專利名稱：具有抗齲齒功能的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有抗齲齒功能的膳食組合物和口腔組合物。更具體地，本發(fā)明涉及具有抗齲齒功能的膳食組合物和口腔組合物，例如給牙齒補充礦質(zhì)以減小齲齒的發(fā)生。
背景技術：
齲齒是一種由口腔中存在于牙齒表面的細菌引起的牙齒表面的脫礦質(zhì)。具體地說，由于一些障礙使口腔細菌產(chǎn)生的有機酸不能擴散，牙齒暴露于高濃度的有機酸，因此牙齒表面被脫礦質(zhì)。在此定義中，任何具有通過代謝發(fā)酵糖產(chǎn)生有機酸的能力的口腔細菌都能引起齲齒。適合有機酸生產(chǎn)的底物是糖類，包括單糖和寡糖(例如，葡萄糖和蔗糖)，和單糖的聚合物多糖(如淀粉)。
一般說來，有機酸不能分散歸因于(1)從飲食中攝取的淀粉在牙頸和牙根上滯留，和(2)不溶解的葡聚糖粘附在牙齒上，這是使用易于降解的糖，例如蔗糖(即發(fā)酵的糖)作為底物由細菌產(chǎn)生的。
對于因素(1)，認為任何具有發(fā)酵糖能力的口腔細菌，例如乳酸桿菌是造成齲齒的原因。在這種情況下，已知齲齒的進展通常是緩慢的。產(chǎn)生高濃度有機酸的環(huán)境的發(fā)展取決于被動因素。
在含蔗糖的食物可廣泛得到的今天，因素(2)是齲齒的主要原因。在這種情況下，認為變異鏈球菌(Streptococcus mutans)和表兄鏈球菌(s.sobrinus)是引起齲齒的原因。這兩種細菌都是以鏈型發(fā)生的鏈球菌的一個類型，每個細胞具有約0.6μm直徑的圓形。在蔗糖存在下，這兩種細菌活躍地產(chǎn)生不溶于水的α-葡聚糖。該葡聚糖具有很好粘附于牙齒表面的特性。細菌迅速代謝蔗糖，發(fā)揮產(chǎn)生酸的能力。該細菌本身具有強的抗酸性并可在其它細菌不能生長的酸性環(huán)境中存活。不溶于水的葡聚糖的粘附性使細菌牢固地粘附于牙齒表面等地方。不溶于水的葡聚糖吸附于牙齒表面，使由細菌產(chǎn)生的有機酸不能擴散，導致牙齒表面暴露于高濃度有機酸的環(huán)境中。認為與因素(1)相比，產(chǎn)生高濃度有機酸的環(huán)境的形成取決于細菌的活性因素。在這種情況下，齲齒的發(fā)展比因素(1)引起的較快。
有一個新的方法通過在微觀水平上考慮牙齒的健康來預防齲齒，即牙質(zhì)的脫礦質(zhì)和補充礦質(zhì)(Yoichi Iijima，Takashi Kumagaya；Kariesu Kontororu Dakkai-toSaisekkaike-no-Mekanizumu[齲齒控制-脫礦質(zhì)和補充礦質(zhì)的機制(Caries Control-Mechanism of Demineralization and Remineralization)]，Ishiyaku Shuppan K.K.；21-51，1999)。牙齒表面是由鈣和磷酸鹽晶體羥磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]制成的，并稱為釉質(zhì)。釉質(zhì)是牙齒最堅硬的部分，并防止由于齒斑中的細菌產(chǎn)生的有機酸、食物中所含的酸等造成的釉質(zhì)下的重要的鈣或磷酸鹽溶解(脫礦質(zhì))。
有機酸通過充滿水的釉柱之間的間隙滲透釉質(zhì)，并通過稱為脫礦質(zhì)的過程溶解羥磷灰石。鈣和磷酸鹽從釉質(zhì)組織中損失導致釉質(zhì)表層下最初的齲齒的發(fā)生。如下文所描述的，根據(jù)本發(fā)明，上述階段的齲齒可以修復。鈣和磷酸鹽離子透過釉質(zhì)表面下的齲齒部分及磷灰石的損失可通過稱為補充礦質(zhì)的過程恢復。
每當攝入含有發(fā)酵的碳水化合物的食物，齒斑的pH變?yōu)樗嵝圆⒊^臨界pH，脫礦質(zhì)開始。這是由于齒斑中產(chǎn)生酸的細菌的作用。當齒斑被唾液緩沖時，齒斑的pH恢復中性，唾液中的鈣和磷酸鹽離子再通過齒斑進入牙質(zhì)(這一過程被稱為補充礦質(zhì))。
因此，預防和治療齲齒的方法不應是引起齲齒使細菌產(chǎn)生有機酸的口腔細菌的營養(yǎng)物；不應是引起齲齒使細菌產(chǎn)生不溶于水的葡聚糖和有機酸的變異鏈球菌的營養(yǎng)物；應防止由于有機酸pH下降至脫礦質(zhì)開始的pH以下(例如，應具有緩沖能力以防止pH下降)；應促進補充礦質(zhì)等等。
迄今為止已知各種抗齲齒的藥劑。
當使用蔗糖作為營養(yǎng)物和糖基轉(zhuǎn)移酶作為酶變異鏈球菌產(chǎn)生不溶于水的葡聚糖時齲齒開始。此葡聚糖覆蓋在牙齒表面，產(chǎn)生齒斑。當變異鏈球菌在齒斑內(nèi)進行酸發(fā)酵時，牙齒被溶解掉并形成牙脫落。
關于抗齲齒的糖類，已提出一些不是變異鏈球菌的營養(yǎng)物的寡糖(S.Hamada等，J.Jpn.Soc.Starch Sci.，31卷，83-91頁，1984)。這些抗齲齒的糖類的一個例子是palatinit(日本公開出版物2000-281550號)。當palatinit與氟或鋅結(jié)合，促進牙齒的補充礦質(zhì)。(日本公開出版物2000-247852號)。但是，palatinit的甜味差且不適合于食物。而且，對于palatinit補充礦質(zhì)的效果需要高達約1-20wt％的濃度。
還已知糖醇(具體是木糖醇)是一種抗齲齒的藥劑(例如，日本公開出版物2000-128752號和日本公開出版物2000-53549號)。日本公開出版物11-12143號公開了一種包含選自木糖醇、甘露醇、半乳糖醇和肌醇的一種或多種糖醇的口腔組合物。日本公開出版物11-12143號描述這些糖醇可促進牙齒補充礦質(zhì)，但不抑制細菌的生長。雖然糖醇只在高濃度時有效，已知大量攝取糖醇引起稀糞。如下文實施例中所描述的，實質(zhì)上沒有證實木糖醇的效果。
另外，已報道和利用茶葉的一種成分多酚作為抗齲齒的藥劑(S.Sakanaka等，F(xiàn)ragrance Journal，11卷，42-49頁，1990)。但是，多酚的使用也引起味覺的問題并因此受到限制。
目前，據(jù)說氟對于補充礦質(zhì)的作用是最有效的。氟可在約2ppm時發(fā)揮足夠的效力。關于氟的效力，已澄清了以下兩點(1)促進補充礦質(zhì)；和(2)氟摻入羥磷灰石晶體，接著羥磷灰石晶體轉(zhuǎn)化成抗脫礦質(zhì)的堅硬的晶體結(jié)構(使用氟是期望效果(2)而不是(1))。最近，具有這種特性的氟已加入各種口腔組合物中。例如，日本公開出版物11-130643號公開了一種含有碳酸鈣和可溶性氟化物的口腔組合物。已知氟化物離子和糖醇的結(jié)合增強氟補充牙齒礦質(zhì)的能力(例如，日本公開出版物11-21217號，日本公開出版物2000-72638號，和日本公開出版物2000-154127號)。日本公開出版物8-12541號公開了一種含有變異酶(mutanase)和氟化物的組合物，它增強牙質(zhì)并促進補充礦質(zhì)而有效地防止齲齒。
本領域已知磷酸鈣的供給促進牙齒補充礦質(zhì)(例如，日本公開出版物11-228369號和日本公開出版物10-310513號)。
日本公開出版物11-29454號公開了一種含有碳酸鈣和藻酸鹽的口腔組合物。該組合物增強碳酸鈣附著和保留在牙齒上的能力，因此獲得令人滿意的pH的中和及促進礦質(zhì)的補充，產(chǎn)生極好的預防齲齒的效果。
日本公開出版物8-104696號描述了其中公開的磷酸化寡糖抑制鈣和磷的沉淀和結(jié)晶(即鈣化作用)，磷酸化寡糖不是引起齲齒的變異鏈球菌的營養(yǎng)物，因此不產(chǎn)生不溶于水的葡聚糖，并且磷酸化寡糖具有緩沖能力并具有防止pH下降的作用。上文描述的特性防止齲齒和齒斑的發(fā)生以及由變異鏈球菌引起的酸發(fā)酵。它還公開了包含于一種膳食組合物或口腔組合物中的磷酸化寡糖具有防止由于乳酸造成的pH下降的作用，乳酸是齒斑內(nèi)發(fā)酵的產(chǎn)物，而對香味沒有影響。然而，日本公開出版物8-104696號沒有提示上述磷酸化寡糖能夠如本文所描述的在低濃度時具有補充礦質(zhì)的作用。
本

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及具有抗齲齒功能的物質(zhì)。具體地說，本發(fā)明的目的是提供膳食組合物和口腔組合物，這些組合物通過牙齒補充礦質(zhì)等減少齲齒的發(fā)生。
發(fā)明者通過使用各種物質(zhì)精密地研究了預防齲齒的技術。結(jié)果，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了一種對牙齒具有補充礦質(zhì)作用的緩沖劑，并完成了本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，一種膳食組合物具有抗齲齒功能。該組合物包含一種在口腔內(nèi)具有pH緩沖作用的緩沖劑。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑選自磷酸化寡糖或其糖醇，其中中磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或者由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接；硫酸軟骨素；硫酸軟骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇。該磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或者是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是以堿性金屬鹽、堿土金屬鹽和鐵鹽的形式存在。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是以鈉鹽或鈣鹽的形式存在。
在本發(fā)明的一個實施例中，該膳食組合物進一步包含有效量的氟或含有抗齲齒的物質(zhì)的氟。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，一種膳食組合物具有抗齲齒的功能。該組合物包括一種在口腔中具有pH緩沖作用的緩沖劑，一種磷-鈣補償劑，一種磷制劑，和/或一種鈣制劑。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑選自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或者由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接；硫酸軟骨素；硫酸軟骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇。該磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或者是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是以堿性金屬鹽、堿土金屬鹽和鐵鹽的形式存在。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是以鈉鹽或鈣鹽的形式存在。
在本發(fā)明的一個實施例中，該膳食組合物進一步包含有效量的氟或含有抗齲齒的物質(zhì)的氟。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，一種口腔組合物具有抗齲齒的功能。該組合物包含在口腔中具有pH緩沖作用的緩沖劑。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑選自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或者由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接；硫酸軟骨素；硫酸軟骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇。該磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或者是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是以堿性金屬鹽、堿土金屬鹽，鋅鹽和鐵鹽的形式存在。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是以鈉鹽、鈣鹽或鋅鹽的形式存在。
在本發(fā)明的一個實施例中，該口腔組合物進一步包含有效量的氟或含有抗齲齒的物質(zhì)的氟。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，一種口腔組合物具有抗齲齒的功能。該組合物包含一種在口腔中具有pH緩沖作用的緩沖劑，一種磷-鈣補償劑，一種磷制劑，和/或一種鈣制劑。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑選自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或者由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接；硫酸軟骨素；硫酸軟骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇。該磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或者是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是以堿性金屬鹽、堿土金屬鹽，鋅鹽或鐵鹽的形式存在。
在本發(fā)明的一個實施例中，該緩沖劑是以鈉鹽、鈣鹽或鋅鹽的形式存在。
在本發(fā)明的一個實施例中，該口腔組合物進一步包含有效量的氟或含有抗齲齒的物質(zhì)的氟。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，一種用于研究預期對牙齒具有抗齲齒作用的樣品的補充礦質(zhì)效果的方法，該方法包括步驟(A)在有樣品的情況下，使含有磷、鈣和牙齒成分的溶液進行鈣沉淀反應；(B)沉淀反應后，測定溶液中鈣的濃度或沉淀的鈣的數(shù)量；(C)使不含有樣品的溶液進行鈣沉淀反應；(D)沉淀反應后，測定溶液中鈣的濃度或沉淀的鈣的數(shù)量；和(E)比較在步驟(B)和(D)中溶液中鈣的濃度或沉淀的鈣的數(shù)量。
在本發(fā)明的一個實施例中，該溶液含有羥磷灰石、緩沖液、KH2PO4和CaCl2。
附圖簡述

