專利名稱：Vhh單重鏈抗體及其在哺乳動物中的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于在哺乳動物中生產(chǎn)單鏈免疫球蛋白的方法，具體地講，本發(fā)明涉及一種用于在哺乳動物中生產(chǎn)單鏈駱駝VHH抗體的方法。還披露了用本發(fā)明方法生產(chǎn)的單鏈抗體及其用途。
本發(fā)明背景抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括兩個獨(dú)立的區(qū)域重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL它可能是Vκ或Vλ)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)本身是由6個多肽環(huán)形成的三個來自VH結(jié)構(gòu)域(H1，H2和H3)，三個來自VL結(jié)構(gòu)域(L1，L2和L3)。編碼VH和VL結(jié)構(gòu)域的V基因的多種主要成分是通過基因片段的組合性重排產(chǎn)生的。VH基因是通過三個基因片段VH，D和JH的重組產(chǎn)生的。在人體內(nèi)，根據(jù)單倍型，存在大約51種功能性VH片段(Cook和Tomlinson(1995)Immunol Today，16237)，25種功能性D片段(Corbett等(1997)J.Mol.Biol.，26869)和6種功能性JH片段(Ravetch等(1981)Cell，27583)。VH片段編碼形成VH結(jié)構(gòu)域的第一和第二抗原結(jié)合環(huán)的多肽鏈的區(qū)(H1和H2)，而VH，D和JH片段組合形成VH結(jié)構(gòu)域第三個抗原結(jié)合環(huán)(H3)。VL基因是通過僅有2個基因片段VL和JL的重組產(chǎn)生的。在人體內(nèi)，根據(jù)單倍型，有大約40種功能性Vκ片段(Schable和Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，3741001)，31種功能性Vλ片段(Williams等(1996)JMol.Biol.，264220；Kawasaki等(1997)Genome Res.，7250)，5個功能性Jκ片段(Hieter等(1982)J.Biol.Chem.，2571516)和4種功能性Jλ片段(Vasicek和Leder(1990)J.Exp.Med.，172609)。VL片段編碼多肽鏈的形成VL結(jié)構(gòu)域的第一和第二抗原結(jié)合環(huán)(L1和L2)的區(qū)域，而VL和JL片段組合形成VL結(jié)構(gòu)域的第三個抗原結(jié)合環(huán)(L3)。據(jù)信，選自這種主要成分的抗體具有足夠的多樣性，以便至少以中等親和力結(jié)合幾乎所有的抗原。高親和力抗體是通過重排基因的“親和力成熟”產(chǎn)生的，其中，由免疫系統(tǒng)根據(jù)改善了的結(jié)合，產(chǎn)生并且選擇點(diǎn)突變。
重鏈基因座包括大量的可變鏈基因(VH；實(shí)際上不是完整基因，但包含第一編碼外顯子加上轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))，這些基因重組到兩個短的編碼區(qū)D和J(被稱作VDJ重組)，這兩個編碼區(qū)位于編碼重鏈Cμ的恒定區(qū)的外顯子前面，得到被稱作IgM的完整抗體重鏈區(qū)。隨后發(fā)生了類轉(zhuǎn)換，其中，所述可變區(qū)與位于IgM恒定區(qū)下游的另一個恒定區(qū)重組，得到IgD，IgG，IgA和IgE(由位于Cμ基因下游的各種Cδ，Cγ，Cα，Cε的外顯子編碼)。在該過程中缺失了間插的恒定區(qū)。在所述輕鏈基因座，κ基因座中發(fā)生了類似過程，并且，當(dāng)這一過程不會導(dǎo)致在λ基因座中產(chǎn)生抗體時發(fā)生(有關(guān)綜述參見Rajewski，K.，Nature381，p751-758，1996；深入的綜述參見免疫學(xué)教科書，Janeway，C.，Travers，P.，Walport，M.，Capra.J.，Current BiologyPublications/Churchill Livingstone/Garland Publishing，fourthedition，1999，ISBN 0-8153-3217-3)。
駱駝類(雙峰駝，單峰駝和無峰駝)除了正常的重鏈和輕鏈抗體(在一個抗體中具有兩條輕鏈和兩條重鏈)之外，還包括單鏈抗體(僅含有重鏈)。這種抗體是由一套被稱為VHH基因的獨(dú)特的VH片段編碼的。單鏈抗體的抗原結(jié)合與在常規(guī)抗體上出現(xiàn)的抗原結(jié)合不同，不過，以相同方式獲得了高的親和力，即通過可變區(qū)的高變和表達(dá)所述高親和力抗體的細(xì)胞的選擇(親和力成熟)。VH和VHH分散在基因組內(nèi)(即它們彼此之間是混合出現(xiàn)的)。在VH和VHH cDNA中的相同D片段的鑒定表明，VH和VHH共同使用了D片段。含有VHH的天然抗體缺少重鏈恒定區(qū)的CH1結(jié)構(gòu)域。編碼CH1結(jié)構(gòu)域的外顯子存在于所述基因組中，但是由于缺少位于CH1外顯子5’側(cè)的功能性剪接受體序列而被剪接掉。結(jié)果，VDJ區(qū)被剪接到CH2外顯子上。當(dāng)VHH重組到所述恒定區(qū)(CH2，CH3)上時，就產(chǎn)生了一種起著單鏈抗體作用的抗體(即有兩條重鏈，沒有輕鏈相互作用的抗體)?？乖Y(jié)合與常規(guī)抗體的抗原結(jié)合不同，但是以相同的方式獲得了高親和力，即通過可變區(qū)的高變和表達(dá)所述高親和力抗體的細(xì)胞的選擇而獲得。
業(yè)已使用NMR和X光晶體學(xué)技術(shù)測定了分離的VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)(Spinell等，(1996)，Nat Structural biol. 3，752)。數(shù)據(jù)表明，在駱駝VHH結(jié)構(gòu)域中很好地保留了免疫球蛋白折疊。兩個β折疊(一個具有四個β鏈，而另一個具有五個β鏈)彼此堆積在一起，并且通過C22和C92之間的保守的結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定化。駱駝VHH結(jié)構(gòu)域的側(cè)面相當(dāng)于Fv中的正常VH上的VL界面，它具有差別很大的結(jié)構(gòu)。與人VH相比，在該區(qū)域具有四個氨基酸取代。
通過檢查所有人和小鼠VH抗原結(jié)合環(huán)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)僅有有限數(shù)量的可能的構(gòu)像。分別披露了第一和第二抗原結(jié)合環(huán)的三種和四種不同的構(gòu)像。這種規(guī)范結(jié)構(gòu)是通過所述環(huán)的長度和特定殘基在關(guān)鍵位點(diǎn)上的存在決定的。H3環(huán)在長度和序列方面是高度可變的(Wu等(1993)Proteinsstructure，funct and genet.，16，1)。令人驚奇的是，駱駝VH結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合環(huán)背離了人和小鼠VHH結(jié)構(gòu)域的規(guī)范環(huán)定義。這種背離是無法預(yù)測的，因?yàn)樵隈橊刅H和人VH之間環(huán)的長度和關(guān)鍵位點(diǎn)上的殘基是非常類似的。駱駝VH結(jié)構(gòu)域中的所述額外規(guī)范環(huán)結(jié)構(gòu)使得其抗原互補(bǔ)位的結(jié)構(gòu)成分大于來自常規(guī)抗體的Fv片段中的VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)成分。另外，與人或小鼠抗體相比，第一抗原結(jié)合環(huán)周圍的高變區(qū)被擴(kuò)大了。人們認(rèn)為，與常規(guī)抗體上的VH相比第一可變區(qū)的延長，和同時出現(xiàn)的抗原結(jié)合表面的擴(kuò)大，部分補(bǔ)償了VL結(jié)構(gòu)域的缺乏(Riechmann，L. & Muyldermans，S(1999)，231 25-38)。
單結(jié)構(gòu)域駱駝VHH抗體，以及比更大的重鏈和輕鏈抗體分子更適合于結(jié)構(gòu)分析，還提供了一種小而有效的抗原結(jié)合單位。這種抗體具有多種和可變的治療潛力。另外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，駱駝單鏈抗原能結(jié)合同時具有重鏈和輕鏈的抗體無法接觸的抗原。人們認(rèn)為這種能力是由于存在一個大的具有10個或10個以上氨基酸的突出的第三高變環(huán)，該高變環(huán)可以插入抗原表面的溝槽內(nèi)。這一點(diǎn)是特別重要的，因?yàn)槊傅拇呋稽c(diǎn)通常位于其蛋白表面的最大的溝槽內(nèi)(Ladowski，R.A(1996).Protein Science 5，2438)。所述位點(diǎn)對于常規(guī)抗體來說通常不是免疫原性的(Novotny，J等，(1986)Proc Nat Acad Sci USA，83，226)。在駱駝VHH cAb-Lys3的結(jié)構(gòu)中，24個殘基的H3環(huán)深深地穿透進(jìn)入溶菌酶的活性位點(diǎn)(Transue，T.R等(1998)ProtStructure，F(xiàn)unctand Genet，32，515)，這表明駱駝重鏈抗體具有形成特異性酶抑制劑的潛力。
最近，業(yè)已在細(xì)菌中制備了分離的駱駝VHH結(jié)構(gòu)域(Riechmann，L等Journal of Immunological Methods 231(1999)，25-38)。不過，細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)具有不能進(jìn)行翻譯后修飾的缺陷。所述修飾，特別是糖基化事件對于抗體有效行使功能來說是重要的，特別是在體內(nèi)環(huán)境下更是如此。
在相同的研究中，將編碼駱駝VHH結(jié)構(gòu)域的基因插入了表達(dá)載體內(nèi)，并且在Cos細(xì)胞中表達(dá)，以便制備多結(jié)構(gòu)域蛋白。在一種例子中，通過將特定的駱駝VHH克隆在人IgG1的鉸鏈和效應(yīng)功能結(jié)構(gòu)域之前，制備了僅有完整的單重鏈的抗體。在Cos細(xì)胞中的表達(dá)與細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)相比所具有的優(yōu)點(diǎn)是，在這些細(xì)胞中發(fā)生了翻譯后修飾事件。與之一致的是，發(fā)現(xiàn)所述抗體在抗原結(jié)合方面具有完整活性。用于制備所述構(gòu)建體的DNA通常是從用B細(xì)胞制備的成熟抗體(即經(jīng)歷了親和力成熟的抗體)中分離的。盡管在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的所述單鏈抗體在體外環(huán)境下能夠結(jié)合一個或多個抗原，但是它們不能進(jìn)行類(同種型)轉(zhuǎn)換和親和力成熟(高變)過程。因此，在Cos細(xì)胞中表達(dá)的單鏈抗體不能經(jīng)歷在哺乳動物中產(chǎn)生的天然存在的抗體的抗體進(jìn)化過程。正是這種抗體進(jìn)化過程導(dǎo)致了能以高親和力結(jié)合的特異性抗體的產(chǎn)生。因此，本領(lǐng)域仍然需要一種可以在哺乳動物中制備單鏈VHH抗體的方法，以便可以進(jìn)行正常的抗體進(jìn)化過程。
