專利名稱：經(jīng)修飾的fvii用于治療ards的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的FVII用于制備治療急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的藥物的用途，還涉及治療ALI和ARDS的方法。本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾的FVII用于制備預(yù)防或最小化與ALI或ARDS相關(guān)的慢性器官衰竭，以及預(yù)防或最小化所述慢性器官衰竭的藥物的用途。
背景技術(shù)：
急性呼吸窘迫綜合征(“ARDS”)是在例如創(chuàng)傷患者體內(nèi)產(chǎn)生的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)現(xiàn)象。該綜合征是急性病癥，其特征在于全身性炎癥介質(zhì)釋放和內(nèi)皮細胞的普遍活化，最終導(dǎo)致多器官功能異常綜合征。感染性損傷(如膿毒病)以及非-感染性病因(如創(chuàng)傷和組織損傷)可產(chǎn)生SIRS并表現(xiàn)出ARDS。ARDS被描述為“炎癥和增加的透性的綜合征，所述透性增加與臨床、放射學(xué)和生理學(xué)異常的相互影響因素相關(guān)”(Am-European Consensusfrom 1994)。它作為急性疾病或損傷，如膿毒病、肺炎、吸入、局部缺血(循環(huán)停止、出血性休克)、創(chuàng)傷等的并發(fā)癥出現(xiàn)。在ARDS患者體內(nèi)，肺的微管、間質(zhì)和肺泡間隙是血纖蛋白沉積的主要目標。這主要是因為肺的表面積大(70m2)，以及接受全部心輸出量的肺毛細管位置所致。然而，在多個器官(其中肺和腎是暴露最多的器官)中出現(xiàn)破壞微血栓形成的現(xiàn)象，這可導(dǎo)致產(chǎn)生多器官衰竭(MOF)。另外，炎癥反應(yīng)也可導(dǎo)致血漿蛋白質(zhì)從血管滲漏到肺泡間隙中，導(dǎo)致肺水腫。
ARDS的特點是透性水腫的結(jié)果導(dǎo)致血氧合和呼吸系統(tǒng)依從的狀況變糟。而多個不同的損傷可導(dǎo)致ARDS，共有的途徑可能會導(dǎo)致肺損傷和/或衰竭，肺內(nèi)白細胞活化以及氧自由基、rachidonic acid代謝物和炎癥介質(zhì)，如白細胞介素-1、蛋白酶和腫瘤壞死因子的釋放導(dǎo)致肺泡-毛細管膜透性增加。隨著該大分子屏障的喪失，肺泡中充滿血清蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)會損害肺表面活性劑的功能(Said等，J.Clin.Invest.44458-464；Holm等，J.Appl.Physiol.631434-1442，1987)。這會產(chǎn)生靜水力，使病情進一步惡化(Jefferies等，J.Appl.Physiol.645620-5628，1988)，導(dǎo)致肺泡水腫和相伴隨的氣體交換和肺順應(yīng)性狀況變糟。
ARDS影響醫(yī)療和手術(shù)患者。綜合征經(jīng)常是漸進性的，其特征在于不同的階段有不同的臨床、組織病理學(xué)和放射學(xué)表現(xiàn)。急性或滲出期表現(xiàn)為具備疾病風(fēng)險因子的患者呼吸衰竭的快速發(fā)作。對補氧療法無反應(yīng)的動脈血氧過少是其特征性的特征。放射學(xué)研究結(jié)果與心原性肺水腫的沒有區(qū)別。兩側(cè)浸潤可以是斑狀或不對稱的，并可包括胸膜滲漏。肺泡充滿、實變和肺膨脹不全主要出現(xiàn)在從屬的肺區(qū)域，相對而言很少會出現(xiàn)在其它區(qū)域。然而，盡管很少會出現(xiàn)上述癥狀，非從屬區(qū)域仍會有大量炎癥。病理學(xué)研究結(jié)果包括擴散的肺泡損害，肺泡間隙中有嗜中性白細胞、巨噬細胞、紅細胞透明膜和富含蛋白質(zhì)的水腫液，毛細管損傷和肺泡上皮被破壞。
盡管對某些患者而言，急性期過后，急性肺損傷和ARDS會完全消退，但對另一些患者而言，會發(fā)展為纖維化肺泡炎，伴隨著持續(xù)性血氧過少，肺泡中不起作用的間隙增加，肺泡或肺順應(yīng)性進一步降低。因肺-毛細管床閉塞而造成的肺高血壓可以是嚴重的并導(dǎo)致右室衰竭。在大多數(shù)戰(zhàn)勝ARDS的患者中，盡管病癥給肺造成了嚴重損傷，但肺功能在6至12個月內(nèi)會恢復(fù)至接近正常水平。肺力學(xué)的殘留損傷包括一氧化碳擴散能力的輕微受限、梗阻、受損，或鍛煉時的氣體-交換異常，但這些異常通常是無癥狀的。嚴重疾病和延長的機械換氣鑒定出肺功能持續(xù)異常風(fēng)險最高的患者。從此疾病中存活的患者與健康相關(guān)的生活質(zhì)量降低，與肺病特異性健康相關(guān)的生活質(zhì)量降低。
據(jù)大多數(shù)對ALI和ARDS的研究報道，死亡率為40-60％。大多數(shù)死亡是膿毒病或多器官功能異常而不是原發(fā)性呼吸病因所致，但最近換氣(一次呼吸進肺內(nèi)的空氣量低)治療的成功表明在某些情況下，死亡與肺損傷直接相關(guān)。
1988年，有人提出擴展綜合征的定義，即通過使用四-點肺-損傷評分體系定量生理呼吸損傷，所述體系基于正的和呼氣的壓力水平、動脈氧與吸入氧的分壓之比率、靜態(tài)肺順應(yīng)性、和胸部放射照片上浸潤事件的水平。評估中包括的其它因素是刺激性臨床疾病和非肺器官功能異常的存在或缺乏。1994年，American-European Consensus Conference Committee推薦了一種新的定義首先認為臨床肺損傷的嚴重程度有所不同血氧過少不太嚴重(由動脈氧與吸入氧的分壓之比率為300或更低來限定)的患者被認為患有ALI，血氧過少更嚴重(所述比率為200或更低)的患者被認為患有ARDS。第二，該定義可簡單地用于臨床背景。1994年取得一致的定義和1988年肺-損傷評分體系被廣泛接受，這改善了臨床研究和試驗的標準化。
結(jié)果，急性肺損傷(ALI)由下列標準定義(Bernard等，Am.J.Respir.Crit.Care Med 149818-24，1994)-急性發(fā)作-胸部放射照片上呈現(xiàn)兩側(cè)浸潤-肺-動脈契壓≤18mmHg或缺乏左前房高血壓的臨床證據(jù)-PaO2∶FiO2≤300ARDS由下列標準定義(Bernard等，Am.J.Respir.Crit.Care Med 149818-24，1994)-急性發(fā)作-胸部放射照片上呈現(xiàn)兩側(cè)浸潤-肺-動脈契壓≤18mmHg或缺乏左前房高血壓的臨床證據(jù)-PaO2∶FiO2≤200(PaO2表示動脈氧分壓，F(xiàn)iO2表示吸入氧分壓)與肺直接損傷有關(guān)的臨床疾病以及在形成全身性疾病狀態(tài)時導(dǎo)致間接肺損傷的疾病(見表A)可引起ARDS表A 與ARDS的發(fā)展有關(guān)的臨床疾病

總的來說，膿毒病最有可能發(fā)展為ARDS，其風(fēng)險約為40％。
能改變調(diào)節(jié)炎癥的方式的疾病(如膿毒病)因不適當和/或過度地刺激宿主防御而導(dǎo)致嚴重的ALI。在炎癥過程中，外源性凝血途徑的幾個組分，包括組織因子(TF)、活化的VII因子(FVIIa)和X因子(FXa)以及凝血酶與關(guān)鍵性的炎癥介質(zhì)相互作用以調(diào)節(jié)組織反應(yīng)。灌注內(nèi)毒素或細菌之后能快速活化凝血途徑，在血管間隙中產(chǎn)生前凝血質(zhì)環(huán)境。這些變化依賴于TF并與炎癥細胞因子的增加有關(guān)。肺中的情況與之類似，在灌注了內(nèi)毒素或患有實驗性ALI的動物中已測出前凝血質(zhì)狀態(tài)。在ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液(BAL)中發(fā)現(xiàn)了類似的前凝血質(zhì)環(huán)境，這表明血管外肺炎癥也能活化外源性凝血途徑。盡管炎癥介質(zhì)對凝血有特殊的作用，但人們對TF作用與相關(guān)凝血事件，如炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)因子之間的相反關(guān)系知之甚少。
本領(lǐng)域需要可用于治療ALI或ARDS的藥物。我們已發(fā)現(xiàn)經(jīng)修飾的FVII能減弱急性肺損傷發(fā)展過程中的炎癥和凝血病反應(yīng)，用經(jīng)修飾的FVII阻斷已確定患有ALI或ARDS的受試者凝血能緩解肺和腎損傷，并能保持肺和腎功能。也能保護其它組織。在已確證的急性肺損傷模型中通過經(jīng)修飾的FVII阻斷TF/FVIIa活性能顯著延長存活期，并能減弱炎癥和凝血病反應(yīng)。有數(shù)據(jù)可以證明這一點，所述數(shù)據(jù)表明實質(zhì)上能預(yù)防血纖蛋白沉積在肺、腎和其它器官中，保持器官功能和顯著減弱IL-6和IL-8釋放。
提及的現(xiàn)有技術(shù)國際申請WO 92/15686涉及經(jīng)修飾的VIIa因子，用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的VIIa因子的多核酸和哺乳動物細胞系，以及含有經(jīng)修飾的VIIa因子、用于抑制血液凝結(jié)的組合物。
國際申請WO 94/27631涉及抑制血管再狹窄、組織因子活性和血小板沉積的方法。
國際申請WO 96/12800涉及治療冠狀動脈急性閉塞的方法，所述方法包括給個體施用含有經(jīng)修飾的VIIa因子以及組織纖溶酶原激活物或鏈激酶的組合物。
Miller等，F(xiàn)ASEB Journal 15(4)，A497，7 March 2001競爭性抑制FVIIa能減弱肺損傷和氣管內(nèi)脂多糖之后的促炎細胞因子釋放。
Welty-Wolf等，American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine158(2)，610，1998細菌致敏增加了革蘭氏陰性膿毒病患者的肺損傷。
Carraway等，American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine157(3)，938，1998抗E-和L-選擇蛋白的抗體不能防止膿毒病狒狒的肺損傷或死亡率。
Taylor等，Critical Care Medicine 2000，28(9)，S12描述了靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)大腸桿菌膿毒病狒狒模型和內(nèi)毒素血癥人模型中的代償和非代償DIC反應(yīng)；獲得更好的DIC定義。
Bajaj等，Thrombosis and Haemostasis 78(1)，471，1997TFPI；潛在的治療應(yīng)用。
Gando等，The Journal of TraumaInjury，Infection and Critical Care 47(4)，719，1999發(fā)展中的ARDS以及創(chuàng)傷和膿毒病患者的TF依賴型凝血途徑的全身性活化。
Taylor等，Haemostasis 1996，26(suppl.1)，83在狒狒中，TF和FVIIa在針對LD100大腸桿菌的促凝劑和炎癥反應(yīng)中的作用。
Welty-Wolf等，Abstract Preview from ATS 2001，得自2001年4月的ATS網(wǎng)頁外源性凝血阻斷能減弱大腸桿菌膿毒病狒狒的炎癥細胞因子水平和肺損傷。
發(fā)明簡述一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的FVII用于制備治療人急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的藥物的用途。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的FVII用于制備治療與人急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)相關(guān)的癥狀和疾病的藥物的用途。
在一個實施方案中，所述藥物用于治療器官衰竭。
在一個實施方案中，所述藥物用于預(yù)防其它器官的衰竭。
在一個實施方案中，所述藥物用于維持或改善器官功能。在一個實施方案中，所述藥物用于治療肺高血壓。在一個實施方案中，所述藥物用于使前凝血質(zhì)活性降低或最小化。在一個實施方案中，前凝血質(zhì)活性與肺上皮細胞和組織巨噬細胞的組織因子表達有關(guān)。在一個實施方案中，所述藥物用于減輕或最小化炎癥。在一個實施方案中，所述藥物用于使IL-6和IL-8的產(chǎn)生減少或最小化。在一個實施方案中，所述藥物用于改善肺氣體交換。在一個實施方案中，所述藥物用于減輕或最小化肺水腫。在一個實施方案中，所述藥物用于減少或最小化肺蛋白滲漏。