圖1是顯示使用牛的牙齒切片在補充礦質(zhì)的試驗系統(tǒng)中由于齲齒導致礦物質(zhì)流失值的圖。
圖2是顯示使用牛的牙切片在補充礦質(zhì)的試驗系統(tǒng)中損傷深度的圖。
圖3是顯示在實施例4中一個簡單的試驗系統(tǒng)中使用磷酸化寡糖鈉鹽補充礦質(zhì)的結(jié)果的圖。
圖4是顯示在實施例4中一個簡單的試驗系統(tǒng)中使用磷酸化寡糖鈣鹽補充礦質(zhì)的結(jié)果的圖。
圖5是顯示當P/Ca為0.6時，磷酸化寡糖對補充礦質(zhì)的影響的圖。
圖6A是顯示在沒有磷酸化寡糖的情況下，P/Ca濃度比的變化對補充礦質(zhì)的影響的圖。圖6B是顯示在有磷酸化寡糖鈉鹽的情況下，P/Ca濃度比的變化對補充礦質(zhì)的影響的圖。圖6C是顯示在有磷酸化寡糖鈣鹽的情況下，P/Ca濃度比的變化對補充礦質(zhì)的影響的圖。
圖7A是顯示在實施例5中磷酸化寡糖鈣鹽和磷酸化寡糖鈉鹽補充礦質(zhì)的作用的圖。圖7B是顯示木糖醇和木糖補充礦質(zhì)作用的圖。圖7C是顯示palatinit和異蔗糖(palatinose)的補充礦質(zhì)作用的圖。
圖8是顯示實施例7中TLC分析結(jié)果的照片。
圖9是顯示實施例7中磷酸化寡糖和氟對補充礦質(zhì)的協(xié)同作用的圖。
圖10是顯示實施例8中具有標準溶液濃度的磷酸化寡糖的TLC分析結(jié)果的照片。
圖11是顯示TLC分析結(jié)果的照片，該結(jié)果說明在實施例8中當食用含有口香糖的磷酸化寡糖時，隨時間洗提的量。
圖12是顯示實施例12中各種物質(zhì)的補充礦質(zhì)的效果的圖。
圖13是顯示實施例13中各種物質(zhì)的補充礦質(zhì)的效果的圖。
圖14是顯示實施例14中一個人工口服裝置中的pH變化的圖。
圖15是顯示實施例16中當咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖時唾液的量的圖。
圖16是顯示實施例16中當咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖時唾液的pH的圖。
圖17是顯示實施例16中當咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖時唾液的P含量的圖。
圖18是顯示實施例16中當咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖時唾液的Ca含量的圖。
圖19是顯示實施例16中當咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖時Ca/P比的變化的圖。
圖20A是顯示實施例16中在每一個處理的牙齒中損傷深度的圖。圖20B是顯示實施例16中在每一個處理的牙齒中礦物質(zhì)流失值的圖。
圖21是顯示實施例17中補充礦質(zhì)比率的圖。
圖22是顯示實施例18中當食用含有POs Ca的糖果時分泌的唾液的pH的圖。
圖23是顯示實施例18中當食用含有POs Ca的冰糖時分泌的唾液的量的圖。
圖24是顯示實施例18中當食用含有POs Ca的糖果時分泌的唾液的Ca和P含量的圖。
圖25是顯示利用含有POs Ca的糖果和含有POs Ca的軟糖補充礦質(zhì)的試驗結(jié)果的圖。
圖26是顯示有代表性的磷酸化寡糖的化學結(jié)構式的圖。
實施本發(fā)明的最佳模式下文中將更詳細地描述本發(fā)明。
本文使用的術語“抗齲齒功能”是指預防齲齒和治療齲齒的功能。治療齲齒的功能是指修復曾經(jīng)由于齲齒而損失的牙齒的部分的功能。本文使用的術語“抗齲齒功能”是指一個或多個如下特性(1)防止由于口腔細菌產(chǎn)生的酸造成的pH下降的pH緩沖能力；(2)防止口腔細菌產(chǎn)生不可溶的葡聚糖的能力；和(3)在齲齒的早期促進牙齒補充礦質(zhì)的能力。較佳地，該抗齲齒功能具有兩個上述特性，最佳地具有全部的上述特性。
本發(fā)明的組合物可穩(wěn)定地對腐蝕的牙齒提供磷酸鹽和鈣。提供了磷酸鹽和鈣的牙齒被補充礦質(zhì)，因此由于齲齒損失的牙齒部分可被修復。
根據(jù)本發(fā)明，一種緩沖劑加入到口腔中，因此在牙齒補充礦質(zhì)中穩(wěn)定地使用存在于口腔的唾液等中的磷酸鹽和鈣。因此，可以實現(xiàn)常規(guī)認為很難或不可能的牙齒的修復。
如果在適當?shù)臈l件下，將鈣或磷酸鹽提供給脫礦質(zhì)的釉質(zhì)部分(補充礦質(zhì))，可修復脫礦質(zhì)損傷達到完好狀態(tài)。為了保持牙齒的完好狀態(tài)，需要通過唾液提供礦物質(zhì)給脫礦質(zhì)的損傷，以便在微觀水平上平衡脫礦質(zhì)和補充礦質(zhì)。通常，在吃或喝東西后齒斑中的pH往往降低，脫礦質(zhì)和補充礦質(zhì)之間的平衡被改變。當脫礦質(zhì)＞補充礦質(zhì)時，損傷發(fā)生。相反，當補充礦質(zhì)＞脫礦質(zhì)時，由于牙齒的補充礦質(zhì)，脫礦質(zhì)的損傷被修復。脫礦質(zhì)和補充礦質(zhì)之間的平衡很大程度上取決于口腔環(huán)境(具體地說，唾液和齒斑中的pH，鈣和磷酸鹽的濃度)。本發(fā)明提供一種補充礦質(zhì)似乎可以發(fā)生的口腔環(huán)境，從而預防齲齒和治療脫礦質(zhì)損傷(齲齒的早期階段)以獲得健康而堅固的牙齒。
本文使用的術語“緩沖劑”是指在口腔中顯示pH緩沖作用的試劑。具體地說，該緩沖劑是一種從例如緩沖劑的陰離子和陽離子獲得的水溶性鹽。口腔中緩沖劑的存在可穩(wěn)定口腔中的pH。該緩沖劑穩(wěn)定唾液中的磷酸鹽離子和鈣離子。因此，具體地說，優(yōu)選一種在有磷酸鹽離子和鈣離子的情況下具有良好的pH緩沖作用的試劑。更優(yōu)選地，當緩沖劑添加到含有磷酸鹽離子和鈣離子的水溶液中，磷酸鹽離子和鈣離子的穩(wěn)定性不被緩沖劑所抑制。換句話說，似乎可與磷酸鹽離子和鈣離子起反應并形成沉淀的緩沖劑是不可取的。
此外，在本發(fā)明中，較佳地在齒斑中獲得pH緩沖效果。如果在唾液中顯示pH緩沖作用，那么pH的緩沖作用典型地顯示于齒斑中。因此，在唾液中顯示pH緩沖作用的緩沖劑可用于顯示齒斑中的pH緩沖作用。一個氫離子敏感場效應晶體管電極(PH-6010由Nihon Kohden公司生產(chǎn))可放置在一個釉質(zhì)切片上并摻入下頜的部分托牙的牙齒間隙部分。此后，在電極敏感部分上形成的齒斑中的pH可根據(jù)YoshizumiTamasawa等(日本牙齒修復協(xié)會學報Journal of the Japan Prosthodontic Society，40卷特刊，147頁，1996)，Kazuhiko Abe(DENTAL OUTLOOK，90(3)，650-654，1997)，Takahashi-Abbe，S等(Oral Microbiol.Immunol.，16，94-99頁，2001)中描述的方法測定。齒斑中的pH較佳是6或更多，更佳是7或更多。當由于緩沖作用引起齒斑中的pH恢復到中性時，存在于口腔唾液中的磷酸鹽離子和鈣離子供應給牙齒表面，導致牙質(zhì)補充礦質(zhì)。齒斑中pH的上限沒有具體限制，但是對于一個實際的生物體不想要一個高的堿性條件。齒斑中的pH較佳是10或更少，更佳是8或更少。
緩沖劑典型地以鹽的形式使用，可任選地以游離酸的形式使用。即使緩沖劑在口腔中以游離酸的形式給予，由于可與游離酸一起形成鹽的堿性金屬等存在于口腔中，基本上可以說游離酸的鹽提供給口腔。
可用于本發(fā)明的較佳的緩沖劑可通過簡單的試驗容易地選擇。具體地說，各種已知的pH緩沖劑加入含有磷酸鹽離子和鈣離子的中性水溶液中(例如pH 6-8的水溶液)。觀察沉淀的出現(xiàn)或不出現(xiàn)。在這種試驗中沒有形成沉淀的pH緩沖劑可滿意地用作加入到本發(fā)明抗齲齒組合物中的緩沖劑。
當緩沖劑不存在時，由于口腔細菌產(chǎn)生的有機酸的作用口腔可被酸性化(即唾液或齒斑變?yōu)樗嵝?。當唾液或齒斑被酸性化時，牙齒的鈣和磷作為Ca和P離子被洗脫，引起齲齒的發(fā)生。在這種情況下，如果緩沖劑存在，口腔中唾液和齒斑的pH穩(wěn)定在中性pH左右，由此齲齒的形成似乎不會發(fā)生。
通常唾液的pH在中性左右。因此，在中性左右的pH具有良好的緩沖作用的緩沖劑是優(yōu)選的。
較佳地，該緩沖劑是一種不與唾液中的磷酸鹽反應而形成沉淀的試劑。
較佳地，該緩沖劑是一種不與唾液中的鈣反應而形成沉淀的試劑。
較佳地，該緩沖劑是一種酸性官能團。
較佳地，該緩沖劑具有任何一種磷酸基、羧基、和硫酸基。
較佳地，該緩沖劑在其分子中具有三個或更少的酸性官能團，更佳地兩個或更少的酸性官能團。當分子中存在過量的酸性官能團時，其向羥磷灰石供給磷和鈣的能力似乎減少。例如，在它們的分子中具有一個或兩個磷酸基的磷酸化寡糖具有改良的齲齒治療的功能，超過在其分子中具有6個磷酸基的植酸的功能。因此，優(yōu)選使用緩沖劑而不是例如植酸的一種物質(zhì)。
具有極好的向羥磷灰石提供磷和鈣的能力的緩沖劑是優(yōu)選的。緩沖劑向羥磷灰石提供提供磷和鈣的能力可通過如下述的簡單的補充礦質(zhì)的試驗系統(tǒng)方法方便地測定。
緩沖劑的例子包括磷酸化寡糖及其糖醇。本文使用的術語“磷酸化寡糖”是指在其分子中具有至少一個磷酸基團的寡糖，較佳地三個或更少的磷酸基團，更佳地兩個或更少的磷酸基團。本文使用的術語“中性寡糖”是指沒有磷酸基團與其連接的寡糖。例如，該磷酸化寡糖可以是由α-1，4鍵連接的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接。另外，磷酸化寡糖可以是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接。緩沖劑的例子包括，但不限于酸性糖類及其糖醇(例如，寡半乳糖醛酸、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素寡糖、葡萄糖-6-磷酸)，有機酸(例如酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、延胡索酸、和馬來酸)、核酸(例如各種核苷或核苷酸的磷酸酯)、氨基酸，和上述磷酸化寡糖的糖醇。
上述緩沖劑可以是鹽的形式，例如金屬鹽，以使緩沖劑有效。用于形成這種金屬鹽的金屬的例子包括堿性金屬、堿土金屬、鋅、鐵、鉻和鉛。例如，包括鉀、鈉、鈣和鎂。作為包含于本發(fā)明的膳食組合物的緩沖劑的金屬鹽，鈣鹽和鈉鹽是優(yōu)選的。作為包含于本發(fā)明的口腔組合物的緩沖劑的金屬鹽，鈣鹽、鈉鹽和鋅鹽是優(yōu)選的。雖然，鋅鹽不用于食物和飲料，但已知鋅鹽具有預防口臭和治療牙周病的作用。因此，作為口腔組合物包含的金屬鹽鋅鹽是優(yōu)選的。此外，緩沖劑可以是銨鹽或季銨鹽的形式。
硫酸軟骨素典一般每兩個糖之間含有一個硫酸基團。硫酸基團連接于硫酸軟骨素A中N-乙酰-D-半乳糖胺的4-位，和硫酸軟骨素C中N-乙酰-D-半乳糖胺的6-位。硫酸軟骨素B(普遍地稱為硫酸皮膚素)具有N-乙酰-D-半乳糖胺-4-硫酸和L-艾杜糖醛酸的雙糖單元的重復結(jié)構。硫酸軟骨素可被軟骨素酶降解成為在非還原末端具有未飽和的己糖醛酸的寡糖的雙糖。例如，硫酸軟骨素可通過軟骨素酶ABC(衍生自普通變形菌)、軟骨素酶ACI(衍生自肝素黃桿菌)、或軟骨素酶ACII(衍生自金黃節(jié)桿菌)(后兩種酶不對硫酸皮膚素起作用)降解成為在它們的還原末端具有己糖胺的不飽和雙糖。硫酸軟骨素，和通過用這種酶降解硫酸軟骨素獲得的不飽和寡糖(較佳地雙糖和四糖)具有補充礦質(zhì)的作用。
寡半乳糖醛酸是一種聚合的半乳糖醛酸的寡糖，該寡糖已知為果膠的組成糖。寡半乳糖醛酸較佳地包含2個或更多的糖，更佳地3個或更多，甚至更佳地4個或更多，并且較佳地10個或更少，更佳地8個或更少，甚至更佳地6個或更少。
本文使用的術語“糖醇”是指其還原末端被還原的糖。例如，磷酸化寡糖的糖醇可通過向磷酸化寡糖的還原末端加入氫產(chǎn)生。氫的加入可使用本領域熟練的技術人員已知的任何方法進行。例如，可通過制備pH 8的1N氫氧化鈉水溶液的弱堿溶液，向100ml的該弱堿溶液中加入30ml的3％氫氧化硼鈉溶液，并使該混合物在40℃放置1小時還原寡糖?？赏ㄟ^使用本領域熟練的技術人員已知的鎳催化劑的典型方法工業(yè)生產(chǎn)糖醇。
由于緩沖劑包含于本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物中，優(yōu)選的磷酸化寡糖是由通過α-1，4鍵偶聯(lián)的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或磷酸化寡糖是由通過α-1，4鍵偶聯(lián)的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接。
這種磷酸化寡糖可從通常的天然植物淀粉制備，較佳地從具有許多磷酸基團的淀粉中制備。用于生產(chǎn)磷酸化寡糖的淀粉的起始植物的例子包括土豆、甘薯、木薯、玉米、小麥、水稻、糯米、糯玉米、糯小麥、糯土豆、野葛、山藥、百合、和栗子。在這些物質(zhì)中，地下莖、水稻、小麥等含有許多連接的磷酸基團，且是適合用于制備磷酸化寡糖的材料。例如，在馬鈴薯淀粉中，磷酸基團相對通常地通過酯鍵與葡萄糖的3-位或6-位結(jié)合作為淀粉的一個組分。磷酸基團主要存在于支鏈淀粉中。當?shù)矸塾糜谏a(chǎn)磷酸化寡糖時，也可優(yōu)選使用化學修飾的淀粉?；瘜W修飾的淀粉通過連接磷與如上所述的天然淀粉獲得。例如，取自玉米、糯玉米等的淀粉與磷化學偶聯(lián)以制備磷酸化寡糖。
上述包含于本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物中的磷酸化寡糖可如下生產(chǎn)。
為了酶解淀粉等，使至少一種選自淀粉分解酶例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡糖淀粉酶(CE 3.2.1.3)、異淀粉酶(EC 3.2.1.68)、支鏈淀粉酶(EC 3.2.1.41)、和新支鏈淀粉酶(Kuriki等，Journal of Bacteriology，170卷，1554-1559頁，1988)；和糖基轉(zhuǎn)移酶例如環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.19；下文中稱為CGTase)對淀粉起作用。另外，至少一種上述的酶與α-葡糖苷酶結(jié)合使用。
