專利名稱：免疫調節(jié)抗體在治療腫瘤性疾病中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于治療腫瘤，特別是B細胞淋巴瘤和白血病的協(xié)同聯合抗體治療。在優(yōu)選的實施方案中，該協(xié)同抗體組合包含一種調節(jié)或調制免疫系統(tǒng)的抗體，例如通過調節(jié)B細胞/T細胞相互作用和/或B細胞活性、分化或增殖(例如抗-B7，抗-CD40，抗-CD23或抗-CD40L)；以及任選地至少一種具有實質性B細胞耗盡活性的抗體(例如抗-CD19，CD20，CD22或CD37抗體)。在其他優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明可包含兩種諸如抗-CD40L和抗-B7的免疫調節(jié)抗體的協(xié)同組合。
背景技術：
脊椎動物(例如包括人、猿和猴子等的靈長類動物)的免疫系統(tǒng)由多種器官和細胞類型組成，其進化為準確地并特異性地識別侵入脊椎動物宿主的外來微生物(“抗原”)；特異性地結合這種外來微生物；并消除/破壞這種外來微生物。淋巴細胞，以及其他類型的細胞，對于免疫系統(tǒng)和消除及破壞外來微生物是關鍵的。淋巴細胞在胸腺、脾臟和骨髓(成年人)中產生，占人(成年人)的循環(huán)系統(tǒng)中存在的白血細胞總數的約30％。淋巴細胞有兩種主要的亞群T細胞和B細胞。T細胞負責細胞介導的免疫，而B細胞負責抗體產生(體液免疫)。但是，T細胞和B細胞可被認為是互相依賴的——在典型的免疫應答中，當T細胞受體與抗原片段結合時，T細胞被激活，而這種抗原片段是與抗原呈遞細胞表面上的主要組織相容性復合體(“MHC”)糖蛋白相結合的；這種活化導致生物介質(“白介素”或“細胞因子”)的釋放，其在本質上刺激B細胞分化和產生針對該抗原的抗體(“免疫球蛋白”)。
宿主中的每個B細胞在其表面上表達一種不同的抗體——由此一個B細胞會表達特異性針對一種抗原的抗體，而另一個B細胞會表達特異性針對不同的抗原的抗體。相應地，B細胞相當多樣，而這種多樣性對于免疫系統(tǒng)是關鍵的。在人類中，每個B細胞可產生數量巨大的抗體分子(即，約107至108)。這種抗體產生最典型的是當外來抗原被中和時停止(或大量減少)。但是，偶爾地，特定B細胞的增殖會持續(xù)不衰；此種增殖可導致一種被稱為“B細胞淋巴瘤”的癌癥。
非霍奇金淋巴瘤是一種特征在于B淋巴細胞惡性生長的淋巴瘤。根據美國癌癥學會估計將有54000新病例被診斷，其中65％將被分類為中間-或高-分級淋巴瘤。被診斷為中間分級淋巴瘤的患者的平均存活率為2-5年，而被診斷為高分級淋巴瘤的患者在確診后平均存活6個月至2年。
傳統(tǒng)療法包括化療和輻射，如果可以找到合適的供體和如果在采收時骨髓含有太多腫瘤細胞，可能同時進行自體或同種異體骨髓或干細胞移植。盡管患者通常對傳統(tǒng)療法有反應，他們常在數月之內復發(fā)。
已知B細胞惡性腫瘤，例如B細胞淋巴瘤和白血病，可使用具有B細胞耗盡活性的特異性針對B細胞抗原的抗體成功地進行治療。已報道具有實際的或潛在的治療B細胞惡性腫瘤的應用價值的B細胞抗體的實例包括特異性針對CD20，CD19，CD22，CD37和CD40的抗體。
另外，已廣泛報道使用具有B細胞耗盡活性的抗CD37抗體具有治療B細胞淋巴瘤的潛能。參見，例如，Presr等，J.Clin.Oncol.7(8)1027-1038(1989年8月)；Grossbard等，Blood 8(4)863-876(1992年8月15日)。
CD20是一種在超過90％B細胞淋巴瘤上表達的細胞表面抗原，其在腫瘤細胞中不脫落或調變(McLaughlin等，J.Clin.Oncol.162825-2833(1998b))。CD20抗原是一種非糖基化的35kDa的B細胞膜蛋白，其參與細胞內信號作用，B細胞分化和鈣離子通道轉移(Clark等，Adv.Cancer Res.5281-149(1989)；Tedder等，Immunology Today15450-454(1994))。該抗原作為人B細胞系的早期標記出現，并以不同抗原密度在正常和惡性B細胞群上均普遍表達。但是，該抗原在完全成熟的B細胞(例如漿細胞)、早期B細胞群和干細胞上缺失，使其成為抗體介導療法的合適靶標。
已制備了抗CD20抗體用于研究和治療。一種抗CD20抗體是單克隆B1抗體(美國專利No.5,843,398)。還制備了放射性核素形式的抗CD20抗體，用于治療B細胞淋巴瘤(例如131I標記的抗CD20抗體)，以及89Sr標記的形式用于緩解由前列腺和乳腺癌轉移引起的骨痛(Endo，Gan To Kagaku Ryoho 26744-748(1999))。
有報道將一種小鼠單克隆抗體1F5(抗CD20抗體)通過連續(xù)靜脈內輸注而施用于B細胞淋巴瘤患者。然而，據報道需要極高水平(＞2克)的1F5才能耗盡循環(huán)腫瘤細胞，而且結果被描述為“短暫的”(Press等，Blood 69584-591(1987))。使用單克隆抗體進行治療的一個潛在問題是非人單克隆抗體(例如小鼠單克隆抗體)通常缺乏人效應物功能，例如它們不能介導補體依賴性溶胞作用或通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性溶解人靶細胞或Fc受體介導的吞噬作用。此外，非人單克隆抗體可被人類宿主識別為外來蛋白；因此重復注射這種外來抗體可導致誘發(fā)免疫應答，這會導致有害的超敏反應。對于基于小鼠的單克隆抗體，這通常稱為人抗小鼠抗體反應，或“HAMA”反應。另外，這些“外來”抗體可遭到宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，由此它們實際上在到達其靶部位之前就被中和了。
RITUXAN(也稱為Rituximab，MabThera，IDEC-C2B8和C2B8)是第一個FDA批準的單克隆抗體，其由IDEC Pharmaceuticals開發(fā)(參見美國專利No.5,843,439；5,776,456和5,736,137)，用于治療人B細胞淋巴瘤(Reff等，Blood 83435-445(1994))。RITUXAN是一種嵌合的抗CD20單克隆(Mab)抗體，它是生長抑制性的，并且據報道在體外可敏化某些淋巴瘤細胞系發(fā)生化療劑誘發(fā)的細胞凋亡(Demidem等，Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals12177-(1997))。當使用小鼠異種移植動物模型在體內測試時，還證實RITUXAN具有抗腫瘤活性。RITUXAN有效地結合人補體，具有強FcR結合，并能在體外通過補體依賴性(CDC)和抗體依賴性(ADCC)機制有效地殺死人淋巴細胞(Reff等，Blood 83435-445(1994))。在獼猴中，該抗體選擇性地耗盡血液和淋巴結中的正常B細胞。
RITUXAN已被推薦用于治療低分級或濾泡性B細胞非霍奇金淋巴瘤(McLaughlin等，Oncology(Huntingt)121763-1777(1998a)；Maloney等，Oncology 1263-76(1998)；Leget等，Curr.Opin.Oncol.10548-551(1998))。在歐洲，RITUXAN已被批準用于治療復發(fā)的III/IV期濾泡性淋巴瘤(White等，Pharm.Sci.Technol.Today295-101(1999))并且據報道對濾泡中心細胞淋巴瘤(FCC)有效(Nguyen等，Eur.J.Haematol 6276-82(1999))。用RITUXAN治療的其他疾病包括濾泡中心細胞淋巴瘤(FCC)、套細胞淋巴瘤(MCL)、彌漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)和小淋巴細胞淋巴瘤/慢性淋巴細胞白血病(SLL/CLL)(Nguyen等，1999))。據報道難治或不治的NHL患者對RITUXAN和CHOP(例如環(huán)磷酰胺、長春新堿、強的松和阿霉素)的聯合治療有反應(Ohnishi等，Gan To KagakuRyoho 252223-8(1998))。在I和II期臨床研究中，RITUXAN在低分級非霍奇金淋巴瘤(NHL)中表現出極低的毒性和顯著的治療活性(Berinstein等，Ann.Oncol.9995-1001(1998))。
RITUXAN，單獨用于治療B細胞NHL的每周劑量通常為375mg/M2，對于復發(fā)或難治的低分級或濾泡性NHL持續(xù)4周，其耐受良好，并具有顯著的臨床活性(Piro等，Ann.Oncol.10655-61(1999)；Nguyen等，(1999)；和Coiffier等，Blood 921927-1932(1998))。但是，4個高達500mg/M2的周劑量也已在使用該抗體的試驗中給予(Maloney等，Blood 902188-2195(1997))。RITUXAN還已與化療劑如CHOP(例如環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松)聯合來治療低分級或濾泡性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者(Czuczman等，J.Clin.Oncol.17268-76(1999)；和McLaughlin等，(1998a))。
此外，在轉讓給IDEC Pharmaceuticals Corporation的一項專利(美國專利No.6,113,198)中提及使用抗B7抗體治療B細胞淋巴瘤。然而，該專利集中在其用于治療疾病的用途，在該疾病中，免疫抑制對于治療是有益的。例子包括過敏性、自身免疫和移植適應癥。
CD40在成熟B細胞的細胞表面以及白血病和淋巴細胞B細胞及霍奇金病(HD)的霍奇金細胞和鏡形(RS)細胞上表達(Valle等，Eur.J.Immunol.191463-1467(1989)；和Gruss等，Leuk.Lymphoma24393-422(1997))。CD40是導致正常和惡性B細胞如非霍奇金濾泡性淋巴瘤活化和存活的B細胞受體(Johnson等，Blood821848-1857(1993)；和Metkar等，Cancer Immunol.Immunother.47104(1998))。通過CD40受體的信號作用保護未成熟B細胞和B細胞淋巴瘤免受IgM或Fas誘發(fā)的細胞凋亡(Wang等，J.Immunology1553722-3725(1995))。類似地，套細胞淋巴瘤細胞具有高水平的CD40，加入外源性CD40L可增加其存活并使它們免受氟達拉濱誘發(fā)的細胞凋亡(Clodi等，Brit.J.Haematol.103217-219(1998))。相比之下，其他人報道了CD40刺激可在體外(Funakoshi等，Blood832787-2794(1994))和在體內(Murphy等，Blood 861946-1953(1995))抑制腫瘤B細胞生長。
抗CD40抗體(參見美國專利No.5,874,082和5,667,165)施用于小鼠可增加帶有人B細胞淋巴瘤的小鼠的存活(Funakoshi等，(1994)；和Tutt等，J.Immunol.1613176-3185(1998))。使用抗CD40抗體模擬CD40L的作用從而傳遞死亡信號來治療腫瘤包括B細胞淋巴瘤和EBV誘發(fā)的淋巴瘤的方法在美國專利No.5,674,492(1997)中有所記載，在此以其整體引入本文作為參考。CD40信號作用還與其與CD20的協(xié)同相互作用相關(Ledbetter等，Circ.Shock 4467-72(1994))。其它描述抗CD40抗體制備和應用的參考文獻包括美國專利No.5,874,085(1999)、5,874,082(1999)、5,801,227(1998)、5,674,492(1997)和5,667,165(1997)，在此以其整體引入本文作為參考。
一種CD40配體，gp39(也稱為CD40配體，CD40L或CD154)在活化的但不是靜止的CD4+Th細胞上表達(Spriggs等，J.Exp.Med.1761543-1550(1992)；Lane等，Eur.J.Immunol.222573-2578(1992)；和Roy等，J.Immunol.1511-14(1993))。CD40和CD40L均已被克隆并表征(Stamenkovi等，EMBO J.81403-1410(1989)；Armitage等，Nature 35780-82(1992)；Lederman等，J.Exp.Med.1751091-1101(1992)；和Hollenbaugh等，EMBO J.114313-4321(1992))。人CD40L還記載于美國專利No.5,945,513中。用CD40L基因轉染并在其表面表達CD40L蛋白的細胞可觸發(fā)B細胞增殖，并且與其他刺激信號一起可誘發(fā)抗體產生(Armitage等，(1992)；和美國專利No.5,945,513)。CD40L可能在霍奇金病區(qū)域中腫瘤濾泡內的腫瘤B細胞(CD4+)或鏡形細胞(CD4+)的細胞接觸依賴性相互作用中起重要作用(Carbone等，Am.J.Pathol.147912-922(1995))?？笴D40L單克隆抗體據報道已被有效用于在LP-BM5-感染的小鼠中抑制小鼠AIDS(MAIDS)的誘發(fā)(Green等，Virology 241260-268(1998))。但是，CD40L-CD40信號作用導致惡性B細胞的存活vs.細胞死亡反應的機制還不清楚。例如，在濾泡性淋巴瘤細胞中，凋亡誘導TRAIL分子(APO-2L)的下調(Ribeiro等，British J.Haematol.103684-689(1998))和過量表達BCL-2，而在B-CLL情況下，CD95(Fas/APO-1)的下調(Laytragoon-Lewin等，Eur.J.Haematol.61266-271(1998))，已被提出作為存活的機制。與此相比，在濾泡性淋巴瘤中存在證據，即CD40活化導致TNF(Worm等，International Immunol.61883-1890(1994))CD95分子(Plumas等，Blood 912875-2885(1998))的上調.
還已制備了抗CD40抗體用于預防或治療抗體介導的疾病，如過敏和自身免疫病，如美國專利No.5,874,082(1999)中所述。據報道，抗CD40抗體已有效地與抗CD20抗體相聯合，在抑制培養(yǎng)的非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤的生長中產生加合作用(Benoit等，Immunopharmacology35129-139(1996))。在小鼠中的體內研究據稱證實了抗CD20抗體比個別施用抗CD40抗體在促進攜帶某些但不是全部淋巴瘤系的小鼠存活方面更為有效(Funakoshi等，J.Immunother.Emphasis TumorImmunol.1993-101(1996))。據報道，抗CD19抗體在體內治療兩種同源小鼠B細胞淋巴瘤BCL1和A31中也有效(Tutt等(1998))。還描述了針對CD40L的抗體用于治療與B細胞活化有關的疾病(歐洲專利NO.555,880(1993))。抗CD40L抗體包括單克隆抗體3E4，2H5，2H8，4D9-8，4D9-9，24-31，24-43，89-76和89-79，如美國專利NO.5,7474,037(1998)中所述，在美國專利NO.5,876,718(1999)中所述的抗CD40L抗體被用于治療移植物抗宿主疾病。
抗CD22單克隆抗體的合成及其在治療方案中的應用也已有報道。CD22是一種參與B細胞粘附的B細胞特異性分子，其可能在同型或異型相互作用中發(fā)揮功能(Stamenkovic等，Nature34474(1990)；Wilson等，J.Exp.Med.173137(1991)；Stamenkovic等，Cell661133(1991))。CD22蛋白在祖B細胞和前B細胞的胞質中表達(Dorken等，J.Immunol.1364470(1986)；Dorken等，Expression ofcytoplasmic CD22 in B-cell ontogeny.In Leukocyte Typing III，WhiteCell Differentiation Antigens.McMichael等編著，Oxford UniversityPress，Oxford，p.474(1987)；Schwarting等，Blood65974(1985)；Mason等，Blood69836(1987))，但僅在成熟B細胞表面發(fā)現。與表面IgD存在時間相同(Dorken等，J.Immunol.1364470(1986))。CD22表達在活化后增加并隨著進一步分化而消失(Wilson等，J.Exp.Med.173137(1991)；Dorken等，J.Immunol.1364470(1986))。在淋巴樣組織中，CD22由濾泡的套和邊緣區(qū)B細胞表達，但生發(fā)中心B細胞僅微弱表達(Dorken等，J.Immunol.1364470(1986)；Ling等，”B-cell and plasma antigensnew and previously defined cluster”，Leukocyte Typing III.White Cell Differentiation Antigens，McMichael等編著，Oxford University Press，Oxford，p.302(1987))。但是，原位雜交顯示，CD22 mRNA在生發(fā)中心內表達最強，而在套區(qū)域內表達較弱(Wilson等，J.Exp.Med.173137(1991))。預計CD22參與B細胞活化的調節(jié)，因為發(fā)現在體外CD22 mAb與B細胞的結合增加胞內游離鈣和表面Ig交聯后誘導的增殖(Pezzutto等，J.Immunol.13898(1987)；Pezzutto等J.Immunol.1401791(1988))。但是，其它研究確定，抗Ig誘導增殖的增加不大(Dorken等，J.Immunol.1364470(1986))。CD22為構成性磷酸化，但磷酸化水平在用PMA處理細胞后增加(Boue等，J.Immunol.140192(1988))。此外，可溶形式的CD22抑制CD3介導的人T細胞活化，提示CD22可能在T細胞-B細胞相互作用中是重要的(Stamenkovic等，Cell661133(1991))。
特異性結合CD22受體的配體已被報道在多種疾病的治療中具有潛在應用價值，特別是B細胞淋巴瘤和自身免疫病。具體地說，已報道了使用標記的和未標記的抗CD22抗體治療這類疾病。
例如，Tedder等，美國專利5,484,892聲稱高親和力結合CD22并阻斷CD22與其它配體的相互作用。這些單克隆抗體據稱可用于治療自身免疫病，如腎小球腎炎、Goodpasture綜合征、壞死性血管炎、淋巴結炎、結節(jié)性動脈周圍炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、關節(jié)炎、血小板減少性紫癜、粒細胞缺乏、自身免疫性溶血性貧血，并用于抑制針對外來抗原如妊娠期間的胚胎抗原的免疫反應，重癥肌無力、胰島素抵抗糖尿病、Grave′s病和過敏反應。
此外，Leung等，美國專利5,789,557公開了由CDR移植產生的嵌合的和人源化的抗CD22單克隆抗體及其綴合和非綴合形式在治療和診斷B細胞淋巴瘤和白血病中的用途。該參考文獻特別公開了與細胞毒性物質如化療藥物、毒素、重金屬和放射性核素綴合的這種抗體(參見美國專利5,789,554，1998年8月4日授予Leung等，并轉讓給Immunomedics)。
另外，PCT申請WO 98/42378，WO 00/20864和WO 98/41641描述了特異性針對CD22的單克隆抗體、綴合物和片段及其治療用途，特別是用于治療B細胞相關疾病。
還提出了使用抗CD22抗體治療自身免疫病和癌癥。參見例如美國專利5,443,953，1995年8月22日授予Hansen等，并轉讓給Immunomedics Inc.，其描述了抗CD22免疫綴合物用于診斷和治療，特別是用于治療病毒和細菌感染性疾病、心血管疾病、自身免疫病和癌癥；美國專利5,484,892，1998年1月16日授予Tedder等，并轉讓給Dana-Farber Cancer institute，Inc.，其描述了多種針對CD22的單克隆抗體，用于治療疾病，在所述疾病中延遲或阻斷CD22粘附功能對于治療是有益的，特別是自身免疫病。這些參考文獻提示抗CD22抗體或片段可直接或間接綴合至所需的效應部分，例如可檢測的標記，如酶、熒光團、放射性核素、電子轉移劑(在體外免疫測定或體內顯像過程中)，或治療效應部分，例如毒素、藥物或放射性同位素。
另外，IgG1同種型的抗人CD22單克隆抗體可從LeincoTechnologies購得，并且據報道可用于治療B細胞淋巴瘤和白血病，包括毛細胞白血病。(Campana，D.等，J.Immunol.1341524(1985))。Dorken等，J.Immunol.1504719(1993)和Engel等，J.Immunol.1504519(1993)也均描述了特異性針對CD22的單克隆抗體。
此外，文獻中已報道了使用抗CD19抗體及其片段治療淋巴瘤。例如，美國專利5,686,072，1997年11月11日授予Uhr等，并轉讓給University of Texas，公開了使用抗CD19和抗CD22抗體及免疫毒素治療白血病淋巴瘤。該專利以其整體引入本文作為參考。
另外已報道了使用抗CD19抗體對白血病的狀況和預后進行分類。
由此基于前述，很明顯已報道了多種單獨抗體具有治療腫瘤性疾病的治療潛能。雖然這樣，本方面的一個目的是提供用于治療多種惡性腫瘤包括淋巴瘤和白血病的新的抗體方案。
發(fā)明概述及目的為此，本方面的一個目的是提供一種新的改進的抗體療法用于治療多種腫瘤性疾病包括B細胞惡性腫瘤，如任何級別的霍奇金和非霍奇金淋巴瘤。
更具體地說，本發(fā)明的一個目的是提供一種新的抗體方案，用于治療腫瘤性疾病，包括施用至少一種免疫調節(jié)或免疫調制抗體，以及任選地至少一種B細胞耗盡抗體。
更具體地說，本發(fā)明的一個目的是提供一種新的抗體療法用于治療腫瘤性疾病，其包括施用至少一種免疫調節(jié)或免疫調制抗體，優(yōu)選選自抗B7抗體、抗CD23抗體、抗CD40抗體、抗CD40L抗體和抗CD4抗體；以及任選地至少一種B細胞耗盡抗體，優(yōu)選選自抗CD20抗體、抗CD19抗體、抗CD22抗體和抗CD37抗體。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述治療或療法將包括施用治療有效量的抗B7抗體，與施用治療有效量的抗CD20抗體相結合。
在其他的實施方案中，本發(fā)明的特別目的是提供對腫瘤性疾病的治療或預防，包括施用治療有效量的針對CD40L的抗體與治療有效量的針對B7的抗體相結合。優(yōu)選施用該抗體組合以治療B細胞惡性腫瘤如非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴細胞白血病(CLL)，甚至更優(yōu)選所述組合包括那些在美國專利6,113,898中公開的B7抗體和那些在美國專利6,001,358中公開的抗CD40L抗體。
