專利名稱：編碼重組的來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa抗原的核酸,和它們的應(yīng)用的制作方法
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背景技術(shù)：
在雞中導(dǎo)致被稱為“球蟲(chóng)病”的疾病的生物屬于頂復(fù)門(mén)(phylumApicomplexa)，孢子綱，球蟲(chóng)亞綱，真球蟲(chóng)目(order Eucoccidia)，艾美球蟲(chóng)亞目(suborder Eimeriorina)，艾美球蟲(chóng)科(family Eimeriidae)，艾美球蟲(chóng)屬(genus Eimeria)。在艾美球蟲(chóng)屬內(nèi)存在許多的種，其中幾種在雞中是致病的。對(duì)于雞產(chǎn)業(yè)主要關(guān)注的物種是柔嫩艾美球蟲(chóng)(Eimeria tenella)，巨型艾美球蟲(chóng)(Eimeria maxima)，堆型艾美球蟲(chóng)(Eimeria acervulina)，扁嘴艾美球蟲(chóng)(Eimeria necatrix)和布氏艾美球蟲(chóng)(Eimeria brunetti)。
在過(guò)去的幾十年中，球蟲(chóng)病已經(jīng)成為雞產(chǎn)業(yè)中的主要經(jīng)濟(jì)問(wèn)題，主要是由于雞場(chǎng)的過(guò)度擁擠和寄生蟲(chóng)抗藥性的發(fā)展。在干草地面上的擁擠條件下飼養(yǎng)雞為艾美球蟲(chóng)屬寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)和傳播提供了最適的條件。在該情形下，衛(wèi)生控制是不可能的，農(nóng)民必須依靠抑球蟲(chóng)劑藥物的效力。然而，必須將藥物一直保持在飼料中，必須使用穿梭計(jì)劃(shuttle program)以避免艾美球蟲(chóng)屬的耐藥品系出現(xiàn)，并且某些藥物具有昂貴的副作用。另外，這些抑球蟲(chóng)劑還具有抗菌效果并因此被認(rèn)為是進(jìn)料(in-feed)抗生素。最近歐盟已經(jīng)決定在雞產(chǎn)業(yè)中禁止使用包括抗球蟲(chóng)藥的所有進(jìn)料抗生素。因此，未來(lái)控制球蟲(chóng)病的唯一可行方法是通過(guò)疫苗開(kāi)發(fā)。
艾美球蟲(chóng)屬寄生蟲(chóng)在腸道的粘膜中經(jīng)歷復(fù)雜的生活周期。除了缺乏節(jié)肢動(dòng)物媒介，該生活周期與其它血孢子蟲(chóng)寄生蟲(chóng)(即瘧原蟲(chóng)屬，巴貝蟲(chóng)屬等)非常相似。卵囊在干草地面上形成孢子，產(chǎn)生4個(gè)孢囊，每個(gè)包含2個(gè)子孢子(因此屬于孢子綱)。卵囊被雞攝食，孢囊通過(guò)砂囊的機(jī)械研磨釋放。然后，由于在腸內(nèi)蛋白水解酶消化孢囊壁，子孢子從孢囊釋放。然后可移動(dòng)的子孢子侵入淋巴細(xì)胞并繼續(xù)侵入上皮細(xì)胞，在那里開(kāi)始無(wú)性生殖周期。寄生蟲(chóng)經(jīng)歷2-4個(gè)復(fù)制和分裂周期(每個(gè)物種具有確定的分裂數(shù))，導(dǎo)致大量子裂殖子的產(chǎn)生。在裂殖子產(chǎn)生的末循環(huán)之后開(kāi)始性周期，產(chǎn)生大配子母細(xì)胞(雌性)和小配子母細(xì)胞。大配子母細(xì)胞其特征在于成壁體(wall forming bodies)的產(chǎn)生，而小配子母細(xì)胞包含涉及小配子的形成的組分，小配子從胞內(nèi)寄生蟲(chóng)的表面出芽。
小配子是有鞭毛的并負(fù)責(zé)大配子的受精。形成合子，其通過(guò)成壁體的融合和細(xì)胞核的濃縮成熟為卵囊。卵囊分泌在糞便中，從而完成循環(huán)。
在過(guò)去幾年中，已經(jīng)使用源于巨型艾美球蟲(chóng)的性(配子母細(xì)胞)階段的天然抗原來(lái)免疫產(chǎn)卵的母雞。子代雞因此通過(guò)母體免疫(保護(hù)性母體抗體)接種。在巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞中先前已經(jīng)鑒定3種主要的保護(hù)性抗原，其具有250，82和56kDa的分子量(歐洲專利號(hào)0 256 536，美國(guó)專利號(hào)5,496,550，和美國(guó)專利號(hào)5,932,225)。歐洲專利號(hào)0 256 536，美國(guó)專利號(hào)5,496,550，和美國(guó)專利號(hào)5,932,225因此通過(guò)參考結(jié)合到本發(fā)明中以便更充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀況。已經(jīng)顯示這些抗原在艾美球蟲(chóng)屬的物種之間是很保守的(Wallach 1995)并且可以交叉保護(hù)免遭在肉用仔雞中導(dǎo)致球蟲(chóng)病的3種主要物種-巨型艾美球蟲(chóng)，柔嫩艾美球蟲(chóng)和堆型艾美球蟲(chóng)的侵襲。新近，顯示在地面圍欄試驗(yàn)(floor pen trials)中，源自用這些天然配子母細(xì)胞抗原接種的母雞的小雞在野外條件下被保護(hù)免遭艾美球蟲(chóng)屬侵襲(Wallach 1996)。該保護(hù)的作用為將卵囊釋放的峰值降低到對(duì)肉用仔雞的性能不導(dǎo)致任何破壞作用的水平?；谏鲜鼋Y(jié)果得出結(jié)論，這些抗原對(duì)雞的球蟲(chóng)病有效并有可能用于防止包括火雞，鵝，羊，牛，豬和魚(yú)的其它家畜的球蟲(chóng)病。
這3種抗原特征還在于分子水平。進(jìn)行無(wú)細(xì)胞翻譯實(shí)驗(yàn)以鑒定編碼它們的RNA分子(Mencher等)。通過(guò)免疫篩選在表達(dá)載體λzap中制備的cDNA文庫(kù)來(lái)克隆編碼這些抗原的cDNA分子(4，美國(guó)專利號(hào)5,932,225)。通過(guò)該方法，克隆和部分測(cè)序了編碼250kDa抗原的基因。在美國(guó)專利號(hào)5,932,225和5,496,550中部分測(cè)序了克隆pEM 250/14。本申請(qǐng)的圖8a復(fù)制美國(guó)專利號(hào)5,932,225和5,496,550的

圖11，其描繪了克隆pEM 250/14開(kāi)始的293個(gè)核苷酸的DNA序列。本申請(qǐng)的圖8b復(fù)制美國(guó)專利號(hào)5,932,225和5,496,550的圖12，其顯示了克隆pEM 250/14最后的196個(gè)核苷酸的DNA序列。此外，在美國(guó)專利號(hào)5,932,225和5,496,550中，克隆和測(cè)序了推定的編碼56和82kDa抗原的基因。
隨后，F(xiàn)ried等將整個(gè)pEM 250/14克隆測(cè)序并發(fā)現(xiàn)抗原具有230kDa的分子量而不是以前所認(rèn)為的250kDa。Fried等發(fā)現(xiàn)230kDa基因包含高度重復(fù)的基序并且貫穿整個(gè)基因包含這些重復(fù)(Fried等)。使用pATH質(zhì)粒載體在細(xì)菌中表達(dá)該克隆，顯示它被在感染巨型艾美球蟲(chóng)14天后采取的恢復(fù)期的雞血清識(shí)別。最后，顯示該基因只在大配子母細(xì)胞階段表達(dá)，并通過(guò)免疫熒光發(fā)現(xiàn)位于大配子的成壁體中(Fried等)。
通過(guò)使用針對(duì)56kDa抗原的多克隆抗體以及單克隆抗體篩選文庫(kù)還獲得編碼56和82kDa抗原的cDNA克隆。先前顯示該單克隆抗體給幼雞提供被動(dòng)免疫(Wallach 1990)。獲得并分析幾個(gè)克隆。發(fā)現(xiàn)克隆中的一個(gè)編碼10kDa的小抗原，因此不是所需克隆。發(fā)現(xiàn)另一個(gè)克隆只包含可讀框(ORF)的一小部分，并通過(guò)RNA印跡法顯示與對(duì)于56和82kDa抗原差不多期望大小的兩條mRNA雜交。因此得出結(jié)論這是所需克隆。然后篩選基因組文庫(kù)以獲得全長(zhǎng)克隆。然而，由于在該克隆中高度重復(fù)的GCA基序，不可能特異性地分離全長(zhǎng)克隆。由于這些重復(fù)導(dǎo)致克隆全長(zhǎng)cDNA分子的嘗試也不成功。最后，可能由于它們的異常序列在細(xì)菌中表達(dá)部分cDNA克隆的嘗試也失敗了，未獲得合理的基因表達(dá)水平。先前已經(jīng)顯示56和82kDa抗原是糖基化的(美國(guó)專利號(hào)5,932,225)。這是基于它們與大豆凝集素的強(qiáng)烈反應(yīng)性。因此，可能需要糖基化作用以便獲得這些基因的良好表達(dá)和基因產(chǎn)物的正確構(gòu)象。
除了56，82和230kDa抗原以外，從高度純化的卵囊壁的級(jí)分中獲得的14kDa抗原已經(jīng)被提議作為防止球蟲(chóng)病的疫苗的可能候選物(Eschenbacher等)。然而，該假說(shuō)沒(méi)有被研究。
幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)正在研究針對(duì)球蟲(chóng)病的亞單位疫苗。這些研究人員大部分已經(jīng)將它們的努力集中在生活周期的胞外無(wú)性繁殖階段，特別是子孢子和裂殖子階段，其被認(rèn)為是最易受免疫攻擊。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)來(lái)自柔嫩艾美球蟲(chóng)的子孢子提取物可以在肉仔雞中誘導(dǎo)針對(duì)該寄生蟲(chóng)的保護(hù)以防攻擊感染達(dá)7周齡(Karkhanis等)。使用針對(duì)來(lái)源于柔嫩艾美球蟲(chóng)子孢子的抗原的單克隆抗體進(jìn)行的工作導(dǎo)致25,000分子量抗原的鑒定，其被克隆和測(cè)序(歐洲專利公開(kāi)號(hào)0 164 176，1985年12月11日)。鑒定了其它幾個(gè)子孢子基因并且檢驗(yàn)它們的重組抗原或轉(zhuǎn)化細(xì)菌本身的保護(hù)性免疫(Danforth等)。結(jié)果顯示這些重組體只能提供針對(duì)艾美球蟲(chóng)屬攻擊感染的相對(duì)低水平的保護(hù)，并不一定防止顯著病變的出現(xiàn)。
也已經(jīng)檢驗(yàn)使用來(lái)源于裂殖子階段的抗原的疫苗(歐洲專利公開(kāi)號(hào)0135 073)。使用這些抗原來(lái)免疫幼肉仔雞，再次發(fā)現(xiàn)提供的保護(hù)是相對(duì)低的(Danforth等)。
在1993年，發(fā)現(xiàn)在保護(hù)性母體免疫和針對(duì)巨型艾美球蟲(chóng)230kDa裂殖子(與配子母細(xì)胞相對(duì))抗原的母體抗體的出現(xiàn)之間存在相關(guān)性(Smith等)。該保護(hù)經(jīng)常是在90％以上并發(fā)現(xiàn)即使當(dāng)母體抗體水平相對(duì)低(盡管與230kDa蛋白質(zhì)的反應(yīng)性仍然強(qiáng)烈)的時(shí)候也存在。還發(fā)現(xiàn)從SDS-PAGE凝膠切割的極少量的天然230kDa裂殖子抗原可以在子代雞中誘導(dǎo)針對(duì)巨型艾美球蟲(chóng)感染的顯著(60％)水平的保護(hù)性母體免疫。另外，蛋白質(zhì)印跡顯示該蛋白質(zhì)在巨型艾美球蟲(chóng)的裂殖子和子孢子中都表達(dá)，并且在艾美球蟲(chóng)屬的物種之間也很保守。
然而，從寄生蟲(chóng)它本身大規(guī)模地分離巨型艾美球蟲(chóng)裂殖子的230kDa抗原是非常困難的。因此，需要克隆和重組表達(dá)該抗原。這將能夠生產(chǎn)用于接種的抗原和檢驗(yàn)它誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的最適濃度。
發(fā)明概述本發(fā)明提供分離的核酸或核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或者編碼該多肽的同源物的核苷酸序列。
本發(fā)明另外提供生產(chǎn)重組的來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa多肽的方法，其包含培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和分離重組的來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞包含分離的核酸或核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或者編碼該多肽的同源物的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供針對(duì)柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉活性抗原的微生物的疫苗，其包含分離的核酸或核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，或者編碼該多肽的同源物的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供另外包含從巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞中分離的56kDa，82kDa或230kDa蛋白質(zhì)或其混合物的上述疫苗。
本發(fā)明還提供針對(duì)球蟲(chóng)病的疫苗，其包含重組的250kDa抗原。
本發(fā)明還提供免疫受試者以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉活性抗原的微生物的感染的方法，其包含向受試者施用上述疫苗中任何一種的步驟。
本發(fā)明還提供分離的核酸或核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼具有SEQ.ID.NO26所示氨基酸序列、來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，或編碼該多肽的同源物的核苷酸序列。
附圖簡(jiǎn)述圖1使用來(lái)源于母體免疫試驗(yàn)的血清和卵黃，巨型艾美球蟲(chóng)形成孢子的卵囊的粗提物的蛋白質(zhì)印跡。泳道1-感染巨型艾美球蟲(chóng)的母雞的12日齡孵化小雞(hatchling)的血清，其也暴露于攻擊感染；泳道2-來(lái)自感染巨型艾美球蟲(chóng)的母雞的3日齡孵化小雞的血清；泳道3-來(lái)自使用SDS-PAGE剪切塊(cutout)250kDa裂殖子蛋白質(zhì)條帶免疫的母雞的卵黃；泳道4-來(lái)自用裂殖子粗提物免疫的母雞的血清。用圖左邊的箭頭顯示250kDa條帶。
圖2使用各種濃度的NaCl，來(lái)自DEAE-sephacel柱的形成孢子的卵囊的洗脫圖(OD 280)。
圖3離子交換分級(jí)的形成孢子的卵囊提取物的銀染色(3a)和蛋白質(zhì)印跡(3b)分析。使用來(lái)源于用裂殖子粗提物免疫的母雞的血清進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。在左邊顯示250kDa蛋白質(zhì)條帶。
圖4來(lái)自DEAE柱的形成孢子的卵囊提取物級(jí)分的蛋白質(zhì)印跡分析，其是用來(lái)自通過(guò)活體感染(live infection)免疫的母雞3日齡的子代雞的血清檢測(cè)。用于洗脫的NaCl濃度在印跡的底部顯示，用箭頭顯示250kDa蛋白質(zhì)條帶。
圖5來(lái)源于PCR的擴(kuò)增的cDNA產(chǎn)物，PCR使用對(duì)編碼250kDa抗原的基因的3’和5’末端特異的基因特異性引物。泳道1顯示DNA標(biāo)記帶，泳道2顯示7 KB PCR產(chǎn)物的條帶。
圖6 250kDa cDNA克隆的完整DNA序列。顯示編碼序列，它的互補(bǔ)序列和氨基酸序列(SEQ.ID.NOs.1-3)。
圖7A&7B 250kDa cDNA巨型艾美球蟲(chóng)克隆與來(lái)自專利WO90/00403.7A)的同源DNA序列的多重序列對(duì)比，DNA序列對(duì)比顯示60％的同源性(SEQ.ID.Nos.4-5.7B)，蛋白質(zhì)序列對(duì)比顯示59％的同源性(SEQ.ID.NOs.6-7)。
圖8a描述克隆pEM 250/14開(kāi)始的293個(gè)核苷酸的DNA序列。顯示編碼序列和它的氨基酸序列(SEQ.ID.NOs.11-12)。圖8b描述克隆pEM250/14最后的196個(gè)核苷酸的DNA序列。顯示編碼序列和它的氨基酸序列(SEQ.ID.NOs.13-14)。
圖9在5％聚丙烯酰胺凝膠上所分離巨型艾美球蟲(chóng)形成孢子的卵囊的粗提物的蛋白質(zhì)印跡分析，其使用選擇的來(lái)自母體免疫試驗(yàn)的血清和卵黃(Smith等，1995)。泳道1，來(lái)自感染巨型艾美球蟲(chóng)的母雞的3日齡孵化小雞的血清；泳道2，在孵化小雞感染巨型艾美球蟲(chóng)之后，感染巨型艾美球蟲(chóng)的母雞的12日齡孵化小雞的血清；泳道3，來(lái)自用裂殖子粗提物免疫的母雞的血清；泳道4，來(lái)自用250kDa裂殖子蛋白質(zhì)條帶的SDS-PAGE剪切塊免疫的母雞的卵黃；泳道5，來(lái)自未感染的對(duì)照組的血清。
圖10巨型艾美球蟲(chóng)形成孢子的卵囊粗提物的DEAE離子交換層析。將大約1.0mg提取物加入柱子并用在40mM Tris.HCL pH8.0中的0.0-1MNaCL的分級(jí)梯度以0.7mL/min的流速洗脫。手動(dòng)收集級(jí)分，級(jí)分大小為10-15mL。
圖11離子交換分級(jí)的巨型艾美球蟲(chóng)形成孢子的卵囊提取物的銀染色(a)和蛋白質(zhì)印跡分析(b)。將15μl的每個(gè)級(jí)分加樣在平行的7.5％SDS-PAGE凝膠上并在還原條件下電泳。用來(lái)源于使用裂殖子粗提物免疫的母雞的血清免疫檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡。(*柱流通(flow-through)(未結(jié)合的蛋白質(zhì)級(jí)分)。)圖12富集免疫顯性蛋白質(zhì)并且在還原條件下的5％SDS-PAGE凝膠上電泳的離子交換層析級(jí)分的銀染色(a)和蛋白質(zhì)印跡分析(b)。用保護(hù)性母體抗血清免疫檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡，該抗血清收獲自在孵化小雞感染巨型艾美球蟲(chóng)之后在孵化小雞感染巨型艾美球蟲(chóng)之后，感染巨型艾美球蟲(chóng)的母雞的12日齡孵化小雞。(*分子量標(biāo)記(2μL))圖13富集免疫顯性蛋白質(zhì)的離子交換層析級(jí)分的Superdex 200凝膠過(guò)濾層析。合并用0.3-0.4M NaCL從10mg形成孢子的卵囊粗提物洗脫的IEX級(jí)分，并濃縮至15μL的樣品體積。將樣品加樣到柱上并以50μL/min的流速洗脫。如所示自動(dòng)收集50μL大小的級(jí)分。
圖14在7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離的凝膠過(guò)濾層析級(jí)分的銀染色。在還原條件下電泳來(lái)自級(jí)分7-15中每一個(gè)的10μL樣品。泳道1，分子量標(biāo)記(Amersham Rainbow MWM，2μL)；泳道2，級(jí)分7；泳道3，級(jí)分8；泳道4，級(jí)分9；泳道5，級(jí)分10；泳道6，級(jí)分11；泳道7，級(jí)分12；泳道8，級(jí)分13；泳道9，級(jí)分14；泳道10，級(jí)分15。箭頭顯示免疫顯性蛋白質(zhì)。
圖15 Triton X-114分級(jí)的裂殖子的蛋白質(zhì)印跡分析，所述裂殖子用來(lái)自使用巨型艾美球蟲(chóng)的裂殖子粗提物免疫的母雞的血清來(lái)免疫檢測(cè)。如所示在非離子型去污劑EX-114中分配純化的裂殖子。泳道1，TX-114水溶性級(jí)分；泳道2，TX-114去污劑可溶性級(jí)分；泳道3，TX-114去污劑不溶性級(jí)分。(*柱流通(未結(jié)合的蛋白質(zhì)級(jí)分)。)圖16來(lái)源于無(wú)性和有性發(fā)育階段的巨型艾美球蟲(chóng)的抗原粗提物的蛋白質(zhì)印跡分析。在還原條件下在7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳10μg如上所述制備的每種提取物的樣品。泳道1，形成孢子的卵囊提取物；泳道2，裂殖子提取物；泳道3，配子母細(xì)胞提取物。使用來(lái)自感染裂殖子粗提物的母雞的血清來(lái)免疫檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡。
圖17巨型艾美球蟲(chóng)Houghton品系和巨型艾美球蟲(chóng)和柔嫩艾美球蟲(chóng)的澳大利亞品系的形成孢子的卵囊粗提物的蛋白質(zhì)印跡分析，其使用來(lái)自感染來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)Houghton品系的裂殖子粗提物的母雞的血清來(lái)免疫檢測(cè)。將10μg每種提取物的樣品加樣到7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上并在還原條件下電泳。A，泳道1，Houghton巨型艾美球蟲(chóng)；泳道2，澳大利亞巨型艾美球蟲(chóng)。B，泳道1，澳大利亞巨型艾美球蟲(chóng)；泳道2，澳大利亞柔嫩艾美球蟲(chóng)。
圖18在還原和非還原條件下在7.5％(A)和5％(B)SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離的免疫顯性蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡分析。在樣品緩沖液中含有或不含2-β-巰基乙醇的情況下電泳富集免疫顯性蛋白質(zhì)的離子交換層析級(jí)分。A泳道1，不含β-ME；泳道2，2.5％β-ME；泳道3，3.75％β-ME；泳道4，5％β-ME；泳道5，7.5％β-ME；泳道6，10％β-ME。B泳道1，不含β-ME；泳道2，2.5％β-ME。用來(lái)自感染裂殖子粗提物的母雞的抗血清來(lái)免疫檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡。
圖19從巨型艾美球蟲(chóng)形成孢子的卵囊中分離出的并通過(guò)在1％非變性瓊脂糖凝膠上電泳分離的總RNA，泳道1，1μgλDNA/EcoRI+HindIII標(biāo)記；泳道2，2.5μg形成孢子的卵囊RNA。顯示28S和18S核糖體RNA條帶。
圖20巨型艾美球蟲(chóng)免疫顯性蛋白質(zhì)的胰蛋白酶肽#1和來(lái)自柔嫩艾美球蟲(chóng)的EtMIC4和表面抗原5401的所選基序之間的相似性。在基于EmIP的胰蛋白酶肽#1設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并PCR引物中考慮保守半胱氨酸殘基(以黑體字顯示)。記錄基序的號(hào)碼指它們各自在EtMIC4/5401氨基酸序列內(nèi)部的位置。(SEQ.ID NOS.15-19)圖21使用簡(jiǎn)并引物FP008來(lái)3’RACE擴(kuò)增巨型艾美球蟲(chóng)的形成孢子的卵囊的cDNA。在1％瓊脂糖凝膠上分離反應(yīng)樣品和分子量標(biāo)記。泳道1，1μgλDNA/EcoRI+HindIII標(biāo)記；泳道2，10μL 100bp的DNA序列梯。
圖22與使用引物FP008產(chǎn)生的3’RACE PCR產(chǎn)物的翻譯序列共享同源性的蛋白質(zhì)序列。通過(guò)NCBI提交445bp的查詢以進(jìn)行針對(duì)所有非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTX分析。列出10個(gè)最高分并顯示最有意義分?jǐn)?shù)的對(duì)比。(SEQ.ID NO.20)圖23編碼EmIP的中間cDNA產(chǎn)物的產(chǎn)生和在0.8％瓊脂糖凝膠上分離。用簡(jiǎn)并引物FP004和基因特異性引物RP016的擴(kuò)增產(chǎn)生微弱可見(jiàn)的，大約6kb的適當(dāng)大小的條帶(A，泳道2)。凝膠純化條帶，并通過(guò)使用簡(jiǎn)并引物FP006和基因特異性引物RP015的巢式PCR反應(yīng)表征。擴(kuò)增大約6kb的期望大小的條帶(B，泳道2)，并用箭頭顯示。A泳道1和B泳道1，1μgλDNA/EcoRI+HindIII標(biāo)記；A標(biāo)記2和B泳道1，1μgλDNA/EcoRI+HindIII標(biāo)記；A泳道2和B泳道2，10μL如所示的PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
圖24編碼EmIP的CDNA的5’末端的擴(kuò)增。在5’RACE反應(yīng)中與AP1一起使用基因特異性引物RP019和RP020(分別泳道2和3)。在泳道3中可見(jiàn)的500-600bp的產(chǎn)物進(jìn)一步通過(guò)使用引物RP019和AP2的巢式PCR反應(yīng)表征(泳道4)。泳道1，1μgλDNA/EcoRI+HindIII標(biāo)記；泳道2，3和4，10μL如所示的PCR反應(yīng)產(chǎn)物。在0.8％的瓊脂糖凝膠上分析樣品。
圖25用引物AP2和RP019產(chǎn)生的5’PCR產(chǎn)物的部分DNA序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列。推定的起始甲硫氨酸是以黑體字顯示在位置231處，上游符合讀框的TAG密碼子在位置186處。給通過(guò)Edman測(cè)序預(yù)測(cè)的成熟蛋白質(zhì)的N-末端序列加上方框。(SEQ.ID.NOS.21-23)圖26編碼完整的成熟巨型艾美球蟲(chóng)免疫顯性蛋白質(zhì)的cDNA的產(chǎn)生。分別從5’和3’RACE序列設(shè)計(jì)的基因特異性引物FP015和RP023擴(kuò)增約7kb的單一PCR產(chǎn)物(泳道2)。泳道1，1μgλDNA/HindIII標(biāo)記；泳道2，10μL如所示的PCR反應(yīng)產(chǎn)物。在0.8％的瓊脂糖凝膠上分離樣品。