不具有支鏈結(jié)構的磷酸化糖類可通過用異淀粉酶和支鏈淀粉酶切割淀粉中的α-1，6支鏈結(jié)構降解淀粉獲得。如果不使用異淀粉酶和支鏈淀粉酶，可獲得具有α-1，6支鏈結(jié)構的磷酸化糖類。通過用葡糖淀粉酶降解磷酸化糖類，與磷酸化糖類的非還原末端連接的非磷酸化葡萄糖可成功地釋放。用這種酶處理，每單位分子量的純化磷酸化糖類的磷酸基團的數(shù)量可增加或減少。
由大多數(shù)種類的酶的降解可通過使酶與淀粉反應同時進行。簡言之，淀粉作為原料溶解于水或具有調(diào)節(jié)的pH的緩沖液中使酶可作用于淀粉。液化的α-淀粉酶、支鏈淀粉酶、葡糖淀粉酶等同時加入反應溶液中，并使得到的溶液在加熱時反應。用這種方法，當?shù)矸郾荒z化時，可釋放中性的糖類，可釋放與磷酸化糖類的非還原末端結(jié)合的非磷酸化葡萄糖，或可切割從磷酸化糖類結(jié)構材料中的衍生的α-1，6支鏈結(jié)構。這種方法使通過一步反應獲得具有增加的磷酸含量的磷酸化糖類成為可能，而不是兩步反應。
在通過使大多數(shù)種類的酶在各個步驟中分別作用于淀粉進行包括兩步或更多步驟的酶反應的情況下，應用酶的次序不限于具體的順序。然而，如果淀粉的濃度高，較佳地淀粉首先用包括液化的淀粉酶的酶處理。如果使異淀粉酶或支鏈淀粉酶作用于淀粉，直鏈淀粉含量增加。直鏈淀粉與支鏈淀粉相比可能老化和沉淀，因此淀粉老化并沉淀。從而，其它的酶不再作用于淀粉。
對于所使用的淀粉降解酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、α-葡糖苷酶的起源沒有具體的限制。例如，α-淀粉酶較佳地是衍生自芽孢桿菌屬的細菌或曲霉屬的淀粉降解酶制劑。酶的反應條件是酶可行使功能的任何溫度和pH。例如，優(yōu)選使用的溫度在25℃到70℃的范圍內(nèi)，pH在4到8的范圍內(nèi)。
首先，作為原料的淀粉溶解于水或具有調(diào)節(jié)的pH的緩沖溶液中，這樣酶可作用于淀粉。液化的α-淀粉酶加入獲得的溶液中，并使之在加熱時反應，借此當被凝膠化時淀粉液化。此后，液化的淀粉在20-80℃的溫度保持適當?shù)囊欢螘r間。只要它可以液化淀粉可使用任何量的液化的α-淀粉酶。較佳的液化α-淀粉酶的量為20-50,000U。只要淀粉液化到在隨后的步驟過程中淀粉不老化的程度，該保持時間沒有限制。較佳地，在20-80℃保持時間為30分鐘。
在液化完成后，不特別需要酶的滅活，但酶可通過通常使用的方法滅活，即在100℃保持10分鐘。此外，可用通常使用的方法例如離心或膜過濾分離和除去不溶解的物質(zhì)。此后，磷酸化的糖類可被分餾。當需要具有增加的磷酸含量的磷酸化糖類時，進行下述的另外的步驟。
簡言之，原料被液化后，葡糖淀粉酶、異淀粉酶、支鏈淀粉酶、和α-葡糖苷酶同時或以適當?shù)拇涡蚣尤胍夯脑弦允乖咸腔＠缡固腔脑显?0-60℃的溫度反應30分鐘到40小時，借此中性的糖和與磷酸化糖類的非還原末端連接的非磷酸化葡萄糖可從原料中釋放，并且衍生自原料的磷酸化糖類結(jié)構中的α-1，6支鏈結(jié)構可被切割。當葡糖淀粉酶、異淀粉酶、和支鏈淀粉酶結(jié)合使用時，該結(jié)合及添加的次序沒有限制。添加的酶的量以及保持的時間可取決于所需的磷酸化糖類的磷酸含量而確定。較佳地，可加入葡糖淀粉酶500-700U，異淀粉酶2-100U，支鏈淀粉酶2-100U，和α-葡糖苷酶50-700U。較佳地可使用固定化酶。
與各個酶的反應完成后，不特別需要酶的滅活，但可用通常使用的方法滅活酶，即在100℃保持10分鐘。此外，用通常使用的方法例如離心或膜過濾分離和除去不溶的物質(zhì)。
為了從含有磷酸化寡糖的糖類混合物中純化磷酸化寡糖，因為不象中性糖類磷酸化糖類是離子物質(zhì)，所以可使用陰離子交換樹脂。對于樹脂的類型沒有具體的限制。樹脂較佳的例子包括Chitopearl BCW 2500型(由Fuji Spinning Co.，Ltd.生產(chǎn))，Anberlite IRA型(由Japan Organo Co.，Ltd生產(chǎn))，DEAE-纖維素(由Whatman生產(chǎn))，DEAE-Sephadex和QAE-Sephadex(由Pharmacia生產(chǎn))，和QAE-CELLULOSE(由BioRad生產(chǎn))。通過使用其pH適當調(diào)節(jié)的緩沖液平衡樹脂。例如，優(yōu)先使用約10-50mM乙酸鹽緩沖液。平衡的樹脂裝入柱，并裝入含有磷酸化寡糖的糖混合物。通過洗滌除去中性糖類，然后吸收到柱上的磷酸化寡糖用堿性溶液或鹽溶液洗提。
在使用增加了離子強度的洗提液洗提磷酸化寡糖的情況下，對所使用的鹽的種類沒有具體限制。鹽的較佳的例子包括氯化鈉、碳酸氫銨、氯化鉀、硫酸鈉和硫酸銨。
在使用pH改變?yōu)閴A性的洗提液洗提磷酸化寡糖的情況下，對于使用的堿性試劑的種類沒有具體限制。例如，可使用銨、碳酸鈉或氫氧化鈉。然而，在強堿條件下，磷酸基團從糖中釋放或糖的還原末端被氧化。因此，磷酸化寡糖較佳地在弱酸到弱堿的pH范圍內(nèi)洗提，更佳地pH范圍為3-8。
在上述情況下，通過使用逐漸或以分步形式增加洗提液的鹽濃度或pH洗提磷酸化糖，磷酸化糖可依賴于與一個磷酸化糖分子結(jié)合的磷酸基團的數(shù)量進行分餾。
活性炭也可用來代替陰離子交換樹脂以從含有磷酸化寡糖的糖混合物中純化磷酸化寡糖。對于使用的活性炭的種類沒有具體限制，但較佳地使用能夠裝入柱的顆粒狀活性炭。使用緩沖液、酸、堿、鹽溶液和蒸餾水制備活性炭，這樣獲得吸附除葡萄糖外的中性糖類的能力。例如，較佳地可使用已裝入柱并用蒸餾水洗滌的具有一致粒徑的脫氣的活性炭。通過將樣品加到柱上并使中性糖類吸附到柱上，磷酸化寡糖可作為通過的部分獲得。
另外，通過加入具有1-3個碳原子的醇沉淀磷酸化寡糖，以從含有磷酸化寡糖的糖混合物中純化磷酸化寡糖。簡言之，向樣品溶液中加入醇僅僅使磷酸化寡糖沉淀。期望的是，如果樣品溶液具有10％或更大的糖濃度，向一份體積的樣品溶液中加入3份或更多體積的醇。
在金屬鹽、較佳地是鈣鹽或鐵鹽加上醇存在的條件下，磷酸化寡糖形成磷酸化糖金屬鹽并可能沉淀。由于這個原因，在有金屬鹽的情況下，使用即使少量的醇與僅使用醇的情況比較，磷酸化寡糖更易回收。較佳地，在堿性條件下磷酸化寡糖沉淀。對使用的鹽的種類沒有具體的限制。例如，較佳地可使用氯化鈣、氯化鎂、或氯化亞鐵，因為它們具有良好的溶解性。通過加入醇產(chǎn)生的沉淀的收集來用通常使用的方法進行，例如傾析、過濾和離心。
磷酸化寡糖可通過從磷酸化寡糖金屬鹽中除去金屬鹽產(chǎn)生，該磷酸化寡糖金屬鹽通過加入金屬鹽沉淀?？赏ㄟ^通常使用的方法進行金屬鹽的去除(脫鹽)。脫鹽可使用例如臺式脫鹽microacilyzer G3(由Asahi Chemical Industry Co.Ltd生產(chǎn))容易地進行。
得到的磷酸化糖溶液、磷酸化糖或磷酸化糖衍生物可使用通常所用的干燥方法，例如熱空氣干燥、流化床干燥和真空干燥等濃縮或研粉。如果需要，通過除去醇可獲得可用于膳食或口服應用的磷酸化糖。
在馬鈴薯淀粉中，磷酸基團相對通常地以酯鍵與葡萄糖的3-位或6-位連接作為淀粉的一個組分。因此，使用各種淀粉酶從馬鈴薯淀粉中制得的磷酸化寡糖可能是其磷酸基團主要與葡萄糖的3-位或6-位結(jié)合的寡糖。例如，如果磷酸基團結(jié)合于通過使葡糖淀粉酶作用于馬鈴薯淀粉獲得的磷酸化寡糖中的葡萄糖的6-位，該淀粉可在其6-位具有磷酸基團的葡萄糖前(在非還原末端一側(cè))立刻被切割。因此，磷酸化寡糖是具有葡萄糖的寡糖，該葡萄糖的6-位在非還原末端與磷酸基團結(jié)合或者該葡萄糖具有一種結(jié)構，該結(jié)構中從非還原末端開始至少第二個葡萄糖其6-位與磷酸基團結(jié)合。如果磷酸基團與磷酸化寡糖中葡萄糖的3-位結(jié)合，從非還原末端開始的第二個葡萄糖的3-位與磷酸基團結(jié)合。圖26中顯示了通過使用各種淀粉酶水解馬鈴薯淀粉獲得的磷酸化寡糖的代表性的例子。當然，具有上述結(jié)構的磷酸化寡糖不限于經(jīng)各種淀粉酶水解馬鈴薯淀粉生產(chǎn)的寡糖。具有相似結(jié)構的磷酸化寡糖具有相似的抗齲齒功能。
本文使用的術語“磷酸化寡糖的糖醇”是指通過還原磷酸化寡糖的還原末端獲得的化合物。上述磷酸化寡糖的糖醇可通過向磷酸化寡糖的還原末端加入氫生產(chǎn)。可使用本領域熟練的技術人員已知的任何方法進行氫的加入。例如，可通過制備pH 8的1N氫氧化鈉水溶液的弱堿溶液，加入30ml的3％氫氧化硼鈉溶液，并使混合物在40℃放置1小時還原寡糖?？赏ㄟ^使用本領域熟練的技術人員已知的鎳催化劑的典型的方法工業(yè)生產(chǎn)糖醇。
上述磷酸化寡糖或其糖醇可以是鹽的形式，例如金屬鹽。用于形成這種金屬鹽的金屬的例子包括堿性金屬、堿土金屬、鋅、鐵、鉻和鉛。例如，包括鉀、鈉、鈣和鎂。作為包含于本發(fā)明的膳食組合物中的磷酸化寡糖的金屬鹽，鈣鹽和鈉鹽是優(yōu)選的。作為包含于本發(fā)明的口腔組合物中的磷酸化寡糖的金屬鹽，鈣鹽、鈉鹽和鋅鹽是優(yōu)選的。雖然，鋅鹽不用于食物和飲料，但已知鋅鹽具有預防口臭和治療牙周病的作用。因此，作為口腔組合物包含的金屬鹽鋅鹽是優(yōu)選的。此外，磷酸化寡糖可以是銨鹽或季銨鹽的形式。
這種金屬鹽可如下進行生產(chǎn)。磷酸化寡糖和金屬鹽的化合物磷酸化寡糖鹽可通過如上述的醇沉淀進行沉淀。如果需要，回收的沉淀可再溶解于水或適當?shù)娜芤褐?，隨后加入醇?？芍貜瓦@一操作。使用這一操作，可除去如中性糖和過量的鹽等雜質(zhì)?？墒褂贸瑸V膜除去如鹽等雜質(zhì)。
已知上述磷酸化寡糖具有如下特性(1)不被齲齒致病菌所利用(即變異鏈球菌和表兄鏈球菌)；(2)抑制由于通過這些細菌以濃度依賴性的形式利用蔗糖產(chǎn)生的pH中的還原；和(3)這種抑制依賴于磷酸化寡糖的緩沖能力(見日本公開出版物8-104696號)。根據(jù)本發(fā)明，進一步發(fā)現(xiàn)鹽形式的磷酸化寡糖及其糖醇具有在非常低的濃度促進牙齒補充礦質(zhì)的作用。通過利用磷酸化寡糖的這種特性，可獲得具有抗齲齒功能的膳食組合物和口腔組合物。具體地說，在低濃度充足地獲得補充礦質(zhì)作用的事實對于加入到食物中是非常有利的。
本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物含有一定量的緩沖劑，這樣緩沖劑在口腔中有效地顯示抗齲齒的功能。例如，就磷酸化寡糖鈉鹽來說，其量可以在口腔中鹽的濃度是0.01-20％，較佳是0.03-1％。例如，就磷酸化寡糖鈣鹽來說，其量可以在口腔中鹽的濃度是0.01-20％，較佳是0.03-1％。例如，就磷酸化寡糖鋅鹽來說，其量可以在口腔中鹽的濃度是0.01-20％，較佳是0.03-1％。對于所有的磷酸化寡糖鈉鹽、磷酸化寡糖鈣鹽、和磷酸化寡糖鋅鹽，最佳地，它們在口腔中的濃度為約0.2％，其中口腔中無機鈣和磷的濃度為約1.5mM和0.9mM。
通過考慮在口腔中本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物的保留時間確定這些添加劑的量。對于需要咀嚼行為的膳食組合物將給出一種意向。例如，就含有約20％磷酸化寡糖的口香糖來說，磷酸化寡糖從膳食組合物中洗提，并且咀嚼后相對高濃度(約1％到約5％)的磷酸化寡糖可存在約10分鐘。約20分鐘到30分鐘后，只有0.25％或更少的磷酸化寡糖存在于口腔中。因此，口腔中磷酸化寡糖的濃度被稀釋為食物中濃度的1/4或更少。因此，就這種食物來說，緩沖劑可以預期在口腔中的四倍或少一些的濃度加入食物中(例如，一到四倍)。另一方面，關于不需要咀嚼行為的組合物(例如飲料)，在口腔中的保留時間在1分鐘以內(nèi)。這種組合物在口腔中沒有充分地稀釋。因此，磷酸化寡糖以基本上等于口腔中期望濃度(例如，0.1％到5％)摻入組合物。本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物可含有單獨的或結(jié)合的上述的緩沖劑，這樣可在口腔中保留上述的劑量。
另一方面，本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物進一步含有任何一種磷-鈣補償劑、磷制劑和鈣制劑、或另外除上述緩沖劑外一種或多種的組合。具體地說，當組合物包含鈣鹽時，過量的鈣從鈣鹽中釋放，以致組合物中鈣磷比發(fā)生變化。而且，加入的緩沖劑可對從牙齒中洗提鈣有影響。在這種情況下，如果通過緩沖劑改變的口腔唾液中磷鈣濃度的比被補償，牙齒補充礦質(zhì)可更加有效。對于正常人，唾液中鈣磷的摩爾比(下文中稱為“Ca/P”)通常為0.25-0.67(P/Ca＝1.45-3.9)，因此，存在的磷比鈣多(即，差不多3摩爾磷比2摩爾鈣到3.9摩爾磷比1摩爾鈣)。牙齒的組分羥磷灰石(表示為Ca10(PO4)6(OH)2))具有1.67的Ca/P比(P/Ca＝0.6)。組成牙齒釉質(zhì)的成分具有1.0-1.67的Ca/P比(P/Ca＝0.6-1.0)。因此，通過和緩沖劑一起提供磷和/或鈣使Ca/P接近1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)，較佳地1.67((P/Ca＝0.6)，它可能促進這些物質(zhì)結(jié)晶進入羥磷灰石。
可補償Ca/P的試劑這里稱為“磷-鈣補償劑”。這種磷-鈣補償劑的例子包括一價的磷酸鈣(Ca(H2PO4)2·H2O)、二價的磷酸鈣(CaHPO4·2H2O)、三價的磷酸鈣、焦磷酸鈣、羥磷灰石粉、無定形磷酸鈣、牛骨鈣、蛋殼鈣、珊瑚鈣、珍珠鈣、魚和貝類的鈣、以及三價的α-磷酸鈣。本文中補償Ca/P是指保持Ca/P基本上約在1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)的范圍內(nèi)。在這種情況下，Ca/P不需要嚴格地限制在1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)。只要Ca/P可基本上接近約1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)，Ca/P可下降至1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)的范圍之外。補償所需的補償劑的量隨緩沖劑和補償劑的種類而變化，但是如果需要，這種量的范圍可通過本領域熟練的技術人員進行簡單的試驗確定。就磷-鈣補償劑而言，對于加入的一份緩沖劑，其適當?shù)哪柫繛?/20份至20份，較佳地1/2份到2份。
