的氨基酸序列與抗體連接。特別要提到Flag多肽，其序列為DYKDDDDK(單字母表示)?；蚱渌娜鏗is標(biāo)簽，其具有至少3個，優(yōu)選至少6個組氨酸殘基。這些序列具有強的抗原特性，可以快速測定和簡化純化重組蛋白。Eastman Kodak Co.，Scientific Imaging Systems Division，New Haven，Connenticut提供與Flag肽結(jié)合的單克隆抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及天然ee3序列的部分，特別是附圖13、14、15A、15B、15C、16或18中所示的序列的部分，其中至少包括20個，優(yōu)選為至少30個和更優(yōu)選為50個氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過常用方法例如化學(xué)合成的方法合成這樣的部分序列，它可優(yōu)選作為產(chǎn)生抗體的抗原。優(yōu)選這些部分序列和/或其衍生物、其等位基因或片段是公開的序列，這些序列在蛋白原的空間模型中形成在本發(fā)明天然ee3序列，特別是附圖13、14、15A、15B、15C、16所示的序列中構(gòu)成至少部分蛋白質(zhì)表面的區(qū)域。優(yōu)選的長度至少為20AA的部分序列至少部分地包含本發(fā)明ee3家族蛋白的胞內(nèi)部分和特別優(yōu)選的本發(fā)明的部分序列包括如附圖8所示序列600-752位的至少20個氨基酸(根據(jù)附圖8)，如肽WWFGIRKDFCQFLLEIFPFLRE(從609至630，21AA)。
此外，本發(fā)明的氨基酸序列，如人源蛋白ee3_1或ee3_2序列，具有與其他代表性的GPCR一樣的特定序列基序。這樣，例如典型的標(biāo)志三聯(lián)體序列也出現(xiàn)在GPCR類蛋白的第3個跨膜區(qū)的下游(包含序列DRY(單字母表示)的序列)。
在本發(fā)明的ee3_1中，序列DRI(103-105位置)出現(xiàn)在TM3(83-102)的下游(根據(jù)附圖15A)。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)已知的典型的GPCR類(Galanine-2受體、C5a受體(大鼠)、BK-2(人)或CXCR-5(人))在相應(yīng)的位置都存在序列DRY或DRF。
因此，如上所述的特別優(yōu)選的本發(fā)明的肽是至少含有20AA，并且含有AA三聯(lián)體DRI。作為這種本發(fā)明的肽的例子可提及具有序列VLVCDRIERGSHFWLLVFMP的肽。這樣的本發(fā)明的肽可用于受體生理功能的調(diào)節(jié)。假如在細(xì)胞中摻入或一般性提供這樣的肽序列，可影響激動劑依賴性激活的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程、激活本發(fā)明的受體與G蛋白的相互作用以及可能的受體的內(nèi)化。本發(fā)明的一些寡-或多肽有可能導(dǎo)致下游信號傳導(dǎo)途徑的組成型激活。因此本發(fā)明的寡-或多肽特別地可作為藥物或適用于制備藥物。
另外，至少含有20個氨基酸的本發(fā)明的寡-或多肽在前兩個胞外環(huán)例如ee3_1(見附圖8)中優(yōu)選可包括2個保守半胱氨酸(根據(jù)附圖15A，在ee3_1的位置78和145)，這是GPCR蛋白的典型特征(序列GETCV在第一個胞外環(huán)的末端，序列ELEILCSVNIL在第2個胞外環(huán)的中間)。因此，本發(fā)明的寡肽序列包括例如上述提到的兩個序列。
最后，也特別優(yōu)選那些至少包含ee3家族蛋白序列的20個AA的肽，來源于TM區(qū)，比如肽LDGHNAFSCIPIFVPLWLSLIT(包含C-端的TM區(qū))。本發(fā)明的這類肽優(yōu)先適用于調(diào)節(jié)特別是抑制ee3蛋白的受體作用，這樣的肽的治療性能涉及下述本發(fā)明的適應(yīng)癥。抑制TM結(jié)構(gòu)的肽由于不能正常結(jié)合而導(dǎo)致功能改變，喪失受體的特異性。與此相關(guān)例如參見涉及β-2-腎上腺素能受體的第6個TM區(qū)的參考文獻(xiàn)(Hebert TE，Moffett S，Morello JP，Loisel TP，Bichet DG，Barret C，Bouvier M(1996)來源于β-2-腎上腺素能受體跨膜區(qū)的肽抑制受體二聚化和激活，J Biol Chem 27116384-16392)。另外，本發(fā)明至少含有來源于ee3家族蛋白序列的20AA的結(jié)合配體的肽片段也可以用作藥物或用于制備藥物，它與天然配體(胞外或胞內(nèi)配體)競爭結(jié)合位點，這樣可以阻斷天然ee3配體的結(jié)合。本發(fā)明的這類肽作為“誘餌受體”在本申請?zhí)岬降乃羞m應(yīng)癥中導(dǎo)致治療效果。
也公開了本發(fā)明的抑制肽的鑒定方法，根據(jù)本發(fā)明，合適的方法是Tarasova等人在另一篇文章(Tarasova NI，Rice WG，Michejda CJ(1999)通過破壞跨膜區(qū)域的相互作用抑制G蛋白偶聯(lián)受體功能，J BiolChem 27434911-34915))中所描述的方法，將關(guān)于該方法的全部內(nèi)容引入本文作為本發(fā)明公開的一部分。這些本發(fā)明的抑制肽可以調(diào)節(jié)，比如抑制如不同TM區(qū)的分子間相互作用，這是本發(fā)明的ee3家族蛋白發(fā)揮作用的重要前提條件。這類本發(fā)明的肽也可作為藥物或用來制備藥物。
上述提到的本發(fā)明的肽也可以肽類似物的形式(仿肽體)存在。在這種情況下，骨架上的酰胺鍵優(yōu)先被另外的但結(jié)構(gòu)相當(dāng)?shù)逆I替代，替代的鍵優(yōu)選不會被天然人源酶裂解。例如，合適的有寡氨基甲酸酯。容易制得N-端保護(hù)的單體氨基烷基碳酸酯，比如從相應(yīng)的氨基醇得到并且可在用堿性不穩(wěn)定的Fmoc基團轉(zhuǎn)化成活化酯后引入固相合成。因為這樣的類似物比相應(yīng)的肽具有更好的疏水性，其特別適用于透過血腦屏障，也就是說特別是用作神經(jīng)疾病的藥物。
本發(fā)明也涉及轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物是遺傳修飾過的動物，以表達(dá)或包含相對于正常動物來說在至少一個組織中改變量的本發(fā)明的基因產(chǎn)物(如通過修飾本發(fā)明基因的啟動子區(qū)域)，或者包含或表達(dá)一種修飾的基因產(chǎn)物(如本發(fā)明ee3族蛋白的衍生物，或者是片段)。根據(jù)本發(fā)明，這包括(a)在基因水平部分或全部不再有天然的本發(fā)明DNA序列或(b)雖然在基因水平仍然保留本發(fā)明的序列但是不能轉(zhuǎn)錄和/或翻譯所述序列因而不含有基因產(chǎn)物的動物。另外，在轉(zhuǎn)基因動物中的本發(fā)明的天然序列也就是ee3蛋白家族序列，如序列5、6、7(包括7b和7c)、8和11(不管有還是沒有)，包含至少一種本發(fā)明的DNA序列和/或被至少一種本發(fā)明的DNA序列所取代。特別地，取代和/或插入的序列可以是本發(fā)明的不具有天然性能的序列。
制備關(guān)于本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)基因動物和/或敲除動物，特別是大鼠、小鼠、豬、牛、羊、果蠅、黑腹果蠅或斑馬魚，用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法進(jìn)行。至此，本發(fā)明的cDNA序列或天然或人工變異體已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)，如在神經(jīng)元中NSE啟動子，在少突膠質(zhì)細(xì)胞中MBP啟動子等。遺傳修飾的動物可以作為研究不同疾病的模型(比如實驗導(dǎo)致中風(fēng)、MCAO)。制備敲除動物可以提供在整個有機體中抑制劑效果的更多信息，因為敲除動物相當(dāng)于抑制本發(fā)明的天然序列。這類方法已用于本發(fā)明抑制劑如本發(fā)明的肽、肽類似物或其他小分子有機化合物的臨床前的測試。
根據(jù)本發(fā)明，所有多細(xì)胞的有機體都可以轉(zhuǎn)基因，特別是哺乳類動物，比如大鼠、小鼠、羊、?；蜇i。轉(zhuǎn)基因植物原則上也是可以的。轉(zhuǎn)基因有機體可以是敲除動物。在本文中，轉(zhuǎn)基因動物可包含本發(fā)明的功能或非功能性核酸或功能性或非功能性核酸構(gòu)建體單獨或與編碼本發(fā)明蛋白的功能性或非功能性序列的組合。
上述轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)一步的實例是轉(zhuǎn)基因動物，在生殖細(xì)胞或其所有/部分體細(xì)胞或在生殖細(xì)胞或所有/部分體細(xì)胞中，本發(fā)明ee3家族的核苷酸序列，特別是序列1-4被通過基因工程方法改變或通過插入DNA元件被間隔。本發(fā)明的核苷酸序列或其部分的另外一種用途是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因或敲除動物或有條件的或區(qū)域特異性敲除的動物或特異性突變的遺傳修飾動物(Ausubel等人(eds.)1998，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York和Torres等人，(eds.)1997，Laboratory protocols for conditional gene targeting，OxfordUniversity Press，Oxford)。另外，也可導(dǎo)入特定的突變，如修飾啟動子或插入增強子，以制備如在轉(zhuǎn)基因動物(“Knock-in”動物)的組成型活性的ee3蛋白。根據(jù)本發(fā)明這樣的動物也可用于例如臨床前試驗的ee3蛋白功能的潛在激動劑的類似模型。
通過轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)或在胚胎干細(xì)胞，通過同源重組產(chǎn)生遺傳突變(無義突變或定點刪除、插入或修飾)，可以制備動物模型，它可以提供本發(fā)明序列(病理)生理學(xué)的有用信息。這種方法制備的動物模型是開發(fā)新的治療藥物的基本測試系統(tǒng)，所述藥物影響本發(fā)明蛋白特別是具有序列5-8的蛋白對神經(jīng)、免疫、繁殖或其他過程的生物活性。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及抗體，其可識別本發(fā)明ee3基因產(chǎn)物，特別是附圖13、14、15A、15B、15C、16或18中所示的蛋白質(zhì)或其衍生物、片段或同工型或等位基因的表位，但也可針對比如本發(fā)明的mRNA。本發(fā)明的術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體和單克隆抗體、嵌合抗體、抗獨特型抗體(針對本發(fā)明抗體)，所有的抗體都可以結(jié)合形式或水溶性形式存在，并可任選用標(biāo)簽標(biāo)記，以及所述抗體的片段。除了分離的本發(fā)明的抗體片段以外，本發(fā)明抗體也可以與其他(蛋白)成分作為融合蛋白的重組形式出現(xiàn)。片段本身或本發(fā)明抗體片段作為融合蛋白的一部分，一般可以通過酶切、蛋白合成或本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的重組方法制得。因而，根據(jù)本發(fā)明的抗體可指多克隆、單克隆、人源或人源化或重組抗體或其片段，單鏈抗體或其他合成抗體。
多克隆抗體是異源抗體分子的混合物，是從抗原免疫的動物血清中獲得。然而本發(fā)明也包括多克隆單種屬的抗體，是純化抗體得到(比如通過裝填特異性表位的肽的柱)。單克隆抗體包含基本上特異針對抗原的均一抗體，有相同的表位結(jié)合位點。單克隆抗體可以通過現(xiàn)有的技術(shù)的方法制備(例如Khler和Milstein，Nature，256，495-397，(1975)；US-Patent 4,376,110；Ausübel等人，Harlow和Lane″Antikrper″Laboratory Manual，Cold Spring，Harbor Laboratory(1988)；Ausubel等人(eds)，1998，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York)。將上述文獻(xiàn)并入本文作為本發(fā)明公開的一部分。
也可以用例如本申請上述提到的方法制備本發(fā)明的基因工程抗體。簡言之，所述方法包括抗體產(chǎn)生細(xì)胞的培育和在細(xì)胞達(dá)到合適的光密度時通過已知的方法用硫氰酸胍裂解細(xì)胞，用醋酸鈉酸化，用苯酚、氯仿/異戊醇提取，用異丙醇沉淀和用乙醇清洗而從所述細(xì)胞中分離出mRNA。然后從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成的cDNA直接或作了基因修飾如定點突變、插入、缺失、轉(zhuǎn)換、刪除或堿基替換之后導(dǎo)入合適的動物、真菌、細(xì)菌或病毒載體中，在相應(yīng)的宿主有機體中表達(dá)。優(yōu)選的是細(xì)菌或酵母載體如pBR322、pUC18/19、pACYC184、Lambda或酵母-mu-載體用于克隆基因和在細(xì)菌如E.coli或酵母如釀酒酵母中表達(dá)?？贡景l(fā)明蛋白的特異抗體可作為診斷試劑和作為ee3家族蛋白起重要病生理作用的疾病的治療藥物。
本發(fā)明抗體屬于下列免疫球蛋白類IgG、IdD、IgM、IgE、IgA、GILD和合適的話，所述類型的亞類如IgG的亞類或其混合物。優(yōu)選IgG和其亞類比如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgGM。更優(yōu)選為IgG的亞類IgG1/k或IgG2b/k。產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可在體外、原位或體內(nèi)培養(yǎng)。高濃度的單克隆抗體優(yōu)選在體內(nèi)或原位獲得。
本發(fā)明的嵌合抗體是包含來源于各種動物的不同部分(比如含有小鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白的保守區(qū))的分子。優(yōu)選應(yīng)用嵌合抗體，一方面是降低應(yīng)用中的免疫原性，另一方面是提高產(chǎn)率，比如鼠源單克隆抗體在雜交瘤細(xì)胞中的產(chǎn)量更高但是也在人體內(nèi)產(chǎn)生高的免疫原性，因此一般優(yōu)先使用人/鼠嵌合抗體。嵌合抗體和其制備方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的(Cabilly等人，Proc.Natl.Sci.USA 813273-3277(1984)；Morrison等人Proc.Natl.Acad.Sci USA 816851-6855(1984)；Boulianne等人Nature 312643-646(1984)；Cabilly等人，EP-A-125023；Neuberger等人，Nature 314268-270(1985)；Taniguchi等人，EP-A-171496；Morrion等人，EP-A-173494；Neuberger等人，WO86/01533；Kudo等人，EP-A-184187；Sahagan等人，J.Immunol.1371066-1074(1986)；Robinson等人，WO 87/02671；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 843439-3443(1987)；Sun等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA 84214218(1987)；Better等人，Science 2401041-1043(1988)和Harlow和Lane，AntikrperA Laboratory Manual，同上)。這些文獻(xiàn)也一起并入作為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。
十分特別優(yōu)選針對本發(fā)明ee3蛋白，特別是如附圖13、14、15A、15B、15C、16或18中所示的蛋白的胞外區(qū)作為表位的這樣的本發(fā)明抗體。在上述公開的各種形式的本發(fā)明的抗體都可用于抑制本發(fā)明的ee3族蛋白，比如體外實驗研究，原位標(biāo)記或通過靜脈、皮下、動脈或肌肉注射體內(nèi)用于治療。
本發(fā)明的抗獨特型抗體可以識別決定部位，所述決定部位通常與本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合位點相連?？躬毺匦涂贵w的制備可以通過相同種類和相同基因型(比如小鼠源)的動物免疫作為起始點用于本發(fā)明抗獨特型抗體針對的單克隆抗體。免疫的動物可識別免疫抗體的獨特型決定簇，這樣就可以產(chǎn)生針對所述獨特型決定簇的抗體(即本發(fā)明抗獨特型抗體)(U.S.4,699,880)。本發(fā)明的抗獨特型抗體也可以作為免疫原來激發(fā)其他動物的免疫反應(yīng)從而導(dǎo)致在其中產(chǎn)生所謂的抗-抗-獨特型抗體。所述抗-抗-獨特型抗體可以，但不必需，其表位的構(gòu)造與引起抗獨特型反應(yīng)的原單克隆抗體一樣。通過這種方法，可以應(yīng)用針對單克隆抗體的獨特型決定簇的抗體來識別其他表達(dá)相同特異性抗體的克隆。
可應(yīng)用針對本發(fā)明蛋白、本發(fā)明蛋白的類似物、片段、衍生物的單克隆抗體，以在相應(yīng)動物如BALB/c小鼠中誘導(dǎo)抗獨特型抗體的結(jié)合。來源于這種免疫小鼠的脾細(xì)胞可用于制備分泌抗獨特型單克隆抗體的抗獨特型雜交瘤細(xì)胞系。此外，抗獨特型單克隆抗體也可以與載體(KLH、匙孔血藍(lán)蛋白)偶聯(lián)，然后用于進(jìn)一步免疫BALB/c小鼠。這些小鼠的血清中就含有抗-抗-獨特性抗體，它具有與原單克隆抗體結(jié)合的特性，并特異性針對本發(fā)明蛋白或其片段或其衍生物的表位。這樣，抗獨特型單克隆抗體有自己的獨特型表位或結(jié)構(gòu)上與所研究的表位相似的“獨特位”。
術(shù)語“抗體”包括完整的分子和其片段。所述片段可提及任何具有一個或兩個抗原-互補結(jié)合位點的截短或改變的抗體片段，例如具有相應(yīng)于所述抗體并由輕鏈和重鏈構(gòu)成的一個結(jié)合位點的抗體部分，如Fv-、Fab-或F(ab′)2片段或單鏈片段。優(yōu)選為截短的雙鏈片段如Fv-、Fab-或F(ab′)2。Fab和F(ab′)2片段缺少例如在完整抗體中存在的Fc片段，以便它們可以在血液循環(huán)中較快運輸和與完整抗體相比具有較低的非特異性組織結(jié)合。在這里要強調(diào)本發(fā)明抗體的Fab和F(ab′)2片段以及這些抗體本身，都可以用于檢測(定性)和定量本發(fā)明蛋白(合適的話，也可用于檢測本發(fā)明蛋白的活性如特異磷酸化)，因此定性的和/或定量的檢測本發(fā)明蛋白的蛋白活性的方法也是本發(fā)明的一部分。
可以使用酶進(jìn)行蛋白裂解制備這樣的片段，其中應(yīng)用酶，如木瓜蛋白酶(制備Fab片段)或胃蛋白酶(制備F(ab′)2片段)或通過化學(xué)氧化或抗體基因的基因修飾制備。
本發(fā)明也包括抗體混合物。除了所述抗體，在所有本發(fā)明方法和應(yīng)用中都可使用抗體混合物。單克隆抗體的純化部分、多克隆抗體或單克隆抗體的混合物都可作為藥物應(yīng)用和用于制備治療下述疾病的藥物腦局部缺血(也就是中風(fēng))、退化性紊亂特別是神經(jīng)變性性紊亂和神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇癥。
本發(fā)明抗體，包括這些抗體片段和/或混合物，都可以用于在樣品中定性或定量檢測本發(fā)明ee3基因產(chǎn)物，特別是如附圖13、14、15A、15B、15C、16或18中所示的蛋白或其片段或衍生物，或檢測表達(dá)和任選分泌本發(fā)明蛋白的細(xì)胞。對此公開了本發(fā)明的抗體作為診斷劑的用途。因而，可以由本發(fā)明抗體確定本發(fā)明基因產(chǎn)物的量和它的活性(比如特異性磷酸化)，比如附圖13、14、15A、15B、15C、16或18中所示的蛋白的活性。所述檢測也借助免疫熒光方法進(jìn)行，其中使用熒光標(biāo)記的抗體與光學(xué)顯微鏡、流式細(xì)胞儀或熒光測定聯(lián)合進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的抗體(包括所述抗體片段或抗體混合物)可用于組織學(xué)的研究，比如在免疫電鏡或免疫熒光過程中，用于原位檢測本發(fā)明蛋白。原位檢測可通過獲取病人的組織學(xué)樣本，并將標(biāo)記的本發(fā)明抗體加到樣本來進(jìn)行?？贵w(或這些抗體的片段)都可作為生物樣本的標(biāo)記形式。這樣不僅可以確定樣本中本發(fā)明蛋白的存在而且可以研究本發(fā)明蛋白在所研究的組織中的分布。生物樣本可以是生物流體、組織提取物、收獲的細(xì)胞如免疫細(xì)胞或心肌細(xì)胞或肝細(xì)胞、或在組織培養(yǎng)基中培育的任何細(xì)胞。可用現(xiàn)有技術(shù)的方法并根據(jù)標(biāo)記的種類(比如熒光方法)來進(jìn)行標(biāo)記抗體的檢測。然而，也可以將生物樣本負(fù)載于固相載體比如硝化纖維或其他載體上，以便固定細(xì)胞、細(xì)胞部分或可溶性蛋白。載體可以用合適的緩沖液沖洗一次或幾次，然后用本發(fā)明可檢測的標(biāo)記抗體處理?？梢杂镁彌_液第二次沖洗固相載體以去除未結(jié)合的抗體。結(jié)合在固相載體上的標(biāo)記的量可根據(jù)傳統(tǒng)方法確定。
合適的載體特別是玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍淀粉酶、天然或改性的纖維素、聚丙烯酰胺和磁石。為了滿足本發(fā)明的條件，載體可以是部分可溶或完全不可溶的。載體的材料可以是任何形狀的，比如小球狀(珠子)或圓柱狀或球狀，優(yōu)選的為小球狀聚苯乙烯。
有好多種方法進(jìn)行可檢測到的抗體標(biāo)記。比如，抗體可與最終在免疫分析(EIA)中用到的酶連接。所用的酶可與相應(yīng)的底物反應(yīng)產(chǎn)生用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法檢測或任選定量的化合物，如通過分光光度測定法、熒光測定法或其他光學(xué)方法。酶可以是蘋果酸脫氫酶、葡萄狀球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天(門)冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶或乙酰膽堿酯酶?？蓱?yīng)用對于標(biāo)記所用的酶特異性的生色底物來進(jìn)行檢測，比如，最后通過酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化的物質(zhì)與對照標(biāo)準(zhǔn)的光學(xué)比較進(jìn)行。
此外，也可以用其他的免疫分析法來檢測，比如通過抗體或抗體片段的放射性同位素標(biāo)記(也就是放射性免疫分析(RIA；LaboratoryTechniques and Biochemistry in Molecular Biology，Work，T.等人North Holland Publishing Company，New York(1978))?？捎瞄W爍計數(shù)器或自動射線照相術(shù)來檢測和定量放射性同位素。
熒光化合物也可以用來標(biāo)記，如熒光素異硫氰酸酯、羅丹明、藻紅蛋白、藻膽青素、異構(gòu)藻膽青素、o-苯二醛和熒光胺。也可以用可發(fā)熒光的金屬152E或鑭系元素。這些金屬通過螯合基團如二亞乙基三胺五乙酸(ETPA)或EDTA與抗體連接。本發(fā)明抗體可以通過借助化學(xué)發(fā)光的化合物來連接?？梢酝ㄟ^化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光來檢測化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體。這樣的化合物有魯米諾、異魯米諾、吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓鹽或草酸酯。也可以用生物發(fā)光化合物。生物發(fā)光是化學(xué)發(fā)光的一種，它可發(fā)生在生物系統(tǒng)和其中催化蛋白增強化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。生物發(fā)光蛋白也可以通過熒光法檢測，如蟲螢光素、熒光素酶和(水母體內(nèi)的)發(fā)光蛋白質(zhì)等生物發(fā)光蛋白。