因此，本發(fā)明的一個重要方面包括治療哺乳動物的腫瘤性疾病的方法，其包括以下步驟向所述哺乳動物施用治療有效量的第一免疫調節(jié)抗體；和向所述哺乳動物施用治療有效量的第二免疫調節(jié)抗體或B細胞耗盡抗體，其中所述第一和第二免疫調節(jié)抗體結合不同的抗原，并且第一免疫調節(jié)抗體和第二免疫調節(jié)抗體或B細胞耗盡抗體可以以任何次序或同時施用。
本發(fā)明的另一目的是提供新的組合、產品和/或藥盒用于治療腫瘤性疾病包括B細胞惡性腫瘤，B細胞淋巴瘤和白血病，其中所述藥盒或產品包括至少一種免疫調節(jié)或免疫調制抗體，和任選地至少一種B細胞耗盡抗體。優(yōu)選地，所述免疫調節(jié)或免疫調制抗體將包括至少一種抗CD23抗體、抗CD40抗體、抗CD40L抗體或抗B7抗體，而B細胞耗盡抗體將特異性針對CD20，CD19，CD22或CD37。最優(yōu)選所述藥盒或產品將包括抗CD40L或抗B7抗體或其組合以及任選地抗CD20抗體。另外，所述產品將包括插頁、使用說明或帶標簽的容器，指示其內容物可用于治療腫瘤性疾病。
本方面的另一個目的是提供一種用于治療B細胞淋巴瘤或B細胞白血病的聯合療法，包括抗CD40L抗體或抗體片段或CD40L拮抗劑，和至少一種以下物質(a)化療劑或化療劑組合，(b)放療，(c)抗CD20抗體或其片段，(d)抗CD40抗體或其片段，(e)抗CD19抗體或其片段，(f)抗CD22抗體或其片段，(g)細胞因子，(h)抗B7抗體或其片段，其中抗體可以綴合毒素或者放射性標記，或用人恒定區(qū)進行改造以引發(fā)人抗體效應機制，及導致靶細胞的凋亡或死亡。
參考以下對優(yōu)選的示例性實施方案的詳細描述，本領域的技術人員將清楚了解本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點。


圖1、暴露4小時之后B淋巴瘤細胞對阿霉素的敏感性。
圖2、(A)抗CD40L(IDEC-131)克服B淋巴細胞瘤對ADM殺傷的CD40L介導抗性。(B)RITUXAN對正常的和sCD 40L預處理的DHL-4細胞的作用。
圖3、(A)抗CD40L抗體(IDEC-131)對B-CLL的CD40L介導細胞存活的阻斷。(B)Rituxan對B-CLL的CD40L介導存活的阻斷。
圖4、在與sCD40L一起培養(yǎng)和不與sCD40L一起培養(yǎng)的CD19+CLL細胞中HLA-DR表達的FACS分析。
圖5、圖示兩個不同批次的IDEC-114與膜結合CD80細胞的結合活性，使用表達CD80分子的CHO細胞通過流式細胞儀進行測定。
圖6、圖示IDEC-114和rituximab對SB或SKW細胞的ADCC活性。
圖7、圖示IDEC-114、rituximab及其組合對從兩個供體A和B獲得的活化宿主細胞的ADCC活性。
圖8A、圖示IDEC-114對表達CD80的CHO細胞的CDC活性。
圖8B、圖示IDEC-114和rituximab對表達CD80的SKW細胞的CDC活性。
圖8C、圖示IDEC-114和rituximab對表達CD80的Daudi細胞的CDC活性。
圖9A、圖示SKW/SCID小鼠對IDEC-114的抗腫瘤應答。
圖9B、圖示SKW/SCID小鼠對rituximab的抗腫瘤應答。
圖10、圖示SKW/SCID小鼠對IDEC-114與rituximab相結合的抗腫瘤應答。
發(fā)明詳述盡管本發(fā)明可以以許多不同的形式實施，本文公開的是其具體的示例性實施方案，其例示本發(fā)明的原理。應該強調本發(fā)明并不限于所例舉的具體實施方案。
本發(fā)明提供了新的抗體方案，包括施用至少一種免疫調制或免疫調節(jié)抗體(對于本文所公開內容，所述術語可以互換使用)，例如抗B7抗體、抗CD23抗體、抗CD40抗體或抗CD40L抗體，和任選地至少一種B細胞耗盡抗體，例如抗CD20、抗CD19、抗CD22或抗CD37抗體，其具有實質性的B細胞耗盡活性。
基于所述抗體引發(fā)治療效益的不同機制，這種組合將產生協(xié)同效果。具體地說，理論上認為互補的作用機制將產生更為持久和有效的臨床反應，因為兩種或多種免疫調節(jié)抗體或免疫調節(jié)抗體與B細胞耗盡抗體可一致攻擊任何腫瘤細胞。例如，在某些實施方案中，B細胞耗盡抗體將耗盡活化的B細胞，該細胞可能對免疫調節(jié)或免疫調制抗體如抗B7或抗CD40L抗體的作用抵抗。對于T細胞以及抗體產生細胞，這種活化的B細胞可能作為有效的抗原呈遞細胞發(fā)揮作用。在B細胞惡性腫瘤中，這種活化的B細胞可能包括惡性細胞，這種細胞如果不根除，將產生新的癌細胞和腫瘤。
因此，本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案包括治療患有腫瘤性疾病患者的方法，包括施用治療有效量的免疫調節(jié)抗體的組合或免疫調節(jié)抗體與B細胞耗盡抗體。在特別優(yōu)選的實施方案中，免疫調節(jié)抗體的組合將包括針對CD40L的抗體或其免疫反應性片段和針對B7的抗體或其免疫反應性片段。本領域技術人員將理解所述兩種免疫調節(jié)抗體可以以任何次序或同時施用，并且治療有效量可以用熟知的技術容易地進行判斷。此外，施用免疫調節(jié)抗體與輔助治療如B細胞耗盡抗體、化療或放射免疫治療的組合屬于本發(fā)明的范圍之內。
在此“B細胞耗盡抗體”是經施用導致可證明的B細胞耗盡的抗體或片段。通常這種抗體會與在B細胞表面上表達的B細胞抗原或B細胞標記結合。優(yōu)選這種抗體在施用后，通常在約數天之內或更短，會導致B細胞數目減少約50％或更多。在優(yōu)選的實施方案中，B細胞耗盡抗體是RITUXAN(一種抗CD20嵌合抗體)或具有基本上相同或至少20-50％RITUXAN細胞耗盡活性的抗體。
在此“B細胞表面標記”或“B細胞靶”或“B細胞抗原”是在B細胞表面上表達的抗原，與其結合的激動劑或拮抗劑可以以其為目標。示例性的B細胞表面標記包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86(B7.2)白細胞表面標記。特別感興趣的B細胞表面標記較哺乳動物的其它非B細胞組織優(yōu)先在B細胞上表達，并且可能在前體B細胞和成熟的B細胞上均有表達。在一個實施方案中，所述標記類似于CD20或CD19，是在該細胞系的整個分化過程中(從干細胞階段直至就在最終分化為漿細胞之前的那一點)的B細胞上均有發(fā)現的一種標記。在此優(yōu)選的B細胞表面標記是CD19和CD20。在此優(yōu)選的B細胞表面標記是CD19、CD20、CD22、CD23、CD80和CD86。
在此使用的“免疫調節(jié)抗體”或“免疫調制抗體”指通過與耗盡B細胞不同的機制而產生對免疫系統(tǒng)的效應的抗體，例如通過CDL和/或ADCC活性，并可能是激動劑。其實例包括抑制T細胞免疫、B細胞免疫的抗體，例如通過誘導耐受(抗CD40L，抗CD40)，或其它免疫抑制抗體，例如抑制B7細胞信號作用的抗體(抗-B7.1，抗-B7.2、抗CD4、抗CD23等)。在某些情況下，免疫調節(jié)抗體可能具有增強凋亡的能力。另外，正常情況下為B細胞耗盡抗體的抗體可被改造成為免疫調節(jié)性，通過實體化人恒定區(qū)以利用不同的效應機制。
在討論本發(fā)明之前，提供以下額外定義在此使用的術語“抗體”旨在包括免疫球蛋白及其片段，它對其所指定的蛋白或肽有特異反應性?？贵w可包括人抗體、靈長類動物源化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、與其他蛋白或放射性標記融合的抗體以及抗體片段。此外，在此術語“抗體”使用其最廣義并具體涵蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、從至少兩種完整的抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們呈現出所需要的生物學活性即可。除非特別指明或在上下文中指出，對于本申請和權利要求的目的而言術語“抗體”應廣義理解，并明確包括所有變體、其片段或免疫反應性構建體，其提供如本文所述的所需要的調節(jié)或耗盡效應。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括其抗原結合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；diabodies；線狀抗體；單鏈抗體分子；結構域缺失的抗體；和從抗體片段形成的多特異性抗體。抗體片段可以使用常規(guī)技術分離。例如，F(ab1)2片段可通過用胃蛋白酶處理抗體而生成。所得的F(ab1)2片段可作處理以還原二硫鍵從而產生Fab1片段。
“天然抗體”通常是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵連接到重鏈，而二硫鍵的數目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之中各異。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個可變區(qū)(VH)然后是數個恒定區(qū)。每條輕鏈在一端具有一個可變區(qū)(VL)，在其另一端具有一個恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)并列，而輕鏈可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)并列。據信特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成界面。
術語“可變”指這樣一個事實，即可變區(qū)的某些部分的序列在抗體之中有廣泛的差異并用于各特定抗體與其特定抗原的結合和特異性。但是，變異性在整個抗體可變區(qū)中并不是平均分布的。它集中在稱為高變區(qū)的3個節(jié)段(在輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)中均有)?？勺儏^(qū)中更為高度保守的部分稱為構架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包含4個FR，大部分采取β折疊構型，由3個高變區(qū)連接，其形成連接β折疊結構的袢，在某些情況下形成部分β-折疊結構。在每條鏈中的高變區(qū)由FR緊緊拉到一起，并且與來自另一條鏈的高變區(qū)一起作用于形成抗體的抗原結合部位(參見Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定區(qū)不直接涉及抗體與抗原的結合，但表現出多種效應子功能，如抗體參與抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為“Fab”片段，各有單一的抗原結合部位，和殘余的“Fc”片段，其名稱反映了其容易結晶的能力。用胃蛋白酶處理產生一個F(ab’)2片段，其具有兩個抗原結合部位并仍能交聯抗原。
“Fv”是最小的抗體片段，其含有完整的抗原識別和抗原結合部位。該區(qū)域由緊密非共價結合的一個重鏈和一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。它取這種構型，使得各可變區(qū)的3個高變區(qū)相互作用，以在VH-VL二聚體表面上形成一個抗原結合部位。6個高變區(qū)集中起來賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單一一個可變區(qū)(或Fv的一半，僅包含對抗原特異性的3個高變區(qū))也具有識別和結合抗原的能力，盡管其親和力比整個結合部位要低。
Fab片段還含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CHI)。Fab’片段與Fab片段的差異在于在重鏈CHI區(qū)的羧基末端添加了幾個殘基，包括一個或多個來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab’-SH是此處對其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇基團的Fab’的命名。F(ab’)Z抗體片段最初是作為成對Fab’片段產生的，其間具有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學偶聯也是已知的。
來自任何脊椎動物種類的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”基于其恒定區(qū)的氨基酸序列，可以歸于兩個明顯不同的類型(稱為κ和λ)之一。
取決于其重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體可以歸于不同的種類。完整抗體有5個主要類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些中幾種可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGI、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應于不同抗體類別的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ和μ。優(yōu)選重鏈恒定區(qū)將完善γ1、γ2、γ3和γ4恒定區(qū)。優(yōu)選這些恒定區(qū)還包含修飾以增強抗體穩(wěn)定性，如在美國專利No.6,011,138(在此全部引入作為參考)中公開的P和E修飾。不同類別免疫球蛋白的亞基結構和三維構型也是熟知的。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包括抗體的VH和VL區(qū)，其中這些區(qū)以單一多肽鏈存在。優(yōu)選Fv多肽進一步包含在VH和VL區(qū)之間的多肽接頭，其使scFv能形成結合抗原所需的結構。關于scFv的綜述，參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore編著，Springer-Verlag，New York，269-315頁(1994)。
術語“diabodies”指具有兩個抗原結合部位的小抗體片段，該片段在相同多肽鏈(VH-VL)中包含重鏈可變區(qū)(VH)連接到輕鏈可變區(qū)(VL)。通過使用一個短接頭(其長度不足以使得在相同鏈上的兩個區(qū)之間發(fā)生配對)，強制所述區(qū)與另一條鏈的互補區(qū)配對并創(chuàng)建兩個抗原結合部位。關于diabodies更完全的記載，參見例如EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)。
在此術語“單克隆抗體”用于指從一群實質上同質的抗體中獲得的抗體，即構成該群體的各抗體除了可能的天然發(fā)生的突變(其可能以較小量存在)外是完全相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制劑相比，每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)勢在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)而合成的，未被其它免疫球蛋白污染。
“人源化抗體”是指從非人抗體通常是小鼠抗體衍生的抗體，其保留了或基本上保留了親本抗體的抗原結合特性，但在人類中免疫原性較低。這可以通過多種方法實現，包括(a)將整個非人可變區(qū)移植到人恒定區(qū)上以生成嵌合抗體；(b)僅將非人互補決定區(qū)(CDR)移植入人構架區(qū)和恒定區(qū)，保留或不保留關鍵的構架殘基；和(c)移植整個非人可變區(qū)，但通過替換表面殘基而用人樣部分“庶掩”它們。這種方法公開在以下文獻中Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-5(1984)；Morrison等，Adv.Immunol.4465-92(1988)；Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28489-498(1991)；和Padlan，Molec.Immun.31169-217(1994)，上述文獻均以其整體引入本文作為參考。人源化抗CD40L抗體可以如1995年11月7日提交的U.S.P.N.6,001,358中所述進行制備，該專利亦以其整體引入本文作為參考。
“人抗體”是指完整包含人輕鏈和重鏈以及恒定區(qū)的抗體，由任何已知的標準方法制備。
“靈長類動物源化抗體”是指一種重組抗體，其經改造而包含猴(或其它靈長類動物)抗體特別是獼猴抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)，并且含有人恒定區(qū)序列，優(yōu)選人免疫球蛋白γ1或γ4恒定區(qū)(或PE變體)。這種抗體的制備如以下文獻中所述Newman等，Biotechnology，101458-1460(1992)；以及普通轉讓的08/379,072、08/487,550或08/746,361，以上文獻均以其整體引入本文作為參考。這些抗體據報道表現出與人抗體的高度同源性，即85-98％，展現出人效應功能，免疫原性降低，并且可表現出與人抗原的高親和力。
“抗體片段”是指抗體的片段，如Fab、F(ab’)2、Fab’和scFv。
“嵌合抗體”是指包含來源于兩種不同抗體(通常為不同物種)的序列的抗體。最為典型的情況是，嵌合抗體包含人和小鼠抗體片段，通常是人恒定區(qū)和小鼠可變區(qū)。
“CD20”抗原是一種在大于90％來自外周血或淋巴樣器官的B細胞表面上發(fā)現的35kDa非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B細胞發(fā)育過程中表達并保持到直至分化為漿細胞。CD20存在于正常B細胞以及惡性B細胞上。在文獻中CD20的其它名稱包括“B淋巴細胞限制性抗原”和“Bp35”。Clark等，PNAS(USA)821766(1985)描述了CD20抗原。
“CD19”抗原指例如由HD237-CD19或B4抗體識別的一種90kDa抗原(Kiesel等，Leukemia Research II，121119(1987))。象CD20一樣，發(fā)現CD20存在于該細胞系整個分化過程中(從干細胞階段直至就在最終分化為漿細胞之前的那一點)的細胞上。拮抗劑與CD19的結合可引起CD19抗原的內化。
“CD22”抗原指一種在B細胞上表達的抗原，也稱為“BL-CAM”和“LybB”，其參與B細胞信號作用和粘附(參見Nitschke等，Curr.Biol.7133(1997)；Stamenkovic等，Nature 34574(1990))。該抗原是一種膜免疫球蛋白相關抗原，當膜Ig連接時發(fā)生酪氨酸磷酸化(Engel等，J.Etyp.Med.181(4)1521，1586(1995))。已克隆了編碼該抗原的基因，并表征了其lg結構域。
B7抗原包括B7.1(CD80)、B7.2(CD86)和B7.3抗原，它們是在B細胞上表達的跨膜抗原。特異性結合B7抗原包括人B7.1和B7.2抗原的抗體在本領域中是已知的。優(yōu)選的B7抗體包括由Anderson等在美國專利No.6,113,198(轉讓給IDEC PharmaceuticalsCorporation)中公開的靈長類動物源化B7抗體，以及人和人源化B7抗體。
CD23指由B和其它細胞表達的IgE的低親和性受體。在本發(fā)明中，CD23優(yōu)選是人CD23抗原。CD23抗體在本領域中也是已知的。在本發(fā)明中最優(yōu)選CD23抗體是人抗人CD23抗體或包含人IgGI或IgG3恒定區(qū)的嵌合抗人CD23抗體。
B細胞“拮抗劑”是這樣一種分子，其經與B細胞表面標記結合而破壞或耗盡哺乳動物的B細胞和/或干擾一種或多種B細胞功能，例如通過減少或阻止由B細胞引發(fā)的體液應答。所述拮抗劑優(yōu)選能耗盡用其治療的哺乳動物的B細胞(即降低循環(huán)B細胞水平)。這種耗盡可通過多種機制實現，如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，抑制B細胞增殖和/或誘導B細胞死亡(例如通過凋亡)。在本發(fā)明范圍之內的拮抗劑包括抗體、合成或天然序列肽以及結合B細胞標記的小分子拮抗劑，所述拮抗劑可選擇性地與細胞毒性劑結合或融合。
CD40L拮抗劑是特異性結合CD40L并優(yōu)選拮抗CD40L與CD40相互作用的一種分子。其實例包括特異性結合CD40L的抗體和抗體片段、可溶性CD40、可溶性CD40融合蛋白和結合CD40L的小分子。根據本發(fā)明優(yōu)選的拮抗劑包括特異性針對CD40的抗體或抗體片段。
“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”指一種細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體，隨后引起靶細胞溶解。介導ADCC的主要細胞—NK細胞僅表達FcyRIII，而單核細胞表達FcyRI、FcyRII和FcyRIII。在造血細胞上的FcR表達總結于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)第464頁的表3。為了評價感興趣分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定，如在美國專利No.5,500,362或5,821,337中描述的測定。對這種測定有用的效應細胞包括外周血單核的細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞?？晒┻x擇地，或額外地，可以在體內評價感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模型中，如在Clynes等，PNAS(USA)95652-656(1998)中公開的動物模型。
“人效應細胞”是表達一種或多種FcR并執(zhí)行效應子功能的白細胞。優(yōu)選所述細胞至少表達FcyRIII并執(zhí)行ADCC效應子功能。介導ADCC的人白細胞的實例包括外周血單核的細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和中性粒細胞；優(yōu)選PBMC和NK細胞。效應細胞可以從其天然來源分離，例如在此所述從血液或PBMC中分離。