既然磷在唾液中是過量的，可使用Ca制劑調(diào)整Ca/P到1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)。在人的唾液中，磷濃度是3-3.5mM，而鈣濃度是0.9-2mM。因此，較佳地加入約4-5mM的鈣以提高鈣濃度。因此，可使用鈣鹽(緩沖劑)作為磷-鈣補償劑。就含有3％鈣的磷酸化寡糖而言，加入約0.7％磷酸化寡糖鈣是適當?shù)?。鈣制劑較佳的例子包括，但不限于碳酸鈣、氯化鈣、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣、乳清鈣、有機酸鈣、膠體碳酸鈣、酪蛋白磷肽鈣和氟化鈣。
本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物進一步含有磷制劑。本文使用的術語“磷制劑”是指磷酸鹽化合物。磷酸鹽化合物的例子包括磷酸鈉、磷酸氫鈉、磷酸鉀、和磷酸氫鉀。
上述磷-鈣補償劑、磷制劑、或鈣制劑可單獨或結(jié)合加入本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物以使Ca/P接近1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)，并較佳地為1.67(P/Ca＝0.6)。
本文使用的術語“膳食組合物”是人的食物、飼養(yǎng)動物或魚的飼料、和寵物食物的總稱。具體而言，本發(fā)明的膳食組合物包括液體和粉末飲料如咖啡、茶、綠茶、烏龍茶、果汁、加工牛奶、和運動飲料；焙烤食物例如面包、比薩餅和餡餅；焙烤甜食例如曲奇餅、脆餅、餅干和蛋糕；意大利面食如意大利式細面條和通心粉；面條例如小麥面條、蕎麥面條、和中式面條；甜品例如糖果、軟糖、口香糖、和巧克力；小吃例如爆米花和馬鈴薯片；冰凍甜食例如冰激凌和果汁牛奶凍；乳制品例如奶油、干酪、奶粉、煉乳和乳制飲料；西方不烘焙的糖果類點心例如果凍、布丁、奶油凍、和酸牛奶；日本甜食例如奶油小圓甜面包、uirou(通過向面粉中加入糖，隨后蒸煮獲得的切成方形年糕)、年糕、和ohagi(用豆醬等包裹的米團)；調(diào)味品例如醬油、蘸的調(diào)味汁、面條湯、辣醬油、原汁肉湯、燉家畜、湯、混合的調(diào)味品、咖哩粉、蛋黃醬、和番茄沙司；聽裝或殺菌袋裝食物例如咖喱、燉肉、湯和米飯；冷凍和冷藏食品例如火腿、漢堡包、肉圓、炸丸子、中國式湯團、炒飯和米團；海加工產(chǎn)品例如tikuwa(管狀魚醬)和kamaboko(魚醬餅)；和米制產(chǎn)品例如野外午餐的米飯和壽司。另外，由于本發(fā)明的膳食組合物具有使鈣易于吸收的能力，因此它包括配制的嬰兒喂養(yǎng)奶、斷乳食品、嬰兒食品、寵物食品、動物飼料、運動食品、營養(yǎng)滋補品和保健品。
在一個較佳的實施例中，食物和飲料是在食用時需要大量咀嚼的種類，例如口香糖。就被大量咀嚼的食物和飲料來說，緩沖劑容易地在口腔中擴散，產(chǎn)生抗齲齒的良好效果。就被大量咀嚼的食物和飲料來說，較佳地緩沖劑可以0.1-50％的重量比，更佳地0.5-20％的重量比，甚至更佳地0.5-10％的重量比，特別優(yōu)選地0.5-5％的重量比加入食物中。具體地，例如，這種食物是含有0.1-50％的重量比的緩沖劑的口香糖，或含有0.1-50％的重量比的緩沖劑的片狀糖食、糖果、軟糖等。
在另一個較佳的實施例中，食物和飲料是在食用時不需要咀嚼的種類，例如飲料(如果汁或淡水)。就食用時不需要咀嚼的食物或飲料來說，較佳地緩沖劑可以0.1-70％的重量比，更佳地0.1-50％的重量比，甚至更佳地0.2-5％的重量比混合到食物中。具體地說，例如，該食物是含有重量比為1-30％的緩沖劑的果汁。較佳地，該食物是含有重量比為0.1-10％的緩沖劑的蔬菜汁、天然果汁、乳制飲料、牛奶、豆奶、運動飲料、近水飲料、營養(yǎng)飲料、咖啡飲品、或可可飲料。
在另一個較佳的實施例中，食物和飲料是在食用時與平常主食咀嚼一樣多的種類。較佳地，該食物和飲料是主食和飲料。例如，這種食物是米飯。就主食來說，既然以足夠的量食用食物，即使加入少量的緩沖劑有利地提供了預防齲齒的顯著和長期的效果。就與平常主食物咀嚼一樣多的食物來說，較佳地緩沖劑可以0.01-20％的重量比，更佳地0.02-10％的重量比，甚至更佳地0.03-5％的重量比，特別優(yōu)選地0.05-3％的重量比加入食物中。具體地說，該食物是，例如含有重量比為0.02-10％的緩沖劑的米飯，含有重量比為0.01-20％磷酸化寡糖的面包等。
當然，本發(fā)明可用于除了上述較佳的實施例中所描述的那些以外的食物和飲料。具體而言，本發(fā)明可用于，例如，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的中國面條，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的小麥面條，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的年糕，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的椒鹽卷餅，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的瓊脂，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的果凍，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的酸牛奶，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的曲奇餅，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的片狀甜食，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的豆腐，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的巧克力，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的米制甜食，含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的中國湯團，和含有重量比為0.1-20％的緩沖劑的火腿。
本文使用的術語“口腔組合物”是指不同于食物和飲料的任何組合物，該組合物能引入口腔并能與牙齒接觸?？谇唤M合物可以是藥物或準藥品或其它化合物。例如，該“口腔組合物”進一步包括化妝品(更具體地說，具有預防齲齒、增白牙齒、除去齒斑、清潔口腔、預防口臭、除去焦油、預防牙垢沉積等作用的潔牙劑(它是在日本藥物法Japanese Pharmaceutical Affairs Law(2001年修訂)下承認的化妝品)。具體而言，本發(fā)明的口腔組合物包括，例如，潔牙劑、嗽口劑、糖錠、含漱液、牙齦按摩膏、錠劑、人工唾液等。
在一個較佳的實施例中，本發(fā)明的口腔組合物是較佳地含有重量比為0.01-20％、更佳地重量比為0.02-10％、甚至更佳地重量比為0.03-5％，和特別優(yōu)選地重量比為0.05-3％的緩沖劑的潔牙劑。
在一個較佳的實施例中，本發(fā)明的口腔組合物是較佳地含有重量比為0.01-20％、更佳地重量比為0.02-10％、甚至更佳地重量比為0.03-5％，和特別優(yōu)選地重量比為0.05-3％的緩沖劑的嗽口藥。
在一個較佳的實施例中，本發(fā)明的口腔組合物是較佳地含有重量比為0.01-20％、更佳地重量比為0.02-10％、甚至更佳地重量比為0.03-5％，和特別優(yōu)選地重量比為0.05-3％的緩沖劑的口腔軟膏。
優(yōu)選地，本發(fā)明的口腔組合物是含有重量比為0.01-20％的緩沖劑的潔牙劑、漱口藥、糖錠、含漱液、人工唾液等。
已使用人工唾液改善口干燥癥。該人工唾液含有與人唾液基本上相同的組分，例如礦物質(zhì)。含有上述緩沖劑的人工唾液不僅能濕潤舌和喉粘膜使舌和喉粘膜平滑移動，還能預防和治療齲齒。
本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物還任選地含有氟。本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物包含在1000ppm或更少，較佳地0.1-500ppm和更佳地0.1-300ppm的范圍內(nèi)。為了提高100ppm或更多的氟的效能，緩沖劑適用于藥物、準藥物和化妝品。本發(fā)明的膳食和口腔組合物可通過進一步含有氟而具有較高水平的牙齒補充礦質(zhì)的效果。這里，“氟”包括氟離子。術語“含氟的物質(zhì)”是指提供氟離子的任何物質(zhì)，較佳地含有氟離子的化合物(例如，單氟磷酸鈉、氟化鈉、氟化鉀、氟化銨、胺鹽氟化物、和氟化錫)。較佳地使用單氟磷酸鈉和氟化鈉。
僅使用氟或含氟的物質(zhì)導致低水平的牙齒補充礦質(zhì)。特別是，氟和含氟的物質(zhì)在100ppm或更高的濃度可能不溶解，導致效能明顯下降。然而，在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)緩沖劑與氟或含氟的物質(zhì)一起使用導致效能的提高。對于食物，含有大量氟(200-300ppm)的茶等是優(yōu)選的。氟或含氟的物質(zhì)摻入牙齒晶體以產(chǎn)生抗酸的堅固晶體。因此，本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物涉及堅固的牙齒晶體的生產(chǎn)以及牙齒補充礦質(zhì)，從而減少齲齒的產(chǎn)生。
本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物可進一步包含本領域熟練的技術人員已知的具有抗齲齒功能的其它物質(zhì)。這種物質(zhì)的例子包括各種寡糖(潘糖(62-葡糖基-麥芽糖)、異麥芽低聚糖、異蔗糖(6-O-α-葡糖吡喃糖基-D-呋喃果糖)、海藻糖(O-α-D-葡糖吡喃糖基(1-1)-α-D-吡喃葡萄糖苷)、麥芽低聚糖、乳蔗糖TM(4G-β-D-半乳糖基蔗糖)、呋喃低聚糖、偶聯(lián)糖、木糖基果糖苷、環(huán)糊精等)；糖醇(木糖醇、赤藻糖醇、palatinit、山梨醇、麥芽糖醇、甘露醇等)；茶葉提取物(氟、多酚、兒茶素等)；草藥(例如薄荷、薄荷油、春黃菊、鼠尾草、姜、迭迭香等，見Shibuya等，香料雜志特刊FRAGRANCEJOURNAL SPECIAL ISSUE，12，150-155頁，1992)；酶(例如，葡聚糖酶、變位酶等)；和疫苗(例如分泌的抗變異鏈球菌的免疫球蛋白A)。糖醇是優(yōu)選的。木糖醇是更優(yōu)選的。本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物通過含有上述物質(zhì)可具有預防齲齒的增強效果。
可使用已知的方法檢測緩沖劑的補充礦質(zhì)的效果，例如一個使用牛牙齒切片的補充礦質(zhì)的試驗系統(tǒng)，它描述于Inaba.D等，Eur.J.Sci.10574-80，1997；Inaba.D等，J.Dent.Health.4767-74，1997；和Iijima.Y等，Dental Caries Research.33206-213，1999。
為了測定包含于本發(fā)明的膳食組合物和口腔組合物中的緩沖劑的補充礦質(zhì)的效果，本發(fā)明的發(fā)明者開發(fā)了與上述補充礦質(zhì)試驗系統(tǒng)相比較簡單的試驗系統(tǒng)。例如，補充礦質(zhì)容易發(fā)生的條件如下向牙齒表面(羥磷灰石)的接觸表面快速提供鈣和磷，并將它們摻入牙齒成分(羥磷灰石)；在包括牙齒表面的系統(tǒng)中保持較高的鈣和磷濃度；除牙齒表面外的區(qū)域沒有鈣和磷的沉積或流失。如下簡化這些用于容易補充礦質(zhì)的條件在包括羥磷灰石的系統(tǒng)中提供用于結(jié)晶的鈣和磷并減少可溶的鈣；和在不包括羥磷灰石的系統(tǒng)中，磷和鈣不沉積并保持其較高的溶解度。因此，比較這兩個系統(tǒng)中鈣的溶解度的大小以檢測補充礦質(zhì)的效果。這些簡單的試驗系統(tǒng)將在下文中描述。TMR(橫向顯微放射顯影術)方法作為一種用于以定量的方式測定牙質(zhì)礦物質(zhì)濃度的分布的標準方法已用于大量的對脫礦質(zhì)和補充礦質(zhì)的研究。對于這種方法，有如下限制需要長時間進行評估；需要高水平的試驗技術等。因此，需要一個能夠迅速捕獲牙質(zhì)礦物質(zhì)濃度變化的簡單的評價系統(tǒng)。通過如下兩個步驟考慮開發(fā)在牙齒釉質(zhì)的早期齲齒損傷中補充礦質(zhì)(i)將釉質(zhì)的組分鈣(Ca)離子和磷(P)離子提供給脫礦質(zhì)的部分；和(ii)提供的Ca離子和P離子用于脫礦質(zhì)的部分中釉質(zhì)的晶體生長。
鑒于上述兩個步驟，一種具有促進補充礦質(zhì)作用的物質(zhì)被認為是一種在中性pH下抑制Ca和P的不溶解和沉淀但不抑制羥磷灰石的晶體生長的物質(zhì)。
這些試驗系統(tǒng)與上述使用牛牙齒的常規(guī)系統(tǒng)有關，并建立了一個簡單和極好的方法。
在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及研究預期具有抗齲齒作用的樣品對牙齒補充礦質(zhì)的效果的方法。該方法包括如下步驟(A)在有樣品的情況下，在含有磷、鈣以及牙齒成分的溶液中沉淀鈣；(B)沉淀后測定溶液中鈣的濃度或沉淀的鈣的量；(C)在不含樣品的溶液中沉淀鈣；(D)沉淀后測定溶液中鈣的濃度或沉淀的鈣的量；和(E)比較步驟(B)和(D)中鈣的濃度或沉淀的鈣的量。在一個較佳的實施例中，上述溶液可包含羥磷灰石、緩沖液、K2HPO4和CaCl2。包含于上述溶液的“牙齒成分”是由于補充礦質(zhì)，沉淀磷和鈣以產(chǎn)生羥磷灰石的任何物質(zhì)。羥磷灰石的使用是優(yōu)選的。另外，可使用如牛等哺乳動物的牙齒、和其切片或分餾物。當制備用于鈣沉淀的溶液時，添加上述磷、鈣和其它牙齒成分的次序沒有限制。較佳地，以如下次序添加以制備溶液，首先是樣品，然后是磷、氯化鈣溶液，和牙齒成分懸浮液或去離子水。較佳地，添加K2HPO4后調(diào)整溶液的pH。一般通過在室溫下培育十幾個小時到幾天產(chǎn)生鈣沉淀(較佳地10小時到7天，更佳地18小時到42小時)。可使用本領域熟練的技術人員已知的任何方法測定溶液的鈣溶解度。溶液的鈣溶解度可通過OCPC方法測定(使用由Wako Pure Chemicals生產(chǎn)的“Calcium Ctest Wako”)。另外，可測定溶液中沉淀的鈣的量?？墒褂帽绢I域熟練的技術人員已知的任何方法測定溶液中沉淀的鈣的量。溶液的鈣溶解度可使用本領域熟練的技術人員已知的任何方法測定。這種方法的例子包括ICP方法(誘導性偶聯(lián)的等離子體方法)、原子吸收分析和離子電極方法。
