專利名稱：生物活性提高的人促紅細(xì)胞生成素的Fc融合蛋白的制作方法
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素(EPO)是30.4千道爾頓的糖蛋白激素，其促進(jìn)紅細(xì)胞祖細(xì)胞的增生并維持它們分化成成熟的紅細(xì)胞(參見，如Krantz，Blood，77419-434，1991)。EPO在成年人的腎和胎兒的肝中產(chǎn)生。在成年人中，EPO主要是腎細(xì)胞應(yīng)答缺氧或貧血而產(chǎn)生的，并在血流中循環(huán)。EPO靶向幾乎只在骨髓紅細(xì)胞祖細(xì)胞表面上的66kDa的特異性受體(EPO-Rc)。與EPO結(jié)合后，受體被激活，并發(fā)生同源二聚化，隨后發(fā)生酪氨酸磷酸化。隨后，發(fā)生一系列細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而增加祖細(xì)胞的數(shù)量，并促進(jìn)祖細(xì)胞成熟成紅細(xì)胞(參見，如Lodish等人，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.，6093-104，1995)。
重組人EPO(rHuEPO)已廣泛應(yīng)用于在晚期和透析前階段因腎病引起的慢性貧血患者的治療中。施用EPO也已成功治療了患者由癌癥的化療、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、HIV感染的AZT治療和骨髓發(fā)育不良綜合癥所引起的貧血。
正常人血清中的EPO濃度為約0.01到0.03單位/ml。補(bǔ)充EPO是一種理想的對EPO產(chǎn)生減少的腎衰竭的治療方法。靜脈內(nèi)注射(i.v.)的rHuEPO的血清清除半衰期約為4到13小時。皮下注射(s.c.)rHuEPO的血清最高濃度為注射后的5到24小時，清除半衰期為17小時。因此，相同劑量皮下注射比靜脈內(nèi)注射在血液中能有更長的保留時間。血清清除EPO的機(jī)制依舊不明。在動物試驗(yàn)中，腎排泄了5％都不到。而能迅速除去唾液基(asialated)的EPO的肝，未顯示在清除EPO中起主要作用(參見，如Fried，Annu.Rev.Nutr.15353-377，1995)。
IgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)。它們的半衰期可高達(dá)21天。已有報道說將IgG的Fc區(qū)域與其它蛋白質(zhì)(如各種細(xì)胞因子和可溶性受體)結(jié)合而形成融合蛋白(參見，如Capon等人，Nature，337525-531，1989；Chamow等人，Trends Biotechnol.，1452-60，1996；美國專利No.5,116,964和5,541,087)。原型融合蛋白是通過IgG Fc絞鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基連接的同源二聚體蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)類似于IgG分子但無CH1區(qū)域和輕鏈。由于結(jié)構(gòu)上的同源，F(xiàn)c融合蛋白表現(xiàn)出與類似同種型的人IgG相當(dāng)?shù)捏w內(nèi)藥物動力學(xué)特性。這種方法已用于一些臨床上很重要的細(xì)胞因子(如IL-2和IFN-α2a)和可溶性受體(如TNF-Rc和IL-5-Rc)(參見，如美國專利No.5,349,053和6,224,867)。為了延長EPO的循環(huán)半衰期和/或增加它的生物活性，通過如本發(fā)明所公開的和/或所述那樣，制造含有與人IgG蛋白質(zhì)的Fc區(qū)域相連的EPO的融合蛋白是有利的。
在大部分已報道的Fc融合蛋白分子中，絞鏈區(qū)作為Fc區(qū)域與細(xì)胞因子或可溶性受體(氨基末端)間的間隔，使這分子的這兩部分功能分開(參見，如Ashkenazi等人，Current Opinion in Immunology，9195-200，1997)。相對于EPO單體，由兩個完整EPO功能域(所述功能域被3-或7-氨基酸肽接頭分隔開)構(gòu)成的融合蛋白顯示減弱的活性(Qiu等，J.Biol.Chem.，27311173-11176，1998)。然而，當(dāng)兩個EPO結(jié)構(gòu)域之間的肽接頭長達(dá)17個氨基酸時，二聚體EPO分子顯示體外和體內(nèi)活性客觀的增強(qiáng)。已顯示在小鼠中增強(qiáng)的活性是由于體外活性的增加，并且該活性具有不同的藥物動力學(xué)特性(參見，如Sytkowski等人，J.Biol.Chem.，27424773-24778，1999；美國專利號6,187,564)。在人EPO和Fc部分間帶有合適肽接頭的人EPO融合蛋白(HuEPO-L-Fc)比rHuEPO的活性高，HuEPO-L-Fc的體外活性至少是rHuEPO的2倍(以摩爾計)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在人EPO和人IgG Fc變體間添加的肽接頭以兩種方式提高HuEPO-L-Fc的體外生物活性(1)使Fc區(qū)域遠(yuǎn)離EPO上的EPO-Rc結(jié)合位點(diǎn)，和(2)使一個EPO遠(yuǎn)離另一個EPO結(jié)構(gòu)域，從而使兩個EPO區(qū)域能分別與紅細(xì)胞樣細(xì)胞祖細(xì)胞上的EPO-Rc反應(yīng)。對本發(fā)明而言，優(yōu)選長度約為20個或更少氨基酸的柔性肽接頭。優(yōu)選使用包含兩個或多個選自以下氨基酸的肽接頭甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。