圖27用于克隆巨型艾美球蟲(chóng)免疫顯性蛋白質(zhì)的cDNA的PCR策略的圖解概要。該圖描述產(chǎn)生不同cDNA片段的順序。底部的橫條表示全長(zhǎng)cDNA。帶箭頭的線條表示通過(guò)指示的引物對(duì)擴(kuò)增的重疊的cDNA區(qū)域(也通過(guò)在括號(hào)中相應(yīng)的bp數(shù)顯示)圖28使用巨型艾美球蟲(chóng)免疫顯性蛋白質(zhì)推定的cDNA編碼區(qū)的BLASTN相似性搜索。列出5個(gè)最高的分?jǐn)?shù)并且顯示具有最有意義的分?jǐn)?shù)-EtMIC4的mRNA-的對(duì)比。(SEQ.ID NO.24)圖29巨型艾美球蟲(chóng)免疫顯性蛋白質(zhì)的核苷酸和預(yù)測(cè)的氨基酸序列。(SEQ.ID NOS.25-26)序列來(lái)源于編碼完整的成熟蛋白和重疊5’和3’RACE產(chǎn)物的cDNA克隆。在預(yù)測(cè)的信號(hào)序列下劃線并給成熟蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸序列加上方框。
圖30 CLUSTALW(4.1)對(duì)比，其顯示存在于巨型艾美球蟲(chóng)免疫顯性蛋白質(zhì)內(nèi)的預(yù)測(cè)的TSP-1樣結(jié)構(gòu)域。以50％同一性的截止確定共有序列，其顯示W(wǎng)XXW和RXR基序(加下劃線)。高度保守的半胱氨酸以黑體字顯示。
圖31存在于巨型艾美球蟲(chóng)免疫顯性蛋白質(zhì)內(nèi)、預(yù)測(cè)的EGF-系樣結(jié)構(gòu)域的CLUSTALW(4.1)對(duì)比。以75％同一性的截止確定共有序列，以黑體字顯示高度保守半胱氨酸殘基。
圖32在預(yù)測(cè)的巨型艾美球蟲(chóng)免疫顯性蛋白質(zhì)的多肽序列內(nèi)的低復(fù)雜性區(qū)域A突出低復(fù)雜性區(qū)域1的簡(jiǎn)并重復(fù)基序的CLUSTALW(4.1)對(duì)比。共有序列顯示保守的同一性，通過(guò)‘.’顯示的殘基之間的相似性。B低復(fù)雜性區(qū)域2，其顯示高頻率的谷氨酸，甘氨酸和脯氨酸殘基。
圖33 EmIP和其它屬于頂復(fù)蟲(chóng)(apicomplexan)微絲蛋白質(zhì)TRAP家族的蛋白質(zhì)的跨膜和胞質(zhì)尾區(qū)的對(duì)比。在推定的跨膜區(qū)域下劃線，保守酪氨酸和色氨酸殘基以黑體顯示。序列是來(lái)源于下列生物巨型艾美球蟲(chóng)(EmIP，EmIP100)；柔嫩艾美球蟲(chóng)(EtMIC4，EtMICl/Etp100)；隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidum parvum)(cpTRAPC1，CpGP900)；Neospara caninum(NcTRAP)；惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)(PfTRAP PFCTRP)；伯氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium berghei)(PbTRAP)；晨瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumrelictum)(PrTRAP)；諾氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium knowlesi)(PkDBP)；鼠肉孢子蟲(chóng)(Sarcocystis muris)(Sm70)；鼠弓形體(Toxoplasma gondii)(TgMIC2，TgMIC6，TgMIC7，TgMIC8，TgMIC9，TgAMAl)。(SEQ.ID NOS.27-41)圖34顯示主要結(jié)構(gòu)特征的巨型艾美球蟲(chóng)的免疫顯性蛋白質(zhì)的圖示。
圖35與巨型艾美球蟲(chóng)免疫顯性蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)氨基酸序列共享同源性的蛋白質(zhì)序列。通過(guò)NCBI提交表示成熟蛋白質(zhì)的序列以進(jìn)行針對(duì)所有非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTP分析。列出20個(gè)具有最高顯著性的對(duì)比。
圖36在使用GAP程序?qū)Ρ群箫@示EmIP和EtMIC4氨基酸序列之間的相似性的GAPSHOW圖。頂部未斷開(kāi)的線表示EmIP(2360個(gè)殘基)，底部未斷開(kāi)的線表示EtMIC4(2189個(gè)殘基)。相似性是通過(guò)中間的垂直線表示。較小的垂直線(在EmIP下和在EtMIC4上)表示在對(duì)比中插入的缺口。
圖37貫穿巨型艾美球蟲(chóng)的發(fā)育階段免疫顯性蛋白質(zhì)的檢測(cè)。使用對(duì)EmIP和HSP70特異性的引物將裂殖子或配子母細(xì)胞的信使RNA進(jìn)行RT-PCR。隨后將RT反應(yīng)產(chǎn)物用作模板，使用對(duì)EmIP或HSP70的基因特異性引物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。泳道1，100bp DNA序列梯(1μg)；泳道2，使用EmIP引物擴(kuò)增的形成孢子的卵囊cDNA(陽(yáng)性對(duì)照，2μL)；泳道3，用EmIP引物擴(kuò)增的裂殖子RT反應(yīng)產(chǎn)物(10μL)，泳道5，用HSP70引物擴(kuò)增的裂殖子RT反應(yīng)產(chǎn)物(陽(yáng)性對(duì)照，10μL)；泳道6，用HSP70引物擴(kuò)增的配子母細(xì)胞RT反應(yīng)產(chǎn)物(陽(yáng)性對(duì)照，10μL)；泳道7，用EmIP引物擴(kuò)增的裂殖子無(wú)RT反應(yīng)產(chǎn)物(陰性對(duì)照，10μL)；泳道8，用EmIP引物擴(kuò)增的配子母細(xì)胞無(wú)RT反應(yīng)產(chǎn)物(陰性對(duì)照，10μL)；泳道9，用EmIP引物擴(kuò)增的無(wú)模板反應(yīng)產(chǎn)物(陰性對(duì)照，10μL)。
圖38限制酶消化巨型艾美球蟲(chóng)基因組DNA的DNA印跡分析。用各種限制性內(nèi)切酶消化大約2.5μg DNA樣品并如所示在0.9％的瓊脂糖上分離。泳道1，BglII；泳道2，EcoRI；泳道3，HindIII；泳道4，NcoI；泳道5，NdeI；泳道6，NsiI。使用EmIP基因特異性引物FP015和RP033產(chǎn)生的32P標(biāo)記的1590bp cDNA片段進(jìn)行雜交。
圖39編碼巨型艾美球蟲(chóng)免疫顯性蛋白質(zhì)的基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)的PCR分析。使用基因特異性引物對(duì)從cDNA和基因組DNA擴(kuò)增相應(yīng)的基因片段。在0.8％瓊脂糖凝膠上分離來(lái)自每個(gè)反應(yīng)的10μL樣品。泳道1，1μgλDNA/EcoRI+HindIII標(biāo)記；泳道2和3，分別用引物對(duì)FPA015/RP033擴(kuò)增的cDNA和基因組DNA；泳道4和5，分別用引物對(duì)FP021/RP030擴(kuò)增的cDNA和基因組DNA；泳道6和7，分別用引物對(duì)FP010/RP023擴(kuò)增的cDNA和基因組DNA；泳道10，1μg 100bp DNA序列梯。
圖40通過(guò)引物FP010和RP023產(chǎn)生的部分基因組DNA序列。在擴(kuò)增的基因片段內(nèi)檢測(cè)到的2個(gè)內(nèi)含子以下劃線表示。
圖41顯示為了設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物CP003和CP004所選區(qū)域(黑體字)的EmIP和EtMIC4氨基酸序列的ClustalW(4.1)對(duì)比。相同的殘基用“*”標(biāo)記，相似的殘基用“.”標(biāo)記。
圖42通過(guò)PCR和DNA印跡分析在艾美球蟲(chóng)屬的澳大利亞品系中EmIP同源的檢測(cè)。使用簡(jiǎn)并引物CP003和CP004，如上所述從基因組DNA樣品產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。在0.8％瓊脂糖凝膠上分離反應(yīng)樣品(10μL)；泳道2，堆型艾美球蟲(chóng)，泳道3，布氏艾美球蟲(chóng)；泳道4，巨型艾美球蟲(chóng)；泳道5，緩艾美球蟲(chóng)；泳道6，扁嘴艾美球蟲(chóng)；泳道7，早熟艾美球蟲(chóng)；泳道8，柔嫩艾美球蟲(chóng)。(泳道1，1μg100bp序列梯)。通過(guò)DNA雜交檢測(cè)產(chǎn)物，其使用Houghton品系的巨型艾美球蟲(chóng)基因組DNA探針，該探針是使用引物CP003和CP004產(chǎn)生的。將膜曝露于X光片10(A)和30(B)分鐘的時(shí)間。
圖43A&B重組形式的56kDa和82kDa配子母細(xì)胞抗原的雞免疫原性試驗(yàn)的ELISA結(jié)果。所有的血清樣品在1∶1000的稀釋度下檢驗(yàn)。A)包被抗原檢驗(yàn)抗APGA血清的APGA；純化以檢驗(yàn)取自用PBS，F(xiàn)IA和兩劑量r56免疫的雞的血清的r56。B)包被抗原檢驗(yàn)抗APGA血清的APGA；r82純化的蛋白質(zhì)，以檢驗(yàn)取自用PBS，F(xiàn)IA和兩劑量r82免疫的雞的血清。
圖44來(lái)自250kDa無(wú)性繁殖階段的蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)片段的DNA和編碼的氨基酸序列。
圖45 250kDa無(wú)性繁殖階段蛋白質(zhì)的重組片段的小鼠免疫原性試驗(yàn)。顯示對(duì)于3次連續(xù)放血每組的平均值，顯示標(biāo)準(zhǔn)誤差條線。所有的血清樣品在1∶1000的稀釋度下檢驗(yàn)。包被抗原是來(lái)自陽(yáng)性對(duì)照APGA組的血清的100ng APGA，或陰性對(duì)照PBS和PBS/FIA組的100ng重組蛋白質(zhì)和2個(gè)重組蛋白質(zhì)劑量(r0.5μg和r5μg)。
圖46 250kDa無(wú)性繁殖階段蛋白質(zhì)的重組片段的雞免疫原性試驗(yàn)。顯示對(duì)于3次連續(xù)放血的每組的平均值，顯示標(biāo)準(zhǔn)誤差條線。所有的血清樣品在1∶1000的稀釋度下檢驗(yàn)。包被抗原是來(lái)自陽(yáng)性對(duì)照APGA組的血清的100ng APGA，或陰性對(duì)照PBS和PBS/FIA組的100ng重組蛋白質(zhì)和2個(gè)重組蛋白質(zhì)劑量(1μg和r10μg)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供分離的核酸或核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
先前認(rèn)為，來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的抗原是230kDa的抗原。然而，我們隨后的研究已經(jīng)顯示該抗原實(shí)際上是巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa抗原。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽具有圖7b所示的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.6)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有大于59％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少70％的同一性。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少75％的同一性。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少80％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少85％的同一性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少90％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少93％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少95％的同一性。
在一個(gè)附加實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少97％的同一性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少99％的同一性。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，核苷酸序列與如圖7a所示的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)具有大于60％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少70％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少75％的同一性。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少93％的同一性。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少97％的同一性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少99％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸是DNA分子。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，DNA分子是cDNA分子。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，核酸具有如圖7a所示的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸是RNA分子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將分離的核酸有效地連接到RNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子上。
本發(fā)明還包括一種包含分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列的載體，所述分離的核酸包含編碼來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體包含具有圖7a所示的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)的核酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體是質(zhì)粒。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含具有圖7a所示的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)的核酸。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列，所述核酸包含編碼來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)粒是命名為230.1質(zhì)粒的質(zhì)粒(澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室保藏號(hào)NM01/22396)。
本發(fā)明還包含宿主細(xì)胞，其包含載體，所述載體包含分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含載體，所述載體包含具有圖7a所示的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)的核酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自細(xì)菌細(xì)胞；植物細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞；和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明另外提供包含分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述分離的核酸包含編碼來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞是在細(xì)菌中命名為230.1的轉(zhuǎn)化細(xì)胞(澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室保藏號(hào)NM01/22397)。
在2001年6月26日將編碼250kDa抗原的本質(zhì)粒保藏在澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室，Pymble，澳大利亞，保藏號(hào)為NM01/22396。在2001年6月26日將用250kDa抗原轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞保藏在澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室，Pymble，澳大利亞，保藏號(hào)為NM01/22397。兩個(gè)保藏都是按照用于專利程序目的的關(guān)于微生物存放的國(guó)際認(rèn)可的布達(dá)佩斯條約進(jìn)行。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞另外包含來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或所述多肽的同源物。
本發(fā)明另外包含一種生產(chǎn)重組的來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa多肽的方法，其包含培養(yǎng)包含分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和分離重組的來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，所述分離的核酸包含編碼來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。本發(fā)明也包含通過(guò)該方法生產(chǎn)的重組多肽。
本發(fā)明還提供一種針對(duì)柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物的疫苗，其包含分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在疫苗的一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸是質(zhì)粒。
另外，本發(fā)明提供一種針對(duì)柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物的疫苗，其包含重組的來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，該重組多肽是通過(guò)培養(yǎng)包含分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和分離重組的來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽來(lái)生產(chǎn)的，所述分離的核酸包含編碼來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗由本發(fā)明的分離的核酸和本發(fā)明的重組多肽的混合物組成。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗由本發(fā)明的分離的核酸，本發(fā)明的重組多肽和包含本發(fā)明的分離的核酸的質(zhì)粒的混合物組成。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，疫苗另外包含第二種抗原。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第二種抗原選自編碼來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的抗原的核酸，包含該核酸的質(zhì)粒，和由該核酸編碼的多肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第二種抗原是從巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞中分離的56kDa蛋白質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第二種抗原是從巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞中分離的82kDa蛋白質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第二種抗原是從巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞中分離的230kDa蛋白質(zhì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗另外包含從巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞中分離的56kDa蛋白質(zhì)和82kDa蛋白質(zhì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗另外包含從巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞中分離的56kDa蛋白質(zhì)，82kDa蛋白質(zhì)和230kDa蛋白質(zhì)。
在美國(guó)專利號(hào)5,932,225和5,496,550中描述了巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取和表征，這些專利的內(nèi)容因此通過(guò)參考結(jié)合到本申請(qǐng)中。簡(jiǎn)要地，每只雞感染10,000卵囊，然后在感染幾天后將其處死。切除腸并通過(guò)在以上參考專利的實(shí)施例1中描述的兩種方法之中的一種提取配子母細(xì)胞。然后使用各種去污劑從配子母細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，并通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢驗(yàn)提取的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)具有10-300kDa的分子量，5種主要的代謝標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子量為約82kDa，73kDa，56kDa，和35kDa。然后通過(guò)無(wú)細(xì)胞翻譯產(chǎn)物的ELISA，免疫熒光，蛋白印跡和免疫沉淀來(lái)分析蛋白質(zhì)。蛋白印跡在雞血清中在82，56和43kDa處檢測(cè)到3條主要條帶，并在250，116，78，52和36kDa處檢測(cè)到次要的條帶。克隆部分250kDa蛋白質(zhì)并同樣測(cè)序。Fried等隨后克隆和測(cè)序了整個(gè)250kDa配子母細(xì)胞蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供免疫受試者以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的方法，其包含向受試者施用本發(fā)明的疫苗的步驟。
在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是選自牛，羊，豬和魚(yú)的物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是鳥(niǎo)類物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種是雞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，施用步驟包含將疫苗噴霧到受試者的鼻孔中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用是在卵內(nèi)(in ovo)進(jìn)行。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用是針對(duì)卵的氣囊，因此使胚胎與疫苗接觸。
本發(fā)明還提供給予鳥(niǎo)類物種的新生受試者以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的母體免疫(抗體)的方法，其包含在產(chǎn)受精卵之前適當(dāng)?shù)臅r(shí)間向受試者的母體施用本發(fā)明的疫苗，以便由此在新生的受試者中通過(guò)母體免疫給予保護(hù)以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的步驟。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
本發(fā)明還提供一種減少在鳥(niǎo)類物種新生受試者的糞便中艾美球蟲(chóng)屬卵囊排出量的方法，其包含在產(chǎn)受精卵之前適當(dāng)?shù)臅r(shí)間向受試者的母體施用本發(fā)明的疫苗，以便誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和將母體抗體傳遞給新生兒以使來(lái)自新生兒的卵囊排出量減小的步驟。
在另外的實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