另外，業(yè)已通過噬菌體展示技術(shù)，選擇并且表達(dá)了駱駝單鏈抗體(Riechmann，L. & Davies，S.J.Bio.mol.NMR，6，141)。另外，盡管所述抗體構(gòu)建體是用從成熟的B細(xì)胞或體細(xì)胞中分離的核酸制備的，因此，與上述情形相同，所表達(dá)的抗體不能經(jīng)歷類轉(zhuǎn)換，和體細(xì)胞高變(親和力成熟)，這種變化是生產(chǎn)能以選擇性和高親和力結(jié)合其抗原的特殊抗體所必須的。
本發(fā)明人認(rèn)為，如果能夠了解在B細(xì)胞早期抗體發(fā)育階段駱駝單鏈抗體分子進(jìn)化的機(jī)制(類轉(zhuǎn)換和親和力成熟)，就可以在體內(nèi)重建該系統(tǒng)。這樣就可以制備大量的進(jìn)化單鏈抗體，用于結(jié)構(gòu)、治療和診斷應(yīng)用。
發(fā)明概述包括重鏈和輕鏈的抗體分子在B細(xì)胞發(fā)育期間進(jìn)行類轉(zhuǎn)換。骨髓中的發(fā)育的B細(xì)胞首先表達(dá)膜結(jié)合IgM。在發(fā)育期間，表達(dá)了分泌型IgG。對于具有輕鏈和重鏈的抗體來說，將J區(qū)重組到Cμ區(qū)上，以便產(chǎn)生包括VHH，D和J區(qū)的IgM。通過轉(zhuǎn)變成不同的重鏈恒定區(qū)，使IgM生產(chǎn)細(xì)胞進(jìn)一步成熟，以便產(chǎn)生例如IgA。重組機(jī)制包括與IgM的VH部分重組的假輕鏈，所述假輕鏈存在于早期B細(xì)胞系。
本發(fā)明人認(rèn)為，了解在前B細(xì)胞發(fā)育期間單鏈抗體類轉(zhuǎn)換和/或發(fā)生親和力成熟(抗體進(jìn)化)的機(jī)制，可以制備本文所定義的VHH基因座，它會導(dǎo)致特異性單鏈VHH抗體的產(chǎn)生，這種抗體經(jīng)歷了與在其天然環(huán)境中產(chǎn)生的駱駝抗體相似或相同的進(jìn)化過程。
因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于在哺乳動物中生產(chǎn)VHH單重鏈抗體的方法，包括在所述哺乳動物中表達(dá)異源VHH重鏈基因座的步驟。
VHH重鏈基因座優(yōu)選包括(a)至少一個各自包括一個VHH外顯子的VHH區(qū)，至少一個各自包括一個D外顯子的D區(qū)，和至少一個各自包括一個J外顯子的J區(qū)，其中，所述VHH區(qū)，D區(qū)和J區(qū)能夠重組形成VDJ編碼序列。
(b)包括至少一個Cγ恒定重鏈基因和至少一個Cμ恒定重鏈基因的恒定重鏈區(qū)，并且當(dāng)它表達(dá)時，既不表達(dá)功能性CH1結(jié)構(gòu)域，也不表達(dá)功能性CH4結(jié)構(gòu)域，并且，當(dāng)所述基因座表達(dá)時，能夠形成完整的單重鏈IgG分子(scIgG)。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種在哺乳動物中生產(chǎn)駱駝化VH單重鏈抗體的方法，包括在所述哺乳動物中表達(dá)駱駝化VH重鏈基因座的步驟。
所述駱駝化VH重鏈基因座優(yōu)選包括(a)各自包括一個VH外顯子的VH區(qū)，該VH外顯子是突變的，以便其核酸序列與駱駝VHH外顯子(‘駱駝化VH外顯子’)相同，包括一個D外顯子的D區(qū)，和包括一個J外顯子的J區(qū)，其中，所述VH區(qū)，D區(qū)和J區(qū)能夠重組形成VDJ編碼序列，和(b)包括至少一個Cγ恒定重鏈基因和至少一個Cμ恒定重鏈基因的恒定重鏈區(qū)，并且當(dāng)它表達(dá)時，既不表達(dá)功能性CH1結(jié)構(gòu)域，也不表達(dá)功能性CH4結(jié)構(gòu)域，并且，當(dāng)所述基因座表達(dá)時，能夠形成完整的單重鏈IgG分子(scIgG)。
在本發(fā)明這一方面的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因座包括一個或多個FRT(flp重組靶)位點(diǎn)(http//www.esb.utexus.edu)，以及兩個或兩個以上LoxP位點(diǎn)(它是由兩個13bp的反向重復(fù)序列組成的，這兩個重復(fù)序列通過8bp的非對稱間隔區(qū)隔開)(Brian Sauer，Methods of Enzymology；1993，Vol 225，890-900)根據(jù)本發(fā)明，在一個基因座中優(yōu)選存在至少兩個lox位點(diǎn)。
FRT位點(diǎn)在所述基因座中的存在，使得能夠產(chǎn)生單拷貝轉(zhuǎn)基因，而Lox位點(diǎn)的存在，使得在必要時缺失IgM和IgD重鏈基因。
本發(fā)明人業(yè)已證實(shí)，對于單重鏈抗體來說，發(fā)生了形成scAb(完整的單重鏈抗體多肽鏈)的類轉(zhuǎn)換，該機(jī)制包括將步驟(a)的J區(qū)與步驟(b)的Cμ重鏈基因重組，以便首先形成膜結(jié)合IgM(使用CH4外顯子，而不是CH3外顯子)。這種中間產(chǎn)物構(gòu)成了生產(chǎn)可溶性IgM的基礎(chǔ)(使用CH3外顯子，而不是CH4外顯子)。然后使諸如Cδ，Cα，Cγ的另一種恒定區(qū)發(fā)生類轉(zhuǎn)換，以便導(dǎo)致諸如IgD，IgA，IgG等的產(chǎn)生。
對于本發(fā)明來說，所述哺乳動物不是人。所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物優(yōu)選比駱駝小，并且容易維持并且用需要的抗原進(jìn)行免疫。理想的是，所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物是嚙齒類動物，如兔、豚鼠、大鼠或小鼠。特別優(yōu)選的是小鼠。還可以使用其他哺乳動物，包括山羊、綿羊、貓、狗和其他家養(yǎng)和野生哺乳動物。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法表達(dá)單鏈抗體時，優(yōu)選使哺乳動物的內(nèi)源重鏈基因座缺失或沉默。用于實(shí)現(xiàn)后一種目的的合適技術(shù)披露于以下文獻(xiàn)中WO00/26373或WO96/33266和(Li和Baker(2000)Genetics156(2)809-821；Kitamura和Rajewsky(1992)；Kitamura和Rajewsky，(1992)Nature356，154-156)。
本發(fā)明所使用的術(shù)語‘VHH單重鏈抗體’表示僅由重鏈(通常為2個)組成的抗體分子，并且不包括任何輕鏈。每一個重鏈包括一個可變區(qū)(由VHH，D和J外顯子編碼)和一個恒定區(qū)。恒定區(qū)還包括一定數(shù)量的CH(恒定重鏈結(jié)構(gòu)域)，它優(yōu)選包括兩個一個CH2結(jié)構(gòu)域和一個CH3結(jié)構(gòu)域，它們是由一個恒定區(qū)基因編碼的。本文所定義的VHH單鏈抗體不具備功能性CH1結(jié)構(gòu)域，并且還缺乏功能性CH4結(jié)構(gòu)域。正是由于功能性CH1結(jié)構(gòu)域的缺乏(在常規(guī)抗體中，具有用于錨定輕鏈恒定區(qū)的錨定部位)，導(dǎo)致了本發(fā)明的重鏈抗體不能與輕鏈結(jié)合，以便形成常規(guī)抗體。
本發(fā)明的術(shù)語‘駱駝化(camelised)VH單重鏈抗體’表示僅由重鏈(通常為2條)組成的抗體分子，并且不包括任何輕鏈。每一個重鏈包括一個可變區(qū)(由‘駱駝化VH外顯子’D和J外顯子編碼)和一個恒定區(qū)。恒定區(qū)包括至少一個恒定區(qū)基因。每一個恒定區(qū)基因包括多個恒定區(qū)外顯子，每一個外顯子編碼一個恒定區(qū)CH結(jié)構(gòu)域。一般，恒定區(qū)包括兩個CH結(jié)構(gòu)域一個CH2結(jié)構(gòu)域和一個CH3結(jié)構(gòu)域。本文所定義的駱駝化VH單鏈抗體不具有功能性CH1結(jié)構(gòu)域，此外，它還缺乏功能性CH4結(jié)構(gòu)域。正是由于功能性CH1結(jié)構(gòu)域的缺乏(在常規(guī)抗體中，具有用于錨定輕鏈恒定區(qū)的錨定部位)，導(dǎo)致了本發(fā)明的重鏈抗體不能與輕鏈結(jié)合，以便形成常規(guī)抗體。
在本發(fā)明中，術(shù)語‘異源’表示本文所定義的VHH重鏈基因座不是所述哺乳動物內(nèi)源的。就是說，當(dāng)所述哺乳動物是駱駝類，即雙峰駝或無峰駝時，所述表達(dá)是正常情況下不存在于雙峰駝或無峰駝體內(nèi)的VHH基因座的表達(dá)。
本發(fā)明的‘VHH重鏈基因座’由一個‘VHH區(qū)’，一個‘J區(qū)’，一個‘D區(qū)’和一個‘恒定重鏈區(qū)’組成。每一個VHH區(qū)包括一個VHH外顯子，每一個J區(qū)包括一個J外顯子，而每一個D區(qū)包括一個D外顯子，并且每一個重鏈恒定區(qū)包括一個或多個重鏈恒定區(qū)基因。另外，每一個VHH區(qū)基本上不包括一個或多個功能性VH外顯子。
本發(fā)明的‘VHH外顯子/區(qū)’表示天然存在的VHH編碼序列，如存在于駱駝體內(nèi)的編碼序列及其任何同源物，衍生物或片段，只要當(dāng)所述核酸表達(dá)時所得到的外顯子/區(qū)能與本發(fā)明的D外顯子/區(qū)，J外顯子/區(qū)和恒定重鏈區(qū)(包括若干外顯子)重組，以便產(chǎn)生本文所定義的VHH單鏈抗體。
本發(fā)明的‘駱駝化VH重鏈基因座’由本文所定義的一個‘駱駝化VH區(qū)’，一個‘J區(qū)’，一個‘D區(qū)’和一個‘恒定重鏈區(qū)’組成。每一個駱駝化VH區(qū)包括一個駱駝化VH外顯子，每一個J區(qū)包括一個J外顯子，而每一個D區(qū)包括一個D外顯子，并且每一個重鏈恒定區(qū)包括一個或多個重鏈恒定區(qū)外顯子。
本發(fā)明的‘駱駝化VH外顯子/區(qū)’表示源于除了駱駝以外的哺乳動物的天然存在的VH編碼序列，例如，發(fā)生了突變的人VH編碼序列，以便所述序列與駱駝外顯子的序列相同。本發(fā)明的駱駝化VH外顯子在其范圍內(nèi)還包括所述外顯子的任何同源物，衍生物或片段，只要外顯子/區(qū)能與D區(qū)/外顯子，J區(qū)/外顯子和包括本發(fā)明的一個或多個外顯子的恒定重鏈區(qū)重組，以便產(chǎn)生本文所定義的駱駝化VH單鏈抗體。
VHH和VH外顯子可以來自天然存在的來源，或者它們可以是用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的并且在本文中所披露的方法合成的。
同樣，在本發(fā)明中，術(shù)語‘D外顯子’和‘J外顯子’包括天然存在的D和J外顯子序列，這些序列存在于駱駝或其他哺乳動物物種中。術(shù)語D外顯子和J外顯子的范圍內(nèi)還包括它的衍生物，同源物和片段，因?yàn)樗玫降耐怙@子能與本文所披露的重鏈抗體基因座的其余部分重組(駱駝化VH或VHH)，以便產(chǎn)生本文所披露的單鏈抗體。D和J外顯子/區(qū)可源于天然存在的來源或可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的、并且披露于本文中的方法合成。
另外，本發(fā)明的重鏈抗體基因座(VHH或駱駝化VH)包括編碼恒定重鏈多肽的DNA區(qū)(恒定重鏈區(qū))的DNA。