術語“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體的Fc區(qū)結合的受體。優(yōu)選的FcR是一種天然序列人FeR。此外，優(yōu)選的FcR與IgG抗體結合(γ受體)并包括FcyRI、FcyRII和FcyRIII亞類的受體，包括等位基因變異體和可供選擇地這些受體的剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA(一種“活化受體”)和FcyRIIB(一種“抑制受體”)，其具有相似的氨基酸序列，主要區(qū)別在于其胞質結構域?；罨荏wFcyRIIA在其胞質結構域中含有免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其胞質結構域中含有免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITAM)(參見綜述M.in Daeon，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。關于FcR的綜述見Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)；Capel等，Immunomethods425-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126330-41(1995)。其它FcR，包括那些有待在將來鑒定的，在此都被術語“FcR”所包括。該術語還包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等，J.Immunol.117587(1976)和Kim等，J.Immunol.24249(1994))。
“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”指分子在補體的存在下溶解目標靶的能力。補體活化途徑由補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)結合與相關抗原復合的分子(例如抗體)而啟動。為了評價補體活化，可以進行CDC測定，例如在Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202163(1996)中所述。
“生長抑制性”拮抗劑阻止或減少表達拮抗劑所結合的抗原的細胞的增殖。例如，該拮抗劑可在體外和/或體內阻止或減少B細胞的增殖。
“銹導凋亡”的拮抗劑誘導例如B細胞的編程性細胞死亡，如由結合膜聯蛋白V、DNA斷裂、細胞皺縮、內質網擴張、細胞破碎和/或形成膜囊泡(稱為凋亡小體)所確定。
術語“高變區(qū)”當用于本文時指抗體中負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如在輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及在重鏈可變區(qū)中的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))，和/或那些來自“高變袢”的殘基(例如在輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及在重鏈可變區(qū)中的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987))。“構架”或“FR”殘基是那些除了在此定義的高變區(qū)殘基之外的可變區(qū)殘基。
“結合”感興趣抗原如B細胞表面標記的拮抗劑能以足夠的親和力結合該抗原，從而該拮抗劑可用作以表達該抗原的細胞即B細胞為靶目標的治療劑。
在此“抗CD20抗體”是特異性結合CD20抗原優(yōu)選人CD20的抗體，其具有可測量的B細胞耗盡活性，優(yōu)選具有至少約10％的RITUXAN(參見美國專利No.5,736,137，全部引入本文作為參考)的B細胞耗盡活性。
如先前所提到的，在此術語“rituximab”或“RITUXAN”指針對CD20抗原的基因工程嵌合小鼠/人單克隆抗體，在美國專利No.5,736,137(在此特別引作參考)中命名為“C2B8”。該抗體是一種IgGIκ免疫球蛋白，含有小鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)序列以及人恒定區(qū)序列。Rituximab對CD20抗原的結合親和力大約為8.0nM。
在此“抗CD22抗體”是特異性結合CD22抗原優(yōu)選人CD22的抗體，其具有可測量的B細胞耗盡活性，優(yōu)選具有至少約10％的RITUXAN的B細胞耗盡活性。
在此“抗CD19抗體”是特異性結合CD19抗原優(yōu)選人CD19的抗體，其具有可測量的B細胞耗盡活性，優(yōu)選具有至少約10％的RITUXAN的B細胞耗盡活性。
在此“抗CD37抗體”是特異性結合CD37抗原優(yōu)選人CD37的抗體，其具有可測量的B細胞耗盡活性，優(yōu)選具有至少約10％的RITUXAN的B細胞耗盡活性。
在此“抗-B7抗體”是特異性結合B7.1、B7.2或B7.3最優(yōu)選人B7.3的抗體，該抗體抑制B7/CD28相互作用，并且實質上不抑制B7/CTLA-4相互作用，甚至更優(yōu)選在美國專利6,113,898(在此全部引入作為參考)中描述的特定抗體。IDEC-114(IDEC Pharmaceuticals，San Diego CA)是一種抗B7抗體，其目前正處于II期臨床試驗，可適用于本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。近來已顯示這些抗體促進凋亡。因此，它們非常適合抗腫瘤應用。結合B7抗原的抗體的其他實例包括以下抗體授予Linsley等的美國專利5,885,577中報道的B7抗體；授予DeBoer等(轉讓給Chiron Corporation)的美國專利5,869,050中報道的抗B7抗體。
“抗CD40L抗體”是特異性結合CD40L(也稱為CD154，gp39，TBAM)的抗體，優(yōu)選具有激動劑活性。優(yōu)選的抗CD40L抗體具有在美國專利No.6,011,358(轉讓給IDEC Pharmaceuticals Corporation，在此全部引入作為參考)中公開的人源化抗體的特異性。IDEC-131(IDEC Pharmaceuticals，San Diego CA)是一種抗CD40L抗體，其目前正處于II期臨床試驗，可適用于本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
“抗CD4抗體”是特異性結合CD4優(yōu)選人CD4的抗體，更優(yōu)選是靈長類動物源化或人源化抗CD4抗體。
“抗CD40抗體”是特異性結合CD40優(yōu)選人CD40的抗體，如在美國專利5,874,085、5,874,082、5,801,227、5,674,442和5,667,165(在此全部引作參考)中公開的那些。
優(yōu)選B細胞耗盡抗體和免疫調節(jié)抗體均含有人恒定區(qū)。合適的抗體可包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同種型。
結合CD20抗原的抗體的具體實例包括“Rituximab”(“RITUXAN”)(美國專利No.5,736,137，特別在此引作參考)；釔-[90]-標記的2B8小鼠抗體“Y2B8”(美國專利No.5,736,137，特別在此引作參考)；任選地用131I標記(131I B1)的小鼠IgG2a“B1”抗體(BEXXARTM)(美國專利No.5,595,721，特別在此引作參考)；小鼠單克隆抗體“1F5”(Press等，Blood 69(2)584-591(1987))；和“嵌合2H7”抗體(美國專利No.5,677,180，特別在此引作參考)。
結合CD22的抗體的具體實例包括由Immunomedics報道的LymphocideTM，現在處于對非霍奇金淋巴瘤的臨床試驗之中。
結合CD23的抗體的具體實例是廣為人知的，優(yōu)選包括由Reff等在1999年7月4日頒發(fā)的美國專利No.6,011,138(普通轉讓給IDECPharmaceuticals Corp.和Seikakagu Corporation of Japan)中報道的特異性針對人CD23的靈長類動物源化抗體；由Bonnefoy等，No.9612741；Rector等，J.Immunol.55481-488(1985)；Flores-Rumeo等，Science 2411038-1046(1993)；Sherr等，J.Immunol.，142481-489(1989)；和Pene等，PNAS，USA 856820-6824(1988)報道的那些。IDEC-152(IDEC Pharmaceuticals，San Diego CA)是一種抗CD23抗體，其目前正處于II期臨床試驗，可適用于本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。據報道這些抗體可用于治療過敏、自身免疫病和炎性疾病。
“分離的”拮抗劑指已被鑒定并分離和/或從其天然環(huán)境的組分中回收。其天然環(huán)境的污染組分是會干擾拮抗劑的診斷或治療應用的物質，并可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶質。在優(yōu)選的實施方案中，拮抗劑將被純化(1)至大于95wt％的拮抗劑，如Lowry法所確定，并最優(yōu)選超過99wt％，(2)其純化程度足以通過使用轉杯式測序儀獲得N末端或內部氨基酸序列的至少15個殘基，或(3)純化至使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染在還原或非還原條件下SDS-PAGE中表現為均一。分離的拮抗劑包括在重組細胞內原位的拮抗劑，因為拮抗劑的天然環(huán)境的至少一種組分將不存在。但是通常分離的拮抗劑將通過至少一個純化步驟來制備。
用于治療目的的“哺乳動物”指任何分類為哺乳動物的動物，包括人、家畜和農場動物以及動物園、運動或寵物動物，如狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選所述哺乳動物是人。
“治療”指治療性治療和預防性措施。那些需要治療的包括已患有疾病或障礙的以及有待預防疾病或障礙的那些。因此，所述哺乳動物可能已經被診斷為患有疾病或障礙或可能傾向于或易患該疾病。
如以上詳細討論的，本發(fā)明提供用于治療需要治療的哺乳動物對象中的腫瘤性疾病的化合物、組合物、藥盒和方法。優(yōu)選所述對象是人。所述腫瘤性疾病(例如癌癥和惡性腫瘤)可包括實體瘤如黑素瘤、神經膠質瘤、肉瘤和癌以及髓樣或血液系統(tǒng)惡性腫瘤如淋巴瘤和白血病。一般來說，本文所公開的發(fā)明可用于預防性或治療性治療任何腫瘤，所述腫瘤包含抗原性標記，從而經修飾的抗體可以靶向針對癌細胞?？芍委煹陌┌Y實例包括但不限于前列腺、結腸、皮膚、乳腺、卵巢、肺和胰腺癌。在優(yōu)選的實施方案中，所選的本發(fā)明抗體組合可用于診斷或治療結腸癌或其他胃癌。更具體地，本發(fā)明的抗體可用于治療卡波西肉瘤、CNS腫瘤(毛細血管母細胞瘤、腦膜瘤和腦轉移)、黑素瘤、胃腸和腎肉瘤、橫紋肌肉瘤、膠質母細胞瘤(優(yōu)選多形性膠質母細胞瘤)、平滑肌肉瘤、視網膜母細胞瘤、卵巢的乳頭狀囊腺癌、Wilm’s腫瘤或小細胞肺癌。應理解，鑒于本發(fā)明所公開的內容，可根據與每種前述腫瘤相關的腫瘤相關抗原得到適宜的抗體組合，而無需過多試驗。
可用本發(fā)明治療的血液系統(tǒng)惡性腫瘤的實例包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤以及白血病，包括ALL-L3(伯基特型白血病)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)和單核細胞白血病。應理解本發(fā)明的化合物和方法對治療多種B細胞淋巴瘤特別有效，包括低分級/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、細胞淋巴瘤(FCC)、套細胞淋巴瘤(MCL)、彌漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴細胞(SL)NHL、中間分級/濾泡性NHL、中間分級彌漫性NHL、高分級免疫母細胞NHL、高分級淋巴母細胞NHL、高分級小未分裂細胞NHL、bulky disease NHL和Waldenstrom巨球蛋白血癥。本領域技術人員應很清楚，由于不斷改變的分類系統(tǒng)，這些淋巴瘤和白血病通常會有不同的命名，患有分類為不同名稱的血液系統(tǒng)惡性腫瘤的患者也可受益于本發(fā)明的聯合治療方案。除了前述腫瘤性疾病之外，應理解本發(fā)明可有利地用于治療其他攜帶相容的腫瘤相關抗原的惡性腫瘤。
在優(yōu)選的實施方案中，所述腫瘤性疾病將包括B細胞惡性腫瘤。根據本發(fā)明，這包括任何B細胞惡性腫瘤，例如B細胞淋巴瘤和白血病。優(yōu)選的實例包括霍奇金病(所有形式，例如復發(fā)性霍奇金病、耐藥的霍奇金病)、非霍奇金淋巴瘤(低分級、中間分級、高分級和其他類型)。實例包括小淋巴細胞/B細胞慢性淋巴細胞白血病(SLL/B-CLL)、漿細胞樣淋巴細胞性(lymphoplasmacytoid)淋巴瘤(LPL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、彌漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特淋巴瘤(BL)、AIDS相關淋巴瘤、單核細胞B細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞淋巴結??；小淋巴細胞、濾泡性、彌漫性大細胞、彌漫性小分裂細胞、大細胞免疫母細胞淋巴母細胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、濾泡性大細胞為主、濾泡性小分裂細胞為主、和濾泡性混合的小分裂細胞和大細胞淋巴瘤。參見，Gaidono等，“Lymphomas”，CANCERPRINCIPLES&PRACTICEOF ONCOLOGY，Vol.22131-2145(De Vita等編著，第5版，1997).
其他類型的淋巴瘤分類包括免疫細胞瘤性Waldenstrom’sMALT-型/類單核細胞B細胞、套細胞淋巴瘤B-CLL/SLL、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤和前體B-LBL。
如所述，B細胞惡性腫瘤還特別包括白血病，如ALL-L3(伯基特型白血病)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性白細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓細胞白血病、淋巴母細胞白血病、淋巴細胞白血病、單核細胞白血病、髓細胞白血病和前髓細胞白血病及單核細胞白血病。
術語“治療有效量”指對于預防、改善或治療所關注的B細胞惡性腫瘤性疾病有效的拮抗劑的量。
此處用于輔助治療所用的術語“免疫抑制劑”指作用于抑制或掩蔽在此接受治療的哺乳動物的免疫系統(tǒng)的物質。這會包括抑制細胞因子產生、下調或抑制自身抗原表達或掩蔽MHC抗原的物質。這種藥劑的實例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶類(參見美國專利No.4,665,077，其內容在此引作參考)、硫唑嘌呤；環(huán)磷酰胺；溴隱亭；達那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美國專利No.4,120,649中所述)；針對MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環(huán)孢菌素A；類固醇如糖皮質激素，例如強的松、甲基強的松龍和地塞米松；細胞因子或細胞因子受體拮抗劑包括抗-干擾素-α、β-或δ-抗體，抗-腫瘤壞死因子-α抗體，抗-腫瘤壞死因子-β抗體，抗-白介素-2抗體和抗-IL-2受體抗體；抗-LFA-1抗體，包括抗-CD11a和抗-CD18抗體；抗-L3T4抗體；異種抗-淋巴細胞球蛋白；泛-T抗體，優(yōu)選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結合域的可溶性肽(公開于7/26/90的WO 90/08187)，streptolanase；TGF-β；鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素；雷怕霉素；T細胞受體(Cohen等，美國專利No.5,114,721)；T細胞受體片段(Offner等，Science，251430-432(1991)；WO 90/11294；laneway，Nature，341482(1989)；和WO 91/01133)；和T細胞受體抗體(EP 340,109)如T10B9。
在此所用的“細胞毒素或細胞毒性劑”指對細胞的生長和增殖有害的并可作用于減輕、抑制或破壞其所接觸的惡性腫瘤的任何物質。示例性的細胞毒素包括但不限于放射性核素、生物毒素、抑制細胞增殖的或細胞毒性的治療劑、前藥、免疫活性配體和生物應答修飾劑如細胞因子。如以下將要更詳細討論的，特別優(yōu)選放射性核素細胞毒素用于本發(fā)明。但是，任何作用于阻礙或減緩惡性細胞生長或消除惡性細胞并可與本文所公開的經修飾抗體相結合的細胞毒素均在本發(fā)明范圍之內。
應理解，在先前的研究之中，用同位素標記的抗腫瘤抗體已被成功地用于在動物模型中有時在人類中破壞實體瘤以及淋巴瘤/白血病中的細胞。放射性核素通過產生電離輻射而起作用，所述輻射引起核DNA中的多處鏈斷裂，導致細胞死亡。用于制備治療綴合物的同位素通常產生高能α-、γ-或β-粒子，其具有治療有效的光程長度。這類放射性核素殺死其臨近的細胞，例如所述綴合物附著或進入的腫瘤細胞。它們通常對非局限細胞無作用或作用極小。放射性核素基本上是無免疫原性的。
至于在本發(fā)明中使用放射性標記的綴合物，可以直接標記(如通過碘化作用)或通過使用螯合劑間接標記抗體。在此所用的短語“間接標記”和“間接標記方法”均指將螯合劑共價連到抗體上，以及將至少一種放射性核素與螯合劑相結合。這種螯合劑通常稱為雙功能螯合劑，因為它們結合多肽和放射性同位素這兩者。特別優(yōu)選的螯合劑包括1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(“MX-DTPA”)和環(huán)己基二亞乙基三胺五乙酸(“CHX-DTPA”)衍生物。其它螯合劑包括P-DOTA和EDTA衍生物。用于間接標記的特別優(yōu)選的放射性核素包括111In和90Y。
本文所用的短語“直接標記”和“直接標記方法”均指將放射性核素直接共價連到抗體上(通常通過氨基酸殘基)。更具體地說，這些連接技術包括隨機標記和定點標記。在后一種情況中，標記定向于二聚體或四聚體上的特定位點，如僅存在于綴合物的Fc部分上的N-連接的糖殘基。此外，多種直接標記技術和方案均適合于本發(fā)明。例如，锝-99m標記的抗體可以通過配體交換方法制備，通過用亞錫離子溶液還原高锝酸鹽(TcO4-)，將還原的锝螯合到Sephadex柱上，并將抗體應用于該柱；或者通過分批標記技術，例如通過溫育高锝酸鹽、還原劑如SnCl2、緩沖溶液如鄰苯二甲酸鈉-鉀溶液，和抗體。在任何情況下，優(yōu)選的用于直接標記抗體的放射性核素是本領域熟知的，特別優(yōu)選的用于直接標記的放射性核素是131I，通過酪氨酸殘基共價相連。本發(fā)明的抗體可以與例如放射性碘化鈉或碘化鉀及以下物質一起衍生化學氧化劑如次氯酸鈉、氯胺T等，或酶氧化劑如乳過氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖。但是，對于本發(fā)明的目的而言，特別優(yōu)選間接標記方法。
涉及螯合劑和螯合劑綴合物的專利在本領域中是已知的。例如，Gansow的美國專利No.4,831,175針對多取代的二亞乙基三胺五乙酸螯合物和含有其的蛋白綴合物，以及其制備方法。Gansow的美國專利No.5,099,069；5,246,692；5,286,850；5,434,287和5,124,471也涉及多取代的DTPA螯合物。這些專利以其整體引入本文。適合的金屬螯合劑的其他實例為乙二胺四乙酸(EDTA)，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，4，8，11-四氮雜十四烷，1，4，8，11-四氮雜十四烷-1，4，8，11-四乙酸，1-氧雜-4，7，12，15-四氮雜十七烷-4，7，12，15-四乙酸等。特別優(yōu)選環(huán)己基-DTPA或CHX-DTPA，并在以下詳細例示。其他合適的螯合劑包括那些有待發(fā)現的螯合劑，可容易地由本領域技術人員進行辨別，并清楚地落入本發(fā)明范圍之內。
優(yōu)選選擇合適的螯合劑，包括用于促進螯合的特定雙功能螯合劑(在同時待審的申請08/475,813；08/475,815和08/478,967中)以提供對三價金屬的高親和性，表現出腫瘤對非腫瘤之比增加和骨攝取減少，以及放射性核素在靶部位(即B細胞淋巴瘤腫瘤部位)的體內停留延長。但是，可能具有或不具有所有這些特征的其他雙功能螯合劑在本領域中是已知的并可能在腫瘤治療中也有益。
還應理解，根據本文的教導，抗體可以綴合至不同的放射性標記用于診斷和治療目的。為此，前述的同時待審的申請(在此以其整體引入本文作為參考)公開了用于在施用治療抗體之前進行腫瘤診斷性“顯像”的放射性標記的治療綴合物。“In2B8”綴合物包含特異性針對人CD20抗原的小鼠單克隆抗體2B8，其通過雙功能螯合劑即MX-DTPA(二亞乙基三胺五乙酸)連到111In上，所述螯合劑包含1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基-DTPA和1-甲基-3-異硫氰酸根合芐基-DTPA的1∶1混合物。特別優(yōu)選111In作為診斷性放射性核素，因為可以安全地施用約1-約10mCi，而無可檢測到的毒性；顯像數據通常可預測隨后的90Y標記的抗體分布。大多數顯像研究利用5mCi111In標記的抗體，因為該劑量既安全又具有與較低劑量相比增加的顯像效率，最佳顯像在施用抗體之后3-6天發(fā)生。參見例如Murray，J.Nuc.Med.263328(1985)和Carraguillo等，J.Nuc.Med.2667(1985)。
如上所述，有多種放射性核素可應用于本發(fā)明，相信本領域技術人員應能容易地確定在不同的情況之下何種放射性核素是最適宜的。例如，131I是一種熟知的用于靶向免疫治療的放射性核素。但是131I的臨床有用性可受到幾種因素的限制，包括8天的物理半衰期；碘化抗體在血液中和在腫瘤部位的脫鹵化作用；和發(fā)射特征(例如大γ成分)，其對于在腫瘤中的局部化劑量沉積可能不最理想。隨著優(yōu)異的螯合劑的出現，將金屬螯合基團連到蛋白質的機會增加了利用其它放射性核素如111In和90Y的機會。對于在放射免疫治療中的應用，90Y提供了幾種益處90Y的半衰期為64小時，其長度足以使得腫瘤蓄積抗體，并且與例如131I不同，90Y是純的高能β發(fā)射體，在其衰變中不伴有γ輻射，其在組織中的范圍為100-1000細胞直徑。而且，最低量的穿透輻射使得可對門診病人施用90Y標記的抗體。另外，對于細胞殺傷，不需要標記抗體的內化，并且電離輻射的局部發(fā)射對缺乏靶抗原的臨近腫瘤細胞應是致死性的。