另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的FVII用于制備預(yù)防或最小化與人ALI或ARDS相關(guān)的慢性器官衰竭的藥物的用途。在一個實施方案中，ALI或ARDS在施用經(jīng)修飾的FVII之前即已被確證。
在本發(fā)明的一個實施方案中，器官是腎、肺、腎上腺、肝臟、小腸、心血管系統(tǒng)或止血系統(tǒng)。在一個實施方案中，器官是肺。在一個實施方案中，器官是腎。在一個實施方案中，器官是心血管系統(tǒng)。在一個實施方案中，器官是止血系統(tǒng)。
一方面，本發(fā)明提供了治療人急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的方法，所述方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的經(jīng)修飾的FVII。
在本發(fā)明不同的實施方案中，所述方法用于治療器官衰竭，預(yù)防其它器官衰竭，治療肺高血壓，使前凝血質(zhì)活性降低或最小化，減輕或最小化炎癥，使IL-6和IL-8的產(chǎn)生減少或最小化，改善肺氣體交換，減輕或最小化肺水腫，以及減輕或最小化肺蛋白滲漏。
一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或最小化與人ALI或ARDS相關(guān)的慢性器官衰竭的方法，所述方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的經(jīng)修飾的FVII。在一個實施方案中，ALI或ARDS在施用經(jīng)修飾的FVII之前即已被確證。
另一方面，本發(fā)明提供了FVIIai用于制備治療肺衰竭的藥物的用途。在一個實施方案中，肺損害是急性肺損傷(ALI)。在一個實施方案中，肺損害是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。在一個實施方案中，治療肺損害是防止ALI發(fā)展成為ARDS。另一方面，本發(fā)明提供了FVIIai用于制備防止已確證的ALI或ARDS患者遭受進一步肺損害的藥物的用途。另一方面，本發(fā)明提供了FVIIai用于制備維持或改善已確證的ALI或ARDS患者的肺功能的藥物的用途。一方面，本發(fā)明提供了治療受試者肺損害的方法，所述方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的FVIIai。在一個實施方案中，肺損害是急性肺損傷(ALI)。在一個實施方案中，肺損害是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。在一個實施方案中，治療肺損害是防止ALI發(fā)展成為ARDS。另一方面，本發(fā)明提供了防止已確證的ALI或ARDS患者遭受進一步肺損害的方法，所述方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的FVIIai。另一方面，本發(fā)明提供了維持或改善已確證的ALI或ARDS患者的肺功能的方法，所述方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的FVIIai。另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的FVII用于制備治療肺高血壓的藥物的用途。另一方面，本發(fā)明提供了治療受試者的肺高壓的方法，所述方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的經(jīng)修飾的FVII。在一個實施方案中，肺高血壓與急性肺損傷(ALI)有關(guān)；在另一個實施方案中，肺高血壓與急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)有關(guān)。另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的FVII用于制備降低或抑制肺中的前凝血質(zhì)活性的藥物的用途。另一方面，本發(fā)明提供了降低或抑制受試者肺中的前凝血質(zhì)活性的方法，所述方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的經(jīng)修飾的FVII。在一個實施方案中，前凝血質(zhì)活性與肺上皮細胞和組織巨噬細胞的組織因子表達有關(guān)。一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的FVII用于制備減少或抑制血管外血纖蛋白沉積的藥物的用途。另一方面，本發(fā)明提供了減少或抑制受試者的血管外血纖蛋白沉積的方法，所述方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的經(jīng)修飾的FVII。在一個實施方案中，血管外血纖蛋白沉積是肺中的沉積。在一個實施方案中，血管外血纖蛋白沉積是器官損傷過程中的沉積。一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的FVII用于制備減輕或抑制肺炎癥的藥物的用途。另一方面，本發(fā)明提供了減輕或抑制受試者肺炎癥的方法，所述方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的經(jīng)修飾的FVII。
在本發(fā)明的一個實施方案中，經(jīng)修飾的FVII是在催化三聯(lián)體中具有至少一個氨基酸殘基取代、插入或缺失的FVII。在一個實施方案中，經(jīng)修飾的FVII是在Ser344，Asp242和His193位(位置參照的是美國專利4,784,950中描述的野生型人FVII序列)具有至少一個氨基酸殘基取代、插入或缺失的FVII。在一個實施方案中，活性位點殘基Ser344被修飾，被Gly，Met，Thr取代，或更優(yōu)選被Ala取代。在一個實施方案中，經(jīng)修飾的FVII是通過與絲氨酸蛋白酶抑制劑反應(yīng)而被修飾的FVIIa。在一個實施方案中，蛋白酶抑制劑是有機磷化合物，磺酰氟(sulfanyl fluoride)，肽鹵甲基酮或氮雜肽(azapeptide)。在一個實施方案中，蛋白酶抑制劑是選自下列的肽鹵甲基酮丹磺酰-L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。在一個實施方案中，蛋白酶抑制劑是D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
在一個實施方案中，經(jīng)修飾的VII因子的催化活性為相應(yīng)物種的野生型VII因子催化活性的約5％以下，更優(yōu)選約1％以下。
在一個實施方案中，膿毒病誘發(fā)ALI或ARDS；在一個實施方案中，創(chuàng)傷誘發(fā)ALI或ARDS。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的FVII用于制備治療已確證的人急性肺損傷(ALI)或已確證的人急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的藥物的用途。
在一個實施方案中，以一次或多次大丸劑注射的形式施用經(jīng)修飾的FVII。
在一個實施方案中，對于70kg重的患者而言，經(jīng)修飾的FVII的給藥量約為0.05mg至500mg/天；1mg至200mg/天；1mg至約150mg/天；1mg至約125mg/天；1mg至約100mg/天；10mg至約175mg/天；10mg至約150mg/天；或10mg至約125mg/天。
在一個實施方案中，通過多次靜脈內(nèi)注射施用經(jīng)修飾的FVII。
在一個實施方案中，經(jīng)修飾的FVII的每天(24小時)給藥劑量為100μg/kg×1，100μg/kg×2，100μg/kg×4，200μg/kg×1，200μg/kg×2，200μg/kg×4，400μg/kg×1，400μg/kg×2，400μg/kg×4，800μg/kg×1或800μg/kg×2。在一個實施方案中，給患者施用一天的經(jīng)修飾的FVII；在另一個實施方案中，給患者施用兩天的經(jīng)修飾的FVII；在另一個實施方案中，給患者施用三天的經(jīng)修飾的FVII。


圖1.大腸桿菌膿毒病中的組織因子(TF)表達。Western印跡(A)表明與用FVIIai預(yù)防性治療過的正常狒狒肺相比，膿毒病對照動物肺中的TF表達有所增加。兩只用TFPI治療的動物中有一只的TF表達沒有變化。圖中顯示出代表性的印跡。(B)對膿毒病對照和經(jīng)FVIIai治療的組進行光密度測定法，并歸一化至非-膿毒病正常對照動物的平均值。兩個實驗組中的n＝6，正常對照組中的n＝3。所示數(shù)據(jù)為平均值±sem(*p＜0.05對正常對照，δp＜0.05對膿毒病對照)。
圖2.通過FVIIai預(yù)防膿毒病-誘發(fā)的肺損傷。數(shù)據(jù)被表示為從t＝12小時至顯示出藥效時的變化。圖中還顯示出得自用TFPI治療的兩只動物的數(shù)據(jù)和得自該實驗室膿毒病對照的累積數(shù)據(jù)。-●-表示膿毒病對照組(n＝6)，-*-表示膿毒病+FVIIai(n＝6)，...表示累積的膿毒病對照(n＝11)，----表示膿毒病+TFPI(n＝2)。將數(shù)據(jù)表示為平均值±sem，并使用二因子ANOVA分析數(shù)據(jù)(*p＜0.05)。FVIIai能防止(A)動脈-肺泡氧梯度增加(AaDO2，p＜0.0001)，(B)肺系統(tǒng)順應(yīng)性下降(Cs，p＜0.001)，(C)肺動脈壓(PAM，p＜0.001)的平均值增加，和(D)肺血管抗性(PVR，p＜0.05)。
圖3.FVIIai治療能減輕肺炎癥。與膿毒病對照相比，經(jīng)治療的動物中的肺MPO活性和BAL LDH有所降低(p＝0.07和*p＜0.01)。這兩組之間的BAL蛋白沒有區(qū)別。將數(shù)據(jù)表示為平均值±sem，并使用t-檢驗分析數(shù)據(jù)。
圖4.在經(jīng)FVIIai治療的動物中，膿毒病-誘發(fā)的損傷的腎和代謝指標有所改善。(A)在經(jīng)FVIIai治療的膿毒病動物中，血清[HCO3-]較高(p＜0.01)。(B)在膿毒病對照組而不是經(jīng)FVIIai治療的膿毒病組中，血清肌酸酐增加(p＝0.059)。(C)和(D)顯示出兩組中類似的液體平衡(靜脈內(nèi)液體減去尿排泄量)，但在經(jīng)FVIIai治療的動物中，膿毒病過程中的尿排泄量較高(p＜0.0001)。將數(shù)據(jù)表示為平均值±sem，并使用二因子ANOVA分析數(shù)據(jù)。-●-表示膿毒病對照組(n＝6)，-*-表示膿毒病+FVIIai(n＝6)。
圖5.FVIIai緩解膿毒病-誘發(fā)的凝血病。(A)膿毒病導(dǎo)致PTT逐漸延長，而在經(jīng)FVIIai治療的動物中，PTT縮短，p＜0.01。治療組的血纖蛋白原耗盡(B)和TAT復(fù)合物升高(C)有所減弱，對兩者而言，p＜0.0001。兩組中被表示為試劑盒標準的百分比的ATIII活性(D)降低，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。將數(shù)據(jù)表示為平均值±sem，并使用二因子ANOVA分析數(shù)據(jù)。-●-表示膿毒病對照組(n＝6)，-*-表示膿毒病+FVIIai(n＝6)。
圖6.通過FVIIai可以減弱膿毒病中的炎癥細胞因子。將數(shù)據(jù)表示為平均值±sem，并使用二因子ANOVA分析數(shù)據(jù)。-●-表示膿毒病對照組(n＝6)，-*-表示膿毒病+FVIIai(n＝6)。通過用FVIIai治療，使膿毒病誘發(fā)的IL-6(A)，IL-8(B)和TNFR-1(D)水平的增加被減弱，對所有組而言，p＜0.01。通過TF阻斷，IL-1β水平(C)未改變。