每一個恒定重鏈區(qū)主要包括至少一個恒定區(qū)重鏈基因，該基因是Cγ，以便可以產(chǎn)生單鏈IgG。每一個恒定重鏈基因包括一個或多個恒定重鏈外顯子，它可以是來源于駱駝或非駱駝的，并且是從Cμ、Cδ，Cγ1-4，Cε和Cα1-2中選擇的。在本發(fā)明的重鏈抗體基因座中的至少一個重鏈恒定區(qū)外顯子優(yōu)選是源于人、小鼠或兔的。優(yōu)選至少一個C γ重鏈外顯子是源于人的。在表達(dá)時，所述恒定重鏈區(qū)缺少存在于雙鏈抗體中的功能性CH1和CH2結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選在本發(fā)明的恒定重鏈區(qū)中只存在一個或多個具有修飾過的(無功能的)CH1結(jié)構(gòu)域的Cγ2和/或Cγ3基因。
本文所定義的‘恒定重鏈基因座外顯子’(‘CH外顯子’)包括天然存在的CH外顯子序列，如存在于駱駝類或人或包括兔和小鼠在內(nèi)的其他哺乳動物中的CH外顯子。術(shù)語‘CH外顯子’的范圍還包括它的衍生物、同源物和片段，只要當(dāng)它是恒定重鏈區(qū)的成分時，CH外顯子能夠形成功能性單重鏈抗體(包括由VHH外顯子或駱駝化VH外顯子編碼的區(qū))。
一般，CH基因包括三個或四個外顯子(CH1-CH4)，它能編碼每一個恒定重鏈多肽的不同結(jié)構(gòu)域，通常由兩個多肽構(gòu)成本文所定義的單重鏈抗體。不過，正如上文所披露的，VHH和駱駝化VH單鏈抗體不具有功能性CH1(含有輕鏈結(jié)構(gòu)域錨定區(qū))或CH4。因此，本發(fā)明的單重鏈抗體基因座具有一個或多個不能表達(dá)功能性CH1或CH4結(jié)構(gòu)域的基因。這種現(xiàn)象可能通過所述恒定重鏈區(qū)基因的CH1和CH4外顯子的突變、缺失、取代或其他處理產(chǎn)生。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，單鏈VHH基因座包括至少一個恒定重鏈基因，其中編碼CH1和CH4的結(jié)構(gòu)域的核酸是突變、缺失或取代或以其他方式處理過的，以便所表達(dá)的本文所定義的VHH單鏈抗體的恒定重鏈不包括功能性CH1結(jié)構(gòu)域和CH4結(jié)構(gòu)域。
為了消除疑問，上文所提到的術(shù)語‘來源于兔的’或‘來源于人的’，表示包括本發(fā)明的重鏈抗體基因座(駱駝化VH或VHH)的一個或多個外顯子的核酸序列與一個或多個天然存在的兔或人抗體基因座外顯子相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，所述外顯子可源于天然來源，或者可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的和本文所披露的方法合成。
每一個VHH或‘駱駝化VH區(qū)’分別包括一個VHH外顯子或‘駱駝化VH外顯子’，每一個J區(qū)和D區(qū)分別包括一個J和D外顯子。優(yōu)選的是，每一個重鏈基因座包括一個以上，兩個以上，三個以上，四個以上，五個以上，六個以上J和/或D區(qū)外顯子。最優(yōu)選的是，本發(fā)明的VHH基因座或駱駝化VH基因座包括與駱駝相同數(shù)量的VHH外顯子/區(qū)和/或D外顯子/區(qū)和/或J外顯子/區(qū)。
優(yōu)選的是，本發(fā)明這一方面的方法是通過表達(dá)VHH重鏈基因座或駱駝化VH重鏈基因座生產(chǎn)單鏈抗體，所述基因座包括一個或多個本文所定義的來源于人、兔或小鼠的恒定重鏈外顯子。就是說，本發(fā)明的單重鏈抗體優(yōu)選是通過雜合的駱駝/人基因座或雜合的駱駝/兔基因座或雜合的駱駝/小鼠基因座的表達(dá)產(chǎn)生的。在本發(fā)明這一方面的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法表達(dá)的單重鏈基因座包括來源于駱駝的所有VHH外顯子和來源于人、兔或小鼠的所有D、J和恒定重鏈區(qū)外顯子。在本發(fā)明這一方面的另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法表達(dá)的單重鏈基因座包括所有駱駝化VH外顯子，和來源于人或兔或小鼠的所有D、J和恒定重鏈區(qū)外顯子。
在本發(fā)明上述方面的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述重鏈基因座還包括一個或多個盒位點(diǎn)，所述位點(diǎn)允許基因座從一個載體裝盒(cassetting)到另一個載體中。優(yōu)選一個或多個盒位點(diǎn)位于所述基因座的5’前導(dǎo)序列中和/或位于所述基因座的3’非翻譯區(qū)。優(yōu)選有一個或多個盒位點(diǎn)同時位于所述基因座的5’前導(dǎo)序列中和所述基因座的3’非翻譯區(qū)。例如，所述直接裝盒，允許將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)菌表達(dá)載體中，以便添加標(biāo)記和信號等。
上述所披露的這種用于制備雜合單重鏈抗體的方法可以特別適用于制備用于人治療的抗體，通常將抗體施用于與所述抗體的來源不同的脊椎動物時，導(dǎo)致出現(xiàn)針對所施用抗體的免疫應(yīng)答。因此，雜合的駱駝/人單鏈抗體在給人施用時很可能比駱駝單鏈抗體具有更低的免疫原性。
在本發(fā)明中，所述抗體包括基本上相同的成分?；旧舷嗤硎揪哂谐^80％的同源性，更優(yōu)選超過85％，90％，95％的同源性。更優(yōu)選超過96％，97％，98％的同源性。最優(yōu)選的是，基本上相同表示突變的人VH區(qū)與駱駝VHH區(qū)的同源性超過99％。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種可以通過本發(fā)明方法獲得的VHH單重鏈抗體，其中，所述抗體的由VHH外顯子編碼的部分是由來源于駱駝的外顯子編碼，而所述抗體分子的其余部分是由來源于人的外顯子編碼。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種可以通過本發(fā)明方法獲得的VHH單重鏈抗體，其中，所述抗體的由VHH外顯子編碼的部分是由來源于駱駝的外顯子編碼的，而恒定重鏈區(qū)是由來源于兔的一個或多個外顯子編碼的。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種可以通過本發(fā)明方法獲得的VHH單重鏈抗體，其中，所述抗體的由VHH外顯子編碼的部分是由來源于駱駝的外顯子編碼的，而恒定重鏈區(qū)是由來源于小鼠的一個或多個外顯子編碼的。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種可以通過本發(fā)明方法獲得的駱駝化單重鏈抗體。
優(yōu)選的是，本發(fā)明這一方面的駱駝化VH單重鏈抗體完全是由本文所定義的來源于人的外顯子編碼的。
在本發(fā)明這一方面的另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，駱駝化VH單重鏈抗體包括由來源于兔的一個或多個外顯子編碼的恒定重鏈區(qū)。
在另一種實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明這一方面的駱駝化VH單重鏈抗體包括由來源于小鼠的一個或多個外顯子編碼的恒定重鏈區(qū)。
與現(xiàn)有技術(shù)的抗體相比，通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗體的優(yōu)點(diǎn)是，它能經(jīng)歷與在它的正常環(huán)境中產(chǎn)生的單鏈駱駝抗體相似或相同的類轉(zhuǎn)換過程?？梢酝ㄟ^本發(fā)明方法獲得的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。它們優(yōu)選是單克隆抗體?？贵w可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法制備。優(yōu)選將雜交瘤用于制備單克隆抗體。有關(guān)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，并且披露于本文中。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種包括本發(fā)明的VHH重鏈基因座的載體。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種包括本發(fā)明的駱駝化VH重鏈基因座的載體。
合適的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。有利的是，優(yōu)選適合插入大量核酸，足以編碼完整的免疫球蛋白重鏈基因座的載體。合適載體包括酵母和細(xì)菌人工染色體，如YACs和BACs。有利的是，構(gòu)建載體，以便將編碼本文所定義的單重鏈抗體基因座的核酸直接裝盒到不同的載體中。例如，可以將編碼單重鏈抗體的逆轉(zhuǎn)錄cDNA‘裝盒’到細(xì)菌表達(dá)載體中，以便添加標(biāo)記、信號或表位等。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種用本發(fā)明的VHH基因座轉(zhuǎn)化過的宿主細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)本發(fā)明的異源VHH重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因哺乳動物。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)本發(fā)明的駱駝化VH重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因哺乳動物。
在本發(fā)明中，術(shù)語‘轉(zhuǎn)基因哺乳動物’的范圍不包括轉(zhuǎn)基因人。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因哺乳動物優(yōu)選是比駱駝類小的哺乳動物。所述哺乳動物優(yōu)選選自下列一組小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、猴子和兔。優(yōu)選是小鼠。
在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因哺乳動物中，優(yōu)選使所述轉(zhuǎn)基因動物的內(nèi)源重鏈基因座缺失或沉默。用于后一種目的的合適技術(shù)披露于以下文獻(xiàn)中WO00/26373或WO96/33266和(Li和Baker(2000)Genetics156(2)809-821；Kitamura和Rajewsky(1992)；Kitamura和Rajewsky，(1992)Nature356，154-156)。
抗體生產(chǎn)細(xì)胞可源于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，并且用于，例如，制備用來生產(chǎn)本文所定義的VHH單鏈抗體的雜交瘤。作為補(bǔ)充或替代方案，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的重組DNA技術(shù)可以從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因哺乳動物中分離核酸序列，并且用于生產(chǎn)單鏈抗體。作為替代或補(bǔ)充方案，可以通過對本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行免疫，制備特殊的單鏈抗體。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種通過用一種抗原免疫本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因哺乳動物而生產(chǎn)單鏈抗體的方法。