本發(fā)明的抗體也可以用于免疫測定分析，也就是“雙位的”或“三明治”法。典型的免疫測定分析系統(tǒng)包括“前沿”分析，其顯著特征是將本發(fā)明的抗體與固相系統(tǒng)相連并通過這種方式使抗體與所研究的樣本相接觸。以這種方式，通過形成二元固相-抗原-抗體復(fù)合物而從樣本中分離抗原。經(jīng)過適宜的培育時間，沖洗固相載體以去掉殘留的液體樣本包括未結(jié)合的抗原，然后與含有未知量的標(biāo)記檢測抗體的溶液接觸。其中的標(biāo)記抗體作為所謂的“報道分子”。經(jīng)過第二次培育以便標(biāo)記的抗體與已連到固相載體上的抗原結(jié)合后，再次沖洗固相載體而去除未反應(yīng)的標(biāo)記抗體。
另外一種分析方法是“三明治”法。在這種方法中，如果將固相連接的抗體和標(biāo)記抗體同時加到分析樣本中則只需要一次培育。在培育后沖洗固相載體去除殘留的液體樣本和未結(jié)合的標(biāo)記抗體。固相載體上的標(biāo)記抗體的存在可與傳統(tǒng)的前沿的三明治法一樣準(zhǔn)確確定。在所謂的反向分析中，在培育一段合適的時間后，首先是向液體樣本中逐步加入標(biāo)記抗體溶液，然后混入與固相載體的未標(biāo)記抗體。在第二次培育步驟后，如傳統(tǒng)方法一樣沖洗固相載體以去掉殘留的液體樣本和未反應(yīng)的標(biāo)記抗體。固相載體反應(yīng)的標(biāo)記抗體的確定同上。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了表達(dá)本發(fā)明ee3基因產(chǎn)物，特別是如附圖13、14、15A、15B、15C、16或18中所示的多肽包括其所有衍生物、類似物和片段的基因產(chǎn)物的方法，其中為此用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞?；诒景l(fā)明DNA序列的基因產(chǎn)物的表達(dá)方法并不提供濃縮和純化的相應(yīng)的基因產(chǎn)物，而是通過導(dǎo)入能表達(dá)相應(yīng)基因產(chǎn)物的本發(fā)明DNA序列而影響細(xì)胞代謝。特別是用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞作為藥物的應(yīng)用或用來制備藥物，特別是用于治療疾病，如腫瘤、神經(jīng)疾病、神經(jīng)變性性紊亂(如多發(fā)性硬化，帕金森)和腦局部缺血(例如中風(fēng))。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可用于治療凋亡、壞死、細(xì)胞生長、細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化或細(xì)胞可塑性失調(diào)的疾病。根據(jù)本發(fā)明的方法，可將這種來自體內(nèi)轉(zhuǎn)化的自體或異體同源的宿主細(xì)胞移植給病人。
本發(fā)明另外一方面包括分離基因產(chǎn)物的方法，所述基因產(chǎn)物至少含有與本發(fā)明氨基酸序列，特別是與序列5、6、7(包括7b和7c)、8和11同源的部分序列，而且至少含20AA、優(yōu)選為至少30AA，其中包括用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和在合適的、能促進(jìn)表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，以使最終能從培養(yǎng)物中純化基因產(chǎn)物。根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)，本發(fā)明DNA序列的基因產(chǎn)物可以從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中分離。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，分離和純化本發(fā)明DNA表達(dá)、重組的蛋白的方法主要依賴于宿主細(xì)胞的種類或其他問題如蛋白是否分泌到培養(yǎng)基中，這是已知的。例如可以使用重組蛋白是宿主細(xì)胞分泌的表達(dá)載體。在這種情況下，就要使用商業(yè)上可獲得的蛋白濃縮過濾器如Amicon或微孔Pelicon來濃縮培養(yǎng)基。濃縮步驟后再進(jìn)行純化步驟，比如凝膠過濾步驟或柱色譜純化步驟?；蛘咭部梢允褂脦EAE基質(zhì)的陰離子交換劑。
作為基質(zhì)可應(yīng)用任何蛋白純化的已知的物質(zhì)，比如丙烯酰胺或瓊脂糖或葡聚糖等。然而也可以使用通常含羧甲基的陽離子交換劑。也可以用HPLC步驟進(jìn)一步純化本發(fā)明DNA編碼的多肽?？梢赃M(jìn)行一步或多步，特別是應(yīng)用反相方法。所述方法可以獲得本發(fā)明DNA序列的基本同源的重組蛋白。
除了用于分離基因產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)基，也可以應(yīng)用轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。在這種情況下，翻譯蛋白可以是分泌型的，以簡化純化。從酵母宿主細(xì)胞中得到的分泌的重組蛋白可以通過Urdal等人(J.Chromato.296171(1994))公開的方法獲得，該方法也是本發(fā)明公開的一部分。
本發(fā)明的核酸序列，特別是本發(fā)明DNA序列和/或本發(fā)明基因產(chǎn)物都可以作為藥物應(yīng)用或用來制備藥物。所述的藥物可以直接施用(比如經(jīng)頰、靜脈、口服、腸胃外、經(jīng)鼻、皮下)或與其他活性化合物、賦形劑或常用藥物添加劑一起施用。本發(fā)明的核酸可以作為裸核酸，特別是靜脈注射施用，或采用載體施用于患者。載體可以是質(zhì)?；虿《据d體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體，或含有本發(fā)明的裸DNA的脂質(zhì)體或含有本發(fā)明DNA的質(zhì)粒。
本發(fā)明的序列特別是核苷酸序列或氨基酸序列1-8或其變異體，以及本發(fā)明的蛋白異體和由其衍生的本發(fā)明的試劑(寡核苷酸、抗體、肽)都可以用于制備治療藥物，也就是用于治療疾病的藥物。優(yōu)選的是治療由細(xì)胞死亡和繁殖的自我平衡失調(diào)引起的疾病或病理生理狀態(tài)。
本文中發(fā)現(xiàn)決定細(xì)胞轉(zhuǎn)錄行為變化的EPO可直接或間接地促使本發(fā)明的受體，例如ee3_1，轉(zhuǎn)錄的增強，此發(fā)現(xiàn)具有重要性。即本發(fā)明的受體調(diào)節(jié)EPO的作用，因此對于與此相關(guān)的疾病有重要作用。這意味著本發(fā)明受體可選擇性地影響EPO的某些作用，例如神經(jīng)保護(hù)性作用(比如在神經(jīng)變性性疾病中)，其中激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB在EPO的神經(jīng)保護(hù)行為中是關(guān)鍵的一個步驟，或增強腦的功能(比如在癡呆中)。動物試驗的相應(yīng)研究表明本發(fā)明的物質(zhì)可用于神經(jīng)疾病的模型如腦局部缺血，試驗引起的腦脊髓炎或蛛網(wǎng)膜下出血。
對于這部分作用是希望的，因為除了神經(jīng)保護(hù)作用外施用EPO可導(dǎo)致血球密度的增強(與所述的神經(jīng)保護(hù)行為有一點矛盾)，因為血液流變學(xué)特性惡化(對微循環(huán)具有負(fù)面效應(yīng))，如在過量表達(dá)紅細(xì)胞生成素的小鼠中體現(xiàn)的(Wiessner等人，2001，J Cereb Blood FlowMetab，21，857-64)。
因而，可應(yīng)用與調(diào)節(jié)有關(guān)的本發(fā)明物質(zhì)如本發(fā)明的核苷酸、寡-或多肽、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞或能與本發(fā)明的受體的任何位點相連的替代配體，特別是用于制備治療神經(jīng)性失調(diào)，尤其是神經(jīng)變性性疾病的藥物。
通過本發(fā)明的應(yīng)用可影響細(xì)胞死亡過程，如在任何表達(dá)本發(fā)明ee3族蛋白或其變異體的細(xì)胞中，特別是在神經(jīng)細(xì)胞中影響導(dǎo)致凋亡的級聯(lián)或?qū)е聣乃赖倪^程，如通過調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的相互作用特別是那些涉及G蛋白偶聯(lián)蛋白的相互作用。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的天然蛋白，特別是序列5-8的蛋白，作為受體是胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑的一部分。它們通常是信號級聯(lián)的起點，他們的失調(diào)可導(dǎo)致多種疾病。因此，發(fā)現(xiàn)上面所述的本發(fā)明蛋白在下列胞內(nèi)過程中作為組分和具有細(xì)胞作用，比如在可作用于細(xì)胞分化、細(xì)胞分裂、生長、可塑性、再生的一般的信號傳導(dǎo)，細(xì)胞分化，繁殖或細(xì)胞死亡。相應(yīng)地，通過本發(fā)明蛋白(如ee3_1或ee3_2)的失活，或通過無功能表達(dá)或通過過量表達(dá)都可導(dǎo)致伴隨如細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、細(xì)胞可塑性或細(xì)胞再生失調(diào)的病理生理學(xué)狀態(tài)。另一方面，其他機制也可能導(dǎo)致病理生理學(xué)狀態(tài)，例如本發(fā)明ee3受體的天然配體的無活性形式或過量的活性形式。根據(jù)病理生理學(xué)紊亂的分子機制，給予本發(fā)明活性蛋白或至少增強的所述蛋白的表達(dá)或抑制胞內(nèi)過量表達(dá)或表達(dá)無活性蛋白對于治療目的都是希望的?？紤]到其在神經(jīng)細(xì)胞死亡、興奮和形成中的作用，優(yōu)選使用本發(fā)明序列，特別是序列1-11的序列。本發(fā)明的這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致使用本發(fā)明序列(核酸-和氨基酸序列)和相應(yīng)的衍生物(如肽、寡核苷酸或抗體)來制備治療腫瘤和神經(jīng)疾病的藥物，特別是缺血狀態(tài)(中風(fēng))，多發(fā)性硬化，神經(jīng)變性疾病比如帕金森疾病、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化、遺傳性退化共濟失調(diào)、神經(jīng)病、亨廷頓疾病、癲癇和老年性癡呆。另外，由于增強的紅細(xì)胞生成素的表達(dá)的正調(diào)節(jié)，本發(fā)明的物質(zhì)可用于其中EPO起(保護(hù))作用的任何病理過程(比如中風(fēng)、和任何形式的急性和慢性組織缺氧)。
根據(jù)本發(fā)明，基于細(xì)胞的HTS分析功能受體的激活，測定酶的互補作用，被證實可用于獲得分子之間關(guān)系的基礎(chǔ)信息。這種分析是基于GPCRs的一般調(diào)控機制，測定激活的受體和β-(視紫紅質(zhì))抑制蛋白之間的相互作用。失活的β-半乳糖苷酶片段互補融合到受體的C-端和β-(視紫紅質(zhì))抑制蛋白。所述受體活化恢復(fù)β-(視紫紅質(zhì))抑制蛋白，這使得兩個半個的β-半乳糖苷酶連在一起，導(dǎo)致有活性的β-半乳糖苷酶，它可轉(zhuǎn)化作為測定信號(ICAST系統(tǒng))的相應(yīng)的底物。原則上任何能表達(dá)為兩個互補的一半的融合蛋白形式并能進(jìn)行根據(jù)常規(guī)方法記錄的底物反應(yīng)的酶都能應(yīng)用上述分析。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明序列的治療用途，也就是本發(fā)明核酸序列或蛋白序列的用途，特別是序列1-4或5-8的核苷酸序列或蛋白質(zhì)序列，或如上限定的變異體，特別是片段的用途，用于哺乳動物的基因治療如人、或其他的基因治療方法?；蛑委煱ㄈ魏涡问降闹委?，或者是導(dǎo)入如權(quán)利要求1-4中任何一項的本發(fā)明序列到身體或其部分如個體組織，或者影響本發(fā)明序列的表達(dá)。因此，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的修飾都可以在基因治療中使用，比如寡核苷酸(如反義或雜交RNA-DNA寡核苷酸)，包括任何含有本發(fā)明序列的修飾物都可以使用。也可以使用包含本發(fā)明任何序列(包括任何變異體如片段、異構(gòu)體、等位基因、衍生物)的病毒構(gòu)建體。相應(yīng)的本發(fā)明的裸DNA序列也適用于基因治療。同樣的，基因治療也可以使用具有酶活性(例如核糖酶)的核酸片段。
除了治療用途，本發(fā)明的核酸或多肽、蛋白異體和由其衍生的本發(fā)明試劑(寡核苷酸、抗體、肽)都可以用于診斷，如診斷人體病癥或基因遺傳缺陷。所述的病癥或基因遺傳缺陷特別是指上述治療用途中涉及的紊亂，特別是神經(jīng)疾病或免疫疾病或腫瘤。診斷方法可在體內(nèi)進(jìn)行，不過一般都不在體內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明的典型非體內(nèi)診斷用途是在生物樣本中定量和/或定性檢測本發(fā)明核酸。此方法優(yōu)選包括如下步驟(a)溫育包含已知量本發(fā)明核酸或適用于擴增本發(fā)明核酸的已知量寡核苷酸引物的生物樣品，(b)通過特定的雜交或PCR擴增檢測本發(fā)明核酸，(c)比較雜交核酸的量或PCR擴增得到的核酸的量與數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)。
而且，本發(fā)明涉及在生物樣本中定量和/或定性檢測本發(fā)明蛋白異體或本發(fā)明蛋白的方法，它包含如下步驟(a)溫育包含特異性針對本發(fā)明蛋白質(zhì)異體或蛋白質(zhì)/多肽的生物樣品，(b)檢測抗體抗原復(fù)合物，(c)比較抗體抗原復(fù)合物的量與數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)通常是來源于正常有機體的生物樣本。為了診斷目的，特別是應(yīng)用本發(fā)明基因如ee3_1基因的特性，在特定病理生理學(xué)的刺激(中風(fēng)、心肌梗塞、腫瘤等)后，胞內(nèi)本發(fā)明序列的mRNA的量發(fā)生變化如增強。因而根據(jù)本發(fā)明，可以預(yù)測(診斷)伴隨本發(fā)明蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化的疾病(如中風(fēng))，進(jìn)行成功的治療的評估或疾病的分類。最后，本發(fā)明的方法也可以用于監(jiān)測上述疾病的治療。
本發(fā)明序列可用于如在人體中測定所述序列多態(tài)性的方法。測定本發(fā)明序列多肽性不但作為本發(fā)明公開的一部分，而且可以作為診斷的預(yù)測標(biāo)記或診斷與本發(fā)明序列的無活性表達(dá)、本發(fā)明無活性序列的表達(dá)和/或過量表達(dá)相關(guān)的疾病的遺傳缺陷。另外，用本發(fā)明序列可以研究人類遺傳疾病，包括單基因和多基因疾病。
除了在人和/或獸醫(yī)(學(xué))的治療和/或診斷用途外，本發(fā)明的核酸或多肽也可用于科研用途。特別是，本發(fā)明序列允許在單細(xì)胞或多細(xì)胞有機體中用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方式鑒定相關(guān)序列，比如用cDNA文庫，或在人類基因組中定位相關(guān)序列。本發(fā)明核苷酸序列，特別是序列1-4(包括任何變異體)，都可以應(yīng)用一般的方法通過同源篩選，如用于老鼠或其他動物基因組和人類基因組中用于分離、繪圖和與標(biāo)記聯(lián)系在一起編碼所述核酸或功能等價物、同源物或衍生物的人類遺傳疾病基因mRNAs。這個過程允許，比如，人體中ee3族序列的染色體座位(染色體2(2q14.2)、X染色體(Xq28，座位編號84548)、染色體5、染色體8、染色體3、染色體7)與特定表型即遺傳疾病聯(lián)系在一起，特別是腫瘤(如肝細(xì)胞腫瘤)，因此大大簡化了診斷所述疾病和使得出現(xiàn)新的治療方法成為可能。本發(fā)明的蛋白也是同樣的。
因此，借助于本發(fā)明地核酸序列可以診斷人類遺傳疾病，包括單基因和多基因疾病，結(jié)果是所述的核酸用作本發(fā)明遺傳疾病的診斷方法的標(biāo)記。
本發(fā)明特別公開了用于科研用途的基于本發(fā)明的氨基酸和/或核苷酸序列的分析系統(tǒng)。與此相關(guān)，cDNA、基因組DNA、本發(fā)明核酸序列調(diào)控元件和多肽及其重組或其非重組形式的片段被用于分析系統(tǒng)。這樣的本發(fā)明分析系統(tǒng)特別適合于測定啟動子或蛋白在待測物質(zhì)存在下的活性。優(yōu)選的所述分析系統(tǒng)包括可以快速測定大量待測物質(zhì)的簡單測量方法(比色法、光度計法、熒光或同位素法)(Bhm，Klebe，Kubinyi，1996，Wirkstoffdesign(藥物設(shè)計)，Spektrum-Verlag，Heidelberg)。分析系統(tǒng)可以用化學(xué)文庫來篩選抑制或激活的方式作用于本發(fā)明蛋白質(zhì)，特別是序列5-8(及其衍生物或片段)的物質(zhì)。鑒定這樣的物質(zhì)是鑒定新的特異性作用于ee3相關(guān)信號傳導(dǎo)的藥物的第一步。其中特別涉及提供運用了與G蛋白偶聯(lián)的蛋白的特性的分析系統(tǒng)，如下面公開的分析系統(tǒng)。
本發(fā)明蛋白(特別是如附圖13、14、15A、15B、15C、16或18中所示的蛋白)的生物活性的抑制，典型的是與細(xì)胞凋亡、繁殖、再生、細(xì)胞生長相關(guān)的活性的抑制，如在中風(fēng)、敗血癥性休克、GvHD(移植物抗宿主疾病)、變性疾病，特別是神經(jīng)變性疾病，急性肝炎或其他上述公開的癥狀中所希望的抑制，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法導(dǎo)入至少10個核苷長度的寡核苷酸至感染的細(xì)胞，其中的寡核苷酸編碼具有序列5、6、7A、7B、7C、8和11的蛋白質(zhì)序列的天然序列的(一部分)反義鏈。由此阻斷了在相應(yīng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中本發(fā)明ee3族蛋白(比如ee3_1或ee3_2)天然mRNA的翻譯，這導(dǎo)致了轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活能力的增強或?qū)?xì)胞生長、細(xì)胞可塑性和細(xì)胞繁殖的調(diào)節(jié)。其中，上述方法也可以用重組病毒。
用核糖酶的方法也可以治療基于相應(yīng)的本發(fā)明序列失調(diào)(如上述提到的指征)的疾病中的病理性增強的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞繁殖。對此使用能剪切靶mRNA的核糖酶。既然這樣，本發(fā)明公開了涉及并公開了能裂解天然ee3(比如ee3_1或ee3_2)-mRNA的核糖酶。本發(fā)明的核糖酶必須能與本發(fā)明目的靶mRNA相互作用，如通過堿基配對，然后裂解所述mRNA以阻斷如ee3_1或ee3_2的翻譯。本發(fā)明的核糖酶經(jīng)合適的載體導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞中(特別是質(zhì)粒、修飾的動物病毒特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒)，其中所述的載體除了任選具有其他序列以外，含有本發(fā)明核糖酶cDNA序列。
調(diào)節(jié)本發(fā)明基因產(chǎn)物，特別是根據(jù)附圖13、14、15A、15B、15C、16或18的基因產(chǎn)物的生物活性，典型地調(diào)節(jié)本發(fā)明基因產(chǎn)物在凋亡或壞死、繁殖或生長-指示信號傳導(dǎo)中的活性，除了上述可能性外，也可以借助于本發(fā)明其他的主題。本發(fā)明化合物可以調(diào)節(jié)，典型地抑制或激活特別是本發(fā)明ee3族蛋白的胞內(nèi)功能或在基于本發(fā)明DNA序列的水平上，比如通過結(jié)合DNA(比如啟動子區(qū)域)或結(jié)合任何控制本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)錄因子而影響的生物活性。本發(fā)明化合物典型的都是特異性結(jié)合本發(fā)明蛋白，特別是具有序列1-4的序列的蛋白或本發(fā)明核酸序列，特別是序列5-8的核酸序列，因而產(chǎn)生一個藥理學(xué)的特別是神經(jīng)保護(hù)或免疫調(diào)節(jié)或抗凋亡或抗繁殖的作用。
因此。本發(fā)明公開了化合物，優(yōu)選為有機化合物，其分子量小于5000，優(yōu)選為小于3000，更優(yōu)選為小于1500，其具有好的生理耐受性和能較好的通過血-腦屏障。需要的話，所述化合物可以是組合物的一部分，所述組合物至少含有一種其他活性化合物和優(yōu)選含有輔料和/或添加劑，而且可以作為藥物應(yīng)用。特別優(yōu)選能與本發(fā)明蛋白結(jié)合，特別是與本發(fā)明蛋白的C-端、胞質(zhì)區(qū)或胞外區(qū)結(jié)合的結(jié)合常數(shù)至少為107mol-1的有機分子。本發(fā)明化合物優(yōu)選的是能以擴散或膜(內(nèi))運輸?shù)鞍椎姆绞酵ㄟ^細(xì)胞膜，需要的話，其在作了合適的修飾后比如連有AA序列。進(jìn)一步優(yōu)選的是那些能抑制或增強本發(fā)明ee3族蛋白與結(jié)合配偶體的相互作用，特別是關(guān)于凋亡或壞死、繁殖或生長指示或再生信號的傳導(dǎo)的化合物。這樣的化合物占據(jù)了特別是本發(fā)明蛋白的表面位點或?qū)е卤景l(fā)明蛋白的局部構(gòu)像變化，以阻斷本發(fā)明蛋白的天然結(jié)合配偶體的結(jié)合。