本發(fā)明還提供免疫受試者以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的方法，其包含向受試者施用活疫苗的步驟，所述活疫苗包含表達(dá)來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa多肽的活的非毒性微生物或活病毒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，活病毒是痘病毒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是選自牛，羊，豬和魚(yú)的物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是鳥(niǎo)類物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
本發(fā)明還提供免疫受試者以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的方法，其包含向受試者給料植物的步驟，所述植物的細(xì)胞表達(dá)來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是小麥。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物是玉米。
在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是選自牛，羊，豬和魚(yú)的物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是鳥(niǎo)類物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
本發(fā)明還提供免疫受試者以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的方法，其包含向受試者施用包含分離的核酸或核酸的互補(bǔ)序列的質(zhì)粒的步驟，所述分離的核酸包含編碼來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是選自牛，羊，豬和魚(yú)的物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是鳥(niǎo)類物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
本發(fā)明還包含來(lái)自鳥(niǎo)類物種的受精卵，其具有用本發(fā)明的疫苗接種的氣囊，所述疫苗能夠在孵化前或孵化后立即在胚胎中誘導(dǎo)抗有毒力形式的柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物的免疫應(yīng)答。
在一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，鴨，火雞，鵝，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種是雞。
本發(fā)明還提供分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼具有如SEQ.ID NO.26所示的氨基酸序列、來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有大于59％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少70％的同一性。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少75％的同一性。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少80％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少85％的同一性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少90％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少93％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少95％的同一性。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少97％的同一性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的同源物與具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少99％的同一性。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有大于60％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少70％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少75％的同一性。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少93％的同一性。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少97％的同一性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少99％的同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸是DNA分子。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，DNA分子是cDNA分子。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，核酸具有如SEQ.ID.NO.25所示的核苷酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸是RNA分子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將分離的核酸有效地連接到RNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上。
本發(fā)明還包括一種包含分離的核酸或核酸的互補(bǔ)序列的載體，所述分離的核酸包含編碼具有如SEQ.ID NO.26所示的氨基酸序列、來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體包含具有如SEQ.ID.NO.25所示的核苷酸序列的核酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體是質(zhì)粒。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含具有如SEQ.ID.NO.25所示的核苷酸序列的核酸。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼具有如SEQ.ID NO.26所示的氨基酸序列、來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
本發(fā)明還包含宿主細(xì)胞，其包含載體，所述載體包含分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼具有如SEQ.ID NO.26所示的氨基酸序列、來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含載體，所述載體包含具有如SEQ.ID.NO.25所示的核苷酸序列的核酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自細(xì)菌細(xì)胞；植物細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞；和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明又提供了轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其包含分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼具有SEQ.ID.NO.26所示的氨基酸序列、來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞另外包含具有如SEQ.ID NO.26所示的氨基酸序列、來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，或編碼所述多肽的同源物。
本發(fā)明另外提供生產(chǎn)重組的來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的多肽的方法，其包含培養(yǎng)包含分離的核酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和分離重組的來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，所述分離的核酸包含編碼具有如SEQ.ID NO 26所示的氨基酸序列、來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。本發(fā)明也包含通過(guò)該方法生產(chǎn)的重組多肽。
本發(fā)明還提供一種針對(duì)柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物的疫苗，其包含分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列，所述核酸包含編碼具有如SEQ.ID NO 26所示的氨基酸序列、來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在疫苗的一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸是質(zhì)粒。
另外，本發(fā)明提供一種針對(duì)柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物的疫苗，其包含重組的來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的多肽，該多肽是通過(guò)培養(yǎng)包含分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和分離重組的來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的多肽來(lái)生產(chǎn)的，所述分離的核酸包含編碼具有如SEQ.ID NO 26所示的氨基酸序列、來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，或編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗由本發(fā)明的分離的核酸和本發(fā)明的重組多肽的混合物組成。
在一個(gè)附加的實(shí)施方案中，疫苗另外包含第二種抗原。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第二種抗原選自編碼來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的抗原的核酸，包含該核酸的質(zhì)粒，和由該核酸編碼的多肽。
本發(fā)明還提供免疫受試者以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的方法，其包含向受試者施用本發(fā)明的疫苗的步驟。
在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是選自牛，羊，豬和魚(yú)的物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是鳥(niǎo)類物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種是雞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，施用步驟包含將疫苗噴霧到受試者的鼻孔中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用是在卵內(nèi)進(jìn)行。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用是針對(duì)卵的氣囊，因此使胚胎與疫苗接觸。
本發(fā)明還提供一種給予鳥(niǎo)類物種的新生受試者以母體免疫(抗體)以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的方法，其包含在產(chǎn)受精卵之前適當(dāng)?shù)臅r(shí)間向受試者的母體施用本發(fā)明的疫苗，以便由此在新生的受試者中通過(guò)母體免疫給予保護(hù)以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的步驟。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
本發(fā)明還提供一種減少鳥(niǎo)類物種的新生受試者的糞便中艾美球蟲(chóng)屬卵囊排出量的方法，其包含在產(chǎn)受精卵之前適當(dāng)?shù)臅r(shí)間向受試者的母體施用本發(fā)明的疫苗，以便誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和將母體抗體傳遞給新生兒以使來(lái)自新生兒的卵囊排出量減小的步驟。
在另外的實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
本發(fā)明還提供一種免疫受試者以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的方法，其包含向受試者施用活疫苗的步驟，所述活疫苗包含表達(dá)具有如SEQ.ID NO 26所示的氨基酸序列、來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子250kDa多肽的免疫顯性部分的活的非毒性微生物或活病毒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，活病毒是痘病毒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是選自牛，羊，豬和魚(yú)的物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是鳥(niǎo)類物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
本發(fā)明還提供一種免疫受試者以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的方法，其包含向受試者給料植物的步驟，所述植物的細(xì)胞表達(dá)來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是小麥。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物是玉米。
在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是選自牛，羊，豬和魚(yú)的物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是鳥(niǎo)類物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
本發(fā)明還提供一種免疫受試者以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的方法，其包含向受試者施用包含具有如SEQ.ID.NO.25所示核苷酸序列的核酸的質(zhì)粒的步驟。
在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是選自牛，羊，豬和魚(yú)的物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是鳥(niǎo)類物種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
本發(fā)明還包含來(lái)自鳥(niǎo)類物種的受精卵，其具有用本發(fā)明的疫苗接種的氣囊，所述疫苗能夠在孵化前或孵化后即刻在胚胎中誘導(dǎo)抗有毒力形式的柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物的免疫應(yīng)答。
在一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種選自雞，鴨，火雞，鵝，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，鳥(niǎo)類物種是雞。
本發(fā)明提供來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的250kDa子孢子/裂殖子抗原的重組克隆和測(cè)序。
從純化的巨型艾美球蟲(chóng)子孢子中分離250kDa抗原，其存在于形成孢子的卵囊中(參見(jiàn)上述生活周期)。分離方法涉及從形成孢子的卵囊中提取蛋白質(zhì)和在DEAE-sephacel陰離子交換柱上分離提取的蛋白質(zhì)。接著進(jìn)行峰級(jí)分的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡以鑒定250kDa的抗原。此外，使用來(lái)源于接種的母雞和子代小雞的保護(hù)性母體抗血清以證實(shí)純化的抗原的同一性。最后，從PVDF薄膜濾器上分離250kDa蛋白質(zhì)以進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)序和克隆。
將250kDa抗原的氨基末端和胰蛋白酶肽消化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。使用來(lái)自胰蛋白酶消化的序列來(lái)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并PCR寡核苷酸引物。將引物用于RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)PCR以擴(kuò)增部分基因的產(chǎn)物。從這些產(chǎn)物的序列，設(shè)計(jì)基因特異性引物并將其用于RACE PCR以確定mRNA的3’和5’末端。然后使用針對(duì)5’和3’末端設(shè)計(jì)的基因特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼抗原的全長(zhǎng)7kb cDNA克隆。該克隆被完全測(cè)序，并且當(dāng)與天然蛋白質(zhì)N-末端的氨基酸序列相比時(shí)顯示其5’末端包含正確的DNA序列。因此，該核酸序列編碼保護(hù)性的250kDa子孢子/裂殖子抗原并且現(xiàn)在可以用來(lái)生產(chǎn)用于接種雞以抗球蟲(chóng)病的重組抗原。
本發(fā)明核酸的同源物是編碼與核酸編碼的多肽具有基本上相同生物活性的多肽的核酸。在此使用的術(shù)語(yǔ)“同源物”指互補(bǔ)性的程度?？赡艽嬖诓糠滞椿蛲耆?即，同一性)。部分互補(bǔ)序列是至少部分抑制相同的序列與目標(biāo)核酸雜交的序列；使用功能術(shù)語(yǔ)(functional term)“基本上同源”來(lái)表示。使用在低嚴(yán)格條件下的雜交試驗(yàn)(DNA印跡或RNA印跡，溶液雜交等)可以檢驗(yàn)完全互補(bǔ)的序列與靶序列的雜交的抑制。在低嚴(yán)格條件下，基本上同源的序列或探針將競(jìng)爭(zhēng)和抑制完全同源的序列或探針與靶序列的結(jié)合(即雜交)。這不是說(shuō)低嚴(yán)格條件是這樣的以致允許非特異性的結(jié)合；低嚴(yán)格條件要求兩個(gè)序列的彼此結(jié)合是特異性(即選擇性的)的相互作用。通過(guò)使用甚至缺少部分程度的互補(bǔ)性(例如小于30％同一性)的第二種靶序列可以檢驗(yàn)非特異性結(jié)合的缺乏；在不存在非特異性結(jié)合時(shí)，探針將不與第二種非互補(bǔ)的靶序列雜交。
如在本領(lǐng)域已知，可以使用眾多等價(jià)條件以包含低或高嚴(yán)格條件?？紤]因素如序列的長(zhǎng)度和性質(zhì)(DNA，RNA，堿基組成)，目標(biāo)的性質(zhì)(DNA，RNA，堿基組成，存在溶液中或固定等)，和鹽的濃度以及其它組分(例如，甲酰胺，葡聚糖硫酸酯和/或聚乙二醇的存在或缺乏)，并且可以改變雜交液以產(chǎn)生與上面列出的條件不同但相當(dāng)?shù)牡突蚋邍?yán)格條件。
本發(fā)明的目的是提供編碼來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa抗原的核苷酸序列和由此推斷的氨基酸序列。具體例舉的編碼序列在圖6中與推斷的氨基酸序列一起給出。關(guān)于例舉的氨基酸序列的所有同義編碼序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供功能上等價(jià)的編碼和蛋白質(zhì)序列，包括來(lái)源于艾美球蟲(chóng)屬其它物種的等價(jià)序列。來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的功能上等價(jià)的250kDa抗原的編碼序列，與具體鑒定的編碼序列理想地是大約50％至大約80％的核苷酸序列同源性(同一性)，并且編碼序列與具體例舉的編碼序列理想地是大約95％至大約100％相同。
特別嚴(yán)格的雜交條件提供給來(lái)自其它物種的編碼序列同源物的鑒定和變體序列的鑒定，其中那些同源物和/或變體序列具有至少(包括在內(nèi))50-85％，85-100％的核苷酸序列同一性，90-100％，或95-100％的核苷酸序列同一性。每個(gè)整數(shù)和每個(gè)指定范圍的每個(gè)子集規(guī)定為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的編碼序列和方法包括在除了巨型艾美球蟲(chóng)以外的物種中的同源編碼序列。使用本文公開(kāi)的序列和本領(lǐng)域眾所周知的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可以使用方法從其它生物分離相應(yīng)的編碼序列(例如，從cDNA)，所述生物包括但不限于其它物種例如在本發(fā)明方法中有用的柔嫩艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)和布氏艾美球蟲(chóng)。
特別包括在本發(fā)明中的是來(lái)源于除了在此例舉的那些的其它物種的序列，其序列與公開(kāi)的序列在嚴(yán)格條件下雜交。嚴(yán)格條件指在本領(lǐng)域?qū)τ诮o定的探針長(zhǎng)度和核苷酸組成所理解的條件，能夠在嚴(yán)格條件下雜交意指在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即高溫和/或低鹽含量)與被試核苷酸序列，或它的互補(bǔ)鏈退火，標(biāo)準(zhǔn)條件往往不利于無(wú)關(guān)序列的退火。
“高嚴(yán)格條件”意指65-68℃，0.1xSSC和0.1％SDS(顯示大約95-100％的核苷酸序列同一性/相似性)的雜交和漂洗條件。在Sambrook等(1989)Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，N.Y.中進(jìn)一步描述雜交試驗(yàn)和條件。如這里使用，適中(中等的)嚴(yán)格的條件是50-65℃，1xSSC和0.1％SDS的雜交和漂洗條件(其中陽(yáng)性雜交結(jié)果反映大約80-95％核苷酸序列的同一性)。低嚴(yán)格條件典型地是40-50℃，6xSSC和0.1％SDS的雜交和漂洗條件(反映大約50-80％核苷酸序列同一性)。
本發(fā)明多肽的同源物是具有與多肽基本上相同的氨基酸序列和生物活性的多肽。因此，同源物可以通過(guò)添加，缺失，或替換一個(gè)或多個(gè)非必需氨基酸殘基而不同于本發(fā)明的多肽，條件是產(chǎn)生的多肽保留多肽的生物活性。使用確定的和眾所周知的方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定可以添加，缺失，或替換(包括該替換可以用哪個(gè)氨基酸進(jìn)行)哪個(gè)氨基酸殘基，所述方法包括例如設(shè)計(jì)和制備DNA序列，所述DNA序列編碼本多肽的多肽同源物的細(xì)菌表達(dá)，通過(guò)定點(diǎn)誘變技術(shù)修飾cDNA和基因組序列，構(gòu)建重組多肽和表達(dá)載體，細(xì)菌表達(dá)多肽，和通過(guò)常規(guī)生物化學(xué)測(cè)定測(cè)量多肽的生物化學(xué)活性的常規(guī)方法。
同源物的實(shí)例是包含少于在本多肽中規(guī)定的所有殘基的缺失同源物，其中用其它殘基替代一個(gè)或多個(gè)規(guī)定殘基的替換同源物，和其中將一個(gè)和多個(gè)氨基酸殘基加入到多肽的添加同源物。所有的這些同源物共有本發(fā)明多肽的生物活性。
在此將“基本上相同的多肽”限定為包含在多肽的氨基酸序列的N-末端缺失，添加或替換少于4個(gè)氨基酸。另外，在序列中可以存在不消除多肽的生物活性的缺失，添加或替換。這類修飾對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。例如，根據(jù)由例如Lehninger，生物化學(xué)，第2版，Worth出版社，紐約(1975)；Creighton，Protein Structure，A Practical Approach，牛津大學(xué)的IRL出版社，牛津，英國(guó)(1989)；和Dayhoff，Atlas of Protein Sequenceand Structure 1972，Naional Biomedical Research Foundation，Maryland(1972)描述的同源或等價(jià)基團(tuán)，替換可以包含高達(dá)10個(gè)殘基。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“生物活性的”指具有天然存在分子的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)，或生物化學(xué)功能的多肽。同樣，“免疫活性的”指天然，重組，或合成的多肽，或其任何寡肽部分，以在動(dòng)物或細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答和與特異性抗體結(jié)合的能力。