90Y標記的經修飾的抗體的有效單一治療劑量(即治療有效量)為約5-約75mCi，更優(yōu)選約10-約40mCi。131I標記的抗體的有效單一治療非骨髓重度抑制劑量從約5-約70mCi，更優(yōu)選約5-約40mCi。131I標記的抗體的有效單一治療重度骨髓抑制劑量(即可能需要自體骨髓移植)為約30-約600mCi，更優(yōu)選約50-小于約500mCi。與嵌合抗體相結合，碘-131標記的嵌合抗體因其相對于小鼠抗體更長的循環(huán)半衰期，其有效單一治療非骨髓重度抑制劑量從約5-約40mCi，更優(yōu)選小于約30mCi。對于例如111In標記，顯像標準通常小于約5mCi。
盡管對于131I和90Y已取得了大量臨床經驗，其它放射性標記在本領域中也是已知的并已用于類似目的。有其它放射性同位素用于顯像。例如，適合本發(fā)明范圍的其它放射性同位素包括但不限于123I，125I，32P，57Co，64Cu，67Cu，77Br，81Rb，81Kr，87Sr，113In，127Cs，129Cs，132I，197Hg，203Pb，206Bi，177Lu，186Re，212Pb，212Bi，47Sc，105Rh，109Pd，153Sm，188Re，199Au，225Ac，211At，和213Bi。在這方面，α、γ和β發(fā)射體均適于本發(fā)明。此外，鑒于本發(fā)明所公開的內容，認為本領域技術人員可以容易地確定何種放射性核素適于所選擇的療程而無需過度試驗。為此，已用于臨床診斷的其它放射性核素包括125I，123I，99Tc，43K，52Fe，67Ga，68Ga以及111In?？贵w也已用多種放射性核素進行標記，以潛在用于靶向免疫治療Peirersz等，Immunl.Cell Biol.65111-125(1987)。這些放射性核素包括188Re和186Re以及199Au和67Cu(較低程度)。美國專利No.5,460,785提供了有關這種放射性同位素的額外數據，引入本文作為參考。
除了放射性核素之外，本發(fā)明的經修飾抗體可以綴合至或結合多種生物反應修飾劑、藥劑、毒素或免疫活性配體中的任何一種。本領域技術人員將理解，取決于所選擇的細胞毒素，可以使用多種技術裝配這些非放射性綴合物。例如，與生物素的綴合物可以這樣制備例如通過使經修飾的抗體與生物素的活化酯如生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯反應。類似的，與熒光標記的綴合物可以在有偶聯劑如以上所列的那些偶聯劑的存在下進行制備，或通過與異硫氰酸酯優(yōu)選異硫氰酸熒光素反應。本發(fā)明嵌合抗體與抑制細胞增殖的/細胞毒性物質的綴合物和金屬螯合物以類似的方式制備。
優(yōu)選的用于本發(fā)明的藥劑為細胞毒性藥物，特別是那些用于癌癥治療的藥物。這種藥物包括，一般來說，抑制細胞增殖的藥劑、烷化劑、抗代謝劑、抗增殖劑、微管蛋白結合劑、激素和激素拮抗劑等。可適于本發(fā)明的細胞增殖抑制劑的例子包括烷化物質，如氮芥、三乙撐磷酰胺、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法侖或三亞胺醌，還有亞硝基脲化合物，如卡莫司汀、洛莫司汀或司莫司汀。其它優(yōu)選類別的細胞毒性劑包括例如蒽環(huán)家族的藥物、長春花藥物、絲裂霉素、博來霉素、細胞毒性核苷、蝶啶家族的藥物、diynene和鬼臼毒素。這些類別中特別有用的成員包括例如阿德里亞霉素、洋紅霉素、柔紅霉素(正定霉素)、阿霉素、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、甲氨蝶呤、普卡霉素、鏈霉黑素、二氯氨甲蝶呤、絲裂霉素C、放線菌素D、泊非霉素、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、替加氟、6-巰基嘌呤、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖甙、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物例如依托泊甙或依托泊甙磷酸鹽、美法侖、長春堿、長春新堿、異長春堿、長春地辛、環(huán)氧長春堿等。其它適合本文教導的細胞毒素包括紫杉醇、紫杉烷、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴乙錠、吐根堿、替尼泊苷(tenoposide)、秋水仙堿、二羥基蒽二酮、米托蒽醌、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、以及嘌羅霉素及其類似物或同類物。激素和激素拮抗劑，如皮質類固醇類，例如強的松；孕激素類，例如羥孕酮或美屈孕酮(medroprogesterone)；雌激素類，例如己烯雌酚；抗雌激素類，例如他莫昔芬；雄激素類，例如睪酮；和芳香酶抑制劑，例如氨基導眠能，也適合本文的教導。如前所述，本領域技術人員可對所需的化合物進行化學修飾，以使該化合物的反應對于制備本發(fā)明的綴合物的目的而言更為便利。
特別優(yōu)選的細胞毒素的一個實例包括enediyne家族抗腫瘤抗生素的成員或衍生物，包括加利車霉素、埃斯波霉素或dynemicin。這些毒素效力非常強，通過裂解核DNA而起作用，導致細胞死亡。與可在體內被切割而產生許多無活性但有免疫原性的多肽片段的蛋白毒素不同，諸如加利車霉素，埃斯波霉素和其它enediynes的毒素是小分子，其基本上無免疫原性。這些非肽毒素可通過先前用于標記單克隆抗體和其它分子的技術而化學連接到二聚體或四聚體上。這些連接技術包括通過僅存在于綴合物Fc部分上的N-連接的糖殘基的位點專一性連接。這種定點連接方法的優(yōu)點在于減少連接對綴合物結合特性的可能影響。
如前所述，合適的細胞毒素可包括前藥。本文所用的術語“前藥”指藥學活性物質的前體或衍生物形式，與親本藥物相比其對腫瘤細胞的細胞毒性較低，并能被酶促活化或轉化為活性更高的親本形式。適合本發(fā)明的前藥包括但不限于含磷酸的前藥、含硫代磷酸的前藥、含硫酸的前藥、含肽的前藥、含β-內酰胺的前藥、含選擇性取代的苯氧乙酰胺的前藥或含選擇性取代的苯基乙酰胺的前藥、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前藥，其可轉換為更具活性的細胞毒性游離藥物。用于本發(fā)明的可衍生為前藥形式的細胞毒性藥物的其它實例包括以上所述的那些化療劑。
在其它細胞毒素之中，應理解所述抗體也可以與生物毒素相結合，如蓖麻毒素A亞基、相思豆毒蛋白、白喉毒素、肉毒桿菌毒素、(botulinum)、cyanginosin、石房蛤毒素、志賀菌毒素、破傷風、河豚毒素、單端孢霉烯、青霉顫抖毒素或毒性酶。優(yōu)選這種構建體將使用允許直接表達所述抗體-毒素構建體的基因工程技術制備?？膳c本發(fā)明的修飾抗體相結合的其它生物反應修飾劑包括細胞因子，如淋巴因子和干擾素。此外，如上所述，類似的構建體可用于將免疫活性配體(例如抗體或其片段)與本發(fā)明的修飾抗體相結合。優(yōu)選這些免疫活性配體會針對免疫活性效應細胞表面上的抗原。在這些情況下，構建體可用于使效應細胞如T細胞或NK細胞與攜帶腫瘤相關抗原的腫瘤細胞相接近，從而引發(fā)所需的免疫應答。鑒于本文所公開的內容，認為本領域技術人員可使用常規(guī)技術容易地形成這類構建體。
“化療劑”是用于治療癌癥的化學化合物?；焺┑膶嵗ㄍ榛瘎┤玎缣孢吆铜h(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸鹽(酯)類如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖啶類如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌和烏瑞替派；氮丙啶類和甲基蜜胺類包括六甲基蜜胺、曲他胺、三乙撐磷酰胺、三乙撐硫代磷酰胺和三羥甲蜜胺；氮芥類如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯環(huán)磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸氧氮芥、美法侖、新氮芥、苯芥膽固醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲類如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素、放線菌素、安曲霉素、重氮乙酰絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、加利車霉素、卡柔比星、洋紅霉素、嗜癌素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌羅霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈佐星、殺結核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝藥如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸、氨甲蝶呤、蝶酰蝶呤、三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU；雄激素類如卡魯睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄氨、睪內酯；抗腎上腺藥如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑如frolinicacid；醋葡醛內酯；aldophosphamide glycoside；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依達曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；依氟鳥氨酸；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇；二胺硝吖啶；噴司他?。坏鞍钡?；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細格孢氮雜酸；三亞胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；噻替哌；紫杉烷類，例如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，NJ)和多西他賽(泰索帝，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊甙(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓；navelbine；二羥基蒽酮；替尼泊甙；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽；CPT11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波霉素；capecitabine；和以上任何物質的可藥用鹽、酸或衍生物。還包括在此定義之內的是抗激素劑，其作用于調節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用，如抗雌激素類，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬，抑制芳香酶的4(5)-咪唑類、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奧那司酮，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素類如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和任何上述物質的可藥用鹽、酸或衍生物。
術語“細胞因子”是對由一個細胞群釋放的作為細胞間介質作用于另一個細胞的蛋白質的總稱。這種細胞因子的實例是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細胞因子中包括有生長激素如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素，和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如卵泡刺激激素(FSH)、甲狀腺刺激激素(TSH)和促黃體生成激素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-β；米勒管-抑制物質；小鼠促性腺激素-相關肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子；整聯蛋白；血小板生成素(TPO)；神經生長因子如NGF-13；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子；干擾素如干擾素-α、-β和-γ；集落剌激因子(CSF)如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-g、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和試劑盒配體(KL)。在此所用的術語細胞因子包括來自天然來源或重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質以及天然序列細胞因子的生物學活性等同物。
本申請中所用的術語“前藥”指藥學活性物質的前體或衍生物形式，與親本藥物相比其對腫瘤細胞的細胞毒性較低，并能被酶促活化或轉變?yōu)榛钚愿叩挠H本形式。參見例如Wilman，“Prodrugs inCancer Chemotherapy，”Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“ProdrugsAChemical Approach to Targeted Drug Delivery，”Directed DrugDelievery，Borchardt等，(ed.)，pp.247-267，Humana Press(1985)。本發(fā)明的前藥包括但不限于含磷酸的前藥、含硫代磷酸的前藥、含硫酸的前藥、含肽的前藥、D-氨基酸-修飾的前藥、糖基化的前藥、含β-內酰胺的前藥、含選擇性取代的苯氧乙酰胺的前藥或含選擇性取代的苯基乙酰胺的前藥、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前藥，其可轉換為更具活性的細胞毒性游離藥物?？裳苌鸀榍八幮问接糜诒景l(fā)明的 細胞毒性藥物的實例包括但不限于以上所述的那些化療劑。
“脂質體”是一種由多種類型脂質、磷脂和/或表面活性劑組成的小囊泡，其可用于將藥物(如在此所公開的拮抗劑，以及選擇性地化療劑)遞送至哺乳動物。脂質體的成分通常排列成雙層結構，類似于生物膜的脂質排列方式。
術語“包裝插頁”用來指常規(guī)包括在治療產品的商業(yè)包裝中的說明書，其包含關于使用這種治療產品的適應癥、用法、劑量、給藥、禁忌癥和/或警告方面的信息。
本發(fā)明的方法和產品使用或引入至少一種具有免疫調節(jié)活性的抗體，例如抗-B7、抗-CD23、抗-CD40L、抗-CD4或抗-CD40抗體，和任選地至少一種結合B細胞表面標記具有B細胞耗盡活性的抗體，例如抗-CD20、抗-CD22、抗-CD19或抗-CD37抗體。相應地，生成這種抗體的方法將在此進行描述。
用于進行制備或篩選的分子可以是例如可溶形式的抗原或其一部分，含有所需要的表位?；蛘?，或額外地，在其細胞表面表達所述抗原的細胞可用于產生或篩選拮抗劑。用于產生拮抗劑的其它形式的B細胞表面標記對本領域的技術人員而言是顯而易見的。用于產生本發(fā)明的抗體的CD40L、CD40、CD19、CD20、CD22、CD23、CD37、CD4和B7抗原(例如B7.1或B7.2)的合適抗原來源是廣為人知的?；蛘?，可以基于氨基酸序列合成制備肽。例如，對于CD40L，其氨基酸序列在Armitage等(1992)中公開。
優(yōu)選CD40L抗體或抗-CD40L抗體是在美國專利6,001,358(頒布于1999年6月14日，并轉讓給IDEC Pharmaceuticals Corporation)中公開的人源化抗-CD40L抗體。
盡管優(yōu)選的CD40L拮抗劑是抗體，也可以施用除抗體以外的拮抗劑。例如，所述拮抗劑可以包括可溶性CD40、CD40融合蛋白或選擇性與細胞毒性劑(如在此所述的那些)融合或綴合的小分子拮抗劑。可以用在此感興趣的B細胞表面標記篩選小分子文庫，以鑒定與該抗原結合的小分子?？蛇M一步篩選小分子的拮抗特性和/或將其與細胞毒性劑綴合。
所述拮抗劑也可以是例如通過合理設計或通過噬菌體展示(WO98/35036，公開于1998年8月13日)產生的肽。在一個實施方案中，所選擇的分子可以是例如基于抗體的CDR設計的“CDR模擬物”或抗體類似物。盡管所述肽可以自身即為拮抗性的，可以選擇性地將該肽與細胞毒性劑或免疫球蛋白Fc區(qū)融合(例如，從而賦予該肽以ADCC和/或CDC活性)。
關于產生用于本發(fā)明的抗體拮抗劑的示例性技術如下所述。
優(yōu)選在動物中產生多克隆抗體，通過多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑。使用雙功能或衍生劑例如馬來酰亞氨基苯甲?；腔牾啺孵?通過半胱氨酸殘基綴合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基)，將相關抗原綴合至在待免疫物種中具有免疫原性的蛋白例如匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑可能是有用的。
通過聯合例如100μg或5μg的蛋白或綴合物(分別對于兔或小鼠)與3體積的弗氏完全佐劑并將所述溶液在多個部位進行皮內注射，而對動物進行針對所述抗原、免疫原性綴合物或衍生物的免疫。一個月之后，通過在多個部位皮下注射處于弗氏完全佐劑中的1/5或1/10最初量的肽或綴合物而對動物進行強化免疫。7-14天之后，對動物取血并測定血清的抗體滴度。對動物進行強化免疫直到滴度達到平臺。優(yōu)選用相同抗原但綴合至不同蛋白和/或通過不同的交聯試劑得到的綴合物對動物進行強化。綴合物也可以在重組細胞培養(yǎng)物中制備，為蛋白融合物。此外，適當采用聚集劑如明礬以增強免疫應答。
單克隆抗體是從一群本質上均一的抗體獲得的，即構成該群體的各抗體除了可能的天然發(fā)生的突變之外是完全相同的，所述突變可能以較小量存在。因此，修飾詞“單克隆”表示抗體不是離散抗體的混合物的特征。
例如，單克隆抗體可以使用由Kohler等，Nature，256495(1975)首先描述的雜交瘤方法制備，或可以通過重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)制備。
在雜交瘤方法中，對小鼠或其它適宜的宿主動物如倉鼠如以上所述進行免疫，以得到產生或能產生將特異性結合用于免疫的蛋白的抗體的淋巴細胞。或者，淋巴細胞可以在體外進行免疫。然后使用合適的融合劑如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。
將如此制備的雜交瘤細胞接種并生長于合適的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常會包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，所述物質阻止HGPRT缺陷細胞的生長。
優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些有效融合、支持所選擇的抗體產生細胞穩(wěn)定高水平產生抗體的骨髓瘤細胞，并對諸如HAT培養(yǎng)基敏感。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是小鼠骨髓瘤系，如來源于可以從SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California USA得到的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤，和可以從American Type CultureCollection，Manassas，Virginia，USA得到的SP-2或X63-Ag8-653細胞。還描述過人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細胞系用于產生人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(MarcelDekker，Inc.，New York，1987))。
測定雜交瘤細胞生長于其中的培養(yǎng)基中針對所述抗原的單克隆抗體的產生情況。優(yōu)選由雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性通過免疫沉淀印跡或通過體外結合測定如放射免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA)來確定。
單克隆抗體的結合親和力可以例如通過Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)的30 Scatchard分析來測定。
在鑒定了產生具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞之后，所述克隆可以通過有限稀釋方法進行亞克隆并通過標準方法培養(yǎng)(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于此目的的合適培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPML-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細胞可以在動物體內作為腹水腫瘤生長。
通過常規(guī)的免疫球蛋白純化操作例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，從培養(yǎng)基、腹水或血清中適當地分離由亞克隆所分泌的單克隆抗體。
使用常規(guī)的方法易于分離編碼單克隆抗體的DNA并對其進行測序(例如，通過使用能特異性結合編碼小鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞作為這種DNA的優(yōu)選來源。一旦被分離之后，可以將DNA置入表達載體中，然后將其轉染入宿主細胞如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或原本不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，從而在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。關于在細菌中重組表達編碼抗體的DNA的綜述文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