發(fā)明詳述簡稱AaDO2動脈-肺泡氧梯度APTT 活化的部分促凝血酶原激酶時間ALI 急性肺損傷APC 活化的C蛋白ARDS 急性呼吸窘迫綜合征ASIS FFR-rFVllaBAL 支氣管肺泡灌洗液BUN 血尿氮BW 體重CO 心輸出量，UminCs 肺系統(tǒng)順應(yīng)性下降DO2 氧傳遞，mUminDVT 深靜脈血栓形成F1-2 纖蛋白原片段1和2FiO2 吸入氧分壓FFR D-苯基丙氨酰-L-苯基丙氨酰-L-精氨酰-三肽FFR-rFVIIa FFR-失活的，rFVIIaFPA 血纖肽AFVII 人凝血因子VIIFVIIa人活化的凝血因子VIIIL-1β白細胞介素-1βIL-6 白細胞介素-6IL-8 白細胞介素-8Kg 千克LPS 脂多糖MW 分子量NIH 國立衛(wèi)生研究院NOEL 未觀察到效果水平PAM 平均肺動脈壓增加PaO2 動脈血液的氧張力PCWP 肺毛細管契壓，mm HgPT 凝血酶原時間PTCA 經(jīng)皮照影冠狀血管成形術(shù)PVR 肺血管抗性RBC 紅血細胞
rFVIIa 重組、活化的人VII因子SVR 全身血管抗性，達因×cm×kg/10TAT 凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物TF 組織因子TNFR-1 TNF受體-1TFPI組織因子途徑抑制劑VO2 氧消耗，mL/minμg 微克術(shù)語“器官損害”包括但不限于腎、肺、腎上腺、肝臟、腸、心血管系統(tǒng)和/或止血系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)損害和/或器官功能損害。器官損害的例子包括但不限于形態(tài)/結(jié)構(gòu)損害和/或器官功能損害，例如因肺清除損害或肺交換機制損害或肺泡-毛細管膜損害造成的蛋白質(zhì)(如表面活性劑)或液體的積累。術(shù)語“器官損傷”，“器官損害”和“器官衰竭”可以互換使用。一般說來，器官損害導(dǎo)致器官衰竭。器官衰竭指的是與未患ALI或ARDS的人的相應(yīng)器官的平均正常功能相比，器官功能有所減弱。器官衰竭可以是功能稍微減弱(如為正常功能的80-90％)或功能大幅度減弱(如為正常功能的10-20％)；減弱也可以是器官功能完全衰竭。器官衰竭包括但不限于例如因組織壞死、缺乏腎小球(腎)、血纖蛋白沉積、出血、水腫或炎癥造成的生物功能(例如尿排泄量)減小。器官損害包括但不限于組織壞死、缺乏腎小球(腎)、血纖蛋白沉積、出血、水腫或炎癥。
術(shù)語“肺損害”包括但不限于先天異?；颢@得性異常所造成的肺損害，如因自身免疫病發(fā)作、移植后肺排斥、導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的感染、肺內(nèi)壓力/體積關(guān)系的變化、使所述哺乳動物暴露于外部因子(如香煙或灰塵)以及有害或有毒試劑(如溶劑或煙)中，或因暴露于治療劑而導(dǎo)致的不合乎需要的副作用所造成的肺損害。肺損害的例子包括但不限于形態(tài)/結(jié)構(gòu)損害和/或肺功能損害，例如因肺清除損害或肺交換機制損害或肺泡-毛細管膜損害造成的蛋白質(zhì)(如表面活性劑)或液體的積累。術(shù)語“肺損傷”，“肺損害”和“肺衰竭”可以互換使用。
檢測器官功能和效力的方法和用于這種檢測的適當生化或臨床參數(shù)是熟練的臨床醫(yī)生所熟知的。
器官功能的標志或生化參數(shù)是例如呼吸PaO2/FiO2比率凝血血小板肝臟膽紅素心血管血壓和對血管加壓處理的需求腎肌酸酐和尿排泄量其它臨床評估可包括無需通風(fēng)設(shè)備的天數(shù)，未出現(xiàn)器官衰竭的天數(shù)，未進行血管加壓處理的天數(shù)，SOFA評分和肺損傷評分評價以及生命體征。
檢測凝血病或炎癥的方法也是熟練的臨床醫(yī)生所熟知的。凝血病或炎癥的標志是例如PTT、血纖蛋白原耗盡、TAT復(fù)合物升高、ATIII活性、IL-6、IL-8和TNFR-1。
術(shù)語“慢性器官損害”包括但不限于因患有ALI或ARDS而導(dǎo)致的長期損害。這一殘留的損害，特別是肺力學(xué)的損害包括但不限于一氧化碳擴散能力的輕微受限、梗阻、受損，或鍛煉時的氣體-交換異常，伴隨著持續(xù)血氧過少的纖維化肺泡炎，肺泡不起作用的間隙增加，肺泡或肺順應(yīng)性進一步降低。因肺-毛細管床閉塞而造成的肺高血壓可以是嚴重的并導(dǎo)致右室衰竭。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“治療”包括治療已確證的ALI，治療已確證的ARDS，以及防止已確證的ALI發(fā)展成為ARDS。治療包括減弱、消除、最小化、減輕或緩解與ALI或ARDS有關(guān)的癥狀或病癥，包括但不限于防止在施用經(jīng)修飾的FVII時已遭受某種程度器官衰竭和/或損害的器官進一步損害和/或衰竭，以及防止在給藥時尚未遭受器官衰竭和/或損害的其它器官發(fā)展為損害和/或衰竭。所述癥狀或病癥的例子包括但不限于對例如但不限于肺、腎、腎上腺、肝臟、腸、心血管系統(tǒng)和/或止血系統(tǒng)這些器官的形態(tài)/結(jié)構(gòu)損害和/或功能損害。所述癥狀或病癥的例子包括但不限于對器官的形態(tài)/結(jié)構(gòu)損害和/或功能損害，例如，因肺清除損害或肺交換機制損害或肺泡-毛細管膜損害、尿排泄量減少(腎)、組織壞死、缺乏腎小球(腎)、血纖蛋白沉積、出血、水腫或炎癥而造成的蛋白質(zhì)(如表面活性劑)或液體的積累。
“減輕”器官衰竭或損害指的是通過對所述器官的至少一個眾所周知的功能標志進行測定，發(fā)現(xiàn)器官功能有所改善；當器官衰竭或損害減輕時，與在未患ALI或ARDS的人中發(fā)現(xiàn)的值相比較，將選定標志的值歸一化。
“經(jīng)確證的”ALI或ARDS指的是根據(jù)上述四-點肺-損傷評分系統(tǒng)，將患者評估為患有ALI或ARDS(Bernard等，Am.J.Respir.Crit.Care Med149818-24，1994)，或者指的是已在患者中觀察到與ALI或ARDS相關(guān)的癥狀或病癥。
暴露于多種肺損傷因子之后急性肺損傷(ALI)可以發(fā)展，所述肺損傷因子例如但不限于吸出胃內(nèi)容物、肺炎、膿毒病、大量輸血、多處創(chuàng)傷和胰腺炎。少數(shù)患者發(fā)展成更嚴重的肺損傷，稱之為成人或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，其死亡率為40-50％左右。暴露于多種肺損傷因子之后ARDS也可以發(fā)展，所述肺損傷因子例如但不限于吸出胃內(nèi)容物、肺炎、膿毒病、大量輸血、多處創(chuàng)傷和胰腺炎。
在本說明書的上下文中，術(shù)語“經(jīng)修飾的VII因子”和“位點-失活的VIIa因子”、“活性位點-失活的VIIa因子”或“FVIIai”可以互換使用。經(jīng)修飾的VII因子或FVIIai可以是酶原(即單鏈分子)的形式，或者可以在其活性位點被裂解。因此，“經(jīng)修飾的VII因子”欲包括經(jīng)修飾的VII因子和經(jīng)修飾的VIIa因子分子，這兩種分子能結(jié)合組織因子并抑制IX因子活化成IXa以及X因子活化成Xa。人FVIIa公開于例如美國專利4,784,950(野生型VII因子)。VII因子序列具有至少一個氨基酸修飾，其中選擇修飾以大大降低活化VII因子催化血漿X或IX因子活化的能力，從而能抑制凝血活性。經(jīng)修飾的VII因子具有被至少一個氨基酸取代修飾的活性位點，其修飾形式能結(jié)合組織因子。經(jīng)修飾的VII因子組合物一般為基本上純的形式。
在人和牛VII因子的優(yōu)選實施方案中，活性位點殘基Ser344被修飾，被Gly，Met，Thr取代，更優(yōu)選被Ala取代。所述取代可以分開進行或與催化三聯(lián)體中其它位點(包括His193和Asp242)的取代聯(lián)合進行。
經(jīng)修飾的VII因子可由多核苷酸分子編碼，所述分子含有兩個可操作相連的區(qū)域編碼序列，它們分別編碼前-肽原和維生素K-依賴型血漿蛋白質(zhì)的gla結(jié)構(gòu)域以及無gla結(jié)構(gòu)域的VII因子蛋白質(zhì)，其中通過表達，所述多核苷酸編碼經(jīng)修飾的VII因子分子，該分子不能顯著活化血漿X或IX因子，但能結(jié)合組織因子。由此多核苷酸表達的經(jīng)修飾的VII因子分子是具有生物活性的抗凝血劑，即它能抑制凝血級聯(lián)系統(tǒng)，因此形成血纖蛋白沉積物或凝血塊。為了表達經(jīng)修飾的VII因子，將多核苷酸分子轉(zhuǎn)染至哺乳動物細胞系，例如BHK，BHK570或293細胞系。
通過催化中心或三聯(lián)體的化學(xué)衍生化，可以抑制VIIa因子的催化活性。通過使VII因子與不可逆抑制劑反應(yīng)，或通過?；纯赏瓿裳苌?，所述抑制劑如有機磷化合物，磺酰氟，肽鹵甲基酮或氮雜肽。優(yōu)選的肽鹵甲基酮包括PPACK(D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮；參見美國專利4,318,904，列入本文作為參考)，D-Phe-Phe-Arg和Phe-Phe-Arg氯甲基酮(FFR-cmk)；和DEGRck(丹磺酰-Glu-Gly-Arg氯甲基酮)。
通過取代、插入或缺失氨基酸也可以抑制VIIa因子的催化活性。在優(yōu)選的實施方案中，在VII因子催化三聯(lián)體的氨基酸序列中進行氨基酸取代，所述三聯(lián)體在本文中被定義為含有對VIIa因子催化位點起作用的氨基酸的區(qū)域。催化三聯(lián)體中的取代、插入或缺失一般位于或鄰近于形成催化位點的氨基酸。在人和牛VII因子蛋白質(zhì)中，形成催化“三聯(lián)體”的氨基酸是Ser344、Asp242和His193(下標的數(shù)字表示在序列中的位置)。使用目前已知的技術(shù)，包括蛋白質(zhì)分離和氨基酸序列分析，可以測定其它哺乳動物物種的VII因子的催化位點。通過將序列與其它絲氨酸蛋白酶，特別是已測出活性位點的胰凝乳蛋白酶序列(Sigler等，J.Mol.Biol.，35143-164(1968)，列入本文作為參考)進行比對，由所述比對結(jié)果確定類似的活性位點殘基，也可以測定催化位點。
進行氨基酸取代、插入或缺失以防止或要不然抑制VIIa因子對X和/或IX因子的活化。通過例如在含有包埋于脂質(zhì)膜中的TF和X因子的系統(tǒng)中，測定VIIa因子產(chǎn)生Xa因子的能力(Persson等，J.Biol.Chem.27219919-19924，1997)；或者在水系統(tǒng)中測定X因子水解(參見下文的“體外蛋白酶解試驗”)可以容易地進行測定。然而，經(jīng)過如此修飾的VII因子應(yīng)該也能保持與真正的VII因子和/或VIIa因子競爭結(jié)合凝血級聯(lián)系統(tǒng)中的組織因子的能力。通過例如本文所述的凝血試驗(如美國專利5,997,864所述)，或使用例如具有細胞表面組織因子的細胞系，如人膀胱癌細胞系J82的競爭結(jié)合試驗(Sakai等，J.Biol.Chem.2649980-9988(1989)，列入本文作為參考)，或通過使用基于表面胞質(zhì)基因組共振的儀器測定其與TF的物理結(jié)合(例如，Persson，F(xiàn)EBS Letts.413359-363，1997)，可以容易地測定競爭。
在VII因子中形成催化位點的氨基酸，如人和牛VII因子中的Ser344、Asp242和His193可以被取代或缺失。在本發(fā)明中，優(yōu)選僅改變單個氨基酸，從而使增加分子抗原性或抑制其結(jié)合組織因子的能力的可能性最小化，然而，也可以進行兩個或多個氨基酸改變(取代、添加或缺失)，也可以進行取代、添加和缺失的組合。在人和牛VII因子的優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選Ser344被Ala取代，但Gly、Met、Thr或其它氨基酸也可以被取代。優(yōu)選用Glu取代Asp，用Lys或Arg取代His。一般說來，選擇取代應(yīng)盡可能少地破壞蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。Dayhoff等(Atlas of Protein Structure 1978，Nat′l Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.，列入本文作為參考)的模型可用作選擇其它氨基酸取代的指南?？梢园瓷衔乃鲈谌?、牛或其它物種的適當VII因子序列的催化位點中導(dǎo)入殘基改變，并按本文所述檢測所得蛋白質(zhì)抑制催化活性的水平以及所得的抗凝血劑活性。對于經(jīng)修飾的VII因子而言，催化活性被大幅度抑制，一般為相應(yīng)物種野生型VII因子催化活性的約5％以下，更優(yōu)選約1％以下(例如在下文“體外蛋白酶解試驗”中測定的數(shù)據(jù))。