在本發(fā)明這一方面的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述哺乳動物是小鼠。
在本發(fā)明中，術(shù)語‘免疫’哺乳動物，表示給本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因哺乳動物施用一種抗原，以便誘導(dǎo)針對這種抗原的免疫應(yīng)答。用于免疫所述哺乳動物的合適方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且披露于本文中。合適的抗原可以是天然存在的或合成的。天然存在的抗原包括蛋白，例如，它可能是酶或輔因子，肽和核酸分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，以上所列舉的例子并非是窮舉性的。
在另一方面，本發(fā)明提供了本文所披露的單重鏈抗體用作細(xì)胞內(nèi)結(jié)合試劑的用途。
在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的單鏈抗體作為酶抑制劑的用途。
在另一方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明方法可獲得的抗體在制備用于預(yù)防和/或治療疾病的藥物中的用途。
在最后一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的重鏈抗體基因座在預(yù)防和治療疾病中的用途。
定義‘基因’包括編碼完整mRNA的一個或多個外顯子?！贵w基因’包括V，D，J外顯子，它們能重組形成VDJ編碼區(qū)，該編碼區(qū)隨后進(jìn)一步與包括一個或多個恒定重鏈外顯子的恒定重鏈區(qū)重組。有許多V，DJ和C外顯子的亞型。一個特定的V區(qū)具有一個外顯子，一個D區(qū)具有一個外顯子，一個J區(qū)具有一個外顯子，以及一個C區(qū)具有若干外顯子。當(dāng)選擇了一個V外顯子，一個D外顯子，一個J外顯子和一個C區(qū)時，在重組之后它們共同形成一個完整基因。
‘外顯子’和‘內(nèi)含子’。外顯子是脫氧核苷酸的編碼序列或信使序列。就是說，它是真核生物的最終會以成熟的mRNA或rRNA分子形式表達(dá)的任何DNA序列。在外顯子之間通常分散有內(nèi)含子。內(nèi)含子是非編碼DNA序列。就是說，它們是最終不會以成熟RNA分子形式表達(dá)的DNA序列。為了制備成熟mRNA，將內(nèi)含子從新轉(zhuǎn)錄的RNA上剪切掉。
本發(fā)明的‘VHH重鏈基因座’由‘VHH區(qū)’，‘J區(qū)/外顯子’，‘D區(qū)/外顯子’和‘恒定重鏈區(qū)’組成。每一個VHH區(qū)包括一個VHH外顯子，每一個J區(qū)包括一個J外顯子，而每一個D區(qū)包括一個D外顯子，以及每一個重鏈恒定區(qū)包括一個或多個重鏈恒定區(qū)外顯子。
本發(fā)明的‘VHH外顯子/區(qū)’表示天然存在的VHH編碼序列，如存在于駱駝體內(nèi)的序列，及其任何同源物、衍生物或片段，只要當(dāng)所述核酸表達(dá)時，當(dāng)本文所定義的VHH區(qū)的成分與本發(fā)明的至少一個D區(qū)，至少一個J區(qū)和至少一個恒定重鏈區(qū)重組時，所得到的外顯子能夠產(chǎn)生本文所定義的VHH單鏈抗體。
本發(fā)明的‘駱駝化VH基因座’由一個或多個本文所定義‘駱駝化VH區(qū)’，一個或多個‘J區(qū)’，一個或多個‘D區(qū)’，和‘恒定重鏈區(qū)’組成。每一個駱駝化VH區(qū)包括一個駱駝化VH外顯子，每一個J區(qū)包括一個J外顯子，而每一個D區(qū)包括一個D外顯子，并且每一個重鏈恒定區(qū)包括一個或多個重鏈恒定區(qū)基因。
在本文中，‘駱駝化VH外顯子/區(qū)’表示源于除了駱駝以外的哺乳動物，例如，業(yè)已突變了的人的天然存在的VH編碼區(qū)，以便所述序列與駱駝外顯子的序列相同。本發(fā)明的駱駝化VH外顯子的范圍，還包括所述外顯子的任何同源物、衍生物或片段，只要當(dāng)本文所定義的駱駝化VH區(qū)的成分與本發(fā)明的至少一個D區(qū)，一個J區(qū)，和一個恒定重鏈區(qū)重組時所得到的外顯子能夠產(chǎn)生本文所定義的駱駝化VH單鏈抗體。
本文所定義的‘恒定重鏈區(qū)外顯子’(‘CH外顯子’)包括天然存在的CH外顯子序列，例如存在于駱駝或人或包括兔和小鼠在內(nèi)的其他哺乳動物中的序列。術(shù)語‘CH外顯子’的范圍還包括其衍生物，同源物，和片段，只要當(dāng)所述CH外顯子是恒定重鏈區(qū)的一種成分時，它能夠形成本文所定義的功能性單重鏈抗體。一般，CH外顯子具有四種不同類型(CH1-CH4)，它們編碼每一種恒定重鏈多肽的不同部分(結(jié)構(gòu)域)。不過，本發(fā)明的VHH和駱駝化VH單鏈抗體不具有功能性CH1結(jié)構(gòu)域(含有輕鏈結(jié)構(gòu)域錨定區(qū))，也不具有功能性CH4結(jié)構(gòu)域。存在大量的恒定重鏈區(qū)外顯子的亞型。不同的抗體類型具有不同的CH外顯子，例如，IgM分子具有一個或多個Cμ恒定區(qū)外顯子，而IgG分子具有一個或多個Cγ外顯子。
本發(fā)明的‘VHH單重鏈抗體’表示僅由重鏈(通常為2條)組成的抗體分子，而不包括任何輕鏈。每一個重鏈包括一個可變區(qū)(由VHH、D和J外顯子編碼)，和一個恒定區(qū)。恒定區(qū)還包括多個由恒定重鏈區(qū)外顯子編碼的CH結(jié)構(gòu)域，通常它包括兩個結(jié)構(gòu)域一個CH2結(jié)構(gòu)域和一個CH3結(jié)構(gòu)域。本文所披露的VHH單鏈抗體不具有功能性CH1結(jié)構(gòu)域，也不具有功能性CH4結(jié)構(gòu)域。正是由于缺乏功能性CH1結(jié)構(gòu)域(在常規(guī)抗體中具有用于錨定輕鏈恒定區(qū)的錨定位置)，導(dǎo)致了本發(fā)明的重鏈抗體不能與輕鏈締合形成常規(guī)抗體。被稱為scIgG2和/或scIgG3的抗體的亞類僅包括Cγ2和/或Cγ3基因。
本發(fā)明的術(shù)語‘駱駝化VH單重鏈抗體’表示僅由重鏈(通常為2條)組成的抗體分子，而不包括任何輕鏈。每一個重鏈包括一個可變區(qū)(由‘駱駝化VH外顯子’，D和J外顯子編碼)和一個恒定區(qū)。由恒定區(qū)外顯子編碼的恒定區(qū)另外編碼多個CH結(jié)構(gòu)域，通常包括兩個一個CH2結(jié)構(gòu)域和一個CH3結(jié)構(gòu)域。本文所定義的駱駝化VH單鏈抗體不具有功能性CH1結(jié)構(gòu)域或功能性CH4結(jié)構(gòu)域。由于缺乏功能性CH1結(jié)構(gòu)域(在常規(guī)抗體中具有用于錨定輕鏈恒定區(qū)的錨定位置)本發(fā)明的重鏈抗體不能與輕鏈締合形成常規(guī)抗體。
本文所使用的‘抗體’表示能夠結(jié)合選定靶位的抗體或抗體片段，并且包括單克隆抗體和多克隆抗體，工程化抗體，包括嵌合的、CDR-嫁接的和人源化的抗體，以及通過噬菌體展示或其他技術(shù)生產(chǎn)的人工選擇的抗體。小的抗體片段具有用于根據(jù)其小的大小和同時具有的優(yōu)良組織分布能力進(jìn)行用于診斷和治療用途的優(yōu)良特性。
‘抗體進(jìn)化’表示在抗體發(fā)育期間出現(xiàn)的類轉(zhuǎn)換和親和力成熟(體細(xì)胞高變)的過程，它會導(dǎo)致能選擇性地結(jié)合，并且具有高親和力的抗體的產(chǎn)生。
附圖簡述

圖1表示本發(fā)明的優(yōu)選單鏈抗體基因座。
發(fā)明詳述一般技術(shù)除非另有說明，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所普遍理解的相同含義(例如，細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué))。將標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于分子、遺傳學(xué)和生物化學(xué)方法(一般參見，Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，2d ed.(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocolsin Molecular Biology(1999)4th Ed，John Wiley & Sons，Inc.。以上文獻(xiàn)被收作本文參考)和化學(xué)方法。另外，有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)可以參見Harlow & Lane.，A Laboratory Manual Cold Spring Harbor，N.Y.。
本發(fā)明的VH/h重鏈基因座在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于在哺乳動物中生產(chǎn)VHH單重鏈抗體的方法，包括在所述哺乳動物中表達(dá)異源VHH重鏈基因座的步驟。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)在哺乳動物中生產(chǎn)駱駝化VH單重鏈抗體的方法，包括在所述哺乳動物中表達(dá)駱駝化VH重鏈基因座的步驟。
有關(guān)基因座構(gòu)建的細(xì)節(jié)在本發(fā)明的概述部分有詳細(xì)說明。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的基因座包括一個或多個FRT(flp重組靶)位點(diǎn)(http//www.esb.utexus.edu)，和兩個或兩個以上LoxP位點(diǎn)(它由兩個1 3bp的反向重復(fù)序列組成，這兩個序列由8bp的不對稱間隔區(qū)隔開)(Brian Sauer，Methods of Enzymology；1993，Vol225，890-900)。
在本發(fā)明的基因座中優(yōu)選具有至少兩個LoxP位點(diǎn)。FRT位點(diǎn)在所述基因座中的存在使得可以生產(chǎn)單拷貝轉(zhuǎn)基因，而Lox位點(diǎn)的存在使得在必要時可以缺失IgM和IgD重鏈基因。
(A)載體本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明構(gòu)建體的載體。主要提供了兩種類型的載體，復(fù)制載體和轉(zhuǎn)化載體。
(I)復(fù)制載體可以將本發(fā)明的構(gòu)建體摻入到諸如BAC載體的重組可復(fù)制載體中?？梢詫⑺鲚d體用于在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制所述構(gòu)建體。因此，在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明構(gòu)建體的方法，包括將本發(fā)明的構(gòu)建體導(dǎo)入可復(fù)制載體，將所述載體導(dǎo)入相容的宿主細(xì)胞，并且在所述構(gòu)建體能夠復(fù)制的條件下生長所述宿主細(xì)胞。可以從所述宿主細(xì)胞中回收所述構(gòu)建體。合適的宿主細(xì)胞包括諸如大腸桿菌的細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞系和其他真核細(xì)胞系，如昆蟲Sf9細(xì)胞(桿狀病毒)。
