專利名稱：包含聚亞烷基二醇的降鈣素藥物-寡聚體共軛物的混合物、其應(yīng)用和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物-寡聚體共軛物，更確切地涉及降鈣素藥物-寡聚體共軛物。
背景技術(shù)：
降鈣素是一種天然存在的激素，半衰期短，據(jù)信它直接作用于破骨細(xì)胞(經(jīng)由細(xì)胞表面上的降鈣素受體)。這種作用可以直接抑制破骨性骨吸收，這可以引起血鈣過少和/或血磷酸鹽過少性血清效應(yīng)。降鈣素可以用于治療各種骨障礙，包括但不限于骨質(zhì)疏松和佩吉特氏病。
骨質(zhì)疏松是這樣一種骨疾病，其中骨組織被正常地礦質(zhì)化，但是骨量減少，小梁狀骨的結(jié)構(gòu)完整性被削弱了。密質(zhì)骨變得更加多孔和更薄。這使骨更脆弱，更容易骨折。在美國，約21％的絕經(jīng)后婦女患有骨質(zhì)疏松(低骨密度)，約16％已經(jīng)發(fā)生過骨折。在80歲以上的婦女中，約40％已經(jīng)經(jīng)歷過髖骨、椎骨、手臂或骨盆的骨折。老年男性與婦女的人口一直在增加，因此患有骨質(zhì)疏松的人數(shù)也在增加。
作為皮下注射給藥的降鈣素已經(jīng)顯示可顯著提高骨密度；不過，已有報道說副作用的發(fā)生率高，包括注射部位的疼痛、面紅和惡心，這可能限制藥物的應(yīng)用。
骨的佩吉特氏病是一種未知來源的代謝性骨障礙，它通常影響老年人。該疾病導(dǎo)致骨生成增加和不規(guī)則，因?yàn)樨?fù)責(zé)溶解機(jī)體舊骨并用新骨代替的骨細(xì)胞變得失去控制。經(jīng)過一段時間，變形了的新骨變得更大、更脆弱，具有比正常骨更多的血管。與正常的骨不同，其結(jié)構(gòu)是不規(guī)則的，所以也是更脆弱的，使它具有即使微小損傷也會骨折的傾向。
在其最輕微的形式中，該疾病沒有癥狀。在更嚴(yán)重的情況下，疼痛可能會很強(qiáng)烈。疾病的無情進(jìn)展可以導(dǎo)致骨彎成弓形，頭顱的大小增加，和脊柱彎曲。隨著骨增大，它們可以壓迫附近的神經(jīng)，這可能導(dǎo)致肌肉萎弱。在嚴(yán)重頭顱增大的情況下，這種壓迫可能導(dǎo)致耳聾、視力模糊、頭暈和耳鳴。
降鈣素可以有效治療骨骼變形增加的障礙，例如佩吉特氏病。在治療佩吉特氏病時，降鈣素的長期應(yīng)用可以引起癥狀的長期減少；不過，降鈣素給藥的副作用可以包括惡心、手脹、蕁麻疹和腸痙攣。
多份參考文獻(xiàn)已經(jīng)提出了共軛多肽，例如降鈣素-聚乙二醇或含聚乙二醇聚合物的多分散混合物。例如，Ekwuribe的美國專利No.5,359,030提出了共軛多肽，例如降鈣素-聚乙二醇改性糖脂聚合物的多分散混合物和聚乙二醇改性脂肪酸聚合物的多分散混合物。由每種組合所生成的聚合物的數(shù)均分子量優(yōu)選地在約500至約10,000道爾頓范圍內(nèi)。
Ekwuribe所述聚合物混合物和共軛物的多分散性同樣是在聚合物合成中使用多分散聚乙二醇的結(jié)果。PEG通常是由堿催化的環(huán)氧乙烷的開環(huán)聚合所生成的。該反應(yīng)是通過向乙二醇加入環(huán)氧乙烷而引發(fā)的，以氫氧化鉀作為催化劑。該過程生成聚乙二醇聚合物的多分散聚合物，數(shù)均分子量在給定的分子量范圍內(nèi)。例如，由Sigma-Aldrich ofMilwaukee，Wisconsin供應(yīng)的PEG產(chǎn)品是以多分散混合物的形式提供的，例如PEG 400(Mn 380-420)；PEG 1,000(Mn 950-1,050)；PEG1,500(Mn 1,400-1,600)；和PEG 2,000(Mn 1,900-2,200)。
需要提供降鈣素藥物-寡聚體共軛物的非多分散混合物，其中該寡聚體包含聚乙二醇。
發(fā)明概述已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的包含聚乙二醇的降鈣素-寡聚體共軛物混合物可以降低血清鈣水平達(dá)10、15或者甚至20％或以上。而且，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的包含聚乙二醇的降鈣素-寡聚體共軛物混合物可以比非共軛的降鈣素更加有效地在體外腸消化模型中存活。此外，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的包含聚乙二醇的降鈣素-寡聚體共軛物混合物可以比非共軛的降鈣素表現(xiàn)更高的生物利用度。
按照本發(fā)明的實(shí)施方式，提供了共軛物的基本單分散混合物，各自包含與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物。聚乙二醇部分優(yōu)選地具有至少2、3或4個聚乙二醇亞單位，最優(yōu)選地具有至少7個聚乙二醇亞單位。寡聚體優(yōu)選地進(jìn)一步包含親脂性部分。降鈣素藥物優(yōu)選地是鮭魚降鈣素。寡聚體優(yōu)選地偶聯(lián)在鮭魚降鈣素的Lys11和Lys18上。共軛物優(yōu)選地是兩親性平衡的，以便共軛物是水溶性的，并且能夠穿透生物膜。
按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，提供了共軛物的基本單分散混合物，其中每一共軛物包括鮭魚降鈣素，在鮭魚降鈣素的Lys11上共價偶聯(lián)第一寡聚體的羧酸部分，該第一寡聚體包含在羧酸部分遠(yuǎn)端與終止于甲基的聚乙二醇部分共價偶聯(lián)的辛酸，該聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞單位，并且在鮭魚降鈣素的Lys18上共價偶聯(lián)第二寡聚體的羧酸部分，該第二寡聚體包含在羧酸部分遠(yuǎn)端與終止于甲基的聚乙二醇部分共價偶聯(lián)的辛酸，該聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞單位。
按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，提供了共軛物的基本單分散混合物，其中每一共軛物包含與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，該混合物能夠降低個體血清鈣水平達(dá)至少5％。
按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，提供了共軛物的基本單分散混合物，其中每一共軛物包含與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，與沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解的抗性相比，該混合物增加了對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解的抗性。
按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，提供了共軛物的基本單分散混合物，其中每一共軛物包含與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，該混合物具有比沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物更高的生物功效。
按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，提供了共軛物的混合物，其中每一共軛物包括與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，該混合物分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于22道爾頓。
按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，提供了共軛物的混合物，其中每一共軛物包括與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，該混合物具有大于10,000的分散系數(shù)(DC)，其中DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1nNiMi)2]]>
其中n是樣本中不同分子的數(shù)量；Ni是樣本中第i個分子的數(shù)量；Mi是樣本中第i個分子的質(zhì)量。
按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，提供了共軛物的混合物，其中每一共軛物包括與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，并且具有相同的聚乙二醇亞單位數(shù)。
按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，提供了共軛物的混合物，其中每一共軛物具有相同的分子量，并且具有下式降鈣素藥物-[-B-Lj-Gk-R-G′m-R′-G″n-T]p(A)其中B是鍵合部分；L是連接基團(tuán)；G、G′和G″是各自選擇的間隔基團(tuán)；R是親脂性基團(tuán)，且R′是聚亞烷基二醇基團(tuán)，或者R′是親脂性基團(tuán)，且R是聚亞烷基氧基團(tuán)；T是終止基團(tuán)；j、k、m和n各自是0或1；p是1至降鈣素藥物上親核殘基數(shù)的整數(shù)。
還提供了包含本發(fā)明共軛物混合物的藥物組合物，以及治療需要這類治療的個體骨質(zhì)疏松的方法，該方法給以有效量的這類藥物組合物。另外，提供了合成這類共軛物混合物的方法。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的降鈣素-寡聚體共軛物混合物可以降低血清鈣水平達(dá)20％或以上。而且，與非共軛的降鈣素相比，這類共軛物可以降低腸酶的降解作用和/或增加生物利用度。
附圖的簡要說明

圖1闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的包含聚乙二醇部分和脂肪酸部分的活化聚合物混合物的一般流程；圖2闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的mPEG混合物的流程；圖3闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的活化mPEG7-己基寡聚體混合物的流程；圖4闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的活化mPEG7-辛基寡聚體混合物的流程；圖5闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的活化mPEG7-癸基寡聚體混合物的流程；圖6闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的活化硬脂酸酯-PEG6寡聚體混合物的流程；圖7闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的活化硬脂酸酯-PEG8寡聚體混合物的流程；圖8闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的活化PEG3寡聚體混合物的流程；圖9闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的活化棕櫚酸酯-PEG3寡聚體混合物的流程；圖10闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的活化PEG6寡聚體混合物的流程；圖11闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的各種丙二醇單體的流程；圖12闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的各種丙二醇聚合物的流程；圖13闡述合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的各種丙二醇聚合物的流程；圖14闡述根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的各種降鈣素-寡聚體共軛物混合物與非共軛降鈣素的平均AUC對比，這僅供對比，不構(gòu)成本發(fā)明的一部分；圖15闡述根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的mPEG7-辛基-降鈣素二共軛物混合物的劑量-響應(yīng)曲線和降鈣素的劑量-響應(yīng)曲線，這僅供對比，不是本發(fā)明的一部分；圖16闡述根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的mPEG7-辛基-降鈣素二共軛物混合物口服給藥后的劑量-響應(yīng)曲線；圖17闡述根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的mPEG7-辛基-降鈣素二共軛物混合物皮下給藥后的劑量-響應(yīng)曲線；圖18闡述鮭魚降鈣素皮下給藥后的劑量-響應(yīng)曲線，這僅供對比，不是本發(fā)明的一部分。
優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)說明現(xiàn)在將參照本文所述優(yōu)選實(shí)施方式描述本發(fā)明。不過應(yīng)當(dāng)意識到的是這些實(shí)施方式僅供闡述發(fā)明，不被解釋為限制由權(quán)利要求所限定的發(fā)明范圍。
本文所用的術(shù)語“非多分散的”用于描述具有與Ekwuribe的美國專利No.5,359,030所述多分散混合物相反的分散性的化合物混合物。
本文所用的術(shù)語“基本單分散的”用于描述這樣的化合物混合物，其中在混合物中至少約95％的化合物具有相同的分子量。
本文所用的術(shù)語“單分散的”用于描述這樣的化合物混合物，其中在混合物中約100％的化合物具有相同的分子量。
本文所用的術(shù)語“基本純粹單分散的”用于描述這樣的化合物混合物，其中在混合物中至少約95％的化合物具有相同的分子量，并且具有相同的分子結(jié)構(gòu)。因而，基本純粹單分散混合物是基本單分散混合物，但是基本單分散混合物不一定是基本純粹單分散混合物。
本文所用的術(shù)語“純粹單分散的”用于描述這樣的化合物混合物，其中在混合物中約100％的化合物具有相同的分子量，并且具有相同的分子結(jié)構(gòu)。因而，純粹單分散混合物是單分散混合物，但是單分散混合物不一定是純粹單分散混合物。
本文所用的術(shù)語“重均分子量”被定義為本文所用的術(shù)語“重均分子量”被定義為在混合物中給定分子的重量份數(shù)乘以混合物中每一分子的分子質(zhì)量的結(jié)果之和?！爸鼐肿恿俊庇梅朚w代表。
本文所用的術(shù)語“數(shù)均分子量”被定義為混合物的總重量除以混合物中的分子數(shù)，用符號Mn代表。
本文所用的術(shù)語“分散系數(shù)”(DC)是由下式定義的DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1nNiMi)2]]>其中n是樣本中不同分子的數(shù)量；Ni是樣本中第i個分子的數(shù)量；Mi是樣本中第i個分子的質(zhì)量。
本文所用的術(shù)語“個體內(nèi)差異”表示在不同時間向該個體給以相同劑量藥物或藥物組合物時在同一個體內(nèi)存在的的活性差異。
本文所用的術(shù)語“個體間差異”表示向每一個體給以相同劑量的給定藥物或藥物制劑時在兩個或多個個體之間的活性差異。
本文所用的術(shù)語“生物功效”表示藥物或藥物共軛物與體內(nèi)一種或多種所需受體發(fā)生相互作用的能力。
本文所用的術(shù)語“降鈣素藥物”表示具有降鈣素的全部或一些生物活性的藥物。
本文所用的術(shù)語“降鈣素”表示雞降鈣素、鰻魚降鈣素、人降鈣素、豬降鈣素、大鼠降鈣素或鮭魚降鈣素，由天然、合成或遺傳工程來源所提供。
本文所用的術(shù)語“降鈣素類似物”表示這樣的降鈣素，其中一個或多個氨基酸已被置換，而保留了降鈣素的一些或全部活性。在描述類似物時，用置換位置上標(biāo)注明置換氨基酸，繼之以降鈣素的說明。例如，“Pro2降鈣素，人”意味著通常見于人降鈣素2位的甘氨酸已被脯氨酸置換。
降鈣素類似物可以借助各種手段獲得，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。例如，降鈣素結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可以被取代為其他氨基酸，而與諸如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)的相互結(jié)合能力不會有可察覺的降低。由于降鈣素相互作用的能力和性質(zhì)決定了其生物學(xué)功能活性，可以在氨基酸序列中進(jìn)行某些氨基酸序列的取代并仍然保留具有相似性質(zhì)的多肽。
在進(jìn)行這類取代時，可以考慮氨基酸的水療指數(shù)。水療氨基酸指數(shù)在賦予多肽以相互作用性生物功能中的重要性是本領(lǐng)域公知的。公認(rèn)的是氨基酸的相對水療性有助于所得多肽的二級結(jié)構(gòu)，這繼而決定了多肽與其它分子的相互作用，例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等等。已經(jīng)根據(jù)其疏水性和電荷特性而指定了每種氨基酸的水療指數(shù)如下異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，某些氨基酸可以被具有相似水療指數(shù)或得分的其他氨基酸取代，而仍然生成具有相似生物活性的多肽，也就是說仍然得到生物功能上等價的多肽。在進(jìn)行這類變化時，優(yōu)選其水療指數(shù)在彼此±2內(nèi)的氨基酸的取代，特別優(yōu)選在彼此±1內(nèi)的那些，進(jìn)而更特別優(yōu)選在彼此±0.5內(nèi)的那些。
本領(lǐng)域還已知可以根據(jù)親水性有效進(jìn)行相似氨基酸的取代。美國專利4,554,101提出，受相鄰氨基酸的親水性支配，蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性與蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)有相互關(guān)系。正如美國專利4,554,101所詳細(xì)描述的，已經(jīng)對氨基酸殘基指定了下列親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(±3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，氨基酸可以被取代為具有相似親水性值的另一氨基酸，并仍然得到生物學(xué)等效、特別是免疫學(xué)等效的多肽。在這類變化中，優(yōu)選其親水性值在彼此±2內(nèi)的氨基酸的取代，特別優(yōu)選在彼此±1內(nèi)的那些，進(jìn)而更特別優(yōu)選在彼此±0.5內(nèi)的那些。
如上所述，氨基酸取代一般因此是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性的，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等?？紤]各種上述特征的示范性取代(也就是可以互換而不顯著改變多肽生物活性的氨基酸)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如包括精氨酸與賴氨酸；谷氨酸與天冬氨酸；絲氨酸與蘇氨酸；谷氨酰胺與天冬酰胺；和纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸。
本文所用的術(shù)語“降鈣素片段”表示見于降鈣素中的氨基酸序列的節(jié)段，它保留降鈣素的一些或全部活性。
本文所用的術(shù)語“降鈣素片段類似物”表示見于降鈣素分子中的氨基酸序列的節(jié)段，其中該節(jié)段中的一個或多個氨基酸已被置換，同時保留降鈣素的一些或全部活性。
本文所用的術(shù)語“PEG”指的是直鏈或支鏈聚乙二醇聚合物，包括聚乙二醇的一甲醚(mPEG)。術(shù)語“PEG亞單位”和聚乙二醇亞單位指的是單一的聚乙二醇單位，即-(CH2CH2O)-。
本文所用的術(shù)語“親脂性”表示溶解在脂質(zhì)中的能力和/或穿透生物膜、與生物膜相互作用和/或跨越生物膜的能力，術(shù)語“親脂性部分”或“親脂物”表示這樣一種部分，它是親脂性的，和/或在與另一化學(xué)實(shí)體連接時，它增加這類化學(xué)實(shí)體的親脂性。親脂性部分的實(shí)例但不限于烷基、脂肪酸、脂肪酸酯、膽固醇基、金剛烷基等。
本文所用的術(shù)語“低級烷基”指的是具有1至5個碳原子的取代或未取代的烷基部分。
本文所用的術(shù)語“高級烷基”指的是具有6個或以上碳原子的取代或未取代的烷基部分。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，提供了降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物。單分散混合物中每一降鈣素藥物-寡聚體共軛物包括與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物。優(yōu)選地，混合物中至少約96、97、98或99％的共軛物具有相同的分子量。更優(yōu)選地，混合物是單分散混合物。進(jìn)而更優(yōu)選地，混合物是基本純粹單分散混合物。進(jìn)而更優(yōu)選地，混合物中至少約96、97、98或99％的共軛物具有相同的分子量，并且具有相同的分子結(jié)構(gòu)。最優(yōu)選地，混合物是純粹單分散混合物。
降鈣素藥物優(yōu)選地是降鈣素。更優(yōu)選地，降鈣素藥物是鮭魚降鈣素。不過，可以理解的是降鈣素藥物可以選自本領(lǐng)域已知的各種降鈣素藥物，例如包括降鈣素前體肽、降鈣素、降鈣素類似物、降鈣素片段和降鈣素片段類似物。降鈣素前體肽包括但不限于katacalcin(PDN-21)(C-前降鈣素)和N-proCT(氨基末端前降鈣素裂解肽)，人。降鈣素類似物可以如上所述借助降鈣素中一個或多個氨基酸的取代而得。降鈣素片段包括但不限于降鈣素1-7，人；和降鈣素8-32，鮭魚。降鈣素片段類似物可以如上所述借助降鈣素片段中一個或多個氨基酸的取代而得。
寡聚體可以是包含聚乙二醇部分的各種寡聚體，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。優(yōu)選地，寡聚體的聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞單位。更優(yōu)選地，聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞單位，最優(yōu)選地，聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞單位。
寡聚體可以包含一個或多個其他部分，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，包括但不限于另外的親水性部分、親脂性部分、間隔部分、連接部分和終端部分。寡聚體中的各種部分是通過可水解的或不可水解的鍵彼此共價偶聯(lián)的。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個另外的親水性部分(也就是除了聚乙二醇部分以外的部分)，包括但不限于糖、聚亞烷基氧和聚胺/PEG共聚物。由于聚乙二醇是一種聚亞烷基氧，另外的親水性部分可以是聚乙二醇部分。
如果通過醚鍵偶聯(lián)，相鄰的聚乙二醇部分將被視為相同的部分。例如，-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是具有六個聚乙二醇亞單位的單一聚乙二醇部分。如果該部分是寡聚體中唯一的親水性部分，那么該寡聚體將不含有另外的親水性部分。如果通過除醚鍵以外的鍵偶聯(lián)，相鄰的聚乙二醇部分將被視為不同的部分。例如， 是具有四個聚乙二醇亞單位的聚乙二醇部分和具有兩個聚乙二醇亞單位的另外親水性部分。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的寡聚體包含聚乙二醇部分，沒有另外的親水性部分。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個親脂性部分，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。親脂性部分優(yōu)選地是飽和或不飽和的、直鏈或支鏈烷基部分或者飽和或不飽和的、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)親脂性部分是烷基部分時，它優(yōu)選地是直鏈的、飽和或不飽和的烷基部分，具有1至28個碳原子。更優(yōu)選地，烷基部分具有2至12個碳原子。當(dāng)親脂性部分是脂肪酸部分時，它優(yōu)選地是天然脂肪酸部分，它是直鏈的、飽和或不飽和的，具有2至18個碳原子。更優(yōu)選地，脂肪酸部分具有3至14個碳原子。最優(yōu)選地，脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個間隔部分，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。間隔基團(tuán)例如可以用于分隔親水性部分與親脂性部分，分隔親脂性部分或親水性部分與降鈣素藥物，分隔第一親水性或親脂性部分與第二親水性或親脂性部分，或者分隔親水性部分或親脂性部分與連接部分。間隔部分優(yōu)選地選自由糖、膽固醇和甘油部分組成的組。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個連接部分，用于使寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。連接部分優(yōu)選地選自由烷基和脂肪酸部分組成的組。
寡聚體可以進(jìn)一步在寡聚體不與降鈣素藥物偶聯(lián)的一個或多個末端包含一個或多個終端部分。終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，更優(yōu)選地是低級烷基或低級烷氧基部分。最優(yōu)選地，終端部分是甲基或甲氧基。盡管終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，不過可以理解的是終端部分可以是將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
寡聚體優(yōu)選地是與降鈣素藥物共價偶聯(lián)的。在一些實(shí)施方式中，利用可水解的鍵(例如酯或碳酸酯鍵)使降鈣素藥物與寡聚體偶聯(lián)?？伤獾呐悸?lián)可以提供充當(dāng)前體藥物的降鈣素藥物-寡聚體共軛物。在某些情形中，例如其中降鈣素藥物-寡聚體共軛物是無活性的(也就是說，共軛物缺乏通過降鈣素藥物的主要作用機(jī)理來影響機(jī)體的能力)，可水解的偶聯(lián)可以提供定時釋放或控制釋放的效果，隨著一個或多個寡聚體從它們各自的降鈣素藥物-寡聚體共軛物上裂解下來以提供活性藥物，在給定時間階段內(nèi)給以降鈣素藥物。在其他實(shí)施方式中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)使降鈣素藥物與寡聚體偶聯(lián)。當(dāng)需要使降鈣素藥物-寡聚體共軛物在血流中長時間循環(huán)時，優(yōu)選至少2小時，不可水解的鍵的使用可能是優(yōu)選的。當(dāng)寡聚體與降鈣素藥物共價偶聯(lián)時，寡聚體進(jìn)一步包含一個或多個鍵合部分，用于使寡聚體與降鈣素藥物共價偶聯(lián)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。鍵合部分優(yōu)選地選自由共價鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分組成的組。寡聚體上一種以上的部分可以與降鈣素藥物共價偶聯(lián)。