通過使用重組DNA技術(shù)也可產(chǎn)生經(jīng)修飾的VII因子。一般說來，修飾克隆的野生型VII因子DNA序列以編碼所需蛋白質(zhì)。然后將經(jīng)修飾的序列插入表達載體，再將表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至宿主細胞。優(yōu)選將高等真核細胞，特別是經(jīng)培養(yǎng)的哺乳動物細胞用作宿主細胞。人VII因子的完整核苷酸和氨基酸序列是已知的。參見美國專利4,784,950，列入本文作為參考，其中描述了重組人VII因子的克隆和表達。牛VII因子序列描述于Takeya等，J.Biol.Chem.26314868-14872(1988)，列入本文作為參考。
通過多種技術(shù)可以完成氨基酸序列改變。通過位點-特異性誘變可以修飾DNA序列。位點-特異性誘變技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，描述于例如Zoller和Smith(DNA 3479-488，1984)。因此，使用VII因子的核苷酸和氨基酸序列，可以導(dǎo)入所選擇的改變。
相應(yīng)被修飾的VII因子包括氨基末端部分(gla結(jié)構(gòu)域)被維生素K-依賴型血漿蛋白質(zhì)IX因子、X因子、凝血酶原、C蛋白、S蛋白或Z蛋白之一的gla結(jié)構(gòu)域取代的蛋白質(zhì)。維生素K-依賴型血漿蛋白質(zhì)的gla結(jié)構(gòu)域的特征在于存在γ-羧基谷氨酸殘基，一般長度約為30至40個氨基酸，C末端對應(yīng)于各個基因的外顯子-內(nèi)含子邊界的位置。美國專利4,784,950(列入本文作為參考)中公開了產(chǎn)生具有異源gla結(jié)構(gòu)域的VII因子的方法。
用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的VII因子的DNA序列一般在VII因子蛋白質(zhì)的氨基末端編碼前肽原以獲得適當?shù)姆g后加工(例如谷氨酸殘基的γ-羧基化)并從宿主細胞中分泌出去。前肽原可以是VII因子或另一種維生素K-依賴型血漿蛋白質(zhì)，如IX因子、X因子、凝血酶原、C蛋白或S蛋白的前肽原。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得在經(jīng)修飾的VII因子的氨基酸序列中還可進行其它修飾，其中所述修飾不能顯著削弱蛋白質(zhì)用作抗凝血劑的能力。例如，也可在活化裂解位點處修飾催化三聯(lián)體已被修飾的VII因子，以抑制酶原VII因子轉(zhuǎn)變?yōu)槠浠罨碾p鏈形式，所述方法一般性地描述于美國專利5,288,629(列入本文作為參考)。
通過在抗-VII因子抗體柱上進行親和層析可以純化經(jīng)修飾的VII因子。特別優(yōu)選使用依賴于鈣的單克隆抗體，參見Wakabayashi等，J.Biol.Chem.26111097-11108，(1986)和Thim等，Biochem.277785-7793，(1988)(列入本文作為參考)。通過常規(guī)的化學(xué)純化方法，例如高效液相層析也可以進行純化。其它純化方法，包括檸檬酸鋇沉淀也是本領(lǐng)域所熟知的，可應(yīng)用于純化本文所述的新的經(jīng)修飾VII因子(一般性地參見Scopes，R.，ProteinPurification，Springer-Verlag，N.Y.，1982)。為了藥用目的，優(yōu)選均一性至少約為90至95％的基本上純的經(jīng)修飾VII因子，最優(yōu)選均一性為98至99％或更高。一旦被部分純化或達到所需的均一性，即可將經(jīng)修飾的VII因子用于治療。
在其活化位點裂解經(jīng)修飾的VII因子，以將其轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進行活化，所述方法如Osterud等，Biochemistry 112853-2857(1972)；Thomas，美國專利4,456,591；Hedner and Kisiel，J.Clin.Invest.711836-1841(1983)；或Kisiel and Fujikawa，Behring Inst.Mitt.7329-42(1983)，列入本文作為參考。然后按下文所述配制和施用所得分子。
給藥和劑量本發(fā)明打算將用于治療肺衰竭的藥物組合物非腸道給藥。優(yōu)選藥物組合物能被非腸道給藥，即靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或肺內(nèi)給藥。用于非腸道給藥的組合物包括溶解于可接受載體，優(yōu)選為含水載體中的經(jīng)修飾VII因子分子的溶液?？梢允褂枚喾N含水載體，例如水、緩沖水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等。也可將經(jīng)修飾的VII因子分子配制成脂質(zhì)體制品以用于傳遞或靶向損傷位點。脂質(zhì)體制品一般性地描述于例如美國專利4,837,028、4,501,728和4,975,282(列入本文作為參考)。可通過常規(guī)的眾所周知的滅菌技術(shù)對組合物進行滅菌。將所得水溶液包裝待用，或在無菌條件下過濾并凍干，給藥前使凍干制品與無菌水溶液混合。必要時，組合物可含有藥物可接受的輔助物質(zhì)以接近生理條件，如pH調(diào)節(jié)和緩沖試劑，張力調(diào)節(jié)劑等，例如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。這些制劑中的經(jīng)修飾VII因子的濃度可以有較寬的范圍，即從體重的約0.5％以下，通常為或至少約為1％至高達15或20％，主要根據(jù)所選定的具體給藥方式，液體體積和粘度等來選擇濃度。
因此，靜脈內(nèi)灌注用的典型藥物組合物可含有250ml無菌的林格溶液和10mg經(jīng)修飾的VII因子。制備可非腸道給藥的化合物的實用方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的或顯而易見的，該方法詳細描述于例如Remington′s Pharmaceutical Science，16th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA(1982)(列入本文作為參考)。
以足以治愈或至少部分抑制疾病及其并發(fā)癥的量，給上述已患病的患者施用含有經(jīng)修飾VII因子的組合物。將足以達到此目的的量定義為“治療有效劑量”。對該用途有效的量取決于疾病或損傷的嚴重程度以及患者的體重和一般狀況，但對于70kg重的患者而言，負載和維持劑量約為0.05mg至500mg/天，更優(yōu)選為1mg至200mg/天，例如1mg至約150mg/天，1mg至約125mg/天，1mg至約100mg/天，10mg至約175mg/天，10mg至約150mg/天，或10mg至約125mg/天。
必須考慮到本發(fā)明的物質(zhì)一般用于嚴重疾病或損傷狀態(tài)，即威脅生命或潛在威脅生命的情況。在這種情況下，考慮到最小化外來物質(zhì)和經(jīng)修飾的人VII因子在人中一般無免疫原性，治療醫(yī)生可以給患者施用大大過量的所述經(jīng)修飾VII因子組合物。
通過單次或多次給藥即可施用藥物。對于每天都需要維持水平的患者而言，可通過例如重復(fù)靜脈內(nèi)注射，或通過使用便攜式泵系統(tǒng)連續(xù)灌注來施用經(jīng)修飾的VII因子。治療ARDS時，經(jīng)修飾FVIIa的給藥模式是例如約1mg/kg靜脈內(nèi)劑量作為負載劑量，接著以約0.05mg/kg/小時作為維持劑量(mg/kg指的是患者每kg體重需要的經(jīng)修飾VII因子的mg數(shù))。另一種模式是例如每天(24小時)施用單劑量或多劑量的經(jīng)修飾FVII，例如100μg/kg×1，100μg/kg×2，100μg/kg×4，200μg/kg×1，200μg/kg×2，200μg/kg×4，400μg/kg×1，400μg/kg×2，400μg/kg×4，800μg/kg×1或800μg/kg×2。該劑量可以一天或多天施用，例如(每天100μg/kg×1)×2天，(100μg/kg×2)×2天，(100μg/kg×4)×2天，(200μg/kg×1)×2天，(200μg/kg×2)×2天，(200μg/kg×4)×2天，(400μg/kg×1)×2天，(400μg/kg×2)×2天，(400μg/kg×4)×2天，(800μg/kg×1)×2天或(800μg/kg×2)×2天。優(yōu)選通過靜脈內(nèi)注射施用藥物。
經(jīng)修飾的FVII或另一種TF拮抗劑(如抗-TF抗體)也可以與活化的C蛋白(APC)或其保留APC生物活性的片段或變體聯(lián)合給藥。此時，施用第一量的經(jīng)修飾FVII或TF拮抗劑和第二種量的APC或其具有生物活性的變體或片段，其中第一和第二種量合起來能有效治療ALI或ARDS。
組合物可以是單制品形式(單劑量形式)，其中含有適當濃度的經(jīng)修飾的FVII或另一種TF拮抗劑的制品，以及APC或其具有生物活性的片段或變體的制品。組合物也可以是由多部分組成的試劑盒形式，所述試劑盒由第一單位劑量形式和第二單位劑量形式組成，前者含有經(jīng)修飾的FVII或另一種TF拮抗劑的制品，后者含有APC或其具有生物活性的片段或變體的制品?？梢韵仁┯萌我环N組分。本說明書上下文中提到第一或第二或第三等單位劑量僅是為了便于表述，并不表示優(yōu)選的給藥次序。優(yōu)選通過相同的靜脈內(nèi)入口注射這兩種產(chǎn)品。試劑盒中包括盛放分開的組合物的容器，如分開的瓶或分開的箔袋。試劑盒中一般還包括施用分開的組分的說明書。當優(yōu)選以不同的劑量形式，不同的劑量間隔施用分開的組分時，或當開處方的醫(yī)生要求滴定組合中的各個組分時，試劑盒形式特別有用。
根據(jù)本發(fā)明施用的經(jīng)修飾FVII或另一種TF拮抗劑的量和APC或其具有生物活性的片段或變體的量的比率可以在約1∶100至約100∶1(w/w)之間變化。因此，經(jīng)修飾FVII或另一種TF拮抗劑與APC或其具有生物活性的片段或變體的比率可以是例如約1∶100，或1∶90，或1∶80，或1∶70，或1∶60，或1∶50，或1∶40，或1∶30，或1∶20，或1∶10，或1∶5，或1∶2，或1∶1，或2∶1，或5∶1，或10∶1，或20∶1，或30∶1，或40∶1，或50∶1，或60∶1，或70∶1，或80∶1，或90∶1，或100∶1；或約1∶90至約1∶1，或約1∶80至約1∶2，或約1∶70至約1∶5，或約1∶60至約1∶10，或約1∶50至約1∶25，或約1∶40至約1∶30，或約90∶1至約1∶1，或約80∶1至約2∶1，或約70∶1至約5∶1，或約60∶1至約10∶1，或約50∶1至約25∶1，或約40∶1至約30∶1，或約10∶1至約1∶10，或約5∶1至約1∶5。
經(jīng)修飾的FVII或另一種TF拮抗劑(如抗-TF抗體)也可以與TFPI或其保留TFPI生物活性的片段或變體聯(lián)合給藥。此時，施用第一量的經(jīng)修飾FVII或另一種TF拮抗劑和第二種量的TFPI或其具有生物活性的變體或片段，其中第一和第二種量合起來能有效治療ALI或ARDS。
組合物可以是單制品形式(單劑量形式)，其中含有適當濃度的經(jīng)修飾的FVII或另一種TF拮抗劑的制品，以及TFPI或其具有生物活性的片段或變體的制品。組合物也可以是由多部分組成的試劑盒形式，所述試劑盒由第一單位劑量形式和第二單位劑量形式組成，前者含有經(jīng)修飾的FVII或另一種TF拮抗劑的制品，后者含有TFPI或其具有生物活性的片段或變體的制品。可以先施用任一種組分。本說明書上下文中提到第一或第二或第三等單位劑量僅是為了便于表述，并不表示優(yōu)選的給藥次序。優(yōu)選通過相同的靜脈內(nèi)入口注射這兩種產(chǎn)品。試劑盒中包括盛放分開的組合物的容器，如分開的瓶或分開的箔袋。試劑盒中一般還包括施用分開的組分的說明書。當優(yōu)選以不同的劑量形式，不同的劑量間隔施用分開的組分時，或當開處方的醫(yī)生要求滴定組合中的各個組分時，試劑盒形式特別有用。
根據(jù)本發(fā)明施用的經(jīng)修飾FVII或另一種TF拮抗劑的量和TFPI或其具有生物活性的片段或變體的量的比率可以在約1∶100至約100∶1(w/w)之間變化。因此，經(jīng)修飾FVII或另一種TF拮抗劑與TFPI或其具有生物活性的片段或變體的比率可以是例如約1∶100，或1∶90，或1∶80，或1∶70，或1∶60，或1∶50，或1∶40，或1∶30，或1∶20，或1∶10，或1∶5，或1∶2，或1∶1，或2∶1，或5∶1，或10∶1，或20∶1，或30∶1，或40∶1，或50∶1，或60∶1，或70∶1，或80∶1，或90∶1，或100∶1；或約1∶90至約1∶1，或約1∶80至約1∶2，或約1∶70至約1∶5，或約1∶60至約1∶10，或約1∶50至約1∶25，或約1∶40至約1∶30，或約90∶1至約1∶1，或約80∶1至約2∶1，或約70∶1至約5∶1，或約60∶1至約10∶1，或約50∶1至約25∶1，或約40∶1至約30∶1，或約10∶1至約1∶10，或約5∶1至約1∶5。