“基本上相同的生物活性”指與天然存在的分子相同的生物活性，在程度或水平上可能稍微不同，其仍可以被熟練的技術(shù)人員認(rèn)為是相同的生物活性。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“部分”，與多肽結(jié)合(如在“給定多肽的一部分”)指該多肽的片段。片段可以在四(4)個(gè)氨基酸殘基到減去一個(gè)氨基酸的整個(gè)氨基酸序列的范圍內(nèi)變化。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“部分”，與核酸結(jié)合(如在“給定核酸的一部分”)指該核酸的片段。片段可以在十二(12)個(gè)核苷酸殘基到減去一個(gè)核苷酸的整個(gè)核酸序列的范圍內(nèi)變化。
在此使用的“缺失”指氨基酸或核苷酸序列的改變，其中分別缺少一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸殘基。
在此使用的“插入”或“添加”指氨基酸或核苷酸序列的改變，與天然存在的分子相比，其分別導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸殘基的增加。
在此使用的“替換”指分別用不同的氨基酸或核苷酸替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸。
本發(fā)明提供來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的形成孢子的卵囊、免疫顯性和高度保護(hù)性的250kDa抗原的重組克隆和測(cè)序。
據(jù)顯示抗原與來(lái)源于保護(hù)的母雞和小雞的血清反應(yīng)，基因的序列是基于由保護(hù)性血清識(shí)別的蛋白質(zhì)的氨基酸序列?；蛟诎l(fā)育的子孢子和裂殖子階段強(qiáng)烈表達(dá)，并且已被預(yù)測(cè)在宿主細(xì)胞的侵入中起作用。因此，該抗原可以用于抗球蟲(chóng)病的疫苗。
本發(fā)明還提供抗球蟲(chóng)病的疫苗，其包含重組250kDa抗原。
本發(fā)明還提供分離的核酸，其具有SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供重組多肽，其中氨基酸序列通過(guò)SEQ.ID NO.26顯示。
通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明，所述實(shí)施例決不應(yīng)該被認(rèn)為是進(jìn)一步限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地理解，討論的具體方法和結(jié)果只是本發(fā)明的舉例說(shuō)明，在其后接著的權(quán)利要求中更充分地描述本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)實(shí)施例1從形成孢子的卵囊純化250kDa子孢子抗原如先前所述(Wagenbach)制備巨型艾美球蟲(chóng)形成孢子的卵囊。充分洗滌100×106個(gè)形成孢子的卵囊，然后重懸浮于等體積的40mM Tris.HClpH8.0中，覆蓋玻璃珠并通過(guò)渦旋5分鐘破裂。然后使用液氮/40℃水浴將勻漿進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的冷凍-熔化，接著在13,000xg下離心10分鐘。去除上清液，轉(zhuǎn)移至微量濃縮器(Centricon 100，Amicon)并通過(guò)在9900xg下4℃離心30分鐘濃縮。用Bradford方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析5μg粗提物樣品，其結(jié)果在圖1中顯示。可以看出，來(lái)源于用巨型艾美球蟲(chóng)或裂殖子粗提物活體感染的母雞或它們子代小雞的血清，與存在于形成孢子的卵囊中的250kDa蛋白質(zhì)條帶反應(yīng)。另外，從泳道3可以看出，來(lái)源于用裂殖子250kDa剪切塊蛋白質(zhì)條帶(先前在我們的母體免疫試驗(yàn)中使用(Smith等))免疫的母雞的卵的卵黃，也與250kDa蛋白質(zhì)反應(yīng)。
使用DEAE-sephacel(Pharmacia，Sweden)陰離子交換樹(shù)脂填充1cm×20cm柱并在40mM Tris.HCl pH8.0中以0.7ml/min的流速平衡。將1.5mg形成孢子的卵囊蛋白質(zhì)粗提物加樣到柱上，并隨后用在40mM Tris pH8.0中的0-1 M NaCl的分級(jí)梯度洗脫蛋白質(zhì)。使用設(shè)置在280nm的UV檢測(cè)器和圖表記錄器監(jiān)測(cè)洗脫物，結(jié)果在圖2中顯示。按照發(fā)現(xiàn)的峰收集并合并級(jí)分，如上所述濃縮和離心。
通過(guò)SDS PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析在用于洗脫的各種NaCl濃度下獲得的合并級(jí)分(圖3)。可以看出，通過(guò)凝膠的銀染色或通過(guò)與針對(duì)裂殖子粗提物產(chǎn)生的雞抗血清的反應(yīng)性，250kDa抗原條帶在0.3-0.5M NaCl級(jí)分中出現(xiàn)。來(lái)源于通過(guò)活體感染免疫的母雞的被保護(hù)的3日齡子代小雞的抗血清也識(shí)別這個(gè)相同的條帶。
實(shí)施例2來(lái)自250kDa抗原的N-末端以及內(nèi)部胰蛋白酶肽的氨基酸測(cè)序合并用0.3-0.5M NaCl洗脫的離子交換純化的級(jí)分，并通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)(圖4)。在電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移PVDF膜上，其然后用考馬斯亮藍(lán)染色。切除相當(dāng)于免疫顯性250kDa蛋白質(zhì)的條帶并將N-末端測(cè)序。為了測(cè)序內(nèi)部肽，將250kDa蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行胰蛋白酶消化并隨后通過(guò)質(zhì)譜序列分析產(chǎn)生的肽。
序列分析的結(jié)果如下N-末端EVNNELSK(C)ESGWTPW(SEQ.ID.NO.8)胰蛋白酶肽1 QWTAWTE(SEQ.ID.NO.9)胰蛋白酶肽2 EL/IVNWF(SEQ.ID.NO.10)實(shí)施例3編碼250kDa抗原的基因的RACE PCR克隆和測(cè)序按照制造廠商的方案使用TRIzol試劑從形成孢子的卵囊中提取總RNA。按照制造廠商的說(shuō)明書(shū)使用Dynal mRNA試劑盒從總RNA中分離mRNA。然后使用Marathon RACE試劑盒(Clonetech)將mRNA用于cDNA的構(gòu)建。從N末端和胰蛋白酶肽序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并PCR引物并用于5’和3’RACE PCR實(shí)驗(yàn)?？寺『蜏y(cè)序產(chǎn)生的條帶并將獲得的序列用于設(shè)計(jì)新的基因特異性引物。然后與簡(jiǎn)并引物一起使用基因特異性引物以精確地確定cDNA的5’和3’末端。然后設(shè)計(jì)基因特異性引物以擴(kuò)增全長(zhǎng)7kb cDNA。結(jié)果在圖5中顯示，其中可以顯現(xiàn)7KB cDNA條帶。
從250kDa cDNA克隆獲得的DNA序列數(shù)據(jù)在圖6中表示?？梢钥闯觯蛄邪瑥膲A基對(duì)數(shù)231(ATG)起始和在堿基對(duì)7310處的終止密碼子終止的氨基末端。序列的總長(zhǎng)為7987個(gè)堿基。該序列編碼2359個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)的分子量為249kDa。
在2001年6月26日將編碼250kDa抗原的本質(zhì)粒保藏在澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室，Pymble，澳大利亞，保藏號(hào)為NM01/22396。在2001年6月26日將用250kDa抗原轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞保藏在澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室，Pymble，澳大利亞，保藏號(hào)為NM01/22397。兩個(gè)保藏都是按照用于專利程序目的的關(guān)于微生物存放的國(guó)際認(rèn)可的布達(dá)佩斯條約進(jìn)行。
從圖7中可以看出，發(fā)現(xiàn)巨型艾美球蟲(chóng)250kDa基因的序列與來(lái)源于柔嫩艾美球蟲(chóng)的命名為GX5401和GX5401 FL的基因序列(WO 90/00403)共享同源性。將恢復(fù)期的雞血清用于篩選文庫(kù)，從柔嫩艾美球蟲(chóng)形成孢子的卵囊中制備的cDNA文庫(kù)中選擇柔嫩艾美球蟲(chóng)克隆GX5401。使用GX5401 cDNA克隆作為探針，從基因組文庫(kù)克隆柔嫩艾美球蟲(chóng)的全長(zhǎng)基因GX5401FL。該基因具有6,567個(gè)堿基的可讀框并且編碼具有預(yù)測(cè)的大約250kDa的分子量的蛋白質(zhì)。在將巨型艾美球蟲(chóng)250kDa克隆的全長(zhǎng)序列與柔嫩艾美球蟲(chóng)的序列比較中(圖7a和7b)，發(fā)現(xiàn)總體上對(duì)于DNA和氨基酸序列分別有60％和59％的同源性。這個(gè)水平的同源性是相對(duì)低的，因此該新克隆的巨型艾美球蟲(chóng)基因顯著區(qū)別于柔嫩艾美球蟲(chóng)克隆。因?yàn)楸揪扌桶狼蛳x(chóng)克隆也被保護(hù)性母體抗體強(qiáng)烈識(shí)別，因此為生產(chǎn)抗雞的球蟲(chóng)病的新重組疫苗提供基礎(chǔ)。
實(shí)施例4來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的免疫顯性無(wú)性繁殖階段的蛋白質(zhì)的純化和蛋白質(zhì)印跡分析材料為方便起見(jiàn)，將以下列出的化學(xué)試劑，生物試劑和混雜材料以供應(yīng)商的名字分組。
化學(xué)試劑除非另外說(shuō)明，貫穿本研究使用的所有化學(xué)品是分析級(jí)。
Amresco(美國(guó))；氯仿，檸檬酸(水合三鈉)，乙酸，檸檬酸EDTA，NaHCO3，苯酚，SDS，Tris硼酸鹽EDTA緩沖液(10x原液0.89M Tris，0.89M硼酸鹽，0.02M EDTA)British Drug Houses Chemicals(英國(guó))；乙酸，乙醇，甘氨酸，HCl，異丙醇，KCl KH2PO4，甲醇，MgCl2，MgSO4，NaCl，Na2HPO4，NaOHProgen Industries Ltd.(澳大利亞)；X-galSigma Chemical Company(美國(guó))；2-巰基乙醇，BCIP/NBT緩沖底物片，EtBr，甘油，IPTG，HBS，異戊醇，PMSF，Tris生物試劑Biotech International Ltd.(澳大利亞)；2mM dNTP溶液Clontech(美國(guó))；Advantage2Taq聚合酶和10x反應(yīng)緩沖液DIFCO Laboratories(美國(guó))；細(xì)菌學(xué)瓊脂，胰蛋白酶，胰蛋白胨，酵母提取物Fluka Chemical Corp(美國(guó))；?；悄懰酙CN(美國(guó))；青霉素10,000I.U./mL和鏈霉素10,000μg/mL抗生素混合物New England Biolabs(美國(guó))；限制性內(nèi)切核酸酶和10x反應(yīng)緩沖液PerkinElmer Life Sciences，Inc.(美國(guó))；32P-dCTPPierce Chemical Company(美國(guó))；BSAProgen Industries Ltd.(澳大利亞)；DNA級(jí)瓊脂糖，氨芐青霉素，蛋白酶KPromega(美國(guó))；T4 DNA連接酶和2x連接緩沖液Roche；DNA酶(不含RNA酶)，RNA酶抑制劑混雜材料BioRad；Econo-柱(低壓色譜柱)Amersham Pharmacia Biotech(瑞典)；DEAE sephacel，Hybond-N+核酸轉(zhuǎn)移膜，PercollPall corporation(美國(guó))；PVDF蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移膜Sigma Chemical Company(U.S.A)；玻璃珠溶液和生長(zhǎng)培養(yǎng)基變性溶液；0.5M NaCl，0.5M NaOH雜交液；0.263M Na2HPO4pH7.2，1％BSA，1mM EDTA，7％SDSLB培養(yǎng)基；1％NaCl，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物L(fēng)B瓊脂；含有0.24％MgSO4，1.5％瓊脂的LB培養(yǎng)基，中和液；0.5M Tris-Cl pH7.4，2.5M NaClPBS 1x；137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4，1.4mMKH2PO4，pH7.4SDS電泳緩沖液；0.151％Tris，7.2％甘氨酸，0.5％SDSSOB培養(yǎng)基；0.05％NaCl，2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物SOC培養(yǎng)基；含有20mM葡萄糖，10mM MgCl2，10mM MgSO4的SOBSSC 20x；3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH7.0TBE電泳緩沖液；0.89M Tris，0.89M硼酸鹽，0.02M EDTATE緩沖液；10mM Tris-Cl pH8.0，1mM EDTA轉(zhuǎn)移溶液；1M NaCl，含有1M檸檬酸的0.1M檸檬酸鈉，pH7.0商品試劑盒DynabeadsmRNA DIRECT試劑盒(DYNAL，挪威)GenEluteTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Sigma，美國(guó))MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒(CLONTECH，美國(guó))OmniscriptTMRT Kit(QIAGEN，美國(guó))pGEM-T Easy Vector System(Promega，美國(guó))蛋白酶抑制劑混合物P8465(Sigma，美國(guó))QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，美國(guó))QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN，美國(guó))隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(Roche)銀染色試劑盒，PlusOne(Amersham Pharmacia Biotech，瑞典)寄生蟲(chóng)在整個(gè)本研究中使用巨型艾美球蟲(chóng)的Houghton品系。形成孢子的卵囊最初由國(guó)家獸醫(yī)研究所提供，烏普薩拉，瑞典。將巨型艾美球蟲(chóng)和柔嫩艾美球蟲(chóng)的澳大利亞品系用于比較實(shí)驗(yàn)，形成孢子的卵囊是由MedichickPty.Ltd.，提供，維多利亞，澳大利亞。
宿主品系貫穿本研究使用家養(yǎng)雞的澳大利亞品系。鳥(niǎo)是由Barter和Sons Pty.Ltd.，N.S.W.，澳大利亞作為日齡的小公雞提供。
方法寄生蟲(chóng)制備形成孢子的卵囊按照修改的由Shirley(1995)描述的方法，在宿主品系中每3-4個(gè)月將巨型艾美球蟲(chóng)常規(guī)傳代。在3-4周齡，通過(guò)使用5×103個(gè)形成孢子的卵囊口服接種感染鳥(niǎo)，并從第6天至第9天pi每天收集糞便。在收集當(dāng)天，將糞便轉(zhuǎn)移至4L桶中并以4份水對(duì)1份糞便的比率加入自來(lái)水。在工業(yè)強(qiáng)度的摻合機(jī)中攪勻淤漿，并將產(chǎn)生的均漿濾過(guò)1mm-規(guī)格的不銹鋼實(shí)驗(yàn)室用篩。在2000xg下將濾液離心10分鐘并丟棄上清液。通過(guò)劇烈振蕩將包含卵囊的沉淀重懸浮在飽和NaCl溶液中并在750xg下離心10分鐘。然后將包含漂浮的卵囊的上清液連續(xù)濾過(guò)17μm和10μm的polymon篩孔，用無(wú)菌移液管從篩孔的表面收集卵囊。為了最大化產(chǎn)率，將仍包含卵囊的沉淀重懸浮在新鮮的飽和NaCl溶液中并重復(fù)方法達(dá)5次。通過(guò)反復(fù)在水中稀釋和在1500xg下離心5分鐘將如此收集的卵囊立即洗去NaCl。然后將卵囊重懸浮在2％重鉻酸鉀中并通過(guò)在振蕩水浴中于28℃下溫育72小時(shí)形成孢子。在孢子形成后，將培養(yǎng)物保存在4℃。
在分離程序的過(guò)程中，polymon篩孔的使用利于巨型艾美球蟲(chóng)卵囊相對(duì)大的尺寸(18μm×30μm)。卵囊不能通過(guò)10μm網(wǎng)孔并被立即回收，并且是小體積的，在下游步驟中容易操作。
卵囊的次氯酸鈉處理在制備感染劑量過(guò)程中和在粗制抗原的制備之前用次氯酸鈉清洗保存在4℃重鉻酸鉀中的卵囊。通過(guò)反復(fù)水洗和在1500xg下離心5分鐘從卵囊培養(yǎng)物中去除重鉻酸鉀。將沉淀的卵囊重懸浮在水中，加入等體積的12.5％w/v次氯酸鈉(終濃度6.25％w/v)并且將懸浮液放置冰上10分鐘。在750xg離心10分鐘后，將包含清潔的卵囊的上清液濾過(guò)10μm的polymon網(wǎng)孔，用無(wú)菌移液管從網(wǎng)孔的表面收集卵囊。通過(guò)反復(fù)用水洗滌和在1500xg下離心5分鐘立即去除次氯酸鈉。如果用于感染，將卵囊重懸浮在水中，或者重懸浮在適當(dāng)?shù)木彌_液中以制備粗制抗原。
裂殖子在3-4周齡通過(guò)使用2×105個(gè)形成孢子的卵囊口服接種感染小雞，并在感染后93小時(shí)處死。切除腸，立即在冰預(yù)冷的PBS pH7.4中漂洗，然后切成長(zhǎng)度約為3cm的塊。將塊加入包含0.025％胰蛋白酶，1％?；悄懰?Fluka)，10mM MgCl2，200單位/mL青霉素和200μg/mL鏈霉素的Hanks平衡鹽溶液pH7.4(Sigma)的溶液中，并在40℃溫育20-30分鐘。在整個(gè)溫育期間用顯微鏡監(jiān)視裂殖子的釋放。然后將溶液連續(xù)濾過(guò)1000μm和250μm不銹鋼實(shí)驗(yàn)室用篩并最后通過(guò)17μm polymon網(wǎng)孔，用來(lái)去除較大的腸碎片。將產(chǎn)生的濾液在1000xg下離心10分鐘，丟棄上清液并將包含裂殖子的沉淀重懸浮在等體積的包含10mM MgCl2的冰預(yù)冷的HBSS中。
為了去除較小碎片，基于Fernando等的方法(1984)將裂殖子在不連續(xù)的Percoll(Pharmacia)梯度上分層。通過(guò)加入各2ml等滲Percoll原液(9份Percoll對(duì)1份10×PBS)，接著70％原液(7份等滲原液對(duì)3份1×PBS)，然后50％原液(5份等滲原液對(duì)5份1×PBS)和最后裂殖子懸浮液來(lái)制備梯度。在10000xg下將梯度離心10分鐘并從70％-50％邊界吸取裂殖子。用1×PBS洗滌收集的裂殖子并通過(guò)在1000xg下離心10分鐘沉淀。沉淀保存在-80℃。
SDS-PAGE按照Laemmli(1970)的方法，使用Bio-Rad電泳單元在預(yù)制的Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Rad或Gradipore)上分離蛋白質(zhì)。用4x樣品緩沖液(1x＝62mM Tris-HCl pH6.8，10％甘油，2％SDS，0.01％溴酚藍(lán))稀釋所有的蛋白質(zhì)樣品，對(duì)于在還原條件下分析的那些樣品，(將β-巰基乙醇加至2.5％的終濃度(除非另外說(shuō)明)。在100℃下將樣品和分子量標(biāo)記(Bio-Rad LMW)加熱4分鐘，立即放置冰上至冷卻，然后在13,000xg下離心1分鐘以去除不溶性物質(zhì)。然后將樣品和標(biāo)記加樣至浸沒(méi)在1x電泳緩沖液(25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％SDS，pH8.3)中的凝膠上并在125V下電泳約90分鐘。
蛋白質(zhì)印跡使用Pharmacia NovaBlot電泳轉(zhuǎn)移試劑盒和Multiphor II電泳單元進(jìn)行從聚丙烯酰胺凝膠到PVDF膜的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移。系統(tǒng)應(yīng)用半干的，不連續(xù)緩沖液技術(shù)，其使用浸泡在電極緩沖液中和堆積在石墨電極板之間的濾紙。
為轉(zhuǎn)移作準(zhǔn)備，用蒸餾水將陽(yáng)極和陰極板飽和，用紙巾去除多余水份。通過(guò)將6層浸泡在陽(yáng)極溶液1(0.3M Tris pH10.4，20％v/v甲醇)的濾紙放置在陽(yáng)極上，然后是浸泡在陽(yáng)極溶液2(25mM Tris pH10.4，20％v/v甲醇)中的3層濾紙和PVDF膜來(lái)裝配每個(gè)轉(zhuǎn)移單元。在PAGE后，將凝膠放置在組套上并用9層浸泡在陰極溶液(4mM 6-氨基正己酸pH7.6，20％v/v甲醇)中的濾紙覆蓋。所有的濾紙和PVDF膜被預(yù)先切割成凝膠大小。通過(guò)加入陰極板和然后放入Multiphor堿中完成轉(zhuǎn)移單元。在0.8mA/cm2凝膠表面積下進(jìn)行轉(zhuǎn)移。包括在凝膠上的有色分子量標(biāo)記用作證實(shí)成功轉(zhuǎn)移的對(duì)照。
蛋白質(zhì)印跡的免疫檢測(cè)在蛋白質(zhì)的電泳轉(zhuǎn)移后，伴隨攪拌在室溫下在PBS/5％SMP溶液中將PVDF膜封閉1小時(shí)。在封閉后，將膜浸沒(méi)于在PBS/5％SMP中稀釋至適當(dāng)濃度的第一抗體并在室溫下振蕩溫育2小時(shí)。然后在PBS/0.03％吐溫20中將膜洗滌3次，每次10分鐘。然后以在PBS/5％SMP中1/1000的濃度加入第二抗體-偶聯(lián)兔抗雞IgG的堿性磷酸酶，并在振蕩下室溫溫育1小時(shí)。在第二抗體溫育后，如上洗滌膜并使用BCIP/NET(SIGMA FASTBCIP/NBT片劑)檢測(cè)。
粗制抗原的制備形成孢子的卵囊通過(guò)反復(fù)在1500xg下離心5分鐘和水洗從卵囊中去除重鉻酸鉀。將清潔的沉淀重懸浮在等體積的40mM Tris.HCl pH8.0中并按照制造廠商的說(shuō)明書(shū)加入蛋白酶抑制劑(Sigma)。用飽和量的玻璃珠(Sigma)覆蓋懸浮液并通過(guò)渦旋5分鐘破裂。通過(guò)顯微鏡檢查證實(shí)卵囊的破裂。然后使用液氮/40℃水浴將勻漿進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的冷凍-熔化，接著在13,000xg下4℃離心10分鐘。去除上清液，轉(zhuǎn)移至微量濃縮器(Centricon 100，Amicon)并通過(guò)在900xg下4℃離心30分鐘濃縮。提取物保存在-80℃。
裂殖子和配子母細(xì)胞將純化的裂殖子或配子母細(xì)胞的沉淀重懸浮在包含10mM PMSF的40mM Tris.HCl pH8.0中，并進(jìn)行如上所述的3個(gè)循環(huán)的冷凍熔化。使用設(shè)置在25W和70％輸出量的Cole-Parmer超聲勻漿器在冰上超聲處理懸浮液20秒，并在13000xg下4℃離心產(chǎn)生的均漿10分鐘。保留上清液并保存在-80℃。
蛋白質(zhì)濃度測(cè)定基于Bradford染料結(jié)合方法，使用Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒來(lái)測(cè)定貫穿本研究中使用的所有抗原粗提取物和其它蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)濃度。
蛋白質(zhì)顯色通過(guò)考馬斯亮藍(lán)或銀染色來(lái)檢測(cè)通過(guò)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離的蛋白質(zhì)。對(duì)于考馬斯亮藍(lán)染色，在振蕩下將凝膠浸沒(méi)在0.2％考馬斯亮藍(lán)R250(Sigma)，50％甲醇和10％冰醋酸中30分鐘。然后在振蕩下在12％乙醇/7％冰醋酸中將凝膠脫色直至蛋白質(zhì)條帶變得可見(jiàn)并且背景幾乎透明。按照制造廠商的說(shuō)明書(shū)使用Amersham Pharmacia銀染色試劑盒進(jìn)行銀染色。
通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)為了N-末端測(cè)序的目的轉(zhuǎn)移至PVDF的蛋白質(zhì)。如上所述將膜染色2分鐘并脫色直至蛋白質(zhì)條帶可見(jiàn)。
蛋白質(zhì)純化程序離子交換層析通過(guò)DEAE離子交換層析分離來(lái)自形成孢子的卵囊粗提物的蛋白質(zhì)。將約5ml DEAE sephacel(Amersham Pharmacia Biotech)陰離子交換樹(shù)脂加至1cm(內(nèi)徑)×20cm(長(zhǎng))，低壓層析柱(Econo-column，Bio-Rad)，并在40mM Tris.HCl pH8.0中以0.7ml/min的流速平衡2小時(shí)。通過(guò)在13000xg下4℃離心10分鐘澄清如上所述制備的粗制抗原，并加樣到柱上。隨后使用在40mM Tris pH8.0中的0-1M NaCl的分級(jí)梯度以0.7ml/min的流速進(jìn)行蛋白質(zhì)洗脫。通過(guò)設(shè)置在280nm并且與Activon Omniscribe系列D5000圖表記錄器連接的Gilson 112 UV/Vis線內(nèi)(in-line)檢測(cè)器來(lái)監(jiān)視洗脫物。與遞增的NaCl濃度對(duì)應(yīng)手動(dòng)收集級(jí)分。在洗脫后，將所有的級(jí)分轉(zhuǎn)移至Centricon 100微量濃縮器(Amicon)并且在900xg下4℃離心1小時(shí)，產(chǎn)生大約60μL的存留體積。為了將級(jí)分脫鹽，用40mM Tris.HCl將存留物稀釋至2ml的體積并如上所述離心。在離心/緩沖液交換后丟棄濾液并將存留物保存在-20℃。