經(jīng)過本發(fā)明蛋白的結(jié)構(gòu)分析可有針對性地發(fā)現(xiàn)具有特異性結(jié)合親和性的本發(fā)明化合物(Rationales Drug Design(Bhm，Klebe，Kubinyi，1996，Wirkstoffdesign，Spektrum-Verlag，Heidelberg))。在此，任何本發(fā)明蛋白(特別是具有序列5-8的蛋白)的結(jié)構(gòu)或部分結(jié)構(gòu)、衍生物、等位基因、異構(gòu)體或其的一部分，可以通過NMR-或X-射線晶體分析方法(如按照“懸掛液滴”法)鑒定，如果無法獲得高分辨率的結(jié)構(gòu)，可根據(jù)結(jié)構(gòu)預(yù)測算法(比如也根據(jù)同源蛋白(如視紫質(zhì))的已知結(jié)構(gòu))建立本發(fā)明蛋白結(jié)構(gòu)模型，所述結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)模型結(jié)合分子模型程序可用于鑒定可作為拮抗劑或激動劑的化合物，以可預(yù)測與本發(fā)明蛋白具有高親和性的化合物。需要的話，上述定義的方法可以相互結(jié)合用于結(jié)構(gòu)分析。合適的力場可以用來模擬潛在親和性的化合物與感興趣的本發(fā)明蛋白的亞結(jié)構(gòu)(比如活性中心、結(jié)合腔或鉸鏈區(qū))的親和力。然后合成這樣的物質(zhì)并用合適的方法測試其結(jié)合能力和他們用于治療的可用性。這種用硅膠方法鑒定顯示具有與本發(fā)明ee3蛋白結(jié)合的潛在活性化合物同樣是本發(fā)明的主題。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明化合物是一種抗體，優(yōu)選的是抗本發(fā)明ee3族蛋白(比如ee3_l、ee3_2或ee3_5)的抗體，或抗基于的mRNA的抗體，其中抗體通過非體內(nèi)方式導(dǎo)入、重新移植的宿主細(xì)胞或通過體內(nèi)基因治療的方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞并在那里不作為“細(xì)胞內(nèi)抗體”分泌但是發(fā)揮其胞內(nèi)作用。這樣的本發(fā)明胞內(nèi)抗體可以保護(hù)細(xì)胞免于錯誤指導(dǎo)的凋亡反應(yīng)，比如過量表達(dá)本發(fā)明蛋白。這樣的過程一般適合于那些組織的細(xì)胞，其中的組織在患者體內(nèi)顯示出病理生理學(xué)的過量凋亡行為，即，比如胰腺細(xì)胞、角化細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)元或肌細(xì)胞。除了抗體或胞內(nèi)抗體(intrabodies)以外，通過這種方式用本發(fā)明胞內(nèi)抗體基因治療修飾的細(xì)胞也是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的化合物，其具有阻斷作用，需要的話，激活本發(fā)明天然ee3蛋白的生物活性，比如序列5、6、7A、7B、7C、8和11，或相應(yīng)的天然等位基因或天然剪切的變異體，比如凋亡作用，可以用做藥物。此處的化合物包括任何上述變異體，也就是，比如有機化合物、抗體、反義寡核苷酸、核糖酶。本發(fā)明化合物特別適合于(制備藥物)治療疾病，特別是神經(jīng)疾病、免疫疾病或增殖疾病。因而，可將本發(fā)明的天然蛋白，特別是一種具有序列5-8的蛋白或其天然變異體的細(xì)胞功能抑制劑(如抑制作用的抗體(特別是胞內(nèi)抗體)、核糖酶、反義RNA、顯性陰性突變體或上述之一，任選的抑制性有機化合物，優(yōu)選高親和力的化合物，如用上述方法獲得的化合物)，比如凋亡反應(yīng)的抑制劑作為藥物和特別是用于治療下述疾病或制備治療下述疾病的藥物心肌梗塞，心力衰竭，原發(fā)性心肌癥，心肌炎，心包炎，心包心肌炎，冠心病，左右分流先天性心臟病，法樂四聯(lián)癥/五聯(lián)癥，Eisenmenger綜合征，中風(fēng)，末端灌注不足，動脈閉合癥(AVK)，外周動脈閉合癥(PAVK)，頸動脈狹窄，腎動脈狹窄，腦中微循環(huán)紊亂(小血管癥)，大腦內(nèi)出血，大腦靜脈和竇血栓癥，血管畸形，蛛網(wǎng)膜下出血，賓斯旺格癡呆(biswanger’s disease)，皮層下動脈硬化性腦病，栓塞引起的多重皮層梗死，脈管炎，糖尿病性視網(wǎng)膜病，不同原因引起的貧血癥連續(xù)癥狀(例如，再生障礙性貧血，脊髓發(fā)育不良綜合癥，紅血球增多癥，巨紅細(xì)胞貧血癥，缺鐵性貧血癥，腎貧血癥，球形紅細(xì)胞溶血性貧血癥，地中海貧血癥，血紅蛋白病，6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏癥，輸血感染，恒河猴不相容疾病，瘧疾，心(臟)瓣膜移植，出血性貧血，脾機能亢進(jìn)癥)，肺纖維化，肺氣腫，肺水腫ARDS，IRDS，復(fù)發(fā)性肺栓塞。
腫瘤(例如，腸癌，乳腺癌，前列腺癌，肺癌)，免疫系統(tǒng)疾病(例如，自身免疫病，特別是糖尿病，銀屑病，免疫缺陷病，多發(fā)性硬化癥，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或遺傳性過敏癥，哮喘)，病毒感染性疾病(例如，HIV，丙型或乙型肝炎感染，細(xì)菌感染(例如，鏈球菌或葡萄球菌感染)，變性疾病，特別是神經(jīng)變性疾病，例如肌肉萎縮癥，GvHD(例如，肝，腎或心)，或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病(特別是，但不限于下述疾病中風(fēng)，多發(fā)性硬化癥，帕金森氏癥，蛛網(wǎng)膜下出血，肌萎縮性側(cè)索硬化，遺傳退化性共濟失調(diào)，亨廷頓氏病，神經(jīng)病，癲癇癥，腦組織損傷，阿爾茨海默病)；肌松癥(例如，肌肉麻痹)，內(nèi)分泌疾病(例如，骨質(zhì)疏松癥或甲狀腺功能亢進(jìn))和皮膚病(例如，銀屑病，神經(jīng)性皮炎)；控制銳痛或鈍痛，遺傳性疾病以及心理疾病(例如，精神分裂癥或抑郁癥)，愈合傷口，改善性功能，心血管疾病(例如，局部缺血性梗塞，心機能不全，心律失常，高血壓)，提高大腦功能。
所有上述提到的癥狀領(lǐng)域都適合于應(yīng)用本發(fā)明的基因產(chǎn)物或本發(fā)明DNA序列制備藥物。
上述提到的本發(fā)明物質(zhì)也可以是藥用組合物的組成部分，其可包含其它的藥用載體、輔料和/或添加劑，以例如穩(wěn)定所述用于治療給藥的組合物，提高生物獲得性和/或藥效。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定藥物活性化合物的方法(篩選方法)，特別是那些對于引起或傳導(dǎo)本發(fā)明序列導(dǎo)致的生理學(xué)反應(yīng)的信號具有抑制特性的化合物。這樣的藥學(xué)活性化合物既可以在胞外端、TM區(qū)阻斷本發(fā)明受體(在此，比如，消弱二聚或多聚合化)，也可以阻斷胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，比如阻斷或激活ee3蛋白和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白的相互作用，特別是影響(激活或抑制)胞內(nèi)蛋白ranbpm和/或MAP1a/MAP1b之間的相互作用。
本發(fā)明方法提供給(a)用權(quán)利要求5的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述表達(dá)載體特別是編碼本發(fā)明多肽，比如具有序列5、6、7A、7B、7C、8和11的多肽的表達(dá)載體，和任選至少一種編碼至少一個報告基因的表達(dá)載體；和(b)適用于觀察本發(fā)明蛋白介導(dǎo)的功能的參數(shù)，比如再生或增殖過程中的信號傳導(dǎo)，特別是(a)獲得的宿主細(xì)胞體系在添加待測化合物后，與不加待測化合物的對照比較測定Caspase-3的激活。對此，按照本發(fā)明方法優(yōu)選用遞增濃度的待測物質(zhì)平行進(jìn)行多個實驗，以在有藥物活性的情況下能夠測定例如待測物質(zhì)的凋亡抑制作用-ID50值。
Ee3蛋白的一級序列可以用作制備重組構(gòu)建體，其運用了現(xiàn)有技術(shù)中已知的GPCR的特性。因而可以，比如用本發(fā)明ee3蛋白的特定序列區(qū)域替換已知的、良好表征的GPCR的特定序列。得到的構(gòu)建體可以用于通過用已知的配體或激動劑鑒定G蛋白偶聯(lián)和所用的第二信使系統(tǒng)，或使用已知G蛋白的偶聯(lián)尋找配體、激動劑或阻斷劑。比如用于上述用途的本發(fā)明的嵌合受體的制備，例如可根據(jù)Kobilka等人所述的方法(將這種方法包括在本發(fā)明公開中)(Kobilka BK，KobilkaTS，Daniel K，Regan JW Caron MG，Lefkowitz RJ(1988)Chimericalpha 2-，beta 2-adrenergic receptorsdelineation of domains involvedin effector coupling and ligand binding specificity.Science 2401310-1316)。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步可以使用ee3族的組成型活性受體突變體，以表征所述受體對于信號傳導(dǎo)途徑的影響和用于篩選配體。作為代表性的7TM-蛋白類的本發(fā)明受體可以特定方法突變，使得所述受體的生理學(xué)的和藥理學(xué)的行為發(fā)生變化。這可以例如當(dāng)天然配體或一種激動劑是未知的時候，用于鑒定胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑。特別適合的是在ee3蛋白DRI恒定區(qū)進(jìn)行這樣的突變，比如DRY序列的R突變?yōu)長ys、His、Glu、Asp、Ala、Asn和Ile(Scheer A，Costa T，F(xiàn)anelliF，DeBenedetti PG，Mhaouty-Kodja S，Abuin L，Nenniger-Tosato M，Cotecchia S(2000)Mutational analysis of the highly conservedarginine within the Glu/Asp-Arg-Tyr motif of the alpha(1b)-adrenergicreceptoreffects on receptor isomerization and activation.MolPharmacol 57219-231)導(dǎo)致在突變?yōu)長ys時組成型活性很大的增強。突變?yōu)镠is或Asp則導(dǎo)致組成激活較小的增強。有趣的是，突變?yōu)锳rg增強激動劑的親和力，因此這些突變體也是HTS篩選所感興趣的。
同樣地，在第三個TM區(qū)的保守的Arg是突變的可能位點(Ballesteros J，Kitanovic S，Guarnieri F，Davies P，F(xiàn)romme BJ，Konvicka K，ChiL，Millar RP，Davidson JS，Weinstein H，Sealfon SC(1998)Functional microdomains in G-protein-coupled receptors.Theconserved arginine-cage motif in the gonadotropin-releasing hormonereceptor。J Biol Chem 27310445-10453)。
或者，基于應(yīng)用固定化的本發(fā)明受體的方法可以用于鑒定內(nèi)源性或替代配體。因而本發(fā)明ee3族的受體可以與GST、Flag標(biāo)簽或TAP標(biāo)簽作為融合蛋白表達(dá)，正如本發(fā)明公開的。相應(yīng)的細(xì)胞或者是根據(jù)一般方法處理得到膜或直接用于溶解。合適的清潔劑，比如十二烷酸麥芽苷(maltoside)、洋地黃皂苷、膽酸鹽、或清潔劑混合物，都可以用于溶解受體，然后連接到相應(yīng)的親和性基質(zhì)，如GST Sepharose、抗-Flag-M2-瓊脂糖或IgG Sepharose等。沖洗基質(zhì)后，與組織提取物或細(xì)胞上清液一起培育，然后又清洗。如果提取物含活性配體比如肽，則所述配體與固定化的受體結(jié)合，在洗脫后可以用分析方法比如質(zhì)譜法鑒定。
根據(jù)本發(fā)明，所謂的“內(nèi)化分析”代表另外一種過程，可以鑒定本發(fā)明受體(比如ee3_1)的天然或特別是替代配體。在此也運用到GPCR類蛋白的不同的特性。比如可以運用GPCR類蛋白的內(nèi)化行為。這可以理解為激活受體后的調(diào)控機制?；趦?nèi)化行為的篩選方法有不需要特定受體的詳細(xì)生理學(xué)知識的好處。特別是，不需要用到偶聯(lián)G蛋白和所用的信號傳導(dǎo)途徑的知識。
比如lenkei等(2000，J Histochem Cytochem，48，1553-64)描述了這樣的一種分析，根據(jù)本發(fā)明其類似地也可用于本發(fā)明的受體。對此，根據(jù)本發(fā)明，首先制備本發(fā)明蛋白與EGFP的C-端融合構(gòu)建體。然后就可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備穩(wěn)定的CHO細(xì)胞。根據(jù)EGFP熒光借助FACS分類子挑選出穩(wěn)定的克隆。借助熒光-顯微鏡判斷表面表達(dá)進(jìn)行最后的選擇。然后將細(xì)胞與組織提取物的HPLC級分一起培育，用共聚焦顯微鏡測定內(nèi)化。根據(jù)熒光信號的細(xì)胞中心距離原則，借助形態(tài)度量的軟件(NIH圖像)進(jìn)行評估。頻率/距離分布對所述內(nèi)化進(jìn)行了較好的鑒別。
為了找到未知的配體，進(jìn)行連續(xù)的分級分離以分出純的相應(yīng)的肽，然后比如通過測序或MALDI-TOF進(jìn)行鑒定。Ghosh(2000，Biotechniques，29，170-5；Conway等人，1999，J Biomol Screen，4，75-86)等描述了原則上相同方法的另外的應(yīng)用。將這兩種全部引入本發(fā)明作為本發(fā)明公開的一部分。
然而，也可以使用功能性Ca分析鑒定配體和/或任選表征本發(fā)明的受體。根據(jù)本發(fā)明，在HEK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞或其他細(xì)胞中產(chǎn)生的多種7TM受體(帶有7個跨膜區(qū)的受體)通過與Gq類G蛋白偶聯(lián)，激活PLC和釋放胞內(nèi)Ca。如果本發(fā)明的某些受體與Gq類G蛋白不偶聯(lián)，則所述受體可以通過共表達(dá)嵌合G蛋白或相對地與受體非特異性偶聯(lián)的G蛋白G15或G16經(jīng)由PLC，即Ca釋放產(chǎn)生信號傳導(dǎo)。本發(fā)明ee3族受體典型地在HEK293和CHO細(xì)胞中既可以穩(wěn)定地也可以瞬時地、單獨和與嵌合G蛋白Gqi5或者與G蛋白Gq15一起表達(dá)。所述細(xì)胞優(yōu)選用能透過膜的Ca-結(jié)合熒光染料比如Fura-2或Fluo-3或-4負(fù)載，并在沖洗細(xì)胞后，加入各種待測物質(zhì)，同時測定Ca釋放，比如用Molecular Device公司的FLIPR設(shè)備。最后，在(僅用載體轉(zhuǎn)染的)對照細(xì)胞中測定顯示陽性信號的待測物質(zhì)，如果發(fā)現(xiàn)信號是特異性的，則進(jìn)行藥學(xué)上表征，即通過劑量-應(yīng)答曲線。
另外，可以通過其他的Ca測試法測定配體引發(fā)的Ca-應(yīng)答，比如Euroscreen的 AequoScreen(Brüssel，Belgien；參見例如http//www.pharmaceuticaltechnology.com/contractors/compound_man/euroscreen/)。其中用到表達(dá)水母發(fā)光蛋白部分蛋白基因的細(xì)胞。在用與水母發(fā)光蛋白結(jié)合的Coelenterazin處理細(xì)胞后產(chǎn)生水母發(fā)光蛋白。如果配體引發(fā)Ca釋放，所述的Ca激活水母發(fā)光蛋白氧化Coelenterazin，由此發(fā)光。發(fā)射光的強度與胞內(nèi)Ca濃度的增加成比例，由此可用于測定發(fā)現(xiàn)的配體的活性(考慮相應(yīng)的對照)。
為了鑒定本發(fā)明的拮抗劑，在足夠高濃度的各種配體存在下用已知的激動劑刺激受體。與對照(只是激動劑，沒有其他配體)相比信號的改變，例如Ca信號的降低，顯示競爭性拮抗劑。
此外，也可以應(yīng)用cAMP分析用于表征本發(fā)明的ee3族受體和用于鑒定配體。關(guān)于用于本發(fā)明ee3受體藥理學(xué)表征的方法和用于鑒定配體(激動劑或拮抗劑)的基礎(chǔ)是GPCRs類受體的特性，也就是說，例如，本發(fā)明蛋白以刺激或抑制方式作用于腺苷酸環(huán)化酶，通常是激活“激活Gs”或“抑制Gi”蛋白。根據(jù)待測物質(zhì)的作用，例如在高通量篩選中，可以通過直接或間接的測定相關(guān)聯(lián)的胞內(nèi)cAMP水平的變化。對此涉及在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定或瞬時表達(dá)受體基因(見實施例2)。在激活腺苷酸環(huán)化酶的GPCRs情況下，通過細(xì)胞中cAMP水平提高，通過與對照細(xì)胞相比cAMP濃度的增強可以鑒定待測物質(zhì)中的潛在的激動劑。待測物質(zhì)中的拮抗劑，例如在HTS方法中，是通過他們阻斷激動劑引發(fā)的cAMP濃度的增加而測定的。至于本發(fā)明Gi-偶聯(lián)的ee3受體，在測定中或者直接用毛喉素刺激腺苷酸環(huán)化酶或通過刺激激活Gs-偶聯(lián)受體而提高cAMP水平。Gi-偶聯(lián)受體的激動劑抑制這種提高。一些商業(yè)上可獲得的分析，例如Amersham公司的cAMP[3H]分析體系可以用于直接的cAMP測定，它是基于在例如通過添加同位素(氚)標(biāo)記的cAMP競爭性取代內(nèi)源性產(chǎn)生的cAMP的原理。間接的cAMP測定通常通過報道分子分析的方式進(jìn)行。為此，在含有報道分子系統(tǒng)，例如CRE-熒光素酶系統(tǒng)的細(xì)胞系中表達(dá)受體。cAMP激活熒光素酶的表達(dá)，熒光素酶的活性由其轉(zhuǎn)化相應(yīng)的底物和產(chǎn)物的熒光測定法來測定。報道分子分析特別適用于大規(guī)模的篩選方法。
最后，除了上述方法外，根據(jù)本發(fā)明也可以使用下面的分析系統(tǒng)來表征本發(fā)明受體的第二信使系統(tǒng)和/或鑒定本發(fā)明ee3受體的配體，根據(jù)本發(fā)明特別是根據(jù)Salomon(Salomon等人，(1979).Adv.CyclicNucleotide Res.10，35-55)測定細(xì)胞內(nèi)或膜的腺苷酸環(huán)化酶活性，以測定肌醇-3-磷酸的濃度或測定花生四烯酸釋放的變化。例如，可以在普通細(xì)胞系中過量表達(dá)ee3_1并通過用組織提取物激活后測定上述第二信使系統(tǒng)的活性。個別地，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的GPCR類的第二信使系統(tǒng)的分析，有的也可以在文獻(xiàn)中找到，例如SignalTransductionA practical approach，G.Milligan，Ed.OxfordUniversity Press，Oxford，England。用于篩選的其它報道分子分析包括MAP激酶/熒光素酶和NFAT-熒光素酶系統(tǒng)。
基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，即ee3受體信號傳導(dǎo)也可以通過MAP激酶信號傳導(dǎo)途徑傳導(dǎo)，可以開發(fā)篩選分析方法來尋找配體或鑒定抑制劑，例如通過NF-kB報道分子系統(tǒng)或熒光素酶系統(tǒng)。
正如上面所述，第二信使的激活也可以用于鑒定與本發(fā)明受體結(jié)合的配體、激動劑或拮抗劑，其中可以顯示其對某些胞內(nèi)過程的激動和/或阻斷作用。例如，微量生理功能測定儀可以用于鑒定配體、激動劑或拮抗劑。Ee3族受體與配體結(jié)合引發(fā)的信號代表能量消耗的過程。因而，這樣的過程總是伴隨著微小的代謝變化，尤其是微小的pH移動。例如，所述的變化可以通過微量生理功能測定儀(細(xì)胞感受器，Molecular Devices)胞外紀(jì)錄。
在鑒定與本發(fā)明ee3族受體蛋白具有結(jié)合潛力的配體、激動劑或拮抗劑后，根據(jù)本發(fā)明通過配體結(jié)合實驗可以進(jìn)一步的表征。配體結(jié)合實驗使得可以直接測定受體的藥理學(xué)，即各種配體對所述受體的親和性。對于結(jié)合研究，典型的是對通過上述方法之一鑒定的或其他方式已知的化學(xué)純的配體進(jìn)行強特異性活性(30-2000Ci/mmol)的同位素標(biāo)記，使這樣的標(biāo)記不會降低關(guān)于配體對所述受體的活性。優(yōu)化對于用于表達(dá)受體的細(xì)胞以及與由此制備的膜有關(guān)的緩沖液組成、鹽、調(diào)節(jié)劑(例如核苷酸)或穩(wěn)定劑(如甘油)的測試條件，以得到可用的信號-背景比率。對于這些結(jié)合實驗而定義特異受體結(jié)合為與受體制備物(細(xì)胞或膜)相關(guān)連的不同的總的放射活性，也就是說，只在特異的同位素配體存在下測定與在同位素配體和過量的非同位素標(biāo)記的配體存在下測定放射活性的差別。其中未標(biāo)記的配體競爭性取代同位素的配體?？赡艿脑?，為了測定非特異結(jié)合使用至少兩種化學(xué)不同的競爭性配體。合適的特異結(jié)合占總結(jié)合的至少50％。結(jié)合實驗要么是不均勻的如過濾實驗，要么是均一的如閃爍親近測定法。
在第一種方法中，將包含受體的制備物(細(xì)胞或膜)與配體在合適的緩沖液中溫育直到達(dá)到結(jié)合平衡，典型的為在RT下1小時和4℃過夜，然后用合適過濾器過濾，例如Whatman或Schleicher&Schuell的任選經(jīng)過預(yù)處理的玻璃纖維過濾器，例如用聚乙烯亞胺過濾，以將結(jié)合的同位素配體與未結(jié)合的分開。清洗過濾器后，在干燥或在濕的狀態(tài)，用合適的閃爍劑處理和可能需要的培育后，用閃爍計數(shù)儀測定放射活性。在閃爍親近測定法中，在合適的緩沖液中溫育合適的閃爍珠子(例如WGA珠子)和配體和包含受體的膜直到達(dá)到結(jié)合平衡，然后用合適的閃爍計數(shù)儀測定放射活性。兩種結(jié)合實驗都可以HTS形式進(jìn)行。
溶解的或純化的受體的測定可以采用閃爍親近測定法或用普通非均相測定法例如PEG沉淀后的過濾實驗、吸收實驗或凝膠過濾實驗(Hulme E，Birdsall N(1986)Distinctions in acetylcholine receptoractivity.Nature 323396-397)。
代替同位素配體，也可以使用熒光配體例如與熒光染料(例如BODIPY)共價結(jié)合的配體。熒光配體與受體結(jié)合的測定是通過熒光偏振進(jìn)行的。這種方法也適用于HTS形式的初步篩選和二級分析。
此外，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步公開了鑒定配體(激動劑或拮抗劑)的高通量篩選方法(HTS)，特別是鑒定本發(fā)明ee3序列的抑制劑。對此，特別優(yōu)選使用MAP信號傳導(dǎo)途徑中的(所有已知的)元件，以在本發(fā)明方法中鑒定抑制劑，特別是鑒定小的有機化合物。優(yōu)選的系統(tǒng)是包含閃爍親近測定法(SPA)(Amersham LifeScience，MAP kinase SPA(s.McDonald等人，1999，Anal Biochem，268，318-29)。將所述文獻(xiàn)全部引入作為本發(fā)明公開的一部分。在此，在體外構(gòu)建MAP級聯(lián)，用GST融合蛋白(E.coli表達(dá))的一部分或在cRAF1情況下用桿狀病毒系統(tǒng)制備。為了可靠的測定抑制劑，級聯(lián)反應(yīng)(MAP-KKK)的第一個元件必須恒久和平穩(wěn)地激活。這通常在桿狀病毒系統(tǒng)中以與src共表達(dá)的方式進(jìn)行，由此保證ras類似物激活cRaf。在用本發(fā)明核苷酸序列轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)節(jié)，以能在HTS中測定通過加入待測物質(zhì)測定對所述調(diào)節(jié)的影響。
在用本發(fā)明上述方法鑒定高親和力的選擇性物質(zhì)后，測試所述物質(zhì)作為藥物治療癲癇、中風(fēng)和其他神經(jīng)的、免疫的或增殖的疾病(腫瘤)的用途。除此之外，通過用酵母雙雜交系統(tǒng)或其他測定方法可以確定所鑒定的和藥理學(xué)上有活性的物質(zhì)與本發(fā)明ee3基因產(chǎn)物，特別是序列5、6、7A、7B、7C、8和11的結(jié)合位點，也就是說，限定參與相互作用的氨基酸，例如天然蛋白之間的相互作用。在下一個步驟中可以鑒定具有高親和力的物質(zhì)(替代配體)，這種物質(zhì)特異性結(jié)合事先已通過本專利申請描述的篩選方法鑒定的負(fù)責(zé)天然相互作用部分(結(jié)構(gòu)區(qū))的氨基酸。這樣，也可以發(fā)現(xiàn)影響特別是抑制本發(fā)明多肽和其可能的天然胞內(nèi)相互作用配偶體的物質(zhì)。由此，本發(fā)明公開了利用與本發(fā)明蛋白具有特異性結(jié)合親和力的物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)方法。對此，特別的參考文獻(xiàn)如Klein等(1998，Nat Biotechnol，16，1334-7))描述的方法。此外，也可以應(yīng)用屬于G蛋白偶聯(lián)受體(與G蛋白偶聯(lián)，傳導(dǎo)信號)的本發(fā)明蛋白的已知特性以鑒定本發(fā)明的抑制劑。
由于ee3族，特別是ee3_1和ee3_2序列，和/或它們天然變異體的本發(fā)明基因或本發(fā)明基因產(chǎn)物在治療例如神經(jīng)變性、增殖，特別是腫瘤的疾病(腫瘤，例如實體瘤(肉瘤(皮膚肉瘤(Kaposi肉瘤)、母細(xì)胞瘤、肝癌、腸癌、胰腺癌、胃癌或肺癌)或造血系統(tǒng)的腫瘤，特別是淋巴瘤或白血病)，或低凋亡或高凋亡疾病等疾病的藥理學(xué)上的重要性，根據(jù)本發(fā)明方法鑒定的藥理學(xué)上有活性的物質(zhì)具有很廣泛的用途。除了抑制與一種或更多種其他分子的相互作用，例如在信號途徑中下游蛋白激酶或調(diào)節(jié)劑(Adaptoren)，特別是也可以用于影響本發(fā)明蛋白在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄的量，這就是藥理活性的基礎(chǔ)。例如可提及的一個例子是通過本發(fā)明化合物抑制病理過程后本發(fā)明DNA序列轉(zhuǎn)錄的快速正調(diào)節(jié)，特別是通過轉(zhuǎn)錄激活的快速調(diào)節(jié)。藥物活性物質(zhì)的優(yōu)選靶標(biāo)是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，例如所述物質(zhì)通過特異性結(jié)合本發(fā)明基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動子或增強子序列)，結(jié)合本發(fā)明基因產(chǎn)物的一個或更多個轉(zhuǎn)錄因子(導(dǎo)致激活或抑制所述轉(zhuǎn)錄因子)或調(diào)節(jié)這樣的轉(zhuǎn)錄因子(轉(zhuǎn)錄或翻譯)本身的表達(dá)。