盡管寡聚體優(yōu)選地是與降鈣素藥物共價偶聯(lián)的，不過可以理解的是，寡聚體可以與降鈣素藥物非共價偶聯(lián)，生成非共價共軛的降鈣素藥物-寡聚體配合物。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，非共價偶聯(lián)包括但不限于氫鍵合、離子鍵合、范德華鍵合和膠束或脂質(zhì)體包封。按照本發(fā)明的實(shí)施方式，寡聚體可以被適當(dāng)?shù)馗脑?、改性?或適當(dāng)?shù)毓倌芑园此x擇的方式賦予非共價共軛的能力(例如賦予氫鍵合能力)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，寡聚體可以用各種化合物衍生化，包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、膽汁酸、膽汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水楊酸、水楊酸衍生物、氨基水楊酸、和氨基水楊酸衍生物。所得寡聚體可以與藥物分子、藥物產(chǎn)品和/或藥物賦形劑非共價偶聯(lián)(配位化合)。所得配合物優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，寡聚體可以用胺和/或烷基胺衍生化。在適合的酸性條件下，所得寡聚體可以與藥物分子、藥物產(chǎn)品和/或藥物賦形劑非共價生成共軛配合物。從這類配位化合作用所得產(chǎn)物優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。
一種以上的寡聚體(即大量寡聚體)可以與降鈣素藥物偶聯(lián)。這些寡聚體優(yōu)選地是相同的。不過可以理解的是，這些寡聚體可以是彼此不同，或者這些寡聚體中的一些可以是相同的，另一些可以是不同的。當(dāng)大量寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)時，可以優(yōu)選的是利用可水解的鍵使一個或多個寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)，利用不可水解的鍵使一個或多個寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)?；蛘?，所有使大量寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)的鍵都是可水解的，但是具有不同程度的可水解性，以便例如一個或多個寡聚體在體內(nèi)被水解作用迅速從降鈣素藥物上除去，一個或多個寡聚體在體內(nèi)被水解作用緩慢從降鈣素藥物上除去。
寡聚體可以與降鈣素藥物偶聯(lián)在該降鈣素藥物的各種親核殘基上，包括但不限于親核性羥基官能和/或氨基官能。當(dāng)降鈣素藥物是多肽時，親核性羥基官能例如可以見于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，親核性氨基官能例如可以見于組氨酸和/或賴氨酸殘基、和/或多肽的一個或多個N-末端。當(dāng)寡聚體與降鈣素多肽的一個或多個N-末端偶聯(lián)時，偶聯(lián)作用優(yōu)選地生成仲胺。當(dāng)降鈣素藥物是鮭魚降鈣素時，例如，寡聚體可以與鮭魚降鈣素的氨基官能度偶聯(lián)，包括Lys11、Lys18和/或N-末端的氨基官能度。盡管一個或多個寡聚體可以與鮭魚降鈣素偶聯(lián)，不過當(dāng)寡聚體與Lys11和Lys18的氨基官能度偶聯(lián)時，在二共軛的鮭魚降鈣素中觀察到更高的生物功效，例如提高了的血清鈣降低能力。
本發(fā)明的降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物可以借助各種方法合成。例如，由羧酸和聚乙二醇組成的寡聚體的基本單分散混合物是這樣合成的，使羧酸的基本單分散混合物與聚乙二醇的基本單分散混合物在足以提供寡聚體的基本單分散混合物的條件下接觸。然后活化寡聚體的基本單分散混合物，以便它們能夠與降鈣素藥物反應(yīng)，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物。用于提供寡聚體的基本單分散混合物的一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖3和實(shí)施例11-18中。用于提供寡聚體的基本單分散混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖4和實(shí)施例19-24中。用于提供寡聚體的基本單分散混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖5和實(shí)施例25-29中。用于提供寡聚體的基本單分散混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖6和實(shí)施例30-31中。用于提供寡聚體的基本單分散混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖7和實(shí)施例32-37中。用于提供寡聚體的基本單分散混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖8和實(shí)施例38中。用于提供寡聚體的基本單分散混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖9和實(shí)施例39中。用于提供寡聚體的基本單分散混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖10和實(shí)施例40中。
可以使活化寡聚體的基本單分散混合物與降鈣素藥物的基本單分散混合物在足以提供降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的條件下反應(yīng)。優(yōu)選的合成描述在下列實(shí)施例41中。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可以控制反應(yīng)條件(例如選擇摩爾比、溶劑混合物和/或pH)，以便從活化寡聚體的基本單分散混合物與降鈣素藥物的基本單分散混合物的反應(yīng)所得降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物是一種基本單分散混合物。例如，通過維持反應(yīng)溶液的pH低于賴氨酸pKa，可以抑制賴氨酸氨基官能度上的共軛作用?；蛘撸缋肏PLC可以分離和離析降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物、例如單-、二-或三-共軛物的基本單分散混合物。所離析的特定共軛物的共軛程度(例如所離析的分子是單-、二-還是三-共軛物)可以利用各種將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的技術(shù)加以測定和/或驗(yàn)證，包括但不限于質(zhì)譜法。特定共軛物結(jié)構(gòu)(例如寡聚體位于鮭魚降鈣素單共軛物的Lys11、Lys18還是N-末端上)可以利用各種將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的技術(shù)加以測定和/或驗(yàn)證，包括但不限于序列分析、肽繪圖、選擇性酶裂解和/或內(nèi)肽酶裂解。
正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，降鈣素藥物上一個或多個反應(yīng)位點(diǎn)例如可以這樣保護(hù)，使降鈣素藥物與適合的保護(hù)試劑反應(yīng)，例如N-叔丁氧羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧羰基)(N-FMOC)。例如當(dāng)降鈣素藥物是一種多肽，并且需要生成在該多肽N-末端上具有寡聚體的不飽和共軛物(也就是其中不是所有的親核殘基都被共軛的共軛物)時，這種方法可能是優(yōu)選的。在這類保護(hù)之后，可以使被保護(hù)的降鈣素藥物的基本單分散混合物與活化寡聚體的基本單分散混合物反應(yīng)，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，具有與一個或多個親核殘基偶聯(lián)的寡聚體，并且具有與其他親核殘基偶聯(lián)的保護(hù)部分。在共軛反應(yīng)后，可以使降鈣素藥物-寡聚體共軛物去保護(hù)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。如果必要的話，然后可以如上所述分離降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物?；蛘?，可以在去保護(hù)之前分離降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物。
與常規(guī)混合物相比，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物優(yōu)選地具有提高了的性質(zhì)。例如，降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物優(yōu)選地能夠降低血清鈣水平達(dá)至少5％。優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少10、11、12、13或14％。更優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少15、16、17、18或19％，最優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少20％。
作為另一個實(shí)例，分別與沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性相比，降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物優(yōu)選地具有增加了的對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性。對胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶的抗性相當(dāng)于利用下列實(shí)施例51所述操作，當(dāng)供試分子在可用的酶中被消化時所剩余的百分比。優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約10％。更優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約15％。最優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約20％。優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約10％。更優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約20％。最優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約30％。
作為另一個實(shí)例，降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物優(yōu)選地具有比沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效更高的生物功效。特定化合物的生物功效相當(dāng)于它的曲線下面積(AUC)值。優(yōu)選地，混合物的生物功效大于沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效約5％。更優(yōu)選地，混合物的生物功效大于沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效約10％。
作為另一個實(shí)例，降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的體內(nèi)活性更大的體內(nèi)活性，該多分散混合物具有與基本單分散混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法，例如凝膠滲透色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMERCHEMISTRY 394-402(2d.ed.，1991)所述。
作為另一個實(shí)例，降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的體外活性更大的體外活性，該多分散混合物具有與基本單分散混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。
作為另一個實(shí)例，與多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性相比，降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物優(yōu)選地具有增加了的對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性，該多分散混合物具有與基本單分散混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。
作為另一個實(shí)例，降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的個體間差異更小的個體間差異，該多分散混合物具有與基本單分散混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。個體間差異可以借助各種方法測量，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。個體間差異優(yōu)選地是如下計算的。測定每一個體的劑量響應(yīng)曲線下面積(AUC)(也就是劑量響應(yīng)曲線與基線值之間的面積)。將每一個體的AUC求和，再除以個體數(shù)，測定所有個體的平均AUC。然后測定每一個體的個別AUC與平均AUC之間差異的絕對值。然后將所得差異的絕對值求和，得到代表個體間差異的數(shù)值。數(shù)值越低，代表個體間差異越低，數(shù)值越高，代表個體間差異越高。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物優(yōu)選地具有兩個或多個上述提高了的性質(zhì)。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物具有三個或多個上述提高了的性質(zhì)。最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的降鈣素藥物-寡聚體共軛物的基本單分散混合物具有四個或多個上述提高了的性質(zhì)。
在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式中，提供了分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的共軛物混合物?；旌衔镏忻恳还曹椢锇ㄅc包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物。標(biāo)準(zhǔn)偏差優(yōu)選地小于約14道爾頓，更優(yōu)選地小于約11道爾頓。分子量分布可以借助本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法加以測定，包括但不限于尺寸排阻色譜法，例如凝膠滲透色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMERCHEMISTRY 394-402(2d.ed.，1991)所述。分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差然后可以借助將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的統(tǒng)計學(xué)方法加以測定。
降鈣素藥物優(yōu)選地是降鈣素。更優(yōu)選地，降鈣素藥物是鮭魚降鈣素。不過，可以理解的是降鈣素藥物可以選自本領(lǐng)域已知的各種降鈣素藥物，例如包括降鈣素前體肽、降鈣素、降鈣素類似物、降鈣素片段和降鈣素片段類似物。降鈣素前體肽包括但不限于katacalcin(PDN-21)(C-前降鈣素)和N-proCT(氨基末端前降鈣素裂解肽)，人。降鈣素類似物可以如上所述借助降鈣素中一個或多個氨基酸的取代而得。降鈣素片段包括但不限于降鈣素1-7，人；和降鈣素8-32，鮭魚。降鈣素片段類似物可以如上所述借助降鈣素片段中一個或多個氨基酸的取代而得。
寡聚體可以是包含聚乙二醇部分的各種寡聚體，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。優(yōu)選地，寡聚體的聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞單位。更優(yōu)選地，聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞單位，最優(yōu)選地，聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞單位。
寡聚體可以包含一個或多個其他部分，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，包括但不限于另外的親水性部分、親脂性部分、間隔部分、連接部分和終端部分。寡聚體中的各種部分是通過可水解的或不可水解的鍵彼此共價偶聯(lián)的。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個另外的親水性部分(也就是除了聚乙二醇部分以外的部分)，包括但不限于糖、聚亞烷基氧和聚胺/PEG共聚物。由于聚乙二醇是一種聚亞烷基氧，另外的親水性部分可以是聚乙二醇部分。
如果通過醚鍵偶聯(lián)，相鄰的聚乙二醇部分將被視為相同的部分。例如，-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是具有六個聚乙二醇亞單位的單一聚乙二醇部分。如果該部分是寡聚體中唯一的親水性部分，那么該寡聚體將不含有另外的親水性部分。如果通過除醚鍵以外的鍵偶聯(lián)，相鄰的聚乙二醇部分將被視為不同的部分。例如， 是具有四個聚乙二醇亞單位的聚乙二醇部分和具有兩個聚乙二醇亞單位的另外親水性部分。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的寡聚體包含聚乙二醇部分，沒有另外的親水性部分。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個親脂性部分，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。親脂性部分優(yōu)選地是飽和或不飽和的、直鏈或支鏈烷基部分或者飽和或不飽和的、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)親脂性部分是烷基部分時，它優(yōu)選地是直鏈的、飽和或不飽和的烷基部分，具有1至28個碳原子。更優(yōu)選地，烷基部分具有2至12個碳原子。當(dāng)親脂性部分是脂肪酸部分時，它優(yōu)選地是天然脂肪酸部分，它是直鏈的、飽和或不飽和的，具有2至18個碳原子。更優(yōu)選地，脂肪酸部分具有3至14個碳原子。最優(yōu)選地，脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個間隔部分，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。間隔基團(tuán)例如可以用于分隔親水性部分與親脂性部分，分隔親脂性部分或親水性部分與降鈣素藥物，分隔第一親水性或親脂性部分與第二親水性或親脂性部分，或者分隔親水性部分或親脂性部分與連接部分。間隔部分優(yōu)選地選自由糖、膽固醇和甘油部分組成的組。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個連接部分，用于使寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。連接部分優(yōu)選地選自由烷基和脂肪酸部分組成的組。
寡聚體可以進(jìn)一步在寡聚體不與降鈣素藥物偶聯(lián)的一個或多個末端包含一個或多個終端部分。終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，更優(yōu)選地是低級烷基或低級烷氧基部分。最優(yōu)選地，終端部分是甲基或甲氧基。盡管終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，不過可以理解的是終端部分可以是將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
寡聚體優(yōu)選地是與降鈣素藥物共價偶聯(lián)的。在一些實(shí)施方式中，利用可水解的鍵(例如酯或碳酸酯鍵)使降鈣素藥物與寡聚體偶聯(lián)?？伤獾呐悸?lián)可以提供充當(dāng)前體藥物的降鈣素藥物-寡聚體共軛物。在某些情形中，例如其中降鈣素藥物-寡聚體共軛物是無活性的(也就是說，共軛物缺乏通過降鈣素藥物的主要作用機(jī)理來影響機(jī)體的能力)，可水解的偶聯(lián)可以提供定時釋放或控制釋放的效果，隨著一個或多個寡聚體從它們各自的降鈣素藥物-寡聚體共軛物上裂解下來以提供活性藥物，在給定時間階段內(nèi)給以降鈣素藥物。在其他實(shí)施方式中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)使降鈣素藥物與寡聚體偶聯(lián)。當(dāng)需要使降鈣素藥物-寡聚體共軛物在血流中長時間循環(huán)時，優(yōu)選至少2小時，不可水解的鍵的使用可能是優(yōu)選的。當(dāng)寡聚體與降鈣素藥物共價偶聯(lián)時，寡聚體進(jìn)一步包含一個或多個鍵合部分，用于使寡聚體與降鈣素藥物共價偶聯(lián)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。鍵合部分優(yōu)選地選自由共價鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分組成的組。寡聚體上一種以上的部分可以與降鈣素藥物共價偶聯(lián)。
盡管寡聚體優(yōu)選地是與降鈣素藥物共價偶聯(lián)的，不過可以理解的是，寡聚體可以與降鈣素藥物非共價偶聯(lián)，生成非共價共軛的降鈣素藥物-寡聚體配合物。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，非共價偶聯(lián)包括但不限于氫鍵合、離子鍵合、范德華鍵合和膠束或脂質(zhì)體包封。按照本發(fā)明的實(shí)施方式，寡聚體可以被適當(dāng)?shù)馗脑?、改性?或適當(dāng)?shù)毓倌芑园此x擇的方式賦予非共價共軛的能力(例如賦予氫鍵合能力)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，寡聚體可以用各種化合物衍生化，包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、膽汁酸、膽汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水楊酸、水楊酸衍生物、氨基水楊酸、和氨基水楊酸衍生物。所得寡聚體可以與藥物分子、藥物產(chǎn)品和/或藥物賦形劑非共價偶聯(lián)(配位化合)。所得配合物優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，寡聚體可以用胺和/或烷基胺衍生化。在適合的酸性條件下，所得寡聚體可以與藥物分子、藥物產(chǎn)品和/或藥物賦形劑非共價生成共軛配合物。從這類配位化合作用所得產(chǎn)物優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。
一種以上的寡聚體(即大量寡聚體)可以與降鈣素藥物偶聯(lián)。這些寡聚體優(yōu)選地是相同的。不過可以理解的是，這些寡聚體可以是彼此不同，或者這些寡聚體中的一些可以是相同的，另一些可以是不同的。當(dāng)大量寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)時，可以優(yōu)選地利用可水解的鍵使一個或多個寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)，利用不可水解的鍵使一個或多個寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)?；蛘?，所有使大量寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)的鍵都是可水解的，但是具有不同程度的可水解性，以便例如一個或多個寡聚體在體內(nèi)被水解作用迅速從降鈣素藥物上除去，一個或多個寡聚體在體內(nèi)被水解作用緩慢從降鈣素藥物上除去。
寡聚體可以與降鈣素藥物偶聯(lián)在該降鈣素藥物的各種親核殘基上，包括但不限于親核性羥基官能和/或氨基官能。當(dāng)降鈣素藥物是多肽時，親核性羥基官能例如可以見于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，親核性氨基官能例如可以見于組氨酸和/或賴氨酸殘基、和/或多肽的一個或多個N-末端。當(dāng)寡聚體與降鈣素多肽的一個或多個N-末端偶聯(lián)時，偶聯(lián)作用優(yōu)選地生成仲胺。當(dāng)降鈣素藥物是鮭魚降鈣素時，例如，寡聚體可以與鮭魚降鈣素的氨基官能度偶聯(lián)，包括Lys11、Lys18和/或N-末端的氨基官能度。盡管一個或多個寡聚體可以與鮭魚降鈣素偶聯(lián)，不過當(dāng)寡聚體與Lys11和Lys18的氨基官能度偶聯(lián)時，在二共軛的鮭魚降鈣素中觀察到更高的生物功效，例如提高了的血清鈣降低能力。
分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物可以借助各種方法合成。例如，由羧酸和聚乙二醇組成的分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的寡聚體混合物是這樣合成的，使分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的羧酸混合物與分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的聚乙二醇混合物在足以提供分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的寡聚體混合物的條件下接觸。然后活化分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的寡聚體混合物，以便它們能夠與降鈣素藥物反應(yīng)，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物。用于提供分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的活化寡聚體混合物的一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖3和實(shí)施例11-18中。用于提供分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖4和實(shí)施例19-24中。用于提供分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖5和實(shí)施例25-29中。用于提供分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖6和實(shí)施例30-31中。用于提供分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖7和實(shí)施例32-37中。用于提供分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖8和實(shí)施例38中。用于提供分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖9和實(shí)施例39中。用于提供分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖10和實(shí)施例40中。