大小排阻層析在離子交換層析后，使用裝備有Superdex 200 PC凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia Biotech)的SMART HPLC系統(tǒng)，通過(guò)大小排阻層析進(jìn)一步分離包含免疫顯性蛋白質(zhì)的所選級(jí)分。將柱在40mM Tris.HCl pH8.0中以50μL/min的流速平衡2小時(shí)。將蛋白質(zhì)級(jí)分注于柱上并以如上所述的流速洗脫。使用SMART系統(tǒng)軟件在280nm和214nm的雙波長(zhǎng)下監(jiān)視洗脫物，在洗脫期的過(guò)程中自動(dòng)收集100μL的級(jí)分。
N-末端測(cè)序如上所述通過(guò)離子交換層析純化形成孢子的卵囊的粗提物，合并富集免疫顯性蛋白質(zhì)的級(jí)分并通過(guò)離心超濾濃縮至60μL的體積。將19μL的樣品等分試樣加樣至5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠的3個(gè)相鄰的孔中，并將3μL等分試樣加樣至第4個(gè)孔。在還原條件下電泳后，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF。然后從膜上剪下包含來(lái)自3μL樣品等分試樣的蛋白質(zhì)的PVDF條，并用抗粗制裂殖子血清免疫檢測(cè)以作為免疫顯性蛋白質(zhì)顯示的對(duì)照。如上所述用考馬斯亮藍(lán)將剩余的膜塊染色，用解剖刀片切除包含免疫顯性蛋白質(zhì)的膜條帶。在測(cè)序前將膜塊保存在-20℃。隨后在澳大利亞蛋白質(zhì)組分析機(jī)構(gòu)(悉尼)和Biotech Australia Pty.Ltd.(悉尼)使用Applied Biosystems 494 Procise Protein Sequencing System進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的自動(dòng)Edman降解。
胰蛋白酶肽測(cè)序如上所述在還原條件下在5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離濃縮的包含免疫顯性蛋白質(zhì)的離子交換層析級(jí)分。在電泳后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色并用解剖刀片切割包含免疫顯性蛋白質(zhì)的凝膠區(qū)域。將凝膠條立即轉(zhuǎn)移至澳大利亞蛋白質(zhì)組分析機(jī)構(gòu)并將樣品在37℃下進(jìn)行16小時(shí)的胰蛋白酶消化，接著使用ZipTip將產(chǎn)生的肽濃縮和脫鹽。然后分離樣品肽并使用Micromass Q-TOF質(zhì)譜儀通過(guò)ESI-TOF MS/MS分析所選的肽。
Triton X-114分級(jí)分離基于Bordier(1981)的方法，在非離子型去污劑Triton X-114中將純化的裂殖子分級(jí)。將大約107個(gè)純化的裂殖子重懸浮在250μL 0.5％ TX-114在PBS中的溶液，其包含10mM PMSF和0.002％溴酚藍(lán)。在冰上溫育30分鐘后，在13000xg下將懸浮液離心10分鐘，分離成去污劑不溶性沉淀和TX-114上清液。將上清液級(jí)分轉(zhuǎn)移至在PBS中包含6％蔗糖和0.06％TX-114的蔗糖緩沖墊(sucrose cushion)之上，并在37℃下溫育3分鐘。然后在13000xg下室溫離心3分鐘，強(qiáng)迫分離成上層水相和下層富含去污劑相。去除水相并將去污劑相稀釋在冰冷的PBS中至250μL的初始裂解液體積。將水相和去污劑相以及去污劑不溶性沉淀保持在冰上直至通過(guò)SDS-PAGE分離。
RNA提取按照改編自Johnston等(1998)所描述的方法，使用TRIzol試劑(LifeTechnologies)從形成孢子的卵囊中分離總RNA。通過(guò)在1500xg下離心5分鐘在10mL聚丙烯管中沉淀大約2.5×107個(gè)清潔的形成孢子的卵囊。向沉淀加入等體積的玻璃珠(Sigma)和1mL冰冷的PBS pH7.4，將混合物在4℃下渦旋4×1周期，任選地在冰上溫育1分鐘。將產(chǎn)生的均漿轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的10mL管中并加入等體積(3.75mL)的TRIzol試劑。通過(guò)反轉(zhuǎn)混合溶液并在室溫下溫育5分鐘以使核苷酸復(fù)合體完全解離。然后為了去除不溶性物質(zhì)(即子孢子和卵囊殼)將懸浮液在11,000xg下4℃離心10分鐘。去除上清液，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的10mL管并加入0.75mL氯仿(2mL氯仿/1mL TRIzol試劑)。在劇烈振蕩15秒后，將混合物在室溫下溫育3分鐘，然后在10,000xg下4℃離心15分鐘以強(qiáng)迫分離成下層酚-氯仿相和包含純化的RNA的上層水相。將水相轉(zhuǎn)移至無(wú)菌10mL管中，加入1.875mL異丙醇(0.5mL/1 mL TRIzol試劑)以沉淀RNA，然后通過(guò)反轉(zhuǎn)混合溶液。在室溫下溫育10分鐘后，通過(guò)在11,000xg下4℃離心10分鐘沉淀RNA。去除上清液并通過(guò)簡(jiǎn)短渦旋在4mL 75％ EtOH中洗滌沉淀。通過(guò)進(jìn)一步在7,000xg下4℃離心5分鐘回收沉淀，在去除75％ EtOH后，在真空罩中簡(jiǎn)短地干燥10分鐘。然后將部分干燥的沉淀重懸浮在200μLDEPC處理的ddH2O中，并保存在-80℃。
使用DynabeadsmRNA DIRECT試劑盒(DYNAL Pty.Ltd.)，在對(duì)制造廠商說(shuō)明書(shū)較小改變的情況下，從形成孢子的卵囊的總RNA中，或直接從裂殖子和配子母細(xì)胞中純化Poly(A)+RNA。簡(jiǎn)要地，在1.5mL無(wú)菌聚丙烯管中將來(lái)源于形成孢子的卵囊的總RNA，或者裂殖子或配子母細(xì)胞的沉淀與裂解/結(jié)合緩沖液(Dynal)混合，并與DynabeadsOligo(dT)25聚苯乙烯磁珠合并。通過(guò)溫和反轉(zhuǎn)4分鐘混合懸浮液，然后將管放置在Dynal磁性粒子濃縮器(MPC)中2分鐘。去除上清液并且在MPC中濃縮前通過(guò)反復(fù)吸取在洗滌緩沖液A(Dynal)中洗滌珠子1分鐘。使用洗滌緩沖液A第二次重復(fù)洗滌程序，用洗滌緩沖液B(Dynal)重復(fù)兩次。在最后洗滌后，通過(guò)加入10mM Tris-HCl pH8.0并在65℃下加熱2分鐘從珠中洗脫mRNA。然后將管轉(zhuǎn)移至MPC 1分鐘并將包含mRNA的上清液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的1.5mL管，之后保存在-80℃。
核酸濃度和純度的測(cè)定使用Pharmacia GeneQuant分光光度計(jì)測(cè)定260nm的吸光度來(lái)測(cè)定貫穿本研究使用的純化的DNA或RNA樣品的濃度。通過(guò)測(cè)量A260/280比率評(píng)估樣品的純度，接受具有1.6-2.0比率的樣品。
EtOH沉淀核酸通過(guò)EtOH沉淀將DNA或RNA的稀釋液常規(guī)濃縮。向每個(gè)樣品中加入0.1體積的3M乙酸鈉pH5.2和2.5體積的EtOH，通過(guò)反轉(zhuǎn)混合溶液。在冰上溫育30分鐘后，將樣品在13,000xg下4℃離心45分鐘并隨后去除和丟棄上清液。用70％ EtOH洗滌沉淀并通過(guò)進(jìn)一步在13,000xg下4℃離心5分鐘回收。在真空罩中干燥沉淀并重懸浮于適當(dāng)體積的用于DNA樣品的ddH2O(非基因組的)，或用于RNA樣品的DEPC處理的ddH2O。
cDNA文庫(kù)構(gòu)建如上所述從總RNA分離巨型艾美球蟲(chóng)的形成孢子的卵囊的信使RNA。將估計(jì)的1μg mRNA與MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒(CLONTECH)一起使用，以制備連接物連接的、準(zhǔn)備好的RACE PCR雙鏈cDNA。對(duì)制造廠商的說(shuō)明書(shū)未進(jìn)行程序修改。將文庫(kù)保存在-20℃。
PCR使用PTC-200 Peltier熱循環(huán)儀DNA Engine(MJ Research)進(jìn)行RCR反應(yīng)。所有反應(yīng)是50μL的體積，其使用1μL 50×Advantage 2 PolymeraseMix(CLONTECH)-推薦與MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒(CLONTECH)一起使用的高保真度的聚合酶混合物。寡核苷酸引物是由Sigma GenosysAustralia Pty.Ltd.合成，制備10μM的工作原液，并且對(duì)于基因特異性引物以0.2μM的濃度使用，或者對(duì)于簡(jiǎn)并引物使用0.4μM。對(duì)于使用cDNA作為模板的反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)使用相當(dāng)于大約0.5ng的5μL cDNA，關(guān)于基因組DNA模板，5μL 10ng/μL的工作原液。第二輪或巢式PCR實(shí)驗(yàn)使用1μL第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物或凝膠純化的PCR產(chǎn)物作為模板，而涉及從質(zhì)粒DNA擴(kuò)增的反應(yīng)使用相當(dāng)于大約5-10ng的1μL標(biāo)準(zhǔn)Miniprep(SIGMA)制劑。對(duì)于預(yù)測(cè)大小小于5kb的產(chǎn)物的擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)加入5μL 2mMdNTP溶液(Biotech International Ltd.)，并且對(duì)于大于5kb的產(chǎn)物的擴(kuò)增增至10μL。所有的反應(yīng)包含5μL 10×Advantage 2PCR緩沖液(CLONTECH)和無(wú)菌ddH2O至50μL，為了最佳擴(kuò)增，從MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒用戶手冊(cè)(CLONTECH)中推薦的程序修改使用降落式(touchdown)和常規(guī)的PCR的循環(huán)參數(shù)。
PCR純化在直接測(cè)序或連接于測(cè)序或表達(dá)載體中之前，按照制造廠商的說(shuō)明書(shū)使用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN，美國(guó))純化PCR產(chǎn)物。將純化的DNA常規(guī)地回收于30μL無(wú)菌ddH2O中并保存在-20℃。
凝膠提取將PCR產(chǎn)物常規(guī)凝膠純化以為第二輪或巢式PCR反應(yīng)提供模板，或者在一些情形中在直接測(cè)序前。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物并使用清潔的解剖刀片切割適當(dāng)?shù)腄NA片段。按照制造廠商的說(shuō)明書(shū)使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)從凝膠切片中純化DNA，并常規(guī)回收于30μL的無(wú)菌ddH2O中。將純化的DNA保存在-20℃。
連接為了測(cè)序的目的，將PCR產(chǎn)物克隆于pGEM-T Easy載體(Promega)中。如上所述純化擴(kuò)增的DNA并將8.5μL加入連接混合物，其包含0.5μLpGEM-TEasy載體，10μL 2x連接緩沖液，和1μL T4連接酶。通過(guò)吸取(pipetting)將溶液混合，并且在轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞之前在4℃下溫育O/N。
將載體pTrcHis B(Invitrogen)用于表達(dá)研究并且在下面詳細(xì)描述表達(dá)構(gòu)建體的發(fā)展。將純化的編碼待表達(dá)多肽的插入片段DNA(7μL)加入連接混合物，其包含2μL消化的pTrcHis B載體，10μL 2x連接緩沖液和1μL T4連接酶(Promega)。如上所述還制備只含載體的對(duì)照連接，但用ddH2O替代插入片段DNA。通過(guò)吸取將連接反應(yīng)物混合并在4℃下溫育O/N。
感受態(tài)細(xì)胞制備從DH5-α或TOP10大腸桿菌菌株的冷凍甘油原液中，將小部分劃線在LB培養(yǎng)基平板上并在4℃下溫育O/N。次日，選擇單克隆，轉(zhuǎn)移至100mL SOB培養(yǎng)基并在設(shè)置為200rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器中在37℃下溫育。在培養(yǎng)物的OD600達(dá)到大約0.5時(shí)，通過(guò)在2,500xg下4℃離心10分鐘收集細(xì)胞并重懸浮在10mL冰預(yù)冷的50mM CaCl2中。將細(xì)胞保持在冰上30分鐘，在2,500xg下4℃離心5分鐘，并溫和地重懸浮于4mL冰預(yù)冷的50mM CaCl2中。在冰上溫育1小時(shí)后，將感受態(tài)細(xì)胞分成90μL的等分試樣并保存在-80℃。
轉(zhuǎn)化用20μL連接反應(yīng)物中的10μL，或1μL(大約5-10ng)來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)小量制備(Sigma)質(zhì)粒制劑的質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化等分試樣的感受態(tài)細(xì)胞(90μL)。在溫和混合后，將溶液在冰上溫育20分鐘，在42℃的水浴中熱激90秒并回到冰上1分鐘。然后加入SOC培養(yǎng)基(900μL)并且通過(guò)反轉(zhuǎn)將溶液混合，之后在設(shè)置為200rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器中37℃溫育1小時(shí)。然后將適當(dāng)量的混合物涂布在包含100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，并在37℃下溫育O/N。為了轉(zhuǎn)化來(lái)源于pGEM-T Easy載體的重組質(zhì)粒，用20μL的50mg/ml Xgal和100μL的100mM IPTG預(yù)先涂布在平板上以允許通過(guò)顏色篩選直接鑒定重組克隆。在O/N溫育后，選擇最少3個(gè)推定包含重組質(zhì)粒的細(xì)菌克隆，培養(yǎng)O/N并用于如下所述的質(zhì)粒制備。通過(guò)使用1μL質(zhì)粒作為模板和載體或插入片段特異性引物的PCR擴(kuò)增，確定DNA插入片段的存在和大小，并隨后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物。
質(zhì)粒制備將細(xì)菌單克隆用于接種4mL含有100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，將培養(yǎng)物在旋轉(zhuǎn)振蕩器中37℃振蕩(200rpm)溫育O/N。次日按照制造廠商的說(shuō)明書(shū)使用GenEluteTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Sigma)從1.5mLO/N培養(yǎng)物中收獲質(zhì)粒。將純化的質(zhì)?；厥赵?00μL無(wú)菌ddH2O中并保存在-20℃。
DNA測(cè)序使用雙脫氧染料-終止劑化學(xué)和ABI自動(dòng)測(cè)序儀，在悉尼大學(xué)PrinceAlfred大分子分析中心(SUPAMAC，悉尼)進(jìn)行DNA測(cè)序。在含有20pmol適當(dāng)?shù)囊锖蚫dH2O至16μL終體積的混合物中，每個(gè)反應(yīng)提供大約每300bp 10ng純化的PCR產(chǎn)物，或3μg質(zhì)粒。
通過(guò)使用質(zhì)粒模板和載體或基因特異性引物的PCR常規(guī)地產(chǎn)生用于測(cè)序的DNA。對(duì)于克隆到pGEM-T Easy載體中的PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增，以下列程序一起使用M13正向和反相引物94℃ 1min；94℃30秒，55℃1分鐘和72℃3分鐘，30個(gè)循環(huán)。設(shè)計(jì)具有高Tms(＞72℃)的基因特異性引物，并用于使用更嚴(yán)格程序的擴(kuò)增中，其與上述類似但使用68℃的退火溫度。
編碼免疫顯性蛋白質(zhì)的cDNA的PCR產(chǎn)生用MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒(CLONTECH)連接物引物1(AP1)和從免疫顯性蛋白質(zhì)的N-末端和胰蛋白酶肽的蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物，使用連接物連接的雙鏈cDNA進(jìn)行3′RACE PCR。用下列降落(touchdown)程序產(chǎn)生RACE產(chǎn)物94℃ 1min；94℃30秒和65℃3分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃30秒，60℃30秒和72℃3分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃30秒，55℃1分鐘，72℃3分鐘35個(gè)循環(huán)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)物的等分試樣(10μL)并切除適當(dāng)?shù)臈l帶，純化并克隆于如上所述的pGEM-T Easy載體中。
從3′RACE產(chǎn)物的序列，設(shè)計(jì)基因特異性引物并與基于N-末端蛋白質(zhì)序列的簡(jiǎn)并引物一起使用，以從cDNA模板擴(kuò)增中間的DNA片段(在5’和3’末端之間)。以下列降落(touchdown)程序產(chǎn)生PCR產(chǎn)物94℃ 1min；94℃30秒，65℃30秒和72℃7分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃30秒，60℃30秒和72℃7分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃30秒，55℃1分鐘和72℃7分鐘35個(gè)循環(huán)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)物的等分試樣(10μL)并將適當(dāng)?shù)臈l帶切除和凝膠純化。然后將純化的第一輪DNA用作模板與巢式引物進(jìn)行下列程序擴(kuò)增94℃1分鐘；94℃30秒，55℃1分鐘和72℃8分鐘，30個(gè)循環(huán)。在瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠純化適當(dāng)?shù)腜CR產(chǎn)物，并克隆于pGEM-T Easy載體中并隨后測(cè)序。
使用cDNA作為模板，用AP1和從推定的中間DNA片段序列的5’區(qū)域設(shè)計(jì)的基因特異性引物進(jìn)行5′RACE。以下列降落(touchdown)程序產(chǎn)生PCR產(chǎn)物94℃ 1min；94℃30秒和72℃4分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃30秒，70℃4分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃20秒和68℃4分鐘，30個(gè)循環(huán)。為了表征產(chǎn)物，將來(lái)源于5′RACE反應(yīng)物的1μL樣品用作模板，與巢式連接物引物2(AP2，CLONTECH)和巢式基因特異性引物以下列程序擴(kuò)增94℃1分鐘；94℃30秒，65℃1分鐘和72℃4分鐘，30個(gè)循環(huán)。如上所述將適當(dāng)?shù)腜CR產(chǎn)物凝膠純化，克隆和測(cè)序。
從由5′和3′RACE產(chǎn)物獲得的序列，設(shè)計(jì)基因特異性引物并與cDNA模板一起使用以下列程序產(chǎn)生全長(zhǎng)cDNA94℃1分鐘；94℃20秒和72℃10分鐘，30個(gè)循環(huán)。如上所述凝膠純化和克隆DNA產(chǎn)物。編碼免疫顯性蛋白質(zhì)的克隆的測(cè)序使用引物-步行策略，從cDNA的5′末端向下游和從3′末端向上游移動(dòng)，將包含編碼全長(zhǎng)成熟免疫顯性蛋白質(zhì)的cDNA的克隆測(cè)序。使用最少3個(gè)克隆來(lái)產(chǎn)生正向和反向的共有序列。通過(guò)將5′和3′RACE產(chǎn)物測(cè)序獲得cDNA的極端5′和3′末端的序列。
RT-PCR從包含大約106個(gè)寄生蟲(chóng)的細(xì)胞沉淀中分離來(lái)源于純化的裂殖子和配子母細(xì)胞的信使RNA，并回收至10μL 10mM Tris-HCl pH8.0之中。使用OmniscriptTMRT試劑盒(QIAGEN)，用1μL每個(gè)mRNA制劑和特異于EmTFP250和組成型表達(dá)的巨型艾美球蟲(chóng)HSP70的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在缺乏逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下也進(jìn)行用作陰性對(duì)照的假逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在37℃擴(kuò)增所有的RT反應(yīng)物1小時(shí)并隨后用作標(biāo)準(zhǔn)PCR的模板。將對(duì)于EmTFP250的基因特異性引物和1μL每個(gè)RT反應(yīng)產(chǎn)物和陰性對(duì)照一起用于使用下列程序的擴(kuò)增94℃1分鐘；94℃30秒和72℃4分鐘，30個(gè)循環(huán)。另外將EmTFP250引物還用于使用1μL質(zhì)粒制劑和不含模板的對(duì)照、使用如上所述程序的PCR，所述質(zhì)粒制劑包含形成孢子的卵囊的編碼EmTFP250的cDNA。以較低Tms設(shè)計(jì)對(duì)于HSP70特異性的引物并與1μL來(lái)自各個(gè)RT的反應(yīng)產(chǎn)物和下列程序一起使用94℃1分鐘；94℃30秒，55℃1分鐘和72℃3分鐘，30個(gè)循環(huán)。
基因組DNA純化將包含大約5×105個(gè)純化的配子母細(xì)胞的細(xì)胞沉淀溫和地重懸浮在2mL PBS和40μL 10％N-十二烷基肌氨酸之中，并在37℃下溫育20分鐘。加入不含DNA酶的RNA酶(20μL)并將溶液在37℃下另外溫育20分鐘，接著加入20μL 20mg/mL的蛋白酶K并在37℃下溫育30分鐘。然后加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)并通過(guò)反轉(zhuǎn)將溶液混合，之后在5,000xg下離心以強(qiáng)迫分離成有機(jī)相和水溶性相。移開(kāi)包含基因組DNA的水相并如上所述用酚/氯仿/異戊醇重復(fù)萃取程序一次和用氯仿/異戊醇(24∶1)重復(fù)一次。在最后的萃取后，移開(kāi)水相并如上所述DNA EtOH沉淀。在真空罩中干燥基因組DNA沉淀大約1小時(shí)，并使其重懸浮在4℃75μL TE緩沖液中O/N。將樣品保存在4℃。
限制性酶切消化為了DNA印跡法，在通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳之前用許多限制酶消化來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)的基因組DNA。將大約2.5μg的基因組DNA加入每個(gè)消化混合物中，其包含40U限制酶(2-4μL)，10μL適當(dāng)?shù)?0x酶緩沖液，和ddH2O至100μL的終體積。將混合物在37℃下溫育2小時(shí)，然后如上所述EtOH沉淀O/N。次日將干燥的沉淀重懸浮在20μL TE緩沖液中，在65℃下加熱5分鐘并簡(jiǎn)短地渦旋。加入另外10U適當(dāng)?shù)南拗泼?0.5-1μL)，5μL 10x酶緩沖液和TE緩沖液至25μL，將混合物在37℃下溫育1小時(shí)。為了評(píng)估消化的程度，將2μL每個(gè)樣品在0.8％的瓊脂糖凝膠上分離。產(chǎn)生從大約23kb至1kb的可見(jiàn)均勻條帶的樣品被接受用于進(jìn)一步的分析。
在表達(dá)構(gòu)建體的構(gòu)建中，用BamHI和EcoRI限制酶雙酶切PCR擴(kuò)增的插入片段DNA和載體DNA。在通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析和隨后凝膠純化之前將混合物在37℃下溫育1小時(shí)。
DNA印跡如上所述通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離限制酶消化的基因組DNA或PCR產(chǎn)物。在用EtBr染色和隨后照相后，將凝膠浸沒(méi)在0.5M NaCl和0.5MNaOH的溶液中20分鐘以使DNA變性，然后在ddH2O中漂洗，之后在2.5M NaCl和0.5M Tris-Cl pH7.4的溶液中進(jìn)行中和20分鐘。在ddH2O中漂洗之后，通過(guò)毛細(xì)管作用使用標(biāo)準(zhǔn)程序(Sambrook)將DNA轉(zhuǎn)移至Hybond-N+核酸轉(zhuǎn)移膜(Amersham)。在O/N轉(zhuǎn)移后，使每個(gè)膜空氣干燥10分鐘，然后在80℃的真空烘箱中烘1小時(shí)。在與放射性標(biāo)記DNA探針雜交之前將膜保存在熱封的塑料袋中。
DNA探針制備將來(lái)源于編碼EmTFP250的cDNA的5′區(qū)域的1590bp DNA片段用來(lái)產(chǎn)生檢測(cè)限制酶消化的巨型艾美球蟲(chóng)基因組DNA的探針。使用下列程序用EmTFP250基因特異性引物和EmTFP250質(zhì)粒擴(kuò)增探針DNA94℃1分鐘；94℃30秒，68℃1分鐘和72℃3分鐘30個(gè)循環(huán)。將根據(jù)EmTFP250/EtMIC4 DNA序列同源性設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物用來(lái)產(chǎn)生檢測(cè)從來(lái)自澳大利亞艾美球蟲(chóng)屬品系的基因組DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的622bp探針。使用下列降落(touchdown)程序從巨型艾美球蟲(chóng)的基因組DNA擴(kuò)增探針DNA94℃1分鐘；94℃30秒，70℃30秒和72℃3分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃30秒，65℃30秒和72℃3分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃30秒，60℃1分鐘和72℃3分鐘，30個(gè)循環(huán)。