經(jīng)修飾的FVII或另一種TF拮抗劑(如抗-TF抗體)也可以與能降低血液葡萄糖的藥劑，如胰島素，優(yōu)選能將每分升患者血漿中的血液葡萄糖維持在100mg或更低的藥劑聯(lián)合給藥。此時，施用第一量的經(jīng)修飾FVII或另一種TF拮抗劑，和第二種量的能降低血液葡萄糖的藥劑，如胰島素或其具有生物活性的變體或片段，其中第一和第二種量合起來能有效治療ALI或ARDS。
組合物可以是單制品形式(單劑量形式)，其中含有適當濃度的經(jīng)修飾的FVII或另一種TF拮抗劑的制品，以及能降低血液葡萄糖的藥劑，如胰島素或其具有生物活性的片段或變體的制品。組合物也可以是由多部分組成的試劑盒形式，所述試劑盒由第一單位劑量形式和第二單位劑量形式組成，前者含有經(jīng)修飾的FVII或另一種TF拮抗劑的制品，后者含有能降低血液葡萄糖的藥劑，如胰島素或其具有生物活性的片段或變體的制品。可以先施用任一種組分。本說明書上下文中提到第一或第二或第三等單位劑量僅是為了便于表述，并不表示優(yōu)選的給藥次序。優(yōu)選通過相同的靜脈內(nèi)入口注射這兩種產(chǎn)品。試劑盒中包括盛放分開的組合物的容器，如分開的瓶或分開的箔袋。試劑盒中一般還包括施用分開的組分的說明書。當優(yōu)選以不同的劑量形式，不同的劑量間隔施用分開的組分時，或當開處方的醫(yī)生要求滴定組合中的各個組分時，試劑盒形式特別有用。
根據(jù)本發(fā)明施用的經(jīng)修飾FVII或另一種TF拮抗劑的量和能降低血液葡萄糖的藥劑，如胰島素或其具有生物活性的片段或變體的量的比率可以在約1∶100至約100∶1(w/w)之間變化。因此，VII因子與能降低血液葡萄糖的藥劑的比率可以是例如約1∶100，或1∶90，或1∶80，或1∶70，或1∶60，或1∶50，或1∶40，或1∶30，或1∶20，或1∶10，或1∶5，或1∶2，或1∶1，或2∶1，或5∶1，或10∶1，或20∶1，或30∶1，或40∶1，或50∶1，或60∶1，或70∶1，或80∶1，或90∶1，或100∶1；或約1∶90至約1∶1，或約1∶80至約1∶2，或約1∶70至約1∶5，或約1∶60至約1∶10，或約1∶50至約1∶25，或約1∶40至約1∶30，或約90∶1至約1∶1，或約80∶1至約2∶1，或約70∶1至約5∶1，或約60∶1至約10∶1，或約50∶1至約25∶1，或約40∶1至約30∶1，或約10∶1至約1∶10，或約5∶1至約1∶5。
對實驗和狒狒模型的描述膿毒病-誘導(dǎo)的組織因子(TF)表達激活了肺中的凝血，并導(dǎo)致前凝血質(zhì)環(huán)境，從而使血纖蛋白沉積，炎癥變得更加嚴重。在TF-VIIa因子(FVIIa)復(fù)合物處防止凝血開始能阻斷血纖蛋白沉積并控制炎癥，從而抑制膿毒病中的急性肺損傷(ALI)和其它器官損害。使用ALI狒狒模型，其中用滅活的大腸桿菌(E.coli)(1×109CFU/kg)使動物致敏，12小時之后，通過灌注1×1010CFU/kg活的大腸桿菌誘發(fā)致命的膿毒病。在灌注活細菌時，給治療組動物靜脈內(nèi)施用TF競爭性抑制劑，即位點-失活的FVIIa(經(jīng)修飾的FVII)，對動物進行36小時生理學(xué)監(jiān)測。FVIIai顯著保護氣體交換和肺順應(yīng)性，防止肺水腫和肺高血壓，相對于載體而言能保留腎功能(p＜0.01)，并能降低全身性促炎細胞因子反應(yīng)，如白細胞介素-6(p＜0.01)。使用組織因子途徑抑制劑(TFPI)進一步證實膿毒病-誘發(fā)的ALI中TF阻斷的保護作用。結(jié)果表明在膿毒病靈長類動物中，TF-FVIIa復(fù)合物能部分通過選擇性刺激促炎細胞因子釋放和血纖蛋白沉積來調(diào)節(jié)器官損傷。
革蘭氏陰性膿毒病患者急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和多器官衰竭(MOF)的發(fā)病率高。這些患者的肺特征性地顯示出肺泡和間隙區(qū)室中的血纖蛋白沉積，但血纖蛋白對膿毒病中ARDS的發(fā)病機理起作用的證據(jù)有其偶然性。經(jīng)設(shè)計通過防止彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)來治療膿毒病的策略降低了伴有休克的人和非人靈長類動物的死亡率，但這些研究受顯著的殘留死亡率、缺乏器官特異性分析和動物模型不能再現(xiàn)類似于ARDS的急性肺損傷(ALI)的限制。由于ARDS在膿毒病患者中導(dǎo)致顯著的病態(tài)和死亡率，我們使用ARDS和MOF的非人靈長類動物模型來研究組織因子(TF)啟動的凝血和血纖蛋白沉積對膿毒病中肺和全身性器官損害的作用。
當內(nèi)毒素或細菌進入循環(huán)時，外源性凝血被快速激活，血管間隙中產(chǎn)生前凝血質(zhì)環(huán)境。這依賴于TF并與能介導(dǎo)內(nèi)毒素的前凝血質(zhì)作用的炎癥細胞因子的增加有關(guān)。類似地，在灌注內(nèi)毒素之后或處于實驗性急性肺損傷(ALI)過程中的動物肺中，以及ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液(BAL)中能發(fā)現(xiàn)前凝血質(zhì)環(huán)境。與在全身性循環(huán)中相同，肺中的前凝血質(zhì)活性與TF表達有關(guān)，這表明血管外炎癥也能激活外源性途徑。盡管前凝血質(zhì)活性和肺損傷之間有一定聯(lián)系，但尚未確定TF和其它凝血因子在肺損傷反應(yīng)中的特定病原學(xué)作用。與TF一樣，活化的VII因子(FVIIa)和X因子(FXa)、凝血酶和血纖蛋白對細胞信號傳導(dǎo)具有特殊的作用，所述信號傳導(dǎo)能改變血管通透性、炎癥細胞遷移和肺表面活性劑功能異常。仍不清楚對膿毒病的反應(yīng)中，凝血和炎癥之間復(fù)合物串話的確切作用。
在革蘭氏陰性膿毒病過程中阻斷凝血能通過減弱與凝血相關(guān)的炎癥反應(yīng)防止ALI和其它器官損害。這一點在已建立的大腸桿菌狒狒模型中得到檢驗，其中通過滅活細菌的致敏性灌注預(yù)先激活了全身性炎癥反應(yīng)。施用第二致死劑量的細菌之后，動物產(chǎn)生類似于ARDS人患者的肌力過度心血管反應(yīng)以及肺和腎衰竭。在施用致敏劑量的細菌之后，我們使用位點-失活的FVIIa(FVIIai)在TF-FVIIa復(fù)合物處阻斷凝血的啟動，所述FVIIai對TF的親和性比天然FVIIa的高5倍，因此能競爭性抑制FVIIa。下述研究表明使用FVIIai阻斷凝血能減輕膿毒病綜合征患者的全身性炎癥和血纖蛋白原耗盡，并能防止對肺和腎的損傷。
這是首次研究表明阻斷致死性膿毒病的凝血啟動之后，終器功能有特異性改善。該發(fā)現(xiàn)確定了TF在膿毒病-誘發(fā)的呼吸和腎衰竭中的病原學(xué)作用，并且表明阻斷TF能有效保持肺和腎功能。評價療效的方法是強有力的，因為被致敏的狒狒的生理學(xué)和組織學(xué)反應(yīng)與人對膿毒病的反應(yīng)非常一致。據(jù)以前用多種策略阻斷膿毒病凝血的動物研究報道阻斷TF或抗凝血之后有較好的存活，但嚴重膿毒病休克的存在使得終器損傷評估變得復(fù)雜。致敏能預(yù)先激活炎癥，并導(dǎo)致類似于人實驗性內(nèi)毒素血癥的肺氣體交換、力學(xué)和血液動力學(xué)的輕微而自身-受限的改變。隨后，無法抵抗的革蘭氏陰性膿毒病導(dǎo)致進行性肺和腎損傷、炎癥細胞因子持續(xù)升高和凝血病。這些動物的免疫應(yīng)答是復(fù)雜的，某些療法，例如抗白細胞粘附分子的mAb能使致敏動物的結(jié)果顯著惡化。相反，灌注致死性大腸桿菌之后，阻斷TF-FVIIa復(fù)合物能減輕凝血病和血纖蛋白沉積，防止肺和腎損傷。
過去，對膿毒病進行凝血阻斷的主要目的是抑制血管區(qū)室中的血纖蛋白沉積，但我們已闡明器官損傷過程中的血管外血纖蛋白沉積也能服從干預(yù)。血纖蛋白為組織修復(fù)中的細胞遷移和膠原形成提供了重要基質(zhì)，但它也會刺激炎癥。在肺中，血纖蛋白的實質(zhì)積累對炎癥細胞遷移、表面活性劑功能異常和前纖維變性過程起作用。盡管在我們的研究中氣體交換和肺水得以大大改善，但在經(jīng)FVIIai治療的動物的肺泡區(qū)域和肺小管附近仍可檢測到殘留的血纖蛋白。這表明因缺乏血纖蛋白，使得TF阻斷的強保護作用不完全，在用FVIIai治療的過程中，包括凝血的關(guān)鍵修復(fù)過程保持完整。
在膿毒病發(fā)生36小時之后，F(xiàn)VIIai能防止肺和腎的管腔內(nèi)出現(xiàn)血纖蛋白塊，這可能會對組織保護起作用。血管內(nèi)血纖蛋白沉積作為小營養(yǎng)血管中阻塞性血栓的直接結(jié)果，并通過增強內(nèi)皮細胞-白細胞相互作用對器官衰竭起作用。盡管血管內(nèi)血纖蛋白對某些組織和在某些臨床背景下，例如當出現(xiàn)無法抵抗的休克和組織低灌注時是重要的，上皮細胞和組織巨噬細胞的血管外TF表達也能啟動前凝血質(zhì)、促炎事件。居留的和浸潤的巨噬細胞以及固定的細胞群體作為發(fā)炎的肺和腎病中的TF來源被牽連，暗示著血管外實質(zhì)中的凝血受不同方式調(diào)節(jié)。
TF是II組細胞因子受體，它可直接調(diào)節(jié)免疫功能，也可通過產(chǎn)生FXa、凝血酶和血纖蛋白(它們都表現(xiàn)出與炎癥的串話)來調(diào)節(jié)免疫功能。每個組分對炎癥反應(yīng)都有獨立的作用，阻斷TF啟動對削弱途徑中隨后步驟的炎癥相互作用是有利的。TF激活與ALI的發(fā)展相關(guān)的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)細胞因子調(diào)節(jié)。特別是，IL-6與ARDS中長時間的炎癥和糟糕的結(jié)果有關(guān)。在體外，F(xiàn)VIIai抑制MAPK活化，這表明經(jīng)由這些途徑的TF信號傳導(dǎo)需要具有催化活性的FVIIa。TF與FVIIa連接誘導(dǎo)了大量免疫調(diào)節(jié)基因，包括IL-1β、IL-8和其它趨化因子、凝血和生長因子以及膠原酶。在本發(fā)明的膿毒病狒狒中，F(xiàn)VIIai能降低IL-6、IL-8和TNFR-1的血漿水平。這源于TF信號傳導(dǎo)減弱或下游產(chǎn)生的FXa和凝血酶減少，它們也可以誘導(dǎo)促炎細胞因子。IL-6和IL-8進一步增加TF表達，而用FVIIai阻斷TF能顯著降低肺中由膿毒病誘導(dǎo)的TF表達。調(diào)節(jié)急性肺損傷的其它重要介質(zhì)，如VEGF需要由TF-FVIIa產(chǎn)生FXa，或需要TF的胞質(zhì)尾。最終的其它數(shù)據(jù)表明當TF高表達時，它作為將FVIIa呈遞給其它起始信號傳導(dǎo)事件的跨膜蛋白質(zhì)的輔因子起作用。當TF象在膿毒病中一樣過量表達時，如果這種相互作用是重要的，直接靶向FVIIa將優(yōu)于其它抑制TF的發(fā)明。
在對患有暴發(fā)性膿毒病的動物進行的早期研究中，三種實驗性藥劑TFPI、抗TF mAb和DEGR-FVIIa被靶向TF-啟動的凝血。這些藥劑改善了存活，然而，遠離TF-FVIIa復(fù)合物的天然蛋白酶抑制劑，包括活化的C蛋白(APC)和抗凝血酶III(AT III)也顯示出存活效力。由于在預(yù)先未經(jīng)攻擊的、快速發(fā)展成為進行性休克的動物中檢驗了所有這些策略，凝血活性可能對TF-FVIIa復(fù)合物下游的休克死亡率起作用。與抗-TF藥劑一樣，尚未研究它們對ALI和MOF的影響。
在上述研究中，觀察到血清IL-6和IL-8的降低，所述降低被認為是改善存活的機理。這些介質(zhì)的重要作用難以定位，并且不能將凝血和細胞因子與存活一致地聯(lián)系起來。在FXa和凝血酶處抑制凝血的AT III能降低死亡率、減輕凝血病、減少IL-6產(chǎn)生，然而，這些結(jié)果在人試驗中無法重復(fù)再現(xiàn)。相反，DEGF-FVIIa能減輕凝血病和減少IL-6產(chǎn)生，但對與細胞因子水平不相關(guān)的存活具有可變的作用。滅活的FXa也能減輕凝血病，但不能改善急性膿毒病休克的存活。這些研究中凝血阻斷的作用與器官功能的生理學(xué)終點不相關(guān)。在人中，用TFPI阻斷TF不會影響低劑量內(nèi)毒素灌注后的IL-6水平，但能防止凝血被活化?？傊?，這些研究暗示了靈長類動物中凝血蛋白酶的炎癥和凝血功能，尤其是作為炎癥攻擊進程的不同界限。