使分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的活化寡聚體混合物與分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物混合物在足以提供降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的條件下反應(yīng)。優(yōu)選的合成描述在下列實(shí)施例41中。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可以控制反應(yīng)條件(例如選擇摩爾比、溶劑混合物和/或pH)，以便從分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的活化寡聚體混合物與分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物混合物的反應(yīng)所得降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物是一種分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的混合物。例如，通過維持反應(yīng)溶液的pH低于賴氨酸pKa，可以抑制賴氨酸氨基官能度上的共軛作用?；蛘撸缋肏PLC可以分離和離析降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，得到分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物、例如單-、二-或三-共軛物的混合物。所離析的特定共軛物的共軛程度(例如所離析的分子是單-、二-還是三-共軛物)可以利用各種將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的技術(shù)加以測定和/或驗(yàn)證，包括但不限于質(zhì)譜法。特定共軛物結(jié)構(gòu)(例如寡聚體位于鮭魚降鈣素單共軛物的Lys11、Lys18還是N-末端上)可以利用各種將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的技術(shù)加以測定和/或驗(yàn)證，包括但不限于序列分析、肽繪圖、選擇性酶裂解和/或內(nèi)肽酶裂解。
正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，降鈣素藥物上一個或多個反應(yīng)位點(diǎn)例如可以這樣保護(hù)，使降鈣素藥物與適合的保護(hù)試劑反應(yīng)，例如N-叔丁氧羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧羰基)(N-FMOC)。例如當(dāng)降鈣素藥物是一種多肽，并且需要生成在該多肽N-末端上具有寡聚體的不飽和共軛物(也就是其中不是所有的親核殘基都被共軛的共軛物)時，這種方法可能是優(yōu)選的。在這類保護(hù)之后，可以使被保護(hù)的分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物混合物與分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的活化寡聚體混合物反應(yīng)，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，具有與一個或多個親核殘基偶聯(lián)的寡聚體，并且具有與其他親核殘基偶聯(lián)的保護(hù)部分。在共軛反應(yīng)后，可以使降鈣素藥物-寡聚體共軛物去保護(hù)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。如果必要的話，然后可以如上所述分離降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，得到分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物?；蛘撸梢栽谌ケＷo(hù)之前分離降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物。
與常規(guī)混合物相比，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有提高了的性質(zhì)。例如，分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地能夠降低血清鈣水平達(dá)至少5％。優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少10、11、12、13或14％。更優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少15、16、17、18或19％，最優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少20％。
作為另一個實(shí)例，分別與沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性相比，分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有增加了的對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性。對胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶的抗性相當(dāng)于利用下列實(shí)施例51所述操作，當(dāng)供試分子在可用的酶中被消化時所剩余的百分比。優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約10％。更優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約15％。最優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約20％。優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約10％。更優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約20％。最優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約30％。
作為另一個實(shí)例，分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效更高的生物功效。特定化合物的生物功效相當(dāng)于它的曲線下面積(AUC)值。優(yōu)選地，混合物的生物功效大于沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效約5％。更優(yōu)選地，混合物的生物功效大于沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效約10％。
作為另一個實(shí)例，分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的體內(nèi)活性更大的體內(nèi)活性，該多分散混合物具有與分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法，例如凝膠滲透色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(2d.ed.，1991)所述。
作為另一個實(shí)例，分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的體外活性更大的體外活性，該多分散混合物具有與分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。
作為另一個實(shí)例，與多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性相比，分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有增加了的對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性，該多分散混合物具有與分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。
作為另一個實(shí)例，分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的個體間差異更小的個體間差異，該多分散混合物具有與分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。個體間差異可以借助各種方法測量，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。個體間差異優(yōu)選地是如下計算的。測定每一個體的劑量響應(yīng)曲線下面積(AUC)(也就是劑量響應(yīng)曲線與基線值之間的面積)。將每一個體的AUC求和，再除以個體數(shù)，測定所有個體的平均AUC。然后測定每一個體的個別AUC與平均AUC之間差異的絕對值。然后將所得差異的絕對值求和，得到代表個體間差異的數(shù)值。數(shù)值越低，代表個體間差異越低，數(shù)值越高，代表個體間差異越高。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有兩個或多個上述提高了的性質(zhì)。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物具有三個或多個上述提高了的性質(zhì)。最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物具有四個或多個上述提高了的性質(zhì)。
按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，提供了共軛物的混合物，其中每一共軛物包括與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，該混合物具有大于10,000的分散系數(shù)(DC)，其中DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1nNiMi)2]]>其中n是樣本中不同分子的數(shù)量；Ni是樣本中第i個分子的數(shù)量；Mi是樣本中第i個分子的質(zhì)量。
共軛物混合物優(yōu)選地具有大于100,000的分散系數(shù)。更優(yōu)選地，共軛物混合物的分散系數(shù)大于500,000，最優(yōu)選地，分散系數(shù)大于10,000,000。變量n、Ni和Mi可以借助各種將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的方法加以測定，包括但不限于如下實(shí)施例49所述方法。
降鈣素藥物優(yōu)選地是降鈣素。更優(yōu)選地，降鈣素藥物是鮭魚降鈣素。不過，可以理解的是降鈣素藥物可以選自本領(lǐng)域已知的各種降鈣素藥物，例如包括降鈣素前體肽、降鈣素、降鈣素類似物、降鈣素片段和降鈣素片段類似物。降鈣素前體肽包括但不限于katacalcin(PDN-21)(C-前降鈣素)和N-proCT(氨基末端前降鈣素裂解肽)，人。降鈣素類似物可以如上所述借助降鈣素中一個或多個氨基酸的取代而得。降鈣素片段包括但不限于降鈣素1-7，人；和降鈣素8-32，鮭魚。降鈣素片段類似物可以如上所述借助降鈣素片段中一個或多個氨基酸的取代而得。
寡聚體可以是包含聚乙二醇部分的各種寡聚體，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。優(yōu)選地，寡聚體的聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞單位。更優(yōu)選地，聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞單位，最優(yōu)選地，聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞單位。
寡聚體可以包含一個或多個其他部分，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，包括但不限于另外的親水性部分、親脂性部分、間隔部分、連接部分和終端部分。寡聚體中的各種部分是通過可水解的或不可水解的鍵彼此共價偶聯(lián)的。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個另外的親水性部分(也就是除了聚乙二醇部分以外的部分)，包括但不限于糖、聚亞烷基氧和聚胺/PEG共聚物。由于聚乙二醇是一種聚亞烷基氧，另外的親水性部分可以是聚乙二醇部分。
如果通過醚鍵偶聯(lián)，相鄰的聚乙二醇部分將被視為相同的部分。例如，-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是具有六個聚乙二醇亞單位的單一聚乙二醇部分。如果該部分是寡聚體中唯一的親水性部分，那么該寡聚體將不含有另外的親水性部分。如果通過除醚鍵以外的鍵偶聯(lián)，相鄰的聚乙二醇部分將被視為不同的部分。例如， 是具有四個聚乙二醇亞單位的聚乙二醇部分和具有兩個聚乙二醇亞單位的另外親水性部分。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的寡聚體包含聚乙二醇部分，沒有另外的親水性部分。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個親脂性部分，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。親脂性部分優(yōu)選地是飽和或不飽和的、直鏈或支鏈烷基部分或者飽和或不飽和的、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)親脂性部分是烷基部分時，它優(yōu)選地是直鏈的、飽和或不飽和的烷基部分，具有1至28個碳原子。更優(yōu)選地，烷基部分具有2至12個碳原子。當(dāng)親脂性部分是脂肪酸部分時，它優(yōu)選地是天然脂肪酸部分，它是直鏈的、飽和或不飽和的，具有2至18個碳原子。更優(yōu)選地，脂肪酸部分具有3至14個碳原子。最優(yōu)選地，脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個間隔部分，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。間隔基團(tuán)例如可以用于分隔親水性部分與親脂性部分，分隔親脂性部分或親水性部分與降鈣素藥物，分隔第一親水性或親脂性部分與第二親水性或親脂性部分，或者分隔親水性部分或親脂性部分與連接部分。間隔部分優(yōu)選地選自由糖、膽固醇和甘油部分組成的組。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個連接部分，用于使寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。連接部分優(yōu)選地選自由烷基和脂肪酸部分組成的組。
寡聚體可以進(jìn)一步在寡聚體不與降鈣素藥物偶聯(lián)的一個或多個末端包含一個或多個終端部分。終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，更優(yōu)選地是低級烷基或低級烷氧基部分。最優(yōu)選地，終端部分是甲基或甲氧基。盡管終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，不過可以理解的是終端部分可以是將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
寡聚體優(yōu)選地是與降鈣素藥物共價偶聯(lián)的。在一些實(shí)施方式中，利用可水解的鍵(例如酯或碳酸酯鍵)使降鈣素藥物與寡聚體偶聯(lián)。可水解的偶聯(lián)可以提供充當(dāng)前體藥物的降鈣素藥物-寡聚體共軛物。在某些情形中，例如其中降鈣素藥物-寡聚體共軛物是無活性的(也就是說，共軛物缺乏通過降鈣素藥物的主要作用機(jī)理來影響機(jī)體的能力)，可水解的偶聯(lián)可以提供定時釋放或控制釋放的效果，隨著一個或多個寡聚體從它們各自的降鈣素藥物-寡聚體共軛物上裂解下來以提供活性藥物，在給定時間階段內(nèi)給以降鈣素藥物。在其他實(shí)施方式中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)使降鈣素藥物與寡聚體偶聯(lián)。當(dāng)需要使降鈣素藥物-寡聚體共軛物在血流中長時間循環(huán)時，優(yōu)選至少2小時，不可水解的鍵的使用可能是優(yōu)選的。當(dāng)寡聚體與降鈣素藥物共價偶聯(lián)時，寡聚體進(jìn)一步包含一個或多個鍵合部分，用于使寡聚體與降鈣素藥物共價偶聯(lián)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。鍵合部分優(yōu)選地選自由共價鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分組成的組。寡聚體上一種以上的部分可以與降鈣素藥物共價偶聯(lián)。
盡管寡聚體優(yōu)選地是與降鈣素藥物共價偶聯(lián)的，不過可以理解的是，寡聚體可以與降鈣素藥物非共價偶聯(lián)，生成非共價共軛的降鈣素藥物-寡聚體配合物。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，非共價偶聯(lián)包括但不限于氫鍵合、離子鍵合、范德華鍵合和膠束或脂質(zhì)體包封。按照本發(fā)明的實(shí)施方式，寡聚體可以被適當(dāng)?shù)馗脑?、改性?或適當(dāng)?shù)毓倌芑?，以按所選擇的方式賦予非共價共軛的能力(例如賦予氫鍵合能力)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，寡聚體可以用各種化合物衍生化，包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、膽汁酸、膽汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水楊酸、水楊酸衍生物、氨基水楊酸、和氨基水楊酸衍生物。所得寡聚體可以與藥物分子、藥物產(chǎn)品和/或藥物賦形劑非共價偶聯(lián)(配位化合)。所得配合物優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，寡聚體可以用胺和/或烷基胺衍生化。在適合的酸性條件下，所得寡聚體可以與藥物分子、藥物產(chǎn)品和/或藥物賦形劑非共價生成共軛配合物。從這類配位化合作用所得產(chǎn)物優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。
一種以上的寡聚體(即大量寡聚體)可以與降鈣素藥物偶聯(lián)。這些寡聚體優(yōu)選地是相同的。不過可以理解的是，這些寡聚體可以是彼此不同，或者這些寡聚體中的一些可以是相同的，另一些可以是不同的。當(dāng)大量寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)時，可以優(yōu)選地利用可水解的鍵使一個或多個寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)，利用不可水解的鍵使一個或多個寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)?；蛘?，所有使大量寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)的鍵都是可水解的，但是具有不同程度的可水解性，以便例如一個或多個寡聚體在體內(nèi)被水解作用迅速從降鈣素藥物上除去，一個或多個寡聚體在體內(nèi)被水解作用緩慢從降鈣素藥物上除去。
寡聚體可以與降鈣素藥物偶聯(lián)在該降鈣素藥物的各種親核殘基上，包括但不限于親核性羥基官能和/或氨基官能。當(dāng)降鈣素藥物是多肽時，親核性羥基官能例如可以見于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，親核性氨基官能例如可以見于組氨酸和/或賴氨酸殘基、和/或多肽的一個或多個N-末端。當(dāng)寡聚體與降鈣素多肽的一個或多個N-末端偶聯(lián)時，偶聯(lián)作用優(yōu)選地生成仲胺。當(dāng)降鈣素藥物是鮭魚降鈣素時，例如，寡聚體可以與鮭魚降鈣素的氨基官能度偶聯(lián)，包括Lys11、Lys18和/或N-末端的氨基官能度。盡管一個或多個寡聚體可以與鮭魚降鈣素偶聯(lián)，不過當(dāng)寡聚體與Lys11和Lys18的氨基官能度偶聯(lián)時，在二共軛的鮭魚降鈣素中觀察到更高的生物功效，例如提高了的血清鈣降低能力。
分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物可以借助各種方法合成。例如，由羧酸和聚乙二醇組成的分散系數(shù)大于10,000的寡聚體混合物是這樣合成的，使分散系數(shù)大于10,000的羧酸混合物與分散系數(shù)大于10,000的聚乙二醇混合物在足以提供分散系數(shù)大于10,000的寡聚體混合物的條件下接觸。然后活化分散系數(shù)大于10,000的寡聚體混合物，以便它們能夠與降鈣素藥物反應(yīng)，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物。用于提供分散系數(shù)大于10,000的活化寡聚體混合物的一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖3和實(shí)施例11-18中。用于提供分散系數(shù)大于10,000的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖4和實(shí)施例19-24中。用于提供分散系數(shù)大于10,000的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖5和實(shí)施例25-29中。用于提供分散系數(shù)大于10,000的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖6和實(shí)施例30-31中。用于提供分散系數(shù)大于10,000的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖7和實(shí)施例32-37中。用于提供分散系數(shù)大于10,000的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖8和實(shí)施例38中。用于提供分散系數(shù)大于10,000的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖9和實(shí)施例39中。用于提供分散系數(shù)大于10,000的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖10和實(shí)施例40中。
使分散系數(shù)大于10,000的活化寡聚體混合物與分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物混合物在足以提供降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的條件下反應(yīng)。優(yōu)選的合成描述在下列實(shí)施例41中。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可以控制反應(yīng)條件(例如選擇摩爾比、溶劑混合物和/或pH)，以便從分散系數(shù)大于10,000的活化寡聚體混合物與分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物混合物的反應(yīng)所得降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物是一種分散系數(shù)大于10,000的混合物。例如，通過維持反應(yīng)溶液的pH低于賴氨酸pKa，可以抑制賴氨酸氨基官能度上的共軛作用?；蛘?，例如利用HPLC可以分離和離析降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，得到分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物、例如單-、二-或三-共軛物的混合物。所離析的特定共軛物的共軛程度(例如所離析的分子是單-、二-還是三-共軛物)可以利用各種將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的技術(shù)加以測定和/或驗(yàn)證，包括但不限于質(zhì)譜法。特定共軛物結(jié)構(gòu)(例如寡聚體位于鮭魚降鈣素單共軛物的Lys11、Lys18還是N-末端上)可以利用各種將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的技術(shù)加以測定和/或驗(yàn)證，包括但不限于序列分析、肽繪圖、選擇性酶裂解和/或內(nèi)肽酶裂解。
正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，降鈣素藥物上一個或多個反應(yīng)位點(diǎn)例如可以這樣保護(hù)，使降鈣素藥物與適合的保護(hù)試劑反應(yīng)，例如N-叔丁氧羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧羰基)(N-FMOC)。例如當(dāng)降鈣素藥物是一種多肽，并且需要生成在該多肽N-末端上具有寡聚體的不飽和共軛物(也就是其中不是所有的親核殘基都被共軛的共軛物)時，這種方法可能是優(yōu)選的。在這類保護(hù)之后，可以使被保護(hù)的分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物混合物與分散系數(shù)大于10,000的活化寡聚體混合物反應(yīng)，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，具有與一個或多個親核殘基偶聯(lián)的寡聚體，并且具有與其他親核殘基偶聯(lián)的保護(hù)部分。在共軛反應(yīng)后，可以使降鈣素藥物-寡聚體共軛物去保護(hù)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。如果必要的話，然后可以如上所述分離降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，得到分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物。或者，可以在去保護(hù)之前分離降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物。
與常規(guī)混合物相比，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有提高了的性質(zhì)。例如，分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地能夠降低血清鈣水平達(dá)至少5％。優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少10、11、12、13或14％。更優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少15、16、17、18或19％，最優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少20％。