如上所述純化PCR擴(kuò)增的探針DNA，按照制造廠商的說(shuō)明書(shū)使用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(Roche)用32P-dCTP標(biāo)記大約25ng。按照Sambrook的方法通過(guò)TCA沉淀測(cè)定探針的比活性，具有大于75％的摻入的探針被接受使用。
雜交將每個(gè)尼龍膜放置在適當(dāng)大小的雜交管(Hybaid)中并加入預(yù)熱到65℃的雜交液。在65℃下預(yù)雜交2小時(shí)后，用預(yù)熱到65℃的新鮮雜交液替換溶液。通過(guò)在100℃下加熱10分鐘使放射性標(biāo)記的DNA探針變性，然后加入雜交管并允許在65℃下雜交16-20小時(shí)。在雜交后移開(kāi)膜，并在65℃下在2×SSC和0.1％SDS中進(jìn)行2×30分鐘的洗滌，接著在65℃下在0.1％SSC和0.1％SDS中洗滌2×30分鐘。然后用3 MM紙將膜吸干以去除多余的水份，覆蓋在塑料包中并且放置于在兩邊包含增感屏的膠卷暗盒中。在曝露于X光片適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后使用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒛わ@影。
通過(guò)PCR檢查基因組組構(gòu)使用一系列對(duì)于編碼EmTFP250的cDNA特異性的引物對(duì)，從包含EmTFP250 cDNA的質(zhì)粒和從巨型艾美球蟲(chóng)基因組DNA擴(kuò)增相應(yīng)的片段。使用下列高嚴(yán)格程序94℃1分鐘；94℃20秒和72℃4分鐘30個(gè)循環(huán)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物并將適當(dāng)?shù)臈l帶測(cè)序以便證實(shí)內(nèi)含子的存在。
通過(guò)PCR和DNA雜交檢測(cè)艾美球蟲(chóng)屬的澳大利亞品系中的EmTFP250同源物將根據(jù)EmTFP250和EtMIC4之間的序列同源性設(shè)計(jì)的一對(duì)簡(jiǎn)并PCR引物用于基因組DNA的擴(kuò)增，所述基因組DNA分離自雞的7種艾美球蟲(chóng)屬寄生蟲(chóng)的澳大利亞品系。將來(lái)源于每個(gè)品系的大約50ngDNA與下列降落式(touchdown)PCR程序一起使用94℃1分鐘；94℃30秒，70℃30秒和72℃3分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃30秒，65℃30秒和72℃3分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃30秒，60℃1分鐘和72℃3分鐘，30個(gè)循環(huán)。在0.8％的瓊脂糖凝膠上分離來(lái)源于每個(gè)反應(yīng)的10μL樣品，隨后染色并照相，然后通過(guò)DNA印跡轉(zhuǎn)移至尼龍膜。如上所述使用以上的簡(jiǎn)并引物對(duì)從巨型艾美球蟲(chóng)Houghton品系的基因組DNA產(chǎn)生DNA探針，并與轉(zhuǎn)移的DNA雜交。在雜交和洗滌程序后，將膜曝露于X光片10和30分鐘的時(shí)間。
通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析顯示，通過(guò)故意的用巨型艾美球蟲(chóng)感染母雞誘導(dǎo)的保護(hù)性母體抗體始終識(shí)別在巨型艾美球蟲(chóng)的粗提物中的一種高分子量，無(wú)性繁殖階段的蛋白質(zhì)。另外，發(fā)現(xiàn)用乳化的免疫顯性蛋白質(zhì)的SDS-PAGE剪切塊的免疫在隨后用巨型艾美球蟲(chóng)攻擊的雞中誘導(dǎo)顯著的保護(hù)。(Smith等，1994)。
根據(jù)提示關(guān)于免疫顯性蛋白質(zhì)的保護(hù)能力的初步研究，以下介紹的工作的目的是兩方面的(1)部分純化免疫顯性蛋白質(zhì)以便獲得用于cDNA克隆中的下游應(yīng)用的N-末端和肽序列數(shù)據(jù)和；(2)使用識(shí)別該蛋白質(zhì)的抗血清以提供關(guān)于它的生物化學(xué)的基本信息，以及對(duì)它的階段發(fā)育和跨越艾美球蟲(chóng)屬的各種品系和物種的保守性的了解。
結(jié)果粗制抗原的免疫檢測(cè)將大約5μg形成孢子的卵囊粗提物樣品加樣至5％聚丙烯酰胺分離膠(Bio-Rad)的分開(kāi)的孔上，電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF。在轉(zhuǎn)移后將PVDF切割成條，并用在先前母體免疫試驗(yàn)(Smith等，1995)期間收集的各種雞血清和卵黃檢測(cè)單個(gè)條帶。以1/100的稀釋度使用血清，以1/500的稀釋度使用卵黃。
用于分析圖9所示條帶的所選免疫血清是從感染巨型艾美球蟲(chóng)的母雞的3日齡孵化小雞(泳道1)，用巨型艾美球蟲(chóng)攻擊的類似的12日齡孵化小雞(泳道2)，和用巨型艾美球蟲(chóng)的裂殖子粗提物免疫的母雞(泳道3)中收獲的。所有主要檢測(cè)到的蛋白質(zhì)條帶具有大于230kDa的表觀分子量。使用來(lái)源于230kDa條帶的裂殖子剪切塊實(shí)驗(yàn)的卵黃樣品的分析也與相同大小的條帶反應(yīng)，盡管沒(méi)有同樣強(qiáng)烈(泳道4)。來(lái)自未感染的鳥(niǎo)的對(duì)照雞血清不與提取物反應(yīng)(泳道5)。
免疫顯性蛋白質(zhì)的純化離子交換層析如上所述將大約1.5mg形成孢子的卵囊粗制抗原加樣至DEAEsephacel離子交換柱上。根據(jù)表示使用遞增的NaCl濃度洗脫的A280nm吸收峰(圖10)手動(dòng)收集級(jí)分。
通過(guò)離心超濾濃縮所有級(jí)分，對(duì)于每個(gè)產(chǎn)生大約60μl的保留體積。從每個(gè)級(jí)分中，將15μl滲余物加樣至平行的7.5％SDS PAGE凝膠(Bio-Rad)上并在還原條件下電泳。在電泳后，將凝膠之一進(jìn)行銀染色(圖11.A)，同時(shí)將第二塊凝膠蛋白質(zhì)印跡，并用來(lái)自用裂殖子粗提物感染的母雞的血清檢測(cè)轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)(圖11.B)。以在PBS中1/100的稀釋度使用血清樣品。
如通過(guò)銀染和免疫印跡都可以看出，以大于230kDa的表觀分子量遷移的免疫顯性蛋白質(zhì)主要出現(xiàn)在用0.3-0.5M NaCl洗脫的那些級(jí)分中。如通過(guò)銀染色顯示，在前面的級(jí)分中洗脫了污染的大部分，較小分子量的蛋白質(zhì)，或者可能在超濾期間去除它們。
為了進(jìn)一步分析部分純化的包含免疫顯性蛋白質(zhì)的級(jí)分，將15μl用0.3-0.4M NaCl洗脫的那些級(jí)分中的每一個(gè)加樣至平行的5％SDS-PAGE凝膠上(Bio-Rad)。在電泳后將凝膠之一銀染(圖12A)，另一個(gè)蛋白質(zhì)印跡(圖12B)。用在用巨型艾美球蟲(chóng)攻擊孵化的小雞后，從感染巨型艾美球蟲(chóng)的母雞的12日齡孵化小雞收集的血清免疫檢測(cè)轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)。以1/100的稀釋度使用血清。
在富集免疫顯性蛋白質(zhì)和通過(guò)5％SDS-PAGE分離的那些級(jí)分中，蛋白質(zhì)作為在250kDa之上遷移的單獨(dú)的條帶出現(xiàn)并與污染，共遷移的蛋白質(zhì)分離(圖12A)。與母體免疫相關(guān)的血清與高分子量蛋白質(zhì)條帶強(qiáng)烈反應(yīng)(圖12B)。
大小排阻層析通過(guò)IEX層析分離大約10mg形成孢子的卵囊粗提物，并如上所述將收集的級(jí)分濃縮。合并用0.3-0.4M NaCI洗脫的級(jí)分并通過(guò)真空離心2小時(shí)將樣品體積減少至15μL。將濃縮的樣品注射到Superdex 200 PC凝膠過(guò)濾柱上，并如上所述洗脫和收集蛋白質(zhì)級(jí)分。圖13顯示獲得的A280nm洗脫圖。對(duì)于級(jí)分7-15中的每一個(gè)，將5μL加樣至7.5％SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad)的分離孔上并在還原條件下電泳。期望在級(jí)分15之后洗脫的級(jí)分不包含高分子量免疫顯性蛋白質(zhì)并不被分析。在電泳后，將凝膠進(jìn)行銀染色(圖14)。
從圖14可以看出，遷移至250kDa之上的免疫顯性蛋白質(zhì)通過(guò)級(jí)分7-15洗脫。盡管所有級(jí)分似乎明顯比IEX純化的前體級(jí)分透明，剩余一些較低分子量的污染蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)測(cè)序N-末端測(cè)序通過(guò)離子交換層析純化約10mg來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的Houghton品系的形成孢子的卵囊粗提物，如上所述通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)一步分離富集免疫顯性蛋白質(zhì)的濃縮級(jí)分。在將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF和通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)后，切除包含免疫顯性蛋白質(zhì)的膜片，隨后在澳大利亞蛋白質(zhì)組分析機(jī)構(gòu)通過(guò)Edman降解法將蛋白質(zhì)樣品測(cè)序。另外，在Biotech Australia Pty.Ltd.將如上制備的和來(lái)源于大約1.0mg巨型艾美球蟲(chóng)澳大利亞品系的形成孢子的粗提物的蛋白質(zhì)樣品測(cè)序。
如表1所示的N-末端測(cè)序結(jié)果顯示IEX層析，離心超濾和凝膠電泳的方法充分純化了用于氨基末端分析目的的免疫顯性蛋白質(zhì)。從Houghton品系的樣品大約13pmol蛋白質(zhì)可供測(cè)序，而存在大約1pmol澳大利亞品系的樣品。Houghton品系樣品的序列要求16個(gè)循環(huán)，在第9循環(huán)處有一個(gè)空白，其可能顯示在那個(gè)循環(huán)的半胱氨酸殘基或修飾的氨基酸(例如糖基化)。澳大利亞品系的序列要求8個(gè)循環(huán)，與對(duì)Houghton品系序列預(yù)測(cè)的開(kāi)始的8個(gè)殘基完全匹配。
表1從巨型艾美球蟲(chóng)的Houghton和澳大利亞品系中分離的免疫顯性蛋白質(zhì)的N-末端測(cè)序結(jié)果。使用單字母氨基酸符號(hào)表示序列，N-末端在左邊。
胰蛋白酶肽測(cè)序通過(guò)IEX層析純化大約10mg形成孢子的卵囊粗提物，合并富集免疫顯性蛋白質(zhì)的級(jí)分，如上所述通過(guò)離心超濾濃縮并通過(guò)SDS-PAGE分離。然后將包含免疫顯性蛋白質(zhì)的凝膠條從凝膠上切除，并遞送至澳大利亞蛋白質(zhì)組分析機(jī)構(gòu)來(lái)胰蛋白酶消化，和隨后通過(guò)質(zhì)譜分析來(lái)序列分析產(chǎn)生的肽。對(duì)于類似地來(lái)源于大約10mg形成孢子的卵囊粗提物的第二個(gè)蛋白質(zhì)樣品，重復(fù)該程序。
對(duì)于2個(gè)胰蛋白酶肽產(chǎn)生預(yù)測(cè)序列并在表2中顯示，然而，對(duì)調(diào)用的序列給予有限的置信度?？赡苡捎诘鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)，許多產(chǎn)生的肽具有相似的質(zhì)量，使得難以區(qū)分它們和保證只有單個(gè)的肽進(jìn)行MS/MS分析(Hains，APAF，個(gè)人通訊聯(lián)絡(luò))。此外由于它們相同的分子量，該技術(shù)不區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸(表示為[L/I])。
表2從巨型艾美球蟲(chóng)的Houghton品系分離的免疫顯性蛋白質(zhì)的胰蛋白酶肽測(cè)序結(jié)果。使用單字母氨基酸符號(hào)表示序列，每個(gè)肽的N-末端在左邊。
序列分析將關(guān)于免疫顯性蛋白質(zhì)的N-末端和胰蛋白酶肽產(chǎn)生的序列提交針對(duì)通過(guò)NCBI訪問(wèn)的所有非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTP分析。使用Basic BLAST參數(shù)未獲得對(duì)于序列有意義的對(duì)比，然而對(duì)于胰蛋白酶肽#1選擇PAM-30矩陣和100的E值的高級(jí)BLAST搜索產(chǎn)生與來(lái)源于柔嫩艾美球蟲(chóng)的微絲蛋白質(zhì)4(EtMIC4)的對(duì)比。針對(duì)專利數(shù)據(jù)庫(kù)使用相同的搜索產(chǎn)生與來(lái)源于柔嫩艾美球蟲(chóng)的表面抗原5401-一種與EtMIC4幾乎相同的蛋白質(zhì)-的單個(gè)對(duì)比。N-末端序列和胰蛋白酶肽#2序列都不能與EtMIC4或表面抗原5401序列對(duì)比。
Triton X-114分級(jí)為了確定免疫顯性無(wú)性繁殖階段的蛋白質(zhì)主要是作為可溶性蛋白質(zhì)存在于寄生蟲(chóng)內(nèi)，還是作為整合膜蛋白，在去污劑TX-114中將巨型艾美球蟲(chóng)的裂殖子分級(jí)。如上所述溶解和分配大約107個(gè)裂殖子，保留水和去污劑可溶性級(jí)分和去污劑不溶性級(jí)分。用水將所有級(jí)分稀釋至250μL體積(與初始的細(xì)胞裂解液體積相等)和4×SDS-PAGE將樣品緩沖液減小至1x濃度。從每個(gè)樣品中，將20μL加樣至7.5％SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad)的分開(kāi)的孔上并如上所述電泳。然后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF，并用以1/100稀釋度使用的抗粗制裂殖子血清檢測(cè)。
從圖15可以看出，高分子量的免疫顯性蛋白質(zhì)主要分配于水溶性級(jí)分(泳道1)中，然而在TX-114去污劑可溶性相中微弱可見(jiàn)以相同表觀分子量遷移的蛋白質(zhì)條帶(泳道2)。另外在去污劑不溶性級(jí)分中可見(jiàn)相同大小的蛋白質(zhì)條帶(泳道3)。
跨越發(fā)育階段檢測(cè)免疫顯性蛋白質(zhì)如上所述制備來(lái)源于發(fā)育的無(wú)性和有性階段的蛋白質(zhì)提取物，并通過(guò)Western分析比較。將大約10μg來(lái)源于形成孢子的卵囊，裂殖子和配子母細(xì)胞粗提物的樣品加樣于7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠的相鄰的孔上，在還原條件下電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF。在轉(zhuǎn)移后，用來(lái)源于感染裂殖子粗提物的母雞的血清免疫檢測(cè)膜。
如在圖16中可以看出，在形成孢子的卵囊和裂殖子的提取物中檢測(cè)免疫顯性蛋白質(zhì)(泳道1和2)，但在配子母細(xì)胞粗提取物中未顯示(泳道3)。該結(jié)果與早期的發(fā)現(xiàn)(Smith，1994)一致，顯示免疫顯性蛋白質(zhì)局限于發(fā)育的無(wú)性繁殖階段。
跨越艾美球蟲(chóng)屬的品系和物種檢測(cè)免疫顯性蛋白質(zhì)為了研究免疫顯性蛋白質(zhì)的保守性，使用來(lái)自感染裂殖子粗提物的母雞的血清，通過(guò)免疫印跡分析來(lái)比較來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的Houghton和澳大利亞品系，和來(lái)源于柔嫩艾美球蟲(chóng)的澳大利亞品系的形成卵囊的粗提物。如上所述，在還原條件下在7.5％SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離大約10μg各個(gè)提取物，轉(zhuǎn)移至PVDF并免疫檢測(cè)。
從圖17中，在來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的Houghton品系(A，泳道1)和澳大利亞品系(A，泳道2；B，泳道1)的提取物中觀察到以約250kDa遷移的免疫顯性蛋白質(zhì)。另外，在柔嫩艾美球蟲(chóng)澳大利亞品系的提取物(B，泳道2)中血清主要檢測(cè)到高分子量蛋白質(zhì)條帶，其遷移稍微快于在巨型艾美球蟲(chóng)的提取物中可見(jiàn)的免疫顯性蛋白質(zhì)條帶。該結(jié)果提示跨越艾美球蟲(chóng)屬品系和物種的免疫顯性蛋白質(zhì)的保守性程度，暗示功能上的意義。
SDS-PAGE表征在還原和非還原條件下，通過(guò)SDS-PAGE分析富集高分子量免疫顯性蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)樣品。如上所述，通過(guò)離子交換層析純化大約1.2mg形成孢子的卵囊的粗制抗原，合并包含免疫顯性蛋白質(zhì)的級(jí)分(0.3和0.4MNaCI級(jí)分)，并濃縮至60μL體積。將來(lái)自那些級(jí)分的等分試樣(8μL)加樣至7.5％(圖18.A)和5％(圖18.B)PAGE凝膠(Bio-Rad)上，并且在樣品緩沖液中含有或不含2-β-巰基乙醇的情況下電泳。在電泳后，將凝膠蛋白質(zhì)印跡并用以1/100的稀釋度使用的抗-粗制裂殖子血清進(jìn)行免疫檢測(cè)。
如在圖18.A中可以看出，在2.5-10％v/v濃度的2-β-巰基乙醇存在的情況下，當(dāng)在7.5％凝膠上分析富集免疫顯性的蛋白質(zhì)時(shí)(泳道2-6)，檢測(cè)到以約250kDa遷移的單一的主要條帶。然而在非還原條件下，血清檢測(cè)到比在還原樣品中可見(jiàn)的免疫顯性條帶遷移稍快的高分子量雙聯(lián)體條帶。另外，檢測(cè)到以大約75kDa的表觀分子量遷移的第二種免疫顯性條帶，其在還原的樣品中未顯示。
當(dāng)與在5％凝膠上的分離(圖18.B)相比時(shí)，在還原的樣品(泳道2)中檢測(cè)到以顯著高于250kDa的表觀分子量遷移的免疫顯性條帶。在非還原條件下，雙聯(lián)體條帶更明顯并且發(fā)現(xiàn)遷移顯著地快于還原樣品中的免疫顯性條帶。當(dāng)在7.5％凝膠上分離時(shí)，在非還原樣品中檢測(cè)到的75kDa條帶在5％聚丙烯酰胺上分離后未檢測(cè)到，可能因?yàn)樗呀?jīng)遷移到凝膠底部之外。它在還原條件下分析的樣品中不可見(jiàn)可能是因?yàn)樵谔烊坏鞍踪|(zhì)中存在的表位在還原后丟失，或者天然形式是較小的二硫鍵結(jié)合的多肽的寡聚體，其遷移出凝膠之外。
結(jié)果提示高分子量免疫顯性蛋白質(zhì)是單體，鏈間的二硫鍵結(jié)合穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)。在非還原條件下檢測(cè)到的雙聯(lián)體條帶可能說(shuō)明蛋白質(zhì)同分異構(gòu)體的形式的存在。
討論已經(jīng)描述為了蛋白質(zhì)測(cè)序目的的高分子量，免疫顯性蛋白質(zhì)的純化。通過(guò)離子交換層析將巨型艾美球蟲(chóng)形成孢子的卵囊提取物級(jí)分，通過(guò)離心超濾濃縮并進(jìn)一步通過(guò)SDS-PAGE分離以為N-末端和胰蛋白酶肽測(cè)序提供足夠純度和數(shù)量的蛋白質(zhì)。
為了研究在具有更高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)遷移，和選擇用于檢測(cè)的適當(dāng)抗體，在還原條件下最初將形成孢子的卵囊提取物在5％聚丙烯酰胺凝膠上分離，用在先前的母體免疫試驗(yàn)(Smith等，1994)期間收獲的各種血清和卵黃進(jìn)行免疫印跡。血清和卵黃樣品主要檢測(cè)到單一的蛋白質(zhì)條帶，表觀分子量顯著大于250kDa，稍微大于先前從使用11％凝膠的SDS-PAGE預(yù)測(cè)的230kDa(Smith等，1994)。然而估值只能被認(rèn)為是近似的，因?yàn)樵谝恍┣樾蜗碌鞍踪|(zhì)可以以表觀分子量不相稱的增大而遷移，例如糖基化和磷酸化的蛋白質(zhì)(Smith，1997；Dunn，1993)。
從在最初的免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中使用的血清和卵黃樣品中，選擇來(lái)源于感染巨型艾美球蟲(chóng)裂殖子粗提物的母雞的血清用于許多隨后實(shí)驗(yàn)中的免疫印跡。盡管理想地，本應(yīng)該在整個(gè)研究中使用母體保護(hù)性抗體，其來(lái)源于故意用活卵囊感染的母雞，可以極有限量地獲得該抗體，當(dāng)可能時(shí)保存。重復(fù)母體免疫試驗(yàn)以獲得抗體被認(rèn)為太費(fèi)時(shí)，并且不能排除在該實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的抗血清不能檢測(cè)相同免疫顯性蛋白質(zhì)的可能性?？梢蕴峁┹^大量的來(lái)源于感染裂殖子粗提物的母雞的抗血清，并證明是強(qiáng)烈反應(yīng)性的。盡管可以爭(zhēng)論不同的抗體可能主要檢測(cè)不同的蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示這不太可能。該分子量的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)組中相對(duì)稀少(Shirley等，1992)并且通過(guò)來(lái)自兩個(gè)來(lái)源的抗血清檢測(cè)的蛋白質(zhì)的銀染色未提示共遷移蛋白質(zhì)的存在。
在選擇和開(kāi)發(fā)用于純化免疫顯性蛋白質(zhì)的方法中考慮許多問(wèn)題，首先是蛋白質(zhì)的來(lái)源。先前的工作已經(jīng)在形成孢子的卵囊和裂殖子的提取物中檢測(cè)到蛋白質(zhì)，并且SDS-PAGE剪切塊保護(hù)實(shí)驗(yàn)使用從裂殖子制備的蛋白質(zhì)提取物。盡管根據(jù)與先前研究的聯(lián)系，可能已經(jīng)優(yōu)選從裂殖子中獲得蛋白質(zhì)，證明難以獲得用于方法開(kāi)發(fā)和測(cè)序所需的大量裂殖子。據(jù)估計(jì)對(duì)于250kDa蛋白質(zhì)和要求的對(duì)于N-末端測(cè)序所建議的10pmol最小量(McInerny，Biotech Australia和APAF，個(gè)人通訊聯(lián)絡(luò))，將需要大約10μg純化的蛋白質(zhì)。保守地，如果免疫顯性蛋白質(zhì)表示1/1000的巨型艾美球蟲(chóng)蛋白質(zhì)組，那么不考慮用于方法開(kāi)發(fā)，僅對(duì)于N-末端測(cè)序需要10mg粗提物。在為了收獲裂殖子的雞的常規(guī)感染中，從20只鳥(niǎo)中每只鳥(niǎo)獲得大約108個(gè)裂殖子，產(chǎn)生小于0.5mg的總蛋白質(zhì)提取物。比較起來(lái)，從20只鳥(niǎo)的感染中獲得大約1×108個(gè)卵囊，產(chǎn)生大約10mg的粗提物(結(jié)果未顯示)。另外難以純化裂殖子并且制劑總是包含一定程度的宿主組織和碎片污染，而更堅(jiān)固的卵囊相對(duì)容易清洗和通過(guò)次氯酸鈉處理滅菌。另外，通過(guò)與國(guó)家獸醫(yī)研究所(烏普薩拉，瑞典)合作可以獲得大量補(bǔ)充的形成孢子的卵囊。
盡管不能排除在形成孢子的卵囊和裂殖子提取物中檢測(cè)到的免疫顯性條帶不表示相同的蛋白質(zhì)，但它似乎不大可能?？?裂殖子粗制抗體在形成孢子的卵囊和裂殖子的提取物中主要檢測(cè)到大約250kDa的蛋白質(zhì)，并且如上所述，該高分子量的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)組內(nèi)相對(duì)稀少。另外，來(lái)源于SDS-PAGE剪切實(shí)驗(yàn)的卵黃樣品和來(lái)源于感染裂殖子粗提物的母雞的血清，兩者在形成孢子的卵囊粗提取物中都檢測(cè)到相同表觀分子量的蛋白質(zhì)條帶。
N-末端測(cè)序所需的蛋白質(zhì)的數(shù)量需要開(kāi)發(fā)產(chǎn)生富集免疫顯性蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)級(jí)分的程序。盡管2-D電泳具有巨大的分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的能力，但由于它固有的低蛋白質(zhì)加樣能力(Dunn，1997)，在本申請(qǐng)中認(rèn)為它不是用于N-末端測(cè)序的適當(dāng)技術(shù)。另外，在第一維上疏水的和高分子量蛋白質(zhì)微弱地吸附在IEF凝膠上(個(gè)人通訊聯(lián)絡(luò)，APAF)。選擇離子交換層析用于分離，其是適合于水溶性蛋白質(zhì)的廣泛使用的技術(shù)，具有高結(jié)合量并保持蛋白質(zhì)的生物活性(Scopes，1994)。
在IEX層析后，在進(jìn)一步分析之前必須脫鹽和濃縮級(jí)分。選擇具有100kDa的分子量截止的離心濃縮器用于本申請(qǐng)，產(chǎn)生另外的去除一些小分子量蛋白質(zhì)的好處。然后在努力利用免疫顯性蛋白質(zhì)的高分子量和去除剩余的較低分子量蛋白質(zhì)中嘗試凝膠過(guò)濾層析。然而該技術(shù)最適合作為純化中最后的精加工步驟，而不是作為對(duì)于相對(duì)復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物的分離工具(Scopes，1994)。隨后通過(guò)SDS-PAGE和銀染色的分析未提示富集免疫顯性蛋白質(zhì)的IEX級(jí)分的顯著的進(jìn)一步分離，未進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該方法。