除了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，即調(diào)節(jié)細(xì)胞中本發(fā)明基因的mRNA的量以外，本發(fā)明藥物活性的化合物也可以干涉其他胞內(nèi)控制過程，這些過程例如影響本發(fā)明蛋白的表達(dá)比率(例如翻譯、剪切過程、本發(fā)明基因產(chǎn)物的天然衍生物例如磷酸化，或調(diào)節(jié)本發(fā)明基因產(chǎn)物的降解。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定本發(fā)明ee3族多肽，即特別是是蛋白ee3_1、ee3_2或ee3_5和/或它們天然的變異體(異構(gòu)體、等位基因、剪切形式、片段)的胞內(nèi)相互作用配偶體的方法。用這種方式可以鑒定蛋白的相互作用配偶體，其對本發(fā)明蛋白具有特異性結(jié)合親和力，或鑒定編碼對本發(fā)明蛋白具有特異性結(jié)合親和力的蛋白的核酸。本發(fā)明ee3蛋白類的蛋白的胞內(nèi)相互作用配偶體的例子有其他的GPCRs或離子通道。
優(yōu)選單獨使用酵母雙-雜交篩選方法(y2h篩選)或與其他生物化學(xué)方法聯(lián)合實施這類本發(fā)明的方法或應(yīng)用本發(fā)明所述多肽、核酸序列和/或核酸構(gòu)建體實施這類方法(Fields and Song，1989，Nature，340，245-6)。Van Aelst等人(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6213-7)和Vojtek等人(1993，Cell，74，205-14)也描述了這種篩選方法。通常，也可以如Luo等人所述(1997，Biotechniques，22，350-2)，使用哺乳動物系統(tǒng)代替酵母系統(tǒng)來實施本發(fā)明所述的方法。前面所述的試驗方法利用了GPCR蛋白家族的典型性質(zhì)，例如，經(jīng)由G蛋白，即已知的細(xì)胞內(nèi)相互作用配偶體，介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
對于y2h篩選，例如將本發(fā)明序列，特別是序列1-4或其天然變體的開放閱讀框，更優(yōu)選本發(fā)明序列的胞內(nèi)區(qū)，例如ee3_1或ee3_2，克隆到具有GAL4結(jié)合域的所謂“誘餌載體”(bait vector)中(Clontech公司的pGBT10或pGBKT7)?？梢愿鶕?jù)已知的方法用所謂的“捕獲文庫”(prey library)在酵母菌中搜索相互作用蛋白。另外，y2h系統(tǒng)也可用于實施所謂的“定位試驗”(mapping experiments)，以確定特異性的相互作用區(qū)域。
在雙雜交系統(tǒng)中，也優(yōu)選使用其它融合配偶體或其它細(xì)胞系，例如Stratagene公司的BacterioMatch系統(tǒng)或Stratagene公司的CytotTrap系統(tǒng)。作為y2h篩選方法的另一種形式，也可以如本發(fā)明所述，使用相應(yīng)的哺乳動物細(xì)胞系，例如Luo等人(1997，Biotechniques，22，350-2)所描述的，將該文獻(xiàn)引入本文作為本發(fā)明公開的一部分。
如本發(fā)明所述，也可以利用免疫共沉淀反應(yīng)，從用本發(fā)明所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中分離相互作用物質(zhì)，以純化與之結(jié)合的蛋白，隨后通過蛋白測序方法(例如，MALDI-TOF，ESI-tandem-MALDI)確定該蛋白相應(yīng)的基因。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及酵母雙雜交系統(tǒng)或現(xiàn)有技術(shù)中已知的類似方法或其它生化方法的應(yīng)用，以確定本發(fā)明ee3蛋白和/或其天然變體的相互作用區(qū)域，以及所述相互作用區(qū)域(天然序列的片段)在藥物治療干預(yù)中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了鑒定ee3族內(nèi)源性或替代配體，即具有與本發(fā)明ee3家族受體相結(jié)合功能的非天然化合物的方法，該方法通過應(yīng)用以下起始物質(zhì)的試驗進(jìn)行(a)應(yīng)用各種各樣的組織提取物和細(xì)胞培養(yǎng)上清夜，所述組織或細(xì)胞可以是預(yù)先以促紅細(xì)胞生成素之類的物質(zhì)處理過的，然后將提取物分級，并用每個級分再進(jìn)行試驗，直到分離出配體。(b)利用商品化物質(zhì)庫，例如Sigma公司的LOPAC。該物質(zhì)庫包含孤兒受體的可能配體，特別是(神經(jīng))遞質(zhì)、生物活性肽、激素、化學(xué)激素和其它天然存在的物質(zhì)，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，這些物質(zhì)能夠與7TM受體相結(jié)合，因此它們也有可能與本發(fā)明的ee3家族受體相結(jié)合。(c)使用組合的肽文庫?；?d)使用組成成分差異較大的商品化物質(zhì)庫。
EPO對例如ee3_1的正向調(diào)節(jié)作用說明ee3_1與細(xì)胞存活相關(guān)，因為EPO具有神經(jīng)保護(hù)作用。因此，本發(fā)明的多肽，特別是應(yīng)對其生物學(xué)功能進(jìn)行研究的它們的天然形式或其它非天然的、人工產(chǎn)生的變體，可如本發(fā)明所述用于凋亡試驗或用于研究本發(fā)明多肽在誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)或抑制細(xì)胞死亡信號或其它細(xì)胞生理過程中的功能和/或效率的方法中?？梢酝ㄟ^用含有本發(fā)明ee3序列，特別是序列1-4，或其變體的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，然后可以研究凋亡的誘導(dǎo)，從而來研究本發(fā)明ee3家族的蛋白或前文所述的變體在例如凋亡級聯(lián)過程中的參與情況(因此，本發(fā)明也公開了他們在這類研究中的應(yīng)用)。這例如可通過用Annexin(Roche Diagnostics)進(jìn)行染色，通過識別Caspase-3活性形式的抗體(New England Biolabs)或通過識別DNA-組蛋白片段的ELISAs(細(xì)胞死亡ELISA，Roche Diagnostics)。所述的凋亡誘導(dǎo)對細(xì)胞型是任選特異性的，所以本發(fā)明優(yōu)選方案中研究了多個細(xì)胞系和初級細(xì)胞。凋亡誘導(dǎo)對刺激物也是任選特異性的，所以在優(yōu)選方案中，本發(fā)明所述的方法采用了多種應(yīng)激條件作為基礎(chǔ)，例如熱沖擊、缺氧環(huán)境、細(xì)胞因子(如IL-1，IL-6，TNF-α)或H2O2處理。適用于本發(fā)明所述方法的典型細(xì)胞都是一些常規(guī)的細(xì)胞系，例如COS細(xì)胞，HEK細(xì)胞，PC21細(xì)胞，THP-1細(xì)胞或初級細(xì)胞，例如神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞，以及根據(jù)需要使用的其它無限增殖的初級細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的核酸、核酸構(gòu)建體或基因產(chǎn)物用于實施增殖試驗和/或用上述本發(fā)明物質(zhì)進(jìn)行類似方法的應(yīng)用。與前面所述的凋亡試驗相類似，可以通過用含有本發(fā)明ee3多核苷酸，例如ee3_1或ee3_2，或其相應(yīng)變體的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，并且隨后利用軟瓊脂試驗(Housey等人，1988，Adv.Exp.Med.Biol.，234，127-40)，研究例如腫瘤發(fā)生的誘導(dǎo)，來研究ee3序列，特別是ee3_1或ee3_2，及其天然或非天然變體在細(xì)胞生長、細(xì)胞周期或腫瘤生成轉(zhuǎn)化過程中的參與情況。優(yōu)選的細(xì)胞類型是一些常規(guī)的細(xì)胞系，例如COS細(xì)胞，HEK細(xì)胞，PC12細(xì)胞，THP-1細(xì)胞或初級細(xì)胞，例如神經(jīng)元細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，也可根據(jù)需要使用其它無限增殖的初級細(xì)胞。尤其可以利用本發(fā)明所述的方法研究本發(fā)明基因產(chǎn)物在ras-信號傳導(dǎo)通路中的功能，研究本發(fā)明基因產(chǎn)物與ras信號傳導(dǎo)通路中的其它成分的相互作用，特別是在增殖過程中的相互作用。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及權(quán)利要求1-4任一項所述的DNA序列或權(quán)利要求8-10任一項所述的基因產(chǎn)物作為自殺基因/自殺蛋白在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的用途。由于本發(fā)明蛋白具有凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或壞死信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物學(xué)功能，所以有可能通過這種途徑引發(fā)宿主細(xì)胞的細(xì)胞死亡。對此，優(yōu)選應(yīng)用本發(fā)明的DNA序列和/或本發(fā)明的蛋白作為自殺基因與啟動子可操作的連接，該基因的轉(zhuǎn)錄只在需要時被抑制和被激活。優(yōu)選在基因治療過程中，當(dāng)患者細(xì)胞進(jìn)行移植后，在體內(nèi)或體外靶向性的關(guān)閉轉(zhuǎn)染細(xì)胞的導(dǎo)入。
總之，如本發(fā)明所述，在哺乳動物體系中鑒定了一種新的膜結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體家族(GPCRs)，它與現(xiàn)有技術(shù)中已知的受體家族有明顯的區(qū)別。本發(fā)明新的蛋白家族及其DNA序列的鑒定，由于它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的分化調(diào)節(jié)作用，所以能夠闡明和表征許多生理學(xué)和病理生理學(xué)過程。
按照本發(fā)明，通過所述的EPO(直接或間接)誘導(dǎo)的ee3_1蛋白轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)進(jìn)行鑒定，這說明ee3_1的激動劑和拮抗劑可以促進(jìn)或取代EPO的作用，或?qū)共幌Ｍ械淖饔??？赡苓x擇性的影響EPO的特殊活性，例如，神經(jīng)保護(hù)作用(如在神經(jīng)變性疾病中)或腦功能增強(如在癡呆癥中)。
本發(fā)明提供的基因是一種新的小鼠或人的7-跨膜蛋白質(zhì)，主要在腦組織中表達(dá)。它是一種G蛋白偶聯(lián)受體。
通過在EMBL序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源檢索，發(fā)現(xiàn)與A家族的GPCRs有較遠(yuǎn)的相似性，尤其是肽受體方面。
另外，ee3_1通過下述神經(jīng)性疾病模型非限制性或僅限制性地調(diào)節(jié)癲癇(海馬，癲癇發(fā)作5期，發(fā)作后2h)，皮層中風(fēng)(皮層，閉塞2.5h和再灌注2和6h)，大鼠全身性缺血(整個腦組織，缺血后3和6小時)。這顯示了與立即早期基因相比，EPO調(diào)節(jié)的高度特異性。
以下面的附圖詳細(xì)說明本發(fā)明圖1a表示的是Epo小鼠腦組織的轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果。該圖顯示了DNA陣列雜交試驗的實驗數(shù)據(jù)。以EPO轉(zhuǎn)基因動物的信號(Y軸)對野生型小鼠的信號(X軸)作圖，所述信號是(相對)熒光信號。在斜線上方的點代表EPO轉(zhuǎn)基因動物腦組織中上調(diào)的基因產(chǎn)物。在斜線2的上方有8個陽性信號(斜線2表示轉(zhuǎn)基因動物EPO的過表達(dá)量是野生型的2倍)。圖1b表示的是微陣列試驗結(jié)果，此圖是以EPO轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織ee3_1的(相對)誘導(dǎo)因子(右邊)對野生型動物腦ee3_1的誘導(dǎo)因子作圖。野生型動物的誘導(dǎo)因子稱為平均誘導(dǎo)值，是從2個獨立的雜交試驗獲得的。單位誘導(dǎo)因子對應(yīng)于同種對照動物腦中ee3_1的濃度，本發(fā)明序列的表達(dá)量幾乎是對照的4倍。
圖2顯示了對小鼠的試驗結(jié)果。該試驗通過定量PCR(LightCycler)，證明了在EPO轉(zhuǎn)基因動物中本發(fā)明的ee3_1以及α-球蛋白基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)增加，α-球蛋白基因產(chǎn)物在EPO轉(zhuǎn)基因動物中也同樣地得到上調(diào)。數(shù)據(jù)代表來自6個腦組織的總RNA樣品(轉(zhuǎn)基因鼠(tg)或野生型鼠(wt))。Y軸代表相對誘導(dǎo)率。與對照(相對誘導(dǎo)率為1)相比，本發(fā)明序列誘導(dǎo)增加了11倍。
圖3顯示了在小鼠發(fā)育過程中(7，11，15，和17天的胚胎)以及在各種成體組織中(腦，心，肝，腎，肺，骨骼肌，脾和睪丸)，本發(fā)明ee3_1的表達(dá)。Y軸代表ee3轉(zhuǎn)錄的相對豐度。試驗結(jié)果說明，在所研究的鼠胚胎發(fā)育的各個階段以及各個組織中，都比較普遍的存在ee3_1的表達(dá)。
根據(jù)EST數(shù)據(jù)，ee3_2在小鼠胚胎癌，腎，肝，B細(xì)胞，肺，乳腺和子宮中表達(dá)。
圖4顯示了人ee3_1、ee3_2和ee3_c5在成年人體組織(心，腦，胎盤，肺，肝，骨骼肌，腎和胰腺)中的表達(dá)。數(shù)據(jù)來自定量PCR試驗(LightCycler)。Y軸數(shù)值與圖3的意義相同，揭示出在所研究的組織中，也存在ee3家族基因普遍和平行的表達(dá)。ee3家族在腎和胰腺中的高表達(dá)非常明顯，而在腦和骨骼肌中的表達(dá)較弱。ee3_1和ee3_2的表達(dá)基本相同，因此，可以推測這兩種蛋白的豐余功能。
可以從人類的下列器官中發(fā)現(xiàn)含ee3_1序列的ESTs腦，眼，生殖細(xì)胞，心，腎，肺，胎盤，前列腺，胚胎，腎上腺，乳腺，大腸，胃和睪丸。這說明了ee3_1序列在較寬范圍內(nèi)表達(dá)。在腦，結(jié)腸，心，腎，肺，胰腺，甲狀旁腺，前列腺，睪丸，子宮，膀胱，乳腺和皮膚等器官，存在ee3_2的ESTs。
圖5顯示了在各種人腫瘤細(xì)胞系中，本發(fā)明人ee3_1表達(dá)的Northern印跡試驗結(jié)果。在所述Northern印跡雜交試驗中，使用了包含人ee3_1開放閱讀框的小鼠探針。此圖顯示了人ee3_1-RNA轉(zhuǎn)錄子的普遍的表達(dá)。
圖6顯示了ee3_1在(大鼠)腦組織不同區(qū)域的表達(dá)。同樣的，ee3_1在腦組織的不同區(qū)域廣泛分布，在小腦和脊髓處的表達(dá)更強。以小鼠ee3_1作為探針。下方的圖是作為加樣對照的溴化乙啶染色的凝膠圖。
圖7顯示了在結(jié)構(gòu)預(yù)測的基礎(chǔ)上，并特別考慮了跨膜區(qū)(TM區(qū))后得出的ee3_1_m蛋白的拓?fù)淠Ｐ?。所述模型揭示了一個典型的GPCR蛋白拓?fù)錁?gòu)象有7個TM區(qū)(以水平并排的形式表示)，一個短的胞外N末端(在第1個TM區(qū)上面)和一個胞內(nèi)C末端(在第7個TM區(qū)下面)。疏水性氨基酸以綠色顯示。
圖8列出了本發(fā)明蛋白ee3_1(“human pro”)、ee3_2和ee3_5的蛋白片段與現(xiàn)有技術(shù)中已知的各種GPCR蛋白(如，dc32-bio，ccr5_human或dop21_human)的比對(序列比較)以及已知的GPCR蛋白家族A、B和C的共有基序(見圖8的cons fam A，cons fam B)?！癙fam”是指蛋白家族并描述了一族蛋白的共有基序。所列出的共有基序是由pfam數(shù)據(jù)庫中得到的。很顯然，本發(fā)明的ee3蛋白家族與A家族的GPCR蛋白最相似。
與已知的GPCR蛋白相比較，人ee3_1和ee3_2的下述序列部分特別能代表本發(fā)明蛋白家族的特點(氨基酸的序數(shù)號如圖8所示)AA75-85，AA 129-135(特別是129位的甘氨酸和132位的絲氨酸以及174位的甘氨酸)，AA193-200(特別是198位的甘氨酸)，260和261位的氨基酸，308位的氨基酸(半胱氨酸)，334-340位的氨基酸，539位的氨基酸(組氨酸)，608位的氨基酸(組氨酸)，611位的氨基酸(天冬氨酸)以及從637位開始的整個C末端序列(特別是640-655位之間的酸性基序，666-670的堿性基序和680-685的脯氨酸富集區(qū))。
圖9A顯示的是本發(fā)明的小鼠DNA序列(序列1)，稱做ee3_c1(ee3_1)。該序列包含翻譯區(qū)(所列出的所有序列都按照下面的方式讀取從左向右，從上到下連續(xù)讀，即從一行的結(jié)尾讀向緊接著的下一行的左端)。該序列區(qū)中的起始密碼子和終止密碼子用粗體表示。圖9B是本發(fā)明的另一序列，它是圖9A所示序列的子序列(3′非翻譯區(qū))。
圖10顯示的是本發(fā)明的小鼠DNA序列(序列2)，稱做ee3_2，也包含翻譯區(qū)。該序列區(qū)中的起始密碼子和終止密碼子用粗體表示。
圖11A顯示的是本發(fā)明的DNA序列(序列3)，稱做ee3_1，包含翻譯區(qū)，該序列區(qū)中的起始密碼子和終止密碼子用粗體表示。另外，推測的多聚腺苷酸信號用粗體加下劃線的形式表示。圖11B和圖11C是編碼本發(fā)明C末端截短蛋白的C端的另一種剪接體除了在兩個圖中用粗體表示起始密碼子和終止密碼子外，圖11B也包含強調(diào)的剪接位點的共有序列。
圖12顯示的是本發(fā)明的人DNA序列(序列4)，稱做ee3_2，包含翻譯區(qū)，該序列區(qū)中的起始密碼子和終止密碼子(分別是ATG和TAA)用粗體表示。推測的多聚腺苷酸信號也用粗體表示。圖12下方的序列是第1部分序列的延續(xù)(第1和第2部分序列的重疊區(qū)，分別在兩個部分中用斜體表示)。
圖13顯示的是本發(fā)明的鼠氨基酸序列(序列5)，稱做ee3_1。該序列是從N端到C端的連續(xù)序列(參照所基于的圖9的DNA序列)。
圖14顯示的是本發(fā)明的鼠氨基酸序列(序列6)，稱做ee3_2。該序列是從N端到C端的連續(xù)序列(參照所基于的圖10的DNA序列)。
圖15A顯示的是本發(fā)明的人氨基酸序列(序列7)，稱做ee3_1。該序列是從N端到C端的連續(xù)序列(參照所基于的圖11A的DNA序列)。圖15B顯示的是本發(fā)明的人氨基酸序列(序列7b)，稱做ee3_1b_h。該序列是從N端到C端的連續(xù)序列(參照所基于的圖11B的DNA序列)。圖15C顯示的是本發(fā)明的人氨基酸序列(序列7c)，稱做ee3_1c_h。該序列是從N端到C端的連續(xù)序列(參照所基于的圖11C的DNA序列)。圖15B和15C的序列是由圖11A所示DNA序列的另一種剪接體的氨基酸序列。
圖16顯示的是本發(fā)明的人氨基酸序列(序列8)，稱做ee3_2。該序列是從N端到C端的連續(xù)序列(參照所基于的圖12的DNA序列)。
圖17顯示的是本發(fā)明的人cDNA序列(序列10)，稱做ee3_5。該序列包含翻譯區(qū)，該序列區(qū)中的起始密碼子和終止密碼子(分別是ATG和TAA)用粗體表示。
圖18顯示的是本發(fā)明的人氨基酸序列(序列11)，稱做ee3_5。該序列是從N端到C端的連續(xù)序列(參照所基于的圖19的DNA序列)。
圖19顯示的是對小鼠腦組織中ee3_1進(jìn)行定量PCR的試驗結(jié)果。對試驗小鼠腹腔注射了5000U/kg體重劑量的促紅細(xì)胞生成素(EPO)。注射6h或24h后，灌注并進(jìn)行試驗。si-6-1和si-24-1分別代表試驗動物注射生理鹽水6h或24h后；ei-6-1，ei-6-2表示注射EPO后6h；ei-24-1，ei-24-2表示注射EPO后24h。試驗顯示，ee3RNA的表達(dá)量增加，并且是隨時間增加的。由注射EPO的動物得到的數(shù)據(jù)與注射生理鹽水的小鼠的數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異(ANOVA，隨后進(jìn)行Newman-Keuls post hoc檢驗)。
圖20顯示的是對小鼠腦組織水平方向切片的原位雜交圖像。所使用的帶有放射性標(biāo)記的探針是ee3_1.3asAACGAAGGGCCAGTAGCACAGAGAACAGCAGCAGACAGGCATAGATGAGG。該探針使得ee3_1在小腦(ce)、海馬(hc)、齒狀回(dg)、皮層(co)，特別是在內(nèi)嗅皮層(ent)以及嗅球(olf)等處的表達(dá)可以被觀察到。相應(yīng)的有義對照探針ee3_1.3s，CCTCATCTATGCCTGTCTGCTGCTGTTCTCTGTGCTACTGGCCCTTCGTT沒有產(chǎn)生特異信號(未顯示)。
圖21顯示的是抗人ee3_1蛋白C端的多克隆抗血清的制備。a在C端選擇具有強抗原性的多肽表位(CLHHEDNEETEETPVPEP)。b免疫印跡說明在瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中特異性的檢測到ee3_1。每次試驗，用例如表達(dá)ee3_1_h_Nter_myc的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染相同數(shù)量的HEK293細(xì)胞裂解物。該構(gòu)建體能夠產(chǎn)生N末端融合了myc標(biāo)簽的ee3_1蛋白。泳道1用myc特異性抗體(Upstate Biotechnology(購自Biomol Feinchemikalien GmbH)，使用時稀釋到1∶2000)檢測到的N末端融合了myc標(biāo)簽的ee3_1蛋白。泳道2-8用不同稀釋度(1∶500-1∶12000)的ee3_1特異性抗血清AS4163檢測到的ee3_1蛋白。抗血清能夠非常靈敏的、特異性識別ee3_1特異性條帶(約35kDa)。泳道9稀釋成1∶500的相應(yīng)的免疫前血清(PIS)，沒有檢測到任何條帶。
圖22顯示的是AS4163抗血清對各種組織中的ee3_1的免疫組織化學(xué)檢測。A體覺皮層中的V層神經(jīng)元的特異性染色。BA的放大圖。C內(nèi)嗅皮層的神經(jīng)元。Dee3_1在齒狀回和海馬CA3區(qū)的表達(dá)情況。E海馬CA3區(qū)的放大圖。Fee3_1在海馬CA3和CA2表達(dá)的分界線。G小腦，對浦肯野細(xì)胞層和小腦核進(jìn)行了特異性免疫組織化學(xué)染色。H小腦浦肯野細(xì)胞。I嗅球。J大僧帽細(xì)胞(largemitral cell)的染色放大圖。K視網(wǎng)膜，其中的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(ganglialcell)和感覺細(xì)胞(sensory cell)被染色。L圖K的放大圖，視網(wǎng)膜感覺細(xì)胞被染色。Mee3_1在脊髓前角的運動神經(jīng)元中的表達(dá)。Nee3_1在三叉神經(jīng)核運動核中的表達(dá)。O黑質(zhì)和網(wǎng)狀部(parsreticulata)的染色。PO圖黑質(zhì)的放大圖。Qee3_1在肺部的神經(jīng)外表達(dá)。染色的是支氣管堿性細(xì)胞和小動脈，venoles細(xì)胞未被染色。R典型的肺部支氣管、動脈和靜脈。S支氣管的放大圖。在特異性的、沒有更詳細(xì)定義的基底細(xì)胞中表達(dá)。T微動脈管壁(左上)和支氣管管壁(右下)的放大圖。U小動脈的縱向剖面。內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁個別平滑肌細(xì)胞被染色。V小動脈橫截面，對平滑肌細(xì)胞和個別內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。W具有隱窩和絨毛結(jié)構(gòu)的小腸。用抗ee3_1抗體染色基底隱窩部分。絨毛中的個別植物神經(jīng)也被染色。XW圖的放大圖。Y小腸壁的神經(jīng)纖維，它屬于小腸植物性腸肌叢。Z皮下脂肪/結(jié)締組織的外周神經(jīng)的橫截面。AA心肌，其中神經(jīng)纖維被特異性染色。BB骨骼肌。圖中央的免疫組織化學(xué)染色與運動終板非常一致。右下方是肌束膜的外周神經(jīng)纖維。