作為另一個實(shí)例，分別與沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性相比，分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有增加了的對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性。對胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶的抗性相當(dāng)于利用下列實(shí)施例51所述操作，當(dāng)供試分子在可用的酶中被消化時所剩余的百分比。優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約10％。更優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約15％。最優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約20％。優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約10％。更優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約20％。最優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約30％。
作為另一個實(shí)例，分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效更高的生物功效。特定化合物的生物功效相當(dāng)于它的曲線下面積(AUC)值。優(yōu)選地，混合物的生物功效大于沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效約5％。更優(yōu)選地，混合物的生物功效大于沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效約10％。
作為另一個實(shí)例，分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的體內(nèi)活性更大的體內(nèi)活性，該多分散混合物具有與分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法，例如凝膠滲透色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY394-402(2d.ed.，1991)所述。
作為另一個實(shí)例，分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的體外活性更大的體外活性，該多分散混合物具有與分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。
作為另一個實(shí)例，與多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性相比，分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有增加了的對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性，該多分散混合物具有與分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。
作為另一個實(shí)例，分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的個體間差異更小的個體間差異，該多分散混合物具有與分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。個體間差異可以借助各種方法測量，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。個體間差異優(yōu)選地是如下計算的。測定每一個體的劑量響應(yīng)曲線下面積(AUC)(也就是劑量響應(yīng)曲線與基線值之間的面積)。將每一個體的AUC求和，再除以個體數(shù)，測定所有個體的平均AUC。然后測定每一個體的個別AUC與平均AUC之間差異的絕對值。然后將所得差異的絕對值求和，得到代表個體間差異的數(shù)值。數(shù)值越低，代表個體間差異越低，數(shù)值越高，代表個體間差異越高。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有兩個或多個上述提高了的性質(zhì)。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物具有三個或多個上述提高了的性質(zhì)。最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的分散系數(shù)大于10,000的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物具有四個或多個上述提高了的性質(zhì)。
按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，提供了共軛物的混合物，其中每一共軛物包括與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，并且具有相同的聚乙二醇亞單位數(shù)。
降鈣素藥物優(yōu)選地是降鈣素。更優(yōu)選地，降鈣素藥物是鮭魚降鈣素。不過，可以理解的是降鈣素藥物可以選自本領(lǐng)域已知的各種降鈣素藥物，例如包括降鈣素前體肽、降鈣素、降鈣素類似物、降鈣素片段和降鈣素片段類似物。降鈣素前體肽包括但不限于katacalcin(PDN-21)(C-前降鈣素)和N-proCT(氨基末端前降鈣素裂解肽)，人。降鈣素類似物可以如上所述借助降鈣素中一個或多個氨基酸的取代而得。降鈣素片段包括但不限于降鈣素1-7，人；和降鈣素8-32，鮭魚。降鈣素片段類似物可以如上所述借助降鈣素片段中一個或多個氨基酸的取代而得。
寡聚體可以是包含聚乙二醇部分的各種寡聚體，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。優(yōu)選地，寡聚體的聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞單位。更優(yōu)選地，聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞單位，最優(yōu)選地，聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞單位。
寡聚體可以包含一個或多個其他部分，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，包括但不限于另外的親水性部分、親脂性部分、間隔部分、連接部分和終端部分。寡聚體中的各種部分是通過可水解的或不可水解的鍵彼此共價偶聯(lián)的。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個另外的親水性部分(也就是除了聚乙二醇部分以外的部分)，包括但不限于糖、聚亞烷基氧和聚胺/PEG共聚物。由于聚乙二醇是一種聚亞烷基氧，另外的親水性部分可以是聚乙二醇部分。
如果通過醚鍵偶聯(lián)，相鄰的聚乙二醇部分將被視為相同的部分。例如，-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是具有六個聚乙二醇亞單位的單一聚乙二醇部分。如果該部分是寡聚體中唯一的親水性部分，那么該寡聚體將不含有另外的親水性部分。如果通過除醚鍵以外的鍵偶聯(lián)，相鄰的聚乙二醇部分將被視為不同的部分。例如， 是具有四個聚乙二醇亞單位的聚乙二醇部分和具有兩個聚乙二醇亞單位的另外親水性部分。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的寡聚體包含聚乙二醇部分，沒有另外的親水性部分。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個親脂性部分，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。親脂性部分優(yōu)選地是飽和或不飽和的、直鏈或支鏈烷基部分或者飽和或不飽和的、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)親脂性部分是烷基部分時，它優(yōu)選地是直鏈的、飽和或不飽和的烷基部分，具有1至28個碳原子。更優(yōu)選地，烷基部分具有2至12個碳原子。當(dāng)親脂性部分是脂肪酸部分時，它優(yōu)選地是天然脂肪酸部分，它是直鏈的、飽和或不飽和的，具有2至18個碳原子。更優(yōu)選地，脂肪酸部分具有3至14個碳原子。最優(yōu)選地，脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個間隔部分，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。間隔基團(tuán)例如可以用于分隔親水性部分與親脂性部分，分隔親脂性部分或親水性部分與降鈣素藥物，分隔第一親水性或親脂性部分與第二親水性或親脂性部分，或者分隔親水性部分或親脂性部分與連接部分。間隔部分優(yōu)選地選自由糖、膽固醇和甘油部分組成的組。
寡聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個連接部分，用于使寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。連接部分優(yōu)選地選自由烷基和脂肪酸部分組成的組。
寡聚體可以進(jìn)一步在寡聚體不與降鈣素藥物偶聯(lián)的一個或多個末端包含一個或多個終端部分。終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，更優(yōu)選地是低級烷基或低級烷氧基部分。最優(yōu)選地，終端部分是甲基或甲氧基。盡管終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，不過可以理解的是終端部分可以是將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
寡聚體優(yōu)選地是與降鈣素藥物共價偶聯(lián)的。在一些實(shí)施方式中，利用可水解的鍵(例如酯或碳酸酯鍵)使降鈣素藥物與寡聚體偶聯(lián)?？伤獾呐悸?lián)可以提供充當(dāng)前體藥物的降鈣素藥物-寡聚體共軛物。在某些情形中，例如其中降鈣素藥物-寡聚體共軛物是無活性的(也就是說，共軛物缺乏通過降鈣素藥物的主要作用機(jī)理來影響機(jī)體的能力)，可水解的偶聯(lián)可以提供定時釋放或控制釋放的效果，隨著一個或多個寡聚體從它們各自的降鈣素藥物-寡聚體共軛物上裂解下來以提供活性藥物，在給定時間階段內(nèi)給以降鈣素藥物。在其他實(shí)施方式中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)使降鈣素藥物與寡聚體偶聯(lián)。當(dāng)需要使降鈣素藥物-寡聚體共軛物在血流中長時間循環(huán)時，優(yōu)選至少2小時，不可水解的鍵的使用可能是優(yōu)選的。當(dāng)寡聚體與降鈣素藥物共價偶聯(lián)時，寡聚體進(jìn)一步包含一個或多個鍵合部分，用于使寡聚體與降鈣素藥物共價偶聯(lián)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。鍵合部分優(yōu)選地選自由共價鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分組成的組。寡聚體上一種以上的部分可以與降鈣素藥物共價偶聯(lián)。
盡管寡聚體優(yōu)選地是與降鈣素藥物共價偶聯(lián)的，不過可以理解的是，寡聚體可以與降鈣素藥物非共價偶聯(lián)，生成非共價共軛的降鈣素藥物-寡聚體配合物。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，非共價偶聯(lián)包括但不限于氫鍵合、離子鍵合、范德華鍵合和膠束或脂質(zhì)體包封。按照本發(fā)明的實(shí)施方式，寡聚體可以被適當(dāng)?shù)馗脑?、改性?或適當(dāng)?shù)毓倌芑园此x擇的方式賦予非共價共軛的能力(例如賦予氫鍵合能力)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，寡聚體可以用各種化合物衍生化，包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、膽汁酸、膽汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水楊酸、水楊酸衍生物、氨基水楊酸、和氨基水楊酸衍生物。所得寡聚體可以與藥物分子、藥物產(chǎn)品和/或藥物賦形劑非共價偶聯(lián)(配位化合)。所得配合物優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，寡聚體可以用胺和/或烷基胺衍生化。在適合的酸性條件下，所得寡聚體可以與藥物分子、藥物產(chǎn)品和/或藥物賦形劑非共價生成共軛配合物。從這類配位化合作用所得產(chǎn)物優(yōu)選地具有平衡的親脂性和親水性。
一種以上的寡聚體(即大量寡聚體)可以與降鈣素藥物偶聯(lián)。這些寡聚體優(yōu)選地是相同的。不過可以理解的是，這些寡聚體可以是彼此不同，或者這些寡聚體中的一些可以是相同的，另一些可以是不同的。當(dāng)大量寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)時，可以優(yōu)選地利用可水解的鍵使一個或多個寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)，利用不可水解的鍵使一個或多個寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)?；蛘?，所有使大量寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)的鍵都是可水解的，但是具有不同程度的可水解性，以便例如一個或多個寡聚體在體內(nèi)被水解作用迅速從降鈣素藥物上除去，一個或多個寡聚體在體內(nèi)被水解作用緩慢從降鈣素藥物上除去。
寡聚體可以與降鈣素藥物偶聯(lián)在該降鈣素藥物的各種親核殘基上，包括但不限于親核性羥基官能和/或氨基官能。當(dāng)降鈣素藥物是多肽時，親核性羥基官能例如可以見于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，親核性氨基官能例如可以見于組氨酸和/或賴氨酸殘基、和/或多肽的一個或多個N-末端。當(dāng)寡聚體與降鈣素多肽的一個或多個N-末端偶聯(lián)時，偶聯(lián)作用優(yōu)選地生成仲胺。當(dāng)降鈣素藥物是鮭魚降鈣素時，例如，寡聚體可以與鮭魚降鈣素的氨基官能度偶聯(lián)，包括Lys11、Lys18和/或N-末端的氨基官能度。盡管一個或多個寡聚體可以與鮭魚降鈣素偶聯(lián)，不過當(dāng)寡聚體與Lys11和Lys18的氨基官能度偶聯(lián)時，在二共軛的鮭魚降鈣素中觀察到更高的生物功效，例如提高了的血清鈣降低能力。
其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物可以借助各種方法合成。例如，由羧酸和聚乙二醇組成的其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的寡聚體混合物是這樣合成的，使其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的羧酸混合物與其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的聚乙二醇混合物在足以提供其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的寡聚體混合物的條件下接觸。然后活化其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的寡聚體混合物，以便它們能夠與降鈣素藥物反應(yīng)，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物。用于提供其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的活化寡聚體混合物的一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖3和實(shí)施例11-18中。用于提供其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖4和實(shí)施例19-24中。用于提供其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖5和實(shí)施例25-29中。用于提供其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖6和實(shí)施例30-31中。用于提供其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖7和實(shí)施例32-37中。用于提供其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖8和實(shí)施例38中。用于提供其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖9和實(shí)施例39中。用于提供其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖10和實(shí)施例40中。
使其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的活化寡聚體混合物與降鈣素藥物混合物在足以提供降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的條件下反應(yīng)。優(yōu)選的合成描述在下列實(shí)施例41中。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可以控制反應(yīng)條件(例如選擇摩爾比、溶劑混合物和/或pH)，以便從其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的活化寡聚體混合物與降鈣素藥物混合物的反應(yīng)所得降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物是一種其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的混合物。例如，通過維持反應(yīng)溶液的pH低于賴氨酸pKa，可以抑制賴氨酸氨基官能度上的共軛作用?；蛘撸缋肏PLC可以分離和離析降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物、例如單-、二-或三-共軛物的混合物，其中混合物中每一共軛物具有相同的聚乙二醇亞單位數(shù)。所離析的特定共軛物的共軛程度(例如所離析的分子是單-、二-還是三-共軛物)可以利用各種將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的技術(shù)加以測定和/或驗(yàn)證，包括但不限于質(zhì)譜法。特定共軛物結(jié)構(gòu)(例如寡聚體位于鮭魚降鈣素單共軛物的Lys11、Lys18還是N-末端上)可以利用各種將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的技術(shù)加以測定和/或驗(yàn)證，包括但不限于序列分析、肽繪圖、選擇性酶裂解和/或內(nèi)肽酶裂解。
正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，降鈣素藥物上一個或多個反應(yīng)位點(diǎn)例如可以這樣保護(hù)，使降鈣素藥物與適合的保護(hù)試劑反應(yīng)，例如N-叔丁氧羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧羰基)(N-FMOC)。例如當(dāng)降鈣素藥物是一種多肽，并且需要生成在該多肽N-末端上具有寡聚體的不飽和共軛物(也就是其中不是所有的親核殘基都被共軛的共軛物)時，這種方法可能是優(yōu)選的。在這類保護(hù)之后，可以使被保護(hù)的降鈣素藥物混合物與活化寡聚體混合物反應(yīng)，其中混合物中每一共軛物具有相同的聚乙二醇亞單位數(shù)，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，具有與一個或多個親核殘基偶聯(lián)的寡聚體，并且具有與其他親核殘基偶聯(lián)的保護(hù)部分。在共軛反應(yīng)后，可以使降鈣素藥物-寡聚體共軛物去保護(hù)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。如果必要的話，然后可以如上所述分離降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，其中混合物中每一共軛物具有相同的聚乙二醇亞單位數(shù)。或者，可以在去保護(hù)之前分離降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物。
與常規(guī)混合物相比，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有提高了的性質(zhì)。例如，其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地能夠降低血清鈣水平達(dá)至少5％。優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少10、11、12、13或14％。更優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少15、16、17、18或19％，最優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少20％。
作為另一個實(shí)例，分別與沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性相比，其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有增加了的對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性。對胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶的抗性相當(dāng)于利用下列實(shí)施例51所述操作，當(dāng)供試分子在可用的酶中被消化時所剩余的百分比。優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約10％。更優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約15％。最優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約20％。優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約10％。更優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約20％。最優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約30％。
作為另一個實(shí)例，其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效更高的生物功效。特定化合物的生物功效相當(dāng)于它的曲線下面積(AUC)值。優(yōu)選地，混合物的生物功效大于沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效約5％。更優(yōu)選地，混合物的生物功效大于沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效約10％。
作為另一個實(shí)例，其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的體內(nèi)活性更大的體內(nèi)活性，該多分散混合物具有與其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法，例如凝膠滲透色譜法，例如H.R.Allcock& F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(2d.ed.，1991)所述。
作為另一個實(shí)例，其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的體外活性更大的體外活性，該多分散混合物具有與其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。
作為另一個實(shí)例，與多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性相比，其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有增加了的對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性，該多分散混合物具有與其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。
作為另一個實(shí)例，其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的個體間差異更小的個體間差異，該多分散混合物具有與其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。個體間差異可以借助各種方法測量，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。個體間差異優(yōu)選地是如下計算的。測定每一個體的劑量響應(yīng)曲線下面積(AUC)(也就是劑量響應(yīng)曲線與基線值之間的面積)。將每一個體的AUC求和，再除以個體數(shù)，測定所有個體的平均AUC。然后測定每一個體的個別AUC與平均AUC之間差異的絕對值。然后將所得差異的絕對值求和，得到代表個體間差異的數(shù)值。數(shù)值越低，代表個體間差異越低，數(shù)值越高，代表個體間差異越高。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有兩個或多個上述提高了的性質(zhì)。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物具有三個或多個上述提高了的性質(zhì)。最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的其中混合物中每一共軛物具有相同聚乙二醇亞單位數(shù)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物具有四個或多個上述提高了的性質(zhì)。