N-末端和胰蛋白酶肽測(cè)序獲得的結(jié)果顯示，用于濃縮和分離免疫顯性蛋白質(zhì)的技術(shù)對(duì)于蛋白質(zhì)測(cè)序的目的是足夠的。將N-末端和胰蛋白酶序列進(jìn)行Basic BLAST搜索，然而未產(chǎn)生有意義的對(duì)比。然后進(jìn)行高級(jí)的BLAST搜索以便產(chǎn)生短序列對(duì)比，其使用適當(dāng)?shù)乃阉骶仃?PAM-30)和增大的期望(E)值。產(chǎn)生胰蛋白酶肽1#和來(lái)源于柔嫩艾美球蟲(chóng)的微絲蛋白質(zhì)4的對(duì)比，所述微絲蛋白質(zhì)4是一種在微絲中和在寄生蟲(chóng)表面上表達(dá)的高分子量酸性蛋白質(zhì)(Tomley等，2001)。盡管令人感興趣，結(jié)果不能被認(rèn)為是在統(tǒng)計(jì)上有意義的。在BLAST搜索中有意義的最大指標(biāo)是表示從具有相同分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)計(jì)的概率匹配數(shù)的E值(Wolfsberg和Madden，1999)。對(duì)于EtMIC4對(duì)比產(chǎn)生的43的E值提示匹配是由于偶然導(dǎo)致的強(qiáng)大的概率。
在陰離子交換層析過(guò)程中，免疫顯性蛋白質(zhì)在相對(duì)高的NaCl濃度下和在廣泛的濃度范圍內(nèi)被洗脫下來(lái)，其顯示蛋白質(zhì)是酸性的并且提示電荷不均勻性的程度。該微觀不均一性可以被認(rèn)為是許多因素造成，所述因素包括穩(wěn)定的備選構(gòu)象異構(gòu)體的存在，不同寡聚亞基的組合，或者不同程度的糖基化，磷酸化，甲基化或乙?；?Righetti，1983)。來(lái)源于在還原條件下的SDS-PAGE分析的結(jié)果顯示免疫顯性蛋白質(zhì)是由一條多肽鏈組成的單體，因此排除了不同寡聚體促使電荷不均勻性的可能性。然而當(dāng)在非還原條件下分析時(shí)，高分子量免疫顯性蛋白質(zhì)作為雙聯(lián)體條帶出現(xiàn)，可能提示穩(wěn)定的構(gòu)象異構(gòu)體，或由有差別的翻譯后修飾導(dǎo)致的同分異構(gòu)體的存在。在2-β-巰基乙醇存在的條件下，構(gòu)象異構(gòu)體或變化的修飾對(duì)于表觀分子量的影響于是被減小，其解釋在還原條件下在分析后檢測(cè)到單一的蛋白質(zhì)條帶。
實(shí)施例5克隆cDNA和表征編碼來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的免疫顯性無(wú)性繁殖階段的蛋白質(zhì)的基因在重組亞基疫苗的開(kāi)發(fā)中，克隆編碼所考慮的蛋白質(zhì)的cDNA極為重要。cDNA克隆的成功主要取決于高質(zhì)量cDNA文庫(kù)的制備和適當(dāng)?shù)暮Y選程序的選擇，所述篩選程序是由可提供的材料和信息決定。
已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了大量編碼推定的保護(hù)性抗原的重組cDNA克隆，大多數(shù)已經(jīng)通過(guò)用針對(duì)寄生蟲(chóng)粗提物或選擇的表面或內(nèi)部蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體篩選cDNA表達(dá)文庫(kù)而被鑒定。該技術(shù)依賴于相對(duì)大量的優(yōu)質(zhì)抗體的可用性，所述抗體能夠在變性條件下強(qiáng)烈識(shí)別所考慮的蛋白質(zhì)(Sambrook)。主要是因?yàn)橹豢蓸O有限量地提供該抗血清，不認(rèn)為該方法適合于克隆編碼巨型艾美球蟲(chóng)無(wú)性繁殖階段的免疫顯性蛋白質(zhì)的cDNA。作為備選，考慮基于RACE PCR的策略，最初使用簡(jiǎn)并引物，其是基于對(duì)于免疫顯性蛋白質(zhì)的N-末端和胰蛋白酶肽(實(shí)施例5)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列而設(shè)計(jì)的。然后RACE產(chǎn)物的產(chǎn)生和測(cè)序?qū)⑼ㄟ^(guò)5′和3′基因特異性引物的使用而促進(jìn)全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增和克隆。
描述工作的目的是使用基于PCR的方法克隆和測(cè)序編碼在實(shí)施例5中討論的高分子量免疫顯性蛋白質(zhì)的cDNA。另外，隨后的cDNA和相應(yīng)基因的表征可以提供增加的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的理解，并且進(jìn)一步舉例說(shuō)明它作為重組疫苗目標(biāo)的潛力。
結(jié)果RNA分離和cDNA文庫(kù)構(gòu)建用玻璃珠將卵囊破裂和用TRIzol′試劑處理產(chǎn)生的均漿證明是用于從巨型艾美球蟲(chóng)形成孢子的卵囊中分離高質(zhì)量的總RNA的適當(dāng)方法。如上所述從大約2.5×107個(gè)形成孢子的卵囊中分離RNA，提供184μg RNA的產(chǎn)率，相當(dāng)于7.36pg/卵囊。為了評(píng)估RNA制劑的完整性，在1％的非變性瓊脂糖凝膠上分離2.5μg樣品。如圖19所示，不連續(xù)的rRNA條帶和與18S rRNA條帶相比更高亮度的28S rRNA條帶顯示高質(zhì)量的樣品。另外通過(guò)測(cè)量A260/280比率評(píng)估制劑的純度，產(chǎn)生1.983的值，其屬于1.7-2.0的可接受范圍內(nèi)。
如上所述將全部總RNA樣品用于mRNA的制備，并將mRNA回收在8μL DEPC處理的ddH2O中。推定100％的回收和mRNA的相對(duì)分布在1-5％的總RNA之間，估計(jì)1.84-9.2μg的mRNA產(chǎn)率。cDNA文庫(kù)構(gòu)建需要1μg mRNA，將mRNA樣品中的一半用于第一條鏈cDNA合成。還使用包括在MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒中的1μg人胎盤(pán)聚腺苷酸化RNA進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照的cDNA合成，據(jù)報(bào)導(dǎo)典型地產(chǎn)生大約1μg的雙鏈cDNA。
為了監(jiān)測(cè)在構(gòu)建文庫(kù)過(guò)程中cDNA的合成和純化，在第一條鏈的反應(yīng)混合物中包括[α-32P]dCTP。在第二條鏈合成后，用900系列輻射微型監(jiān)測(cè)儀(Mini Instruments Ltd.，英國(guó))檢查實(shí)驗(yàn)的雙鏈cDNA產(chǎn)率，估計(jì)大約為陽(yáng)性對(duì)照雙鏈cDNA產(chǎn)率的1/10。因?yàn)闃悠樊a(chǎn)率顯著小于所預(yù)計(jì)的，沒(méi)有通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估形成孢子的卵囊雙鏈cDNA的完整性。將整個(gè)雙鏈cDNA樣品用于連接物連接，并按照適合于PCR的濃度稀釋。
為了保證cDNA連接物的連接成功和Marathon RACE方案適合于與PTC-200Peltier熱循環(huán)儀一起使用，與對(duì)照引物和推薦的PCR程序一起使用對(duì)照雙鏈cDNA進(jìn)行對(duì)照PCR實(shí)驗(yàn)。在擴(kuò)增后在1％的瓊脂糖凝膠上分析樣品。所有的5′和3′RACE以及內(nèi)部對(duì)照反應(yīng)都產(chǎn)生期望大小的DNA條帶(結(jié)果未顯示)。
克隆編碼免疫顯性蛋白質(zhì)的cDNA注釋為了方便，在表3中表示貫穿本部分涉及的簡(jiǎn)并和基因特異性引物的序列基于從免疫顯性蛋白質(zhì)的N-末端和胰蛋白酶肽產(chǎn)生的序列設(shè)計(jì)許多簡(jiǎn)并PCR引物。另外，進(jìn)一步研究EtMIC4和5401柔嫩艾美球蟲(chóng)表面抗原序列顯示類似于來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)免疫顯性蛋白質(zhì)的胰蛋白酶肽#1的許多短的肽基序。如圖20所示，所有柔嫩艾美球蟲(chóng)的基序在羧基末端包含保守的半胱氨酸殘基。將該信息用于設(shè)計(jì)另外的簡(jiǎn)并引物，其基于胰蛋白酶肽#1并結(jié)合C-末端半胱氨酸。通過(guò)考慮在柔嫩艾美球蟲(chóng)的基因序列中報(bào)導(dǎo)的密碼子使用(Ellis等，1993)降低引物內(nèi)的簡(jiǎn)并性水平。
將基于胰蛋白酶肽#1的簡(jiǎn)并引物用于3′RACE PCR，并且如圖21所示擴(kuò)增許多產(chǎn)物。使用引物AP1和FP008產(chǎn)生大約2.2kb的主要條帶，所述FP008是用適于C-末端半胱氨酸殘基的3′TG設(shè)計(jì)的。將該條帶克隆并部分測(cè)序，并提交針對(duì)所有通過(guò)NCBI訪問(wèn)的非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTX分析。分析顯示與EtMIC4預(yù)測(cè)的氨基酸序列區(qū)域的高水平同源性(圖22)。
正向和反向基因特異性引物是從3′DNA條帶的序列設(shè)計(jì)的并與基于N-末端蛋白質(zhì)序列的簡(jiǎn)并引物一起用于PCR。FP004(簡(jiǎn)并)和RP016(基因特異性)引物擴(kuò)增許多產(chǎn)物，選擇大約6kb的條帶用于凝膠純化(圖23A)。為了進(jìn)一步表征條帶，將1μL純化的產(chǎn)物用作使用FP006(簡(jiǎn)并)和RP015(基因特異性)引物的巢式PCR反應(yīng)的模板。將大約6kb的擴(kuò)增條帶(圖23B)凝膠純化，克隆并部分測(cè)序。
從上面獲得的序列的5′區(qū)域，設(shè)計(jì)基因特異性反向引物以擴(kuò)增cDNA的5′末端。使用引物RP019和RP020(位于RP019的3′的31bp)進(jìn)行分開(kāi)的5′RACE反應(yīng)，如圖24所示，泳道2和3，兩個(gè)反應(yīng)都擴(kuò)增500-600bp的相似大小的條帶。為了進(jìn)一步表征擴(kuò)增產(chǎn)物，將1μL RP020 RACE反應(yīng)用作使用AP2和RP019引物的巢式PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)產(chǎn)生500-600bp的期望大小的單一產(chǎn)物(圖24，泳道4)?？寺l帶，序列的翻譯顯示如通過(guò)Edman降解測(cè)定的成熟免疫顯性蛋白質(zhì)的N-末端蛋白質(zhì)序列(圖25)。
從5′和3′RACE產(chǎn)物的序列設(shè)計(jì)基因特異性引物以擴(kuò)增推定編碼完整的、成熟免疫顯性蛋白質(zhì)的cDNA。用引物FP015和RP023產(chǎn)生估計(jì)大約為7kb的單一條帶(圖26)，并如上所述克隆。在圖27中表示PCR克隆策略的圖解概述。
表3用于克隆巨型艾美球蟲(chóng)免疫顯性蛋白質(zhì)的cDNA的寡聚核苷酸引物。
引物 序列(5’-3’)AP1CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGCFP008 TGGACNGCNTGGACNGARTGFP004 AARTGYGARTCNGGNTGGACRP016 CGTTGTTCGCCGGCTTGCTGCACTCCTCFP006 GARTCNGGNTGGACNCCRP015 GTTGCATTCGCTCCATGGGCCCCACTGRP019 CTGTCCCACCACACACGACATATCGCCRP020 CCTGCATGCCCTCACTTCCTGCACCTCAP2ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCFP015 GCTGCACTCTATGGCGGAACAGGAATCGRP023 GCCTGTTTCGCCTTCGCATCCTTCG全長(zhǎng)cDNA的序列分析通過(guò)將推定編碼整個(gè)成熟蛋白質(zhì)的克隆和與此重疊的5′和3′RACEPCR產(chǎn)物測(cè)序產(chǎn)生全長(zhǎng)cDNA序列。除了在cDNA的極端5′未端的大約50bp區(qū)域以外全都被測(cè)序，重復(fù)努力將該富含T的區(qū)域測(cè)序是不成功的。cDNA預(yù)測(cè)7122bp的可讀框并且顯示7080bp的編碼區(qū)，680bp的3′非翻譯區(qū)和大約280bp的5′非翻譯區(qū)。針對(duì)所有通過(guò)NCBI訪問(wèn)的非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)的推定編碼序列的BLASTN分析顯示與EtMIC4的mRNA序列的高水平同源性(圖28)。將EmIP和EtMIC4 cDNA編碼序列配對(duì)的Clustal W(1.4)序列對(duì)比產(chǎn)生60％的同一性分?jǐn)?shù)(對(duì)比未顯示)。
預(yù)測(cè)的免疫顯性蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)在圖29中表示推定編碼EmIP的全長(zhǎng)cDNA和預(yù)測(cè)的翻譯。第一個(gè)符合讀框的ATG在從預(yù)測(cè)的ORF的開(kāi)始下游43bp處出現(xiàn)，并且可能表示起始甲硫氨酸，條件是它編碼在如通過(guò)Edman降解測(cè)定的成熟N-末端上游中出現(xiàn)的唯一符合讀框的甲硫氨酸。此外將翻譯序列通過(guò)ExPASY提交給SignalP 1.1版互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器，顯示典型的26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，從推定的起始甲硫氨酸開(kāi)始并在成熟N-末端之前緊接著具有一個(gè)切割位點(diǎn)。
通ORF預(yù)測(cè)的成熟多肽包括2334個(gè)氨基酸，如通過(guò)程序ProtParam確定具有預(yù)測(cè)的大約246kDa的分子量和4.2的理論pI。多肽具有表示12.3％氨基酸含量的高頻率的谷氨酸殘基，和與147個(gè)帶正電的殘基(精氨酸和賴氨酸)相比總共440個(gè)帶負(fù)電的殘基(谷氨酸和天冬氨酸)，其解釋了預(yù)測(cè)的負(fù)電荷。蛋白質(zhì)還特別富含甘氨酸和半胱氨酸，其分別表示11.8％和10.6％的氨基酸組成。
為了搜索蛋白質(zhì)內(nèi)部的保守結(jié)構(gòu)域，將多肽序列通過(guò)ExPASY服務(wù)器提交給SMART，ScanProsite和PROSCAN程序分析。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的大部分包含兩種不同富含半胱氨酸的附著結(jié)構(gòu)域的重復(fù)，其已知與細(xì)胞之間和細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的重要的結(jié)合相互作用相關(guān)。第一組包括16個(gè)人血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1)的類型1重復(fù)的截短形式的重復(fù)，出現(xiàn)在殘基27-194(4拷貝)，1517-1648(3拷貝)和1765-2143(9拷貝)(圖30)。16個(gè)重復(fù)中的9個(gè)其特征在于WXXW基序，其類似于與蛋白聚糖和硫酸化糖脂結(jié)合直接相關(guān)的TSP-1 WSXW基序(Guo等，1992)。WXXW基序的下游，重復(fù)中的8個(gè)包含基本殘基基序RXR，其與糖胺聚糖介導(dǎo)的細(xì)胞結(jié)合活性相關(guān)(Gantt等，1997)。
第二個(gè)附著結(jié)構(gòu)域組構(gòu)成大約57％的成熟蛋白質(zhì)并包含31個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣(EGF-樣)結(jié)構(gòu)域家族的串聯(lián)重復(fù)，其出現(xiàn)在殘基195-1513之間(圖31)。在真核生物的大量膜結(jié)合的和胞外蛋白質(zhì)中已經(jīng)鑒定了這些結(jié)構(gòu)域，并且被認(rèn)為主要涉及配體受體的相互作用。結(jié)構(gòu)域的特有特征是存在6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基。所有存在于免疫顯性蛋白質(zhì)中的EGF樣重復(fù)提示為了它們的生物功能需要鈣的EGF-CA鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域亞型的典型模式。
在TSP-1重復(fù)7和8之間(殘基1649-1764)多肽包含2個(gè)富含谷氨酸和甘氨酸殘基的低復(fù)雜，高度帶負(fù)電荷的區(qū)域中的第一個(gè)。第一個(gè)區(qū)域其特征在于7個(gè)重復(fù)的基序GEVQPGTEEGAGVG SEQ.ID NO.的簡(jiǎn)并形式(圖32A)。第二個(gè)區(qū)域出現(xiàn)在殘基2144-2285之間的最后TSP-1重復(fù)之后，另外富含脯氨酸殘基(圖32B)。緊接著第二個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域的下游是預(yù)測(cè)的跨膜區(qū)域(TM)和胞質(zhì)尾區(qū)(CT)，其在頂復(fù)門(mén)(apicomplexa)微絲蛋白質(zhì)的TRAP家族的成員中發(fā)現(xiàn)高度保守(圖33)。胞質(zhì)尾區(qū)區(qū)域其特征通常在于在TM附近保守的酪氨酸殘基和靠近C-末端保守的色氨酸殘基的存在。
蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征在圖34中用示意圖顯示。針對(duì)所有通過(guò)NCBI訪問(wèn)的非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)多肽序列的BLASTP分析顯示與EtMIC4的最高分對(duì)比，和與蛋白質(zhì)的原纖蛋白家族成員的有意義分?jǐn)?shù)(圖35)。與EtMIC4的ClustalW(1.1)對(duì)比顯示61％的氨基酸同一性分?jǐn)?shù)，另外10％相似性(未顯示全對(duì)比)。通過(guò)用GAP和GAPSHOW程序分析在圖36中圖解表示在氨基酸水平上EmIP和EtMIC4之間的總體相似性，其顯示在由EGF樣重復(fù)跨越的區(qū)域內(nèi)特別高的保守程度。兩個(gè)蛋白質(zhì)在N-末端最不相似。
跨越發(fā)育階段的免疫顯性蛋白質(zhì)的表達(dá)注釋為了方便，貫穿本部分涉及的基因特異性引物的序列在表4中表示為了證明顯示EmIP局限于發(fā)育的無(wú)性繁殖階段的早期發(fā)現(xiàn)，從裂殖子和配子母細(xì)胞中分離mRNA并使用EmIP基因特異性引物RP022進(jìn)行RT-PCR。另外，引物CRP6(對(duì)于組成型表達(dá)的巨型艾美球蟲(chóng)HSP70特異)被包括在所有的RT反應(yīng)內(nèi)作為陽(yáng)性對(duì)照。在缺乏逆轉(zhuǎn)錄酶的情形下還進(jìn)行重復(fù)反應(yīng)以證實(shí)產(chǎn)生的PCR條帶不是從可能污染mRNA樣品的基因組DNA擴(kuò)增的。用1μL每個(gè)RT反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)，使用EmIP特異性引物FP010和RP023以產(chǎn)生1211bp期望大小的產(chǎn)物，和HSP70特異性引物CFP1和CRP3以產(chǎn)生具有336bp預(yù)測(cè)大小的條帶。為了證實(shí)用EmIP引物擴(kuò)增的產(chǎn)物的同一性，如上所述將1μL包含形成孢子的卵囊的編碼EmIP的cDNA也用于使用FP010和RP023的擴(kuò)增。還包括無(wú)模板對(duì)照以確保PCR試劑未被污染。
在PCR后，通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分析來(lái)自所有反應(yīng)的樣品。如在圖37中可以看出，對(duì)EmIP特異性的引物從形成孢子的卵囊cDNA中擴(kuò)增期望大小的條帶(泳道2)，并在裂殖子中檢測(cè)到對(duì)EmIP特異性的信使RNA(泳道3)。從配子母細(xì)胞的mRNA模板未產(chǎn)生對(duì)EmIP特異性的PCR產(chǎn)物(泳道4)，然而HSP70陽(yáng)性對(duì)照引物從裂殖子(泳道5)和配子母細(xì)胞(泳道6)的mRNA中擴(kuò)增期望大小的條帶。在RT陰性對(duì)照中(泳道7和8)，或者在無(wú)模板對(duì)照中(泳道9)未產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果證實(shí)免疫顯性蛋白質(zhì)存在于發(fā)育的無(wú)性繁殖階段但在配子母細(xì)胞中不表達(dá)。
表4在RT-PCR分析中用于基因特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增的寡聚核苷酸引物。
當(dāng)適用時(shí)給出PCR產(chǎn)物的預(yù)測(cè)大小。
基因 引物 序列(5’-3’)產(chǎn)物大小(bp)EmIP RP022CGAGCTCTTGGGGTGGAGATGCAACTGN/AEmHSP70 CRP6 TGTTTATTAGCCTCATCCTCTGCC N/AEmIP FP010CAGTGGGGCCCATGGAGCGAATGCAAC1211RP023GCCTGTTTCGCCTTCGCATCCTTCGEmHSP70 CFP1 AGGATTAGAGACAGCAGGAGGAG336CRP3 CCTTGACTAAGTCTACCCTTATC基因組組構(gòu)限制酶分析在0.9％瓊脂糖凝膠上分離限制酶切消化的巨型艾美球蟲(chóng)的基因組DNA并如上所述轉(zhuǎn)移至尼龍膜。使用通過(guò)用EmIP特異性引物FP015(5′-GCTGCACTCTATGGCGGAACAGGAATCG-3′)和RP033(5′-GGCGCACTCGTCGATATCTTTGCATGC-3′)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的1590bp cDNA片段將膜雜交。如從圖38中可以看出，用BglII(泳道1)，EcoRI(泳道2)，HindIII(泳道3)，NcoI(泳道4)，和NdeI(泳道5)消化產(chǎn)生單一的雜交條帶，而由于在探針序列內(nèi)存在切割位點(diǎn)用NsiI(泳道6)消化產(chǎn)生兩條帶，因此互補(bǔ)的基因組DNA。DNA印跡分析提示編碼EmTFP250的基因是作為單拷貝存在于巨型艾美球蟲(chóng)的基因組內(nèi)。
內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)在用EmIP cDNA的PCR擴(kuò)增中使用一組4對(duì)基因特異性引物以產(chǎn)生一系列覆蓋編碼成熟免疫顯性蛋白質(zhì)的cDNA的DNA片段(表5)。為了檢測(cè)EmIP基因內(nèi)部的內(nèi)含子，還將引物對(duì)用于用巨型艾美球蟲(chóng)基因組DNA的擴(kuò)增中以產(chǎn)生表示相應(yīng)基因片段的DNA條帶。在通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物后，通過(guò)在相應(yīng)的cDNA片段上增加尺寸來(lái)鑒定推定的包含內(nèi)含子序列的DNA條帶。如圖39所示，所有的引物對(duì)從基因組DNA中主要擴(kuò)增單一的PCR產(chǎn)物，其尺寸大于cDNA對(duì)應(yīng)物。從對(duì)所有引物對(duì)進(jìn)行的單引物和無(wú)模板陰性對(duì)照中未產(chǎn)生產(chǎn)物(結(jié)果未顯示)。
為了證實(shí)內(nèi)含子的存在，將通過(guò)用引物FP010和RP023擴(kuò)增產(chǎn)生的基因組DNA片段純化和測(cè)序。序列分析分別顯示2個(gè)推定的139bp和151bp的內(nèi)含子，包含典型的真核供體/受體位點(diǎn)(圖40)。通過(guò)引物對(duì)FP015/RP033，F(xiàn)P021/RP030和FP026/RP015擴(kuò)增的基因組片段未被測(cè)序?？缭桨狼蛳x(chóng)屬的品系和物種的EmIP的保守性使用Clustal W(1.4)多重序列對(duì)比程序?qū)mIP和EtMIC4的cDNA和蛋白質(zhì)序列對(duì)比，基于高度保守區(qū)域(圖41)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并PCR引物。將引物對(duì)CP003(5′-AAGACTTCGGCGARGGNGGNGTNTG-3′)和CP004(5′-GCCTCGCACTCRTCNACRTCNACRC與來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的Houghton品系的基因組DNA一起使用，以擴(kuò)增具有622bp期望大小的DNA片段。產(chǎn)生適當(dāng)大小的DNA產(chǎn)物并通過(guò)凝膠純化和測(cè)序證實(shí)它的同一性。
表5在內(nèi)含子-外顯子分析中用于從cDNA和基因組DNA擴(kuò)增基因特異性產(chǎn)物的寡聚核苷酸引物對(duì)。顯示了擴(kuò)增cDNA的區(qū)域和預(yù)測(cè)的產(chǎn)物大小。
FP015 GCTGCACTCTATGGCGGAACAGGAATCG273-1865 1593RP033 GGCGCACTCGTCGATATCTTTGCATGCFP021 GCATGCAAAGATATCGACGAGTGCGCC 1839-4554 2716RP030 CTGCTGTGCACTCATCGATGTCAACGFP026 CGTTGACATCGATGAGTGCACAGCAG 4529-6209 1681RP015 GTTGCATTCGCTCCATGGGCCCCACTGFP010 CAGTGGGGCCCATGGAGCGAATGCAAC 6183-7394 1212RP023 GCCTGTTTCGCCTTCGCATCCTTCG為了評(píng)估EmIP的保守程度，將來(lái)源于雞中艾美球蟲(chóng)屬寄生蟲(chóng)的所有7個(gè)物種的澳大利亞分離物的基因組DNA與簡(jiǎn)并引物CP003和CP004一起用于PCR擴(kuò)增。在使用堆型艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)和柔嫩艾美球蟲(chóng)DNA產(chǎn)生的樣品中在0.8％瓊脂糖凝膠上分離的PCR產(chǎn)物的EtBr染色僅顯示微弱的適當(dāng)大小的條帶(結(jié)果未顯示)。為了進(jìn)一步研究PCR產(chǎn)物，通過(guò)DNA印跡將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜并與用引物CP003和CP004產(chǎn)生的Houghton品系，巨型艾美球蟲(chóng)的基因組DNA雜交。