在本發(fā)明的動物中，F(xiàn)VIIai消除了肺炎癥，但不會完全阻斷凝血。新的觀察結(jié)果給應(yīng)避免出血的膿毒病患者提供了前景。盡管FVIIai能有效結(jié)合TF，但它在體外不完全地阻斷凝血。因此，相對于凝血而言，炎癥需要更高程度地活化TF-FVIIa，以本研究所用的FVIIai劑量，未觀察到嚴重的出血。另外，如果發(fā)生了出血，用人重組FVIIa可逆轉(zhuǎn)藥物對凝血的作用。
概括地說，我們已證實在TF-FVIIa復(fù)合物處阻斷凝血能防止非人靈長類動物大腸桿菌膿毒病過程中的肺和腎損傷。對其它組織也有不同程度的保護，這暗示著在不同器官中，對膿毒病損傷的基于-TF的作用是不同的。在病情危急的ARDS人患者中，我們在存在持久炎癥時檢驗了該策略，其中長期的細胞因子表達對功能性結(jié)果具有至關(guān)重要的影響。以前基于凝血的不同方面的膿毒病休克策略取得了不同的臨床成功。
這可能反映了膿毒病不均一的損傷以及與炎癥有關(guān)的不同凝血蛋白酶之間的相互作用。我們的數(shù)據(jù)暗示在凝血級聯(lián)系統(tǒng)中作用最接近的藥劑對膿毒病的肺和腎損傷具有較高的積極影響。
提供下述實施例是為了闡明而不是限制本發(fā)明。
實施例實施例1FVII的生物活性使用適當濃度為100-1000nM的生理學(xué)底物，如X因子測定VIIa因子或VIIa因子變體的活性，其中在加入適當?shù)纳孜?如S-2765)之后測定產(chǎn)生的Xa因子。另外，可在生理學(xué)溫度下進行活性試驗。
“體外蛋白酶解試驗”平行檢測天然(野生型)VIIa因子和VIIa因子變體(下文稱之為“VIIa因子”)以直接比較它們的比活性。在微滴板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中進行該試驗。將溶于100μl 50mM Hepes，pH7.4(含有0.1M NaCl，5mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白)的VIIa因子(10nM)和X因子(0.8μM)保溫15分鐘。然后通過加入50μl含有0.1M NaCl，20mM EDTA和1mg/ml牛血清白蛋白的50mM Hepes，pH7.4以終止X因子裂解。通過加入終濃度為0.5mM的生色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-硝基酰苯胺(S2765，Chromogenix，Sweden)，測定所產(chǎn)生的Xa因子的量。在SpectraMaxTM340微滴板讀數(shù)儀(Molecular Devices，USA)中連續(xù)測定450nm處的光吸收值。減去不含F(xiàn)VIIa的空白對照孔中的光吸收值之后，10分鐘內(nèi)產(chǎn)生的光吸收值被用于計算變體和野生型VIIa因子的蛋白酶解活性之間的比率比率＝(VIIa因子變體的A405nm)/(野生型VIIa因子的A405nm)根據(jù)該比率，可以鑒定出活性大大低于天然VIIa因子的VIIa因子變體，例如，變體活性和天然VII因子(野生型FVII)活性之間的比率低于5％，或1％或更低的變體。
實施例2阻斷外源性凝血能降低已確證患有革蘭氏陰性膿毒病的狒狒中的肺損傷已闡明在用活細菌灌注時使用活性位點-被滅活的VIIa(ASIS)阻斷凝血啟動能減輕狒狒體內(nèi)與膿毒病相關(guān)的急性肺損傷(ALI)和腎衰竭。我們已證實經(jīng)確證的大腸桿菌膿毒病對ASIS治療的反應(yīng)是ALI和腎衰竭減輕。
用1×109/kg熱-滅活的大腸桿菌灌注成年雄性狒狒，12小時之后靜脈內(nèi)施用1×1010/kg活的大腸桿菌。對動物實行機械通風(fēng)48小時，用液體支持動物以維持8-12mm Hg的PCWP(肺毛細管契壓)。灌注活細菌之后1小時，用ASIS治療6只動物(1mg/kg靜脈內(nèi)給藥，接著以50μg/kg/小時給藥)。將6只動物用作膿毒病對照。數(shù)值被表示為平均值±SE。
ASIS能防止血漿血纖蛋白原耗盡，這與治療性阻斷外源性途徑一致。膿毒病誘發(fā)的中性白細胞減少癥和血小板減少癥未受影響。48小時之后，經(jīng)治療的動物的氣體交換功能得以保留(ΔAaDO2，mmHgC＝25.4±3.9，ASIS＝14.4±5.2)，而肺濕/干重降低(C＝6.9±0.8，ASIS＝5.0±0.2)。肺組織學(xué)顯示出在經(jīng)ASIS治療的膿毒病動物中，炎癥有所減輕。在用ASIS治療的膿毒病動物中，尿排泄量較高(UOP，ml/kg/hr C＝5.7±1，ASIS＝12.3±1.7，p≤0.01)，代謝性酸中毒減輕(ΔHCO3-，meq/dlC＝-4.3±2.9，ASIS＝+3±1.1，p≤0.05)。與膿毒病對照相比，取自經(jīng)ASIS治療的動物的腎顯示出受保護的小管構(gòu)造。藥物灌注被較好地耐受，并無出血并發(fā)癥。結(jié)果表明在已確證的膿毒病中抑制外源性凝血的啟動能防止急性肺和腎損傷。

ASIS是D-Phe-Phe-Arg-FVIIa。
實施例3 實驗性急性肺損傷中的組織因子阻斷我們在因大腸桿菌膿毒病而患有ALI的狒狒中研究了對由TF-啟動的凝血的阻斷?；钚晕稽c被滅活的FVII(ASIS)阻斷了外源性凝血，并能降低全身性細胞因子反應(yīng)，包括白細胞介素(IL)-6、IL-8和組織壞死因子受體-1。它也可減輕與膿毒病相關(guān)的肺、腎和其它組織損傷。對血漿血纖蛋白原和凝血酶-抗-凝血酶III(TAT)復(fù)合物的測定進一步證實了用ASIS治療之后，血管內(nèi)凝血活化的降低。
在未經(jīng)治療的膿毒病動物中，肺和其它組織的血管內(nèi)和血管外區(qū)室中，血纖蛋白顯著沉積。在用ASIS治療的膿毒病動物中，血纖蛋白沉積被減輕但不能被消除，這表明TF-阻斷的保護作用不僅僅是因為血纖蛋白產(chǎn)生量的減少。用ASIS阻斷TF也能減少肺中的炎癥變化，包括嗜中性粒細胞浸潤，并能減輕水腫和出血。用ASIS阻斷凝血和減輕血纖蛋白沉積能通過維持氣體交換和順應(yīng)性改善肺功能、減輕肺高血壓以及改善腎功能。用TFPI治療的兩只膿毒病狒狒也顯示出氣體交換和肺順應(yīng)性的改善，但其改善程度低于用ASIS治療的狒狒。這些結(jié)果表明TF-FVIIa復(fù)合物是對膿毒病的病理學(xué)反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)位點。
在膿毒病中阻斷凝血的一個可能的保護性機制是減少促炎細胞因子的產(chǎn)生。凝血和炎癥之間的串話很可能是調(diào)節(jié)異常的炎癥的關(guān)鍵組分，該可能性與終器損害的程度有關(guān)。在肺中，由肺上皮細胞和巨噬細胞在肺泡和間隙表達的TF可啟動膿毒病中的促凝血、促炎事件，當通過TF阻斷作用發(fā)生改變后，可導(dǎo)致肺功能的改善。
ASIS是D-Phe-Phe-Arg-FVIIa。
實施例4方法制備動物。將體重為14至20kg的成年雄性狒狒(Papio cyanoce-phalus)隔離至少4周，使用前確定它們未患肺結(jié)核。根據(jù)AAALAC指南處理動物，實驗方法得到Duke University Institutional Animal Care and Use Commitee的認可。將狒狒隨機分成治療和膿毒病對照組(每組n＝6)。在時間t＝12小時時，給治療動物靜脈內(nèi)(iv.)施用1mg/kg活性位點-滅活的FVIIa(FVIIai，NovoNordisk，Copenhagen)，然后立即灌注活細菌，接著靜脈內(nèi)施用50mcg/kg/小時FVIIai。非治療動物僅接受載體的靜脈內(nèi)灌注。藥物衍生自人重組FVIIa，其中通過摻入小肽(D-Phe-L-Phe-L-Arg氯甲基酮)阻斷了活性位點，根據(jù)對人患者的安全性研究選擇劑量。修飾阻斷了蛋白酶解活性并將TF親和性增加了5倍。為了用獨立的TF抑制劑進一步證實該發(fā)現(xiàn)，以相同的方法，用相同劑量的組織因子途徑抑制劑(TFPI，Abla Creasy惠贈，Chiron，Emeryville，CA)治療另外兩只狒狒。
禁食過夜之后，通過肌內(nèi)施用克他命(20-25mg/kg)使每只動物麻醉，并給所有動物插管。用克他命(3-10mg/kg/h)和安定(每2小時0.4-0.8mg/kg)使動物保持深度麻醉。用體積-循環(huán)通風(fēng)設(shè)備給動物通風(fēng)，間隙性地用巴夫龍(靜脈內(nèi)4mg)使動物麻痹，然后測定呼吸。FiO2為0.21，一次吸入肺內(nèi)的空氣量為12mg/kg，正的末梢-呼氣壓為2.5cm H2O，調(diào)節(jié)速率以使動脈PCO2維持在40mm Hg。通過切開股動脈在其中放置動脈線和肺動脈導(dǎo)管以進行血液動態(tài)監(jiān)測。有關(guān)該模型的詳細描述已經(jīng)公開(例如Welty-Wolf等，Am JResp Crit Care Med 1998；158610-619)。
在t＝0小時，以60分鐘的灌注給所有動物施用約109CFU/kg熱-滅活的大腸桿菌，12小時之后，即當t＝12小時時，在60分鐘內(nèi)灌注體積為50ml的1010CFU/kg活的大腸桿菌以誘導(dǎo)活大腸桿菌膿毒病。完成活大腸桿菌灌注后60分鐘，施用慶大霉素(3mg/kg靜脈內(nèi))和頭孢他定(1mg靜脈內(nèi))。必要時施用液體以維持肺毛細管契壓(PCWP)為8-12mmHg并保持血壓。當盡管補充了液體，平均動脈壓(MAP)仍降至65mmHg時，可使用多巴胺治療血壓過低。48小時(灌注活細菌之后36小時)之后，通過注射KCl深度麻醉并殺死動物。預(yù)先確定的終結(jié)標準包括難治療的血壓過低(MAP低于60mmHg)、血氧過少(需要FiO2大于40％)或難治療的代謝性酸中毒(PaCO2正常時pH＜7.10)。
血液動態(tài)監(jiān)測。每個小時記錄一次生理學(xué)參數(shù)，包括心率(HR)、溫度、動脈血壓、肺動脈壓、通風(fēng)設(shè)備參數(shù)和液體攝取量。按文獻報道(如Welty-Wolf等，Am J Resp Crit Care Med 1998；158610-619)，獲得每6個小時一次的心輸出量(CO)(通過熱稀釋)、中樞靜脈壓(CVP)、PCWP、動脈和混合的靜脈血氣體、氧飽和度、氧容量和血紅蛋白(Hgb)測量結(jié)果。每6個小時測量一次尿?qū)Ч芘判沽?，將液體平衡計算為總靜脈內(nèi)攝取量減去尿排泄量。
制備大腸桿菌。按文獻(7-10)的描述制備大腸桿菌(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD；血清型為086aK61)，將其調(diào)整為終劑量為每只狒狒1×1010CFU/kg(LD100)。通過在65℃水浴中將裝有細菌的試管加熱至少30分鐘以制備熱滅活的大腸桿菌。通過倒平板進行菌落計數(shù)，進一步證實細菌數(shù)目和熱滅活的效力。
對全血、血漿和血清的測量。在0，12，13，18，24，36和48小時取血樣。對全血進行全血計數(shù)(Sysmex-1000血細胞計數(shù)器，Sysmex，Inc.，Long Grove，IL)。分離血漿(從檸檬酸化的血液中)和血清并儲存于-80℃。使用ST4機械凝血分析儀(Diagnostiga Stago，Parsippany，NJ)測定血纖蛋白原。以雙份試驗重復(fù)測定凝血酶原時間(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)，在MDA凝血分析儀(Organon Teknika；Durham，NC)上用生色試驗測定抗凝血酶III(ATIII)活性，將結(jié)果表示為試劑盒標準的百分數(shù)。使用ELISA測定血漿凝血酶-抗凝血酶(TAT)復(fù)合物(Dade Behring，Deerfield，IL)以及血漿和BAL中的FVIIai水平(Novo Nordisk，Copenhagen)。使用ELISA試劑盒(R andD Systems，Inc.，Minneapolis，MN)檢測血清樣品中的白細胞介素1β(IL-1β)，IL-6，IL-8和TNF受體-1(TNFR-1)。用標準的臨床技術(shù)測定血液尿氮(BUN)和肌酸酐。
組織收集和制備。實驗后給動物開膛，結(jié)扎左邊的主支氣管，取出左肺。在左上方的肺葉上用240ml 0.9％的鹽水進行BAL。用手給取自左下方肺葉的肺組織樣品充氣，浸入4％多聚甲醛以進行光學(xué)顯微鏡檢查和免疫組織化學(xué)。從剩下的左肺中隨機取出4個樣品以測定濕/干重，取樣時要小心以避開大的血管和支氣管結(jié)構(gòu)。在液氮中快速冷凍其它取自肺、腎、肝臟、小腸、心臟和腎上腺的樣品，儲存于-80℃供Western印跡和生物化學(xué)研究用。在30cm的固定壓力下，用含2％戊二醛的0.85M甲次砷酸鈉緩沖液(pH7.4)將整個右肺充氣-固定15分鐘。通過浸入4％多聚甲醛固定其它取自腎、肝臟、小腸、心臟和腎上腺的組織。隨機選擇4份小腸樣品以測定濕/干重。