(II)轉(zhuǎn)化載體還可以將本發(fā)明的構(gòu)建體摻入到能夠?qū)⑺鰳?gòu)建體插入受體基因組、并因此實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的載體中。除了本發(fā)明的構(gòu)建體之外，所述轉(zhuǎn)化載體可以包括一個或多個以下成分。
啟動子啟動子通常是從能夠在哺乳動物細(xì)胞中起作用的啟動子中選擇的，不過，也可以使用原核啟動子和能夠在其他真核細(xì)胞中起作用的啟動子。啟動子通常源于病毒或真核基因的啟動子序列。例如，它可以是源于發(fā)生表達(dá)的細(xì)胞的基因組的啟動子。對于真核啟動子來說，它可以是以遍在方式起作用的啟動子(如α-肌動蛋白、β-肌動蛋白、微管蛋白的啟動子)或以組織特異性方式起作用的啟動子(如免疫球蛋白基因的啟動子)。它們還可以是對特殊刺激有反應(yīng)的啟動子，例如，能結(jié)合甾體激素受體的啟動子。還可以使用病毒啟動子，例如，Moloney鼠白血病病毒長末端重復(fù)(MMLV LTR)啟動子，Rous肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子或人巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動子。另外有利的是，所述啟動子是誘導(dǎo)型的，以便異源基因的表達(dá)水平，在細(xì)胞的生命時間內(nèi)是可以調(diào)節(jié)的。誘導(dǎo)型表示用啟動子可以調(diào)節(jié)獲得的表達(dá)水平。
另外，可以通過添加其他調(diào)節(jié)序列，例如增強(qiáng)子序列，對上述任一種啟動子進(jìn)行修飾。優(yōu)選能夠調(diào)節(jié)在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中表達(dá)的組織特異性增強(qiáng)子。具體地講，可以包括成功地在體內(nèi)激活抗體基因座所需要的重鏈增強(qiáng)子(Serwe，M.，和Sablitzky，F(xiàn).，EMBO J.12，p2321-2321，1993)。還可以使用基因座控制區(qū)(LCRs)，特別是免疫球蛋白LCR。還可以使用包括來自兩個或兩個以上不同啟動子的序列元件的嵌合啟動子。
其他載體成分除了啟動子和所述構(gòu)建體之外，本發(fā)明的載體優(yōu)選包括可用于優(yōu)化所述載體在插入了該載體的哺乳動物中的功能的其他元件。這些元件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且，舉例來說，披露于以下文獻(xiàn)中Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989。
載體的構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化哺乳動物胚胎的載體是使用本領(lǐng)域眾所周知的方法構(gòu)建的，包括，但不限于限制性內(nèi)切核酸酶消化、連接、質(zhì)粒和DNA和RNA純化、DNA測序等標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)，例如，這些技術(shù)披露于以下文獻(xiàn)中Sambrook，F(xiàn)ritsch，和Maniatis，eds.，Molecular CloningALaboratory Manual.，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)。一般，載體構(gòu)建包括以下步驟a)使內(nèi)源小鼠基因座失活，例如，使用公開的剔除方法之一(例如，Kitamara，D和Rajewski K.，Nature352，p154-156，1992)。
b)本文所披露的合適重鏈區(qū)的DJ和IgM區(qū)是作為重組DNA從人PAC，BAC或YAC文庫中定位的，并且是作為限制酶片段，例如Sall片段克隆的。該區(qū)還包括用于在體內(nèi)成功地激活抗體基因座所需要的重鏈增強(qiáng)子(參見Serwe，M.，Sablitzky，F(xiàn).，EMBO J.12，p2321-2321，1993)。
c)首先，通過用常規(guī)技術(shù)構(gòu)建合適的基因組DNA文庫，將大量VHH或‘駱駝化VH外顯子’克隆為粘粒。由于VHH外顯子定位在本文所披露的VH外顯子之間，這些外顯子隨后隨同VHH外顯子一起克隆。因此，產(chǎn)生了一系列VH和VHH外顯子。這一系列的基因可以作為MluI(或其他限制酶)片段分離。
d)3′人免疫球蛋白重鏈LCR-所述基因座表達(dá)所需要的調(diào)節(jié)區(qū)是作為SceI限制片段克隆的。
e)所述恒定區(qū)重鏈外顯子是作為分離的限制片段克隆的。通過在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組(Imam等，2000)，通過除去CH1外顯子和/或CH4外顯子的剪接受體序列(Nguyen等，同上)，使得由相應(yīng)的外顯子編碼的CH1和/或CH4結(jié)構(gòu)域沒有功能。
步驟b-e提供了‘VHH重鏈基因座’或‘駱駝化VH重鏈基因座’的片段(圖3)，這些片段將接管在步驟a)中披露的失活的小鼠基因座的功能。所述基因座是通過將每一個片段以合適的順序克隆到合適的載體，例如，含有包括上述所有限制位點(diǎn)的接頭區(qū)的BAC載體中而構(gòu)建的(圖1)。按照本發(fā)明方法制備的基因座，其大小通常為200-250kb?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)從所述載體中分離并且純化所述基因座。然后，可以將編碼本發(fā)明的‘VHH重鏈基因座’或‘駱駝化VH重鏈基因座’的純化核酸(圖3)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入源于在步驟a)中所披露的剔除小鼠的小鼠受精卵內(nèi)，以便獲得能表達(dá)一個或多個本發(fā)明基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠。
本發(fā)明的單鏈抗體應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的術(shù)語‘單重鏈抗體’和‘VHH重鏈基因座’還包括從任何來源獲得的同源多肽和核酸序列，例如，相關(guān)的細(xì)胞同源物，來自其他物種的同源物及其變體或衍生物。
因此，本發(fā)明包括本文所披露的單重鏈抗體和VHH重鏈基因座的變體、同源物或衍生物。
在本發(fā)明中，同源序列包括在氨基酸水平上，超過至少30，優(yōu)選50，70，90或100個氨基酸，具有至少80，85，90，95，96，97，98，99，99.5，99.6，99.7，99.8，99.9％的同一性的氨基酸序列。盡管同源性還可以被理解成相似性(即具有相似化學(xué)特性/功能的氨基酸殘基)，在本發(fā)明中，它優(yōu)選表示序列同一性方面的同源性。
同源性比較可以通過肉眼進(jìn)行，或者更常見的是，借助于可方便獲得的序列比較程序進(jìn)行。這些市場上出售的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩個或兩個以上序列之間的百分同源性。百分同源性可以在連續(xù)序列中計(jì)算，即一個序列與另一個序列比對，并且將一個序列中的每一個氨基酸直接與另一個序列中的相應(yīng)的氨基酸進(jìn)行比較，每次比較一個殘基。這種比較被稱為“無空位”比對。通常，這種無空位比對僅在相對較少數(shù)量的殘基上進(jìn)行(例如少于50個連續(xù)氨基酸)。
盡管這是一種非常簡單和一致的方法，但是它無法考慮，例如，本來應(yīng)該相同的序列對，由于一個插入或缺失，將會導(dǎo)致隨后的氨基酸殘基不能恰當(dāng)比對，因此，在進(jìn)行總體比對時，很有可能導(dǎo)致百分同源性的顯著降低。因此，大多數(shù)序列比較方法被設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生考慮到了可能的插入和缺失的最佳比對，而不會過度對總體同源性罰分。這一目的是通過在序列比對中插入“空位”以便使局部同源性最大化而實(shí)現(xiàn)的。
不過，這種更復(fù)雜的方法為存在于比對中的每一個空位規(guī)定了“空位罰分”，以便對于相同數(shù)量的相同氨基酸來說，具有盡可能少的空位的序列比對——體現(xiàn)了兩個比較序列之間的更的相關(guān)性——將獲得比具有很多空位的序列更高的得分。通常使用“親族空位成本(affinegap costs)”，它通常用于對空位的存在罰相對高的分，并且對所述空位中每一個后續(xù)的殘基罰相對少的分。這是最常用的空位評分系統(tǒng)。高的空位罰分，理所當(dāng)然地會產(chǎn)生具有較少空位的最優(yōu)比隊(duì)。大多數(shù)比對程序允許對空位罰分進(jìn)行修改。不過，在將所述軟件用于序列比較時，優(yōu)選使用缺省值。當(dāng)使用GCG Wisconsin Bestfit軟件包(參見下文)時，對于空位的氨基酸序列的缺省空位罰分為-12，而對于每一個延伸來說為-4。
因此，最大百分同源性的計(jì)算，首先需要產(chǎn)生最優(yōu)比對，這種比對考慮到了空位罰分。用于進(jìn)行這種比對的一種合適的計(jì)算機(jī)程序是GCG Wisconsin Bestfit軟件包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12387)。可以進(jìn)行序列比較的其他軟件的例子包括，但不局限于BLAST軟件包(參見Ausubel等，1999，同上，第18章)，F(xiàn)ASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS成組比較工具。BLAST和FASTA都可用于脫機(jī)和聯(lián)機(jī)檢索(參見Ausubel等，1999，同上，第7-58到7-60頁)。不過，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。
盡管能夠以同一性形式測量最終百分同源性，所述比對過程本身通常不基于全或無的成對比較。相反，通常使用一種成比例的相似性評分矩陣，它能根據(jù)化學(xué)相似性或進(jìn)化距離為每一種成對的比較確定得分。通常使用的這種矩陣的例子是BLOSUM62矩陣-用于BLAST程序組的缺省矩陣。如果已經(jīng)提供，GCG Wisconsin程序通常使用公共缺省值或客戶符號比較表(更多的細(xì)節(jié)參見用戶手冊)。對于GCG軟件包來說，優(yōu)選使用公共缺省值?；?qū)τ谄渌浖碚f，使用諸如BLOSUM62的缺省矩陣。
一旦所述軟件產(chǎn)生了最優(yōu)比對，就可以計(jì)算百分同源性，優(yōu)選百分序列同一性。所述軟件通常是將其作為序列比較的一部分而進(jìn)行的，并且產(chǎn)生了數(shù)字結(jié)果。
用于生產(chǎn)本發(fā)明單鏈抗體的方法(A)轉(zhuǎn)基因動物可以將本發(fā)明的基因座和載體導(dǎo)入一種動物，以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。因此，本發(fā)明還提供了包括本文所披露的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動物。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的任何技術(shù)將所述基因座插入受體動物的基因組中，例如，通過顯微注射。在將核酸導(dǎo)入受精卵之后，用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行重新植入。通常，對替代宿主進(jìn)行麻醉，并且將所述卵插入輸卵管。植入特定宿主體內(nèi)的卵的數(shù)量有所不同，但是通常與該物種天然產(chǎn)生的后代的數(shù)量相當(dāng)。