如圖42A所示，在高嚴(yán)謹(jǐn)洗滌和將膜曝露于X光片10分鐘后，在堆型艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)和柔嫩艾美球蟲(chóng)的樣品中檢測(cè)到適當(dāng)大小的雜交帶(分別是泳道2，4，6和8)。在30分鐘曝光后(圖42B)，在布氏艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)和早熟艾美球蟲(chóng)的PCR產(chǎn)物(分別是泳道3，5和7)中也檢測(cè)到相似大小的單一雜交帶。結(jié)果提供在遍及導(dǎo)致雞球蟲(chóng)病的艾美球蟲(chóng)屬的品系和物種中EmIP基因是高度保守的進(jìn)一步的證據(jù)。
實(shí)施例6重組56kDa(r56)和82kDa(r82)配子母細(xì)胞抗原，和250kDa(r250)雞的無(wú)性繁殖階段的抗原的免疫和攻擊試驗(yàn)免疫動(dòng)物雞-84日齡(～12周)澳洲黑小公雞-保持含藥(robenidene)食物-所有小雞被單獨(dú)標(biāo)記和記錄抗原在37℃下在0.1mg/ml氨芐青霉素0.01M Mg2+SOB中培養(yǎng)在pTRCHisb表達(dá)系統(tǒng)中的重組蛋白質(zhì)，并用1Mm IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)。將蛋白質(zhì)在Ni-瓊脂糖柱上純化，濃縮，脫鹽，并與穩(wěn)定劑(3％乳糖，1％谷氨酸單鈉)一起凍干。使用Bradford測(cè)定測(cè)量所有抗原使用的蛋白質(zhì)濃度。將M.Wallach提供的親和純化的配子母細(xì)胞抗原(APGA)制劑用作試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。
組和劑量-每組使用9只雞；總共9組；總共使用81只雞。
-以下列抗原只在雞的一側(cè)每只鳥(niǎo)用0.5ml抗原/弗氏不完全抗原(FIA)混合物(0.25ml抗原/0.25ml FIA)將雞肌內(nèi)免疫組1 僅PBS組2 佐劑(FIA)/PBS組3 APGA(2.5g)組4 r250蛋白質(zhì)(1.0g)組5 r250蛋白質(zhì)(10.0g)組6 r56蛋白質(zhì)(0.5g)組7 r56蛋白質(zhì)(5.0g)組8 r82蛋白質(zhì)(0.5g)組9 r82蛋白質(zhì)(5.0g)免疫程序免疫1 第1周免疫2第3周放血 第6周放血 第8周放血/處死第9周分析-采(～1.5-2ml/鳥(niǎo))，分離血清并通過(guò)ELISA和免疫印跡檢驗(yàn)結(jié)果放血的結(jié)果在圖43中顯示。
攻擊動(dòng)物和寄生蟲(chóng)-使用來(lái)自基于第1次放血的ELISA的結(jié)果，具有最高抗體效價(jià)的每組的5只雞(148日齡；～4.5個(gè)月)；在PBS和FIA對(duì)照的情形中，使用具有最低抗體效價(jià)的雞-巨型艾美球蟲(chóng)(品系Houghton)；-在攻擊前1周從飼料中去除robenidene組下列各組和雞是取自如上所述的免疫試驗(yàn)，并用于攻擊實(shí)驗(yàn)中組1僅PBS 雞號(hào)碼2，3，4，6，8組2佐劑(FIA)/PBS 雞號(hào)碼12-16組3APGA(2.5g) 雞號(hào)碼20，22，23，25，27組5r250蛋白質(zhì)(10.0g) 雞號(hào)碼37，39，41，44，45組7r56蛋白質(zhì)(5.0g) 雞號(hào)碼57，59，60，61，63組9r82蛋白質(zhì)(5.0g) 雞號(hào)碼74，75，76，79，80攻擊程序去除Robenidene第6天每只鳥(niǎo)用100個(gè)形成孢子的卵囊攻擊卵囊收獲和計(jì)數(shù)程序感染后第0天感染后第1天感染后第2天感染后第3天感染后第4天檢查另一物種污染的卵囊排出量替換塑料片開(kāi)始收集。
感染后第5天收集糞便，并將卵囊計(jì)數(shù)感染后第6天收集糞便，并將卵囊計(jì)數(shù)感染后第7天收集糞便，并將卵囊計(jì)數(shù)感染后第8天收集糞便，并將卵囊計(jì)數(shù)感染后第9天收集糞便，并將卵囊計(jì)數(shù)感染后第10天收集糞便，并將卵囊計(jì)數(shù)表6免疫和攻擊試驗(yàn)I
實(shí)施例7250kDa無(wú)性繁殖階段蛋白質(zhì)的重組片段的表達(dá)選擇編碼預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域/胞質(zhì)尾區(qū)和上游親水結(jié)構(gòu)域的250kDa蛋白質(zhì)的區(qū)域用于表達(dá)研究(圖44)。選擇該區(qū)域是因?yàn)樵S多原因，如下所述1)在許多頂復(fù)門(mén)的微絲蛋白質(zhì)中已經(jīng)鑒定了類似的3′親水尾部區(qū)域并似乎對(duì)于該蛋白家族是獨(dú)特的；2)在其它微絲蛋白質(zhì)中該區(qū)域也被鑒定為免疫顯性，主要是柔嫩艾美球蟲(chóng)微絲蛋白質(zhì)1(EtMIC1)和表面抗原5401(EtMIC4)；3)從柔嫩艾美球蟲(chóng)5401抗原(EtMIC4)中表達(dá)類似的區(qū)域并發(fā)現(xiàn)提供針對(duì)柔嫩艾美球蟲(chóng)攻擊的顯著保護(hù)(Danforth等，1988)；4)蛋白質(zhì)的其它區(qū)域主要包括EGF樣和TSP-1樣的結(jié)構(gòu)域。發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)域類型在真核生物中高度保守，因此必須考慮它們誘導(dǎo)自身免疫的可能性。另外因?yàn)樵摻Y(jié)構(gòu)域類型的普遍，它們似乎不太可能負(fù)責(zé)誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。
設(shè)計(jì)PCR引物EP006(5′-TTGGATCCCGAATTGCACCCCATTCC-3′)和EP007(5′-TTGAATTCTGAATGTCGCCGCTGTCG-3′)以從編碼250kDa蛋白質(zhì)的cDNA克隆擴(kuò)增選擇的DNA區(qū)域。引物結(jié)合BamHI(EP006)和EcoRI(EP007)限制酶切位點(diǎn)以促進(jìn)克隆于選擇的表達(dá)載體中。將使用該引物隨后產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物凝膠純化并通過(guò)測(cè)序證實(shí)它的同一性。
選擇細(xì)菌表達(dá)載體pTrcHisB(Invitrogen)用于表達(dá)研究。用限制酶BamHI和EcoRI消化質(zhì)粒載體DNA和凝膠純化的cDNA插入片段，將消化的DNA片段凝膠純化和連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5α中并接著鋪平板和溫育，選擇產(chǎn)生的克隆，培養(yǎng)并用于質(zhì)粒制備。通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)選擇的重組體的同一性。
為表達(dá)作準(zhǔn)備，將包含表達(dá)構(gòu)建體的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主表達(dá)菌株TOP10中。在鋪平板和溫育后，選擇單個(gè)細(xì)菌克隆并用于建立LB培養(yǎng)基的O/N培養(yǎng)物。還建立僅有載體的陰性對(duì)照培養(yǎng)物。然后將每個(gè)培養(yǎng)物的等分試樣轉(zhuǎn)移至新鮮的LB培養(yǎng)基，并溫育直至細(xì)胞到達(dá)對(duì)數(shù)中期，在該階段加入1mM IPTG誘導(dǎo)階段表達(dá)。在誘導(dǎo)后0，1，2，5和24小時(shí)從表達(dá)培養(yǎng)物和陰性對(duì)照培養(yǎng)物中取樣，并離心將細(xì)菌細(xì)胞沉淀。然后將所有沉淀重懸浮在TE緩沖液中，超聲處理并離心以將水溶性級(jí)分(上清液)從不溶性級(jí)分(沉淀)中分離。在還原條件下在SDS-PAGE凝膠上分析所有級(jí)分并隨后用考馬斯亮藍(lán)染色。當(dāng)與陰性對(duì)照樣品相比時(shí)，在可溶性級(jí)分中檢測(cè)到過(guò)量表達(dá)的蛋白質(zhì)，其遷移至剛好在45kDa標(biāo)記之下。
使用抗體的可溶性級(jí)分的Western分析檢測(cè)到相同表觀分子量的蛋白質(zhì)條帶，所述抗體是與pTrcHis表達(dá)產(chǎn)物的6x組氨酸標(biāo)記反應(yīng)性的。表達(dá)蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)大小大約是30kDa，稍微小于在SDS-PAGE凝膠上所觀察到的。大小差異可能通過(guò)在表達(dá)蛋白質(zhì)中高頻率的脯氨酸殘基來(lái)解釋，已知其導(dǎo)致蛋白質(zhì)以明顯高的分子量遷移。
為免疫原性試驗(yàn)作準(zhǔn)備，對(duì)制造廠商的推薦方案較小修改，使用Ni-NTA瓊脂糖帶鎳(nickel-charged)樹(shù)脂(QIAGEN)純化表達(dá)的蛋白質(zhì)。包含6×His標(biāo)記的表達(dá)蛋白質(zhì)與樹(shù)脂結(jié)合并被洗脫緩沖液中增大濃度的咪唑替換。簡(jiǎn)短地，將細(xì)胞沉淀重懸浮在包含1mg/ml溶菌酶的裂解緩沖液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH8.0)中。在冰上將懸浮液超聲處理并離心沉淀不溶性物質(zhì)。然后將包含可溶性的表達(dá)蛋白質(zhì)的上清液與Ni-NTA樹(shù)脂混合并加至一次性洗脫柱。使淤漿沉降然后用洗滌緩沖液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0)洗滌，之后用洗脫緩沖液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH8.0)洗脫。通過(guò)還原的SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色分析洗脫級(jí)分的純度。
免疫原性的細(xì)節(jié)是關(guān)于56kDa和82kDa試驗(yàn)的。對(duì)于小鼠試驗(yàn)，每只小鼠使用0.5μg和5μg劑量的重組蛋白質(zhì)(6只鼠/組)。對(duì)于雞試驗(yàn)，每只鳥(niǎo)使用1μg和10μg劑量(9只鳥(niǎo)/組)。對(duì)于從小鼠和雞試驗(yàn)中收集的血清樣品的ELISA結(jié)果分別在圖45和46中表示。
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權(quán)利要求
1.一種分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或者編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中所述多肽具有如SEQ.ID.NO.6所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中所述多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有大于59％的同一性。
4.權(quán)利要求3的分離的核酸，其中所述多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少80％的同一性。
5.權(quán)利要求3的分離的核酸，其中所述多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少90％的同一性。
6.權(quán)利要求3的分離的核酸，其中所述多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少95％的同一性。
7.權(quán)利要求3的分離的核酸，其中所述多肽的同源物與具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少97％的同一性。
8.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中所述核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有大于60％的同一性。
9.權(quán)利要求8的分離的核酸，其中所述核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性。
10.權(quán)利要求9的分離的核酸，其中所述核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
11.權(quán)利要求10的分離的核酸，其中所述核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性。
12.權(quán)利要求11的分離的核酸，其中所述核苷酸序列與如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少97％的同一性。
13.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中所述核酸是DNA分子。
14.權(quán)利要求13的分離的核酸，其中所述DNA分子是cDNA分子。
15.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中所述核酸具有如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列。
16.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中所述核酸是RNA分子。
17.權(quán)利要求1的分離的核酸，其有效地與RNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子連接。
18.一種載體，其包含權(quán)利要求1的核酸。
19.一種載體，其包含權(quán)利要求15的核酸。
20.權(quán)利要求18的載體，其中所述載體是質(zhì)粒。
21.權(quán)利要求19的載體，其中所述載體是質(zhì)粒。
22.一種質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求1的核酸。
23.權(quán)利要求22的質(zhì)粒，其命名為230.1質(zhì)粒，在澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室保藏號(hào)為NM01/22396。
24.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求18的載體。
25.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求19的載體。
26.權(quán)利要求25的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自細(xì)菌細(xì)胞；植物細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞；和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
27.一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的核酸。
28.權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其命名為230.1細(xì)菌，在澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室保藏號(hào)為NM01/22397。
29.權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其另外包含來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或所述多肽的同源物。
30.一種生產(chǎn)重組的來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa多肽的方法，所述方法包含培養(yǎng)權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和分離重組的來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa多肽。
31.一種重組多肽，其通過(guò)權(quán)利要求30的方法生產(chǎn)。
32.一種針對(duì)柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物的疫苗，其包含權(quán)利要求1的核酸或權(quán)利要求22的質(zhì)粒，或權(quán)利要求31的重組多肽。
33.權(quán)利要求32的疫苗，其另外包含第二種抗原。
34.權(quán)利要求33的疫苗，其中所述第二種抗原選自編碼來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)的抗原的核酸，包含該核酸的質(zhì)粒，或由該核酸編碼的多肽。
35.權(quán)利要求33的疫苗，其中所述第二種抗原是從巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞中分離的56kDa蛋白質(zhì)。
36.權(quán)利要求33的疫苗，其中所述第二種抗原是從巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞中分離的82kDa蛋白質(zhì)。
37.權(quán)利要求33的疫苗，其中所述第二種抗原是從巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞中分離的230kDa蛋白質(zhì)。
38.權(quán)利要求35的疫苗，其另外包含從巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞中分離的82kDa蛋白質(zhì)。
39.權(quán)利要求38的疫苗，其另外包含從巨型艾美球蟲(chóng)的配子母細(xì)胞中分離的230kDa蛋白質(zhì)。
40.一種免疫受試者以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的方法，其包含向所述受試者施用權(quán)利要求32-39中任何一項(xiàng)的疫苗的步驟。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述受試者是選自牛，羊，豬和魚(yú)的物種。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述受試者是鳥(niǎo)類物種。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述鳥(niǎo)類物種是雞。
45.權(quán)利要求40的方法，其中所述施用步驟包含將所述疫苗噴霧至所述受試者的鼻孔內(nèi)。
46.權(quán)利要求40的方法，其中所述施用步驟包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
47.權(quán)利要求42的方法，其中所述施用是在卵內(nèi)進(jìn)行。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述施用是針對(duì)卵的氣囊，因此將胚胎與所述疫苗接觸。
49.一種給予鳥(niǎo)類物種的新生受試者以母體免疫以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的方法，其包含在產(chǎn)受精卵之前適當(dāng)?shù)臅r(shí)間向所述受試者的母體施用權(quán)利要求32-39中任何一項(xiàng)的疫苗，以便由此在所述新生的受試者中通過(guò)母體免疫給予保護(hù)以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的步驟。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
51.權(quán)利要求49的方法，其中所述施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
52.一種減少在來(lái)自鳥(niǎo)類物種的新生受試者的糞便中艾美球蟲(chóng)屬卵囊排出量的方法，其包含在產(chǎn)受精卵之前適當(dāng)?shù)臅r(shí)間向所述受試者的母體施用權(quán)利要求32-39中任何一項(xiàng)的疫苗，以便誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和將母體抗體傳遞給所述新生兒以使來(lái)自所述新生兒的卵囊排出量減小的步驟。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
55.一種來(lái)源于鳥(niǎo)類物種的具有氣囊的受精卵，其中用權(quán)利要求32的疫苗接種所述氣囊，該疫苗能夠在孵化之前或緊接著孵化后在胚胎中誘導(dǎo)抗有毒力形式的柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物的免疫應(yīng)答。
56.權(quán)利要求55的受精卵，其中所述鳥(niǎo)類物種選自雞，鴨，火雞，鵝，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
57.權(quán)利要求56的受精卵，其中所述鳥(niǎo)類物種是雞。
58.一種分離的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列，所述分離的核酸包含編碼具有如SEQ.ID NO.26所示氨基酸序列、來(lái)源于巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫顯性部分，或者編碼所述多肽的同源物的核苷酸序列。
59.一種載體，其包含權(quán)利要求58的核酸。
60.一種質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求58的核酸。
61.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求59的載體。
62.一種重組多肽，其中所述氨基酸序列由SEQ.ID NO.26表示。
63.一種針對(duì)柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物的疫苗，其包含權(quán)利要求58的核酸或權(quán)利要求60的質(zhì)粒，或者權(quán)利要求62的重組多肽。
64.一種給予鳥(niǎo)類物種的新生受試者以母體免疫以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的方法，其包含在產(chǎn)受精卵之前適當(dāng)?shù)臅r(shí)間向所述受試者的母體施用權(quán)利要求63的疫苗，以便由此在所述新生的受試者中通過(guò)母體免疫給予保護(hù)以抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物感染的步驟。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
66.權(quán)利要求64的方法，其中所述施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
67.一種減少在來(lái)自鳥(niǎo)類物種的新生受試者的糞便中艾美球蟲(chóng)屬卵囊排出量的方法，其包含在產(chǎn)受精卵之前適當(dāng)?shù)臅r(shí)間向所述受試者的母體施用權(quán)利要求63的疫苗，以便誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和將母體抗體傳遞給所述新生兒以使來(lái)自所述新生兒的卵囊排出量減小的步驟。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述鳥(niǎo)類物種選自雞，火雞，鵝，鴨，矮腳雞，鵪鶉和鴿子。
69.權(quán)利要求67的方法，其中所述施用包含靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
全文摘要
本發(fā)明提供分離的核酸或其互補(bǔ)序列，該核酸包含編碼來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或編碼該多肽同源物的核苷酸序列，和產(chǎn)生它的重組250kDa多肽的方法。提供分離的核酸或其互補(bǔ)序列，該核酸包含編碼具有此處的氨基酸序列、來(lái)自巨型艾美球蟲(chóng)子孢子/裂殖子250kDa多肽的免疫顯性部分，或編碼該多肽同源物的核苷酸序列。提供抗柔嫩艾美球蟲(chóng)，巨型艾美球蟲(chóng)，堆型艾美球蟲(chóng)，扁嘴艾美球蟲(chóng)，早熟艾美球蟲(chóng)，緩艾美球蟲(chóng)或布氏艾美球蟲(chóng)，或表達(dá)免疫交叉反應(yīng)性抗原的微生物的疫苗及免疫受試者以抗它們感染的方法。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1592751SQ02817524
公開(kāi)日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2002年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月6日
發(fā)明者戴維·威特科姆里, 尼古拉斯·C·史密斯, 邁克爾·瓦拉赫 申請(qǐng)人:Abic特瓦生物實(shí)驗(yàn)室有限公司, 悉尼理工大學(xué)