另一種生成對CD40L，CD19，CD22，CD20或CD40蛋白或肽(例如在美國專利No.5,945,513中描述的gp39融合蛋白)有反應的特異性抗體或抗體片段的方法是，用CD40L，CD19，CD20或CD22蛋白或肽篩選在細菌中表達的編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達文庫。例如，用噬菌體表達文庫可在細菌中表達完整的Fab片段、VH區(qū)和Fv區(qū)。參見，例如Ward等，Nature 341544-546(1989)；Huse等，Science2461275-1281(1989)；和McCafferty等，Nature 348552-554(1990)。用例如CD40L，CD22，CD19或CD20肽篩選這種文庫可鑒定出可與CD40L，CD22，CD19或CD20反應的免疫球蛋白片段?；蛘?，可利用SCID-hu小鼠(可從Genparm得到)來產生抗體或其片段。
在另一個實施方案中，可以從使用在McCafferty等，Nature，348552-554(1990)中描述的技術生成的抗體噬菌體文庫分離抗體或抗體片段。Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離小鼠和人抗體。隨后的出版物描述了高親和力(nM范圍)人抗體的產生，通過鏈改組(Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992))，以及組合感染和體內重組作為策略構建非常大的噬菌體文庫(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993))。由此，這些技術是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術的可行備選方案。
用于制備針對CD40L(包括人CD40L和小鼠CD40L)的單克隆抗體(MAb)和用于本發(fā)明方法的合適單克隆抗體的方法學在標題為“Anti-gp39 Antibodies and Uses Therefor”的PCT申請WO 95/06666中有所描述，該專利申請的教導以其整體引入本文作為參考。特別優(yōu)選的本發(fā)明的抗人CD40L抗體是MAb 24-31和89-76，分別由雜交瘤24-31和89-76產生。分別產生89-76和24-31抗體的89-76和24-31雜交瘤已在1994年9月2日根據布達佩斯條約的規(guī)定進行保藏，保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209。89-76雜交瘤的ATCC保藏號為HB11713，24-31雜交瘤的ATCC保藏號為HB11712。
所述DNA也可以是經修飾的，例如，通過置換人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列來代替同源的小鼠序列(美國專利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價連接至免疫球蛋白編碼序列。
通常，這種非免疫球蛋白多肽被用來代替抗體的恒定區(qū)，或者它們被用來代替抗體的一個抗原結合部位的可變區(qū)，以創(chuàng)建包含一個對一種抗原具有特異性的抗原結合部位和另一個對不同抗原具有特異性的抗原結合部位的嵌合二價抗體。
將非人抗體人源化的方法已在現有技術中有所記載。優(yōu)選人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入其中的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，其通常取自于“輸入”可變區(qū)?？梢曰旧献裱韵路椒ㄟM行人源化Winter和同事的方法(Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988))，通過用高變區(qū)序列代替人抗體的相應序列。因此，這種“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利No.4,816,567)，其中實質上小于完整的人可變區(qū)被來自非人物種的相應序列代替。在實踐中，人源化抗體通常是人抗體，其中部分高變區(qū)殘基及可能部分FR殘基被來自嚙齒類動物抗體中類似位點的殘基所代替。
選擇用于制備人源化抗體的人可變區(qū)(輕鏈和重鏈)對降低抗原性是非常重要的。根據所謂的“最適”方法，用嚙齒類動物抗體可變區(qū)的序列篩選已知的人可變區(qū)序列的整個文庫。然后接受最接近嚙齒類動物的人序列作為人構架區(qū)(FR)用于人源化抗體(Suns等，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一種方法使用來源于具有特定亞型輕鏈或重鏈的所有人抗體的共有序列的特定構架區(qū)。該相同的構架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，J.Immunol.，1512623(1993))。
另外重要的是，抗體被人源化時保留對抗原的高親和力和其它有利的生物學特性。為了實現這一目標，根據優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和多種構思的人源化產物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可以得到的并且是本領域的技術人員所熟悉的。說明并展示所選擇的候選免疫球蛋白序列可能的三維構象結構的計算機程序是可以得到的。觀察這些展示可分析殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中可能起的作用，特別是分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。以此方式，可以從受者和輸入序列選擇并組合FR殘基，從而獲得所需要的抗體特征，如對靶抗原的親和力增加。一般來說，高變區(qū)殘基直接并最為實質性地參與對抗原結合的影響。
另一種高效的生成重組抗體的方式由Newman，Biotechnology，101455-1460(1992)公開。更具體地說，該技術導致生成包含猴可變區(qū)和人恒定序列的靈長類動物源化抗體。該參考文獻以其整體引入本文作為參考。此外，該技術還記載于以下文獻普通轉讓的美國申請No.08/379,072(1995年1月25日提交)，它是U.S.Serial No.07/912,292(1992年7月10日提交)的繼續(xù)申請，而后者是U.S.SerialNo.07/856,281(1992年3月23日提交)的部分繼續(xù)申請，No.07/856,281又是U.S.Serial No.07/735,064(1991年7月25日提交)的部分繼續(xù)申請。08/379,072及其母案申請均以其整體引入本文作為參考。
該技術修飾抗體，從而使得它們在施用于人時不受到抗原性排斥。該技術依賴于用人抗原或受體免疫獼猴。該技術被開發(fā)用于創(chuàng)建針對人細胞表面抗原的高親和性單克隆抗體。
可使用在普通轉讓的美國申請No.08/487,550(1995年6月7日提交，以其整體引入本文作為參考)中描述的方法，篩選噬菌體展示文庫或利用來自CD40L，CD20，CD22，CD40或CD19免疫猴的B淋巴細胞所獲得的猴異雜交瘤，鑒定抗人CD40L，CD20，CD22，CD40或CD19的獼猴抗體。
據先前的報道，使用在這些申請中所述的方法生成的抗體表現出人效應功能，免疫原性降低，并且血清半衰期長。該技術依賴于這樣的事實，即盡管獼猴與人類在系統(tǒng)發(fā)生上相近似，它們仍識別許多人蛋白為外來物并因此產生免疫應答。而且，由于獼猴與人類在系統(tǒng)發(fā)生上相近，在這些猴中生成的抗體已被發(fā)現與在人中產生的抗體具有高度的氨基酸同源性。事實上，在對獼猴免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區(qū)基因進行測序之后，發(fā)現各基因家族的序列與其人對應物的同源性為85-98％(Newman等，1992)。以這種方式產生的第一個抗體，抗CD4抗體，與人免疫球蛋白構架區(qū)的共有序列的同源性為91-92％(Newman等，1992)。
如上所述，本發(fā)明部分地涉及單克隆抗體或其靈長類動物源化形式的用途，所述抗體特異性針對人CD40L抗原，并能抑制CD40信號作用或抑制CD40/CD40L相互作用。用所鑒定的抗體(或其治療有效片段)阻斷CD40與CD40L之間的主要活化位點，同時使得對正向共同刺激的拮抗作用與對負向信號作用的激動作用相結合，將成為對在復發(fā)形式的惡性腫瘤特別是B細胞淋巴瘤和白血病中進行干預的有用治療方法。所鑒定抗體的功能活性由阻斷CD40的信號(使其存活并避免IgM-或Fas-誘導的凋亡)來定義。
可以使用在美國專利No.6,001,358或5,750,105(均轉讓給IDECPharmaceuticals Corporation)中描述的方法或其它已知方法，制備特異性結合人CD40L的單克隆抗體以及由其衍生的靈長類動物源化抗體。優(yōu)選這種抗體將具有對CD40L的高度親和性，并因此可用作抑制CD40L/CD40途徑的免疫抑制劑。類似的技術將產生特異性針對CD20，CD19，CD22或CD40的猴抗體。
制備猴單克隆抗體將優(yōu)選通過以下方法實現篩選噬菌體展示文庫，或使用從用CD40L(例如人CD40L)免疫的猴獲得的B淋巴細胞制備猴異雜交瘤。人CD40也可以來自在美國專利No.5,945,513中描述的融合蛋白。
如上所述，生成抗CD40L，CD19，CD20，CD22或CD40抗體的第一種方法涉及重組噬菌體展示技術。通常這將包括合成針對靶目標的重組免疫球蛋白文庫，所述靶目標即在絲狀噬菌體表面上展示的CD19，CD22，CD20，CD40或CD40L抗原，和選擇分泌具有對CD40L抗原高親和性的抗體的噬菌體。如上文所述，優(yōu)選將選擇結合人CD40L和CD40這兩者的抗體。為實現這種方法，本發(fā)明人創(chuàng)建了對于猴文庫的獨特文庫，其降低了重組的可能性并提高了穩(wěn)定性。
基本上，為采用用于獼猴文庫的噬菌體展示，該載體含有為PCR擴增猴免疫球蛋白基因的特異性引物。這些引物是基于開發(fā)靈長類動物源化技術時所獲得的獼猴序列和包含人序列的數據庫。適宜的引物公開于普通轉讓的08/379,072(引入本文作為參考)。
第二種方法涉及對猴即獼猴進行針對目的抗原靶即人CD19，CD20，CD22，CD40或CD40L的免疫。將獼猴用于產生單克隆抗體的固有優(yōu)點在上文中已討論。具體地說，可以用人抗原或受體免疫這種猴即獼猴。此外，所得的抗體可用于根據Newman等(1992)和Newman等普通轉讓的U.S.Serial No.08/379,072(1995年1月25日提交，以其整體引入本文作為參考)的方法制備靈長類動物源化抗體。
從獼猴獲得的抗體的顯著優(yōu)點在于，這些猴識別許多人蛋白為外來物并因而會形成抗體，其中某些對所需的人抗原如人表面蛋白和細胞受體具有高親和性。而且，由于其與人類在系統(tǒng)發(fā)生上相近，所得的抗體表現出與在人類中產生的抗體高度的氨基酸同源性。如上所述，在對獼猴免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區(qū)基因進行測序之后，發(fā)現各基因家族的序列與其人對應物的同源性為85-88％(Newman等，1992)。
更具體地說，對獼猴施用人CD19，CD20，CD22，CD40或CD40L抗原，從其中分離B細胞，例如從動物取淋巴結活檢，然后使用聚乙二醇(PEG)將B淋巴細胞與KH6/B5(小鼠x人)異骨髓瘤細胞融合。然后鑒定分泌結合人CD40L抗原的抗體的異雜交瘤。
對于結合CD40L或CD40的抗體，理想的是它們發(fā)生結合的方式可干擾或調節(jié)CD40信號作用，因為這種抗體，與其反受體一起，可潛在地用于抑制CD40L與CD40的相互作用。如果可開發(fā)針對CD40L或CD40上超過一種表位的抗體，并將所述抗體一起應用，則它們的聯合活性可能會提供協(xié)同效應。
本發(fā)明涉及使用一種動物，其被致敏以產生特定的抗體(例如，靈長類動物，如organgutan、狒狒、恒河猴和獼猴)?？捎糜诋a生針對人CD40L的抗體的其它動物包括但不限于以下小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、猴、豬、山羊和兔。
然后將表達特異性結合人CD40L抗原的抗體的細胞系用于克隆可變區(qū)序列以制備靈長類動物源化抗體，基本上如以下文獻中所述Newman等，(1992)和Newman等，U.S.Serial No.379,072(1995年1月25日提交)，這兩篇文獻均引入本文作為參考。基本上，這必需包括從中提取RNA，轉化為cDNA，并使用Ig特異性引物通過PCR對其進行擴增。合適的引物在Newman等，1992和U.S.Serial No.379,072中有所記載。類似的技術將產生表達特異性針對CD40，CD19，CD20或CD22的抗體的細胞系。
然后將克隆的猴可變基因插入表達載體中，該表達載體含有人重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因。優(yōu)選使用被稱為NEOSPLA的IDEC，Inc.專利表達載體來實現該步驟。該載體含有巨細胞病毒啟動子/增強子，小鼠β球蛋白主要啟動子，SV40復制起點，牛生長激素聚腺苷酸化序列，新霉素磷酸轉移酶外顯子1和外顯子2，人免疫球蛋白κ或λ恒定區(qū)，二氫葉酸還原酶基因，人免疫球蛋白γ1或γ4 PE恒定區(qū)和前導序列。已發(fā)現該載體經引入猴可變區(qū)基因、轉染入CHO細胞、然后在含G418的培養(yǎng)基中選擇及氨甲蝶呤擴增后，會非常高水平地表達靈長類動物源化抗體。
例如，先前公開了該表達體系會產生對CD4和其它人細胞表面受體具有高親和性(Kd≤10-10M)的靈長類動物源化抗體。而且，已發(fā)現所述抗體表現出與原始的猴抗體相同的親和性、特異性和功能活性。該載體系統(tǒng)實質上記載于普通轉讓的U.S.Serial No.379,072(引入本文作為參考)以及U.S.Serial No.08/149,099(1993年11月3日提交，也以其整體引入本文作為參考)。該體系提供高表達水平，即＞30pg/細胞/天。當然，可使用相同的方法制備產生特異性針對CD19，CD20，CD22或CD40的抗體的細胞系。
作為人源化的備選方案，可以產生人抗體。例如，現在已可能產生轉基因動物(例如小鼠)，其經免疫能產生人抗體的所有組成成分而無內源性免疫球蛋白產生。例如，已描述了在嵌合和種系突變小鼠中純合缺失抗體重鏈連接區(qū)PH)基因導致完全抑制內源性抗體產生。在這種種系突變小鼠中轉入人種系免疫球蛋白基因陣列會導致在抗原攻擊時產生人抗體。參見例如Jakobovits等，Proc.Mad.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in immuno.，733(1993)；和美國專利No.5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者，可以使用噬菌體展示技術(McCafferty等，Nature348552-553(1990))，從來自非免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因所有組成成分，在體外產生人抗體和抗體片段。根據該技術，將抗體V區(qū)基因符合讀框地克隆入絲狀噬菌體如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒的表面上展示為有功能的抗體片段。由于絲狀顆粒含有單鏈DNA拷貝的噬菌體基因組，基于抗體功能特性的選擇還導致選擇編碼表現出那些特性的抗體的基因。因此，該噬菌體模擬B細胞的某些特性。噬菌體展示可以以多種形式進行；關于其綜述參見例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3564-571(1993)?？梢允褂脦追N來源的V基因片段用于噬菌體展示。Clackson等，Nature，352624-628(1991)從來源于免疫小鼠脾的V基因小隨機組合文庫分離了一大批不同的抗噁唑酮抗體。可以基本上遵循以下技術構建來自未免疫人供體的V基因的所有組成成分，并且可以分離針對一大批不同的抗原(包括自身抗原)的抗體Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)。還參見美國專利No.5,565,332和5,573,905。
還可以由體外活化的B細胞產生人抗體(參見美國專利No.5,567,610和5,229,275)。使用SCID小鼠生成人抗體的優(yōu)選方式公開于共有的同時待審的申請中。
已發(fā)展了多種技術用于產生抗體片段。傳統(tǒng)的做法是通過蛋白水解消化完整的抗體而產生這些片段(參見例如Morimoto等，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24107-117(1992)和Brennan等，Science，22981(1985))。然而，這些片段現在可以由重組宿主細胞直接產生。例如，可以從上述抗體噬菌體文庫分離抗體片段。或者，可以從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段并化學偶聯以形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology 10163-167(1992)).根據另一種方法，可以直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物分離F(ab’)2片段。用于產生抗體片段的其它技術對技術人員而言是顯而易見的。在其它的實施方案中，所選的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利No.5,571,894；和美國專利No.5,587,458?？贵w片段還可以是“線狀抗體”，例如在美國專利No.5,641,870中所述。這種線狀抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
雙特異性抗體是對至少兩種不同表位具有結合特異性的抗體。示例性的雙特異性抗體可結合B細胞表面標記的兩種不同表位。其它的這種抗體可結合第一B細胞標記并進一步結合第二B細胞表面標記。或者抗B細胞標記結合臂可與結合白細胞上的觸發(fā)分子的臂聯合，所述觸發(fā)分子如T細胞受體分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受體(FcyR)如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)，以將細胞防御機制集中到B細胞。雙特異性抗體還可以用于使細胞毒性劑局限定位于B細胞。這些抗體具有B細胞標記結合臂和結合細胞毒性劑(例如皂草素、抗干擾素α、長春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可以制備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab)2雙特異性抗體)。
制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。傳統(tǒng)上產生全長雙特異性抗體是基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中兩條鏈具有不同的特異性(Millstein等，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配組合，這些雜交瘤(quadroma)產生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中僅一種具有正確的雙特異性結構。對正確分子的純化(通常是通過親和層析步驟完成)相當麻煩，并且產物的產率低。類似的操作公開于WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.，103655-3659(1991)。
根據一種不同的方法，將具有所需要的結合特異性(抗體-抗原結合部位)的抗體可變區(qū)融合至免疫球蛋白恒定區(qū)序列。所述融合優(yōu)選是與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，包括至少部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。優(yōu)選在至少一種融和中存在包含輕鏈結合所必需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物，和如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分別的表達載體，并共轉染至適合的宿主生物體中。當構建中所用的3種多肽鏈的不等比例提供最理想的產率時，這為在實施方案中調節(jié)3種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。但是，當至少兩種多肽鏈以相等比例表達導致高產率時或當比例無關緊要時，可將兩種或全部3種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。
在該方法的優(yōu)選實施方案中，雙特異性抗體由在其一條臂的具有第一結合特異性的雜種免疫球蛋白重鏈，和在其另一條臂的雜種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)組成。發(fā)現該不對稱結構有助于所需要的雙特異性化合物從不需要的免疫球蛋白鏈組合分離，因為僅在雙特異性分子的一半存在免疫球蛋白輕鏈為分離提供了便利的途徑。該方法公開于WO 94/04690。關于產生雙特異性抗體的更多細節(jié)，參見例如Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。