另外，可以將所述DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞(ES)，可以將這種細(xì)胞插入宿主胚胎，以便通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。
在另一種實(shí)施方案中，可以將所述DNA導(dǎo)入任何細(xì)胞。用所述細(xì)胞的細(xì)胞核取代來自任何物種的受精卵的細(xì)胞核，以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。這種核轉(zhuǎn)移技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
可以通過任何合適的方法篩選替代宿主的轉(zhuǎn)基因后代中轉(zhuǎn)基因的存在。篩選通常是通過Southern或Northern分析進(jìn)行的，使用至少與所述轉(zhuǎn)基因的一部分互補(bǔ)的探針?？梢允褂脤τ伤鲛D(zhuǎn)基因編碼的抗體特異的配體進(jìn)行的Western印跡分析作為篩選的替代或補(bǔ)充方案。通常，檢測被認(rèn)為以最高水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因的組織或細(xì)胞，不過，任何組織或細(xì)胞類型都可用于這種分析。
所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物的后代可以通過讓所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物與合適的配偶體交配，或通過從所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物獲得的卵和/或精子的體外受精而獲得。在采用體外受精時，可以將受精的胚胎植入替代宿主，或在體外溫育，或進(jìn)行這兩種操作。在通過交配產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代時，可以讓所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物與親代系回交。無論采用哪一種方法，都可以用上述方法或其他合適的方法評估所述后代中轉(zhuǎn)基因的存在。
所述動物可以改變，只要是哺乳動物就行。所述動物優(yōu)選是非人哺乳動物，如嚙齒類，更優(yōu)選是大鼠或小鼠。就此而言，所述受體動物還優(yōu)選不能產(chǎn)生包括輕鏈的抗體，或者最起碼產(chǎn)生這種抗體的能力降低。為此，所述受體動物可以是“剔除”動物，它可能具有產(chǎn)生輕鏈被關(guān)閉或阻遏的抗體所需要的一個或多個基因。
通過使用不能產(chǎn)生包括輕鏈的抗體或起碼具有降低的產(chǎn)生這種抗體的能力的宿主動物，本發(fā)明的方法在用特定抗原刺激時，能夠有效生產(chǎn)大量的單鏈抗體和來自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。
(B)噬菌體展示技術(shù)用于噬菌體展示的載體將所編碼的多肽融合于，例如，基因III蛋白(pIII)或基因VIII蛋白(pVIII)，以便展示在絲狀噬菌體，如M13的表面。參見Barbas等，Phage DisplayA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press(2001)(ISBN 0-87969-546-3)；Kay等(eds.)，Phase Display of Peptides and ProteinsA LaboratorvManual，San DiegoAcademic Press，Inc.，1996；Abelson等(eds.)，Combinatorial Chemistry，Methods in Enzymology vol.267，Academic Press(May1996)。
原核宿主特別適用于生產(chǎn)本發(fā)明的噬菌體展示抗體?，F(xiàn)在業(yè)已完善了噬菌體展示抗體的技術(shù)，其中，將抗體可變區(qū)片段融合于，例如，基因III蛋白(pIII)或基因VIII蛋白(pVIII)上，以便展示在如M13的絲狀噬菌體表面上，Sidhu，Curr.Opin.Biotechnol.11(6)610-6(2000)；Griffiths等，Curr.Opin.Biotechnol.9(1)102-8(1998)；Hoogenboom等，Immunotechnology，4(1)1-20(1998)；Rader等，Current Opinion in Biotechnology 8503-508(1997)；Aujame等，Human Antibodies 8155-168(1997)；Hoogenboom，Trendsin Biotechnol.1562-70(1997)；de Kruif等，17453-455(1996)；Barbas等，Trends in Biotechnol.14230-234(1996)；Winter等，Ann.Rev.Immunol.433-455(1994)，最近業(yè)已匯編了制備、繁殖、篩選(淘選)和使用所述文庫的抗體片段所需要的技術(shù)和方法，Barbas等，Phage DisplayA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)(ISBN 0-87969-546-3)；Kay等(eds.)，Phage Display of Peptides and ProteinsA Laboratory Manual，Academic Press，Inc.(1996)；Abelson等(eds.)，CombinatorialChemistry，Methods in Enzymology vol.267，Academic Press(May1996)，以上文獻(xiàn)被以其全文形式收作本文參考。
對于本文所述的包括其片段的抗體的噬菌體展示來說，它們優(yōu)選與噬菌體g3p蛋白融合。
(C)雜交瘤可以用業(yè)已建立的方法，利用重組DNA技術(shù)在細(xì)菌，優(yōu)選在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)本發(fā)明的單鏈抗體。所選擇的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)選能分泌單鏈抗體產(chǎn)物。
雜交瘤細(xì)胞或哺乳動物宿主細(xì)胞的體外繁殖是在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行的，這些培養(yǎng)基是常見的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，例如，Dulbecco′s改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)或RPMI1640培養(yǎng)基，任選補(bǔ)充了哺乳動物血清，例如，胎牛血清或微量元素和生長維持添加劑，例如，飼養(yǎng)細(xì)胞，如正常小鼠腹膜溢泌細(xì)胞，體細(xì)胞，骨髓巨噬細(xì)胞，2-氨基乙醇，胰島素，運(yùn)鐵蛋白，低密度脂蛋白，或油酸等。諸如細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞的宿主細(xì)胞的擴(kuò)增，同樣是在本領(lǐng)域所公知的合適培養(yǎng)基中進(jìn)行，例如，對于細(xì)菌來說，使用LB，NZCYM，NZYM，NZM，Terrific培養(yǎng)液，SOB，SOC，2×YT，或M9基本培養(yǎng)基，而對于酵母來說，使用YPD，YEPD，基本培養(yǎng)基，或完全基本Dropout培養(yǎng)基。
在體外生產(chǎn)中，提供了相對純的免疫球蛋白制劑，并且可以放大以提供大量的需要的免疫球蛋白。用于細(xì)菌細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且包括均勻懸浮培養(yǎng)，例如，在氣升式反應(yīng)器或在連續(xù)攪拌反應(yīng)器，或固定化或限制細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)，例如在空心纖維，微膠囊中，在瓊脂糖微珠或陶瓷柱上培養(yǎng)。
還可以通過在體內(nèi)擴(kuò)增哺乳動物細(xì)胞獲得大量需要的免疫球蛋白。為此，將產(chǎn)生需要的免疫球蛋白的雜交瘤細(xì)胞注射到組織相容性哺乳動物中，導(dǎo)致抗體生產(chǎn)腫瘤的生長。在注射之前，任選用烴激發(fā)所述動物，特別是使用諸如降植烷(四甲基-十五烷)的礦物油。在1-3周之后，從所述哺乳動物的體液中分離免疫球蛋白。例如，雜交瘤細(xì)胞是通過以下方法獲得的通過將合適的骨髓瘤細(xì)胞與來自Balb/c小鼠的抗體生產(chǎn)脾細(xì)胞融合，或?qū)⒃从谀墚a(chǎn)生需要的抗體的雜交瘤細(xì)胞系Sp2/0的轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞經(jīng)腹膜內(nèi)途徑注射到任選用降植烷處理過的Balb/c小鼠體內(nèi)，并且在1-2周之后，從所述動物中采集腹水。
例如，上述及其他技術(shù)披露于以下文獻(xiàn)中Kohler和Milstein，(1975)Nature 256495-497；US 4,376,110；Harlow和Lane，Antibodiesa Laboratory Manual，(1988)Cold Spring Harbor，這些文獻(xiàn)被收作本文參考。用于制備重組抗體分子的技術(shù)披露于上述文獻(xiàn)中，并且還披露于諸如EP 0623679；EP 0368684和EP 0436597的文獻(xiàn)中，這些文獻(xiàn)被收作本文參考。
在所述細(xì)胞培養(yǎng)上清液中篩選需要的抗體，優(yōu)選通過免疫印跡，通過酶免疫測定，例如，夾心測定或斑點(diǎn)測定，或放射免疫測定對表達(dá)需要的靶的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色而篩選。
為了分離所述抗體，可以濃縮存在于所述培養(yǎng)上清液或腹水中的抗體，例如，通過用硫酸銨沉淀，用諸如聚乙二醇的吸濕材料透析，或通過選擇性膜過濾等。如果必要和/或需要的話，通過常用的層析方法純化，例如凝膠過濾、離子交換層析，用DEAE-纖維素層析和/或(免疫)親和層析，例如，用靶分子或用蛋白-A進(jìn)行的親和層析。
(3)轉(zhuǎn)基因動物的免疫在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)本發(fā)明單鏈抗體的方法，包括給本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物施用一種抗原。
由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的單鏈抗體包括多克隆和單克隆單鏈抗體及其片段。如果需要多克隆抗體，可以用來自收集的，并且按本發(fā)明方法處理過的免疫動物的抗原和血清免疫所述轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠、兔、山羊、馬等)。如果含有多克隆抗體的血清含有針對其他抗原的抗體的話，可以通過免疫親和層析和本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的類似技術(shù)，純化感興趣的多克隆抗體。用于純化和加工多克隆抗血清的技術(shù)同樣為本領(lǐng)域所公知。