圖23顯示了野生型小鼠脊髓中ee3_1的免疫組織化學(xué)染色(圖的上部)與EPO過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠(tg6)染色(圖的下部)的比較結(jié)果。同樣的染色條件下，轉(zhuǎn)基因小鼠的染色信號明顯更強。每組試驗再使用兩只小鼠，仍能證明該現(xiàn)象。
圖24顯示了小鼠中ee3_1和map1b的雙免疫熒光。這兩種蛋白是作為y2h系統(tǒng)中的相互作用配偶體被檢測到的。兩種蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布情況表現(xiàn)出驚人的一致性。綠色代表ee3_1染色，紅色是Map1b染色，黃色是兩種信號的電子疊加。本圖顯示了來自脊髓(sc)和小腦(cb)的樣品。
圖25顯示了小鼠map1b基因突變體的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(Meixner等人(2000)，J.Cell Biol.，151，1169-78)。結(jié)果表明，在map1b純合動物中，只能觀察到痕量的ee3_1。A海馬，b皮層，c小腦。
圖26顯示了大鼠海馬的成熟神經(jīng)干細(xì)胞(nsc)中的ee3_1的PCR結(jié)果。在陰性泳道(N)沒有觀察到信號。這些神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)ee3_1。
圖27列出了不同種屬的ee3蛋白的比對結(jié)果，包括非洲爪蟾(X.Laevis)和斑馬魚(D.Rerio)的序列。
以下面的實施例詳細(xì)說明本發(fā)明實施例1ee3_1_m及其同源物的分子克隆和鑒別(a)ee3_1_m的鑒別在麻醉條件下穿心灌注后，取出促紅細(xì)胞生成素過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織并經(jīng)液氮速凍。按照Chomczynski和Sacchi的方法提取RNA(Anal Biochem(1987)，162，156-9)。根據(jù)Incyte的程序步驟，在小鼠cDNA陣列(芯片)上進(jìn)行2只轉(zhuǎn)基因小鼠和2只同種對照小鼠的雜交試驗(參見http//www.incyte.com/reagents/lifearray/lifearrayservice.s html)。這個試驗還包括在兩種不同標(biāo)記的樣品的輔助下進(jìn)行的競爭雜交試驗(分別用Cy5和Cy3標(biāo)記)。雜交試驗產(chǎn)生了大量上調(diào)序列。特別是，在重復(fù)試驗中證實了EST克隆AA185432在Epo轉(zhuǎn)基因小鼠中同樣發(fā)生了上調(diào)。與非轉(zhuǎn)基因同種小鼠相比，相對誘導(dǎo)因子為+3.9±0.1(圖1)。應(yīng)用LightCycler系統(tǒng)的定量PCR也證實了所述上調(diào)(圖2，正向引物5′-GGTGTGGGAGAAATGGCTTA-3′，反向引物5′-ATACCAGCAGAGCCTGGAGA-3′)。
(b)ee3序列的克隆在EST數(shù)據(jù)庫BLANSTN檢索的輔助下，擴展已識別的EST序列。用這種方法鑒定了另一個小鼠同源序列ee3_2_m。使用合適的程序(BLAST，TBLASTN)進(jìn)行同源檢索，有可能在EST和基因組數(shù)據(jù)庫中識別人類的同源序列(ensembl)。
在Shepard的PCR克隆方法(Shepard AR，Rae JL(1997)Magneticbead capture of cDNA from double-stranded plasmid cDNA libraries.Nucleic Acids Res 253183-3185)的輔助下，在鼠和人的序列數(shù)據(jù)庫中檢索(篩選)，對所獲得的序列進(jìn)行了確認(rèn)。前面所引用的出版物和其中引用的現(xiàn)有技術(shù)在本發(fā)明中均完整引用作為本發(fā)明公開的一部分。所述的方法是基于下述步驟將質(zhì)粒文庫的cDNA分子與生物素偶聯(lián)的寡核苷酸序列雜交，隨后以鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)的磁珠抽提所述質(zhì)粒，以診斷PCR檢查抽提結(jié)果，并重復(fù)該步驟兩次。然后重復(fù)轉(zhuǎn)化所獲得的質(zhì)粒選擇直至獲得單克隆。該方法使用了下述引物組合(1)克隆全長基因片段所使用的寡核苷酸For ee3_1-h-ee3_1-5′biotin1-hsAATTCCTCATCTATGCCTGTCTGCT-ee3_1-3′block1-hsGCTGTTCTCTGTGCTGCTGGCCCTTCGTTTGGATGGCATC-ee3_1-5′block1-hsATGAACCTGAGGGGCCTCTTCCAGGACTTCAACCCGAGTA-ee3_1-1s-hsTGCTCCAATATGGCTGTGGA-ee3_1_1as-hsCTCTAGTGACCTGTCATGTC-ee3_1-2s-hGACAGAGCTTAAGTGGACTG-ee3_1-2as-hTACAGTTCCTACTGACTGCC-ee3_1-5′block2-hACGCACTCTCTCCGCCTTCCTCTGCCCCCTCGTTCACCCC-ee3_1-5′biotin2-hGCAGACCAGAACCAGTACTGGAGCT-ee3_1-3′block2-hGGGTCTCCAGGTACGTCCATCTCATGCCTTGTTTGCATCCFor ee3_1-m-ee3_1-5′biotin1-mATTCCTCATCTATGCCTGTCTGCTG-ee3_1-3′block1-mCTGTTCTCTGTGCTACTGGCCCTTCGTTTGGATGGCATCA-ee3_1-5′block1-mTGAACCTGAGGGGCCTCTTTCAGGACTTCAACCCGAGTAA-ee3_1-1s-mGGATGGCATCATTCAATGGAG-ee3_1-1as-mGAACAATGGCATGAAGACCAG-ee3_1-2s-mACTGAGCTGGATGACCATTGT-ee3_1-2as-mTCCTCACTATCTTCATGGTGG-ee3_1-5′biotin2-mTCATCACCCAGAGCCCTGGCAAGTA-ee3_1-5′block2-mCCTAAAATTGCACCTATGTTCCGCAAGAAGGCCAGGGTAG-ee3_1-3′block2-mTGTCCTTCCTCCACCCAAACTAAATATTGAAATGCCAGAC
For ee3_2_h-ee3_c2-1as-hTGAACTGCAGGATGTTGACC-ee3_c2-1s-hTCATCCAATGGAGCTACTGG-ee3_c2-5′block1-hATGAACCCCAGGGGCCTGTTCCAGGACTTCAACCCCAGTA-ee3_c2-5′biotin1-hAGTTTCTCATCTACACCTGCCTGCT-ee3_c2-3′block1-hGCTCTTCTCGGTGCTGCTGCCCCTCCGCCTGGACGGCATCFor ee3_2-m-ee3_c2-3′block1-mACTCTTCTCCGTGCTGCTGCCCCTGCGCCTGGACGGCATC-ee3_c2-5′biotin1-mAGTTCCTCATTTATGCCTGCTTGCT-ee3_c2-1as-mTGGATAATCCTGTCCAGCCT-ee3_c2-1s-mATCATCCAGTGGAGCTACTG-ee3_c2-5′block1-mATGAACCCCAGGGGCCTGTTCCAGGACTTCAACCCCAGTA-ee3_c2-m-2sTGTGGAAGCTCCTGGTCATCGT-ee3_c2-m-2asGATAATCCTGTCCAGCCTCAGG-ee3_c2-5′block2-mGAAGCTCCTGGTCATCGTGGGCGCCTCGGTGGGTGCGGGC-ee3_c2-5′biotin2-mGTGTGGGCCCGCAACCCACGCTACC-ee3_c2-3′block2-mGTACAGAGGGGGAAGCCTGCGTGGAATTCAAAGCCATGCT-ee3_c2-5′biotin3-mACAGAGCCCTGGGAAATATGTGCCT-ee3_c2-3′block3-mCCACCTCCCAAGTTAAACATTGATATGCCAGACTAAACTC-ee3_c2-5′block3-mTTGCTCCAATGTTTGGAAAGAAGGCGCGGGTAGTTATAACFor ee3_c3-h-ee3_c3-5′block1-hCCACCTTGGGCACCTTGGTGTCTTTCAAAAGTGCCAGGCT-ee3_c3-5′biotin1-hCCTTCCTGCCTCAGGGCCTTTGCAC-ee3_c3-3′block1-hTTGCTGCTCCCTCCGTTTGAAATACTGTATCCCAGAGAGT-ee3_c3-1s-hGGCACCTTGGTGTCTTTCAA-ee3_c3-1as-hCAGTCTGAATTAGGAGCCAGFor ee3_c5-h-ee3_c5-1as-hTCGGAGCTTCTGGAACCAAT-ee3_c5-1s-hCCATCAGCTGGATAACGACT-ee3_c5-5′block1-hACCATGGCCATCAGCTGGATAACGACTGTCATCGTGCCCC-ee3_c5-5′biotin1-hTGCTCACCTTTGAAGTCCTGCTGGT-ee3_c5-3′block1-hTCACAGACTGGATGGCCGCAATACATTCTCCTGTATCTCCFor ee3_c8-h-ee3_c8-5′block1-hAATTTTGGTATATGGTGCAAAAAAAGGGGTCCAATTTCTT-ee3_c8-5′biotin1-hCTGCAACTGGCCAGCCAGTTATCTC-ee3_c8-3′block1-hAGCATCATTAATTGAATAGGGAATCCTTACCCCACTGATT-ee3_c8-1s-hAACTGGCCAGCCAGTTATCT-ee3_c8-1as-hAATGGATTGTTGGGTGCAGC-ee3_c8-2s-hCCAGCCAGTTATCTCAGCATCA-ee3_c8-2as-hACCATGGCATGTGTATCCCAGA(2)另外，將ee3序列的編碼區(qū)克隆到GATEWAY(tm)相容性載體以進(jìn)行功能分析。使用了下述寡核苷酸
For ee3_1-h-ee3_1_h_B1GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGCTACCATGAACCTGAGGGGCCTCTTCCA-ee3_1_h_B2GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTCCTAATCTGGCATTTCGATATTTAATTTGGGAGGT-ee3_1-h-C-fus-B2GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTCGCATTTCGATATTTAATTTGGGAGGTGGGAGFor ee3_2-h-ee3_c2-h-B1GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TCTACCATGAACCCCAGGGGCCTGTTCC-ee3_c2-h-B2GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTCTTAATCTGGCATATCAATATTTAACTTGGGAGGG-ee3_c2-h-c-fus-B2GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTCATCTGGCATATCAATATTTAACTTGGGAGGGFor ee3_c2-m-ee3_c2-m-B1GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGCTCTACCATGAACCCCAGGGGCCTGTTCC-ee3_c2-m-B2GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTCTTAGTCTGGCATATCAATGTTTAACTTGGGAG(c)人cDNA文庫的構(gòu)建取2μg人胎兒腦組織mRNA(Clontech，Heidelberg，Germany)和5μg成年小鼠的腦mRNA，用Stratagene(Amsterdam，Netherlands)的cDNA合成試劑盒制備相應(yīng)的cDNA文庫。基本上按照試劑盒的說明進(jìn)行各個步驟的操作。首先使用試劑盒說明書所述的oligodT引物合成第一鏈cDNA，然后按照試劑盒(Stratagene)的指導(dǎo)，根據(jù)大小選擇克隆相容性的(EcoRI/XhoI)雙鏈cDNA片段，并將該片段連接到pBluescript SKII質(zhì)粒載體中(Stratagene)。用電穿孔的方法將該連接體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中(DH10B，Gibco)，在LB-氨芐瓊脂培養(yǎng)板上擴增培養(yǎng)。用堿性裂解液和離子交換色譜分離質(zhì)粒DNA(Qiagen公司的QIAfilter試劑盒，Hilden，Germany)。
人胎兒腦cDNA文庫的獨立克隆的復(fù)雜度是4百萬。隨機分析了每個cDNA文庫的24個克隆中插入片段的大小，顯示插入片段長度從800bp到4.5kB，人類文庫中插入的cDNA片段的平均長度約為1.2kB。
實施例2促紅細(xì)胞生成素(EPO)對ee3_1的調(diào)節(jié)作用ee3_1被確定為是EPO轉(zhuǎn)基因小鼠腦上調(diào)基因的產(chǎn)物(tg6和tg21小鼠系)。
本發(fā)明表達(dá)所使用的小鼠，其特征已被多次描述過(Ruschitzka等人，2000，Proc Natl Acad Sci USA，97，11609-13.；Wagner等人，2001，Blood，97，536-42.；Wiessner等人，2001，J Cereb Blood Flow Metab，21，857-64)。按照Hergersberg描述的方法用轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體處理小鼠(Hergersberg等人，Hum.Mol.Genet.4，359-366)。該構(gòu)建體含有PDGF啟動子和促紅細(xì)胞生成素的編碼序列。獲得了很多轉(zhuǎn)基因鼠系，本發(fā)明只研究tg6和tg21鼠系。根據(jù)Ruschitzka等人的方法(2000，ProcNatl Acad Sci USA，97，11609-13)，通過血清學(xué)研究證實只有tg6小鼠的EPO全身性表達(dá)增加了。tg21小鼠的全身EPO水平?jīng)]有提高。與Sasahara等人(1991，Cell，64，217-27)的試驗結(jié)果相似，所使用的PDGF啟動子片段可能會引起轉(zhuǎn)基因EPO的表達(dá)，特別是在神經(jīng)元細(xì)胞中。
在tg6鼠系小鼠中，EPO的全身性表達(dá)增加導(dǎo)致紅血球生成的顯著提高，使紅細(xì)胞增多至血細(xì)胞比容達(dá)到0.8，并且血容積顯著增加至4.0ml(Wanger等人，2001，Blood，97，536-42)。與之對照，tg21鼠系在表型方面并不非常顯著。
RNA產(chǎn)物，例如ee3_1基因的RNA產(chǎn)物，在促紅細(xì)胞生成素過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達(dá)增加(tg6和tg21鼠系(Ruschitzka等人，2000，Proc Natl Acad Sci USA，97，11609-13.；Wagner等人，2001，Blood，97，536-42.；Wiessner等人，2001，J Cereb Blood Flow Metab，21，857-64))，并通過DNA陣列試驗證實。通過發(fā)現(xiàn)另一種調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物，即α-球蛋白證明過量表達(dá)的EPO對EE3_1轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)在生理學(xué)和病理生理學(xué)方面的重要性。使用微陣列通過轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)α-球蛋白在兩個轉(zhuǎn)基因鼠系中都被調(diào)節(jié)。利用LightCycler系統(tǒng)也證明了這一點(圖2)。所述的增加是可見的，特別是在海馬區(qū)(原位雜交)。
實施例3本發(fā)明的序列在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)以及穩(wěn)定細(xì)胞系的建立將ee3家族基因的開放閱讀框克隆到普通的真核表達(dá)載體中，如Clontech公司的pcDNA系列(Heidelberg，Germany)。特別是通過磷酸鈣法以所獲得的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞和CHO-dhfr-細(xì)胞，或用DEAE-葡聚糖珠轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，隨后用400-500mg/ml G418進(jìn)行選擇。選擇后3周，挑選單個克隆擴大培養(yǎng)用于其它分析。用Northern印跡和Western印跡方法分析了大約30個克隆。將ee3家族基因的開放閱讀框克隆到真核表達(dá)載體中，該表達(dá)載體含有二氫葉酸還原酶基因作為選擇性標(biāo)記，用所獲得的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以在無核苷酸的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)染的CHO-dhfr-細(xì)胞。用此方式轉(zhuǎn)染的CHO-dhfr-細(xì)胞以及用相同方法轉(zhuǎn)染的其它細(xì)胞，用加大濃度的氨甲蝶呤處理，選擇出二氫葉酸還原酶的表達(dá)量增加，從而受體的表達(dá)也增加的細(xì)胞。
實施例4使用ee3_1C端片段的酵母雙-雜交試驗為了鑒別酵母雙-雜交系統(tǒng)中可能的相互作用配偶體，將本發(fā)明ee3_1的C端部分克隆到誘餌載體pGBKT7(Clontech)中。
所用的蛋白的序列為KGGNHWWFGIRKDFCQFLLEIFPFLREYGNISYDLHHEDNEETEETPVPEPPKIAPMFRKKARVVITQSPGKYVLPPPKLNIEMPD，相應(yīng)的核苷酸序列是AAGGGAGGAAACCACTGGTGGTTTGGTATCCGCAAAGATTTCTGTCAGTTTCTGCTTGAAATCTTCCCATTTCTACGAGAATATGGAAACATTTCCTATGATCTCCATCACGAAGATAATGAAGAAACCGAAGAGACCCCAGTTCCGGAGCCCCCTAAAATCGCACCCATGTTTCGAAAGAAGGCCAGGGTGGTCATTACCCAGAGCCCTGGGAAGTATGTGCTCCCACCTCCCAAATTAAATATCGAAATGCCAGAT根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法(配對法，Clontech)，使用人腦文庫篩選相互作用配偶體。結(jié)果獲得了含有重疊序列的2個克隆(克隆11和36)。
克隆11的序列如下GGGGACTCGGCCCTGAACGAGCAGGAGAAGGAGTTGCAGCGGCGGCTGAAGCGTCTNTACCCGGCCGTGGACNAACAAGAGACGCCGTTGCCTCGGTCCTGGAGCCCGAAGGACAAGTTCAGCNTACATCGGCCTNTNTNAGAACAACCTGCGGGTGCACTACAAAGGTCATGGCAAAACCCCAAAAGATGCCGCGTCAGTTCGAGCCACGCATCCAATACCAGCAGCCTGTGGGATTTATTATTTTGAAGTAAAAATTGTCAGTAAGGGAAGAGATGGTTNCATGGGAATTGGTCTTTCTGCTCAAGGNGTGAACATGAATAGACTACCAGGTTGGGATAAGCATTCATATGGTTACCATGGGGATGATGGACATTCGTTTTGTTCTTCTGGAACTGGACAACCTTATGGACCAACTTTCACTACTGGTGATGTCATTGGCTGTTGTGTTAATCTTATCAACAATACCTGCTTTTACACCAAGAATGGACATAGTTTAGGTATTGCTTTCACTGACCTACCGCCAAATTTGTATCCTACTGTGGGGCTTCAAACACCAGGAGAAGTGGTCGATGCCAATTTTGGGCAACATCCTTTCGTGTTTGATATAGAAGACTATNTGCGGGAGTGGAGAACCAAAATCCAGGCNCAGATAGATCGATT.
相互作用基因產(chǎn)物被鑒定為RANBPM或RANBP9(Nishitani H，Hirose E，Uchimura Y，Nakamura M，Umeda M，Nishii K，Mori N，Nishimoto T(2001)Full-sized RanBPM cDNA encodes a proteinpossessing a long stretch of proline and glutamine within the N-terminal region，comprising a large protein complex. Gene 27225-3)。同樣，確定了另兩個相互作用蛋白Map1a和Map1b。有趣的是，兩個蛋白的C端部分就是相互作用部分，含有同源區(qū)。Map1a和Map1b同源區(qū)如下所示，上邊的序列是Map1a，下邊的序列是Map1bALIGN calculates a global alignment of two sequencesversion 2.0uPlease citeMyers and Miller，CABIOS (1989)411-17Sequence 1212 aa vs.
Sequence 2177 aascoring matrixBLOSUM50， gap penalties-12/-243.6％identity Global alignment score 6141020304050/tmp/f KEKVQGRVGRRAPGKAKPASPARRLDLRGKRSPTPGKGPADRASRAPPRP--RSTTSQVT: ...:..: ... ..
Sequen -----------------------------------KKESVEKAAKPTTTPEVKAARGEEK102060708090 100 110
/tmp/f PAEEKDGHSPMSKGLVNGLKAGPMALSSKGSS----GAPVYVDLAYIPNXCSGKTADLDF: :.. . .. .. ::: . .. ::: :::.:: :::: ..:..:..:
Sequen DKETKNAANASASKSAKTATAGPGTTKTTKSSAVPPGLPVYLDLCYIPNHSNSKNVDVEF304050607080120 130 140 150 160 170/tmp/f FRRVRASYYVVSGNDPANGXPSRAVLDALLEGKAQWGENLQVTLIPTHDTEVTREWYQQT:.:::.::::::::::: ::::::::::::::::: :.:::::::::.:: :::::.:
Sequen FKRVRSSYYVVSGNDPAAEEPSRAVLDALLEGKAQWGSNMQVTLIPTHDSEVMREWYQET90 100 110 120 130 140180 190 200 210/tmp/f HEQQQQLNVLVLASTXTVVMQDESFPACRLSSEKPPSL::.::.::..::::. ::::::::::::..