根據在美國專利No.5,731,168中描述的另一種方法，可以將一對抗體分子之間的界面改造成使從重組細胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比達到最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3域的至少一部分。在該方法中，將來自第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側鏈置換為較大的側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)。通過用較小的氨基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)置換大氨基酸側鏈而在第二抗體分子的界面上創(chuàng)建與大側鏈相同或相似大小的互補“空穴”。這提供了一種機制來增加異二聚體相對于其它不想要的終產物如同二聚體的產率。
雙特異性抗體包括交聯的或“異綴合”抗體。例如異綴合物中的抗體之一可以偶聯至抗生物素蛋白，而另一抗體偶聯至生物素。已提出例如用這種抗體使免疫系統(tǒng)細胞瞄準不想要的細胞(美國專利No.4,676,980)，并用于治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可以使用任何便利的交聯方法來制備異綴合抗體。合適的交聯劑以及多種交聯技術是本領域廣為人知的，并公開于美國專利No.4,676,980中。
用于從抗體片段生成雙特異性抗體的技術在文獻中也已有記載。例如，可以使用化學鍵合制備雙特異性抗體。Brennan等，Science，22981(1985)描述了一種方法，其中將完整的抗體進行蛋白水解切割，以生成F(ab’)2片段。將這些片段在二硫醇配位劑亞砷酸鈉的存在下還原以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫化鍵形成。然后將生成的Fab’片段轉換為硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后將Fab’-TNB衍生物之一通過用巰基乙胺進行還原而重新轉換為Fab’-硫醇，并與等摩爾量的另一Fab’-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生的雙特異性抗體可用作選擇性固定酶的物質。
近來的研究進展有助于從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，其可化學偶聯以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J.Exp.Med.，1752 17-225(1992)描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab’)2分子的產生。各Fab’片段分別從大腸桿菌中分泌出來，并在體外進行定向的化學偶聯以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能結合過量表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞，以及引發(fā)人細胞毒性淋巴細胞針對人乳腺腫瘤靶的溶解活性。
用于直接從重組細胞培養(yǎng)物制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術也已有記載。例如，已使用亮氨酸拉鏈制備了雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合連接到兩種不同抗體的Fab’部分。將該抗體同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后再氧化以形成抗體異二聚體。此方法還可用于產生抗體同二聚體。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)描述的“diabody”技術為制備雙特異性抗體片段提供了備選機制。所述片段包含重鏈可變區(qū)(VH)，通過接頭連接至輕鏈可變區(qū)(VL)，所述接頭的長度不足以使得相同鏈上的兩個區(qū)之間發(fā)生配對。因此，一個片段的VH和VL區(qū)被迫與另一個片段的互補VL和VH區(qū)配對，從而形成兩個抗原結合部位。通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體而制備雙特異性抗體片段的另一種策略也已有報道，參見Gruber等，J.Immunol.，1525368(1994)。
可以想到具有超過二價的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.14760(1991)。
在此可以預見對所述抗體的其它修飾。例如，抗體可以連接到多種非蛋白質聚合物中的一種，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物。
在此公開的抗體還可以制成脂質體。含有拮抗劑的脂質體通過本領域已知的方法制備，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030(1980)；美國專利No.4,485,045和4,544,545；和WO97/38731(公開于1997年10月23日)。循環(huán)時間延長的脂質體公開于美國專利No.5,013,556。
特別有用的脂質體可以如下產生通過反相蒸發(fā)方法，使用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物。通過確定孔徑的濾器擠出脂質體以產生具有所需直徑的脂質體。本發(fā)明抗體的Fab’片段可以如Martin等，J.Biol.Chem.257286-288(1982)所述通過二硫化物互換反應而綴合至脂質體。在脂質體中可選擇性地含有化療劑。參見Gabizon等，J.National CancerInst.81(19)1484(1989)。
可以預見在此描述的蛋白或肽拮抗劑的氨基酸序列修飾。例如，可能想要改善抗體的結合親和力和/或其它生物學特性?？贵w的氨基酸序列變異體通過如下方法制備將適宜的核苷酸改變引入抗體編碼核酸，或通過肽合成。這種修飾包括，例如缺失，和/或插入，和/或置換拮抗劑氨基酸序列中的殘基。對缺失、插入和置換作任何組合以得到最終的構建體，條件是最終的構建體具有所需要的特征。氨基酸改變還可能改變拮抗劑的翻譯后過程，如改變糖基化位點的數目或位置。
一種用于鑒定抗體中作為誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有用方法被稱為“丙氨酸掃描誘變”，如Cunningham和Wells，Science，2441081-1085(1989)所述。在此，靶殘基中的一個或一組得到鑒定(例如帶電荷的殘基，如arg，asp，his，lys和glu)，并被中性或帶負性電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)置換以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在或對置換位點引入進一步的或其它的變異體來精修那些證實對置換在功能上敏感的氨基酸位置。這樣，盡管預先確定引入氨基酸序列變異的位點，但突變本身的性質并不需要預先確定。例如，為了分析在給定位點突變所表現出的作用，在靶密碼子或區(qū)域進行丙氨酸掃描或隨機誘變，并對所表達的拮抗劑變異體進行所需活性的篩選。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端融合，長度從1個殘基至含有100個或更多個殘基的多肽，以及序列內插入單個或多個氨基酸殘基。末端插入的實例包括具有N-末端甲硫氨酰殘基的拮抗劑或融合至細胞毒性多肽的拮抗劑。拮抗劑分子的其它插入變異體包括酶或延長拮抗劑血清半衰期的多肽融合至拮抗劑的N-或C-末端。
另一類型的變異體是氨基酸置換變異體。對于這些變異體，拮抗劑分子中的至少一個氨基酸殘基被不同的殘基置換。對抗體拮抗劑進行置換誘變的最有用位點包括高變區(qū)，但也可以預見FR改變。保守置換如表1所示，標題為“優(yōu)選的置換”。如果這種置換導致生物學活性改變，則可以引入表1中的更為實質性的改變(稱為“示例性置換”)或如以下參照氨基酸類別進一步描述，并對產物進行篩選。
表1


對抗體的生物學特性的實質性修飾是通過如下方法實現的通過選擇其對維持(a)在置換區(qū)域的多肽主鏈的結構，例如作為折疊或螺旋構象，(b)分子在靶位點的電荷或疏水性，或(c)側鏈的大小的效應顯著不同的置換。天然存在的殘基基于共同的側鏈特性分為以下幾組(1) 疏水性正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2) 中性親水性cys，ser，thr；(3) 酸性asp，glu；(4) 堿性asn，gln，his，lys，arg；(5) 影響鏈取向的殘基gly，pro；和(6) 芳香族trp，tyr，phe。
非保守置換將伴有這些類別之一的成員換成另一類別。
任何不參與維持拮抗劑適當構象的半胱氨酸殘基也可以被置換，通常置換為絲氨酸，以提高分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常的交聯。反過來，可以將半胱氨酸(鍵)添加入拮抗劑以改善其穩(wěn)定性(特別是當拮抗劑是抗體片段如Fv片段的情況)。
特別優(yōu)選類型的置換變異體包括置換親本抗體(如人源化或人抗體)的一個或多個高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進一步開發(fā)的所得變異體相對于產生其的親本抗體具有改善的生物學特性。產生這種置換變異體的便利方法是使用噬菌體展示的親和力成熟。簡而言之，對幾個高變區(qū)位點(例如6-7個位點)進行突變以產生在每個位點所有可能的氨基酸置換。如此產生的抗體變異體以單價的方式由絲狀噬菌體顆粒展示，作為在每個顆粒中包裝的與M13的基因III產物的融合體。然后如在此所公開的，對由噬菌體展示的變異體篩選其生物學活性(例如結合親和力)。為了鑒定進行修飾的候選高變區(qū)位點，可以對已鑒定的對抗原結合起顯著作用的高變區(qū)殘基進行丙氨酸掃描誘變?；蛘?，或另外，分析抗原-抗體復合物的晶體結構以鑒定抗體與抗原之間的接觸點可能是有益的。這種接觸殘基和鄰近的殘基可作為根據在此詳述的技術進行置換的候選對象。一旦產生了這種變異體，對這些變異體如在此所述進行篩選，可選擇在一種或多種相關測定中顯示出優(yōu)異特性的抗體作進一步開發(fā)。
抗體的另一類型氨基酸變異體改變了拮抗劑原本的糖基化模式。改變意味著去除拮抗劑中存在的一個或多個糖部分，和/或添加拮抗劑中不存在的一個或多個糖基化位點。
多肽的糖基化通常是N-連接的或O-連接的。N-連接指糖部分附著于天冬酰胺殘基的側鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是糖部分酶促附著于天冬酰胺側鏈的識別序列。因此，在多肽中這些三肽序列中任一個的存在創(chuàng)建潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥基氨基酸的附著，所述羥基氨基酸最常見為絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。
通過改變氨基酸序列使得其含有一個或多個上述三肽序列而便利地實現向抗體添加糖基化位點(對于N-連接的糖基化位點)。還可以通過向最初拮抗劑的序列添加或置換一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行改變(對于O-連接的糖基化位點)。
編碼抗體的氨基酸序列變異體的核酸分子可通過多種本領域已知的方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(對于天然存在的氨基酸序列變異體的情況)，或通過對拮抗劑的較早制備的變異體或非變異形式進行寡核苷酸介導(或定點)誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備。
可能需要修飾本發(fā)明中所使用的抗體，以改善效應功能。例如，增強拮抗劑的抗原依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。這可以通過將一個或多個氨基酸置換引入抗體拮抗劑的Fc區(qū)來實現。或者或額外地，可以將半胱氨酸殘基引入Fc區(qū)，從而在該區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。如此生成的同二聚體抗體可能內化能力提高和/或補體介導的細胞殺傷作用及抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)增強。參見Caron等，J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1992)。也可以使用如Wolff等，Cancer Research 532560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯劑制備抗腫瘤活性增強的同二聚體抗體?；蛘呖梢愿脑炀哂须p重Fc區(qū)的抗體，從而可具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3219-230(1989)。
為了延長抗體的血清半衰期，可以將補救受體結合表位引入拮抗劑(特別是抗體片段)，例如如美國專利5,739,277中所述。在此所用的術語“補救受體結合表位”指IgG分子(例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)的Fc區(qū)的表位，它使得IgG分子在體內的血清半衰期延長。
包含本發(fā)明所使用的拮抗劑的治療制劑是這樣制備用于貯存的將具有所需純度的拮抗劑與選擇性的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑相混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16thedition，Osol，A.Ed.(1980))，制成凍干制劑或水溶液的形式?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑以所采用的劑量和濃度對接受者是無毒性的，包括緩沖劑如磷酸、檸檬酸和其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯己雙銨；苯扎氯銨，氯化芐乙氧銨；苯酚，丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖和其它糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽平衡離子如鈉；金屬絡合物(例如Zn-蛋白絡合物)；和/或非離子型表面活性劑如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
免疫調節(jié)抗體和B細胞耗盡抗體可以處于同一制劑中或以不同制劑給藥。所述組合物可進一步包括其它非抗體拮抗劑，例如CD40L或B7拮抗劑。其實例包括可溶性CD40、B7及其融合物。給藥可以是同時的或序貫的，并且任一次序都會有效。
示例性的抗CD20抗體制劑如WO98/56418所述(在此特別引入作為參考)。該公開文獻描述了一種液體多劑量制劑，包含40mg/mLrituximab，25mM乙酸，150mM海藻糖，0.9％芐醇，0.02％聚山梨酯20，pH為5.0，最低架期為貯存于2-8℃兩年。另一種有用的抗CD20制劑包含10mg/mL rituximab，處于9.0mg/mL氯化鈉、7.35mg/mL檸檬酸鈉二水合物、0.7mg/mL聚山梨酯80及無菌注射用水中，pH6.5。
適于皮下給藥的凍干制劑如WO97/04801中所述。這種凍干制劑可以用合適的稀釋劑重新配制至高蛋白濃度，并可將重新配制的制劑對在此待治療的哺乳動物進行皮下給藥。
在此所述制劑還可以包含超過一種對所治療的特定適應癥所必需的活性化合物，優(yōu)選具有互補活性彼此不產生不利影響的那些。例如，可能想要進一步提供一種化療劑、細胞因子或免疫抑制劑(例如作用于T細胞的物質，如環(huán)孢菌素，或結合T細胞的抗體，例如結合LFA-1的抗體)。這種其它物質的有效量取決于制劑中存在的拮抗劑的量、疾病或障礙或治療的類型，以及以上討論的其它因素。這些物質通常以與上文所用相同的劑量和給藥途徑使用，或迄今所采用劑量的約1-99％。
活性成分還可以包入例如通過30凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊中，例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，分別在膠態(tài)藥物遞送體系中(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳狀液、納米顆粒和納米膠囊)或處于粗滴乳狀液中。這種技術公開于Remington’s Pharmaceutical Sciences 16thedition，Osol，A.Ed.(1980)。
可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適例子包括含有拮抗劑的固體疏水性聚合物的半透基質，所述基質為成形產品的形式，例如薄膜或微膠囊。緩釋基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利No.3,773,919)、L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸酯、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物與醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)，和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。用于體內給藥的制劑必須是無菌的。通過經無菌過濾膜濾過可以容易地實現這一要求。
將配制、調劑量并以符合正規(guī)醫(yī)學實踐的方式施用包含B細胞耗盡抗體和/或免疫調節(jié)抗體的組合物。在這種情況下要考慮的因素包括所治療的特定惡性腫瘤或疾患、所治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床情況、疾病或障礙的病因、藥劑遞送部位、給藥方法、給藥方案和醫(yī)學從業(yè)者所知道的其它因素。待施用的抗體的治療有效量將通過這些考慮因素來控制和決定。
如以上廣泛討論的，所選擇的本發(fā)明的實施方案包括向患者施用抗體，或與一種或多種輔助治療如放療或化療相聯合或結合(即聯合治療方案)。如在此所用的，施用抗體與另一種選擇的抗體或輔助治療相結合或聯合意味著序貫、同時、延伸及同時間、并行、相伴或同時期的給藥或應用所公開的抗體和/或治療。本領域的技術人員將理解可以設定施用或應用所述聯合治療方案的各種組成成分的時間，以增加治療的總有效性。例如，可以以標準的熟知的療程施用免疫調節(jié)抗體，然后在數周之內施用本發(fā)明的B細胞耗盡抗體。反過來，可以靜脈內施用與細胞毒素結合的B細胞耗盡抗體，然后是局限于腫瘤局部的外射線照射。在另外的實施方案中，免疫調節(jié)抗體可以與一種或多種所選擇的B細胞耗盡抗體在一次就診中同時施用。技術人員(如有經驗的腫瘤學家)基于所選擇的抗體和本申請說明書的教導，能容易地判斷有效的聯合治療方案，而無需過多試驗。
在這方面，應理解所選擇的抗體組合可以以任何次序并在對患者提供治療裨益的任何時間框架內施用。即，免疫調節(jié)抗體以及任選地B細胞抗體可以以任何次序或同時施用。在選擇的實施方案中，本發(fā)明的免疫調節(jié)抗體將施用于先前經歷過B細胞耗盡的患者。在其它的實施方案中，選擇的免疫調節(jié)抗體(例如抗B7和抗CD40L)將基本上同時或相伴施用。在優(yōu)選的實施方案中，選擇的抗體(無論免疫調節(jié)或B細胞耗盡)將在彼此用藥1年之內施用。在其它優(yōu)選的實施方案中，選擇的抗體將在彼此用藥10、8、6、4或2個月內施用。在另外優(yōu)選的實施方案中，選擇的抗體將在彼此用藥4、3、2或1周內施用。在另外的實施方案中，選擇的抗體將在彼此用藥5、4、3、2或1天內施用。也可以理解所選擇的藥劑或治療可在事實上數小時或數分鐘之內(即基本上同時)施用于患者。
作為一般的建議，每劑胃腸外給藥的抗體的治療有效量通常為大約0.1-500毫克/公斤患者體重/天，通常所用拮抗劑的初始范圍為大約2-100毫克/公斤。
優(yōu)選的B細胞耗盡抗體是RITUXAN。這種抗體的合適劑量是例如從大約20mg/m2至大約1000mg/m2。該抗體的劑量可以與現在推薦RITUXAN用于治療非霍奇金淋巴瘤的劑量相同或不同。例如，可以給予患者一劑或多劑實質上小于375mg/m2的抗體，例如劑量從大約20mg/m2至大約250mg/m2，例如從大約50mg/m2至大約200mg/m2。
此外，可以施用一個或多個初始劑量的抗體，然后施用一個或多個后續(xù)劑量，其中在后續(xù)劑量中的mg/m2抗體劑量超過在初始劑量中的mg/m2抗體劑量。例如，初始劑量可以從大約20mg/m2至大約250mg/m2(例如從大約50mg/m2至大約200mg/m2)，而后續(xù)劑量可以從大約250mg/m2至大約1000mg/m2。
然而，如以上提到的，免疫調節(jié)抗體和B細胞耗盡抗體的這些建議量均要經受大量的治療判斷。在選擇適宜劑量和時序安排中的關鍵因素是獲得的結果，如以上所指出的。例如，對于治療正在發(fā)生的和急性的疾病，最初可能需要相對較高的劑量。為了獲得最有效的結果，取決于特定的B細胞惡性腫瘤，拮抗劑的給予要盡可能接近所述疾病或障礙最初的征象、診斷、表現或發(fā)生或在所述疾病或障礙的消退期間。
可通過任何合適的方式給予抗體，包括胃腸外、皮下、腹膜內、肺內和鼻內，如果需要進行局部免疫抑制治療，可通過病損內給藥。胃腸外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。另外，抗體可以適當地通過脈沖輸注給予，例如用下降劑量的抗體。優(yōu)選通過注射給藥，最優(yōu)選靜脈內或皮下注射，部分地取決于給藥是短暫的還是長期的。
可以與本文的抗體一起另外施用其它化合物，如化療劑、免疫抑制劑和/或細胞因子。聯合給藥包括使用單獨分開的制劑或單一的藥物制劑共同給藥，以及以任一次序的序貫給藥，其中優(yōu)選存在一個時間段，而使兩種(或全部)活性劑同時發(fā)揮其生物學活性。
除了將抗體給予患者之外，本發(fā)明還預見通過基因療法施用抗體。這種編碼所述抗體的核酸的給藥包括在“施用治療有效量的拮抗劑”表述之中。參見例如WO96/07321(公開于1996年3月14日)，其涉及使用基因療法產生胞內抗體。