為了測定抗齲齒的功能，一種人造口腔設備用于獲得盡可能真實的脫礦質(zhì)的釉質(zhì)(見例如Jpn.J.Oral Biol.20288-291，1984)。例如，該設備可包含一個電極、附著在電極周圍的釉質(zhì)切片、和變異鏈球菌細胞懸浮液、培養(yǎng)液、和滴下糖溶液的工具。使用這種設備，合成不溶于水的葡聚糖的變異鏈球菌附著在電極表面形成一個人工空斑，從而產(chǎn)生低的pH。而且，一個人工空斑相似地在釉質(zhì)部分上形成，導致釉質(zhì)硬度的顯著下降。
(實施例)下文中，將以實施例的方式詳細描述本發(fā)明。這些實施例不是要限制本發(fā)明。用于實施例的材料、試劑等除非另外提及均為商業(yè)購得。
(實施例1)實施例1顯示了生產(chǎn)用于本發(fā)明組合物的磷酸化寡糖的方法。
首先，當1％的馬鈴薯淀粉溶液溶解于含有6mM氯化鈉和2mM的氯化鈣的5ml溶液中時迅速加熱到100℃以凝膠化。此后，使35U的由Hankyu Bioindustry Ltd.生產(chǎn)的α-淀粉酶(Fukutamirase)作用于凝膠化的混合物，并在50℃保持30分鐘。少量的反應液用于制備0.2％的糖溶液。1/10份的0.01M的碘-碘化鉀溶液加入一份的糖溶液中。在碘量滴定法中證實產(chǎn)生的混合物是陰性的。此后，同時使2U的支鏈淀粉酶(由Hayashibara Biochemical Lab.生產(chǎn))和6U的葡糖淀粉酶(由Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))在40℃作用于混合物20小時。終止反應，隨后離心。將上清液應用于用20mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)平衡的陰離子交換樹脂柱(Chitopearl BCW 2501；由FujiSpinning Co.，Ltd生產(chǎn))。該柱用乙酸鹽緩沖液徹底洗滌以除去中性糖類，隨后用含有0.5M氯化鈉的乙酸鹽緩沖液洗提。各個洗提的部分用蒸發(fā)器濃縮、脫鹽、并凍干，由此獲得磷酸化寡糖。
這樣獲得的磷酸化寡糖再次用于用20mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)平衡的陰離子交換樹脂柱(Chitopearl BCW 2501)。該柱用乙酸鹽緩沖液徹底洗滌以除去中性糖類。使該柱用含有0.15M氯化鈉的乙酸鹽緩沖液和然后用含有0.5M氯化鈉的乙酸鹽緩沖液洗提。收集的部分脫鹽并凍干。根據(jù)上文提到的用于確定結(jié)構的方法分析這些部分，表明在從0.15M氯化鈉洗提的部分中(PO-1部分)獲得的磷酸化糖中，一個磷酸基團與具有含α-1，4鍵的3-5個葡萄糖的葡聚糖結(jié)合；并在從0.5M氯化鈉洗提的部分中(PO-2部分)獲得的磷酸化糖中，兩個或更多的磷酸基團與具有含α-1，4鍵的2-8個葡萄糖的葡聚糖結(jié)合。
上述磷酸化寡糖的結(jié)構分析如下進行。
首先，從磷酸化寡糖中除去磷酸基團。100μl、3％磷酸化寡糖溶液與100μl含有10mM氯化鎂、0.3mM氯化鋅、和0.05％疊氮鈉的60mM碳酸鈉緩沖液(pH 9.4)混合。100μl、30U/ml堿性磷酸酶(EC.3.1.3.1；衍生自大腸桿菌由SIGMA生產(chǎn))加入混合物，然后使之在40℃反應18小時。通過使用超濾膜除去堿性磷酸酶終止反應，由此獲得含有已除去磷酸基團的糖(下文稱為脫磷酸糖)的反應液(下文中稱為反應液A)。
向10μl得到的反應液A加入溶解于10μl的200mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.8)的5000U/ml的β-淀粉酶(產(chǎn)生自甘薯；由SIGMA生產(chǎn))，得到的混合物在37℃保留2小時(得到的液體稱為反應液B)。相似地，溶解于10μl的60mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)的300U/ml的糖淀粉酶(衍生自根霉菌屬；由Totobo Co.，Ltd.生產(chǎn))加入10μl的反應液A，得到的混合物在35℃保留18小時(下文中得到的液體稱為反應液C)。
分析反應液A-C以證實其中的產(chǎn)物。通過使用陰離子交換樹脂柱，CarboPacPA-100(Ф4×250mm，由Dionex Corp.生產(chǎn))的高效液相色譜或使用硅膠的薄層層析分析這些液體證實這些反應液中的產(chǎn)物，并將分析結(jié)果與具有各種聚合度的標準麥芽低聚糖的產(chǎn)物作比較。使用高效液相色譜洗提脫磷酸糖通過使用100mM氫氧化鈉作為基礎溶液，提高1M的乙酸鈉的濃度進行。脫磷酸糖的檢測使用脈沖電流檢測器(由Dionex Corp.生產(chǎn))進行。使用薄層層析分析脫磷酸糖可通過用乙腈/水(80/20)多重展開脫磷酸糖，噴灑硫酸/甲醇溶液(＝1/1)，并在130℃保留3分鐘進行。
分析反應液A，以便確定磷酸化寡糖的鏈長。當分析反應液B時，只檢測到麥芽糖和麥芽三糖(和少量的葡萄糖)。因此，證實脫磷酸糖是葡聚糖，其中葡萄糖通過α-1，4鍵互相連接。而且，當分析反應液C時，僅檢測到葡萄糖。因此證實脫磷酸糖是由α-鍵連接的葡萄糖組成。
糖的平均鏈長(下文中，由DP代表，使用葡萄糖作為一個單位)從具有各種聚合度的脫磷酸糖類的糖含量獲得。整個磷酸化糖類的總糖含量使用苯酚-硫酸方法測定。連接的磷酸基團的數(shù)量作為通過使脫磷酸糖類濕灰化(與淀粉相關的糖類試驗方法，《生化試驗方法》(Biochemistry experimental method)19，M.Nakamura等，31頁，1986，JSSP Tokyo)獲得的無機磷酸確定。根據(jù)如下公式，使用脫磷酸糖類濕灰化后確定的無機磷酸的量和DP計算每分子結(jié)合的磷酸基團的數(shù)量(每分子結(jié)合的磷酸基團的平均數(shù)量)＝ (實施例2)含有每分子具有一個磷酸基團的磷酸化寡糖的PO-1部分和含有每分子具有兩個磷酸基團的磷酸化寡糖的PO-2部分各10g溶解于100ml的蒸餾水中。使用電透析儀(Micro acilyzer)G3、AC210-400膜由Asahi Kasei Co.，Ltd生產(chǎn))除去這些水溶液中的鹽分，然后使用強陽離子交換樹脂(Dowex 50w 20-50MESH，H-型由NisshinKasei生產(chǎn))進行離子交換，由此獲得pH2.7的糖溶液。用1N氫氧化鈉或氫氧化鈣溶液中和得到的溶液，隨后凍干，由此制得磷酸化寡糖鈉鹽或鈣鹽。
在下面的實施例中使用的磷酸化糖類(以鈉鹽或鈣鹽的形式)是含有80％或更多的上述PO-1部分的磷酸化糖和PO-2部分的磷酸化糖的剩余物的磷酸化糖類混合物。
(實施例3)在實施例3中，使用牛牙齒斷片的系統(tǒng)用于澄清磷酸化寡糖對于早期齲齒補充礦質(zhì)的作用。
該試驗的進行基本上根據(jù)Inaba.D等，Eur.J.Sci.10574-80，1997；Inaba.D等，J.Dent.Helth.4767-74，1997；和Iijima.Y等，Caries Research.33206-213，1999。
在試驗中使用的牙齒斷片如下制備放置每邊3mm的立方的牛牙齒斷片以便其釉質(zhì)表面向上。除釉質(zhì)表面外用合成樹脂覆蓋斷片。用濕的研磨砂紙?zhí)幚碛再|(zhì)。脫礦質(zhì)如下進行牙齒斷片在37℃浸沒于含有6％羧甲基纖維素凝膠的1％乳酸凝膠(pH5.0)中3周。補充礦質(zhì)如下進行在37℃，脫礦質(zhì)的牙齒斷片浸沒于含有1.5mMCaCl2和0.9mM KH2PO4的20mM 2-[4-(2-羥乙基)]-1-哌嗪乙磺酸鹽(HEPES)緩沖液(pH7.0)中一周。
制備如下8個試驗組(1)僅脫礦質(zhì)(空白；圖1和2中的“空白”)；(2)僅補充礦質(zhì)(陰性對照；圖1和2中的“對照”)；(3)補充礦質(zhì)溶液+2ppm氟(F)(陽性對照；圖1和2中的“2ppm F”)；(4)補充礦質(zhì)溶液+4.0％磷酸化寡糖鈉鹽(圖1和2中的“POsNa 4％”)；(5)補充礦質(zhì)溶液+1.0％磷酸化寡糖鈉鹽(圖1和2中的“POs Na 1％”)；(6)補充礦質(zhì)溶液+0.2％磷酸化寡糖鈉鹽(圖1和2中的“POs Na 0.2％”)；(7)補充礦質(zhì)溶液+0.2％磷酸化寡糖鈣鹽(圖1和2中的“POs Ca 0.2％”)；和(8)補充礦質(zhì)溶液+0.07％磷酸化寡糖鈣鹽(圖1和2中的“POs Ca 0.07％”)。
經(jīng)過各個處理后，從各個處理的牙齒斷片中制備200μm厚的切片，從顯微放射照相的圖象(未顯示)分析其礦物質(zhì)濃度的分布。當牙齒斷片被脫礦質(zhì)時，礦物質(zhì)從牙齒斷片洗脫并流失，其中依次產(chǎn)生空腔(齲齒發(fā)作)。圖1顯示根據(jù)該礦物質(zhì)濃度分析礦物質(zhì)流失值的圖(垂直軸表明礦物質(zhì)流失值)。圖2顯示脫礦質(zhì)的深度[垂直軸表明損傷深度(μm)]。根據(jù)圖1，對于磷酸化寡糖鈉和磷酸化寡糖鈣，在測試濃度的最低濃度水平上，礦物質(zhì)損失最少。該礦物質(zhì)損失少于(2)陽性對照的損失。就磷酸化寡糖鈉和磷酸化寡糖鈣來說，得到淺的損傷深度(圖2)。這表明空腔通過補充礦質(zhì)而填充。有趣的是，關于具有氟的(2)陽性對照，損傷深度沒有改變。
經(jīng)過各個處理后，還分析了補充礦質(zhì)后的溶液中鈣和磷濃度。溶液在10,000g離心2分鐘，并分析上清液。使用鉬酸方法測定磷濃度(“Shin-ban Bunseki KagakuJikken《新版分析化學實驗》(New Edition Analyical Chemistry Experiment)(第一版)，313-314頁，由Kagaku Dojin K.K.出版)，并用OCPC方法(由Wako Pure Chemicals生產(chǎn)使用“calcium C test Wako”試劑盒測定)測定鈣濃度。結(jié)果顯示于表1中。
表1Pi(mM) Ca(mM)對照 0.34 0.682ppm F0.41 0.73POs Na4％ 1.43.861％ 1.21.860.2％1.11.63POs Ca0.2％1.22.660.07％ 1.21.80
根據(jù)表1，發(fā)現(xiàn)通過加入磷酸化寡糖，溶解于溶液中的鈣和磷的濃度仍高。
因此，鈣試驗表明通過加入磷酸化寡糖，溶解于溶液中的鈣和磷的濃度仍高，結(jié)果，這些溶解的磷和鈣可提供給齲齒部分并用于補充礦質(zhì)。這種現(xiàn)象被認為發(fā)生在人的口腔中。
(實施例4)在實施例4中，一種補充礦質(zhì)的簡單試驗系統(tǒng)用于澄清磷酸化寡糖對早期齲齒補充礦質(zhì)的作用。
(補充礦質(zhì)試驗系統(tǒng)的步驟)為了以更加簡單的方式檢測補充礦質(zhì)現(xiàn)象，更容易地產(chǎn)生補充礦質(zhì)的條件被簡化。在一個包含羥磷灰石的系統(tǒng)中，供給鈣和磷用于結(jié)晶且可溶的鈣被減少。相反，在一個不包含羥磷灰石的系統(tǒng)中，鈣和磷不沉淀，以致其溶解度保持在高水平?；谶@些事實，設計如下試驗系統(tǒng)。
通過以如下次序混合下列物質(zhì)制備500μl的溶液(1)50μl的200mM HEPES緩沖液(pH 7.0)；(2)200μl的去離子水或樣品；(3)50μl的18mM KH2PO4溶液；(4)50μl的30mM氯化鈣溶液；和(5)羥磷灰石懸浮液(5mg/ml)或去離子水。加入(3)后，使用0.1N氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)溶液的pH。攪拌得到的溶液并在37℃培育1-7天。此后，溶液在12,000rpm離心3分鐘。得到的上清液的鈣濃度使用OCPC方法測定(如上述)。為此，使用Calcium test C Wako(編號272-21801)在570-nm處測定吸光度。可溶鈣的百分比通過用加入的鈣的濃度除以上清液的鈣濃度乘以100獲得。通過計算由去離子水獲得的值和在(5)中加入羥磷灰石時得到的值之間的差數(shù)獲得補充礦質(zhì)的百分比。
(具有各種濃度的磷酸化寡糖對補充礦質(zhì)的影響)上述簡單試驗系統(tǒng)用于在37℃培育具有各種濃度的磷酸化寡糖鈉鹽和磷酸化寡糖鈣鹽18小時或42小時。磷酸化寡糖鈉鹽和磷酸化寡糖鈣鹽補充礦質(zhì)的結(jié)果分別顯示于圖3和4中(在圖3和4中，垂直軸表示補充礦質(zhì)的比率(％)，水平軸表示樣品(％)，對照表示未加入樣品；對于各個樣品濃度，左邊的條表示18小時處理，右邊的條表示42小時處理)。磷酸化寡糖鈉鹽即使在低濃度下也改進了溶解加入的鈣的能力(圖3)。磷酸化寡糖鈣鹽具有低的溶解外部加入的鈣鹽的能力，并相反地釋放額外的鈣以改變?nèi)芤褐械拟}/磷比，以致于鈣更容易沉淀并因此不能保持高的鈣濃度(圖4)。
因此，磷酸化寡糖鈉鹽能顯示溶解作用而不改變系統(tǒng)中的鈣/磷比。就磷酸化寡糖鈣鹽來說，認為需要與磷(磷酸鹽、磷化合物等)同時供給以保持Ca/P比為1.67(P/Ca比＝0.6)。另外，加入的磷酸化寡糖鈣鹽的濃度需要對比值幾乎沒有影響。
(Ca/P濃度比＝1.67(P/Ca濃度比＝0.6)的磷酸化寡糖對補充礦質(zhì)作用的影響)當使用磷酸化寡糖鈣鹽時，鈣與磷濃度的比設定為1.67(P/Ca濃度比＝0.6)，設定濃度以從磷酸化寡糖中獲得鈣。設定鈉鹽以與磷酸化寡糖的濃度相匹配。濃度設定顯示于以下表2中。
表2對照 POs Na