Sequen HEKQQDLNIMVLASSSTVVMQDESFPACKIEL------150 160 170實施例5人ee3_1/ee3_2的同源序列(a)在染色體5q33.1上使用TbIastn從毗鄰序列AC11406.00015中鑒別出另一個同源序列>ACO11406.00015Length40,820Minus Strand HSPsScore＝389(136.9bits)，Expect＝1.3e-41，Sum P(3)＝1.3e-41Identities＝72/303(71％)，Positives＝78/303(77％)，F(xiàn)rame＝-1Query224 LLTFEILLVHKLDGHNAFSCIPIFVPLWLSLITLMATTFGQKGGNHWWFGIRKDFCQFLL 283LLTFE+LLVH+LDG N FSCI I VPLWL L+TLM TTF K GNHWWFGIR+DFCQFLLSbjct14312 LLTFEVLLVHRLDGRNTFSCISISVPLWLLLLTLMTTTFRPKRGNHWWFGIRRDFCQFLL 14253Query284 EIFPFLREYGNISYDLHHEDNXXXXXXXXXXXXKIAPMFRK 324EIFPFLREYGNISYDLH ED+KIAP+F Ksbjct14252 EIFPFLREYGNIsYDLHQEDsEGAEETLVPEAPKIAPVFGK 14010Score＝86(30.3bits)，Expect＝1.3e-41，Sum P(3)＝1.3e-41Identities＝15/51(88％)，Positives＝16/51(94％)，F(xiàn)rame＝-3Query334 PGKYVLPPPKLNIEMPD 350PGKYV PPPKLNI+MPDSbjct13992 PGKYVPPPPKLNIDMPD l3942Score＝67(23.6bits)，Expect＝1.3e-41，Sum P(3)＝1.3e-41Identities＝12/57(63％)，Positives＝17/57(89％)，F(xiàn)rame＝-2Query206 QRRTHITMALSWMT-IVVP 223Q RTH+TMA+SW+T ++VPSbjct14368 Q*RTHVTMAISWITTVIVP 14312可以獲得相應(yīng)的cDNA，但是翻譯該cDNA只能獲得ee3同源蛋白的C端片段。
與ee3_1_m序列的比較如下所示ALIGN calculates a global alignment of two sequencesversion 2.0uPlease citeMyers and Miller，CABIOS(1989)411-17Seouence 1350 aa vs.
Sequence 2148 aascoring matrixBLOSUM50，gap penalties-12/-229.4％ identity； Global alignment score649102030405060/tmp/f MNLRGLFQDFNPSKFLIYACLLLFSVLLALRLDGIIQWSYWAVFAPIWLWKLMVIVGASVSequen ------------------------------------------------------------708090 100 110 120/tmp/f GTGVWARNPQYRAEGETCVEFKAMLIAVGIHLLLLMFEVLVCDRIERGSHFWLLVFMPLFSequen ------------------------------------------------------------130 140 150 160 170 180/tmp/f FVSPVSVAACVWGFRHDRSLELEILCSVNILQFIFIALRLDKIIHWPWLVVCVPLWILMSSequen ------------------------------------------------------------190 200 210 220 230 240/tmp/f FLCLVVLYYIVWSVLFLRSMDVIAEQRRTHITMALSWMTIVVPLLTFEILLVHKLDGHNA.:. .. .. : ::. :::::.::::.:::.:.
Sequen ----------------MRTTRAV-KNTRDH-GHQLD-NDCHRALLTFEVLLVHRLDGRNT10 203040250260 270 280 290 300/tmp/f FSCIPIFVPLWLSLITLMATTFGQKGGNHWWFGIRKDFCQFLLEIFPFLREYGNISYDLH:::: : ::::: :.:::.::: : :::::::::.::::::::::::::::::::::::
Sequen FSCISISVPLWLLLLTLMTTTFRPKRGNHWWFGIRRDFCQFLLEIFPFLREYGNISYDLH5060708090 100310 320 330 340 350/tmp/f HEDSEETEETPVPEPPKIAPMFRKKARVVITQSPGKYVLPPPKLNIEMPD.:::: .::: ::: :::::.: :.:::. ::::: :::::::.:::
Sequen QEDSEGAEETLVPEAPKIAPVF-GKTRVVLI--PGKYVPPPPKLNIDMPD110 120130 140因為所獲得的cDNA序列與基因組數(shù)據(jù)完全一致，并且在ATG的上游存在一個包含在閱讀框中的終止子，所以自然可以產(chǎn)生唯一的GPCR片段(參見序列)。
Minus Strand HSPsScore＝6976(1046.7bits)，Expect＝0.0，Sum P(2)＝0.0Identities＝1396/1397(100％)，Positives＝1396/1397(100％)，Strand＝Minus/PlusQuery2499 AGGTTTAGACCTTAAAATAATACCTGATTGTTGGCCACTTCTGGTTAAGGCCACTCTCTC 2440| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct13048 AAGTTTAGACCTTAAAATAATACCTGATTGTTGGCCACTTCTGGTTAAGGCCACTCTCTC 13107
Query2439 CAGCTTTCCAGTGACAGGTAATGCTTTACATTACAACCAACTAATATTCTAAGATTCTTA 2380||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct13108 CAGCTTTCCAGTGACAGGTAATGCTTTACATTACAACCAACTAATATTCTAAGATTCTTA 13167Query2379 GAAATGGACAAACCACTTGTTGCTTATTTTGATTGTTTCTGGACAGTTACTACCTGTGTG 2320||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct13168 GAAATGGACAAACCACTTGTTGCTTATTTTGATTGTTTCTGGACAGTTACTACCTGTGTG 13227Query2319 GAAAAATTCAGGGTGCTAAACAACAGTGTCACTTTATGGCCTGGTACTACACTAGAGCAT 2260||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct13228 GAAAAATTCAGGGTGCTAAACAACAGTGTCACTTTATGGCCTGGTACTACACTAGAGCAT 13287Query2259 GTCACAAGTTCGCAAGGGCGGTGGCTGCTCCCTCTACTAACGGATACTACCAGAGACCTT 2200||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct13288 GTCACAAGTTCGCAAGGGCGGTGGCTGCTCCCTCTACTAACGGATACTACCAGAGACCTT 13347Query2199 CACACAGTGCAGACCTCGGTTACTAACACCTAAATATTAACACCCATGGGATTTGCAGTC 2140||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct13348 CACACAGTGCAGACCTCGGTTACTAACACCTAAATATTAACACCCATGGGATTTGCAGTC 13407Query2139 CCTATGTTCATGTCTAGTACTTGGGTAAGCTCCACACCAGGCACATATTGTTTTATGCAA 2080||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct13408 CCTATGTTCATGTCTAGTACTTGGGTAAGCTCCACACCAGGCACATATTGTTTTATGCAA 13467Query2079 TCTTTAAAGACATCTGCAATAGACAATATGCAGTTTAAACAAACTGTGAGGTTTATAAAC 2020||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct13468 TCTTTAAAGACATCTGCAATAGACAATATGCAGTTTAAACAAACTGTGAGGTTTATAAAC 13527Query2019 AGAGAATTCTTTACGTTTGCTATTATGTCATAACAGGCACAATCTGAAATACAATTTTGT 1960||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct13528 AGAGAATTCTTTACGTTTGCTATTATGTCATAACAGGCACAATCTGAAATACAATTTTGT 13587Query1959 ACTAGCAGTGTATAAAAATACTTTTAAACGATACTTTCGATAGGTACAGTAGCACTTTAA 1900||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct13588 ACTAGCAGTGTATAAAAATACTTTTAAACGATACTTTCGATAGGTACAGTAGCACTTTAA 13647Query1899 AGAAAACCACTGTGTAGTTATTCCTTTTGAGGACCTACTAAAACAGTTCAACTTACTGCC 1840||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct13648 AGAAAACCACTGTGTAGTTATTCCTTTTGAGGACCTACTAJAACAGTTCAACTTACTGCC 13707Query1839 CCCAGCTACATCTAAAGCACGAATGTGGAAAGCAAGTTCTCTTACCCAGGTACACACCAC 1780||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct13708 CCCAGCTACATCTAAAGCACGAATGTGGAAAGCAAGTTCTCTTACCCAGGTACACACCAC 13767Query1779 ACACACCCACATGCTGAAACAGTCTCCATTTATGATGCATGCTGATGAGGCATCAATCTC 1720||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct13768 ACACACCCACATGCTGAAACAGTCTCCATTTATGATGCATGCTGATGAGGCATCAATCTC 13827Query1719 AAACAGGGTATGAGATGACAGTGTTTGGTGCCTGTTTCCATTTCCAGGTTTGGTATGAAT 1660||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct13828 AAACAGGGTATGAGATGACAGTGTTTGGTGCCTGTTTCCATTTCCAGGTTTGGTATGAAT 13887Query1659 GAACAAGAGGCAAAGGCAAGGTGGAGTCTGTGTATGGGCCCTCTCTAGGAGTTTAATCTG 1600||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct13888 GAACAAGAGGCAAAGGCAAGGTGGAGTCTGTGTATGGGCCCTCTCTAGGAGTTTAATCTG 13947Query1599 GCATATCAATATTTAACTTGGGAGGTGGGGGAACATATTTCCCAGGGATTAAAACTACCT 1540||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct13948 GCATATCAATATTTAACTTGGGAGGTGGGGGAACATATTTCCCAGGGATTAAAACTACCT 14007Query1539 GGTCTTCCCAAACACTGGAGCAATTTTCGGAGCTTCTGGAACCAATGTTTCTTCAGCACC 1480||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct14008 GGTCTTCCCAAACACTGGAGCAATTTTCGGAGCTTCTGGAACCAATGTTTCTTCAGCACC 14067Query1479 TTCGCTATCTTCCTGATGGAGATCATATGAAATGTTCCCATATTCTCTTAAAAATGGGAA 1420||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||sbjct14068 TTCGCTATCTTCCTGATGGAGATCATATGAAATGTTCCCATATTCTCTTAAAAATGGGAA 14127
Query1419 AATTTCAAGCAGAAACTGGCAGAAGTCTCTGCGAATACC2AACCACCAATGATTGCCCCT 1360||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct14128 AATTTCAAGCAGAAACTGGCAGAAGTCTCTGCGAATACCAAACCACCAATGATTGCCCCT 14187Query1359 TTTTGGCCTAAATGTTGTGGTCATTAAAGTTAGTAACAAAAGCCAAAGGGGGACAGATAT 1300||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct14188 TTTTGGCCTAAATGTTGTGGTCATTAAAGTTAGTAACAAAAGCCAAAGGGGGACAGATAT 14247Query1299 GGAGATACAGGAGAATGTATTGCGGCCATCCAGTCTGTGAACCAGCAGGACTTCAAAGGT 1240||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct14248 GGAGATACAGGAGAATGTATTGCGGCCATCCAGTCTGTGAACCAGCAGGACTTCAAAGGT l4307Query1239 GAGCAGGGCACGATGACAGTCGTTATCCAGCTGATGGCCATGGTCACGTGTGTTCTTCAC 1180||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct14308 GAGCAGGGCACGATGACAGTCGTTATCCAGCTGATGGCCATGGTCACGTGTGTTCTTCAC 14367Query1179 TGCCCTGGTAGTTCTCATTTGTTCTTTTTCTAGTTTCTTAAGGTAGAAGCTGATGTCATT 1120||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct14368 TGCCCTGGTAGTTCTCATTTGTTCTTTTTCTAGTTTCTTAAGGTAGAAGCTGATGTCATT 14427Query1119 GATTCAAAACCTTTCTT l103|||||||||||||||||Sbjct14428 GATTCAAAACCTTTCTT 14444(b)在染色體8q11.22上從Ensembl毗鄰序列Ac034174中鑒別出另一個同源序列。
同源核苷酸片段所對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列如下AATTTTGGTATATGGTGCAAAAAAAGGGGTCCAATTTCTTCTGCAACTGGCCAGCCAGTTATCTCAGCATCATTAATTGAATAGGGAATCCTTACCCCACTGATTGTTTTTGTCAGGTTTGTCAAAGATGAAATAGTTGTAGGTGTATGGTCTTATTTCTGGGTTCCCCATTCTGTTCCACTGGTATATGTGTCTGGTTTTGAACTAGTGCCATGCTGTTTTGGTTACTATAGCCCTGTTTAAAATCAAATGGAGTGATGCCGCCACGTTGTATTTATTTTATTTTTTTATTATACTTTAAGTTCTGGGATACACATGCCATGGTGGTTTGCTGCACCCAACAATCCATTATCTATGTTGTTTTCTC(c)在染色體3p25.3上在3號染色體上發(fā)現(xiàn)了一個同源序列CCACCTTGGGCACCTTGGTGTCTTTCAAAAGTGCCAGGCTCCTTCCTGCCTCAGGGCCTTTGCACTTGCTGCTCCCTCCGTTTGAAATACTGTATCCCAGAGAGTCCCATTTCTGGCTCCTAATTCAGACTGA(d)在染色體XP21.1上>ACO27722.00010Length3,576Minus Strand HSPsScore＝65(22.9bits)，Expect＝4.1e+02，Sum P(2)＝1.0Identities＝11/90(37％)，Positives＝19/90(63％)，F(xiàn)rame＝-1Query159 RLDKIIHWPWLVVCVPLWI-LMSFLCLVVL 187R+ ++W L C+P+W+ +SF CL+ LSbjct1848 RIMSSLNWDSLTSCLPIWMTFISFSCLIAL 1759Score＝57(20.1bits)，Expect＝4.1e+02，SumP(2)＝1.0Identities＝16/147(33％)，Positives＝24/147(49％)，F(xiàn)rame＝-2
Query88 VGIHLLLLMFEVLVCDRIERG-SH-FWLLVFMPLFFVSPVSVAACVWGF 134+G L++ F V D++ G H FW L +PLF VS C + +Sbjct2507 IGCCFLIVCFVCFVEDQMYVGLQHYFWALYSVPLFCVSVFVPVPCSFSY 2361對應(yīng)于這些同源片段的核苷酸序列如下所示ATCATGTCATCTCTAAACTGGGATAGTTTGACTTCCTGTCTTCCTATTTGGATGACTTTTATTTCTTTCTCTTGCCTGATTGCTCTGG和ATAGGGTGTTGTTTCCTCATTGTTTGTTTTGTCTGCTTTGTGGAAGATCAGATGTATGTAGGTTTGCAGCATTATTTCTGGGCTCTCTATTCTGTTCCTTTGTTCTGTGTGTCTGTGTTTCTACCAGTACCATGTTCTTTTAGTTACT然而，缺失了共有序列DRI。
(e)選擇性剪接產(chǎn)物ee3_1b_h和ee3-1c_h人基因產(chǎn)物ee_1_h的選擇性剪接產(chǎn)物命名為ee3_1b_h(見圖11B，序列號3B)。這個剪接產(chǎn)物是由外顯子3的共有剪接供體位點形成的，并且產(chǎn)生了含有修飾的C末端和翻譯提前終止的修飾的開放閱讀框。該剪接產(chǎn)物所編碼的蛋白(166個氨基酸，分子量19.2kD)在第4個TM域后終止(見圖15B，序列號7B)。另外，還發(fā)現(xiàn)了一個選擇性剪接產(chǎn)物，命名為ee3_1c_h(見圖11C，序列號3C)，它所編碼的蛋白質(zhì)的序列如圖15C所示(序列號7C)，該蛋白在第2個TM域之后的部分被截去。根據(jù)Shepard等人的克隆方法(參見實施例1)在克隆和測序的過程中鑒別出所述的剪接產(chǎn)物。
預(yù)測ee3_1b_h的TM區(qū)如下所示----->STRONGLY preferred modelN-terminus outside4 strong transmembrane helices，total score6315# from to length score orientation11533(19)2066 o-i(ooutside，iinside)24056(17)1143 i-o383102(20) 1765 o-i4112 134(23) 1341 i-o.
這種剪接產(chǎn)物對于調(diào)節(jié)全長受體，例如V2加壓素受體的功能非常重要(Zhu和Wess，1998，Biochemistry，37，15773-84；Schulz等人，2000，J Biol Chem，275，2381-9)。由于GPCR蛋白容易發(fā)生同源二聚反應(yīng)或異源二聚反應(yīng)(Bouvier，2001，Nat Rev Neurosci，2，274-86.)，所以本發(fā)明序列的這種截短形式起顯性的負(fù)調(diào)節(jié)作用。
本發(fā)明專門描述了本發(fā)明ee3蛋白的這種剪接體形式的用途(例如，作為本發(fā)明表達(dá)載體中的裸DNA，或作為本發(fā)明的蛋白序列等)，還描述了該剪接體的變體在制備治療疾病的藥物中的用途(如前述)。本發(fā)明還包括剪接體用于研究本發(fā)明ee3家族受體的藥理學(xué)作用的用途。
實施例6ee3家族蛋白質(zhì)的拓?fù)鋵W(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)用TMPred程序篩選TM區(qū)(跨膜區(qū))，結(jié)果得到如下特別有用的模型(a)ee3_1----->STRONGLY prcierred modelN-teminus outside7 strong transmembrane helices，total score11863# from to length score orientation1 15 33(19) 2066 o-iFLIYACLLLFSVLLALRLD2 40 56(17) 1143 i-oYWAVFAPIWLWKLMVIV3 83 102(20) 1765 o-iAMLIAVGIHLLLLMFEVLVC4 112 134(23) 1341 i-oWLLVFMPLFFVSPVSVAACVWGF5 168 191(24) 2978 o-iWLVVCVPLWILMSFLCLVVLYYIV6 211 227(17) 1070 i-oITMALSWMTIVVPLLTF7 240 258(19) 1500 o-iAFSCIPIFVPLWLSLITLMTM域之間的片段的間隔為15，7，27，10，34，20，13個氨基酸，胞內(nèi)殘基長度為92個氨基酸。
(b)對于ee3_2得到同樣的拓?fù)鋱D譜----->STRONGLY preferred modelN-terminus outside7 stronq transmembrane helices，total score12351# from to length score orientation1 15 36(22)1811 o-i2 32 50(19)1219 i-o3 83 102(20) 1733 o-i4 112 134(23) 1330 i-o5 168 191(24) 3068 o-i6 211 227(17) 1239 i-o7 243 260(18) 1951 o-iTM域之間的片段的間隔為15，0，33，10，34，20，16個氨基酸，所述殘基長度為90個氨基酸。
(c)作為對比的對照實驗是現(xiàn)有技術(shù)已知的CCR-5受體(同樣屬于7TM受體家族)的拓?fù)鋵W(xué)數(shù)據(jù)15176(26)2895 o-i289108(20) 1155 i-o3124 145(22) 1163 o-i4163 187(25) 1415 i-o5220 239(20) 2183 o-i6260 281(22) 1782 i-o7298 325(28) 1325 o-iTM域之間的片段的間隔為51，13，16，18，33，21，17個氨基酸，胞外殘基長度為46個氨基酸。
本發(fā)明的ee3_1與緩激肽-2，CXCR5，Galanine受體-2和過敏毒素C5a等不太相關(guān)的7TM受體在普通拓?fù)鋵W(xué)方面進(jìn)行比較(列出了每個蛋白非跨膜區(qū)的氨基酸殘基數(shù)，如N末端、C末端以及環(huán)基序的殘基數(shù))，結(jié)果如下receptorN terminus 1 2 3 4 5 6restC5a39 12142228162045BK-2 63 13142027262456galanin2 28 10171924251 105cxcr-5 55 11142130182346mw 43.3 11.7 15.0 20.3 26.3 22.3 15.0 63.0ee3_1 15 7 271034201392這些蛋白質(zhì)的普通拓?fù)鋵W(xué)非常相近。
實施例7ee3_1的信號序列與基序的確定應(yīng)用Prosite程序Matching pattern PS00001 ASN_GLYCOSYLATIONAS 294NISYTotal matches1Matching pattern PS00006 CK2_PHOSPHO_SITEAS 77TCVETotal matches1Matching pattern PS00008 MYRISTYLAS 57 GASVGTAS 263GQKGGNTotal matches2
77位是CK2磷酸化作用位點，294位是天冬酰胺糖基化位點，57位和263位是兩個肉豆蔻基化位點(參見圖7中的連續(xù)數(shù)字)。C末端沒有發(fā)現(xiàn)典型的磷酸化位點。
實施例8單次施用促紅細(xì)胞生成素對ee3的誘導(dǎo)作用如圖19所示，對大鼠單次腹腔注射促紅細(xì)胞生成素(Janssen產(chǎn)Erypo；5000U/kg體重)能夠在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)ee3_1。注射促紅細(xì)胞生成素后6h和24h，注射Rompun/Ketanest麻醉大鼠并處死，取腦組織。對照組注射生理鹽水。通過在LightCycler(Roche，Mannheim，Germany)上，用半定量RT-PCR技術(shù)測定大鼠ee3_1的信使RNA。通過將樣品的相對熒光值與親環(huán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線比較而進(jìn)行定量。