有兩種主要的方法將核酸(選擇性地包含在載體之中)置入患者細胞中體內和離體。對于體內遞送，將核酸直接注射入患者體內，通常在需要拮抗劑的部位進行注射。對于離體治療，取出患者細胞，將核酸引入這些分離的細胞中，并將經修飾的細胞直接給予患者或例如包封入多孔膜內植入患者體內(參見例如美國專利No.4,892,538和5,283,187)。有多種可利用的技術將核酸引入活細胞中。這些技術各異，取決于核酸是在體外轉移入培養(yǎng)的細胞，還是在體內轉移入指定宿主的細胞中。適于在體外將核酸轉移入哺乳動物細胞的技術包括使用脂質體、電穿孔、微注射、細胞融合、DEAF-葡聚糖、磷酸鈣沉淀方法等。用于離體遞送基因的常用載體是逆轉錄病毒。
當前優(yōu)選的體內核酸轉移技術包括用病毒載體(如腺病毒、單純皰疹I病毒或腺伴隨病毒)轉染和基于脂質的體系(對脂質介導的基因轉移有用的脂質是例如DOTMA，DOPE和DC-Chol)。在某些情況下，需要給核酸來源提供以靶細胞為目標的物質，如對細胞表面膜蛋白或靶細胞特異性的抗體，靶細胞上受體的配體等。當采用脂質體時，可以使用結合與胞吞作用相關的細胞表面膜蛋白的蛋白以定向和/或促進攝取，例如親特定細胞類型的衣殼蛋白或其片段、針對在循環(huán)中經歷內化作用的蛋白的抗體，和引導胞內定位并延長胞內半衰期的蛋白。受體介導的胞吞技術有所記載，例如Wu等，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA873410-3414(1990)。關于目前已知的基因標記和基因療法方案的綜述，參見Anderson等，Science 256808-813(1992)。還可參見WO93/25673及其中引用的參考文獻。
如先前所討論的，本發(fā)明的抗體、其免疫反應性片段或重組體可以以藥學有效量施用以在體內治療哺乳動物惡性腫瘤。在此方面，應理解所公開的抗體將配制為易化給藥和增加活性劑的穩(wěn)定性。優(yōu)選本發(fā)明的藥物組合物包括可藥用無毒無菌載體，如生理鹽水，無毒緩沖劑、防腐劑等。對于本申請的目的而言，綴合或未綴合至細胞毒性劑的治療抗體、其免疫反應性片段或重組體的治療有效量應被認為意味著足以實現與腫瘤細胞上的所選擇免疫反應性抗原有效結合并使那些細胞死亡增加的量。當然，本發(fā)明的藥物組合物可以以單劑或多劑施用以提供藥學有效量的經修飾抗體。
更具體地說，所公開的抗體和方法應可用于減小腫瘤體積，抑制腫瘤生長和/或延長攜帶腫瘤的動物的存活時間。因此，本發(fā)明還涉及治療人類或其它動物中的腫瘤的方法，通過向所述人或動物施用有效無毒量的至少一種免疫調節(jié)抗體，以及任選地至少一種B細胞耗盡抗體。本領域技術人員能通過常規(guī)試驗確定為治療惡性腫瘤目的的經修飾抗體的有效無毒量。例如，經修飾抗體的治療活性量可根據多種因素而變化，諸如疾病階段(例如I期相對于IV期)、治療對象的年齡、性別、醫(yī)學并發(fā)癥(例如免疫抑制病癥或疾病)和體重，以及所述抗體在該對象中引發(fā)所需應答的能力?？梢哉{整劑量方案，以提供最理想的治療反應。例如，每天可施用幾個分開的劑量，或者根據治療情況的緊急事件可成比例地減少劑量。然而一般來說，預計有效劑量在約0.05-100毫克/公斤體重/天的范圍之內，更優(yōu)選0.5-10毫克/公斤體重/天。
依據本文公開內容的范圍，本發(fā)明的抗體可按照上述治療方法以足以產生治療或預防程度的作用的量施用于人或其它動物。本發(fā)明的抗體可以以常規(guī)劑型施用于所述人或其它動物，該劑型是按照已知技術通過將本發(fā)明的抗體與常規(guī)可藥用載體或稀釋劑相結合而制備的。本領域技術人員將認識到，可藥用載體或稀釋劑的形式和性質取決于其有待與之結合的活性成分的量，給藥途徑和其它已知的變量。本領域技術人員還將理解，包含一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體的混合劑可能證實特別有效。
制備和施用抗體、其免疫反應性片段或重組體與治療劑的綴合物的方法對于本領域技術人員而言是熟知的或可以容易確定。本發(fā)明抗體(或其片段)的給藥途徑可以是口服、胃腸外、吸入或局部用藥。本文所用的術語胃腸外包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、直腸或陰道給藥。通常優(yōu)選靜脈內、動脈內、皮下和肌內形式的胃腸外給藥。盡管所有這些形式的給藥很明顯均在本發(fā)明范圍之內，優(yōu)選的給藥形式為注射溶液，特別是用于靜脈內或動脈內注射或滴注的溶液。通常，適于注射的藥物組合物可包含緩沖劑(例如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖劑)、表面活性劑(例如聚山梨酯)，任選地穩(wěn)定劑(例如人白蛋白)等。但是，在其它符合本文教導的方法中，抗體可以被直接遞送惡性腫瘤部位，從而增加腫瘤組織與治療劑的接觸。
用于胃腸外給藥的制劑包括無菌水溶液或非水溶液、懸液和乳液。非水溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯如油酸乙酯。含水載體包括水，醇/水溶液、乳液或懸液，包括鹽水和緩沖介質。在本發(fā)明中，可藥用載體包括但不限于，0.01-0.1M優(yōu)選0.05M磷酸緩沖液或0.8％鹽水。其它常用的胃腸外載體包括磷酸鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化林格氏液或不揮發(fā)油。靜脈內載體包括液體和營養(yǎng)補充劑、電解質補充劑如基于林格氏葡萄糖的那些，和諸如此類。防腐劑和其它添加劑也可能存在，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。
更具體地說，適于注射應用的藥物組合物包括無菌水溶液(水溶性)或分散體，和無菌粉末用于臨時制備無菌注射溶液或分散體。在這種情況下，組合物必須是無菌的，并且其流動程度應易于注射。該組合物在制備和貯存條件下應該是穩(wěn)定的，并優(yōu)選貯存時不受微生物如細菌和真菌的污染。載體可以是溶劑或分散介質，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物。通過例如使用包衣如卵磷脂，通過維持所需的粒徑(分散體)和通過使用表面活性劑，可以保持適當的流動性。
通過利用多種抗菌劑和抗真菌劑可預防微生物的作用，例如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化鈉。通過在組合物中包含延遲吸收的物質例如單硬脂酸鋁和明膠，可延長注射組合物的吸收。
在任何情況下，可以這樣制備無菌注射溶液將活性化合物(例如經修飾的抗體本身或與其它活性劑相結合)以所需量，根據需要與一種在此列舉的成分或其組合一起，在適宜的溶劑中混合，然后過濾除菌。通常，分散體是這樣制備的將活性化合物摻入無菌載體中，所述載體含有基礎分散介質和所需的選自以上所列的其它成分。對于用于制備無菌注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和凍干，產生來自其先前無菌濾過溶液的活性成分加上任何額外的所需成分的粉末。
按照本領域已知的方法，對注射制劑進行加工處理，注入容器內，所述容器如安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶，并在無菌條件下進行密封。另外，所述制劑可以進行包裝并以藥盒形式出售，如在同時待審的U.S.S.N.09/259,337和U.S.S.N.09/259,338(各引入本文作為參考)中描述的那些。作為整體，所述產品或藥盒可包含一種或幾種組合物。在那些組合物中的一種中的至少一種活性劑是具有免疫調節(jié)活性的抗體，如抗CD40L，抗CD40，抗CD23，抗CD4或抗B7抗體。其還可包括從商業(yè)和使用者角度所需要的其它材料，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。這種產品將優(yōu)選具有標簽、使用說明或包裝插頁，指示相關組合物可用于治療患有或傾向于患癌癥、惡性腫瘤或腫瘤性疾病的對象。在優(yōu)選的實施方案中，使用說明或標簽將指示所述癌癥或惡性腫瘤是B細胞腫瘤。
本發(fā)明的更多細節(jié)通過以下非限定性實施例進行說明。在本說明書中所有引用文獻的內容在此特別引入作為參考。
實施例實施例1B淋巴瘤細胞DHT-4細胞的特性使用IDEC-131和暴露于阿霉素(ADM)的B細胞淋巴瘤細胞系DHL-4(Roos等，Leuk.Res.10195-202(1986))，在體外檢驗這樣的觀念，即抗CD40L抗體可阻斷惡性B細胞由CD40L-CD40介導的避免化療誘導的細胞毒性/凋亡而存活的行為。IDEC-131是小鼠單克隆抗人CD40L抗體24-31的人源化形式。
首先，通過將DHL-4細胞暴露于不同濃度的ADM 4小時來確定對DHL-4細胞有細胞毒性的ADM最低濃度。通過Alamar Blue活細胞染料還原試驗，測定培養(yǎng)5天后DHL-4細胞的細胞毒性(參見Gazzano-Santoro等，J.Immunol Meth.202163-171(1997))。簡而言之，將處于生長培養(yǎng)基(RMPI-1640加10％胎牛血清)中的1×105DHL-4細胞與不同濃度的ADM(1×10-6M到1×10-8M)在細胞培養(yǎng)管中于37℃培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)之后，清洗細胞，以1×105細胞/毫升濃度重懸于生長培養(yǎng)基中，取200μl細胞懸液加入96孔平底板的各孔中。將平板于37℃溫育，并在不同的時間點測定細胞毒性。在溫育的最后18個小時期間，將50μl氧還染料Alamar Blue(BlosourceInternational，Cat.#DAL 1100-)加入各孔。溫育之后，通過將平板置于振蕩器上于室溫溫育10分鐘而冷卻平板，測定染料的細胞內還原。使用96孔熒光計以530nm激發(fā)和590nm發(fā)射讀取熒光。結果表達為相對熒光單位(RFU)。如下計算細胞毒性百分比[1-(測試樣本的平均RFU÷對照細胞的平均RFU)]×100％建立ADM細胞毒性的滴定曲線，并選擇產生細胞毒性的藥物最低濃度用于隨后的試驗。
結果如圖1所示，顯示了在培養(yǎng)之前暴露于ADM(2×10-7M和4×10-8M的ADM)4小時后培養(yǎng)5天的DHL-4細胞的細胞毒性。在暴露之后將細胞洗一次并在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，如上所述通過Alamar Blue染料攝取試驗測定細胞毒性。另外，通過流式細胞儀表征DHL-4細胞對所選擇CD分子的膜表達。發(fā)現DHL-4細胞表達CD19，CD20，CD40分子，但未檢測到CD40L表達。
實施例2抗CD40L抗體消除CD40L介導的B淋巴瘤細胞對阿霉素殺傷的抗性圖2A顯示抗CD40L抗體對CD40L-CD40介導的DHL-4細胞對ADM誘導細胞死亡的抗性的作用.將DHL-4細胞(0.5×106細胞/ml)在10μg/ml可溶性CD40L(sCD40L，P.A.Brams，E.A.Padlan，K.Hariharan，K.Slater，J.Leonard，R.Noelle 和R.Newman，“Ahumanized anti-human CD154 monoclonal antibody blocksCD154-CD40 mediated human B cell activation”(手稿已提交))存在下于37℃培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)1小時后，加入低濃度的ADM(2×10-7M-4×10-8M)，并在存在或缺乏CD40L(10μg/ml)的條件下再培養(yǎng)4小時。暴露于ADM后，清洗細胞并以0.5×106細胞/毫升濃度重懸于生長培養(yǎng)基中，取100μl細胞懸液加入96孔平底板的各孔中，一式兩份，有或無sCD40L。將sCD40L(10μg/ml)加入已在ADM處理期間持續(xù)暴露于sCD40L的培養(yǎng)物和在接觸ADM期間無sCD40L的培養(yǎng)物。此外，將10μg/ml的IDEC-131加入培養(yǎng)物中以測定其對與sCD40L和ADM一起培養(yǎng)的DHL-4細胞的作用。5天之后，如上所述通過Alamar Blue染料攝取試驗測定細胞毒性。
數據顯示sCD40L延長了DHL-4細胞在ADM處理后的存活，而如所預期的，在缺乏sCD40L條件下暴露于ADM的細胞中觀察到了增加的細胞毒性。此外，加入抗CD40L抗體(IDEC-131)逆轉了CD40L介導的細胞存活，導致細胞毒性增加(圖2A)。
單獨加入IDEC-131對用sCD40L處理的DHL-4細胞沒有作用，這表示該抗體本身對DHL-4細胞無任何直接的抑制活性或細胞毒活性(圖2B)。將與或不與sCD40L一起預溫育的DHL-4細胞在不同濃度IDEC-131，RITUXAN，抗CD20抗體CE9.1和抗CD4抗體存在下培養(yǎng)(Anderson等，Clin.Immunol.&Immunopathol.8473-84(1997))。5天后，如上所述通過Alamar Blue試驗測定DHL-4細胞的細胞毒性/增殖。圖2B顯示了IDEC-131對DHL-4細胞的增殖或細胞毒性無作用，而RITUXAN，如所預期的，抑制細胞增殖和誘導細胞毒性。在與抗CD4抗體一起培養(yǎng)的DHL-4細胞中沒有觀察到作用。
實施例3CD40L-CD40信號作用阻止抗CD20抗體RITUXAN導致的B淋巴瘤細胞凋亡使用涉及DHL-4細胞和RITUXAN表面交聯的體外系統(tǒng)，測定CD40L-CD40介導的信號作用對抗CD20抗體誘導的B淋巴瘤細胞凋亡的影響。將DHL-4細胞(0.5-1×106細胞/ml)與sCD40L(10μg/ml)一起于37℃培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)后，收獲細胞，并與10μg/ml的RITUXAN或對照抗體(CE9.1；抗CD4抗體)以及有或無sCD40L(10μg/ml)于冰上培養(yǎng)。培養(yǎng)1小時后，對細胞進行離心以除去未結合的抗體，并以1×106細胞/ml重懸于生長培養(yǎng)基(5％FCS-RPMI)中，于組織培養(yǎng)管中培養(yǎng)。通過以15μg/ml摻加山羊抗人Ig-Fcγ特異性抗體的F(ab’)2片段，交聯細胞表面結合的抗體，并將培養(yǎng)物于37℃培養(yǎng)，直到進行凋亡測定。使用流式細胞儀天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3測定檢測凋亡。在4和24小時收獲培養(yǎng)的細胞，清洗并使用Cytofix(Cytofix/CytopermTM試劑盒，Pharmingen Cat.#2075KK)于4℃固定。固定20分鐘后，清洗細胞并加入15μl親和純化的綴合PE的多克隆兔抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3抗體(Pharmingen，Cat.#67345)和50μl的cytoperm(Pharmingen；Cat.#2075KK)。將細胞置于冰上于暗處培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)之后將細胞洗一次并重懸于cytoperm中。在FACScan上獲取流式細胞儀數據，并使用來自VeritySoftware House的WinList軟件進行分析。
表I顯示了DHL-4淋巴瘤細胞暴露于sCD40L而對RITUXAN誘導的凋亡的抗性。在這些研究中，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3的活化被用作代用標記，因為我們先前的研究顯示了天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3與Tunel測定之間的良好相關性。在sCD40L存在下DHL-4細胞表面上RITUXAN的交聯降低了凋亡水平，而未暴露于sCD40L的細胞發(fā)生凋亡。相比之下，在相同同種型抗體-對照抗體(CE9.1)的存在下培養(yǎng)的培養(yǎng)物不發(fā)生細胞凋亡。由此，所述數據提示sCD40L誘導的CD40途徑信號作用可導致發(fā)生RITUXAN介導的對B淋巴瘤細胞的殺傷。
表IsCD40L引起的DHL-4細胞對RITUXAN介導的細胞凋亡的抗性

(a)具有天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3活性的陽性細胞百分比及其對數標度的平均熒光強度。
實施例4IDEC-131對慢性淋巴細胞白血病(CLL)細胞存活的作用為了測定IDEC-131對B-CLL細胞在體外生長和存活的影響，將B-CLL細胞與或不與IDEC-131一起在CD40L存在下體外培養(yǎng)。使用Ficoll-Hypaque梯度離心，從CLL患者血中分離外周血單核的細胞(PBMC)。通過臺盼藍染料排斥確定存活，為＞98％。流式細胞儀分析顯示＞70％的淋巴細胞為CD19+/CD20+。將CLL細胞(PBMC)在CLL生長培養(yǎng)基(例如RPMI-1640培養(yǎng)基補充5％FCS或2％自體供體血漿，添加2mM的L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素-鏈霉素)中培養(yǎng)。另外，對于某些試驗，使用CD19+DynabeadsTM根據制造商的使用說明(Dynal，Cat.#111.03/111.04)純化CD19+B細胞并如上培養(yǎng)。在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CLL或純化的B-CLL細胞大多數經歷自發(fā)的編程性細胞死亡。但是，在sCD40L存在下培養(yǎng)這些細胞延長了其在培養(yǎng)物中的存活。表II顯示在不同時間點，在存在或缺乏sCD40L(5μg/ml)條件下生長的CD19+B-CLL細胞的細胞存活，并顯示CLL細胞的更長存活。與sCD40L一起培養(yǎng)的來自患者#1的B-CLL細胞的存活≥60％超過2周，而在缺乏sCD40L條件下生長的細胞則存活低于10％。
表II在sCD40L存在下B-CLL細胞的存活

(a)等于通過臺盼藍染料排斥測定的存活百分比。
圖3A顯示在培養(yǎng)7天之后，IDEC-131對B-CLL細胞的生長和存活的影響。將來自CLL患者的純化的B-CLL細胞(2×106細胞/ml)分到兩個培養(yǎng)管中。將一個管中的細胞與等體積生長培養(yǎng)基中的sCD40L(5μg/ml)混合，而另一管與等體積生長培養(yǎng)基一起培養(yǎng)作為對照。于37℃培養(yǎng)1小時后，將細胞輕輕混合，并取100μl細胞懸液培養(yǎng)基加入96孔平底板的各孔中，一式兩份，有或無不同濃度的IDEC-131(10μg/ml-0.3μg/ml)。7天后，如上所述通過Alamar Blue試驗測定培養(yǎng)物中的細胞存活/死亡。數據顯示在有sCD40L的培養(yǎng)物中的細胞存活。向培養(yǎng)物中加入IDEC-131導致細胞死亡增加，指示細胞存活的逆轉或對細胞死亡致敏。另外，以與IDEC-131相同的濃度施用的RITUXAN對細胞死亡的作用比IDEC-131要小或低(圖3B)。
實施例5CD40L-CD40介導的B-CLL中HLA-DR分子的上調為了測定CD40L-CD40信號轉導途徑是否完整，將來自CLL患者的CLL細胞與或不與5μg/ml的CD40L一起于37℃進行培養(yǎng)(5×105細胞/毫升)。在48和144小時，通過流式細胞儀使用標準程序在CD19+細胞上測定II類分子HLA-DR表達。簡而言之，在不同的時間點收獲培養(yǎng)的淋巴細胞，并使用FACScan(Becton-Dickinson)流式細胞儀，用偶聯至熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)的抗體單一或雙重染色，分析分子表面表達。為了染色用于流式細胞分析，將培養(yǎng)管中的1×106細胞與如下的適宜抗體一起培養(yǎng)抗CD45-FITC，用于在散點圖上分選淋巴細胞群；抗CD19-PE(Pharmingen，Cat.#30655)或抗CD20-FITC(Pharmingen；Cat.#33264)抗體，以確定CD19+和/或CD20+B細胞；抗CD3-FITC抗體(Pharmingen；Cat.#30104)以去掉(gate-off)T細胞；抗CD19-RPE和抗HLA-DR-FITC抗體(Pharmingen；Cat.#32384)以測定CD19+細胞上的II類表達。通過與2ml冷PBS離心(200×g，6分鐘)將細胞洗一次，并與抗體一起在冰上培養(yǎng)30分鐘，然后將細胞洗一次，固定在0.5％低聚甲醛中并貯存于4℃直到進行分析。在FACScan上獲取流式細胞儀數據并使用WinList軟件(VeritySoftware House)進行分析。將機器設置為自動門控，以檢查含有RPE或FITC單染色、未染色或雙重染色的細胞的象限。圖4顯示在與sCD40L一起培養(yǎng)的CD19+細胞和未與sCD40L一起培養(yǎng)的那些細胞中HLA-DR表達的比較。在有sCD40L存在下培養(yǎng)的B-CLL細胞上檢測到更高水平的HLA-DR表達(表III)。
表IIIB-CLL中CD40L-CD40介導的HLA-DR分子的上調

(a)HLA-DR分子陽性的CD19+B細胞及其平均熒光強度(MIF)實施例6IDEC-131制劑和RITUXAN為治療CD40+惡性腫瘤，將在配制緩沖液(10mM檸檬酸鈉，150mM NaCl，0.02％聚山梨酯80，pH6.5)中約10-約50mg/ml的IDEC-131靜脈內輸注(iv)給治療對象。在施用RITUXAN之前、之后或與RITUXAN一起施用IDEC-131。輸注的RITUXAN劑量范圍從約3-約10mg/kg治療對象體重。
實施例7IDEC-131制劑和CHOP為治療對CHOP有反應的CD40+惡性腫瘤(例如霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病，以及對于其中細胞為CD40+的惡性腫瘤的搶救治療)，在開始CHOP周期之前即刻，以范圍從約3-約10mg/kg患者體重的劑量輸注IDEC-131。在每個CHOP周期之前將重復IDEC-131給藥，總共4-8個周期。
實施例8施用抗CD40L或抗B7抗體與RITUXAN相結合治療患者的B細胞淋巴瘤聯合治療可特別用作搶救治療或用于治療復發(fā)性或侵襲形式的CD40+惡性腫瘤(例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤和CLL)。當IDEC-131有待與CHOP和RITUXAN聯合施用時，如以上在實施例6中所述施用IDEC-131，隨后采用在實施例7中所述的CHOP-IDEC-131給藥方案?；蛘?，實施相同的方案，其中IDEC-131(抗CD40L)實質上在抗B7抗體之中。
實施例9使用淋巴瘤細胞系對抗CD80和抗CD20的體外研究為了加強采用抗CD80和抗CD20作為聯合治療方案用于治療淋巴瘤的科學基礎，使用淋巴瘤細胞系進行以下體外試驗。