本發(fā)明單鏈抗體的用途本發(fā)明的單鏈抗體，包括其片段可用于體內(nèi)治療和預(yù)防用途，用于體外和體內(nèi)診斷用途，用于體外測定和試劑用途等。
本發(fā)明單鏈抗體的治療和預(yù)防用途包括給諸如人的受體哺乳動物施用上述抗體。
與駱駝VHH單鏈抗體分子相比，在人治療方面‘駱駝化VH單鏈重鏈抗體’具有若干優(yōu)點(diǎn)。例如，駱駝化VH單鏈抗體在基于VH3基因家族的抗體的情況下具有蛋白A結(jié)合位點(diǎn)。另外，在給人施用時，駱駝化VH單鏈抗體預(yù)期具有比駱駝VH單鏈抗體低的免疫原性。
還應(yīng)當(dāng)理解的是，與常規(guī)雙鏈抗體相比，‘駱駝化VH單重鏈抗體’和‘駱駝VHH單重鏈抗體’具有某些不同的物理特征。例如，由于缺少功能性CH1重鏈結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明的抗體不能結(jié)合與補(bǔ)體的典型途徑的激活相關(guān)的補(bǔ)體分子C1q。
基本上純的單鏈抗體，包括其至少為90-95％均質(zhì)的片段優(yōu)選用于給哺乳動物施用，98-99％或更高的均質(zhì)性最優(yōu)選用于藥物學(xué)用途，特別是當(dāng)所述哺乳動物是人時。一旦根據(jù)需要進(jìn)行了部分或純化至均質(zhì)，即可將本文所披露的單鏈抗體用于診斷或治療(包括身體外的治療)，或用于開發(fā)和實(shí)施采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的程序的測定方法。
本發(fā)明的選定的單鏈抗體通?？捎糜陬A(yù)防、抑制或治療炎癥狀態(tài)，變應(yīng)性過敏，癌癥，細(xì)菌或病毒感染，以及自身免疫疾病(包括，但不局限于I型糖尿病，多發(fā)性硬化，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，克隆氏病和重癥肌無力)，以及用于預(yù)防移植排斥。例如，消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或干擾募集可導(dǎo)致增強(qiáng)了的免疫應(yīng)答，這可能特別適用于治療可能逃脫正常免疫應(yīng)答的感染。
另外，選定的單鏈抗體，包括其片段可用于在它們在脊椎動物中正常不定位的區(qū)域調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。例如，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的技術(shù)將本文所披露的一種或多種抗體用于輸注、注射到脊椎動物組織中。本文所披露的抗體在所述異位環(huán)境中的存在可被用于例如，在移植排斥期間調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等。
在本申請中，術(shù)語“預(yù)防”包括在誘導(dǎo)疾病之前施用所述預(yù)防性組合物?！白瓒簟北硎驹谡T導(dǎo)事件之后，但是在所述疾病的臨床出現(xiàn)之前施用所述組合物。“治療”包括在疾病癥狀開始表現(xiàn)之后施用所述預(yù)防性組合物。
可以獲得動物模型系統(tǒng)，該系統(tǒng)可用于篩選本發(fā)明的選定抗體在預(yù)防或治療疾病方面的效果。用于檢測易感的小鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的方法為本領(lǐng)域所公知(Knight等(1978)J.Exp.Med.，1471653；Reinersten等(1978)New Eng.J.Med.，299515)。通過用來自另一種物種的可溶性AchR蛋白誘導(dǎo)所述疾病，在SJL/J雌性小鼠中檢測重癥肌無力(MG)(Lindstrom等(1988)Adv.Immunol.，42233)。關(guān)節(jié)炎是通過注射II型膠原在小鼠的易感株中誘導(dǎo)的(Stuart等(1984)Ann.Rev.Immunol.，42233)。業(yè)已披露了通過注射分支桿菌熱激蛋白在易感大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)佐劑關(guān)節(jié)炎的模型(VanEden等(1988)Nature，331171)。通過按公開方法施用甲狀腺球蛋白，在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)甲狀腺炎(Maron等(1980)J.Exp.Med.，1521115)。胰島素依賴型糖尿病(IDDM)在某些小鼠株中可以天然存在或可以誘導(dǎo)，如通過Kanasawa等(1984)Diabetologia，27113所披露的方法誘導(dǎo)。小鼠和大鼠體內(nèi)的EAE被用作人MS的模型。在該模型中，通過施用髓鞘堿性蛋白誘導(dǎo)了脫髓鞘疾病(參見Paterson(1986)Textbook of Immunopathology，Mischer等，eds.，Grune和Stratton，New York，pp.179-213；McFarlin等(1973)Science，179478和Satoh等(1987)J.Immunol.，138179)。
一般，本發(fā)明的選定的單鏈抗體是以純化形式與藥理學(xué)合適的載體一起使用的。通常，所述載體包括水溶液或醇/水溶液，乳液或懸浮液，包括鹽水和/或緩沖培養(yǎng)基的任何溶液。腸胃外載體包括氯化鈉溶液，Ringer′s右旋糖，右旋糖和氯化鈉以及乳酸化Ringer′s。如果必須在懸浮液中保持多肽復(fù)合物，合適的、生理學(xué)上可以接受的佐劑可以從增稠劑中選擇，如羧甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，凝膠和藻酸鹽。
靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)添加劑和電解質(zhì)添加劑，如基于Ringer′s右旋糖的添加劑。還可以存在防腐劑和其他添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack(1982)Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版)。
本發(fā)明的選定的單鏈抗體，包括其片段可以被用作單獨(dú)施用的組合物使用或與其他制劑組合使用。其中可以包括各種免疫治療藥物，如環(huán)孢菌素、氨甲蝶呤、阿霉素或順鉑和免疫毒素。藥物組合物可以包括各種細(xì)胞毒性或其他試劑與選定抗體，或本發(fā)明的T細(xì)胞或甚至是本發(fā)明選定抗體的組合的“雞尾酒”。
本發(fā)明藥物組合物的施用途徑可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的任何途徑。對于治療來說，包括，但不局限于免疫治療，可以按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)給任何患者施用本發(fā)明的選定抗體、受體或其結(jié)合蛋白。所述施用可以是任何合適的方式，包括腸胃外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)肺途徑，或者還可以通過用導(dǎo)管直接輸注。施用的劑量和頻率取決于患者的年齡、性別和狀況，同時施用的其他藥物，禁忌癥和醫(yī)生考慮的其他參數(shù)。
具體地講，本發(fā)明的單鏈抗體和/或其片段和/或組合物特別適合用作抗病毒和/或抗細(xì)菌藥物外部使用，例如，以霜劑形式用于皮膚，用于陰道等。另外，本發(fā)明的抗體片段和組合物還可用于治療設(shè)備，如用于經(jīng)常會出現(xiàn)偶然機(jī)會性感染的場所。例如，抗體、其片段和組合物特別適用于醫(yī)院環(huán)境，特別是密集的護(hù)理單位。另外，本發(fā)明的抗體、其片段和組合物可用于治療人工或天然組織的移植物質(zhì)。例如，支架或受CMV或其他病毒感染的骨髓。
本發(fā)明的抗體、其片段和組合物還可用于內(nèi)部使用，用來治療多種疾病，如腦膜炎，和用于治療抗細(xì)菌毒素。另外，抗體、其片段和組合物可用于治療多種疾病和/或炎癥，諸如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明的選定的抗體可以冷凍干燥以便保存，并且，在使用之前在合適的載體中重配?？梢圆捎靡阎睦鋬龈稍锖椭嘏浼夹g(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，冷凍干燥和重配可以導(dǎo)致不同程度的功能活性喪失，并且，必須將用量上調(diào)以便進(jìn)行補(bǔ)償。
另外，本發(fā)明的抗體可用于診斷目的。例如，本文所披露的抗體可以用在疾病狀態(tài)下特異性表達(dá)的抗原制備或產(chǎn)生，或者在特定疾病狀態(tài)期間其水平發(fā)生改變。
對于諸如診斷或示蹤目的的某些用途來說，可以添加標(biāo)記物。合適的標(biāo)記物包括，但不局限于下列任意一種放射性標(biāo)記，NMR自己旋標(biāo)記和熒光標(biāo)記。用于檢測標(biāo)記的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
合適的放射性標(biāo)記的例子包括锝99m(99mTc)或碘-123(123I)。諸如碘-123，碘-313，銦-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，鎵，錳或鐵的標(biāo)記物，使得這些標(biāo)記物可以通過NMR進(jìn)行檢測。諸如11C甲硫氨酸和FDG的標(biāo)記物適用于正電子發(fā)射體層攝影術(shù)的技術(shù)。使用PET的方法和方案的說明為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
合適的熒光團(tuán)是GFP或其突變體。GFP及其突變體可以按照本領(lǐng)域眾所周知的方法通過作為融合多肽表達(dá)與本發(fā)明的抗體或靶分子一起合成。例如，轉(zhuǎn)錄單位可以作為所需要的GFP或免疫球蛋白或靶分子的框內(nèi)融合體形式構(gòu)建，并且通過常規(guī)PCR克隆和連接技術(shù)插入上述載體。
本發(fā)明的抗體可以用能夠產(chǎn)生信號的任何試劑標(biāo)記。所述信號可以是任何可檢測的信號，如誘導(dǎo)可檢測基因產(chǎn)物的表達(dá)。可檢測基因產(chǎn)物的例子包括生物發(fā)光多肽，如熒光素酶和GFP，可以通過特殊測定檢測的多肽，如β-半乳糖苷酶和CAT，以及調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞生長特征的多肽，如代謝所需要的酶，如HIS3，或抗生素抗性基因，如G418。
為了進(jìn)行預(yù)防和/或治療性治療，可以施用含有本發(fā)明的選定抗體的組合物或它的混合物。在某些治療用途中，可以在選定細(xì)胞群中獲得至少部分抑制、阻遏、調(diào)節(jié)、殺滅、或某些其他可測定參數(shù)的合適用量，被定義為“治療有效劑量”。為了達(dá)到上述劑量所需要的量取決于疾病的嚴(yán)重程度和患者自身免疫系統(tǒng)的一般狀態(tài)，不過一般為0.00005-5.0mg選定的單鏈抗體/kg體重，更常用的劑量為0.0005-2.0mg/kg/劑。對于預(yù)防性用途來說，還可以以類似的或略低一些的劑量施用含有本發(fā)明的選定多肽的組合物或其混合物。