POs Ca

在上述簡單試驗系統(tǒng)中，37℃培育15小時。結(jié)果顯示于圖5中(垂直軸表示補充礦質(zhì)的比率(％)，水平軸表示Ca濃度(mM)，填充的方形代表不含磷酸化寡糖鹽的對照，菱形代表磷酸化寡糖鈉鹽(POs Na)，圓形代表磷酸化寡糖鈣鹽(POs Ca))。如圖5所示，當Ca/P濃度比＝1.67(P/Ca濃度比＝0.6)不變且加入的鈣的濃度提高時，在磷酸化寡糖鈉鹽和磷酸化寡糖鈣鹽之間獲得相似的結(jié)果。當加入的鈣鹽是6mM或更多時，添加的磷酸化寡糖的作用降低。
(各種Ca/P比的磷酸化寡糖對補充礦質(zhì)作用的影響)上述簡單試驗系統(tǒng)在37℃培養(yǎng)17.5小時或1周，期間鈣與磷濃度比的改變顯示于表3中(表3使用P/Ca)。
表3

該結(jié)果顯示于圖6A到6C中(垂直軸表示補充礦質(zhì)的比率(％)，水平軸表示P/Ca)。圖6A顯示了不含磷酸化寡糖的對照的結(jié)果。方形代表17.5小時的處理，填充的菱形代表一周處理。圖6B顯示磷酸化寡糖鈉鹽的結(jié)果。三角形代表17.5小時處理，填充的三角形代表一周處理。圖6C顯示磷酸化寡糖鈉鹽的結(jié)果。圓形代表17.5小時處理，填充的圓形代表一周處理。如圖6A到6C所示，當Ca固定到1.5mM并且磷濃度變化而改變P/Ca比時，認為磷酸化寡糖鈉鹽和磷酸化鈣鹽引起相對有效地補充礦質(zhì)。根據(jù)這一結(jié)果，認為即使在高濃度磷的情況下，鈣鹽更加穩(wěn)定。
(實施例5)實施例5顯示磷酸化寡糖與其它抗齲齒藥劑在補充礦質(zhì)作用中的比較。作為抗齲齒的藥劑，使用木糖、木糖醇、異蔗糖和palatinit。使用實施例3的簡單系統(tǒng)檢測補充礦質(zhì)的效果。在該簡單系統(tǒng)中，37℃培育8天。結(jié)果顯示于圖7A到7C中(垂直軸表示補充礦質(zhì)的比率(％)，水平軸表示樣品濃度(％))。圖7A顯示磷酸化寡糖鹽的結(jié)果，其中填充的三角形代表鈣鹽，空的三角形代表鈉鹽。圖7B顯示木糖醇的結(jié)果，其中填充的圓形代表木糖醇，空的圓形代表木糖。圖7C顯示palatinit的結(jié)果，其中填充的方形代表palatinit，空的方形代表異蔗糖。根據(jù)圖7A到7C，濃度低至約0.1％磷酸化寡糖顯示了高的補充礦質(zhì)的效果，而其它抗齲齒的藥劑(木糖醇、異蔗糖、和palatinit)如以前所報道的，在濃度為20％時顯示補充礦質(zhì)的作用(日本公開出版物2000-128752號，日本公開出版物2000-247852號等)。對于木糖，在任何濃度補充礦質(zhì)的百分比都低。
(實施例6)在實施例6中檢測了磷酸化寡糖抑制脫礦化的效果。
制備具有如下組分的脫礦化溶液6.0mM氯化鈣溶液；3.6mM磷酸二氫鉀；2％乳酸鹽溶液；和5mg/ml羥磷灰石溶液，pH 5.0。125μl的脫礦化溶液和125μl的具有終濃度為0.2％和2％磷酸化寡糖鈉鹽溶液混合并攪拌，隨后在37℃培育2天。此后，混合物在12,000rpm離心3分鐘。使用OCPC方法測定得到的上清液的鈣濃度。加入的鈣濃度和處理后鈣的濃度。如果在有檢測樣品的情況下，加入的鈣濃度和處理后鈣的濃度之間的差異與對照(不含檢測的樣品)相比小，認為檢測樣品具有抑制脫礦化的作用。與不含磷酸化寡糖的對照(5mM)相比，0.2％和2％磷酸化寡糖鈉鹽溶液具有小的差異(3mM和2mM)。因此，認為磷酸化寡糖鈉鹽具有抑制脫礦化的作用。
(實施例7)實施例7顯示了磷酸化寡糖與氟對于補充礦質(zhì)作用的協(xié)同影響。
下面表4中描述的組合物用于檢測在磷酸化寡糖存在或不存在的情況下補充礦質(zhì)的效果。
表4

實施例中的簡單系統(tǒng)用于檢測補充礦質(zhì)的效果。在簡單系統(tǒng)中在37℃培育5天。此后，使用OCPC方法測定可溶鈣的量。通過薄層層析(TLC)定性地證實磷酸化寡糖。用于TLC分析的條件如下硅膠平板(由Merck生產(chǎn))；乙醇/去離子水/乙酸(＝70/30/2)；在室溫展開一次；加入5μl的樣品；1μl的1％磷酸化寡糖和1μl的1％的麥芽三糖作為標記。
TLC分析的結(jié)果顯示于表8中。在圖8中，各個泳道顯示具有各種濃度(ppm)的氟，上方的點代表麥芽三糖，下方的點代表磷酸化寡糖。圖9顯示磷酸化寡糖與氟對補充礦質(zhì)效果的協(xié)同作用(垂直軸表示補充礦質(zhì)的比率(％)，水平軸表示氟的濃度(ppm)；在各個值中，左邊的條表示不含磷酸化寡糖的對照，右邊的條屬于0.2％磷酸化寡糖的組)。氟是高度活潑的鹵素。檢測了氟對磷酸化寡糖和鈣的定量的作用。在試驗條件下，氟加入的影響似乎是微不足道的(圖8)。氟的加入改變了Ga/P的濃度比的平衡，以致不溶解性下降。因此，由于氟濃度的提高補充礦質(zhì)的比率下降。然而，當加入0.2％磷酸化寡糖鈉鹽時，補充礦質(zhì)的效果趨于提高，因此，可證實顯著的協(xié)同作用(圖9)。
(實施例8)實施例8顯示與口香糖混合的磷酸化寡糖以及進入人口腔的磷酸化寡糖的洗提。
制備顯示于表5中的含有磷酸化寡糖鈣鹽的片狀口香糖(平板樣口香糖)(鈣含量是3.2％)(片狀口香糖具有約3.2g的重量)。
表5

3.2g/片狀口香糖當咀嚼口香糖時，隨時間洗提進入口腔的鈣鹽的量通過薄層層析(TLC)分析。用于TLC的條件如下展開平板是一個硅膠平板；展開洗提液是乙醇/去離子水/乙酸＝70/30/2；展開溫度是室溫，展開進行一次；點樣的量是3μl；通過向平板噴灑檢測溶液(硫酸/乙醇＝1∶1)進行檢測，隨后在130℃處理3分鐘，借此點顯出顏色。
圖10顯示具有標準溶液濃度的磷酸化寡糖的TLC分析結(jié)果。各個泳道顯示具有各種濃度的磷酸化寡糖的洗提(表示左邊為1％木糖醇作為對照和右邊為1％麥芽三糖(G3))。下方的點代表磷酸化寡糖，上方的點代表木糖醇和麥芽三糖。圖11顯示當咀嚼含磷酸化寡糖的口香糖時隨時間的洗提量。各泳通表示隨咀嚼時間的洗提(表示左邊為1％磷酸化寡糖作為對照，右邊為1％木糖醇和麥芽三糖(G3)。下方的點代表磷酸化寡糖，上方的點代表木糖醇和麥芽三糖。磷酸化寡糖沒有用唾液淀粉酶水解。根據(jù)這些圖，將理解咀嚼開始后約10分鐘，相對高濃度的磷酸化寡糖存在于口腔中，20分鐘后，磷酸化寡糖保留約0.25％濃度。
(實施例9)實施例9顯示磷酸化寡糖對蔗糖發(fā)酵的影響。
變異鏈球菌菌株8148在37℃培養(yǎng)于1,000ml的腦心浸液培養(yǎng)基(由DIFCOCorporation生產(chǎn))14小時。此后，通過在6,000rpm離心20分鐘收集細菌。細菌用磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH 7.2)洗滌，并于相同的PBS中懸浮至40％(v/v)。為了測定pH，反應混合物(250μl)由125μl的40％細菌細胞懸浮液、62.5μl的80mM蔗糖和62.5μl的含有各種寡糖的水溶液(5％磷酸化寡糖鈉鹽和磷酸化寡糖鈣鹽)組成。在37℃培養(yǎng)時，反應混合物的pH用pH儀(由Toa Denpa生產(chǎn))連續(xù)測定。
當0.684％蔗糖或0.684％葡萄糖加入含有變異鏈球菌8158菌株的20％細菌細胞懸浮液，5分鐘內(nèi)反應液的pH下降至5.0以下，10分鐘后下降至4.0。當5％磷酸化寡糖(PO-1和PO-2)同時存在時，在兩種情況下pH的下降被明顯抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。當加入5％磷酸化寡糖鈉鹽或磷酸化寡糖鈣鹽時，由于0.684％的蔗糖的發(fā)酵引起的pH下降被有效抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。
(實施例10)在實施例10中，制備磷酸化寡糖的糖醇。
10g含有每分子具有一個磷酸基團的磷酸化寡糖的PO-1部分和具有2個磷酸基團的磷酸化寡糖的PO-2部分溶解于100ml的蒸餾水中。用1N氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)整為弱堿溶液(約pH 8)。向100ml獲得的溶液加入30ml的3％氫氧化硼鈉溶液。使混合物在40℃放置1小時以使磷酸化寡糖還原。這樣，氫被加入磷酸化寡糖的還原末端。用1N鹽酸溶液調(diào)節(jié)加入氫的溶液到pH 7.5。反應終止后，溶液使用0.22μm膜進行透析。獲得的溶液使用電透析儀(Micro acilyser)G3，AC210-400膜由AsahiKasei Corporation生產(chǎn))脫鹽，然后使用強陽離子交換樹脂(Dowex 50w 20-50 MESH，H-型由Nisshin Kasei生產(chǎn))進行離子交換，由此獲得pH 2.7的糖溶液。獲得的溶液用1N氫氧化鈉溶液或氫氧化鈣溶液中和，隨后凍干，從而制備磷酸化寡糖鈉或鈣鹽。
(實施例11)在實施例11中，制備硫酸軟骨素寡糖(不飽和雙糖(二聚體))。
4.8g的硫酸軟骨素鈉(C型由Katayama Kagaku生產(chǎn))溶解于500ml的蒸餾水中(pH 6.0)。15U軟骨素酶ACII(衍生自金黃節(jié)桿菌，由Seikagaku Kogyo生產(chǎn))加入得到的溶液并使之在37℃反應23小時。在沸水浴中終止反應，隨后如實施例10中所描述的脫鹽。這樣，制備了硫酸軟骨素寡糖鈉或鈣鹽。
(實施例12)在實施例12中，檢測了各種物質(zhì)的補充礦質(zhì)的作用。
使用實施例4的簡單補充礦質(zhì)試驗系統(tǒng)。關于樣品，使用顯示于以下表6中的物質(zhì)。制備所有物質(zhì)為0.1％的終濃度。
表6編號 樣品1POs Na2PO-2 Na3POsH Na4G35PO-2H Na6Glc-6-P7Ser-P8硫酸軟骨素C9低聚半乳糖醛酸10 二聚體Na11 D.W.
在上述表6中，編號1的POs Na表示磷酸化寡糖(PO-1部分)鈉鹽，編號2的PO-2Na表示磷酸化寡糖(PO-2部分)鈉鹽，編號3的POsH Na表示磷酸化寡糖(PO-1部分)糖醇鈉鹽，編號4的PO-2H Na表示磷酸化寡糖(PO-2部分)糖醇鈉鹽，編號5的G3表示麥芽三糖(葡萄糖三糖)，編號6的Glc-6-P表示葡萄糖-6-磷酸，編號7的Ser-P表示磷酸絲氨酸，編號8表示硫酸軟骨素C，編號9表示低聚半乳糖醛酸，編號10表示硫酸軟骨素的不飽和雙糖(在表6和圖12中，二聚體鈉)，和編號11的D.W.表示去離子水。
結(jié)果顯示于圖12中(垂直軸表示補充礦質(zhì)的比率(％)，水平軸表示樣品物質(zhì))。圖中，具有比去離子水補充礦質(zhì)的比率高的物質(zhì)被判定具有補充礦質(zhì)的作用。磷酸化寡糖醇鈉鹽、葡萄糖-6-磷酸、硫酸軟骨素C鈉鹽，和硫酸軟骨素不飽和雙糖鈉鹽顯示補充礦質(zhì)的作用，其作用與磷酸化寡糖鈉鹽一樣好或優(yōu)于磷酸化寡糖鈉鹽。
(實施例13)在實施例13中，檢測了各種物質(zhì)的補充礦質(zhì)的作用。
使用實施例4的簡單補充礦質(zhì)試驗系統(tǒng)。關于樣品，使用顯示于表7中的物質(zhì)。
表7

表7中，編號1的POs Na表示磷酸化寡糖(PO-1部分)鈉鹽(0.2％的終濃度)，編號2的POs Na表示磷酸化寡糖(PO-1部分)鈉鹽(2.0％的終濃度)，編號3表示異蔗糖(20％的終濃度)，編號4表示異蔗糖(20％的終濃度，編號5表示木糖醇(Wako 244-0052)(2.0％的終濃度)，編號6表示木糖醇(Wako 244-0052)(20％的終濃度)，編號7表示海藻糖(Wako 02252)(2％的終濃度)，編號8表示海藻糖(Wako 02252)(20％的終濃度)，編號9表示山梨醇(Katayama 28-4770)(2％的終濃度)，編號10表示山梨醇(Katayama 28-4770)(20％的終濃度)，編號11的G3表示麥芽三糖(2％的終濃度)，編號12的D.W.表示去離子水(對照)，編號13表示有機酸(酒石酸)(2％的終濃度)，編號14表示有機酸(酒石酸)(1.4％的終濃度)，和編號15表示硫酸葡聚糖(0.2％的終濃度)。
結(jié)果顯示于圖13中(垂直軸表示補充礦質(zhì)比率(％)，水平軸表示樣品物質(zhì))。在包括木糖醇、異蔗糖、和山梨醇的20％添加組中，證實補充礦質(zhì)的作用與以前報道的一致(如上述)。而且，與硫酸軟骨素相似，證實硫酸皮膚素具有補充礦質(zhì)的作用。有機酸與磷酸化寡糖相似也是有效的。
(實施例14)在實施例14中，在人工口腔裝置中檢測預防齲齒的效果。
表兄鏈球菌菌株6715培養(yǎng)物(預培養(yǎng)于腦心浸液培養(yǎng)基(由DIFCO Corporation生產(chǎn)))，心浸液培養(yǎng)基(由DIFCO Corporation生產(chǎn))，和樣品溶液(各個樣品在檢測過程中冷卻)，以6ml/小時/管的速度分別提供給保存于恒溫浴(37℃)的牛牙齒(約5×5mm)。隨時間測定牙齒表面的pH。結(jié)果顯示于圖14中(垂直軸表示pH的改變，水平軸表示時滯；圓形代表添加僅1％糖(GF)，填充的三角形代表添加1％GF+5％磷酸化寡糖鈣鹽(POs Ca))。16小時后，齒斑從牙齒上刮去，在500nm處測定渾濁度。而且，通過苯酚-硫酸方法測定形成的水不溶的葡聚糖(WIG)的量。使用硬度計測定牙齒的硬度。得到此硬度與未處理的牙齒的硬度之間的差值(ΔH)。結(jié)果顯示于表8中。
表8