按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，提供了共軛物的混合物，其中每一共軛物具有相同的分子量，并且具有式A結(jié)構(gòu)降鈣素藥物-[-B-Lj-Gk-R-G′m-R′-G″n-T]p(A)其中B是鍵合部分；L是連接基團(tuán)；G、G′和G″是各自選擇的間隔基團(tuán)；R是親脂性基團(tuán)，且R′是聚亞烷基二醇基團(tuán)，或者R′是親脂性基團(tuán)，且R是聚亞烷基氧基團(tuán)；T是終止基團(tuán)；j、k、m和n各自是0或1；p是1至降鈣素藥物上親核殘基數(shù)的整數(shù)。
降鈣素藥物優(yōu)選地是降鈣素。更優(yōu)選地，降鈣素藥物是鮭魚降鈣素。不過，可以理解的是降鈣素藥物可以選自本領(lǐng)域已知的各種降鈣素藥物，例如包括降鈣素前體肽、降鈣素、降鈣素類似物、降鈣素片段和降鈣素片段類似物。降鈣素前體肽包括但不限于katacalcin(PDN-21)(C-前降鈣素)和N-proCT(氨基末端前降鈣素裂解肽)，人。降鈣素類似物可以如上所述借助降鈣素中一個或多個氨基酸的取代而得。降鈣素片段包括但不限于降鈣素1-7，人；和降鈣素8-32，鮭魚。降鈣素片段類似物可以如上所述借助降鈣素片段中一個或多個氨基酸的取代而得。
按照本發(fā)明的這些實(shí)施方式，寡聚體的聚亞烷基二醇部分優(yōu)選地具有至少2、3或4個聚亞烷基二醇亞單位。更優(yōu)選地，聚亞烷基二醇具有至少5或6個聚亞烷基二醇亞單位，最優(yōu)選地，聚亞烷基二醇具有至少7個聚亞烷基二醇亞單位。聚亞烷基二醇部分優(yōu)選地是低級聚亞烷基二醇部分，例如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。更優(yōu)選地，聚亞烷基二醇部分是聚乙二醇部分或聚丙二醇部分。最優(yōu)選地，聚亞烷基二醇部分是聚乙二醇部分。當(dāng)聚亞烷基二醇部分是聚丙二醇部分時，該部分優(yōu)選地具有均勻的(也就是非隨機(jī)的)結(jié)構(gòu)。具有均勻結(jié)構(gòu)的示范性聚丙二醇部分如下 這種均勻的聚丙二醇結(jié)構(gòu)可以被描述為在聚丙二醇鏈中僅有一個甲基取代的碳原子與每一氧原子相鄰。這類均勻的聚丙二醇部分可以表現(xiàn)親脂性和親水性特征，因而可用于提供兩親性降鈣素藥物-寡聚體共軛物，無需使用親脂性聚合物部分。此外，使聚丙二醇部分的仲醇部分與降鈣素藥物偶聯(lián)，可以為降鈣素藥物(例如鮭魚降鈣素)提供提高了的對酶降解作用的抗性，例如見于腸中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的均勻聚丙二醇優(yōu)選地是如圖11至13所述合成的，現(xiàn)在將描述之。正如圖11所述，使1，2-丙二醇53與伯醇保護(hù)試劑反應(yīng)，得到仲醇延長單體54。伯醇保護(hù)試劑可以是將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種伯醇保護(hù)試劑，包括但不限于甲硅烷基氯化合物，例如叔丁基二苯基甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯，和酯化試劑，例如Ac2O。優(yōu)選地，伯醇保護(hù)試劑是與仲醇基本無反應(yīng)性的伯醇保護(hù)試劑，例如叔丁基二苯基甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯?？梢允怪俅佳娱L單體(54)與甲磺酰氯(MeSO2Cl)反應(yīng)，得到伯醇延長單體甲磺酸酯55。
或者，可以使仲醇延長單體54與仲醇保護(hù)試劑反應(yīng)，得到化合物56。仲醇保護(hù)試劑可以是將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種仲醇保護(hù)試劑，包括但不限于芐基氯?？梢允够衔?6與B1去保護(hù)試劑反應(yīng)，以除去保護(hù)部分B1，得到伯醇延長單體57。B1去保護(hù)試劑可以選自將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種去保護(hù)試劑。當(dāng)通過成酯來保護(hù)伯醇時，B1去保護(hù)試劑是一種去酯化試劑，例如一種堿(例如碳酸鉀)。當(dāng)用一種甲硅烷基氯保護(hù)伯醇時，B1去保護(hù)試劑優(yōu)選地是氟化四丁銨(TBAF)?？梢允共佳娱L單體57與甲烷磺酰氯反應(yīng)，得到仲醇延長單體甲磺酸酯58。
伯醇延長單體54和仲醇延長單體57可以如下被封端?？梢允怪俅佳娱L單體54與封端試劑反應(yīng)，得到化合物59。封端試劑可以是將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種封端試劑，包括但不限于烷基鹵，例如甲基氯?？梢允够衔?9與B1去保護(hù)試劑反應(yīng)，得到伯醇封端單體60?？梢允共挤舛藛误w60與甲磺酰氯反應(yīng)，得到仲醇封端單體甲磺酸酯61?？梢允共佳娱L單體57與封端試劑反應(yīng)，得到化合物62。封端試劑可以是如上所述的各種封端試劑?？梢允够衔?2與B2去保護(hù)試劑反應(yīng)，以除去保護(hù)部分B2，得到仲醇封端單體63。B2去保護(hù)試劑可以是將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種去保護(hù)試劑，包括但不限于在鈀/活性碳催化劑的存在下的H2。可以使仲醇封端單體與甲磺酰氯反應(yīng)，得到伯醇封端單體甲磺酸酯64。盡管圖11所述實(shí)施方式顯示了封端單體的合成，不過可以理解的是可以進(jìn)行相似的反應(yīng)得到封端聚合物。
一般而言，鏈延長可以這樣進(jìn)行，使伯醇延長單體或聚合物、例如伯醇延長單體57與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯、例如伯醇延長單體甲磺酸酯55反應(yīng)，得到各種均勻的聚丙烯鏈，或者使仲醇延長單體或聚合物、例如仲醇延長單體54與仲醇延長單體或聚合物甲磺酸酯、例如仲醇延長單體甲磺酸酯58反應(yīng)。
例如，在圖13中，使伯醇延長單體甲磺酸酯55與伯醇延長單體57反應(yīng)，得到二聚化合物65?；蛘?，可以使仲醇延長單體甲磺酸酯58與仲醇延長單體54反應(yīng)，得到二聚化合物65。二聚化合物65上的B1保護(hù)部分可以用如上所述的B1去保護(hù)試劑除去，得到伯醇延長二聚物66?？梢允共佳娱L二聚物66與甲磺酰氯反應(yīng)，得到仲醇延長二聚物甲磺酸酯67。或者，二聚化合物65上的B2保護(hù)部分可以用如上所述的B2去保護(hù)試劑除去，得到仲醇延長二聚物69。可以使仲醇延長二聚物69與甲磺酰氯反應(yīng)，得到伯醇延長二聚物甲磺酸酯70。
正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可以重復(fù)鏈延長過程，以達(dá)到各種其他鏈長。例如，如圖13所述，可以使伯醇延長二聚物66與伯醇延長二聚物甲磺酸酯70反應(yīng)，得到四聚化合物72。進(jìn)一步如圖13所述，一般的鏈延長反應(yīng)流程牽涉使伯醇延長單體或聚合物73與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯74反應(yīng)，得到均勻的聚丙烯聚合物75。m和n的值可以各自為0至1000或以上。優(yōu)選地，m和n各自為0至50。盡管圖13所述實(shí)施方式顯示了伯醇延長單體和/或聚合物是與伯醇延長單體和/或聚合物甲磺酸酯反應(yīng)的，不過可以理解的是可以使用仲醇延長單體和/或聚合物和仲醇延長單體和/或聚合物甲磺酸酯來進(jìn)行相似的反應(yīng)。
可以使伯醇延長單體或聚合物的末端或伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯的末端分別與伯醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端單體或聚合物反應(yīng)，得到被封端的均勻的聚丙烯鏈。例如，如圖12所述，使伯醇延長二聚物甲磺酸酯70與伯醇封端單體60反應(yīng)，得到被封端/被保護(hù)的伯醇延長三聚物71。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可以除去B1保護(hù)部分，可以使所得封端伯醇延長三聚物與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯反應(yīng)，以延長被封端的三聚物71的鏈。
可以使仲醇延長單體或聚合物的末端或仲醇延長單體或聚合物甲磺酸酯的末端分別與仲醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端單體或聚合物反應(yīng)，得到被封端的均勻的聚丙烯鏈。例如，如圖12所述，使仲醇延長二聚物甲磺酸酯67與仲醇封端單體63反應(yīng)，得到被封端/被保護(hù)的伯醇延長三聚物68?？梢匀缟纤龀2保護(hù)部分，可以使所得被封端的仲醇延長三聚物與仲醇延長鏈節(jié)甲磺酸酯反應(yīng)，以延長被封端的三聚物68的鏈。盡管圖12所述實(shí)施方式顯示了二聚物與封端單體反應(yīng)得到三聚物，不過可以理解的是可以在均勻聚丙二醇部分合成中的任何點(diǎn)上進(jìn)行封端過程，或者可以提供未被封端的均勻聚丙二醇部分。盡管圖12所述實(shí)施方式顯示了聚丁烯寡聚體借助封端單體合成而封端，不過可以理解的是可以如上圖11所述使用封端試劑將本發(fā)明的聚丁烯寡聚體直接封端(也就是無需加入封端單體)。
可以使根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的聚丙二醇部分與降鈣素藥物、親脂性部分(例如羧酸)和/或各種其他部分偶聯(lián)，借助將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種方法，包括但不限于本文關(guān)于聚乙二醇部分所述那些。
按照本發(fā)明的這些實(shí)施方式，親脂性部分是將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的親脂性部分。親脂性部分優(yōu)選地是飽和或不飽和的直鏈或支鏈烷基部分或者飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪酸部分。當(dāng)親脂性部分是烷基部分時，它優(yōu)選地是直鏈的、飽和或不飽和烷基部分，具有1至28個碳原子。更優(yōu)選地，烷基部分具有2至12個碳原子。當(dāng)親脂性部分是脂肪酸部分時，它優(yōu)選地是天然脂肪酸部分，它是直鏈的、飽和或不飽和的，具有2至18個碳原子。更優(yōu)選地，脂肪酸部分具有3至14個碳原子。最優(yōu)選地，脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
按照本發(fā)明的這些實(shí)施方式，間隔部分G、G′和G″是將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的間隔部分。間隔部分優(yōu)選地選自由糖、膽固醇和甘油部分組成的組。優(yōu)選地，這些實(shí)施方式的寡聚體不包括間隔部分(也就是說，k、m和n優(yōu)選地是0)。
按照本發(fā)明的這些實(shí)施方式，連接部分L可以用于使寡聚體與藥物偶聯(lián)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。連接部分優(yōu)選地選自由烷基和脂肪酸部分組成的組。
按照本發(fā)明的這些實(shí)施方式，終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，更優(yōu)選地是低級烷基或低級烷氧基部分。最優(yōu)選地，終端部分是甲基或甲氧基。盡管終端部分優(yōu)選地是烷基或烷氧基部分，不過終端部分可以是將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
按照本發(fā)明的這些實(shí)施方式，使由式A結(jié)構(gòu)的括號部分代表的寡聚體與降鈣素藥物共價偶聯(lián)。在一些實(shí)施方式中，利用可水解的鍵(例如酯或碳酸酯鍵)使降鈣素藥物與寡聚體偶聯(lián)。可水解的偶聯(lián)可以提供充當(dāng)前體藥物的降鈣素藥物-寡聚體共軛物。在某些情形中，例如其中降鈣素藥物-寡聚體共軛物是無活性的(也就是說，共軛物缺乏通過降鈣素藥物的主要作用機(jī)理來影響機(jī)體的能力)，可水解的偶聯(lián)可以提供定時釋放或控制釋放的效果，隨著一個或多個寡聚體從它們各自的降鈣素藥物-寡聚體共軛物上裂解下來以提供活性藥物，在給定時間階段內(nèi)給以降鈣素藥物。在其他實(shí)施方式中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)使降鈣素藥物與寡聚體偶聯(lián)。當(dāng)需要使降鈣素藥物-寡聚體共軛物在血流中長時間循環(huán)時，優(yōu)選至少2小時，不可水解的鍵的使用可能是優(yōu)選的。當(dāng)寡聚體與降鈣素藥物共價偶聯(lián)時，寡聚體進(jìn)一步包含一個或多個鍵合部分，用于使寡聚體與降鈣素藥物共價偶聯(lián)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。鍵合部分優(yōu)選地選自由共價鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分組成的組。寡聚體上一種以上的部分可以與降鈣素藥物共價偶聯(lián)。
變量p是1至降鈣素藥物上親核殘基數(shù)的整數(shù)。當(dāng)p大于1時，一個以上寡聚體(即大量寡聚體)與藥物偶聯(lián)。按照本發(fā)明的這些實(shí)施方式，這些寡聚體都是相同的。當(dāng)大量寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)時，可以優(yōu)選的是利用可水解的鍵使一個或多個寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)，利用不可水解的鍵使一個或多個寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)?；蛘?，所有使大量寡聚體與降鈣素藥物偶聯(lián)的鍵都是可水解的，但是具有不同程度的可水解性，以便例如一個或多個寡聚體在體內(nèi)被水解作用迅速從降鈣素藥物上除去，一個或多個寡聚體在體內(nèi)被水解作用緩慢從降鈣素藥物上除去。
寡聚體可以與降鈣素藥物偶聯(lián)在該降鈣素藥物的各種親核殘基上，包括但不限于親核性羥基官能和/或氨基官能。當(dāng)降鈣素藥物是多肽時，親核性羥基官能例如可以見于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，親核性氨基官能例如可以見于組氨酸和/或賴氨酸殘基、和/或多肽的一個或多個N-末端。當(dāng)寡聚體與降鈣素多肽的一個或多個N-末端偶聯(lián)時，偶聯(lián)作用優(yōu)選地生成仲胺。當(dāng)降鈣素藥物是鮭魚降鈣素時，例如，寡聚體可以與鮭魚降鈣素的氨基官能度偶聯(lián)，包括Lys11、Lys18和/或N-末端的氨基官能度。盡管一個或多個寡聚體可以與鮭魚降鈣素偶聯(lián)，不過當(dāng)寡聚體與Lys11和Lys18的氨基官能度偶聯(lián)時，在二共軛的鮭魚降鈣素中觀察到更高的生物功效，例如提高了的血清鈣降低能力。
其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物可以借助各種方法合成。例如，由羧酸和聚乙二醇組成的寡聚體混合物是這樣合成的，使羧酸混合物與聚乙二醇混合物在足以提供寡聚體混合物的條件下接觸。然后活化寡聚體混合物，以便它們能夠與降鈣素藥物反應(yīng)，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物。用于提供其中每一寡聚體具有相同分子量且具有式A寡聚體結(jié)構(gòu)的活化寡聚體混合物的一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖3和實(shí)施例11-18中。用于提供其中每一寡聚體具有相同分子量且具有式A寡聚體結(jié)構(gòu)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖4和實(shí)施例19-24中。用于提供其中每一寡聚體具有相同分子量且具有式A寡聚體結(jié)構(gòu)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖5和實(shí)施例25-29中。用于提供其中每一寡聚體具有相同分子量且具有式A寡聚體結(jié)構(gòu)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖6和實(shí)施例30-31中。用于提供其中每一寡聚體具有相同分子量且具有式A寡聚體結(jié)構(gòu)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖7和實(shí)施例32-37中。用于提供其中每一寡聚體具有相同分子量且具有式A寡聚體結(jié)構(gòu)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖8和實(shí)施例38中。用于提供其中每一寡聚體具有相同分子量且具有式A寡聚體結(jié)構(gòu)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖9和實(shí)施例39中。用于提供其中每一寡聚體具有相同分子量且具有式A寡聚體結(jié)構(gòu)的活化寡聚體混合物的另一種合成途徑實(shí)施方式闡述在下列圖10和實(shí)施例40中。
可以使其中每一寡聚體具有相同分子量且具有式A寡聚體結(jié)構(gòu)的活化寡聚體混合物與其中混合物中每一藥物具有相同分子量的降鈣素藥物混合物在足以提供降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的條件下反應(yīng)。優(yōu)選的合成描述在下列實(shí)施例41中。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可以控制反應(yīng)條件(例如選擇摩爾比、溶劑混合物和/或pH)，以便從其中每一寡聚體具有相同分子量且具有式A寡聚體結(jié)構(gòu)的活化寡聚體混合物與降鈣素藥物混合物的反應(yīng)所得降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物是共軛物的混合物，其中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)。例如，通過維持反應(yīng)溶液的pH低于賴氨酸pKa，可以抑制賴氨酸氨基官能度上的共軛作用?；蛘?，例如利用HPLC可以分離和離析降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物、例如單-、二-或三-共軛物的混合物，其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)。所離析的特定共軛物的共軛程度(例如所離析的分子是單-、二-還是三-共軛物)可以利用各種將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的技術(shù)加以測定和/或驗(yàn)證，包括但不限于質(zhì)譜法。特定共軛物結(jié)構(gòu)(例如寡聚體位于鮭魚降鈣素單共軛物的Lys11、Lys18還是N-末端上)可以利用各種將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的技術(shù)加以測定和/或驗(yàn)證，包括但不限于序列分析、肽繪圖、選擇性酶裂解和/或內(nèi)肽酶裂解。
正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，降鈣素藥物上一個或多個反應(yīng)位點(diǎn)例如可以這樣保護(hù)，使降鈣素藥物與適合的保護(hù)試劑反應(yīng)，例如N-叔丁氧羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧羰基)(N-FMOC)。例如當(dāng)降鈣素藥物是一種多肽，并且需要生成在該多肽N-末端上具有寡聚體的不飽和共軛物(也就是其中不是所有的親核殘基都被共軛的共軛物)時，這種方法可能是優(yōu)選的。在這類保護(hù)之后，可以使被保護(hù)的降鈣素藥物混合物與活化寡聚體混合物反應(yīng)，其中混合物中每一寡聚體具有相同分子量且具有式A寡聚體結(jié)構(gòu)，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，具有與一個或多個親核殘基偶聯(lián)的寡聚體，并且具有與其他親核殘基偶聯(lián)的保護(hù)部分。在共軛反應(yīng)后，可以使降鈣素藥物-寡聚體共軛物去保護(hù)，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。如果必要的話，然后可以如上所述分離降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，得到降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)。或者，可以在去保護(hù)之前分離降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物。
與常規(guī)混合物相比，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有提高了的性質(zhì)。例如，其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地能夠降低血清鈣水平達(dá)至少5％。優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少10、11、12、13或14％。更優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少15、16、17、18或19％，最優(yōu)選地，共軛物混合物能夠降低血清鈣水平達(dá)至少20％。
作為另一個實(shí)例，分別與沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性相比，其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有增加了的對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性。對胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶的抗性相當(dāng)于利用下列實(shí)施例51所述操作，當(dāng)供試分子在可用的酶中被消化時所剩余的百分比。優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約10％。更優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約15％。最優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性約20％。優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約10％。更優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約20％。最優(yōu)選地，降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性大于沒有與寡聚體共軛的降鈣素藥物混合物對胰蛋白酶降解作用的抗性約30％。
作為另一個實(shí)例，其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效更高的生物功效。特定化合物的生物功效相當(dāng)于它的曲線下面積(AUC)值。優(yōu)選地，混合物的生物功效大于沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效約5％。更優(yōu)選地，混合物的生物功效大于沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效約10％。
作為另一個實(shí)例，其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的體內(nèi)活性更大的體內(nèi)活性，該多分散混合物具有與其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法，例如凝膠滲透色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(2d.ed.，1991)所述。
作為另一個實(shí)例，其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的體外活性更大的體外活性，該多分散混合物具有與其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。
作為另一個實(shí)例，與多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性相比，其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有增加了的對胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶降解作用的抗性，該多分散混合物具有與其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。
作為另一個實(shí)例，其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有比多分散降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的個體間差異更小的個體間差異，該多分散混合物具有與其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物相同的數(shù)均分子量。正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，混合物的數(shù)均分子量可以借助各種方法測量，包括但不限于尺寸排阻色譜法。個體間差異可以借助各種方法測量，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。個體間差異優(yōu)選地是如下計算的。測定每一個體的劑量響應(yīng)曲線下面積(AUC)(也就是劑量響應(yīng)曲線與基線值之間的面積)。將每一個體的AUC求和，再除以個體數(shù)，測定所有個體的平均AUC。然后測定每一個體的個別AUC與平均AUC之間差異的絕對值。然后將所得差異的絕對值求和，得到代表個體間差異的數(shù)值。數(shù)值越低，代表個體間差異越低，數(shù)值越高，代表個體間差異越高。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物優(yōu)選地具有兩個或多個上述提高了的性質(zhì)。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物具有三個或多個上述提高了的性質(zhì)。最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的其中混合物中每一共軛物具有相同分子量且具有式A結(jié)構(gòu)的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物具有四個或多個上述提高了的性質(zhì)。