所用的細胞系細胞系的獲得和維持如下。將表達CD20和B7的B淋巴瘤細胞系(SKW，SB和Daudi細胞)置于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基為RPMI 1640培養(yǎng)基(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)，補充10％熱滅活的FBS(Hyclone)，2mM l-谷氨酰胺，100單位/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素。SKW細胞系為Epstein-Bar病毒(EBV)陽性，并可被誘導分泌IgM(SKW 6.4，ATCC)。SB細胞系源自一名急性淋巴母細胞白血病患者，并呈EBV陽性(CCL-20，ATCC)。Daudi細胞系是從一名伯基特淋巴瘤患者分離的(CCL-213，ATCC)。使用IDEC Pharmaceuticals專利載體系統(tǒng)生成新霉素抗性的表達CD80的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。
所用的抗體在這些研究中所用的特異性抗體如下。IDEC-114為一種PRIMATIZED抗人CD80mAb，其包含人γ1重鏈(Lot114S004F，code 3002G710；Lot ZPPB-01)，而rituximab是抗人CD20特異性小鼠-人γ1嵌合抗體(Lot E9107A1；Lot D9097A1)。所用的其它抗體包括小鼠抗人CD80 mAb L307.4(BD Pharmingen，San Diego，CA)，靈長類動物源化抗人CD4mAb CE9.1，其具有人γ1鏈(LotM2CD4156)，和小鼠同種型匹配的(IgG1)對照抗體3C9，其在IDECPharmaceuticals開發(fā)。
CD80和CD20在某些淋巴瘤細胞系上的表達為了測定CD80和CD20在某些淋巴瘤細胞系上的細胞表面表達，如下通過熒光激活的細胞分選(FACS)測定在那些細胞系上的IDEC-114和Rituxan結合。將在冷FACS結合緩沖液中稀釋至200μl終體積的不同濃度的測試或對照抗體與1×106細胞在細胞培養(yǎng)管中培養(yǎng)。IDEC-114和rituximab用作測試抗體，而CE9.1用作為同種型匹配的陰性對照。將細胞置于冰上培養(yǎng)60分鐘，并于培養(yǎng)之后在FACS洗滌緩沖液中洗一次。將細胞重懸于200μl FACS結合緩沖液中，每106細胞加入2μl綴合FITC的山羊F(ab’)2抗人Igγ鏈特異性抗體(Southern Biotechnology，Birmingham，AL)。再于冰上培養(yǎng)30分鐘后，將細胞洗一次并重懸于200μl冷HBSS中，用200μl 1％甲醛固定。
圖5顯示來自兩個不同批次(Lot 114S004F和Lot 114S015)的IDEC-114與CD80-CHO細胞以濃度依賴性方式特異性結合。正如所預期的，無關特異性的同種型匹配對照抗體(IDEC-152)不結合CD80-CHO細胞。對IDEC-114結合SKW和SB淋巴瘤細胞系上的CD80的測試顯示其結合比rituximab低，如較低的陽性細胞百分比(表IV)和較低的平均熒光強度(表V)所證實。
表IV抗體與B淋巴瘤細胞系的結合

*與細胞的結合通過流式細胞儀在抗體的飽和濃度下測定。結合活性強度＝測試抗體的MFI÷對照抗體的MFI。
表VCD80-CHO和SB細胞上的相對CD80抗原密度

*相對CD80抗原通過平均熒光強度(MFI)測量。在減去背景內部熒光之后數值以單位表示。
這些結果加強了抗CD80和抗CD20作為淋巴瘤治療劑的適用性。
抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)為了進一步證實抗CD80和抗CD20作為淋巴瘤治療劑的適合性，對每種抗體的實例測定其介導ADCC的能力。在ADCC測定中，SKW或SB細胞和活化的人外周單核細胞(PBMC)分別用作靶和效應細胞。使用Histopaque(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)從健康供體的全血分離PBMC。在75cm2組織培養(yǎng)瓶中以5×106細胞/ml的濃度在含有20U/ml重組人IL-2(Invitrogen，Carlsbad，CA)的完全培養(yǎng)基中于37℃和5％CO2培養(yǎng)PBMC。過夜培養(yǎng)后，將1×106SKW或SB靶細胞用150μCi的51Cr(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)于37℃和5％CO2標記1小時。將細胞洗4次并重懸于5ml完全培養(yǎng)基中；取50μl細胞懸液分入含有等體積測試或對照抗體的各孔中。
Rituximab(Lot E9107A1)或IDEC-114(Lot 114S004F，code3002G710)用作測試抗體。使用同種型匹配的CE9.1(Lot M2CD4156)或L307.4(BD Pharmingen)，或具有無關特異性的小鼠同種型匹配(IgG1)抗體3C9。將所有的孔一式三份平板接種到96孔圓底組織培養(yǎng)板中。收獲效應細胞，用完全培養(yǎng)基洗一次，并以在100μl體積中的1×106細胞加入每孔，以獲得50∶1的效應細胞與靶細胞之比。以下對照孔也一式三份包括在內與100μl完全培養(yǎng)基一起培養(yǎng)的靶細胞，以測定自發(fā)釋放；和與100μl 0.5％Triton X-100(Sigma-AldrichCorp.)一起培養(yǎng)的靶細胞，以測定最大釋放。將培養(yǎng)物于37℃和5％CO2培養(yǎng)4小時，通過γ計數器(ISODATA)測定由于細胞溶解在培養(yǎng)上清中釋放的51Cr。細胞毒性表示為特異性溶胞百分比并計算如下 圖6顯示IDEC-114和rituximab對CD20+/CD80+SB和SKW細胞的ADCC活性?？傮w上，對SB細胞觀察到了較SKW細胞更高水平的ADCC活性。IDEC-114顯示出對SB和SKW細胞的劑量依賴性殺傷，在10μg/ml，最大殺傷分別為75％和46％。以相當抗體濃度的Rituximab顯示出比IDEC-114更高的ADCC活性(對SB細胞為97％，對SKW細胞為65％)，這與rituximab較IDEC-114更高的細胞結合活性相關。如所預期的，不結合人Fc受體的小鼠L307.4顯示出微弱的ADCC活性。對于同種型人和小鼠對照(分別為CE9.1和3C9)僅觀察到背景水平的ADCC。
進行試驗以測定將IDEC-114與rituximab相聯合增加宿主效應細胞介導的對腫瘤細胞的殺傷的作用。在這些試驗中，固定濃度的IDEC-114與不同濃度的rituximab相聯合，以反映方案，其中B淋巴瘤細胞上低CD20密度及正常B7表達可導致有效的腫瘤殺傷。圖7顯示IDEC-114與rituximab的組合導致對SKW淋巴瘤細胞的ADCC活性增強。10μg/ml固定濃度的IDEC-114與0.1-0.01μg/ml濃度的rituximab相結合介導增強的對SKW細胞的殺傷。使用來自兩個供體的宿主效應細胞獲得的結果顯示ADCC活性的相同趨勢。
補體依賴性細胞毒性(CDC)
使用B細胞系和人補體(C)測定IDEC-114和rituximab的CDC活性。以4×濃度稀釋抗體，取50μl分入各96孔中，一式三份。將SKW或Daudi細胞用51Cr(150μCi/106細胞)于37℃和5％CO2標記1小時。將細胞洗4次并重懸于完全培養(yǎng)基中，將在50μl中的1×104細胞分入各孔中。加入在完全培養(yǎng)基中1∶4或1∶8稀釋的100μl正常人血清補體(Quidel，San Diego，CA)。自發(fā)和最大釋放對照和設置的方法與以上關于ADCC試驗所述相同。將培養(yǎng)物于37℃和5％CO2培養(yǎng)4小時。通過γ計數器測定釋放入培養(yǎng)上清中的放射性。計算特異性細胞溶解百分比的公式亦如上對ADCC試驗所述。
在rituximab與CD20抗原結合之后補體級聯的活化導致在體外有效殺傷B淋巴瘤細胞。Reff ME，Carner K，Chambers KS，Chinn PC，Leonard JE，Raab R等，Depletion of B cells in vivo by a chimericmouse human monoclonal antibody to CD20.Blood1994；83(2)435-45。因此，我們評價了IDEC-114介導對CD80+靶細胞的補體依賴性殺傷的能力。結果顯示IDEC-114介導對表達CD80的CHO細胞的CDC(圖8a)。但是，IDEC-114與CD80+Daudi和SKW淋巴瘤細胞系的結合未顯示CDC跡象(分別見圖8b和圖8c)。與此相比，rituximab對這兩種細胞系均顯示出CDC活性，盡管Daudi細胞系比SKW細胞系對CDC更為敏感(分別見圖8b和圖8c)。
實施例10使用從腫瘤樣本分離的細胞對抗CD80和抗CD20的體外研究為了進一步評估采用抗CD80和抗CD20作為治療淋巴瘤的聯合治療方案的科學基礎，使用從腫瘤樣本分離的細胞進行以下體外試驗。
CD80在活化B細胞和活化APC表面上短暫表達，但在靜止B細胞和靜止APC上微弱表達或不表達。由于CD80是B細胞活化標記，因此其主要在分裂和/或活化的淋巴瘤細胞上表達。報道提示CD80在惡性B細胞上組成型表達。為了證實這些報道，通過流式細胞儀在獲自20名患者的一組淋巴瘤和白血病標本中測定CD80的表達。結果表明CD80在淋巴瘤和白血病中以不同的密度表達(表VI)。
表VICD80在淋巴瘤/白血病標本上的表達

*陽性樣本/測試的樣本表達水平為主觀值，通過分析流式細胞儀數據而估計，并且是陽性分選細胞相對于對照抗體的百分比；弱＝＜10％，低＝10％-25％，中＝25％-50％，高＝＜50％在濾泡性小分裂低分級淋巴瘤和小未分裂伯基特淋巴瘤中觀察到最高的CD80表達。在一份慢性淋巴細胞淋巴瘤(CLL)樣本和一例小未分裂高分級淋巴瘤中見到最低的表達。在濾泡性小分裂低分級淋巴瘤樣本上的CD80表達如表VII所示。
表VIICD80在濾泡性小分裂低分級淋巴瘤標本上的表達

在這些淋巴瘤細胞上的CD80表達為樣本中25％到90％的腫瘤細胞。然而令人感興趣的是，在相同的淋巴瘤內，“大”細胞為90％-100％陽性，而“小”細胞為25％-100％陽性。可能CD80在增殖或活化的惡性B細胞上表達，這可能可解釋表達在測試的淋巴瘤樣本之內的變異性。
實施例11使用SCID小鼠模型對抗CD80和抗CD20的體內研究為了測試聯合治療的有效性，使用抗CD80(IDEC-114)和抗CD20(RITUXAN(rituximab))進行以下體內試驗。
IDEC-114和Rituximab單一藥劑治療在淋巴瘤中的體內治療效果研制在嚴重免疫缺陷(SCID)小鼠中的人淋巴瘤腫瘤模型。簡而言之，將3×106-4×106人SKW淋巴瘤細胞靜脈內(IV)接種到6-8周齡雌性BALB/c SCID小鼠體內，監(jiān)測其存活45-60天。接種之后，SKW細胞播散遍及小鼠體內并主要在肺和肝中生長。在第1，3，5，7，9和11天，對治療組小鼠(N＝8)腹膜內注射100μg、200μg或400μg的IDEC-114(a)或rituximab(b)。在致死亡之前，所有的小鼠均發(fā)生麻痹形式的該疾病。處死發(fā)生嚴重麻痹的小鼠并記為死亡。使用統(tǒng)計學分析系統(tǒng)(SAS)進行Kaplan-Meier分析，通過log-rank檢驗生成p值。
圖9A和圖9B顯示，使用3個劑量(100、200和400μg)的抗體，單一藥劑IDEC-114(圖9A)和單一藥劑rituximab(圖9B)治療的抗腫瘤反應。IDEC-114和rituximab單一藥劑治療在全部劑量都顯示出對疾病進展的抑制。對IDEC-114觀察到的抗腫瘤反應與相同劑量和治療方案的rituximab的抗腫瘤反應相似。
實施例12IDEC-114/Rituximab聯合治療在淋巴瘤中的體內治療效果基于IDEC-114作為單一藥劑的抗腫瘤活性，在與以上關于單一藥劑研究所述相同的腫瘤模型中，以相同的給藥方案，評價IDEC-114和rituximab的組合。
對SKW/SCID小鼠注射200μg的IDEC-114和200μg的rituximab，并與注射200μg或400μg的IDEC-114或者200μg或400μg的rituximab的小鼠作比較。圖10顯示用IDEC-114/rituximab聯合療法治療的小鼠與用IDEC-114或rituximab作為單一藥劑療法治療的小鼠相比的存活優(yōu)勢。結果顯示IDEC-114與rituximab的組合與單獨的任一種抗體相比，導致無病存活增加。在聯合治療組中，70％(7/10)的小鼠在最后一次抗體注射之后存活超過50天。相比之下，單獨用IDEC-114或rituximab治療的小鼠中少于10％在研究結束時仍存活。通過Kaplan-Meier和log-rank檢驗分析存活數據(表VIII)。
表VIIIIDEC-114/Rituximab聯合治療與IDEC-114或Rituximab單一藥劑治療的比較

*由Log-rank檢驗生成的p-值IDEC-114/rituximab聯合治療比200μg或400μg的IDEC-114或rituximab單一藥劑治療產生統(tǒng)計學上更強的反應。
本領域技術人員會進一步理解本發(fā)明可以以其它具體的形式實施而不偏離其實質或中心特質。本發(fā)明的前述說明書僅僅公開了示例性的實施方案，應理解也可以想到其它改變在本發(fā)明的范圍之內。因此，本發(fā)明并不限于本文詳細描述的特定實施方案，而是應參照所附的權利要求，其表明了本發(fā)明的范圍和內容。
權利要求
1.一種用于治療患有或傾向于患腫瘤性疾病的哺乳動物的方法，包括以下步驟向所述哺乳動物施用治療有效量的第一免疫調節(jié)抗體；和向所述哺乳動物施用治療有效量的第二免疫調節(jié)抗體或B細胞耗盡抗體，其中所述第一和第二免疫調節(jié)抗體結合不同的抗原，并且所述第一免疫調節(jié)抗體和第二免疫調節(jié)抗體或B細胞耗盡抗體可以以任何次序或同時施用。
2.權利要求1的方法，其中所述第一免疫調節(jié)抗體與B7抗原反應或結合。
3.權利要求2的方法，包括施用第二免疫調節(jié)抗體，其中所述第二免疫調節(jié)抗體與選自以下的抗原反應或結合CD40L、CD40和CD23。
4.權利要求3的方法，其中所述第二免疫調節(jié)抗體結合CD40L抗原。
5.權利要求1的方法，其中所述第一免疫調節(jié)抗體、所述第二免疫調節(jié)抗體和所述B細胞耗盡抗體為單克隆抗體。
6.權利要求5的方法，其中所述單克隆抗體選自嵌合抗體和人源化抗體。
7.權利要求6的方法，其中至少一種所述單克隆抗體為嵌合抗體且所述嵌合抗體是靈長類動物源化的。
8.權利要求7的方法，其中所述靈長類動物源化的抗體是IDEC-114。
9.權利要求1的方法，其中所述腫瘤性疾病選自復發(fā)性霍奇金??；耐藥的霍奇金病；高分級、低分級和中間分級的非霍奇金淋巴瘤；B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)；漿細胞樣淋巴細胞性淋巴瘤(LPL)；套細胞淋巴瘤(MCL)；濾泡性淋巴瘤(FL)；彌漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)；伯基特淋巴瘤(BL)；AIDS相關性淋巴瘤；單核細胞性B細胞淋巴瘤；血管免疫母細胞淋巴結??；小淋巴細胞、濾泡性彌漫性大細胞、彌漫性小分裂細胞、大細胞免疫母細胞成淋巴細胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、濾泡性大細胞為主、濾泡性小分裂細胞為主、和濾泡性小分裂細胞和大細胞混合的淋巴瘤。
10.權利要求1的方法，包括施用第一免疫調節(jié)抗體和B細胞耗盡抗體。
11.權利要求10的方法，其中所述B細胞耗盡抗體與選自以下的抗原反應或結合CD20、CD19、CD22和CD37抗原。
12.權利要求11的方法，其中所述B細胞耗盡抗體與CD20反應或結合。
13.權利要求12的方法，其中所述B細胞耗盡抗體與放射性同位素相結合。
14.權利要求12的方法，其中所述B細胞耗盡抗體為RITUXAN。
15.權利要求14的方法，其中所述第一免疫調節(jié)抗體為IDEC-114。
16.權利要求14的方法，其中所述第一免疫調節(jié)抗體為IDEC-131。
17.權利要求1的方法，還包括施用化療劑的步驟。
18.一種用于治療患有或傾向于患腫瘤性疾病的哺乳動物的方法，包括以下步驟向所述哺乳動物施用治療有效量的至少一種化療劑；和向所述哺乳動物施用治療有效量的至少一種免疫調節(jié)抗體，其中所述化療劑和所述免疫調節(jié)抗體可以以任何次序或同時施用。
19.權利要求18的方法，其中所述免疫調節(jié)抗體結合選自以下的抗原B7、CD40、CD40L和CD23抗原。
20.權利要求19的方法，其中所述免疫調節(jié)抗體包括單克隆抗體。
21.權利要求20的方法，其中所述單克隆抗體選自嵌合抗體和人源化抗體。
22.權利要求21的方法，其中所述免疫調節(jié)抗體為嵌合抗體且所述嵌合抗體是靈長類動物源化的。
23.權利要求22的方法，其中所述靈長類動物源化的抗體是IDEC-114。
24.權利要求21的方法，其中所述單克隆抗體是人源化的。
25.權利要求24的方法，其中所述人源化抗體包括IDEC-131。
26.權利要求18的方法，其中所述腫瘤性疾病選自復發(fā)性霍奇金?。荒退幍幕羝娼鸩?；高分級、低分級和中間分級的非霍奇金淋巴瘤；B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)；漿細胞樣淋巴細胞性淋巴瘤(LPL)；套細胞淋巴瘤(MCL)；濾泡性淋巴瘤(FL)；彌漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)；伯基特淋巴瘤(BL)；AIDS相關性淋巴瘤；單核細胞性B細胞淋巴瘤；血管免疫母細胞淋巴結??；小淋巴細胞、濾泡性彌漫性大細胞、彌漫性小分裂細胞、大細胞免疫母細胞成淋巴細胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、濾泡性大細胞為主、濾泡性小分裂細胞為主、和濾泡性小分裂細胞和大細胞混合的淋巴瘤。
27.權利要求18的方法，還包括施用B細胞耗盡抗體的步驟。
28.權利要求27的方法，其中所述B細胞耗盡抗體與CD20抗原反應或結合。
29.一種用于治療患有或傾向于患腫瘤性疾病的哺乳動物的方法，包括以下步驟向所述哺乳動物施用治療有效量的第一免疫調節(jié)抗體；和向所述哺乳動物施用治療有效量的第二免疫調節(jié)抗體，其中所述第一和第二免疫調節(jié)抗體結合不同的抗原，并且所述第一免疫調節(jié)抗體和第二免疫調節(jié)抗體可以以任何次序或同時施用。
30.權利要求29的方法，其中所述第一和第二免疫調節(jié)抗體與選自以下的抗原結合B7、CD40、CD40L和CD23抗原。
31.權利要求30的方法，其中所述第一免疫調節(jié)抗體與B7抗原反應或結合，而所述第二免疫調節(jié)抗體與CD40L抗原反應或結合。
32.權利要求31的方法，其中所述第一免疫調節(jié)抗體包括IDEC-114，而所述第二免疫調節(jié)抗體包括IDEC-131。
33.權利要求32的方法，其中所述腫瘤性疾病選自復發(fā)性霍奇金??；耐藥的霍奇金病；高分級、低分級和中間分級的非霍奇金淋巴瘤；B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)；漿細胞樣淋巴細胞性淋巴瘤(LPL)；套細胞淋巴瘤(MCL)；濾泡性淋巴瘤(FL)；彌漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)；伯基特淋巴瘤(BL)；AIDS相關性淋巴瘤；單核細胞性B細胞淋巴瘤；血管免疫母細胞淋巴結??；小淋巴細胞、濾泡性彌漫性大細胞、彌漫性小分裂細胞、大細胞免疫母細胞成淋巴細胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、濾泡性大細胞為主、濾泡性小分裂細胞為主、和濾泡性小分裂細胞和大細胞混合的淋巴瘤。
34.權利要求32的方法，還包括施用治療有效量的至少一種化療劑的步驟。
35.權利要求32的方法，還包括施用至少一種B細胞耗盡抗體的步驟。
36.權利要求35的方法，其中所述B細胞耗盡抗體與選自以下的抗原反應或結合CD20、CD19、CD22和CD37抗原。
37.權利要求36的方法，其中所述B細胞耗盡抗體與CD20反應或結合。
38.權利要求37的方法，其中所述B細胞耗盡抗體為RITUXAN。
39.用于治療患有或傾向于患腫瘤性疾病的哺乳動物的藥盒，包括至少一個容器，其中存放有免疫調節(jié)抗體；和標簽、使用說明或插頁，指示所述免疫調節(jié)抗體可用于治療所述腫瘤性疾病。
40.權利要求39的藥盒，其中所述免疫調節(jié)抗體與選自以下的抗原結合B7，CD40，CD40L和CD23抗原。
41.權利要求40的藥盒，其中所述免疫調節(jié)抗體包括單克隆抗體。
42.權利要求41的藥盒，其中所述單克隆抗體選自嵌合抗體和人源化抗體。
43.權利要求42的藥盒，其中所述免疫調節(jié)抗體是嵌合抗體并且所述嵌合抗體是靈長類動物源化的。
44.權利要求43的藥盒，其中所述靈長類動物源化的抗體是IDEC-114。
45.權利要求42的藥盒，其中所述單克隆抗體是人源化的。
46.權利要求45的藥盒，其中所述人源化抗體包括IDEC-131。
47.權利要求39的藥盒，還包括一個容器，裝有第二免疫調節(jié)抗體或B細胞耗盡抗體，其中所述第二免疫調節(jié)抗體結合的抗原與所述免疫調節(jié)抗體不同。
48.權利要求47的藥盒，包含免疫調節(jié)抗體和第二免疫調節(jié)抗體，其中所述免疫調節(jié)抗體結合B7抗原，而所述第二免疫調節(jié)抗體結合CD40L抗原。
49.權利要求48的藥盒，其中所述免疫調節(jié)抗體包括IDEC-114，而所述第二免疫調節(jié)抗體包括IDEC-131。
50.權利要求47的藥盒，包含免疫調節(jié)抗體和B細胞耗盡抗體，其中所述免疫調節(jié)抗體與選自CD40L和B7抗原的抗原反應或結合，而所述B細胞耗盡抗體與CD20抗原反應或結合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療B細胞惡性腫瘤的聯合抗體治療，使用免疫調節(jié)抗體，特別是抗B7、抗CD23或抗CD40L抗體，和B細胞耗盡抗體，特別是抗CD19、抗CD20、抗CD22或抗CD37抗體。優(yōu)選所述聯合治療將包括施用抗B7抗體和抗CD20抗體。
文檔編號A61P31/18GK1568198SQ02805702
公開日2005年1月19日 申請日期2002年1月31日 優(yōu)先權日2001年1月31日
發(fā)明者K·哈里哈蘭, N·翰納 申請人:拜奧根Idec公司