很明顯在1％GF(糖)的情況下，產(chǎn)生有機酸，約10分鐘后，pH為5.6或更少，該有機酸保持在齒斑中。齒斑充分地形成，牙齒遭受脫礦質(zhì)并變脆。相反，在含有1％GF和5％磷酸化寡糖的溶液中，沒有形成齒斑，并且pH沒有降低。即，防止了齲齒細菌侵入牙齒，以致于齒斑形成受到阻抑，并抑制了牙齒的脫礦化。因此，牙齒的硬度沒有改變。根據(jù)這一結(jié)果，清楚地發(fā)現(xiàn)磷酸化寡糖具有預防齲齒的作用。認為這一現(xiàn)象類似地發(fā)生于人的口腔中。
(實施例15)在實施例15中，從各種淀粉中制備磷酸化寡糖。
用于本實施例的淀粉取自水稻、淀粉(品牌名稱Better FriendTM由ShimadaKagaku生產(chǎn))和木薯淀粉(Sanwa Cornstarch Co.，Ltd.)。
100g的淀粉粉末加入800-1000ml水中。向得到的溶液中加入50μl衍生自細菌地衣芽孢桿菌(購自Fukutamirase，來自Hankyu Industries，1％)的5000U/ml的淀粉液化α-淀粉酶(BLA)。該溶液在50℃水浴中凝膠化48小時。另外，50μl的5000U/mlBLA(Fukutamirase，來自Hankyu Industries，1％)、50μl的200U/ml支鏈淀粉酶(Promozyme由Novo Nordisk生產(chǎn))、和50μl的葡糖淀粉酶(416U/ml)(購自Toyobo)加入到凝膠化的淀粉中，隨后在50℃培養(yǎng)48小時。獲得的混合物在8,000rpm離心20分鐘。將上清液應用于用10mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)平衡的陰離子交換樹脂(Chitopearl BCW 2501由Fuji Spinning Co.，Ltd.生產(chǎn))。用相同的緩沖液徹底洗滌柱以除去中性糖類，隨后用含有0.5M氯化鈉的相同緩沖液洗提。各個洗提的部分用蒸發(fā)器濃縮，隨后去鹽和凍干。由此獲得磷酸化寡糖。
這樣獲得的磷酸化寡糖再次用于由20mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)平衡的陰離子交換樹脂柱(Chitopearl BCW2501)。用相同的緩沖液徹底洗滌柱以除去中性糖類。首先用含有0.15M氯化鈉的相同緩沖液洗提柱，接著用含有0.5M氯化鈉的相同緩沖液洗提，由此收集部分。收集到的部分去鹽并凍干。根據(jù)上述用于確定結(jié)構的方法分析這些部分，表明在從0.15m氯化鈉洗提的部分(PO-1部分)獲得的磷酸化寡糖中，一個磷酸基團與含α-1，4鍵的3-5個葡萄糖的葡聚糖連接；在從用0.5M氯化鈉洗提的部分(PO-2部分)中獲得的磷酸化寡糖中，兩個或更多的磷酸基團與含α-1，4鍵的2-8個葡萄糖的葡聚糖結(jié)合。磷酸化寡糖的結(jié)構分析如實施例1中描述的進行。
(實施例16)實施例16顯示含有磷酸化寡糖的口香糖具有促進早期齲齒中釉質(zhì)補充礦質(zhì)的作用。
用通常使用的方法生產(chǎn)兩種片狀口香糖(約1.5g/片)含有衍生自馬鈴薯淀粉的2.5％(平均含量)的POs Ca的無糖口香糖(含有45％的木糖醇)和不含POs Ca的無糖口香糖(含有47.5％的木糖醇)。所有的試驗試劑都是保證試劑。各個物質(zhì)的含量是關于口香糖總重量的比例。
關于牙齒材料，使用牛牙齒的冠釉質(zhì)。使用菱形鋸(由LUXO生產(chǎn))將釉質(zhì)切成具有標準大小側(cè)面的塊(7×7×3mm)。這些釉質(zhì)塊(6個樣品)包埋于自聚的樹脂，(UNIFAST Trad，由GC生產(chǎn))，形成具有大小為15×50mm和厚度為7mm的平板。此后，用濕潤的研磨砂紙(粒度800)研磨平板的表面以暴露出平坦而新鮮的釉質(zhì)。另一方面，牙齒的牙質(zhì)側(cè)預先包埋于印模膏(由GC生產(chǎn))。每一個這樣制備的釉質(zhì)塊包埋平板在37℃浸沒于100ml的0.1M乳酸凝膠(6wt％羧甲基纖維素，pH 5.0)4周，由此人為地產(chǎn)生齲齒。
17名健康的受檢者參加了一項測試，測試中受檢者咀嚼兩種含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖顆粒(3.0g)20分鐘。測試中，沒有告知受檢者口香糖的種類。在口香糖咀嚼開始后到1分鐘后、1分鐘后到3分鐘后、3分鐘后到6分鐘后、6分鐘后到10分鐘后，以及10分鐘后到20分鐘后的時間階段中，使用塑料漏斗從受檢者收集唾液到10ml的塑料試管中。收集后立即測定唾液的量和pH。其后，用蒸餾水稀釋唾液上清液10倍，隨后用0.45μm濾器(由Millipore生產(chǎn))過濾。使用OCPC方法(Calcium Ctest Wako；由Wake Pure Chemicals生產(chǎn))和鉬酸方法定量濾液中Ca和無機P的含量。
12名健康的受檢者參加了一項測試，測試中受檢者咀嚼兩種片狀的含POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖(3.0g)20分鐘。測試中，沒有告知受檢者口香糖的種類。使用塑料漏斗從受檢者收集在20分鐘咀嚼的第一個10分鐘的過程中(唾液A)和第二個10分鐘的過程中(唾液B)的唾液放入50ml塑料試管中。收集后立即測定唾液的量和pH。測定后，立即將7ml的唾液傾入塑料容器(10×30×60mm)中，在該容器中事先放置一個具有人造齲齒的包釉質(zhì)塊包埋平板。此量為釉質(zhì)塊包埋平板可充分浸沒于唾液中的量。平板浸沒于唾液A中10分鐘后，該平板浸沒于唾液B中10分鐘。此后，移去平板，用蒸餾水徹底洗滌平板表面。該浸沒操作是在37℃進行，并一天連續(xù)重復4次。操作后釉質(zhì)塊包埋平板日常保存于濕度為100％的涼爽環(huán)境中。使用每天收集的人唾液連續(xù)4天進行測試。對于測試中使用的唾液，使用上清液的部分并用蒸餾水稀釋10倍，隨后用0.45μm濾器(由Millipore生產(chǎn))過濾。使用上述方法每天測定濾液的Ca和無機P。
在人的唾液中浸沒后，使用堅硬組織切割器(Isomet，Buhler，USA)將各個牙齒釉質(zhì)切割成為具有約500μm厚度的切片。用濕潤的研磨砂紙(粒度800)研磨各個切片到約200μm厚度。各個切片進行顯微放射照相(PW-1830，Philips，荷蘭)。用于顯微放射照相的條件是管電壓為25kv；電流是25mA；管和受檢者之間的距離是370mm。此后，使用Inaba等的圖象定量方法(Eur.J.Oral.Sci.10574-84，1997)測定損傷深度(Ld，μm)和礦物質(zhì)流失值ΔZ(體積％·μm)。
17名健康的受檢者咀嚼2種含POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖顆粒(3.0g)20分鐘。在這種情況下，唾液的量(圖15水平軸代表口香糖咀嚼時間垂直軸代表唾液量(ml))、唾液的pH(圖16水平軸代表口香糖咀嚼時間，垂直軸代表pH)、唾液中Ca含量(圖18水平軸代表口香糖咀嚼時間，垂直軸代表Ca量(mg))，和唾液中P含量(圖17水平軸代表口香糖咀嚼時間，垂直軸代表磷量(mg))隨時間而測定，其中數(shù)值從開始由整合值表示。而且，計算唾液的Ca/P比的變化(圖19水平軸代表口香糖咀嚼時間，垂直軸代表Ca/P比)。在各個圖中，含POs Ca的口香糖(+POs Ca口香糖)和不含POs Ca的口香糖(-POs Ca口香糖)分別由方形和菱形表示。
結(jié)果，分泌的唾液的量(圖15)、pH變化(圖16)和P含量的變化(圖17)在口香糖類型中沒有改變到統(tǒng)計學上的顯著水平。在20分鐘的口香糖咀嚼中，分泌約30ml的唾液，5分鐘后唾液的pH從開始咀嚼口香糖時的7.0提高到7.5。通過口香糖咀嚼分泌的唾液中P的含量約5mg，與鈣含量相比它足以用于補充礦質(zhì)。相反，清楚地發(fā)現(xiàn)在含有POs Ca的口香糖的情況下，咀嚼開始20分鐘后溶解于唾液中的Ca量約4倍于咀嚼不含POs Ca的口香糖的情況(圖18)。由于一定量的P本來存在于唾液中(圖16)，在含有POs Ca的口香糖情況下，Ca/P比也明顯高(p＜0.001)(圖19)。在上述分析結(jié)果中，在女性和男性受檢者之間沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。
圖9顯示了從咀嚼兩種含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖顆粒(3.0g)20分鐘的12名健康受檢者中收集的唾液A和唾液B的分析結(jié)果。
表9唾液體積、pH和礦物質(zhì)含量的比較口香糖種類 唾液A 唾液B唾液(ml) +POs Ca 20.34±4.139.35±3.24-POs Ca 20.74±4.439.65±3.35Ca(mM)+POs Ca 6.2±2.44**1.72±0.53*-POs Ca 1.69±0.41 1.51±0.42P(mM) +POs Ca 5.62±1.41 6.22±1.31-POs Ca 6.15±1.35 6.49±1.15Ca/P +POs Ca 1.12±0.31**0.28±0.08-POs Ca 0.28±0.08 0.23±0.06平均值±標準差，*p＜0.05，**p＜0.001，n＝12在兩種口香糖中，唾液A的量約兩倍于唾液B的量。在唾液A中，不含POs Ca的口香糖和含有POs Ca的口香糖之間Ca含量有明顯差異。然而，在唾液B中，這種差異。對于P含量，在兩種口香糖之間以及在唾液A和B之間沒有鑒別到差異。因此，在唾液A中，當咀嚼含有POs Ca的口香糖時，其Ca/P比約4倍于當咀嚼不含POs Ca的口香糖時的Ca/P比。
接著，對于12個受檢者的被處理牙齒的補充礦質(zhì)促進效果的評估結(jié)果以損傷深度和礦物質(zhì)流失值顯示于圖20A(垂直軸表示損傷深度(Ld，μm))和圖20B(垂直軸表示礦物質(zhì)流失值ΔZ(v％·μm))。在兩個圖中，水平軸以空白、含有POs Ca的口香糖、和不含POs Ca的口香糖的次序表示。根據(jù)損傷深度(Ld)和礦物質(zhì)流失值(ΔZ)，觀察到在含有POs Ca的口香糖的情況下比不含POs Ca的口香糖的情況下脫礦質(zhì)的牙齒釉質(zhì)的恢復明顯。即，在含有POs Ca的口香糖的咀嚼組中，獲得了補充礦質(zhì)的促進效果(p＜0.001)。
(實施例17)實施例17顯示在人的口腔中，含有磷酸化寡糖的口香糖對釉質(zhì)的補充礦質(zhì)的促進效果。
與實施例13相似，制備了兩種片狀的口香糖(約1.5g/片)，即含有POs Ca口香糖和不含POs Ca無糖口香糖。所有使用的試驗試劑是保證試劑。
從牛切牙的齒冠部的釉質(zhì)部分制備釉質(zhì)片(直徑5mm；厚度1.5mm)。頰面的頭部表面用濕潤的研磨砂紙(粒度800)磨光以暴露出新鮮而平刨的釉質(zhì)。這樣制備的釉質(zhì)片在37℃浸沒于100ml的0.1M乳酸溶液(pH 5.0)3天以產(chǎn)生人造齲齒。脫礦質(zhì)后，三個釉質(zhì)片附著在一個可移動的腭板的上部右側(cè)磨牙的腭區(qū)。
12名健康的受檢者(6名男性和6名女性；平均年齡＝21歲)一次咀嚼2片含有POsCa的口香糖、不含POs Ca的口香糖，或蔗糖口香糖(含62％的蔗糖)(1粒約1.5g)20分鐘。在這一測試中，每個受檢者咀嚼其中的一種口香糖一天4次。沒有告知負責該測試的人以及受檢者正在咀嚼的口香糖的類型。對于每一種口香糖，該測試一直進行2周。在各個測試之間有一周的間隔時間。在口香糖咀嚼的過程中或之后，腭板被附著20分鐘。在測試期間，受檢者沒有使用氟劑并且分離的腭板在100％濕度下儲存，避免干燥。
1、2和4周后，測試的附著的牙齒從各個受檢者的腭板上除去。從各個釉質(zhì)上切厚度約為200μm的切片。各個切片進行顯微放射照相(PW-1830，Philips，荷蘭)。顯微放射照相的條件如下管電壓25kV；管電流25mA；管和受檢者之間的距離為370mm。此后，用Inaba等的圖象定量方法測定損傷深度(ld，μm)(Eur.J.Oral.Sci.10574-84，1997)。Ld的值根據(jù)礦物質(zhì)分布圖作為從牙齒頭部表面到損傷位置之間的距離而確定，在損傷的位置中礦物質(zhì)含量達到健康組織礦物質(zhì)含量的95％水平。補充礦質(zhì)的比率計算為與脫礦質(zhì)后初始ld值有關的ld值的縮減比。補充礦質(zhì)的結(jié)果顯示于圖21。在圖21中，水平軸以周1、周2和周4的次序表示蔗糖口香糖組(Suc)，不含POs Ca的口香糖組(Xyl)，和含有POs Ca的口香糖組(POs)。垂直軸表示補充礦質(zhì)的比率(％)。
在含有POs Ca的口香糖組(POs)中，周1、周2和周4時補充礦質(zhì)的比率分別為67％、54％和76％。不含POs Ca的口香糖組(Xyl)是12到23％，該值低于含有POsCa的口香糖組。蔗糖口香糖組(Suc)截止到周2顯示正的補充礦質(zhì)的比率，而截止到周4最終達到負值，表明脫礦質(zhì)。
人的口腔內(nèi)評估顯示在含有POs Ca的口香糖的情況下比在不含POs Ca的口香糖和蔗糖口香糖的情況下具有較高的補充礦質(zhì)促進效果。具體地說，所有的12名受檢者咀嚼各種口香糖各兩周并在含有POs Ca的口香糖的情況下獲得顯著的結(jié)果。因此，通過人的口腔內(nèi)評估證實向口香糖中加入POs Ca導致高水平的補充礦質(zhì)促進效果。同時，在口腔中還證實通過在基本上每天的基礎上食用含有POs Ca的口香糖產(chǎn)品，增強早期齲齒補充礦質(zhì)的作用，因此非常有效地預防齲齒。
(實施例18)在實施例18中，分析了當攝入含有磷酸化寡糖的糖果時唾液的成分。
制備含有如圖10中描述的成分的糖果。
表10糖果 (％按重量計)Palatinit 95POs Ca 2.94調(diào)味劑 2.064個健康的成人受檢者食用糖果(4.7g)并收集分泌的唾液。糖果放入口中后在口腔中停留約10分鐘。在如下4個時間段收集唾液(i)0-1分鐘；(ii)1-3分鐘；(iii)3-6分鐘；和(iv)6-10分鐘。通過漏斗收集分泌的唾液進入15ml的試管。收集后，立即攪拌分泌的唾液，并測定唾液的pH和含量。結(jié)果顯示于圖22和23中。在圖22中，水平軸表示攝入時間(min)，垂直軸表示pH?？谇恢型僖旱膒H恒定為7。圖23中，水平軸表示攝入時間(min)，垂直軸表示唾液的量(ml/min)。分泌的唾液的量在攝入時間過程中基本上恒定。
而后，1800μl的唾液放入4個離心管中。200μl的1N HCl溶液加入各個管中?；旌弦撼浞只旌希S后在10,000xg離心3分鐘，并使之通過0.5μm膜。用OCPC方法測定10μl獲得的上清液以確定鈣含量。使用鉬方法測定50μl的上清液以確定磷含量。鈣和磷含量顯示于圖24中。在圖24中，水平軸表示攝入時間(min)，左邊的垂直軸表示鈣或磷含量(mM)，右邊的垂直軸表示Ca/P比。在攝入時間過程中，鈣和磷含量基本恒定(保持在約0.6)。
(實施例19)實施例19中，制備含有磷酸化寡糖的糖果和軟糖以確定補充礦質(zhì)促進效果。
依據(jù)通常使用的方法制備表11中所顯示的含有這些成分的糖果(4.7g/粒)和軟糖(4.0g/粒)。
表11糖果(％按重量計)Palatinit 95POs-Ca 2.94調(diào)味劑 2.06軟糖(％按重量計)Palatinit 47.5木糖醇 47.5POs-Ca 2.94調(diào)味劑 2.0610ml蒸餾水加入各個上述糖果或軟糖中，并在沸水浴中溶解。使用微型pH儀測定得到的提取溶液的pH。此后，提取溶液在10,000xg離心3分鐘并通過0.5μm膜。用OCPC方法測定10μl獲得的上清液以確定鈣濃度。使用釩鉬酸方法測定50μl的上清液溶液以確定無機磷濃度。結(jié)果顯示于表12中。
表12軟糖和糖果的提取物中Ca和P的礦物質(zhì)含量產(chǎn)物Ca(mM) P(mM) Ca/P軟糖3.88 1.822.13糖果5.18 2.142.42而且，基于表12的結(jié)果分析，調(diào)整2倍和10倍稀釋的提取液具有鈣和磷的含量顯示于表13中。此后，評估對羥磷灰石的補充礦質(zhì)促進效果。
表13用于促進補充礦質(zhì)作用的評估系統(tǒng)3.0mM CaCl2溶液1.8mM KH2PO4溶液20mM HEPES緩沖液(pH 7.0)(0.5mg/ml羥磷灰石)結(jié)果顯示于圖24中。在圖24中，水平軸表示攝入時間(min)，左邊的垂直軸表示鈣或磷含量(mM)，右邊的垂直軸表示Ca/P比。
在糖果或軟糖中，10倍稀釋的溶液顯示了高水平的補充礦質(zhì)促進效果。
(實施例20)用通常使用的方法制備含有顯示于表14中的組合物的潔牙劑。
表14