生物化學(xué)測定按文獻所述(如Caraway等，AM J Resp Crit Care1998，157938-949)測定肺勻漿液的髓過氧化物酶(MPO)活性和蛋白質(zhì)濃度，以及BAL液體的蛋白質(zhì)和乳酸脫氫酶(LDH)濃度。MPO活性被表示為光吸收值/分鐘/g濕重組織的變化。LDH值被表示為每升的活性單位(U/L)。
Western印跡在冰冷的裂解緩沖液(150mM NaCl，50mM Tris，pH7.61％SDS，3％ Nonidet P-40，5mM EDTA，1mM MgCl2，2mM 1，3-二氯異香豆素，2mM 1，10-菲咯啉，和0.4mM E-64)中勻漿肺樣品，15,000×g離心10分鐘。將上清液與Laemmli緩沖液混合，冷凍于-80℃。使用12％聚丙烯酰胺凝膠，在還原條件下進行電泳。將等量蛋白質(zhì)上樣于泳道，在Hoefer微量凝膠系統(tǒng)(Hoefer Scientific Instruments，San Francisco，CA)上進行電泳。轉(zhuǎn)移之后，使用抗-TF mAb(小鼠抗人，American Diagnostica，Greenwich，CT)和與HRP綴合的第二Ab(山羊抗小鼠，Transduction Laboratories，Lexington，KY)探測印跡中的TF表達。通過ECL檢測顯示信號，使用商用軟件(Quantity One，BioRad，Hercules，CA)測定印跡的密度。
組織學(xué)和免疫化學(xué)。將經(jīng)多聚甲醛固定的組織包埋于石蠟中，切片并用蘇木精和伊紅(H&E)染色，通過光學(xué)顯微鏡進行檢查。在肺、腎、腎上腺和小腸的石蠟切片上，使用mAb(抗-人血纖蛋白原β-鏈，AmericanDiagnostica，Greenwich，CT)進行血纖蛋白的免疫定位。所述Ab與血纖蛋白發(fā)生強烈反應(yīng)，與血纖蛋白原發(fā)生微弱反應(yīng)。用二甲苯去除切片(5微米)上的石蠟，并在分級醇中重新水合，清洗后于4℃同抗-血纖蛋白Ab保溫過夜。然后清洗切片，與生物素化的第二Ab保溫，用與過氧化物酶綴合的親和素和氨基聯(lián)苯胺顯示信號。按上述處理陰性對照，不同之處在于與非-免疫小鼠血清(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)進行初次保溫。
統(tǒng)計學(xué)。將數(shù)據(jù)輸入計算機電子數(shù)據(jù)表，使用商用軟件(StatView，Calabasas，CA)進行分析。通過二-因子ANOVA分析生理學(xué)數(shù)據(jù)和一系列血樣的數(shù)據(jù)。使用不成對的t-試驗分析實驗結(jié)束時獲得的BAL和組織的生化數(shù)據(jù)。圖和表中提供了平均值±sem和p值；可以認為p＜0.05是顯著的，還標明了p＜0.10的趨勢。
結(jié)果在灌注致死劑量的活大腸桿菌之前，死細菌能活化凝血和炎癥。就在施用活大腸桿菌之前，動物已患有輕微的凝血病，伴有與急性期反應(yīng)一致的TAT復(fù)合物和aPTT增加，血小板減少，和血纖蛋白原增加。炎癥介質(zhì)IL-6，IL-8和TNFR-1增加2-10倍。給這些動物灌注活細菌導(dǎo)致大面積的肺損傷、腎功能不全以及對其它重要器官，包括肝臟、小腸和腎上腺的損害。以不斷灌注的方式靜脈內(nèi)施用FVIIai能有效阻斷凝血和炎癥的進一步活化，防止器官損傷，并減少血管內(nèi)和血管外的血纖蛋白沉積。對肺和腎中血纖蛋白組織沉積的作用最顯著，而與經(jīng)載體治療的膿毒病對照相比，經(jīng)FVIIai治療的動物顯示出顯著改善的氣體交換和腎功能。未經(jīng)治療的膿毒病對照動物的肺中具有強TF上調(diào)，用FVIIai可以防止這種上調(diào)(p＜0.05，圖1)。測定血漿和BAL中的藥物水平，結(jié)果表明FVIIai侵入肺泡區(qū)室，其中實驗結(jié)束時BAL液體中的藥物水平為194.2±34.7ng/mg蛋白質(zhì)。表1顯示了血漿水平。下文提供了對這些動物中的FVIIai治療對肺和腎保護作用的分析。
膿毒病中的急性肺損傷。FVIIai治療能防止膿毒病-誘發(fā)的血氧過少、肺高血壓和肺系統(tǒng)順應(yīng)性損失。這些生理學(xué)數(shù)據(jù)示于圖2，以從t＝12小時至顯示出藥效時的變化作圖。在圖上以虛線表示早期未經(jīng)治療的動物(n＝11)和用TFPI治療的兩只膿毒病動物的歷史數(shù)據(jù)，其目的僅是為了進行比較(統(tǒng)計學(xué)分析中未包括這些數(shù)據(jù))。灌注滅活的細菌之后，兩組中的肺泡動脈氧梯度(AaDO2)增加，而在t＝12小時時，活細菌膿毒病發(fā)作之后，膿毒病對照組中的AaDO2逐漸惡化。膿毒病對照組中的一只動物需要補氧。用FVIIai治療能防止膿毒病過程中的氣體交換惡化(p＜0.0001)，與t＝12小時時相比，這些動物中的最終AaDO2實際上得以改善。FVIIai能減緩膿毒病誘發(fā)的平均肺動脈壓(PAM)和肺血管抗性kg(PVR*kg)的增加(對未經(jīng)治療的膿毒病對照而言p＜0.001和p＜0.02)。FVIIai也能防止可在膿毒病對照動物中觀察到的肺系統(tǒng)順應(yīng)性損失(p＜0.001)。類似地，在實驗過程中，無功能的間隙有所增加，兩組的分鐘通風(fēng)量(VE)都需要增加30-35％(表1)。將兩組的PaCO2控制在40mm Hg(對VE和PaCO2而言p＝NS)。
在死后，用FVIIai治療的動物的肺看上去很正常，類似于未損傷的、經(jīng)通風(fēng)處理的動物的肺。相反，膿毒病對照動物的肺增厚并有出血。在治療組中，有關(guān)肺濕/干重、嗜中性白細胞(PMN)積累和灌洗LDH的定量測量結(jié)果都有改善(圖3)。膿毒病對照中的肺濕/干重為5.81±0.19，而在經(jīng)FVIIai治療的動物中為5.05±0.09(p＜0.01，正常參照范圍為4.6-5.0)。BAL LDH幾乎降低60％(p＜0.01)，肺MPO活性降低40％以上(p＝0.07)。兩組的BAL蛋白沒有顯著不同。
肺組織學(xué)顯示出用FVIIai治療的膿毒病動物中的顯著保護作用。用抗-血纖蛋白抗體染色代表性的肺切片。膿毒病對照動物的肺具有增厚的肺泡間隔、斑狀肺泡水腫和出血、以及巨噬細胞和PMN的肺泡內(nèi)炎癥細胞浸潤?？?血纖蛋白染色顯示出沿著間隔、肺泡內(nèi)炎癥細胞上以及肺泡液中大面積擴散的血纖蛋白沉積。肺中的一些小管含有血纖蛋白塊。經(jīng)治療的動物的肺具有正常的肺泡間隔構(gòu)造、最小程度的肺泡PMN浸潤、而不具有肺水腫。在這些動物中，血纖蛋白的間隔染色是不均勻的，與膿毒病對照相比，面積較小。在經(jīng)治療的動物中，血纖蛋白染色經(jīng)常局限于緊鄰小管四周的區(qū)域，然而，血管內(nèi)血纖蛋白塊不明顯，肺泡巨噬細胞和血管內(nèi)單核細胞成為染色的焦點。
膿毒病中的腎和其它器官損害。FVIIai也能防止膿毒病中的腎衰竭(圖4)。膿毒病對照組中的血清肌酸酐加倍，但治療組中的血清肌酸酐正常(p＝0.05)。在未經(jīng)治療的動物中，灌注活大腸桿菌之后，尿排泄量相應(yīng)有所減少。相反，在治療組中，尿排泄量能維持或增加(p＜0.0001)。這不是復(fù)蘇的差異造成的，因為兩組中的液體平衡(圖4)和全身性血液動力學(xué)(表1)類似。在未經(jīng)治療的動物中，血液pH和血清[HCO3-]較低(分別為p＜0.001和p＜0.1，圖4)。
死亡后，未經(jīng)治療的動物的腎腫脹并出血，但在經(jīng)FVIIai治療的動物中，腎看上去是正常的。未經(jīng)治療的動物的腎H&E染色切片具有斑狀急性小管壞死(ATN)區(qū)域并且缺乏腎小球。經(jīng)治療動物的腎除了有少量ATN病灶外，顯示出正常的腎構(gòu)造。免疫染色顯示出膿毒病對照動物腎小球中的血纖蛋白沉積，伴有毛細管結(jié)構(gòu)閉合。小管上皮細胞也被染色，一些小管含有血纖蛋白為陽性的不定形物質(zhì)?？梢匀菀椎罔b定出被血纖蛋白塊阻塞的血管。在經(jīng)治療的動物中，未見腎小球血纖蛋白沉積，僅在幾只動物中觀察到最低程度的小管上皮細胞染色。
在經(jīng)FVIIai治療的動物中，腎上腺、肝臟和小腸的外觀正常。相反，未經(jīng)治療的動物的腎上腺腫脹并出血，小腸嚴重水腫。在未經(jīng)治療的動物中，小腸濕/干重較高，但腸損傷中的高變異性不允許組之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(治療組動物為6.36±0.51，而非治療組動物為8.30±1.13，p＝0.15)。與肺和腎中的血纖蛋白染色減少相反，在治療和非治療組膿毒病動物的腎上腺和小腸中觀察到集中的血纖蛋白沉積。盡管在用FVIIai治療的膿毒病動物中，腎上腺皮質(zhì)充血和出血以及小腸出血和水腫已被減輕。FVIIai對除肺以外的器官中的PMN含量沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著作用。在對照動物中，腎、肝臟和小腸中的MPO活性是可變的，兩組之間的差別在統(tǒng)計學(xué)上不顯著。
膿毒病-誘發(fā)的凝血病。與對照相比，在用FVIIai治療的膿毒病動物中，凝血的血管內(nèi)活化有所減弱(圖5)。最初的凝血參數(shù)值處于該物種的正常范圍。通過治療性阻斷凝血，藥物治療能如預(yù)期的那樣防止血漿血纖蛋白原耗盡(p＜0.0001)。在膿毒病對照中，施用活大腸桿菌之后，TAT復(fù)合物增加，13-18小時達到峰值，然后因AT III活性水平的降低而降低。在經(jīng)治療的動物中，TAT復(fù)合物的增加減緩(p＜0.0001)，然而，AT III活性的降低在統(tǒng)計學(xué)上沒有差異。盡管在未經(jīng)治療的膿毒病動物中，實驗后期的TAT水平降低，但凝血仍在這些狒狒中發(fā)展著。aPTT在這兩組中逐漸增加，但在未經(jīng)治療的動物中較高(p＜0.01)。因藥物對該試驗的作用，治療組中的PT較高，在藥物灌注過程中PT為53至67s(p＜0.0001)。在非治療組中，PT從12小時(灌注活大腸桿菌之前)時的17.8±0.4逐漸增加為實驗結(jié)束時的25.5±3.6。
在灌注了活的大腸桿菌之后，兩組動物都發(fā)展成為中性白細胞減少癥、血小板減少癥和貧血(見表1)。在灌注1小時之后(t＝13小時)，兩組中的WBC達到約1,500(×103/μl)的最低點，在實驗結(jié)束前，逐漸增加至接近基線水平(治療組動物為9,400±1,800，而非治療組動物為13,000±3,900，p＝0.08)。在灌注活大腸桿菌12小時(t＝24小時)之后，所有動物都患有血小板減少癥，實驗結(jié)束時兩組中的平均血小板計數(shù)為30,000或更少。類似地，兩組中的Hgb也有所降低，在任一組中都沒有顯著出血的跡象(表1)。
促炎細胞因子水平。用FVIIai治療能減緩炎癥細胞因子的升高(圖6)。灌注了活大腸桿菌之后，治療和非治療組動物中的IL-1β，IL-6，IL-8和TNFR-1的循環(huán)水平急速升高。兩組中的IL-6峰值水平?jīng)]有差異，但在經(jīng)FVIIai治療的動物中，IL-6降低地更快(p＜0.001)，并返回至在首次用于實驗的動物中發(fā)現(xiàn)的水平。類似地，與對照相比，IL-8和TNFR-1水平降低(p＜0.01和p＜0.001)。兩組中的IL-8水平?jīng)]有差異。
全身性血液動態(tài)參數(shù)。用FVIIai治療不會改變血液動態(tài)測量結(jié)果，包括HR，MAP，PCWP，CO/kg和全身性血管抗性*kg(SVR*kg)(表1)。在兩組動物中，低血壓對IV液體作出反應(yīng)；治療組的一只動物在灌注活細菌之后馬上需要低劑量的多巴胺。12只動物中有10只可以存活到該方案計劃好的終點。一只膿毒病對照動物在30小時時(灌注活細菌后18小時)死于ALI，伴有難治療的血氧過少和難治療的酸中毒，F(xiàn)VIIai治療組的一只動物在研究結(jié)束前3小時死于氣管內(nèi)插管的并發(fā)癥。在實驗過程中，每組中有兩只動物發(fā)展成為自身-受限的血尿，F(xiàn)VIIai治療組的一只動物死亡后，支氣管中間部有血塊。兩組中的大多數(shù)動物有一些與某些研究點的吸氣引液有關(guān)的染血分泌物。在兩組中都未出現(xiàn)嚴重的或威脅生命的出血并發(fā)癥。