根據(jù)Chomczynski/Sacchi的方法(酸性酚抽提)，從大鼠前腦(不包括小腦和嗅球)分離總RNA，然后按照產(chǎn)品說明書的指導(dǎo)，用RNeasy抽提試劑盒純化總RNA(Qiagen，Santa Clarita，CA，USA)。用分光光度計測定RNA的濃度，通過瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA的質(zhì)量。RNA使用前保存于-80℃。
使用Superscript II進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(Invitrogen-Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)，采用LightCycler技術(shù)通過實時在線PCR分別對逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物相對定量。為了實現(xiàn)定量的目的，使用了3只野生型小鼠和3只轉(zhuǎn)基因tg6小鼠的腦總RNA樣品。親環(huán)蛋白的特異性寡核苷酸引物序列如下正向引物5′ACCCCACCGTGTTCTTCGAC-3′，反向引物5′CATTTGCCATGGACAAGATG-3′，結(jié)合溫度60℃。大鼠ee3_1的正向引物是5′-GGTGTGGGAGAAATGGCTTA-3′，反向引物5′-ATACCAGCAGAGCCTGGAGA-3′。
擴增cDNA的系列稀釋液以進(jìn)行定量，稀釋度分別是1∶3，1∶9，1∶27，1∶81和1∶243。擴增步驟如下94℃初始變性5min，擴增50個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性5s，根據(jù)上述不同的特異性引物在55℃或60℃結(jié)合10s，72℃延伸30s。每個循環(huán)結(jié)束后測定每個樣品的熒光值，測定溫度80℃，測定時間10s。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳和熔解曲線分析反應(yīng)產(chǎn)物的特異性(結(jié)果未顯示)。每個PCR反應(yīng)只產(chǎn)生一個反應(yīng)產(chǎn)物。
利用所述PCR反應(yīng)的對數(shù)期進(jìn)行定量，這包括擬合一條漸進(jìn)線。由于血紅蛋白PCR反應(yīng)的對數(shù)期曲線實質(zhì)上是平行的斜線，因此可以用其斜率與親環(huán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率進(jìn)行比較。每種cDNA稀釋液的校準(zhǔn)的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。以這種方法檢測出的數(shù)量差異對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因動物和野生型動物RNA表達(dá)的相對變化。所有反應(yīng)都只產(chǎn)生唯一的反應(yīng)產(chǎn)物。注射促紅細(xì)胞生成素6h后，ee3的平均誘導(dǎo)因子是1.35倍，注射24h后，ee3的平均誘導(dǎo)因子是1.44倍。
實施例9ee3_1 RNA在腦中的分布使用帶有放射標(biāo)記的寡核苷酸探針通過原位雜交的方法研究小鼠ee3_1轉(zhuǎn)錄子的定位。使用低溫保持器在-20℃將腦組織切成15μm厚的切片，放置在聚L-賴氨酸涂覆的載玻片上，用含4％多聚甲醛的PBS(pH 7.4)固定。使用末端轉(zhuǎn)移酶(Roche Diagnostics，Mannheim)將寡核苷酸用a-35S-dATP放射性標(biāo)記。按照Wisden&Morris的方法進(jìn)行標(biāo)記和隨后的雜交反應(yīng)(In situ-Hybridization Protocols for theBrain，Academic Press 1994)。
所使用的帶有放射性標(biāo)記的探針是ee3_1.3asAACGAAGGGCCAGTAGCACAGAGAACAGCAGCAGACAGGCATAGATGAGG。該探針使得ee3_1在小腦(ce)、海馬(hc)、齒狀回(dg)、皮層(co)，特別是內(nèi)嗅皮層(ent)以及嗅球(olf)等處的表達(dá)可以被觀察到。相應(yīng)的有義對照探針(ee3_1.3s，CCTCATCTATGCCTGTCTGCTGCTGTTCTCTGTGCTACTGGCCCTTCGTT)沒有產(chǎn)生特異信號(未顯示)(圖20)。
實施例10ee3_1在小鼠組織中分布的免疫組織化學(xué)研究切取2μm厚的石蠟包埋組織，放置在預(yù)先處理的載玻片上DAKO，Glostrup，Denmark)，空氣干燥過夜，然后用二甲苯和遞減的乙醇脫蠟。在檸檬酸鹽緩沖液中用500W的微波處理10min后，將切片與1∶500稀釋的抗ee3_1血清(AS4163)在室溫和潮濕條件下共培養(yǎng)1h。按照產(chǎn)品的使用說明(DAKO，Glostrup，Denmark)，用DAB作為顯色劑，使用ABC技術(shù)觀察免疫反應(yīng)。用同樣的方法處理組織切片，但不加入第一抗體以及用相應(yīng)的免疫前血清代替第一抗體作為陰性對照。
免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖22所示，揭示了ee3在神經(jīng)元的特異性分布，而在腸和肺的一些組織中沒有分布。ee3在具有整合功能的神經(jīng)元細(xì)胞中頻繁的表達(dá)。這種神經(jīng)元細(xì)胞包括皮層V的大錐體細(xì)胞，嗅球的僧帽細(xì)胞，小腦的浦肯野細(xì)胞細(xì)胞。圖A-C顯示了ee3在皮層V中的分布，同時神經(jīng)元細(xì)胞也被清楚的染色。圖C顯示了在內(nèi)溴皮層的更加清晰的免疫染色效果。從生理學(xué)角度說，負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶的信息從內(nèi)嗅皮層傳遞到海馬。
在患有中風(fēng)、阿爾茨海默癥或頭部、腦部損傷的患者中，經(jīng)常能觀察到內(nèi)嗅皮層的變化。內(nèi)嗅皮層的疾病可能導(dǎo)致行為變化，例如知覺、感官的衰退和學(xué)習(xí)障礙(David等人，Nurs Res 50(2)77-85(2001))。圖D-F顯示了ee3在海馬中的分布方式。ee3在CA3區(qū)域表達(dá)，而在CA2和CA1區(qū)域不表達(dá)，兩者之間的界限在圖中表現(xiàn)的非常明顯。CA1區(qū)的神經(jīng)元對于非壞死型和非炎癥型的生理性細(xì)胞死亡(凋亡)特別敏感，對于伴隨有中樞神經(jīng)損傷的細(xì)胞死亡尤其敏感，而CA4區(qū)神經(jīng)元的敏感程度較低(例如，Hara等人，Stroke，31，236-8，(2000))。與之相對照，齒狀回似乎更容易受到壞死型損傷的影響。齒狀回與病態(tài)刺激導(dǎo)致的新神經(jīng)元形成相關(guān)聯(lián)(Takagi等人，Brain Res，831，283-7，(1999))(Parent等人，J Neurosci，17，3727-38，(1997))。在新皮層形成區(qū)之外的區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了ee3，這些區(qū)域包括作為整合神經(jīng)元的小腦浦肯野細(xì)胞(G，H)，嗅球的僧帽細(xì)胞(I，J)。ee3在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和視網(wǎng)膜感覺細(xì)胞中的表達(dá)更為強烈(K，L)。
最近報道了促紅細(xì)胞生成素在視網(wǎng)膜中的神經(jīng)保護(hù)作用(Junk等人，Erythropoietin administration protects retinal neurons from acuteischemia-reperfusion injury.Proc Natl Acad Sci USA.2002 Aug 6；99(16)10659-64.；Grimm等人，HIF-1-induced erythropoietin in thehypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration.NetMed.2002 Jul；8(7)718-24.)。這些發(fā)現(xiàn)暗示EPO的誘導(dǎo)作用與ee3的表達(dá)之間存在聯(lián)系。同樣的，ee3在屬于運動系統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞中也有較高表達(dá)。所以在脊髓前角的運動神經(jīng)元中(圖22M)，以及在三叉神經(jīng)核的運動核中具有類似功能的神經(jīng)元細(xì)胞中(圖22N)，都能觀察到ee3的特異性表達(dá)。
所述的ee3在脊髓中的分布情況可能用于治療和診斷肌萎縮性側(cè)索硬化。肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS，又稱為Lou Gehrig氏病，Charcot氏病)是一種神經(jīng)變性疾病，每年發(fā)病率可達(dá)0.4-1.76/100000人(Adams等人，Principles of neurology，6th ed.，New York，pp 1090-1095)。它是一種最常見的運動神經(jīng)元疾病，主要癥狀有肌肉自發(fā)性震顫，骨骼肌系統(tǒng)進(jìn)行性萎縮和無力，痙攣，陽性錐體束癥，構(gòu)音障礙，吞咽困難以及呼吸困難。其致病機制主要是由于前角脊髓和下腦干運動神經(jīng)核中神經(jīng)細(xì)胞的損失而造成的，也可能影響皮層的第一級運動神經(jīng)元。雖然人們已經(jīng)十分清楚的知道在家族性疾病中超氧化物歧化酶突變反應(yīng)的作用，但是肌萎縮性側(cè)索硬化的致病機制仍有大部分是未知的。到目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過90種能夠引起ALS的SOD1突變蛋白(Cleveland和Rothstein(2001)，Nat Rev Neurosci，2，806-19.)。神經(jīng)微絲似乎也參與這種疾病。由過多的谷氨酸鹽所引發(fā)的興奮性中毒，是肌萎縮性側(cè)索硬化的另一個致病因子。利魯唑(Riluzole)對患者的作用也證明了這一點。半胱氨酸酶和凋亡的激活可能共同構(gòu)成了ALS的最終發(fā)病途徑(Ishigaki等人，(2002)，J Neurochem，82，576-84.，Li等人(2000).Science，288，335-9.)。ee3蛋白在患ALS的神經(jīng)元中的分布明確的指出了ee3激動劑或拮抗劑對這種疾病潛在的治療功能和診斷應(yīng)用。
ee3在中腦黑質(zhì)中的分布使對帕金森氏病的治療和診斷成為可能(圖22O，P)。帕金森氏病也是一種最常見的運動失調(diào)性疾病，在北美約有一百萬患者，超過65歲的人當(dāng)中約有1％的人受到影響。帕金森氏病的主要癥狀是僵直，震顫，運動失能(Adams等人，Principlesof neurology，6th ed.，New York，pp 1090-1095)。這種疾病的發(fā)病機理并不清楚。但是對尸檢組織和動物模型的分析表明在黑質(zhì)中存在持續(xù)的氧化應(yīng)激，這會導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)變性。通過施用神經(jīng)毒素，例如6-羥多巴胺、MPTP(N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫嘧啶)，對動物模型施加氧化應(yīng)激，從而研究神經(jīng)變性過程。雖然已經(jīng)有一種能改善癥狀的療法(例如，L-DOPA聯(lián)合脫羧酶抑制劑；溴麥角環(huán)肽，多巴胺激動劑pergolide和抗膽堿能物質(zhì)如三己芬迪((安坦))，仍然非常需要開發(fā)一種能夠阻斷發(fā)病過程的、針對病因的療法，例如神經(jīng)保護(hù)療法。在動物模型和人體中都發(fā)現(xiàn)凋亡機制確實參與了發(fā)病過程(Mochizuki等人，(2001)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，10918-23.，Xu等人，(2002)，Nat.Med.，8，600-6.，Viswanath等人(2001)，J.Neurosci.，21，9519-28，Hartmann等人(2002)，Neurology，58，308-10)。
ee3在神經(jīng)系統(tǒng)的分布充分證明了該蛋白的表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞死亡、神經(jīng)變性和神經(jīng)塑性之間存在聯(lián)系。
在肺部，ee3分布在不同組織中(圖22Q-V)。在末端支氣管發(fā)現(xiàn)了表達(dá)ee3的基底細(xì)胞，該細(xì)胞可能具有神經(jīng)內(nèi)分泌的活性。這種分布情況說明了ee3對于支氣管疾病的重要治療作用。小動脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中也有ee3的表達(dá)(12U，V)。與之相反，在venoles中沒有顯示任何可記錄的ee3免疫組織化學(xué)表達(dá)跡象(圖22Q和R)。內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)的特殊受體具有重要的藥理學(xué)價值，因為藥物與血液中的這層細(xì)胞是直接接觸的。作用于循環(huán)系統(tǒng)的有價值藥物，其作用靶點是小動脈，特別是內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。因此，ee3是影響循環(huán)性疾病，如動脈高血壓，十分重要的靶蛋白。
在小腸，ee3基本分布在隱窩(圖22W，X)和屬于腸叢的神經(jīng)細(xì)胞中(圖22Y)。在多數(shù)進(jìn)行組織學(xué)研究的器官中，并沒有對器官特異性細(xì)胞專門染色，而是在多數(shù)情況下，只對神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了明顯染色(例如，心肌，圖22AA，或結(jié)締組織，圖22Z)。ee3在軸突的清楚分布使其可以用于外周神經(jīng)疾病(神經(jīng)病)的診斷和治療，這種疾病包括糖尿病人中普遍的多發(fā)性神經(jīng)病。同樣，普通的外周神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病，如HMSN(遺傳性運動傳感神經(jīng)病)也能由此受益。
最后，ee3在骨骼肌的表達(dá)與其在運動神經(jīng)終極的分布十分吻合(圖22BB)。這有利于研究神經(jīng)末梢疾病，如重癥肌無力。
實施例11EPO過量表達(dá)小鼠中，ee3在蛋白水平上調(diào)免疫組織化學(xué)試驗(抗血清AS4163)也證明了促紅細(xì)胞生成素對ee3蛋白顯著的上調(diào)(圖23)。平行處理的CNS部分表現(xiàn)出明顯增強的ee3信號。每組試驗共有各3只小鼠(野生型和EPO過量表達(dá)tg6小鼠)，根據(jù)基因型的不同，采用盲法試驗進(jìn)行染色和評價。
實施例12ee3和map1b的共同分布以及在map1b缺陷小鼠中ee3表達(dá)的消失以ee3_1的C末端進(jìn)行的酵母雙-雜交試驗證明Map1a和Map1b的輕鏈?zhǔn)窍嗷プ饔玫鞍?參見前面的實施例，實施例4)。圖24顯示了小鼠ee3_1和map1b的雙免疫熒光，并且證明了未預(yù)見到的，ee3_1和map1b在小鼠中表達(dá)的重疊。
為了實現(xiàn)雙免疫熒光染色，將脫蠟組織用微波處理后(檸檬酸鹽緩沖液，500W，10min)，與兔ee3_1抗體(AS4163)和羊抗map1a抗體(MAP-1B(C20)sc-8971；Santa Cruz；Santa Cruz，USA)一起在潮濕的室中于室溫條件下培養(yǎng)一小時。經(jīng)過適當(dāng)洗滌后，將組織與FITC抗兔第二抗體和TRITC抗羊第二抗體的混合物共培養(yǎng)30min(兩種抗體均用PBS稀釋到1∶30，抗體來自Dianova，Hamburg，Germany)。再次以PBS洗滌組織后，用Histosafe密封制備產(chǎn)物，使用合適的濾片用熒光顯微鏡進(jìn)行分析(Olympus IX81，Olympus，Germany)。用分析軟件畫出信號覆蓋圖(軟件繪圖系統(tǒng)，Stuttgart，Germany)。在單色平行熒光染色中，每次其他色道的信號都會消失，這就排除了每次信號發(fā)射到其他色道的現(xiàn)象(例如應(yīng)用不適當(dāng)?shù)倪^濾器)。用互換發(fā)色團對第二抗體進(jìn)行雙染色產(chǎn)生同樣的結(jié)果(未顯示)。
圖24顯示了令人驚訝的兩種蛋白在CNS的共同分布。綠色代表ee3_1；紅色是Map1b；黃色代表兩種信號的電子疊加。圖24顯示了來自脊髓(sc)和小腦(cb)的樣品。
Map1b是一種重要的神經(jīng)元蛋白。它是一種在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中表達(dá)的第一微管伴隨蛋白(maps)，并且參與神經(jīng)元的軸突起源過程(Gonzalez-Billault等人(2001)，Mol Biol Cell，12，2087-98，Gonzalez-Billault等人(2002)，Brain Res，943，56-67.)。最近的研究證明了在神經(jīng)元細(xì)胞的相互作用中，map1b的重要功能。Map1b參與脆性X染色體綜合癥的致病過程。脆性X染色體綜合癥是一種常見的遺傳性智力低能疾病。Map1b的mRNA受FMRP控制，而脆性X染色體的mRNA又直接調(diào)節(jié)FMRP蛋白。對果蠅的研究表明，map1b(果蠅的futsch)對于脆性X染色體綜合癥類似表型的顯現(xiàn)起主要作用(Sohn(2001)，Science，294，1809，Zhang等人，(2001)，cell，107，591-603.)。map1b也與gigaxonin結(jié)合，gigaxonin蛋白的基因突變會導(dǎo)致巨軸突神經(jīng)病(GAN)這種隱性遺傳疾病(Ding等人(2002)，J CellBol，158，427-33.)。外周神經(jīng)受到損傷后，有髓鞘的神經(jīng)產(chǎn)生的神經(jīng)元中，map1b被誘導(dǎo)增加并可能參與軸突的萌生(Soares等人(2002)，EurJ Neurosci，16，593-606.)。最后，map1b還能將GABA-C受體定位到它的突觸位點(Pattnaik等人(2000)，J Neurosci，20，6789-96)。
小鼠的map1b基因是失活的(敲除)。Meixner等人描述了一種最優(yōu)的敲除小鼠(Meixner，Haverkamp，Wassle，F(xiàn)uhrer，Thaihammer，Kropf，Bittner，Lassmann，Wiche and Propst(2000)，J Cell Biol，151，1169-78.)。對攜帶純和失活map1b基因的小鼠進(jìn)行ee3表達(dá)的免疫組織化學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)ee3_1的染色性大大降低(圖25)，這說明ee3_1蛋白的表達(dá)或穩(wěn)定性依賴于它與map1b的相互作用。因此，該相互作用的抑制劑能導(dǎo)致ee3表達(dá)的明顯減弱。
實施例13檢測ee3_1的抗血清的制備用DNAStar程序包(Lasergene)中的部分程序Protean分析人ee3_1的蛋白序列。根據(jù)推測的二級結(jié)構(gòu)、蛋白表面的可能構(gòu)象以及推測的強抗原性，選擇出對應(yīng)于氨基酸299-315位的表位LHHEDNEETEETPVPEP，該表位位于胞內(nèi)C末端。合成所述肽，并且在N末端添加一個半胱氨酸(CLHHEDNEETEETPVPEP)，使它能夠與載體蛋白KLH(keyhole limpet hemocyanine)發(fā)生可控的、特異性偶聯(lián)。根據(jù)最優(yōu)選方法，用肽-KLH結(jié)合體免疫兩只兔子。肽的合成以及隨后與KLH的偶聯(lián)以及免疫兔子都是從BioTrendChemikalien GmbH定制的。在初次免疫之前，化驗這些兔子的免疫前血清，以檢查假轉(zhuǎn)染細(xì)胞與腦組織提取物在Western印跡分析中的交叉反應(yīng)性。初次免疫后3周，背景忽略不計的2只兔子進(jìn)行第1次加強免疫，再過4周后，進(jìn)行第2次加強免疫。一周后，取兔血20ml，用western印跡分析免疫血清，對瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞(HEK293，CHO-dhfr-)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。第3次或第4次加強免疫之后，將兔子放血處死。
2只兔子的血清都是陽性的。特別是AS4163抗血清能夠非常專一性的識別在各種細(xì)胞中瞬時表達(dá)的人ee3_1蛋白。并且，將AS4163抗血清稀釋到1∶12000，可用于western印跡分析。AS4163抗血清也適用于ee3_1蛋白的免疫沉淀反應(yīng)，因此可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞或天然組織來源的ee3_1及其相互作用蛋白的沉淀。AS4163抗血清尤其能夠識別鼠ee3_1序列中相應(yīng)的表位，該表位與人表位的序列只相差一個氨基酸，即N304突變?yōu)榻z氨酸。所以AS4163抗血清非常適用于對野生型、轉(zhuǎn)基因和敲除小鼠中ee3_1蛋白的表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，如圖22-24所示。
實施例14神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的ee3根據(jù)上文所述的方法(Ray等人，1993)，從4-6周齡的雄性Wistar大鼠的海馬中分離神經(jīng)干細(xì)胞。該操作符合德國的法律。用1％(V/V)isoflurane，70％N2O和29％氧麻醉動物，斷頭處死。取腦組織，并用50ml冰冷的含4.5g/l葡萄糖的Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液洗滌(DPBS/Glc)。從6只大鼠中提取海馬，以10ml DPBS/Glc洗滌，在4℃、1600g離心5min。棄去上清夜，用剪刀和解剖刀將組織勻漿。組織塊用DPBS/Glc洗滌，在800g離心5min，用含0.01％(W/V)木瓜蛋白酶，0.1％(W/V)dipase II(中性蛋白酶)，0.01％(W/V)DNase I和12.4mM硫酸錳的Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)重懸沉淀。用吸液管的管尖研磨組織，室溫下培養(yǎng)40min并間歇進(jìn)行混合(每10min)。將混懸液在4℃、800g離心5min，將沉淀用10ml含2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM Ham’s F-12溶液洗滌3次。然后用1ml含B27(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、20ng/ml EGF、20ng/ml FGF-2和2μg/ml肝素的神經(jīng)基底培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。無菌條件下，在6孔培養(yǎng)板中加入25000-100000細(xì)胞/ml濃度的細(xì)胞液。培養(yǎng)板在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，每周更換約2/3的培養(yǎng)液(參考Ray J，Peterson DA，Schinstine M，Gage FH(1993)Proliferation，differentitation and long-term culture of primary hippocampalneurons.Proc Natl Acad Sci USA 903602-6)。
海馬干細(xì)胞培養(yǎng)3周后，進(jìn)行凍融，然后按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟(Qiagen的RNeasy試劑盒)分離RNA。用oligodT引物和Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco)按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟合成cDNA并進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)參數(shù)如下94℃變性10min，隨后共進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃30s，55℃50s，72℃60s。循環(huán)完成后再在72℃延伸5min，4℃保存。使用了下述引物對ee3_plus 5′-GGTGTGGGAGAAATGGCTTA-3′和ee3 minus 5′-ATACCAGCAGAGCCTGGAGA-3′。
最近，人們認(rèn)識到了神經(jīng)性疾病發(fā)病過程中，新的神經(jīng)細(xì)胞形成(神經(jīng)發(fā)生)的重要性。與其它許多組織不同，成熟的腦組織只具有有限的再生能力。并且由于細(xì)胞通常具有高度特異性，使得健康組織不可能替代損傷組織的功能。而由成年腦組織前體細(xì)胞發(fā)育出的神經(jīng)細(xì)胞，在理論上可以替代損傷組織的功能。
神經(jīng)發(fā)生過程出現(xiàn)在成熟腦組織的個別區(qū)域，如側(cè)腦室的吻端室下區(qū)(SVZ)和齒狀回(DG)的亞粒狀區(qū)(SGZ)。很多試驗證明神經(jīng)的損傷能夠誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生(例如，腦萎縮癥(Jin等人(2001)，Proc.Nati。Acad.Sci.USA，98，4710-5；Jiang等人(2001)，Stroke，32，1201-7；Kee等人(2001)，Exp.Brain.Res.，136，313-20；Perfilieva等人(2001)，J.Cereb.Blood flow Metab.，21，211-7))。人體中也有神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象(Eriksson等人(1998)，Nat Med，4，1313-7.)，并確實產(chǎn)生了有功能的神經(jīng)元(van Praag等人(2002)，Nature，415，1030-4)。在成人的一生中，齒狀回的亞粒狀區(qū)和門區(qū)可能產(chǎn)生新的神經(jīng)元(Gage等人(1998)，J Neurobiol，36，249-66)。在海馬的神經(jīng)干細(xì)胞中能夠很明顯的觀察到ee3(圖25)，這說明了ee3對于神經(jīng)發(fā)生的重要性。ee3在神經(jīng)發(fā)生中的重要性是ee3對任何神經(jīng)變性疾病普遍有效的進(jìn)一步證明。