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例21)用通常使用的方法制備含有顯示于表15中的組合物的潔牙劑。
表15

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例22)用通常使用的方法制備含有顯示于表16中的組合物的潔牙劑。
表16

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例23)用通常使用的方法制備含有顯示于表17中的組合物的潔牙劑。
表17

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例24)用通常使用的方法制備含有顯示于表18中的組合物的潔牙劑。
表18

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例25)用通常使用的方法制備含有顯示于表19中的組合物的潔牙劑。
表19

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例26)用通常使用的方法制備含有顯示于表20中的組合物的潔牙劑。
表20

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例27)用通常使用的方法制備含有顯示于表21中的組合物的潔牙劑。除1N氫氧化鋅溶液用于中和外，POs Zn以與實施例2中相同的方式制備。
表21

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例28)用通常使用的方法制備含有顯示于表22中的組合物的潔牙劑。
表22

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例29)用通常使用的方法制備含有顯示于表23中的組合物的漱口劑。
表23

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例30)用通常使用的方法制備含有顯示于表24中的組合物的漱口劑。
表24

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例31)用通常使用的方法制備含有顯示于表25中的組合物的漱口劑。
表25

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例32)用通常使用的方法制備含有顯示于表26中的組合物的漱口劑。
表26

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例33)用通常使用的方法制備含有顯示于表27中的組合物的漱口劑。除1N氫氧化鋅溶液用于中和外，POs Zn以與實施例2中相同的方式制備。
表27

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例34)用通常使用的方法制備含有顯示于表28中的組合物的口腔軟膏。
表28

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例35)用通常使用的方法制備含有顯示于表29中的組合物的口腔軟膏。
表29

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例36)用通常使用的方法制備含有顯示于表30中的組合物的潔牙劑。
表30

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例37)用通常使用的方法制備含有顯示于表31中的組合物的潔牙劑。
表31

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例38)用通常使用的方法制備含有顯示于表32中的組合物的潔牙劑。
表32

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例39)用通常使用的方法制備含有顯示于表32中的組合物的潔牙劑。
表33

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例40)用通常使用的方法制備含有顯示于表34中的組合物的潔牙劑。
表34

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例41)用通常使用的方法制備含有顯示于表35中的組合物的潔牙劑。
表35

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例42)用通常使用的方法制備含有顯示于表36中的組合物的潔牙劑。
表36

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例43)用通常使用的方法制備含有顯示于表37中的組合物的潔牙劑。
表37

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例44)用通常使用的方法制備含有顯示于表38中的組合物的潔牙劑。
表38

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例45)用通常使用的方法制備含有顯示于表39中的組合物的漱口劑。
表39

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例46)用通常使用的方法制備含有顯示于表40中的組合物的漱口劑。
表40

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例47)用通常使用的方法制備含有顯示于表41中的組合物的漱口劑。
表41

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例48)用通常使用的方法制備含有顯示于表42中的組合物的漱口劑。
表42

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例49)用通常使用的方法制備含有顯示于表43中的組合物的漱口劑。
表43

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例50)用通常使用的方法制備含有顯示于表44中的組合物的口腔軟膏。
表44

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例51)用通常使用的方法制備含有顯示于表45中的組合物的口腔軟膏。
表45

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例52)用通常使用的方法制備含有顯示于表46中的組合物的潔牙劑。
表46

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例53)用通常使用的方法制備含有顯示于表47中的組合物的潔牙劑。
表47

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例54)用通常使用的方法制備含有顯示于表48中的組合物的潔牙劑。
表48

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例55)用通常使用的方法制備含有顯示于表49中的組合物的潔牙劑。
表49

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例56)用通常使用的方法制備含有顯示于表50中的組合物的潔牙劑。
表50

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例57)用通常使用的方法制備含有顯示于表51中的組合物的潔牙劑。
表51

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例58)用通常使用的方法制備含有顯示于表52中的組合物的潔牙劑。
表52

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例59)用通常使用的方法制備含有顯示于表53中的組合物的潔牙劑。
表53

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例60)用通常使用的方法制備含有顯示于表54中的組合物的潔牙劑。
表54

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例61)用通常使用的方法制備含有顯示于表55中的組合物的漱口劑。
表55

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例62)用通常使用的方法制備含有顯示于表56中的組合物的漱口劑。
表56

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例63)用通常使用的方法制備含有顯示于表57中的組合物的漱口劑。
表57

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例64)用通常使用的方法制備含有顯示于表58中的組合物的漱口劑。
表58

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例65)用通常使用的方法制備含有顯示于表59中的組合物的漱口劑。
表59

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例66)用通常使用的方法制備含有顯示于表60中的組合物的口腔軟膏。
表60

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例67)用通常使用的方法制備含有顯示于表61中的組合物的口腔軟膏。
表61

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例68)用通常使用的方法制備含有顯示于表62中的組合物的潔牙劑。
表62

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例69)用通常使用的方法制備含有顯示于表63中的組合物的潔牙劑。
表63

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例70)用通常使用的方法制備含有顯示于表64中的組合物的潔牙劑。
表64

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例71)用通常使用的方法制備含有顯示于表65中的組合物的潔牙劑。
表65

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例72)用通常使用的方法制備含有顯示于表66中的組合物的潔牙劑。
表66

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例73)用通常使用的方法制備含有顯示于表67中的組合物的潔牙劑。
表67

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例74)用通常使用的方法制備含有顯示于表68中的組合物的潔牙劑。
表68

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例75)用通常使用的方法制備含有顯示于表69中的組合物的潔牙劑。
表69

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例76)
用通常使用的方法制備含有顯示于表70中的組合物的潔牙劑。
表70

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例77)用通常使用的方法制備含有顯示于表71中的組合物的漱口劑。
表71

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例78)用通常使用的方法制備含有顯示于表72中的組合物的漱口劑。
表72

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例79)用通常使用的方法制備含有顯示于表73中的組合物的漱口劑。
表73

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例80)用通常使用的方法制備含有顯示于表74中的組合物的漱口劑。
表74

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例81)用通常使用的方法制備含有顯示于表75中的組合物的漱口劑。
表75

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例82)用通常使用的方法制備含有顯示于表76中的組合物的口腔軟膏。
表76

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例83)用通常使用的方法制備含有顯示于表77中的組合物的口腔軟膏。
表77

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例84)用通常使用的方法制備含有顯示于表78中的組合物的潔牙劑。
表78

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例85)用通常使用的方法制備含有顯示于表79中的組合物的潔牙劑。
表79

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例86)用通常使用的方法制備含有顯示于表80中的組合物的潔牙劑。
表80

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例87)用通常使用的方法制備含有顯示于表81中的組合物的潔牙劑。
表81

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例88)用通常使用的方法制備含有顯示于表82中的組合物的潔牙劑。
表82

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例89)用通常使用的方法制備含有顯示于表83中的組合物的潔牙劑。
表83

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例90)用通常使用的方法制備含有顯示于表84中的組合物的潔牙劑。
表84

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例91)用通常使用的方法制備含有顯示于表85中的組合物的潔牙劑。
表85

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例92)用通常使用的方法制備含有顯示于表86中的組合物的潔牙劑。
表86

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例93)用通常使用的方法制備含有顯示于表87中的組合物的漱口劑。
表87

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例94)用通常使用的方法制備含有顯示于表88中的組合物的漱口劑。
表88

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例95)用通常使用的方法制備含有顯示于表89中的組合物的漱口劑。
表89

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例96)用通常使用的方法制備含有顯示于表90中的組合物的漱口劑。
表90

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例97)用通常使用的方法制備含有顯示于表91中的組合物的漱口劑。
表91

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例98)用通常使用的方法制備含有顯示于表92中的組合物的口腔軟膏。
表92

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例99)用通常使用的方法制備含有顯示于表93中的組合物的口腔軟膏。
表93

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例100)用通常使用的方法制備含有顯示于表94中的組合物的潔牙劑。
表94

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例101)用通常使用的方法制備含有顯示于表95中的組合物的潔牙劑。
表95

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例102)用通常使用的方法制備含有顯示于表96中的組合物的潔牙劑。
表96

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例103)用通常使用的方法制備含有顯示于表97中的組合物的潔牙劑。
表97

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例104)用通常使用的方法制備含有顯示于表98中的組合物的潔牙劑。
表98

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例105)用通常使用的方法制備含有顯示于表99中的組合物的潔牙劑。
表99

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例106)用通常使用的方法制備含有顯示于表100中的組合物的潔牙劑。
表100

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例107)用通常使用的方法制備含有顯示于表101中的組合物的潔牙劑。
表101

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例108)用通常使用的方法制備含有顯示于表102中的組合物的潔牙劑。
表102

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例109)用通常使用的方法制備含有顯示于表103中的組合物的漱口劑。
表103

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例110)用通常使用的方法制備含有顯示于表104中的組合物的漱口劑。
表104

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例111)用通常使用的方法制備含有顯示于表105中的組合物的漱口劑。
表105

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例112)用通常使用的方法制備含有顯示于表106中的組合物的漱口劑。
表106

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例113)用通常使用的方法制備含有顯示于表107中的組合物的漱口劑。
表107

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例114)用通常使用的方法制備含有顯示于表108中的組合物的口腔軟膏。
表108

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例115)用通常使用的方法制備含有顯示于表109中的組合物的口腔軟膏。
表109

使用這種組合物可獲得滿意的抗齲齒功能。
(實施例116)用通常使用的方法制備含有顯示于表110中的組合物的人造唾液。
表110(mg)氯化鈉 42.2氯化鉀 60氯化鈣 7.3氯化鎂 2.6磷酸二氫鉀 17.1POs Ca 20總量(ml) 50該人造唾液具有極好的補充礦質(zhì)促進效果和使口腔中的pH恢復到中性的能力。
(實施例117)用通常使用的方法制備含有顯示于表111中的組合物的人造唾液。
表111(mg)氯化鈉 42.2氯化鉀 60POs Ca 10氯化鎂 2.6磷酸二氫鉀 17.1總量(ml) 50該人造唾液具有極好的補充礦質(zhì)促進效果和使口腔中的pH恢復到中性的能力。
人造唾液可類似地通過加入除POs Ca和POs Na外的緩沖劑制備。
工業(yè)適用性如上所述，本發(fā)明提供了通過牙齒補充礦質(zhì)等減少齲齒的發(fā)生的膳食組合物和口腔組合物。
權利要求
1.一種具有抗齲齒功能的膳食組合物，其特征在于，所述組合物包括在口腔中具有pH緩沖作用的緩沖劑。
2.如權利要求1所述的膳食組合物，其特征在于，所述緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇。
3.如權利要求1所述的膳食組合物，其特征在于，所述緩沖劑選自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接；硫酸軟骨素；硫酸軟骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
4.如權利要求1所述的膳食組合物，其特征在于，所述緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接。
5.如權利要求1所述的膳食組合物，其特征在于，所述緩沖劑是呈堿金屬鹽、堿土金屬鹽、或鐵鹽的形式。
6.如權利要求5所述的膳食組合物，其特征在于，所述緩沖劑是呈鈉鹽或鈣鹽的形式。
7.如權利要求1所述的膳食組合物，其特征在于，所述組合物進一步包含有效量的氟或用于抗齲齒的含氟物質(zhì)。
8.一種具有抗齲齒功能的膳食組合物，其特征在于，所述組合物包含在口腔中具有pH緩沖作用的緩沖劑、磷-鈣補償劑、磷制劑、和/或鈣制劑。
9.如權利要求8所述的膳食組合物，其特征在于，所述緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇。
10.如權利要求8所述的膳食組合物，其特征在于，所述緩沖劑選自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接；硫酸軟骨素；硫酸軟骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
11.如權利要求8所述的膳食組合物，其特征在于，所述緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接。
12.如權利要求8所述的膳食組合物，其特征在于，所述緩沖劑是呈堿金屬鹽、堿土金屬鹽、或鐵鹽的形式。
13.如權利要求12所述的膳食組合物，其特征在于，所述緩沖劑是呈鈉鹽或鈣鹽的形式。
14.如權利要求8所述的膳食組合物，其特征在于，所述組合物進一步包含有效量的氟或用于抗齲齒的含氟物質(zhì)。
15.一種具有抗齲齒功能的口腔組合物，其特征在于，所述組合物包括在口腔中具有pH緩沖作用的緩沖劑。
16.如權利要求15所述的口腔組合物，其特征在于，所述緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇。
17.如權利要求15所述的口腔組合物，其特征在于，所述緩沖劑選自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接；硫酸軟骨素；硫酸軟骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
18.如權利要求15所述的口腔組合物，其特征在于，所述緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接。
19.如權利要求15所述的口腔組合物，其特征在于，所述緩沖劑是呈堿金屬鹽、堿土金屬鹽、鋅鹽或鐵鹽的形式。
20.如權利要求19所述的口腔組合物，其特征在于，所述緩沖劑是呈鈉鹽、鈣鹽、或鋅鹽的形式。
21.如權利要求15所述的口腔組合物，其特征在于，所述組合物進一步包含有效量的氟或用于抗齲齒的含氟物質(zhì)。
22.如一種具有抗齲齒功能的口腔組合物，其特征在于，所述組合物包含在口腔中具有pH緩沖作用的緩沖劑、磷-鈣補償劑、磷制劑、和/或鈣制劑。
23.如權利要求22所述的口腔組合物，其特征在于，所述緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇。
24.如權利要求22所述的口腔組合物，其特征在于，所述緩沖劑選自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接；硫酸軟骨素；硫酸軟骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
25.如權利要求22所述的口腔組合物，其特征在于，所述緩沖劑是磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4鍵的3-5個葡萄糖組成的葡聚糖，其中一個磷酸基團與葡聚糖連接，或是由具有α-1，4鍵的2-8個葡萄糖組成的葡聚糖，其中兩個磷酸基團與葡聚糖連接。
26.如權利要求22所述的口腔組合物，其特征在于，所述緩沖劑是呈堿金屬鹽、堿土金屬鹽、鋅鹽或鐵鹽的形式。
27.如權利要求26所述的口腔組合物，其特征在于，所述緩沖劑是呈鈉鹽、鈣鹽、或鋅鹽的形式。
28.如權利要求22所述的口腔組合物，其特征在于，所述組合物進一步包含有效量的氟或用于抗齲齒的含氟物質(zhì)。
29.一種用于研究預期對牙齒具有抗齲齒作用的樣品的補充礦質(zhì)效果的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟在樣品存在的情況下，使含有磷、鈣、和牙齒成分的溶液進行鈣沉淀反應；沉淀反應后，測定溶液中鈣的濃度或沉淀的鈣的量；在不含樣品的情況下，使溶液進行鈣沉淀反應；沉淀反應后，測定溶液中鈣的濃度或沉淀的鈣的量；和比較步驟(B)和(D)中溶液中鈣的濃度或沉淀的鈣的量。
30.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述溶液含有羥磷灰石、緩沖液、KH2PO4和CaCl2。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗齲齒功能的膳食組合物和口腔組合物。本發(fā)明提供具有抗齲齒功能的膳食組合物和口腔組合物，該組合物包含在口腔中具有pH緩沖作用的緩沖劑。
文檔編號A61K8/60GK1501774SQ02805648
公開日2004年6月2日 申請日期2002年2月28日 優(yōu)先權日2001年2月28日
發(fā)明者釜阪寬, 西村隆久, 戶尾健二, 栗木隆, 岡田茂孝, 阪本禮一郎, 木村敏幸, 魚津伸夫, 一郎, 久, 二, 夫, 孝, 幸 申請人:江崎格力高株式會社