TFPI灌注后的肺和腎損傷。為了進一步證實TF阻斷對大腸桿菌膿毒病中ALI的作用，以相同的實驗方法用TFPI治療兩只狒狒。灌注TFPI之后，阻斷了膿毒病中的凝血活化，血漿血纖蛋白原水平也得到類似的改善。這些動物中的最終血纖蛋白原水平(t＝48小時)為12小時數(shù)值的75％和95％。與FVIIai一樣，TFPI不會改變?nèi)硇匝簞討B(tài)參數(shù)。兩只動物的氣體交換和肺力學(xué)都得到保護(見圖2)。施用TFPI之后，肺組織的組織病理學(xué)和血纖蛋白免疫染色顯示出肺中減少的炎癥細胞浸潤、減小的間隔增厚和減弱的血纖蛋白沉積。與FVIIai治療組相同，施用TFPI之后，腎構(gòu)造正常，腎中沒有血纖蛋白染色。
表1

表1膿毒病對照和經(jīng)FVIIai治療的膿毒病組的全身性檢測結(jié)果。在t＝0小時灌注熱-滅活的細菌，在t＝12小時灌注活細菌。數(shù)據(jù)被表示為平均值±sem，用二因子ANOVA分析數(shù)據(jù)。以ng/ml血漿表示治療組中的FVIIai藥物水平?？s寫Temp(溫度℃)，Hgb(血紅蛋白)，VE(分鐘通風(fēng)量，L/分鐘)，HR(心率)，MAP(平均動脈壓，mmHg)，CO(心輸出量，L/分鐘)，DO2(氧傳遞，mL/分鐘)，VO2(氧消耗，mL/分鐘)，SVR(全身性血管抗性，達因×cm×kg/10)，PCWP(肺毛細管契壓，mmHg)。
權(quán)利要求
1.經(jīng)修飾的FVII用于制備治療人急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的藥物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，用于治療器官衰竭。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中器官是腎、肺、腎上腺、肝臟、小腸、心血管系統(tǒng)或止血系統(tǒng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中器官衰竭是肺衰竭。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的用途，用于維持或改善器官功能。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，用于治療肺高血壓。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，用于使前凝血質(zhì)活性降低或最小化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中前凝血質(zhì)活性與肺上皮細胞和組織巨噬細胞的組織因子表達有關(guān)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，用于使炎癥減弱或最小化。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，用于使IL-6和IL-8的產(chǎn)生減少或最小化。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，用于改善肺氣體交換。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，用于使肺水腫減弱或最小化。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，用于使肺蛋白滲漏減弱或最小化。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的用途，其中經(jīng)修飾的FVII是在催化三聯(lián)體中具有至少一個氨基酸殘基取代、插入或缺失的FVII。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其中經(jīng)修飾的FVII是在Ser344，Asp242和His193位具有至少一個氨基酸殘基取代、插入或缺失的FVII。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中的活性位點殘基Ser344被修飾，被Gly，Met，Thr取代，或更優(yōu)選被Ala取代。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的用途，其中經(jīng)修飾的FVII是通過與絲氨酸蛋白酶抑制劑反應(yīng)而被修飾的FVIIa。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其中的蛋白酶抑制劑是有機磷化合物，磺酰氟，肽鹵甲基酮或氮雜肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中的蛋白酶抑制劑是選自下列的肽鹵甲基酮丹磺酰-L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其中的蛋白酶抑制劑是D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
21.經(jīng)修飾的FVII用于制備防止或最小化與人ALI或ARDS相關(guān)的慢性器官衰竭的藥物的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，其中在施用經(jīng)修飾的FVII之前確證ALI或ARDS。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的用途，其中的器官衰竭是腎、肺、腎上腺、肝臟、小腸、心血管系統(tǒng)或止血系統(tǒng)的衰竭。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的用途，其中的器官衰竭是肺衰竭。
25.根據(jù)權(quán)利要求21至24中任一項的用途，其中經(jīng)修飾的FVII是在催化三聯(lián)體中具有至少一個氨基酸殘基取代、插入或缺失的FVII。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中經(jīng)修飾的FVII是在Ser344，Asp242和His193位具有至少一個氨基酸殘基取代、插入或缺失的FVII。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其中的活性位點殘基Ser344被修飾，被Gly，Met，Thr取代，或更優(yōu)選被Ala取代。
28.根據(jù)權(quán)利要求21至24中任一項的用途，其中經(jīng)修飾的FVII是通過與絲氨酸蛋白酶抑制劑反應(yīng)而被修飾的FVIIa。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的用途，其中蛋白酶抑制劑是有機磷化合物，磺酰氟，肽鹵甲基酮或氮雜肽。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的用途，其中蛋白酶抑制劑是選自下列的肽鹵甲基酮丹磺酰-L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的用途，其中蛋白酶抑制劑是D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
32.治療人急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的方法，所述方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的經(jīng)修飾的FVII。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，用于治療器官衰竭。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中的器官衰竭是腎、肺、腎上腺、肝臟、小腸、心血管系統(tǒng)或止血系統(tǒng)的衰竭。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中的器官衰竭是肺衰竭。
36.根據(jù)權(quán)利要求32至35中任一項的方法，用于維持或改善器官功能。
37.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，用于治療肺高血壓。
38.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，用于使前凝血質(zhì)活性降低或最小化。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中的前凝血質(zhì)活性與肺上皮細胞和組織巨噬細胞的組織因子表達有關(guān)。
40.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，用于使炎癥減弱或最小化。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，用于使IL-6和IL-8的產(chǎn)生減少或最小化。
42.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，用于改善肺氣體交換。
43.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，用于使肺水腫減弱或最小化。
44.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，用于使肺蛋白滲漏減弱或最小化。
45.根據(jù)權(quán)利要求32至44中任一項的方法，其中經(jīng)修飾的FVII是在催化三聯(lián)體中具有至少一個氨基酸殘基取代、插入或缺失的FVII。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中經(jīng)修飾的FVII是在Ser344，Asp242和His193位具有至少一個氨基酸殘基取代、插入或缺失的FVII。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中的活性位點殘基Ser344被修飾，被Gly，Met，Thr取代，或更優(yōu)選被Ala取代。
48.根據(jù)權(quán)利要求32至44中任一項的方法，其中經(jīng)修飾的FVII是通過與絲氨酸蛋白酶抑制劑反應(yīng)而被修飾的FVIIa。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中的蛋白酶抑制劑是有機磷化合物，磺酰氟，肽鹵甲基酮或氮雜肽。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中的蛋白酶抑制劑是選自下列的肽鹵甲基酮丹磺酰-L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中的蛋白酶抑制劑是D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
52.防止或最小化與人ALI或ARDS相關(guān)的慢性器官衰竭的方法，所述方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的經(jīng)修飾的FVII。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中在施用經(jīng)修飾的FVII之前確證ALI或ARDS。
54.根據(jù)權(quán)利要求52或53的方法，其中的器官衰竭是腎、肺、腎上腺、肝臟、小腸、心血管系統(tǒng)或止血系統(tǒng)的衰竭。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中的器官衰竭是肺衰竭。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的VII因子用于制備治療人急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的藥物的用途。
文檔編號A61P7/00GK1522151SQ02813430
公開日2004年8月18日 申請日期2002年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月2日
發(fā)明者米雷拉·埃茲本, 史蒂文·艾德爾, 克勞德·A·皮安塔多西, A 皮安塔多西, 艾德爾, 米雷拉 埃茲本 申請人:諾沃挪第克公司