還提供了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的包含共軛物混合物的藥物組合物?？梢园凑找阎夹g(shù)將上述降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物配制成在藥物載體中給藥的形式。例如參見Remington，The Science AndPractice of Pharmacy(9th ed.1995)。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的藥物組合物的制備中，一般將降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物尤其與藥學(xué)上可接受的載體混合。當(dāng)然，載體在與藥物組合物中任何其他成分可相容的意義上必須是可接受的，并且不應(yīng)有害于患者。載體可以是固體或液體，或者二者皆是，并且優(yōu)選地與降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物配制成單位劑量制劑，例如片劑，可以含有約0.01或0.5％至約95％或99％重量的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物。藥物組合物可以借助任何熟知的藥學(xué)技術(shù)加以制備，包括但不限于混合各組分，可選地包括一種或多種輔助成分。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的藥物組合物包括適合于口服、直腸、局部、吸入(例如經(jīng)由氣霧劑)、頰(例如舌下)、陰道、腸胃外(例如皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、動脈內(nèi)或靜脈內(nèi))、局部(也就是皮膚和粘膜表面，包括氣道表面)和透皮給藥的那些，不過最適合的途徑在任何給定情況下將取決于所治療病癥的性質(zhì)與嚴(yán)重性和所用特定降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的性質(zhì)。
適合于口服給藥的藥物組合物可以以離散單元的形式存在，例如膠囊劑、扁囊劑、錠劑或片劑，各自含有預(yù)定量的降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物；可以為粉劑或顆粒劑；可以為在水性或非水性液體中的溶液劑或混懸劑；或者可以為水包油或油包水乳劑。這類制劑可以借助任何適合的藥學(xué)方法制備，包括將降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物與適合載體(可以含有一種或多種輔助成分，如上所述)締合的步驟。一般而言，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的藥物組合物是這樣制備的，將降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物與液體或微細(xì)粉碎的固體載體或二者皆是均勻緊密地混合，然后如果必要的話，使所得混合物成型。例如，片劑可以這樣制備，壓制或模制含有降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物和可選的一種或多種輔助成分的粉末或顆粒。壓制片可以這樣制備，在適合的機(jī)器中壓制自由流動形式的混合物，例如粉末或顆粒，可選地混有粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑和/或表面活性劑/分散劑。模制片可以這樣制備，在適合的機(jī)器中模制用惰性液體粘合劑潤濕的粉狀化合物。
適于頰(舌下)給藥的藥物組合物包括錠劑，在矯味的基質(zhì)中包含降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，基質(zhì)通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠；和軟錠劑，在惰性基質(zhì)中包含降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物，基質(zhì)例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠。
適合于腸胃外給藥的根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的藥物組合物包含降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的無菌水性與非水性注射溶液，該制劑優(yōu)選地與打算接受者的血液是等滲的。這些制劑可以含有抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑和賦予組合物與打算接受者的血液以等滲性的溶質(zhì)。水性與非水性的無菌混懸液可以包括懸浮劑和增稠劑。組合物可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以貯存在冷凍-干燥(凍干)條件下，僅需在使用之前立即加入無菌的液體載體，例如鹽水或注射用水。臨時的注射溶液和混懸液可以從前述類型的無菌粉劑、顆粒劑和片劑制備。例如，可以提供位于密封容器中的可注射、穩(wěn)定無菌組合物的單位劑量形式，其中包含降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物?？梢蕴峁┙碘}素藥物-寡聚體共軛物混合物的凍干產(chǎn)物形式，它能夠與適合的藥學(xué)上可接受的載體再生為適合向個體注射的液體組合物。單位劑量形式一般包含約10mg至約10克降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物。當(dāng)降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物基本上是水不溶性的時，可以采用生理學(xué)上可接受的足量乳化劑，使降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物在水性載體中乳化。一種這類有用的乳化劑是磷脂酰膽堿。
適合于直腸給藥的藥物組合物優(yōu)選地是以單位劑量栓劑的形式存在的。它們可以這樣制備，混合降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物與一種或多種常規(guī)固體載體，例如椰子油，然后使所得混合物成型。
適合于皮膚局部用藥的藥物組合物優(yōu)選地采取軟膏劑、霜劑、洗劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑的形式?？梢允褂玫妮d體包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮增強(qiáng)劑和兩種或多種的組合。
適合于透皮給藥的藥物組合物可以以離散貼劑的形式存在，適于與接受者的表皮保持長時間的緊密接觸。適合于透皮給藥的組合物還可以借助離子電滲療法來釋放(例如參見Pharmaceutical Research3(6)318(1986))，一般采取降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的可選被緩沖的水溶液的形式。適合的制劑包含枸櫞酸鹽或bis\tris緩沖劑(pH6)或乙醇/水，含有0.1至0.2M活性成分。
還提供了治療需要這類治療的個體骨障礙的方法，該方法給以有效量的這類藥物組合物。骨障礙優(yōu)選地是以過量破骨性骨吸收和/或血鈣過多性血清效應(yīng)為特征的。
其應(yīng)用屬于本發(fā)明范圍的任何降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的有效量將因混合物和患者而異，將取決于一些因素，例如患者的年齡與病癥和釋放的途徑。這類劑量可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)藥理學(xué)操作加以確定。作為一般性建議，約0.1至約50mg/kg的劑量將具有治療功效，所有重量都是基于降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的重量來計算的。在較高劑量下的毒性考慮可能限制靜脈內(nèi)劑量至較低的水平，例如最高約10mg/kg，所有重量都是基于降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物的重量來計算的。約10mg/kg至約50mg/kg的劑量可以用于口服給藥。一般而言，約0.5mg/kg至5mg/kg的劑量可以用于肌內(nèi)注射。給藥的頻率通常為每天一、二或三次，或者可以根據(jù)控制病癥的需要?；蛘?，藥物-寡聚體共軛物可以通過連續(xù)輸注給藥。治療的持續(xù)時間取決于所治療的骨障礙類型，可以長達(dá)患者的一生。
還提供了合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的共軛物混合物的方法。盡管下列合成途徑實(shí)施方式涉及單分散混合物的合成，不過可以利用相似的合成途徑來合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的其他降鈣素藥物-寡聚體共軛物混合物。
如反應(yīng)1所述得到包含聚乙二醇部分的基本單分散聚合物混合物R1(OC2H4)nO-X++R2(OC2H4)mOMs→R2(OC2H4)m+nOR11(I) (II)(III)R1是H或親脂性部分。R1優(yōu)選地是H、烷基、芳基烷基、芳族部分、脂肪酸部分、脂肪酸部分的酯、膽固醇基或金剛烷基。R1更優(yōu)選地是H、低級烷基或芳族部分。R1最優(yōu)選地是H、甲基或芐基。
式I中，n是1至25。n優(yōu)選地是1至6。
X+是陽離子。X+優(yōu)選地是能夠使PEG上羥基部分電離的化合物、例如強(qiáng)堿中的任何陽離子。陽離子的實(shí)例包括但不限于鈉離子、鉀離子、鋰離子、銫離子和鉈離子。
R2是H或親脂性部分。R2優(yōu)選地是直鏈或支鏈烷基、芳基烷基、芳族部分、脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯。R2更優(yōu)選地是低級烷基、芐基、具有1至24個碳原子的脂肪酸部分或具有1至24個碳原子的脂肪酸部分的酯。R2最優(yōu)選地是甲基、具有1至18個碳原子的脂肪酸部分或具有1至18個碳原子的脂肪酸部分的酯。
式II中，m是1至25。m優(yōu)選地是1至6。
Ms是甲磺酸酯部分(即CH3S(O2)-)。
如反應(yīng)1所述，使具有式I結(jié)構(gòu)的化合物的混合物與具有式II結(jié)構(gòu)的化合物的混合物反應(yīng)，得到包含聚乙二醇部分并具有式III結(jié)構(gòu)的聚合物的混合物。具有式I結(jié)構(gòu)的化合物的混合物是基本單分散混合物。優(yōu)選地，式I化合物混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量，更優(yōu)選地，式I化合物混合物是單分散混合物。式II化合物的混合物是基本單分散混合物。優(yōu)選地，式II化合物混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量，更優(yōu)選地，式II化合物混合物是單分散混合物。式III化合物的混合物是基本單分散混合物。優(yōu)選地，式III化合物混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量。更優(yōu)選地，式III化合的混合物是單分散混合物。
反應(yīng)1優(yōu)選地是在約0℃與約40℃之間進(jìn)行的，更優(yōu)選地是在約15℃與約35℃之間進(jìn)行的，最優(yōu)選地是在室溫(大約25℃)下進(jìn)行的。
反應(yīng)1可以進(jìn)行將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種時間階段。反應(yīng)1優(yōu)選地進(jìn)行約0.25、0.5或0.75小時至約2、4或8小時。
反應(yīng)1優(yōu)選地是在質(zhì)子惰性溶劑中進(jìn)行的，例如但不限于N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、六甲基磷酸三酰胺、四氫呋喃(THF)、二噁烷、二乙醚、甲基叔丁醚(MTBE)、甲苯、苯、己烷、戊烷、N-甲基吡咯烷酮、四氫萘、十氫萘、1，2-二氯苯、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮或它們的混合物。更優(yōu)選地，溶劑是DMF、DMA或甲苯。
式I化合物與式II化合物的摩爾比優(yōu)選地大于約1∶1。摩爾比更優(yōu)選為至少約2∶1。通過提供過量的式I化合物，可以確保基本上所有的式II化合物都進(jìn)行了反應(yīng)，這有助于式III化合物的回收，正如下文所討論的。
式I化合物優(yōu)選地是如反應(yīng)2所述制備的能夠使式IV2電離的化合物(IV)(I)R1和X+是如上所述的，式IV化合物混合物是基本單分散的；優(yōu)選地，式IV化合物混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量；更優(yōu)選地，式IV化合物混合物是單分散混合物。
各種能夠使式IV化合物PEG部分上羥基部分電離的化合物將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。能夠使羥基部分電離的化合物優(yōu)選地是強(qiáng)堿。更優(yōu)選地，能夠使羥基部分電離的化合物選自由氫化鈉、氫化鉀、叔丁醇鈉、叔丁醇鉀、丁基鋰(BuLi)和二異丙氨基化鋰組成的組。能夠使羥基部分電離的化合物更優(yōu)選地是氫化鈉。
能夠使式IV化合物PEG部分上羥基電離的化合物與式IV化合物的摩爾比優(yōu)選為至少約1∶1，更優(yōu)選為至少約2∶1。通過提供過量的能夠使羥基部分電離的化合物，確保了基本上所有的式IV化合物都進(jìn)行了反應(yīng)，得到式I化合物。因此，可以避免了分離困難，這出現(xiàn)于式IV化合物和式I化合物都存在于反應(yīng)產(chǎn)物混合物中。
反應(yīng)2優(yōu)選地是在約0℃與約40℃之間進(jìn)行的，更優(yōu)選地是在約0℃與約35℃之間進(jìn)行的，最優(yōu)選地是在約0℃與室溫(大約25℃)之間進(jìn)行的。
反應(yīng)2可以進(jìn)行將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種時間階段。反應(yīng)1優(yōu)選地進(jìn)行約0.25、0.5或0.75小時至約2、4或8小時。
反應(yīng)2優(yōu)選地是在質(zhì)子惰性溶劑中進(jìn)行的，例如但不限于N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、六甲基磷酸三酰胺、四氫呋喃(THF)、二噁烷、二乙醚、甲基叔丁醚(MTBE)、甲苯、苯、己烷、戊烷、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、氯仿、四氫萘、十氫萘、1，2-二氯苯、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮或它們的混合物。更優(yōu)選地，溶劑是DMF、二氯甲烷或甲苯。
式II化合物優(yōu)選地是如反應(yīng)3所述制備的
R2和Ms是如上所述的，式V化合物是以式V化合物的基本單分散混合物的形式存在的；式V化合物混合物中優(yōu)選至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量；更優(yōu)選地，式V化合物混合物是單分散混合物。
Q是鹵化物，優(yōu)選氯化物或氟化物。
CH3S(O2)Q是甲磺酰鹵。甲磺酰鹵優(yōu)選地是甲磺酰氯或甲磺酰氟。更優(yōu)選地，甲磺酰鹵是甲磺酰氯。
甲磺酰鹵與式V化合物的摩爾比優(yōu)選地大于約1∶1，更優(yōu)選為至少約2∶1。通過提供過量的甲磺酰鹵，確保了基本上所有的式V化合物都進(jìn)行了反應(yīng)，得到式II化合物。因此，可以避免了分離困難，這出現(xiàn)于式V化合物和式II化合物都存在于反應(yīng)產(chǎn)物混合物中。
反應(yīng)3優(yōu)選地是在約-10℃與約40℃之間進(jìn)行的，更優(yōu)選地是在約0℃與約35℃之間進(jìn)行的，最優(yōu)選地是在約0℃與室溫(大約25℃)之間進(jìn)行的。
反應(yīng)3可以進(jìn)行將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種時間階段。反應(yīng)1優(yōu)選地進(jìn)行約0.25、0.5或0.75小時至約2、4或8小時。
反應(yīng)3優(yōu)選地是在脂族胺的存在下進(jìn)行的，包括但不限于一甲胺、二甲胺、三甲胺、一乙胺、二乙胺、三乙胺、單異丙胺、二異丙胺、單正丁胺、二正丁胺、三正丁胺、單環(huán)己胺、二環(huán)己胺或它們的混合物。更優(yōu)選地，脂族胺是叔胺，例如三乙胺。
正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，各種式V化合物的基本單分散混合物是商業(yè)上可得到的。例如，當(dāng)R2是H或甲基時，式V化合物分別是PEG或mPEG化合物，在商業(yè)上可從Aldrich of Milwaukee，Wisconsin；Fluka of Switzerland和/或TCl America of Portland，Oregon獲得。
當(dāng)R2是親脂性部分時，例如高級烷基、脂肪酸、脂肪酸的酯、膽固醇基或金剛烷基，式V化合物可以借助將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種方法制得。式V化合物優(yōu)選地是如下制得的
4(VI) (VII) (VIII)5(VIII) (V)R2是親脂性部分，優(yōu)選高級烷基、脂肪酸酯、膽固醇基或金剛烷基，更優(yōu)選脂肪酸的低級烷基酯，最優(yōu)選具有1至18個碳原子的脂肪酸乙基酯。
R3是H、芐基、三苯甲基、四氫吡喃或?qū)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所理解的其他醇保護(hù)基團(tuán)。
X2+是如上關(guān)于X+所述的陽離子。
m的值是如上所述的。
關(guān)于反應(yīng)4，使式VI化合物混合物與式VII化合物混合物在與上面關(guān)于反應(yīng)1所述相似的條件下反應(yīng)。式VI化合物混合物是基本單分散混合物。優(yōu)選地，式VI化合物混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量。更優(yōu)選地，式VI化合物混合物是單分散混合物。式VII化合物混合物是基本單分散混合物。優(yōu)選地，式VII化合物混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量。更優(yōu)選地，式VII化合物混合物是單分散混合物。
關(guān)于反應(yīng)5，VIII化合物可以被將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的各種方法水解，轉(zhuǎn)化R3部分為醇。當(dāng)R3是芐基或三苯甲基時，水解作用優(yōu)選地是這樣進(jìn)行的，利用H2，在鈀-木炭催化劑的存在下，這將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。當(dāng)然，當(dāng)R3是H時，反應(yīng)5是不必要的。
式VI化合物可以是商業(yè)上可得到的或者如上關(guān)于反應(yīng)3所述制得。式VII化合物可以如上關(guān)于反應(yīng)2所述制得。
可以使包含PEG部分且具有上式III結(jié)構(gòu)的基本單分散聚合物混合物進(jìn)一步與其他包含PEG部分的基本單分散聚合物反應(yīng)，目的是延長PEG鏈。例如，可以采用下列流程

(LX) (X) (XI)Ms、m和n是如上反應(yīng)1所述的；p與n和m相似，X2+與如上關(guān)于反應(yīng)1所述X+相似。Q是如上反應(yīng)3所述的。R2是如上反應(yīng)1所述的，優(yōu)選低級烷基。R1是H。反應(yīng)6優(yōu)選地是按照如上關(guān)于反應(yīng)3所述相似的方式進(jìn)行的。反應(yīng)7優(yōu)選地是按照如上關(guān)于反應(yīng)1所述相似的方式進(jìn)行的。優(yōu)選地，式III化合物混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量，更優(yōu)選地，式III化合物混合物是單分散混合物。式X化合物混合物是基本單分散混合物。優(yōu)選地，式X化合物混合物中至少約96、97、98或99％的化合物具有相同的分子量，更優(yōu)選地，式X化合物混合物是單分散混合物。
圖1所示流程闡述了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的方法，現(xiàn)將描述之?；締畏稚⒌暮垡叶脊丫垠w的合成開始于基本單分散聚乙二醇一芐醚(1)的制備。使過量的商業(yè)上可得到的基本單分散聚乙二醇與芐基氯在含水氫氧化鈉的存在下反應(yīng)，如Coudert et al(SyntheticCommunications，16(1)19-26(1986))所述。然后加入NaH制備1的鈉鹽，使這種鈉鹽與從羥基鏈烷酸(2)的酯合成的甲磺酸酯反應(yīng)。經(jīng)由催化氫化作用使甲磺酸酯置換產(chǎn)物(3)脫芐基化，得到醇(4)?？梢酝ㄟ^加入甲磺酰氯制備這種醇的甲磺酸酯(5)，用作親電試劑與基本單分散聚乙二醇衍生物的一甲醚的鈉鹽反應(yīng)，從而延長寡聚體的聚乙二醇部分至所需長度，得到延長了的酯(6)。酯可以在水性基質(zhì)中水解為酸(7)，借助與碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為活化酯(8)。盡管圖1所述寡聚體是用N-羥基琥珀酰亞胺活化的，不過可以理解的是各種其他試劑也可以用于活化本發(fā)明的寡聚體，包括但不限于活性氯甲酸苯基酯，例如氯甲酸對硝基苯基酯、氯甲酸苯基酯、3，4-苯基二氯甲酸酯和3，4-苯基二氯甲酸酯；tresylation；和縮醛生成。
參照圖1，q是1至24。優(yōu)選地，q是1至18，q更優(yōu)選地是4至16。R4是能夠經(jīng)歷水解作用得到羧酸的部分。R4優(yōu)選地是低級烷基，更優(yōu)選乙基。變量n和m是如上關(guān)于反應(yīng)1所述的。
用在本文所述操作中的所有原料都是商業(yè)上可得到的，或者可以使用商業(yè)上可得到的原料借助本領(lǐng)域已知的方法加以制備。
現(xiàn)將參照下列實(shí)施例描述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)意識到的是這些實(shí)施例是用來闡述本發(fā)明各方面的，并不限制由權(quán)利要求所限定的發(fā)明范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1至10實(shí)施例1至10中的反應(yīng)是在氮下、用磁攪拌進(jìn)行的，另有指定除外。“逐步處理(Work-up)”表示用有機(jī)溶劑萃取、有機(jī)相用飽和NaCl溶液洗滌、干燥(MgSO4)、蒸發(fā)(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)。薄層色譜法是利用預(yù)先涂有硅膠60°F-254的Merck玻璃板進(jìn)行的，斑點(diǎn)是用碘蒸氣顯色的。所有質(zhì)譜法都是用Macromolecular Resources Colorado StateUNiversity，CO測定的，是按m/z、(相對強(qiáng)度)的順序報告的。元素分析和熔點(diǎn)測定是用Galbraith Laboratories，Inc.，Knoxville，TN進(jìn)行的。實(shí)施例1-10涉及圖2所述流程。
實(shí)施例18-甲氧基-1-(甲磺?；?氧基-3，6-二氧雜辛烷(9)將非多分散三甘醇一甲醚分子(4.00ml，4.19g，25.5mmol)與三乙胺(4.26ml，3.09g，30.6mmol)的無水二氯甲烷(50ml)溶液在冰浴中冷卻，置于氮?dú)夥障?。從加液漏斗滴加甲磺酰?2.37ml，3.51g，30.6mmol)的無水二氯甲烷(20ml)溶液。氯化物加入完成10分鐘后，除去反應(yīng)混合物的冰浴，使其恢復(fù)至室溫。將混合物攪拌另外1小時，此時TLC(以含15％MeOH的CHCl3作為洗脫劑)顯示沒有剩余的三甘醇一甲醚。將反應(yīng)混合物用另外75ml二氯甲烷稀釋，連續(xù)用飽和NaHCO3、水和鹽水洗滌。將有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾，在真空中濃縮，得到化合物9的非多分散混合物，為澄清的油(5.31g，86％)。
實(shí)施例2乙二醇一甲醚(10)(m＝4，5，6)在N2下，向攪拌著的非多分散化合物11(35.7mmol)的無水DMF(25.7ml)溶液分批加入60％NaH的礦物油分散體，將混合物在室溫下攪拌1小時。向該鹽12一次性加入非多分散甲磺酸酯9(23.36mmol)的無水DMF(4ml)溶液，將混合物在室溫下攪拌3.5小時。用TLC(12％CH3OH-CHCl3)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。將反應(yīng)混合物用等量1N HCl稀釋，用乙酸乙酯萃取(2×20ml)，棄去。萃取水溶液并逐步處理，得到非多分散聚合物10(收率82-84％)。
實(shí)施例33，6，9，12，15，18，21-七氧雜二十二烷醇(10)(m＝4)油狀物；Rf 0.46(甲醇∶氯仿＝3∶22)；MS m/z C15H32O8的計算值為340.21(M++1)，實(shí)測值為341.2。
實(shí)施例43，6，9，12，15，18，21，24-八氧雜二十五烷醇(10)(m＝5)油狀物；Rf 0.43(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C17H36O9的計算值為384.24(M++1)，實(shí)測值為385.3。
實(shí)施例53，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧雜二十八醇(10)(m＝6)油狀物；Rf 0.42(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C19H40O10的計算值為428.26(M++1)，實(shí)測值為429.3。
實(shí)施例620-甲氧基-1-(甲磺?；?氧基-3，6，9，12，15，18-六氧雜二十烷(14)如9所述從醇13(m＝13)和甲磺酰氯以定量收率得到非多分散化合物14，為油狀物；Rf 0.4(乙酸乙酯∶乙腈＝1∶5)；MS m/z C17H37O10的計算值為433.21(M++1)，實(shí)測值為433.469。
實(shí)施例7乙二醇一甲醚(15)(m＝3，4，5)利用上述化合物10操作從二醇制備非多分散化合物15。
實(shí)施例83，6，9，12，15，18，21，24，27，30-十氧雜二十一醇(15)(m＝3)油狀物；Rf 0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C21H44O11的計算值為472.29(M++1)，實(shí)測值為472.29。
實(shí)施例93，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氧雜三十四醇(15)(m＝4)
油狀物；Rf 0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C23H48O12的計算值為516.31(M++1)，實(shí)測值為516.31。
實(shí)施例103，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36-十二氧雜三十七醇(15)(m＝5)油狀物；Rf 0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z C25H52O13的計算值為560.67(M++1)，實(shí)測值為560.67。