含有一種或多種本發(fā)明的選定抗體的組合物可用于預(yù)防性和治療性設(shè)置，以便有助于改變、滅活、殺滅或除去哺乳動物中的選定靶細(xì)胞群。另外，還可將本文所披露的多肽的選定組成成分用于在體外選擇性地殺滅、消除或有效除去異質(zhì)細(xì)胞收集物中的靶細(xì)胞群?？梢栽隗w外將來自哺乳動物的血液與選定的抗體、細(xì)胞表面受體或其結(jié)合蛋白混合，以便殺滅或除去所述血液中的不需要的細(xì)胞，以便按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)送回到所述哺乳動物中。
在另一方面，本發(fā)明提供了將本文所披露的單重鏈抗體用作細(xì)胞內(nèi)結(jié)合試劑的用途。
本發(fā)明的抗體可以在任何細(xì)胞類型中表達(dá)，并且可以結(jié)合并且影響任何細(xì)胞內(nèi)成分的功能。例如，細(xì)胞內(nèi)成分可以是細(xì)胞骨骼成分，參與基因表達(dá)和/或表達(dá)調(diào)節(jié)的分子，參與細(xì)胞成分功能調(diào)節(jié)的酶或分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，以上所列舉的并非是窮舉性的。例如，當(dāng)所述成分是酶抑制劑時，本發(fā)明的抗體可以增強(qiáng)或減弱所述酶的活性。酶的活性位點(diǎn)通常位于蛋白表面上最大的溝槽中。所述位點(diǎn)對于常規(guī)抗體來說，通常是沒有免疫原性的(Novotny等，(1986)Proc.Nat.Acad USA，83，226)。本發(fā)明單鏈抗體的長的H3環(huán)深深地穿透至酶的活性位點(diǎn)，使得它們起著有效酶抑制劑的作用。
另外，可以給本發(fā)明的抗體附加其他功能，如轉(zhuǎn)運(yùn)肽和/或提供一種酶活性的功能性成分，例如激酶，蛋白酶，磷酸酶，脫乙酰酶，乙酰酶，遍在化酶，sumolation酶，甲基化酶等。另外，可以將其他抗體連接在本發(fā)明的單鏈抗體或其片段上。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，以上所列舉的并非是窮舉性的。
另外，抗體或其片段可以作為純化試劑使用，通過將單鏈抗體或其片段連接在其他表面上，可以純化其他表面上的抗原(即親和純化)。
另外，本發(fā)明的抗體或其片段可用作診斷工具。例如，可將其用于檢測存在于血液中的腫瘤特異性蛋白，從而可以早期檢測腫瘤特異性蛋白。另外，本發(fā)明的抗體或其片段能夠以陣列形式用于診斷目的，從而有效地同時檢測抗體及其片段和配體之間的多種分子相互作用。
在上面的說明書中所提到的所有文獻(xiàn)都被收作本文參考。在不超出本發(fā)明范圍和構(gòu)思的前提下，本發(fā)明所披露的各種方法和系統(tǒng)的各種改進(jìn)，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。盡管業(yè)已結(jié)合具體優(yōu)選實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行了說明，應(yīng)當(dāng)理解的是，要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)當(dāng)被過度局限于所述具體實(shí)施方案。實(shí)際上，對所披露的用于實(shí)施本發(fā)明的方案的各種改進(jìn)對于生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，這些改進(jìn)被認(rèn)為屬于以下權(quán)利要求書的范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于在哺乳動物中生產(chǎn)VHH單重鏈抗體的方法，包括在所述哺乳動物中表達(dá)異源VHH重鏈基因座的步驟。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述VHH重鏈基因座包括(a)至少一個各自包括一個VHH外顯子的VHH區(qū)，至少一個各自包括一個D外顯子的D區(qū)，和至少一個各自包括一個J外顯子的J區(qū)，其中，所述VHH區(qū)，D區(qū)和J區(qū)能夠重組形成VDJ編碼序列，(b)包括至少一個Cγ恒定重鏈基因和至少一個Cμ恒定重鏈基因的恒定重鏈區(qū)，并且當(dāng)它表達(dá)時，既不表達(dá)功能性CH1結(jié)構(gòu)域，也不表達(dá)功能性CH4結(jié)構(gòu)域，并且，當(dāng)所述基因座表達(dá)時，能夠形成完整的單重鏈IgG分子(scIgG)。
3.一種在哺乳動物中生產(chǎn)駱駝化VH單重鏈抗體的方法，包括在所述哺乳動物中表達(dá)駱駝化VH重鏈基因座的步驟。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述駱駝化VH重鏈基因座包括(a)至少一個各自包括一個VH外顯子的VH區(qū)，該VH外顯子是突變的，以便其核酸序列與駱駝VHH外顯子(‘駱駝化VH外顯子’)相同，至少一個各自包括一個D外顯子的D區(qū)，和至少一個包括一個J外顯子的J區(qū)，其中，所述VH區(qū)，D區(qū)和J區(qū)能夠重組形成VDJ編碼序列，和(b)包括至少一個Cγ恒定重鏈基因和至少一個Cμ恒定重鏈基因的恒定重鏈區(qū)，并且當(dāng)它表達(dá)時，既不表達(dá)功能性CH1結(jié)構(gòu)域，也不表達(dá)功能性CH4結(jié)構(gòu)域，并且，當(dāng)所述基因座表達(dá)時，能夠形成完整的單重鏈IgG分子(scIgG)。
5.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述基因座包括一個或多個FRT位點(diǎn)。
6.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述基因座包括兩個或兩個以上LoxP位點(diǎn)。
7.如權(quán)利要求1、2、5和6的方法，其中，所述VHH重鏈基因座包括至少一個來源于人的D區(qū)和至少一個來源于人的J區(qū)。
8.如權(quán)利要求3或4、5和6的方法，其中，所述駱駝化VH重鏈基因座包括至少一個來源于人的D區(qū)和至少一個來源于人的J區(qū)。
9.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述恒定重鏈區(qū)包括至少一個來源于駱駝的恒定重鏈基因。
10.如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述恒定重鏈區(qū)包括至少一個非駱駝來源的恒定區(qū)重鏈基因。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中，至少一個恒定區(qū)重鏈基因來源于人。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中，至少一個恒定區(qū)重鏈基因來源于兔。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中，至少一個恒定區(qū)重鏈基因來源于小鼠。
14.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述重鏈基因座還包括使所述基因座能夠裝盒的一個或多個盒位點(diǎn)。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述一個或多個盒位點(diǎn)位于所述重鏈基因座中，位于該基因座的5’前導(dǎo)序列中。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中，所述一個或多個盒位點(diǎn)位于所述重鏈基因座中，位于該基因座的3’非翻譯區(qū)中。
17.通過權(quán)利要求1、2和5-16中任意一項(xiàng)的方法可獲得的VHH單重鏈抗體，其中，由VHH外顯子編碼的抗體部分是由來源于駱駝的外顯子編碼的，而所述抗體分子的其余部分是由一個或多個來源于人的區(qū)域編碼的。
18.通過權(quán)利要求1、2和5-16中任意一項(xiàng)的方法可獲得的VHH單重鏈抗體，其中，由VHH外顯子編碼的抗體部分是由來源于駱駝的外顯子編碼的，而恒定重鏈區(qū)是由一個或多個來源于兔的區(qū)域編碼的。
19.通過權(quán)利要求1、2和5-16中任意一項(xiàng)的方法可獲得的VHH單重鏈抗體，其中，由VHH外顯子編碼的抗體部分是由來源于駱駝的外顯子編碼的，而恒定重鏈區(qū)是由一個或多個來源于小鼠的區(qū)域編碼的。
20.一種用權(quán)利要求3，4和5-16中任意一項(xiàng)的方法可獲得的駱駝化VH單重鏈抗體。
21.如權(quán)利要求20的駱駝化VH單重鏈抗體，其中，整個抗體是由一個或多個來源于人的區(qū)域編碼的。
22.如權(quán)利要求20的駱駝化VH單重鏈抗體，其中，編碼恒定重鏈區(qū)的所述抗體部分是由一個或多個來源于兔的區(qū)域編碼的。
23.如權(quán)利要求20的駱駝化VH單重鏈抗體，其中，編碼恒定重鏈區(qū)的所述抗體部分是由一個或多個來源于小鼠的區(qū)域編碼的。
24.如權(quán)利要求20-23中任意一項(xiàng)的駱駝化VH單重鏈抗體，它是單克隆抗體。
25.一種載體，包括權(quán)利要求1，2和5-16中任意一項(xiàng)所述的VHH重鏈基因座。
26.一種載體，包括權(quán)利要求3，4和5-16中任意一項(xiàng)所述的駱駝化VH重鏈基因座。
27.一種用權(quán)利要求25和26中任意一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化過的宿主細(xì)胞。
28.一種表達(dá)如權(quán)利要求2和5-16中任意一項(xiàng)所述的異源VHH重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因哺乳動物。
29.一種表達(dá)如權(quán)利要求4和5-16中任意一項(xiàng)所述的駱駝化VH重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因哺乳動物。
30.如權(quán)利要求28或29的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，它是小鼠。
31.一種通過用一種抗原免疫權(quán)利要求28-30中任意一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因哺乳動物而生產(chǎn)單鏈抗體的方法。
32.權(quán)利要求17-24中任意一項(xiàng)的單重鏈抗體在制備用于預(yù)防和/或治療疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在哺乳動物中生產(chǎn)單鏈免疫球蛋白的方法。具體地講，本發(fā)明涉及一種用于在哺乳動物中生產(chǎn)單鏈駱駝VHH抗體的方法，它會經(jīng)歷出現(xiàn)在抗體生產(chǎn)B細(xì)胞內(nèi)的類轉(zhuǎn)換和親和力成熟的過程。還披露了用本發(fā)明方法制備的單鏈抗體及其用途。
文檔編號A61P1/04GK1518559SQ02812599
公開日2004年8月4日 申請日期2002年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月24日
發(fā)明者F·格羅斯維爾德, F 格羅斯維爾德 申請人:鹿特丹伊拉茲馬斯大學(xué)