與ee3作用于腦組織內(nèi)源性干細(xì)胞不同，在治療方法中，ee3是在體外處理干細(xì)胞(例如，體外的分化和增殖)。目前，干細(xì)胞由于其有效性應(yīng)用于很多種神經(jīng)變性疾病，特別是帕金森氏病和中風(fēng)。人們希望，在體外分化細(xì)胞，再移植到帕金森氏病患者體內(nèi)，以此來補償注射后的多巴胺能缺乏(替代療法)(Arenas(2002)，Brain Res.Bull，57，795-808；Barker(2002)，Mov.Disord.，17，233-41)。另一種導(dǎo)入干細(xì)胞的可能方式是，例如對中風(fēng)或腦損傷患者進(jìn)行動脈或靜脈注射(Mahmood等人(2001)，Neurosurgery，49，1196-203；Discussion 1203-4，Lu等人(2001)，J Neurotrauma，18，813-9；Lu等人(2002)，CellTransplant，11，275-81；Li等人(2002)，Neurology，59，514-23)。干細(xì)胞療法中ee3的另一個可能的用途是制備持續(xù)分泌ee3激動劑或拮抗劑的細(xì)胞。
實施例15從非洲爪蟾(Xenopus laevis)和斑馬魚(Dario rerio)克隆其它ee3受體家族相關(guān)受體根據(jù)本發(fā)明序列的同源標(biāo)準(zhǔn)可以克隆ee3蛋白家族的其它成員。應(yīng)用TBLASTN，以人ee3_1的蛋白序列在EST數(shù)據(jù)庫中檢索，得到了爪蟾(Xenopus laevis)和斑馬魚(Dario rerio)的EST序列。用標(biāo)準(zhǔn)方法對所述EST序列測序，結(jié)果如下x1_ee3(非洲爪蟾)的全長序列CCCGGGCACGTTACCGTATTGATGTTACTAGTAGCGCACAGAAACATCCTGGTCTAAGCAGTTGCAGCAGGTACTGCGTTGTAGTGGCGGTAGTTACGACTCTGTAGGTTAGAGCGGAGGCTTTGCTGGAGCAATGTCCGCCTAGTGAAGCTCGGAGAGGTGCTCGCACCATGAATCTTAGGGGCCTCTTCCAGGATTTTAACCCCAGTAAATTTCTCATCTACGCATGTTTGTTGCTCTTTTCTGTTCTCCTTTCCCTGCGACTGGATAATATTATTCAGTGGAGTTACTGGGCGGTGTTTGCTCCAATATGGTTGTGGAAACTAATGGTTATTGTGGGAGCCTCAGTTGGTACAGGTGTATGGGCACGTAACCCTCAATACAGGGCAGAAGGTGAAACATGTGTGGAGTTCAAGGCCATGCTAATTGCAGTGGGAATTCATTTGCTGCTTCTTATGTTTGAAGTTCTTGTTTGCGATCGTATTGAAAGAGGAAACCACTACTTCTGGTTGCTAGTCTTTATGCCTTTATTCTTTGTGTCCCCAGTATCCGTTGCAGCTTGCGTTTGGGGCTTTCGGCATGATCGATCATTGGAATTGGAAATCTTGTGCTCCGTCAATATTCTGCAGTTTATATTCATTGCCCTAAGACTTGACAGCATCATCACTTGGCCTTGGCTTGTGGTATGTGTCCCGCTGTGGATCCTTATGTCCTTCCTGTGCCTAGTAGTTCTGTATTATATTGTGTGGTCAGTTCTGTTCCTGCGTTCAATGGATGTTATTGCAGAACAAAGGAGAACTCATATTACTATGGCAGTCAGTTGGATGGCTATAGTTGTACCGCTTCTGACATTCGAGATATTACTTGTTCATCGACTTGATGGGCACAATCCATTATCGAATATCCCTATATTTGTTCCGCTTTGGCTTTCCTTAATAACGTTGATGGCAACAACCTTTGGACAGAAAGGAGGCAATCACTGGTGGTTTGGGATTCGTAAAGACTTCTGCCAGTTTCTGTTGGAGATTTTCCCTTTTCTTCGAGAATATGGCAATATCTCATATGATATTCATCATGAAGACAGTGAAGATGCTGAAGAAACACCTGTACCGGAGCCCCCCAAAATCGCACCAATGTTTCGAAAGAAGACTGGCGTTGTCATTACCCAGAGCCCAGGGAAATATATTGTTCCTCCTGCTAAACTTAACATCGACATGCCGGATTAAGGTGAAATTTGGTGGCTTGAGGGCACTTTTTTCTGTTTTAACTAATCCTGTTAGTAGTACACTATCAGGTGTCATGGACTGAAGGGAAAAAAAGACTACTGACCTCATTCCTTTTTTGTATTCATTTGTAATTTTTTTTGTTCCTGCAATGGTATGTGTTTTCCCATTCCTAATTCATGTCATCATGTTACTCAAGATCAGGGAAGCTTCTTAAGGGCAAAGAATGCTGGAATTTGTAGTTTATAATTTGTGGATGACTATAAATTTTCACATCTGTTGTCTTGGTAATGACTGCAGTCTTGCATTCTAGTTTCTAGTAACACAGAGATAGACCAGCTGTGGCCCTCCAGATACTGAGCTAACAAGCTTTGGGAGACATCCTGGGAATCTTAGCAGCTCTGGGGCCACAGGTTGGACTTCTCAGCAGTAAAATTAAGTATAATGTTTATCTTAAGTAAATGTCTTTGTGTGTGTTGTTATGCAATGCAGCTATTGTTTGATATCTTTAcagcagaacttgtgcatagaattgaattcaagttgtgagctgttttataccactataaaaatacttttAAAAAAAAATCTGTTTAAGGGTCAAGCATTACCTTGGAGAAGTGATATTTGAGCAGAGGGCTTATGGGATATATCTAATATACACCTTCCCTTAGGAGTTACTACTCCTTGCTCACTTGTATAGTATTTATAAGAACATTTTATCAATGTAATATATTGTGTTCAAAATTATTCTTATGTACAGTATAAATGGATAAATACAAAGTATTTTTTTAAATAAAAGATGTAAAATACATATAAGTTGTCAAAATTTTGTTTGTAATTTACATTTTAAAATGATCTATGTGAATTCTACAATGAAAAAAGATCTATACAATTTCAAAAGCCAGTATGTCATTTTTATATACTGACCATGTACATATTATGTAAGATGTAAAGCCAAACACCAATGACATGAATGTTAAGTTATTAGACTATGAATAAAACATTGATTTTATTTTATGTTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAx1_ee3的開放閱讀框ATGAATCTTAGGGGCCTCTTCCAGGATTTTAACCCCAGTAAATTTCTCATCTACGCATGTTTGTTGCTCTTTTCTGTTCTCCTTTCCCTGCGACTGGATAATATTATTCAGTGGAGTTACTGGGCGGTGTTTGCTCCAATATGGTTGTGGAAACTAATGGTTATTGTGGGAGCCTCAGTTGGTACAGGTGTATGGGCACGTAACCCTCAATACAGGGCAGAAGGTGAAACATGTGTGGAGTTCAAGGCCATGCTAATTGCAGTGGGAATTCATTTGCTGCTTCTTATGTTTGAAGTTCTTGTTTGCGATCGTATTGAAAGAGGAAACCACTACTTCTGGTTGCTAGTCTTTATCCCTTTATTCTTTGTGTCCCCAGTATCCCTTGCAGCTTGCGTTTGGGGCTTTCGGCATGATCGATCATTGGAATTGGAAATCTTGTGCTCCGTCAATATTCTGCAGTTTATATTCATTGCCCTAAGACTTGACAGCATCATCACTTGGCCTTGGCTTGTGGTATGTGTCCCGCTGTGGATCCTTATGTCCTTCCTGTGCCTAGTAGTTCTGTATTATATTGTGTGGTCAGTTCTGTTCCTGCGTTCAATGGATGTTATTGCAGAACAAAGGAGAACTCATATTACTATGGCAGTCAGTTGGATGGCTATAGTTGTACcGCTTCTGACATTCGAGATATTACTTGTTCATCGACTTGATGGGCACAATCCATTATCGAATATCCCTATATTTGTTCCGCTTTGGCTTTCCTTAATAACGTTGATGGCAACAACCTTTGGACAGAAAGGAGGCAATCACTGGTGGTTTGGGATTCGTAAAGACTTCTGCCAGTTTCTGTTGGAGATTTTCCCTTTTCTTCGAGAATATGGCAATATCTCATATGATATTCATCATGAAGACAGTGAAGATGCTGAAGAAACACCTGTACCGGAGCCCCCCAAAATCGCACCAATGTTTCGAAAGAAGACTGGCGTTGTCATTACCCAGAGCCCAGGGAAATATATTGTTCCTCCTGCTAAACTTAACATCGACATGCCGGATTAAxl_ee3的蛋白質(zhì)序列
MNLRGLFQDFNPSKFLIYACLLLFSVLLSLRLDNIIQWSYWAVFAPIWLWKLMVIVGASVGTGVWARNPQYRAEGETCVEFKAMLIAVGIHLLLLMFEVLVCDRIERGNHYFWLLVFNPLFFVSPVSVAACVWGFRBDRSLELEILCSVNILQFIFIALRLDSIITWPWLVVCVPLWILMSFLCLVVLYYIVWSVLFLRSMDVIAEQRRTHITMAVSWMAIVVPLLTFEILLVHRLDGHNPLSNIPIFVPLWLSLITLMATTFGQKGGNHWWFGIREDFCQFLLEIFPFLREYGNISYDIHHEDSEDAEETPVPEPPKIAPMFRKKTGVVITQSPGKYIVPPAKLNIDMPD斑馬魚(D.Rerio)的序列如下(dr_ee3)CTCGAGCACTGTTGGCCTACTGGGATGTGAGTGCCAGTCAGCTAGCCAGCCTCTCCTTTTCAGTTCATGTAACTATGGTCTGAAGAGGAAACCATGAATCTCCGAGGCGTTTTCCAAGATTTCAACCCCAGTAAGTTCCTGATCTACGCATGTCTGCTGCTCTTCTCTGTGCTGCTGTCACTGAGGCTGGATGGCATCATCCAGTGGAGCTACTGGGCCGTGTTTGCGCCCATCTGGCTCTGGAAGCTCATGGTCATCATCGGGGCGTCTGTGGGCACTGGAGTGTGGGCTCACAACCCGCAGTACAGGGCTGAAGGGGAGACGTGTGTGGAGTTTAAGGCCATGCTGATCGCAGTGGGAATCCACCTGCTCCTGCTCACCTTCGAGGTGCTGGTCTGCGAGCGCGTGGAACGGGCTTCCATCCCCTACTGGCTCCTGGTGTTCATGCCGCTCTTCTTCGTCTCTCCGGTGTCAGTGGCAGCGTGTGTGTGGGGATTCAGACACGACCGCTCGCTGGAGCTGGAGATTCTGTGCTCTGTAAATATTCTTCAGTTTATCTTCATCGCTCTGAAACTGGACGGGATCATCAGCTGGCCGTGGCTGGTGGTGTGTGTGCCGCTCTGGATCCTCATGTCCTTCTTGTGTCTGGTGGTcctctattatatcgtgtggtctgTGCTGTTTCTGCGCTCCATGGATGTGATCGCGGAGCAGCGGCGCACACACATCACCATGGCCATCAGCTGGATGACTATAGTCGTGCCCCTGCTCACTTTTGAGATTCTCCTCGTCCACAAGCTgGATAATCATTATAGCCCCAACTACGTcCCGGTGTTTGTTCCTCTCTGGGTTTCTTTAGTGACTCTAATGGTGACCACATTTGGCCAGAAAGGAGGCAATCACTGGTGGTTTGGCATCCGTAAAGACTTCTGCCAGTTTCTgCTGGAGCTCTTCCCGTTCCTCAGGGAATATGGCAACATCTACTATGACCTGCATCACGAGGACTCAGACATGTcCGAGGAGTTGCCCATTCACGAGGTGCCCAAAATCCCTACCATGTTTAgCAAGAAGACGGGGGTGGTGATCACCCAAAGCCCTGGGAAATACTTTGTGCCCCCACCCAAACTGTGCATCGACATGCCAGACTAACATTGGAGCTCTCGTATACAGTATAGCACTATGCAATGGAATTCGCTTTGTTACGTgCTGTTGAAGACGGcAACAACAATCCCATTAAACTCGGCTCTTGTTTCCTAAAAAAAATAGCTGCGCAAACGGACCTGTTGACATCAdr_ee3的開放閱讀框ATGAATCTCCGAGGCGTTTTCCAAGATTTCAACCCCAGTAAGTTCCTGATCTACGCATGTCTGCTGCTCTTCTCTGTGCTGCTGTCACTGAGGCTGGATGGCATCATCCAGTGGAGCTACTGGGCCGTGTTTGCGCCCATCTGGCTCTGGAAGCTCATGGTCATCATCGGGGCGTCTGTGGGCACTGGAGTGTGGGCTCACAACCCGCAGTACAGGGCTGAAGGGGAGACGTGTGTGGAGTTTAAGGCCATGCTGATCGCAGTGGGAATCCACCTGCTCCTGCTCACCTTCGAGGTGCTGGTCTGCGAGCGCGTGGAACGGGCTTCGATCCCCTACTGGCTCCTGGTGTTCATGCCGCTCTTCTTCGTCTCTCCGGTGTCAGTGGCAGCGTGTGTGTGGGGATTCAGACACGACCGCTCGCTGGAGCTGGAGATTCTGTGCTCTGTAAATATTCTTCAGTTTATCTTCATCGCTCTGAAACTGGACGGGATCATCAGCTGGCCGTGGCTGGTGGTGTGTGTGCCGCTCTGGATCCTCATGTCCTTCTTGTGTCTGGTGGTcctctattatatcgtgtggtctgTGCTGTTTCTGCGCTCCATGGATGTGATCGCGGAGCAGCGGCGCACACACATCACCATGGCCATCAGCTGGATGACTATAGTCGTGCCCCTGCTCACTTTTGAGATTCTCCTCGTCCACAAGCTgGATAATCATTATAGCCCCAACTACGTcCCGGTGTTTGTTCCTCTCTGGGTTTCTTTAGTGACTCTAATGGTGACCACATTTGGCCAGAAAGGAGGCAATCACTGGTGGTTTGGCATCCGTAAAGACTTCTGCCAGTTTCTgCTGGAGCTCTTCCCGTTCCTCAGGGAATATGGCAACATCTACTATGACCTGCATcACGAGGACTCAGACATGTcCGAGGAGTTGCCCATTCACGAGGTGCCCAAAATCCCTACCATGTTTAgCAAGAAGACGGGGGTGGTGATCACCCAAAGCCCTGGGAAATACTTTGTGCCCCCACCCAAACTGTGCATCGACATGCCAGACTAA和dr_ee3的蛋白序列MNLRGVFQDFNPSKFLIYACLLLFSVLLSLRLDGIIQWSYWAVFAPIWLWKLMVIIGASVGTGVWAHNPQYRAEGETCVEFKAMLIAVGIHLLLLTFEVLVCERVERASIPYWLLVFMPLFFVSPVSVAACVWGFRHDRSLELEILCSVNILQFIFIALKLDGIISWPWLVVCVPLWILMSFLCLVVLYYIVWSVLFLRSMDVIAEQRRTHITMAISWMTIVVPLLTFEILLVHKLDNHYSPNYVPVFVPLWVSLVTLMVTTFGQKGGNHWWFGIRKDFCQFLLELFPFLREYGNIYYDLHHEDSDMSEELPIHEVPKIPTMFSKKTGVVITQSPGKYFVPPPKLCIDMPD圖27通過例舉非洲爪蟾和斑馬魚蛋白序列，再次說明了ee3家族的高度進(jìn)化保守性。
權(quán)利要求
1.DNA序列，其特征在于它包含編碼多肽的序列區(qū)，所述多肽含有如附圖13、14、15A、15B、15C、16或18所示的多肽的至少20個氨基酸長度的部分序列，包括所有的功能同源衍生物、片段、等位基因或與其雜交的DNA序列，所述附圖也是本權(quán)利要求的一部分。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于它含有編碼如附圖13、14、15A、15B、15C、16和18所示多肽的序列區(qū)，包括所有的功能同源衍生物、片段、等位基因或與其雜交的DNA序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的DNA序列，其特征在于它編碼如附圖13、14、15A、15B、15C、16和18所示的多肽，包括所有的功能同源衍生物、片段、等位基因或與其雜交的DNA序列。
4.如前面任意一項權(quán)利要求所述的DNA序列，其特征在于它包含如附圖9A，10，11A，11B，11C，12或17所示(c)DNA序列的至少60個核苷長度的部分序列，特別是包含附圖9A，10，11A，11B，11C，12或17中所示的翻譯區(qū)(以大寫字母表示)。
5.表達(dá)載體，其特征在于它含有權(quán)利要求1至4任意一項所述的DNA序列。
6.宿主細(xì)胞，其特征在于它是用權(quán)利要求5所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的。
7.權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于它是哺乳動物細(xì)胞，特別是人類細(xì)胞。
8.一種純化的基因產(chǎn)物，其特征在于所述基因產(chǎn)物由權(quán)利要求1至4任意一項的DNA序列所編碼。
9.如權(quán)利要求8所述的純化基因產(chǎn)物，其特征在于該產(chǎn)物是多肽。
10.權(quán)利要求8或9所述的純化基因產(chǎn)物，其特征在于它包含如附圖13、14、15A、15B、15C、16或18所示的氨基酸序列，以及所述產(chǎn)物的功能同源的等位基因、片段或衍生物。
11.一種轉(zhuǎn)基因動物，其特征在于與正常動物相比，該轉(zhuǎn)基因動物被遺傳修飾，所述遺傳修飾包括權(quán)利要求9或10所述的至少一條氨基酸序列數(shù)量的(特異性)改變，特別是附圖13、14、15A、15B、15C、16和18所示的氨基酸序列的改變或權(quán)利要求9或10所述的氨基酸序列相對于天然ee3氨基酸序列(優(yōu)選附圖13、14、15A、15B、15C、16或18所示的序列)在序列順序上的特異性改變，所述遺傳修飾還包括缺失或改變至少一條天然ee3氨基酸序列特別是權(quán)利要求9所述的序列或如附圖13、14、15A、15B、15C、16和18所示的序列或其部分。
12.一種抗體，其特征在于它識別權(quán)利要求8-10任意一項所述基因產(chǎn)物的表位。
13.權(quán)利要求12所述的抗體，其特征在于它是單克隆抗體。
14.權(quán)利要求12或13所述的抗體，其特征在于它以胞外區(qū)的序列片段作為識別的表位。
15.一種表達(dá)權(quán)利要求8-10任意一項所述基因產(chǎn)物的方法，其特征在于用權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
16.一種分離權(quán)利要求8-10任意一項所述基因產(chǎn)物的方法，其特征在于在合適的、有利于表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求6或7所述的宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)基中純化基因表達(dá)產(chǎn)物。
17.權(quán)利要求1-4任意一項所述DNA序列或權(quán)利要求8-10任意一項所述基因產(chǎn)物作為藥物的用途。
18.權(quán)利要求1-4任意一項所述DNA序列或權(quán)利要求8-10任意一項所述基因產(chǎn)物用于治療腫瘤，急慢性缺氧，心血管疾病，(神經(jīng))變性疾病，免疫系統(tǒng)疾病，特別是自身免疫性疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是中風(fēng)，多發(fā)性硬化癥，帕金森氏病，肌萎縮性側(cè)索硬化，遺傳退化性共濟失調(diào)，亨廷頓氏病，神經(jīng)病和癲癇癥的用途(和/或制備治療這些疾病的藥物的用途)。
19.一種化合物，其特征在于它調(diào)節(jié)，特別是抑制ee3蛋白的胞內(nèi)和/或胞內(nèi)功能，例如針對ee3蛋白細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)的胞內(nèi)抗體。
20.權(quán)利要求19所述的化合物，其特征在于它是一種有機化合物，分子量優(yōu)選＜3000。
21.權(quán)利要求19或20所述的化合物，其特征在于它能夠以擴散的方式或通過膜轉(zhuǎn)運蛋白穿過細(xì)胞膜。
22.一種鑒別權(quán)利要求19-21任意一項所述藥物活性化合物的方法，其特征在于(a)用權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，特別是編碼如附圖13、14、15A、15B、15C、16或18所示的蛋白的表達(dá)載體，和任選一種編碼至少一種報告基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，和(b)加入待鑒別化合物后，采用適宜的分析系統(tǒng)以不加待鑒別化合物為對照對由(a)得到的宿主細(xì)胞的一些參數(shù)進(jìn)行測定，所述參數(shù)反映了權(quán)利要求8-10任一項所述本發(fā)明的基因產(chǎn)物所介導(dǎo)的功能，特別是凋亡，細(xì)胞生長，細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞塑性的功能。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于該方法還包括另一步驟(c)以適當(dāng)?shù)纳锘瘜W(xué)或結(jié)構(gòu)-生物學(xué)方法確定藥物活性化合物與本發(fā)明所述蛋白的結(jié)合位點。
24.權(quán)利要求22或23所述的方法，其特征在于在(b)步驟中測定細(xì)胞內(nèi)Ca釋放量。
25.權(quán)利要求19-22所述的化合物用于治療會發(fā)生或伴有急慢性缺氧現(xiàn)象的疾病的用途(或制備治療這些疾病的藥物的用途)，例如心肌梗塞，心力衰竭，原發(fā)性心肌癥，心肌炎，心包炎，心包心肌炎，冠心病，左右分流先天性心臟病，法樂四聯(lián)癥/五聯(lián)癥，Eisenmenger綜合征，中風(fēng)，末端灌注不足，動脈閉合癥(AVK)，外周動脈閉合癥(PAVK)，頸動脈狹窄，腎動脈狹窄，腦中微循環(huán)紊亂(小血管癥)，大腦內(nèi)出血，大腦靜脈和竇血栓癥，血管畸形，蛛網(wǎng)膜下出血，賓斯旺格癡呆，皮層下動脈硬化性腦病，栓塞引起的多重皮層梗死，脈管炎，糖尿病性視網(wǎng)膜病，不同原因引起的貧血癥連續(xù)癥狀(例如，再生障礙性貧血，脊髓發(fā)育不良綜合癥，紅血球增多癥，巨紅細(xì)胞貧血癥，缺鐵性貧血癥，腎貧血癥，球形紅細(xì)胞溶血性貧血癥，地中海貧血癥，血紅蛋白病，6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏癥，輸血感染，恒河猴不相容疾病，瘧疾，心(臟)瓣膜移植，出血性貧血，脾機能亢進(jìn)癥)，肺纖維化，肺氣腫，肺水腫ARDS，IRDS，復(fù)發(fā)性肺栓塞，腫瘤(例如，腸癌，乳腺癌，前列腺癌，肺癌)，免疫系統(tǒng)疾病(例如，自身免疫病，特別是糖尿病，銀屑病，免疫缺陷病，多發(fā)性硬化癥，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或遺傳性過敏癥，哮喘)，病毒感染性疾病(例如，HIV，丙型或乙型肝炎感染，細(xì)菌感染(例如，鏈球菌或葡萄球菌感染)，變性疾病，特別是神經(jīng)變性疾病，例如肌肉萎縮癥，GvHD(例如，肝，腎或心)，或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病(特別是，但不限于下述疾病中風(fēng)，多發(fā)性硬化癥，帕金森氏癥，蛛網(wǎng)膜下出血，肌萎縮性側(cè)索硬化，遺傳退化性共濟失調(diào)，亨廷頓氏病，神經(jīng)病，癲癇癥，腦組織損傷，阿爾茨海默病)；肌松癥(例如，肌肉麻痹)，內(nèi)分泌疾病(例如，骨質(zhì)疏松癥或甲狀腺功能亢進(jìn))，皮膚病(例如，銀屑病，神經(jīng)性皮炎)；控制銳痛或鈍痛，遺傳性疾病以及心理疾病(例如，精神分裂癥或抑郁癥)，愈合傷口，改善性功能，心血管疾病(例如，局部缺血性梗塞，心機能不全，心律失常，高血壓)，提高大腦功能，神經(jīng)變性性疾病，特別是阿爾茨海默癡呆病和帕金森氏病，肌肉萎縮癥，病毒感染疾病，腫瘤，自身免疫病或大腦局部缺血。
26.一種鑒別ee3蛋白質(zhì)或其天然等位基因、片段、衍生物的細(xì)胞相互作用物質(zhì)的方法，其特征在于使用“酵母雙-雜交系統(tǒng)”。
27.權(quán)利要求1-4任意一項所述DNA序列或權(quán)利要求8-10任意一項所述基因產(chǎn)物用于鑒別參與ee3蛋白質(zhì)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)過程的其他蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及(i)DNA序列，(ii)含所述DNA序列的表達(dá)載體，(iv)含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，(v)由所述序列編碼的基因產(chǎn)物，(vi)用改變相關(guān)所述序列的轉(zhuǎn)基因動物，(vii)抗所述基因產(chǎn)物的抗體，(viii)表達(dá)和分離所述基因產(chǎn)物的方法，(iv)所述DNA序列或基因產(chǎn)物作為藥物的用途，(x)藥用組合物及其制備方法及和應(yīng)用，和(xi)所述DNA序列或基因產(chǎn)物的非治療用途。
文檔編號A61K45/00GK1694900SQ02825346
公開日2005年11月9日 申請日期2002年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月18日
發(fā)明者A·施奈德, M·莫勒, W·庫斯欽斯基, S·格雷內(nèi)瓦爾德, N·加斯勒 申請人:阿克薩隆生物科學(xué)股份公司