實(shí)施例11至18涉及圖3所述流程。
實(shí)施例11六甘醇一芐醚(16)將3.99g(100mmol)NaOH溶于4ml水，向非多分散六甘醇(28.175g，25ml，100mmol)加入該氫氧化鈉水溶液。加入芐基氯(3.9g，30.8mmol，3.54ml)，將反應(yīng)混合物加熱至100℃，攪拌18小時。然后將反應(yīng)混合物冷卻，用鹽水(250ml)稀釋，用二氯甲烷萃取(200ml×2)。合并有機(jī)層，用鹽水洗滌一次，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾，在真空中濃縮，得到暗褐色油。粗產(chǎn)物混合物經(jīng)由快速色譜純化(硅膠，梯度洗脫∶乙酸乙酯至9/1乙酸乙酯/甲醇)，得到8.099g(70％)非多分散的16，為黃色的油。
實(shí)施例12乙基6-甲磺酰氧基己酸酯(17)將非多分散乙基6-羥基己酸酯(50.76ml，50.41g，227mmol)的無水二氯甲烷(75ml)溶液在冰浴中冷卻，置于氮?dú)夥障?。加入三乙?34.43ml，24.99g，247mmol)。從加液漏斗滴加甲磺酰氯(19.15ml，28.3g，247mmol)的無水二氯甲烷(75ml)溶液。將混合物攪拌三個半小時，隨著冰浴融化，緩慢恢復(fù)至室溫。通過硅膠過濾混合物，濾液連續(xù)用水、飽和NaHCO3、水和鹽水洗滌。有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾，在真空中濃縮，得到淡黃色油。最后，粗產(chǎn)物經(jīng)過快速色譜純化(硅膠，1/1己烷/乙酸乙酯)，得到非多分散產(chǎn)物(46.13g，85％)，為澄清無色的油。FAB MSm/e 239(M+H)，193(M-C2H5O)。
實(shí)施例136-{2-[2-(2-{2-[2-(2-芐氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}己酸乙酯(18)
將氫化鈉(3.225g或60％油分散體，80.6mmol)懸浮在80ml無水甲苯中，置于氮?dú)夥障拢诒≈欣鋮s。向NaH懸液加入非多分散醇16(27.3g，73.3mmol)的80ml無水甲苯溶液。將混合物在0℃下攪拌30分鐘，使其恢復(fù)至室溫，攪拌另外54小時，在此期間混合物變?yōu)槌吻搴稚芤?。向NaH/醇混合物加入非多分散甲磺酸酯17(19.21g，80.6mmol)的80ml無水甲苯溶液，將合并了的溶液在室溫下攪拌3天。將反應(yīng)混合物用50ml甲醇猝滅，通過堿性氧化鋁過濾。在真空中濃縮濾液，經(jīng)過快速色譜純化(硅膠，梯度洗脫3/1乙酸乙酯/己烷至乙酸乙酯)，得到非多分散產(chǎn)物，為淡黃色油(16.52g，44％)。FAB MSm/e 515(M+H)。
實(shí)施例146-{2-[2-(2-{2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}己酸乙酯(19)將非多分散芐基醚18(1.03g，2.0mmol)溶于25ml乙醇。向該溶液加入270mg 10％Pd/C，將混合物置于氫氣氛下，攪拌4小時，此時TLC顯示原料完全消失。通過C鹽545過濾反應(yīng)混合物以除去催化劑，在真空中濃縮濾液，得到非多分散標(biāo)題化合物，為澄清的油(0.67g，79％)。FAB MSm/e 425(M+H)，447(M+Na)。
實(shí)施例156-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲磺酰基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}己酸乙酯(20)將非多分散醇19(0.835g，1.97mmol)溶于3.5ml無水二氯甲烷，置于氮?dú)夥障?。加入三乙?0.301ml，0.219g，2.16mmol)，將混合物在冰浴中冷卻。2分鐘后，加入甲磺酰氯(0.16ml，0.248g，2.16mmol)。將混合物在0℃下攪拌15分鐘，然后在室溫下攪拌2小時。通過硅膠過濾反應(yīng)混合物以除去氯化三乙銨，濾液連續(xù)用水、飽和NaHCO3、水和鹽水洗滌。有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾，在真空中濃縮。殘余物經(jīng)過柱色譜純化(硅膠，9/1乙酸乙酯/甲醇)，得到非多分散化合物20，為澄清的油(0.819g，83％)。FAB MSm/e 503(M+H)。
實(shí)施例166-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}己酸乙酯(21)
在N2下，將NaH(88mg 60％油分散體，2.2mmol)懸浮在無水甲苯(3ml)中，冷卻至0℃。加入非多分散二甘醇一甲醚(0.26ml，0.26g，2.2mmol)，后者已經(jīng)經(jīng)由甲苯共沸蒸餾干燥。使反應(yīng)混合物恢復(fù)至室溫，攪拌4小時，在此期間渾濁的灰色懸液變?yōu)槌吻宓狞S色，再變?yōu)楹稚＜尤爰谆撬狨?0(0.50g，1.0mmol)的2.5ml無水甲苯溶液。在室溫下攪拌過夜后，加入2ml甲醇猝滅反應(yīng)，通過硅膠過濾所得溶液。在真空中濃縮濾液，F(xiàn)AB MSm/e 499(M+H)，521(M+Na)。另外經(jīng)過制備型色譜純化(硅膠，19/3氯仿/甲醇)，得到非多分散產(chǎn)物，為澄清黃色的油(0.302g，57％)。FAB MSm/e 527(M+H)，549(M+Na)。
實(shí)施例176-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}己酸(22)將非多分散酯21(0.25g，0.46mmol)在0.71ml 1N NaOH中攪拌18小時。18小時后，在真空中濃縮混合物以除去醇，將殘余物溶于另外10ml水。將水溶液用2N HCl酸化至pH2，產(chǎn)物用二氯甲烷萃取(30ml×2)。合并有機(jī)相，用鹽水洗滌(25ml×2)，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾，在真空中濃縮，得到非多分散標(biāo)題化合物，為黃色的油(0.147g，62％)。FAB MSm/e 499(M+H)，521(M+Na)。
實(shí)施例186-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}己酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(23)將非多分散酸22(0.209g，0.42mmol)溶于4ml無水二氯甲烷，在N2氣氛下加入到已經(jīng)含有NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)(57.8mg，0.502mmol)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)(98.0mg，0.502mmol)的干燥燒瓶內(nèi)。將溶液在室溫下攪拌過夜，通過硅膠過濾以除去過量試劑和從EDC生成的脲。在真空中濃縮濾液，得到非多分散產(chǎn)物，為暗黃色油(0.235g，94％)。FAB MSm/e 596(M+H)，618(M+Na)。
實(shí)施例19至24涉及圖4所述流程。
實(shí)施例19三甘醇一甲醚的甲磺酸酯(24)向在冰浴中冷卻至0℃的CH2Cl2溶液(100ml)加入非多分散三甘醇一甲醚(25g，0.15mol)。然后加入三乙胺(29.5ml，0.22mol)，將溶液在0℃下攪拌15分鐘，然后滴加甲磺酰氯(13.8ml，0.18mol，溶于20ml CH2Cl2)。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30分鐘，使其溫?zé)嶂潦覝?，然后攪?小時。將粗反應(yīng)混合物通過C鹽過濾(用CH2Cl2～200ml洗滌)，然后用H2O(300ml)、5％NaHCO3(300ml)、H2O(300ml)、飽和NaCl(300ml)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，蒸發(fā)至干。然后將油置于真空管道上～2小時以確保干燥，得到非多分散標(biāo)題化合物，為黃色的油(29.15g，收率80％)。
實(shí)施例20七甘醇一甲醚(25)向非多分散四甘醇(51.5g，0.27mol)的THF(1L)溶液加入叔丁醇鉀(14.8g，0.13mol，歷經(jīng)～30分鐘分小批量加入)。然后將反應(yīng)混合物攪拌1小時，然后滴加24(29.15g，0.12mol)的THF(90ml)溶液，將反應(yīng)混合物攪拌過夜。將粗反應(yīng)混合物通過C鹽過濾(用CH2Cl2～200ml洗滌)，蒸發(fā)至干。然后將油溶于HCl(250ml，1N)，用乙酸乙酯(250ml)洗滌以除去過量的24。為了除去殘留的24可能需要另外的乙酸乙酯(125ml)洗滌。將含水相用CH2Cl2(125ml)反復(fù)洗滌，直至大多數(shù)25已經(jīng)從含水相中除去。第一萃取液將含有24、25和雙偶聯(lián)的副產(chǎn)物，應(yīng)當(dāng)用HCl(125ml，1N)反萃取。合并有機(jī)層，蒸發(fā)至干。然后將所得油溶于CH2Cl2(100ml)，用H2O(50ml)反復(fù)洗滌，直至除去25。合并含水部分，總體積為500ml，加入NaCl，直至溶液變?yōu)闇啙?，然后用CH2Cl2洗滌(2×500ml)。合并有機(jī)層，經(jīng)MgSO4干燥，蒸發(fā)至干，得到非多分散標(biāo)題化合物，為一種油(16.9g，收率41％)。為了確保高純度，可能需要重復(fù)一步或多步純化。
實(shí)施例218-溴辛酸酯(26)向8-溴辛酸(5.0g，22mmol)的乙醇(100ml)溶液加入H2SO4(0.36ml，7.5mmol)，將反應(yīng)物加熱至回流，攪拌3小時。將粗反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用H2O(100ml)、飽和NaHCO3(2×100ml)、H2O(100ml)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，蒸發(fā)至干，得到澄清的油(5.5g，收率98％)。
實(shí)施例22MPEG7-C8酯(27)的合成向非多分散化合物25(3.0g，8.8mmol)的乙醚(90ml)溶液加入叔丁醇鉀(1.2g，9.6mmol)，將反應(yīng)混合物攪拌1小時。然后滴加非多分散化合物26(2.4g，9.6mmol)的乙醚(10ml)溶液，將反應(yīng)混合物攪拌過夜。將粗反應(yīng)混合物通過C鹽過濾(用CH2Cl2～200ml洗滌)，蒸發(fā)至干。將所得油溶于乙酸乙酯，用H2O洗滌(2×200ml)，經(jīng)MgSO4干燥，蒸發(fā)至干。進(jìn)行柱色譜(二氧化硅，乙酸乙酯至乙酸乙酯/甲醇10∶1)，得到非多分散標(biāo)題化合物，為澄清的油(0.843g，收率19％)。
實(shí)施例23MPEG7-C8酸(28)向非多分散化合物27(0.70g，1.4mmol)的油加入1N NaOH(2.0ml)，將反應(yīng)混合物攪拌4小時。將粗反應(yīng)混合物濃縮，酸化(pH～2)，用NaCl飽和，用CH2Cl2洗滌(2×50ml)。合并有機(jī)層，用飽和NaCl洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，蒸發(fā)至干，得到非多分散標(biāo)題化合物，為澄清的油(0.35g，收率53％)。
實(shí)施例24MPEG7-C8酸的活化(29)將非多分散mPEG7-C8酸28(0.3g，0.64mmol)溶于3ml無水二氯甲烷，然后加入N-羥基琥珀酰亞胺(0.079g，0.69mmol)與EDCI.HCl(135.6mg，0.71mmol)的無水二氯甲烷溶液。將反應(yīng)物攪拌若干小時，然后用1N HCl、水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾，濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)過柱色譜純化，濃縮，得到非多分散標(biāo)題化合物，為澄清的油，經(jīng)由真空干燥。
實(shí)施例25至29涉及圖5所述流程。
實(shí)施例2510-羥基癸酸酯(30)向非多分散10-羥基癸酸(5.0g，26.5mmol)的乙醇(100ml)溶液加入H2SO4(0.43ml，8.8mmol)，將反應(yīng)物加熱至回流，攪拌3小時。將粗反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用H2O(100ml)、飽和NaHCO3(2×100ml)、H2O(100ml)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，蒸發(fā)至干，得到非多分散標(biāo)題化合物，為澄清的油(6.9g，收率98％)。
實(shí)施例2610-羥基癸酸酯甲磺酸酯(31)向CH2Cl2溶液(27ml)加入非多分散10-羥基癸酸酯30(5.6g，26mmol)，在冰浴中冷卻至0℃。然后加入三乙胺(5ml，37mmol)，將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌15分鐘。然后加入甲磺酰氯(2.7ml，24mmol)的CH2Cl2(3ml)溶液，將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30分鐘，除去冰浴，將反應(yīng)物在室溫下攪拌另外2小時。將粗反應(yīng)混合物通過C鹽過濾(用CH2Cl280ml洗滌)，將濾液用H2O(100ml)、5％NaHCO3(2×100ml)、H2O(100ml)、飽和NaCl(100ml)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，蒸發(fā)至干，得到非多分散標(biāo)題化合物，為淺黃色油(7.42g，收率97％)。
實(shí)施例27MPEG7-C10酯(32)向非多分散七甘醇一甲醚25(2.5g，7.3mmol)的四氫呋喃(100ml)溶液加入氫化鈉(0.194g，8.1mmol)，將反應(yīng)混合物攪拌1小時。然后滴加非多分散10-羥基癸酸酯甲磺酸酯31(2.4g，8.1mmol)的四氫呋喃(10ml)溶液，將反應(yīng)混合物攪拌過夜。將粗反應(yīng)混合物通過C鹽過濾(用CH2Cl2～200ml洗滌)，蒸發(fā)至干。將所得油溶于乙酸乙酯，用H2O洗滌(2×200ml)，經(jīng)MgSO4干燥，蒸發(fā)至干，經(jīng)過色譜純化(二氧化硅，乙酸乙酯/甲醇10∶1)和色譜純化(二氧化硅，乙酸乙酯)，得到非多分散標(biāo)題化合物，為澄清的油(0.570g，收率15％)。
實(shí)施例28MPEG7-C10酸(33)向非多分散mPEG7-C10酯32的油(0.570g，1.1mmol)加入1N NaOH(1.6ml)，將反應(yīng)混合物攪拌過夜。將粗反應(yīng)混合物濃縮，酸化(pH～2)，用NaCl飽和，用CH2Cl2洗滌(2×50ml)。合并有機(jī)層，用飽和NaCl洗滌(2×50ml)，經(jīng)MgSO4干燥，蒸發(fā)至干，得到非多分散標(biāo)題化合物，為澄清的油(0.340g，收率62％)。
實(shí)施例29MPEG7-C10酸(34)的活化利用與上面實(shí)施例24所述相似的操作活化非多分散酸33。
實(shí)施例30和31涉及圖6所述流程。
實(shí)施例30C18(PEG6)寡聚體(36)的合成向PEG6(5g，17.7mmol)與吡啶(0.97g，12.4mmol)在苯中的混合物緩慢加入非多分散硬脂酰氯35(0.7g，2.31mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌若干小時(～5)。然后進(jìn)行TLC，用乙酸乙酯/甲醇作為展開溶劑。然后將反應(yīng)混合物用水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，濃縮，經(jīng)由真空干燥。用FABMS分析經(jīng)過純化的非多分散化合物36m/e 549M+H。
實(shí)施例31C18(PEG6)寡聚體的活化非多分散C18(PEG6)寡聚體的活化是分兩步完成的1)將非多分散硬脂酰-PEG6 36(0.8g，1.46mmol)溶于甲苯，加入到用冰浴冷卻的光氣溶液中(10ml，20％甲苯溶液)。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌1小時，然后在室溫下攪拌3小時。然后蒸餾除去光氣和甲苯，剩余的非多分散硬脂酰PEG6氯甲酸酯37經(jīng)P2O5干燥過夜。
2)向非多分散硬脂酰PEG6氯甲酸酯36(0.78g，1.27mmol)與TEA(128mg，1.27mmol)的無水二氯甲烷溶液加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的二氯甲烷溶液。將反應(yīng)混合物攪拌16小時，然后用水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾，濃縮，經(jīng)由真空干燥，得到非多分散活化C18(PEG6)寡聚體38。
實(shí)施例32至37涉及圖7所述流程。
實(shí)施例32四甘醇一芐醚(39)向非多分散四甘醇的油(19.4g，0.10mol)加入NaOH溶液(4.0g，4.0ml)，將反應(yīng)物攪拌15分鐘。然后加入芐基氯(3.54ml，30.8mmol)，將反應(yīng)混合物加熱至100℃，攪拌過夜。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用飽和NaCl(250ml)稀釋，用CH2Cl2洗滌(2×200ml)。合并有機(jī)層，用飽和NaCl洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，經(jīng)過色譜純化(二氧化硅，乙酸乙酯)，得到非多分散標(biāo)題化合物，為黃色的油(6.21g，收率71％)。
實(shí)施例33四甘醇一芐醚甲磺酸酯(40)向CH2Cl2溶液(20ml)加入非多分散四甘醇一芐醚39(6.21g，22mmol)，在冰浴中冷卻至0℃。然后加入三乙胺(3.2ml，24mmol)，將反應(yīng)混合物在0℃攪拌15分鐘。然后加入甲磺酰氯(1.7ml，24mmol)的CH2Cl2(2ml)溶液，將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30分鐘，除去冰浴，將反應(yīng)物在室溫下攪拌另外2小時。將粗反應(yīng)混合物通過C鹽過濾(用CH2Cl280ml洗滌)，將濾液用H2O(100ml)、5％NaHCO3(2×100ml)、H2O(100ml)、飽和NaCl(100ml)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥。所得黃色的油在含有活性碳(10g)的二氧化硅墊上經(jīng)過色譜純化，得到非多分散標(biāo)題化合物，為澄清的油(7.10g，收率89％)。
實(shí)施例34八甘醇一芐醚(41)向含有氫化鈉(0.43g，18mmol)的四氫呋喃(140ml)溶液滴加非多分散四甘醇(3.5g，18mmol)的四氫呋喃(10ml)溶液，將反應(yīng)混合物攪拌1小時。然后滴加非多分散四甘醇一芐醚甲磺酸酯40(6.0g，16.5mmol)的四氫呋喃(10ml)溶液，將反應(yīng)混合物攪拌過夜。將粗反應(yīng)混合物通過C鹽過濾(用CH2Cl2250ml洗滌)，將濾液用H2O洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，蒸發(fā)至干。所得油經(jīng)過色譜純化(二氧化硅，乙酸乙酯/甲醇10∶1)和色譜純化(二氧化硅，氯仿/甲醇25∶1)，得到非多分散標(biāo)題化合物，為澄清的油(2.62g，收率34％)。
實(shí)施例35硬脂酸酯PEG8-芐基(43)的合成向攪拌著的冷卻的非多分散八甘醇一芐醚41(0.998g，2.07mmol)與吡啶(163.9mg，2.07mmol)溶液加入非多分散硬脂酰氯42(627.7mg，2.07mmol)的苯溶液。將反應(yīng)混合物攪拌過夜(18小時)。第二天，將反應(yīng)混合物用水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，濃縮，經(jīng)由真空干燥。粗產(chǎn)物然后經(jīng)過快速硅膠柱色譜純化，10％甲醇/90％氯仿洗脫。合并含有產(chǎn)物的部分，濃縮，經(jīng)由真空干燥，得到非多分散標(biāo)題化合物。
實(shí)施例36硬脂酸酯-PEG8-芐基的氫解向非多分散硬脂酸酯-PEG8-Bzl 43(0.854g，1.138mmol)的甲醇溶液加入Pd/C(10％)(10％wt披鈀活性碳)。將反應(yīng)混合物在氫下攪拌過夜(18小時)。然后將溶液過濾，濃縮，經(jīng)過快速柱色譜純化，用10％甲醇/90％氯仿洗脫，收集Rt＝0.6的部分，濃縮，干燥，得到非多分散酸44。
實(shí)施例37C18(PEG8)寡聚體的活化如上實(shí)施例31硬脂酸酯-PEG6所述進(jìn)行非多分散硬脂酸酯-PEG8寡聚體的兩步活化，得到非多分散活化C18(PEG8)寡聚體45。
實(shí)施例38活化三甘醇一甲基寡聚體的合成下列說明涉及圖8所述流程。將含有20％光氣的甲苯溶液(100ml，約18.7g，189mmol光氣)在N2氣氛下冷卻至0℃。將非多分散mTEG(三甘醇，一甲醚，7.8g，47.5mmol)溶于25ml無水乙酸乙酯，加入到冷卻的光氣溶液中。將混合物在0℃下攪拌1小時，然后使其溫?zé)嶂潦覝?，攪拌另外兩個半小時。經(jīng)由真空蒸餾除去殘留的光氣、乙酸乙酯和甲苯，得到非多分散mTEG氯甲酸酯46，為澄清的油狀殘余物。
將非多分散殘余物46溶于50ml無水二氯甲烷，向其中加入TEA(三乙胺，6.62ml，47.5mmol)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺，5.8g，50.4mmol)。將混合物在室溫干燥氣氛下攪拌20小時，在此期間有大量白色沉淀出現(xiàn)。過濾混合物以除去該沉淀，在真空中濃縮。將所得油47溶于二氯甲烷，用冷去離子水洗滌兩次，用1N HCl洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。有機(jī)相經(jīng)MgSO4干燥，過濾，濃縮，得到非多分散標(biāo)題化合物，為澄清的淺黃色油。如果必要的話，NHS酯可以進(jìn)一步經(jīng)過硅膠快速色譜純化，使用EtOAc作為洗脫劑。
實(shí)施例39活化棕櫚酸酯-TEG寡聚體的合成下列說明涉及圖9所述流程。將非多分散棕櫚酸酐(5g；10mmol)溶于無水THF(20ml)，在室溫下攪拌。向攪拌中的溶液加入3mol過量吡啶，然后加入非多分散三甘醇(1.4ml)。將反應(yīng)混合物攪拌1小時(用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程；乙酸乙酯-氨仿；3∶7)。反應(yīng)結(jié)束時，除去THF，將產(chǎn)物與10％H2SO4混合，用乙酸乙酯萃取(3×30ml)。合并萃取液，依次用水、鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，蒸發(fā)，得到非多分散產(chǎn)物48。向非多分散產(chǎn)物48(1mmol)的10ml無水DMF溶液加入N，N′-二琥珀酰亞氨基碳酸酯(3mmol)的DMF(～10ml)溶液，同時攪拌。向反應(yīng)混合物緩慢加入氫化鈉(3mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌若干小時(例如5小時)。加入二乙醚，使活化寡聚體沉淀。該過程重復(fù)3次，最后將產(chǎn)物干燥。
實(shí)施例40活化六甘醇一甲基寡聚體的合成下列說明涉及圖10所述流程。類似于上述實(shí)施例39非多分散三甘醇的方法制備非多分散活化六甘醇一甲醚。將20％光氣的甲苯溶液(35ml，6.66g，67.4mmol光氣)在N2氣氛下、在冰/鹽水浴中冷卻。將非多分散六甘醇50(1.85ml，2.0g，6.74mmol)溶于5ml無水EtOAc，經(jīng)由注射器加入到光氣溶液中。將反應(yīng)混合物在冰浴中持續(xù)攪拌1小時，除去冰浴，在室溫下攪拌另外2.5小時。通過真空蒸餾除去光氣、EtOAc和甲苯，得到非多分散化合物51，為澄清的油狀殘余物。
將非多分散殘余物51溶于20ml無水二氯甲烷，置于干燥的惰性氣氛下。加入三乙胺(0.94ml，0.68g，6.7mmol)，然后加入NHS(N-羥基琥珀酰亞胺，0.82g，7.1mmol)，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時。將混合物通過硅膠過濾以除去白色沉淀，在真空中濃縮。將殘余物溶于二氯甲烷，用冷水洗滌兩次，用1N HCl洗滌一次，用鹽水洗滌一次。有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾，濃縮。經(jīng)由快速色譜(硅膠，EtOAc)進(jìn)行最后的純化，得到UV活性非多分散NHS酯52。
實(shí)施例41將150mg鮭魚降鈣素(MW 3432，0.043mmol)溶于30ml無水DMF。然后加入TEA(35μl)與實(shí)施例24活化寡聚體(42mg，0.067mmol)的無水THF(2ml)溶液。將反應(yīng)物攪拌1小時，然后用2ml 0.1％TFA水溶液猝滅。用HPLC監(jiān)測反應(yīng)。然后將反應(yīng)混合物濃縮，經(jīng)過制備型HPLC純化(RC Vydac C18蛋白質(zhì)和肽，1×25柱，含0.1％TFA的水/乙腈，檢測波長280nm)。解析到兩個峰，相當(dāng)于單-與二-共軛物。用MALDI-MS分析樣本。關(guān)于PEG7-辛基-sCT單共軛物的MS3897。關(guān)于PEG7-辛基-sCT二共軛物的MS4361。
實(shí)施例42利用實(shí)施例41的操作使鮭魚降鈣素與實(shí)施例29活化寡聚體共軛。關(guān)于PEG7-癸基-sCT單共軛物的MS3926。關(guān)于PEG7-癸基-sCT二共軛物的MS4420。
實(shí)施例43利用實(shí)施例41的操作使鮭魚降鈣素與實(shí)施例31活化寡聚體共軛。關(guān)于硬脂酸酯-PEG6-sCT單共軛物的MS4006。關(guān)于硬脂酸酯-PEG6-sCT一共軛物的MS4582。
實(shí)施例44利用實(shí)施例41的操作使鮭魚降鈣素與實(shí)施例37活化寡聚體共軛。關(guān)于硬脂酸酯-PEG8-sCT單共軛物的MS4095。
實(shí)施例45利用實(shí)施例41的操作使鮭魚降鈣素與實(shí)施例18活化寡聚體共軛。
實(shí)施例46利用實(shí)施例41的操作使鮭魚降鈣素與實(shí)施例38活化寡聚體共軛。
實(shí)施例47利用實(shí)施例41的操作使鮭魚降鈣素與實(shí)施例39活化寡聚體共軛。
實(shí)施例48利用實(shí)施例41的操作使鮭魚降鈣素與實(shí)施例40活化寡聚體共軛。
實(shí)施例49鮭魚降鈣素-寡聚體共軛物混合物的分散系數(shù)測定鮭魚降鈣素-寡聚體共軛物混合物的分散系數(shù)是如下測定的。制得鮭魚降鈣素-寡聚體共軛物混合物，例如上面實(shí)施例41所述。經(jīng)由HPLC純化第一份混合物樣本，以分離和離析樣本中的各種鮭魚降鈣素-寡聚體共軛物。假定每一所離析的部分含有共軛物的純粹單分散混合物，“n”等于所收集的部分?jǐn)?shù)。混合物可以包括一種或多種下列共軛物，通過規(guī)定共軛位置繼之以共軛程度加以描述Lys11單共軛物；Lys18單共軛物；N-末端單共軛物；Lys11，18二共軛物；Lys11，N-末端二共軛物；Lys18，N-末端二共軛物；和/或Lys11，18，N-末端三共軛物。經(jīng)由質(zhì)譜法分析混合物每一所離析的部分，以測定該部分的質(zhì)量，這可以將每一所離析的部分分為單-、二-或三-共軛物，并且為樣本中每一共軛物的變量“Mi”賦值。
經(jīng)由HPLC分析第二份混合物樣本，以提供HPLC痕量。假定摩爾吸收性不因共軛作用而改變，混合物中特定共軛物的重量百分比是由對應(yīng)于特定共軛物的HPLC痕量的峰下面積占所有HPLC痕量峰下總面積的百分比所提供的。收集樣本，冷凍干燥，測定樣本的無水重量克數(shù)。樣本的重量克數(shù)乘以樣本中每一組分的重量百分比，以測定樣本中每一共軛物的重量克數(shù)。特定共軛物(第i個共軛物)的變量“Ni”是這樣測定的，樣本中特定共軛物的重量克數(shù)除以特定共軛物的質(zhì)量，商再乘以阿弗伽德羅常數(shù)(6.02205×1023mol-1)、如上測定的Mi，得到樣本中特定共軛物的分子數(shù)Ni。然后利用n、根據(jù)每一共軛物所測定的Mi和根據(jù)每一共軛物所測定的Ni計算分散系數(shù)。
實(shí)施例50細(xì)胞傳感器研究將T-47D細(xì)胞(輸乳管癌細(xì)胞系，得自美國典型菌種保藏中心)按1×107細(xì)胞/ml的密度懸浮在工作緩沖液中(低緩沖的、無血清的、無碳酸氫鹽的RPMI 1640培養(yǎng)基，來自Molecular Devices ofSunnyvale，California)。然后將大約100,000個細(xì)胞固定在瓊脂糖細(xì)胞包埋培養(yǎng)基中，呈10μl小滴，在細(xì)胞傳感器套杯中夾在兩個3μm聚碳酸酯膜之間。細(xì)胞傳感器套杯置于細(xì)胞傳感器微量生理儀上的傳感腔內(nèi)，再固定在非常靠近pH敏感性檢測器處。然后泵入工作緩沖液穿過細(xì)胞，速率100μl/min，不過有30秒間隔，此時停止流動，測量傳感腔內(nèi)工作緩沖液的酸化作用。每2分鐘測定酸化率。傳感腔的溫度為37℃。在實(shí)驗(yàn)開始之間使細(xì)胞在傳感腔內(nèi)平衡2-3小時，在此期間監(jiān)測基礎(chǔ)酸化率。然后使細(xì)胞暴露于按不同nM濃度稀釋在工作緩沖液中的供試化合物(鮭魚降鈣素或辛基-二降鈣素)。細(xì)胞暴露于供試化合物發(fā)生在每次2分鐘泵入周期的前40秒，該周期重復(fù)進(jìn)行總計20分鐘。這使細(xì)胞充分暴露于供試化合物，引發(fā)細(xì)胞代謝中的受體介導(dǎo)反應(yīng)，然后流過不含化合物的工作緩沖液達(dá)約50秒。該操作在測量酸化率之前清洗除去傳感腔內(nèi)的供試溶液(它已具有略低于單獨(dú)工作緩沖液的pH)。因而，酸化率僅僅是細(xì)胞活性的量度。利用相似的操作得到關(guān)于PEG7-辛基-sCT，單共軛物(辛基-Mono)；PEG7-癸基-sCT，單共軛物(癸基-Mono)；PEG7-癸基-sCT，二共軛物(癸基-Di)；硬脂酸酯-PEG6sCT，單共軛物(PEG6 St.Mono)；和硬脂酸酯-PEGS-sCT，單共軛物(PEG8 St.Mono)的數(shù)據(jù)。就這些數(shù)據(jù)分析化合物的相對活性，計算每一細(xì)胞傳感器腔酸化率圖的曲線下面積(AUC)，作成圖14所述條形圖，顯示在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，由此測量平均AUC。
實(shí)施例51酶穩(wěn)定性將化合物的凍干粉末重新懸浮在10mM磷酸鹽緩沖液pH 7.4中，然后借助HPLC進(jìn)行濃度測定。磷酸鹽緩沖液用于生成這樣一種溶液，其pH對每一特定腸酶的活性而言是最佳的。將如此制備的化合物試樣轉(zhuǎn)移至1.7ml微量離心管內(nèi)，在37℃水浴中搖動15分鐘，使化合物與溫度平衡。15分鐘后，向每支試管加入2μl適當(dāng)濃縮的腸酶，以達(dá)到所需的最終濃度。將胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶重新懸浮在1mM HCl中。而且，作為對照，將化合物用2μl 1mM HCl處理。加入后立即從對照管中取出100μl樣本，用25μl胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶猝滅溶液(1∶1 1％TFA∶異丙醇)猝滅。該樣本將充當(dāng)T＝0分鐘。在不同的時間間隔重復(fù)取樣操作，這取決于所用的腸酶。胰凝乳蛋白酶具有15、30和60分鐘的樣本。胰蛋白酶具有30、60、120和180分鐘的樣本。一旦已經(jīng)獲得所有時間點(diǎn)的樣本，從對照管中取出最后一份樣本，以確定所觀察的降解作用與溫度或緩沖液無關(guān)。胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶樣本可以被直接收集到HPLC小瓶內(nèi)。利用RP-HPLC(乙腈梯度)測定每份樣本的AUC，基于T＝0分鐘對照計算％降解作用。下表1至4提供了結(jié)果。
表10.5U/ml胰凝乳蛋白酶消化后，PEG7-辛基-鮭魚降鈣素二共軛物的殘留％
表20.5U/ml胰凝乳蛋白酶消化后，鮭魚降鈣素的殘留％(僅供對比，不是本發(fā)明的一部分)
表31U/ml胰蛋白酶消化后，PEG7-辛基-鮭魚降鈣素二共軛物的殘留％
表41U/ml胰蛋白酶消化后，鮭魚降鈣素的殘留％(僅供對比，不是本發(fā)明的一部分)
實(shí)施例52活性和個體間差異將體重20-25g的雄性CF-1小鼠(Charles River，Raleigh，NC)籠養(yǎng)在Nobex動物園中，控制房間的光照(L∶D周期為12∶12，早6時開始光照)、溫度(21-23℃)和濕度(40-60％相對濕度)。允許動物自由獲取實(shí)驗(yàn)室飼料(PMI Nutrition)和自來水。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天之前，使小鼠適應(yīng)籠養(yǎng)條件達(dá)48-72小時。
給藥之前，使小鼠禁食過夜，可隨意飲水。將小鼠隨機(jī)分組，每一時間點(diǎn)五只，給以單一口服劑量的根據(jù)本發(fā)明的PEG7-辛基-sCT二共軛物(辛基-Di)或供對比的鮭魚降鈣素(sCT或降鈣素)?？诜┝渴抢霉茱曖橆^(Popper#18，從插孔至斜面5cm)給藥的，劑量為10ml/kg的下列0.2μg/ml磷酸鹽緩沖的PEG7-辛基-sCT二共軛物制劑
緩沖制劑是這樣制備的，在清潔的涂以焦油的玻璃燒杯內(nèi)加入80ml磷酸鹽緩沖液。向磷酸鹽緩沖液緩慢加入膽酸鈉，同時攪拌，直至溶解。然后加入脫氧膽酸鹽，繼續(xù)攪拌，直至溶解。加入相當(dāng)于20μg的PEG7-辛基-sCT二共軛物溶液。最后，加入其余磷酸鹽緩沖液，達(dá)到100g的最終重量。在全部實(shí)驗(yàn)中使用載體對照小鼠。利用藥物給藥后的單一時間點(diǎn)60分鐘構(gòu)造劑量-響應(yīng)曲線。這些曲線如圖15-18所述。
在適當(dāng)?shù)臅r間點(diǎn)，將小鼠用乙醚麻醉，使腔靜脈外置，經(jīng)由裝有25度量針頭的注射器獲得血樣。使血樣在22℃下凝固1小時，除去血清，吸移至清潔的容器內(nèi)。利用經(jīng)過校準(zhǔn)的Vitros DT60II分析儀測定每只動物的總血清鈣。
將血清鈣數(shù)據(jù)作圖，利用SigmaPlot軟件(4.1版)經(jīng)由曲線適配技術(shù)測定藥動學(xué)參數(shù)。計算平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差(或標(biāo)準(zhǔn)誤差)，作圖，以測定給藥組之間的效應(yīng)差異。下表5提供了各種共軛物的平均血清鈣數(shù)據(jù)。
表5
盡管如上實(shí)施例50所測定的體外活性可能不與PEG7-辛基-sCT與PEG7-癸基-sCT單-與二-共軛物、硬脂酸酯-PEG6-sCT二共軛物和硬脂酸酯-PEG8-sCT二共軛物相當(dāng)，不過體內(nèi)活性似乎與PEG7-辛基-sCT與PEG7-癸基-sCT單-與二-共軛物的體內(nèi)活性相當(dāng)(得到上表5中基線鈣下降％的證明)。盡管不希望局限于特定的理論，不過含有硬脂酸酯的共軛物提高了的體內(nèi)活性可能表明這些共軛物經(jīng)歷體內(nèi)水解作用，得到活性鮭魚降鈣素或活性鮭魚降鈣素-PEG共軛物。
本說明書已經(jīng)公開了本發(fā)明的典型優(yōu)選實(shí)施方式，盡管采用了專用術(shù)語，不過它們僅僅是在一般性的和說明性的意義上使用的，而不是限制性的，發(fā)明的范圍是由下列權(quán)利要求所闡明的。
權(quán)利要求
1.共軛物的基本單分散混合物，每一共軛物包含與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞單位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞單位。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞單位。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該共軛物混合物是單分散混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該共軛物混合物是基本純粹單分散混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該共軛物混合物是純粹單分散混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該混合物具有降低血清鈣水平達(dá)至少5％的能力。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中與沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性相比，該混合物具有增加了的對胰凝乳蛋白酶降解作用的抗性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該混合物具有比沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效更大的生物功效。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該降鈣素藥物是鮭魚降鈣素。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的混合物，其中該寡聚體是與該鮭魚降鈣素的胺官能共價偶聯(lián)的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的混合物，其中該胺官能位于該鮭魚降鈣素的Lys11或Lys18。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的混合物，其中該共軛物包含第一寡聚體和第二寡聚體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的混合物，其中該第一寡聚體是與該鮭魚降鈣素的Lys11共價偶聯(lián)的，該第二寡聚體是與該鮭魚降鈣素的Lys18共價偶聯(lián)的。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該降鈣素藥物是與該寡聚體共價偶聯(lián)的。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該降鈣素藥物是通過可水解的鍵與該寡聚體共價偶聯(lián)的。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該降鈣素藥物是與該寡聚體的聚乙二醇部分共價偶聯(lián)的。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該寡聚體進(jìn)一步包含親脂性部分。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的混合物，其中該降鈣素藥物是與該親脂性部分共價偶聯(lián)的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的混合物，其中該聚乙二醇部分是與該親脂性部分共價偶聯(lián)的。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該共軛物包含大量寡聚體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的混合物，其中該大量寡聚體中每一寡聚體具有相同的分子結(jié)構(gòu)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其中該寡聚體包含通過不可水解的鍵與該降鈣素藥物共價偶聯(lián)的第一聚乙二醇部分和通過可水解的鍵與該第一聚乙二醇部分共價偶聯(lián)的第二聚乙二醇部分。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的單分散混合物，其中該寡聚體進(jìn)一步包含與該第二聚乙二醇部分共價偶聯(lián)的親脂性部分。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的單分散混合物，其中該共軛物是各自兩親性平衡的，以便每一共軛物都是水溶性的，并且能夠穿透生物膜。
27.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1的混合物；和藥學(xué)上可接受的載體。
28.共軛物的基本單分散混合物，各自包含鮭魚降鈣素，在該鮭魚降鈣素的Lys11與羧酸的羧酸部分共價偶聯(lián)，該羧酸在該羧酸部分的遠(yuǎn)端與終止于甲基的聚乙二醇部分共價偶聯(lián)，該聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞單位，并且在該鮭魚降鈣素的Lys18與羧酸的羧酸部分共價偶聯(lián)，該羧酸在該羧酸部分的遠(yuǎn)端與終止于甲基的聚乙二醇部分共價偶聯(lián)，該聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞單位。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的混合物，其中該共軛物各自由鮭魚降鈣素組成，在該鮭魚降鈣素的Lys11與辛酸的羧酸部分共價偶聯(lián)，該辛酸在該羧酸部分的遠(yuǎn)端與終止于甲基的聚乙二醇部分共價偶聯(lián)，該聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞單位，并且在該鮭魚降鈣素的Lys18與辛酸的羧酸部分共價偶聯(lián)，該辛酸在該羧酸部分的遠(yuǎn)端與終止于甲基的聚乙二醇部分共價偶聯(lián)，該聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞單位。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的混合物，其中該混合物是單分散混合物。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的混合物，其中該混合物是基本純粹單分散混合物。
32.根據(jù)權(quán)利要求28的混合物，其中該混合物是純粹單分散混合物。
33.治療需要這類治療的個體骨障礙的方法，所述方法包含向該個體給以有效量的共軛物的基本單分散混合物以治療該骨障礙，該共軛物各自包含與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中該骨障礙是以過量破骨性骨吸收或血鈣過多性血清效應(yīng)為特征的。
35.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中該骨障礙是骨質(zhì)疏松、佩吉特氏病或高鈣血癥。
36.共軛物的基本單分散混合物，每一共軛物包含與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，所述混合物能夠降低個體血清鈣水平達(dá)至少5％。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的混合物，其中該混合物能夠降低個體血清鈣水平達(dá)至少10％。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的混合物，其中該混合物能夠降低個體血清鈣水平達(dá)至少20％。
39.根據(jù)權(quán)利要求36的混合物，與沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物對胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶降解作用的抗性相比，進(jìn)一步具有增加了的對胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶降解作用的抗性。
40.根據(jù)權(quán)利要求36的混合物，進(jìn)一步具有比沒有與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的生物功效更高的生物功效。
41.共軛物的混合物，每一共軛物包含與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，該寡聚體包含具有至少4個聚乙二醇亞單位的聚乙二醇部分，所述混合物具有標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約22道爾頓的分子量分布。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的共軛物混合物，其中該分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約14道爾頓。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的共軛物混合物，其中該分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于約11道爾頓。
44.根據(jù)權(quán)利要求41的共軛物混合物，其中該混合物中每一共軛物包含在Lys11與第一寡聚體偶聯(lián)且在Lys18與第二寡聚體偶聯(lián)的鮭魚降鈣素，其中該第一寡聚體和第二寡聚體具有下式
45.根據(jù)權(quán)利要求41的共軛物混合物，其中該混合物中每一共軛物包含在Lys11與第一寡聚體偶聯(lián)且在Lys18與第二寡聚體偶聯(lián)的鮭魚降鈣素，其中該第一寡聚體和第二寡聚體具有下式
46.根據(jù)權(quán)利要求41的共軛物混合物，其中該混合物中每一共軛物包含在Lys11或Lys18與具有下式的寡聚體偶聯(lián)的鮭魚降鈣素
47.共軛物的混合物，該共軛物各自包含與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，其中該混合物具有大于10,000的分散系數(shù)，其中 其中n是樣本中不同分子的數(shù)量；Ni是樣本中第i個分子的數(shù)量；Mi是樣本中第i個分子的質(zhì)量。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的共軛物混合物，其中該分散系數(shù)大于100,000。
49.根據(jù)權(quán)利要求47的共軛物混合物，其中該分散系數(shù)大于500,000。
50.根據(jù)權(quán)利要求47的共軛物混合物，其中該混合物中每一共軛物包含在Lys11與第一寡聚體偶聯(lián)且在Lys18與第二寡聚體偶聯(lián)的鮭魚降鈣素，其中該第一寡聚體和第二寡聚體具有下式
51.根據(jù)權(quán)利要求47的共軛物混合物，其中該混合物中每一共軛物包含在Lys11與第一寡聚體偶聯(lián)且在Lys18與第二寡聚體偶聯(lián)的鮭魚降鈣素，其中該第一寡聚體和第二寡聚體具有下式
52.根據(jù)權(quán)利要求41的共軛物混合物，其中該混合物中每一共軛物包含在Lys11或Lys18與具有下式的寡聚體偶聯(lián)的鮭魚降鈣素
53.共軛物的混合物，其中每一共軛物包含與寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，并且具有相同的聚乙二醇亞單位數(shù)。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的共軛物混合物，其中該混合物中每一共軛物包含在Lys11與第一寡聚體偶聯(lián)且在Lys18與第二寡聚體偶聯(lián)的鮭魚降鈣素，其中該第一寡聚體和第二寡聚體具有下式
55.根據(jù)權(quán)利要求53的共軛物混合物，其中該混合物中每一共軛物包含在Lys11與第一寡聚體偶聯(lián)且在Lys18與第二寡聚體偶聯(lián)的鮭魚降鈣素，其中該第一寡聚體和第二寡聚體具有下式
56.根據(jù)權(quán)利要求53的共軛物混合物，其中該混合物中每一共軛物包含在Lys11或Lys18與具有下式的寡聚體偶聯(lián)的鮭魚降鈣素
57.共軛物的混合物，其中每一共軛物具有相同的分子量，并且具有下式結(jié)構(gòu)降鈣素藥物-[-B-Lj-Gk-R-G′m-R′-G″n-T]p(A)其中B是鍵合部分；L是連接基團(tuán)；G、G′和G″是各自選擇的間隔基團(tuán)；R是親脂性基團(tuán)，且R′是聚亞烷基二醇基團(tuán)，或者R′是親脂性基團(tuán)，且R是聚亞烷基氧基團(tuán)；T是終止基團(tuán)；j、k、m和n各自是0或1；p是1至降鈣素藥物上親核殘基數(shù)的整數(shù)。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的共軛物混合物，其中該聚亞烷基二醇部分是聚乙二醇部分。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的共軛物混合物，其中該聚乙二醇部分具有至少2、3或4個聚乙二醇亞單位。
60.根據(jù)權(quán)利要求58的共軛物混合物，其中該聚乙二醇部分具有至少5或6個聚乙二醇亞單位。
61.根據(jù)權(quán)利要求58的共軛物混合物，其中該聚乙二醇部分具有至少7個聚乙二醇亞單位。
62.根據(jù)權(quán)利要求57的共軛物混合物，其中R是烷基或亞烷基；R’是聚乙二醇部分，具有至少6個聚乙二醇亞單位；T是烷基或烷氧基；j是1；k、m和n是0。
63.根據(jù)權(quán)利要求57的共軛物混合物，其中B是羰基；R是C7-C16亞烷基；R’是聚乙二醇部分，具有6至8個聚乙二醇亞單位；T是甲基或甲氧基；k、m和n是0。
64.合成共軛物的基本單分散混合物的方法，每一共軛物包含與包含聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物，所述方法包含使包含具有式I結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散混合物R1(OC2H4)m-O-X+(I)其中R1是H或親脂性部分；m是1至25；X+是陽離子，與包含具有式II結(jié)構(gòu)的化合物的基本分散混合物R2(OC2H4)n-OMs (II)其中W是H或親脂性部分；n是1至25，在足以提供包含具有式III結(jié)構(gòu)的聚合物的基本單分散混合物的條件下反應(yīng)，R2(OC2H4)m+n-OMs (III)活化包含式III聚合物的基本單分散混合物，得到能夠與降鈣素藥物反應(yīng)的活化聚合物的基本單分散混合物；使該活化聚合物的單分散混合物與降鈣素藥物的基本單分散混合物在足以提供各自包含與包含具有m+n個亞單位的聚乙二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物的共軛物的基本單分散混合物的條件下反應(yīng)。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中R2是脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中該脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯包含至少5個碳原子長度的烷基部分。
67.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中R1是甲基。
68.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，進(jìn)一步包含使包含具有式V結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散混合物R2(OC2H4)n-OH(V)與甲磺酰鹵在足以提供包含具有式II結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散混合物的條件下反應(yīng)，R2(OC2H4)n-OMs (II)。
69.根據(jù)權(quán)利要求68的方法，進(jìn)一步包含使包含具有式VI結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散混合物R2-OMs (VI)其中R2是親脂性部分，與包含具有式VII結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散混合物R3(OC2H4)m-O-X2+(VII)其中R3是芐基、三苯甲基或THP；X2+是陽離子，在足以提供包含具有式VIII結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散混合物的條件下反應(yīng)，R3(OC2H4)m-OR2(VIII)；使包含具有式VIII結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散混合物在足以提供包含具有式V結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散混合物的條件下反應(yīng)，R2(OC2H4)m-OH (V)。
70.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，進(jìn)一步包含使包含具有式IV結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散混合物R1(OC2H4)n-OH (IV)在足以提供包含具有式I結(jié)構(gòu)的化合物的基本單分散混合物的條件下反應(yīng)，R1(OC2H4)n-O-X+(I)。
71.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中該基本單分散混合物的活化包含使式III聚合物的基本單分散混合物與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，得到能夠與降鈣素藥物反應(yīng)的活化聚合物。
72.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中該降鈣素藥物是鮭魚降鈣素，其中該活化聚合物的基本單分散混合物與鮭魚降鈣素的基本單分散混合物的反應(yīng)包含使該活化聚合物的基本單分散混合物與該鮭魚降鈣素的Lys11和Lys18反應(yīng)，得到二共軛物的基本單分散混合物，該二共軛物各自包含與兩個寡聚體偶聯(lián)的鮭魚降鈣素，該寡聚體各自包含具有m+n個亞單位的聚乙二醇部分。
全文摘要
公開了共軛物的混合物，其中混合物中每一共軛物包含與包括聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶聯(lián)的降鈣素藥物?；旌衔锟梢越档蛡€體血清鈣水平達(dá)10、15或20％或以上。而且，混合物可以比非共軛的降鈣素更加有效地在體外腸消化模型中存活。此外，混合物可以比非共軛的降鈣素表現(xiàn)更高的生物利用度。
文檔編號A61P19/08GK1538851SQ02815302
公開日2004年10月20日 申請日期2002年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月4日
發(fā)明者N·N·?？藶趵镓? C·H·普里斯, A·M·安薩里, A·L·奧登保, N N 埃克烏里貝, 奧登保, 安薩里, 普里斯 申請人:諾貝克斯公司