人免疫球蛋白的Fc區(qū)域在消滅病原體的免疫防御中起重要作用。IgG的效應(yīng)子功能由Fc介導(dǎo)而通過兩種主要機(jī)制(1)與細(xì)胞表面Fc受體(FcγRs)的結(jié)合，導(dǎo)致通過抗體-依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)途徑，由殺傷細(xì)胞通過吞噬作用或裂解作用而攝食病原體，或(2)與第一補(bǔ)體成分C1的C1q部分的結(jié)合，引發(fā)依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)途徑，從而裂解病原體。在四種人IgG同種型中，IgG1和IgG3能有效地結(jié)合FcγR。IgG4與FcγR的結(jié)合親和力比IgG1或IgG3的低一個數(shù)量級，而IgG2與FcγR的結(jié)合低得難以測定。人IgG1和IgG3還能有效地結(jié)合C1q，并激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)。人IgG2對補(bǔ)體的固定很弱，而IgG4似乎在激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的能力方面很有缺陷(參見，如Jefferis等人，Immunol.Rev.，16359-76，1998)。對應(yīng)用于人的治療而言，當(dāng)HuEPO-L-Fc結(jié)合于紅細(xì)胞樣細(xì)胞祖細(xì)胞表面上的EPO-Rc時，融合蛋白的Fc區(qū)域必須不能有不良效應(yīng)子功能，因此不會裂解或除去這些祖細(xì)胞。因此，HuEPO-L-Fc的Fc區(qū)域必須是非裂解性的，即結(jié)合于FcγRs和C1q從而觸發(fā)效應(yīng)子功能方面，F(xiàn)c區(qū)域必須是無活性的。顯然，沒有一種天然的IgG同種型適合產(chǎn)生HuEPO-L-Fc融合蛋白。為了得到非裂解性的Fc，必須使天然Fc區(qū)域中的一些氨基酸突變，以減少其效應(yīng)子功能。
通過比較人和鼠的IgG同種型的氨基酸序列，已顯示，CH2區(qū)域N末端附近的Fc部分在IgG Fc與FcγRs的結(jié)合中起作用。已用基因工程抗體證明在234位到237位基序的重要性(參見，如Duncan等人，Nature，332563-564，1988)。氨基酸殘基編號是按Kabat等人所述的EU編號體系(《SEQUENCESof PROTEINS of IMMUNOLOGICAL INTEREST》，第5版，United StatesDepartment of Health and Human Services，1991)。在四種人IgG同種型中，IgG1和IgG3與FcγRs的結(jié)合最好，且具有相同的序列Leu234-Leu-Gly-Gly237(

圖1僅顯示了IgG1)。在以低親和力與FcγRs結(jié)合的IgG4中，其序列含有單個氨基酸取代，即在234位上Phe取代Leu。在不結(jié)合FcγRs的IgG2中，有兩個取代和一個缺失，從而形成Val234-Ala-Gly237(圖1)。為了減少Fc與FcγR的結(jié)合和ADCC活性，用Ala替代IgG4中的Leu235(參見，如Hutchins等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9211980-11984，1995)。在此基序中已用IgG2序列中的Pro233-Val-Ala235替代Glu233-Leu-Leu235來改變IgG1。這種替代使IgG1變體在小鼠中失去了FcγR-介導(dǎo)的除去靶細(xì)胞的能力(參見，如Isaacs等人，J.Immunol.，1613862-3869，1998)。
對FcγR與C1q結(jié)合至關(guān)重要的第二部分位于人IgG的CH2區(qū)域羧基端附近(參見，如Duncan等人，Nature，332738-740，1988)。在四種人IgG同種型中，這部分中僅有一個位點(diǎn)顯示取代IgG4中的Ser330和Ser331替換了IgG1、IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331(圖1)。Ser330的存在不影響FcγR與C1q的結(jié)合。用Ser替代Pro331使IgG1失去了與C1q的結(jié)合親和力，而用Pro替代Ser331部分保留了IgG4的補(bǔ)體固定活性(參見，如Tao等人，J.Exp.Med.，178661-667，1993；Xu等人，J.Biol.Chem.，2693469-3474，1994)。
我們發(fā)現(xiàn)，可以設(shè)計至少三種Fc變體(vFc)用于產(chǎn)生HuEPO-L-vFc融合蛋白(圖1)。人IgG2不結(jié)合FcγR，但顯示出弱的補(bǔ)體活性。具有Pro331Ser突變的Fcγ2變體應(yīng)比天然Fcγ2的變體活性更低，而且仍舊不結(jié)合于FcγR。IgG4Fc在激活補(bǔ)體級聯(lián)中有缺陷，且它與FcγR的結(jié)合親和力比活性最高的同種型(IgG1)低約一個數(shù)量級。與天然Fcγ4相比，具有Leu235Ala突變的Fcγ4變體應(yīng)表現(xiàn)出最小的效應(yīng)子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的Fcγ1也表現(xiàn)出比天然Fcγ1低得多的效應(yīng)子功能。這些Fc變體都比天然存在的人IgG Fc更適于制備EPO融合蛋白。在非裂解Fc的制備中也可引入其它替換，而不危及循環(huán)半衰期或?qū)е虏涣嫉臉?gòu)型變化。
本發(fā)明有許多優(yōu)點(diǎn)。血清中HuEPO-L-vFc融合蛋白增高的活性和存在時間的延長，能減低劑量以及減少注射的頻率。血清中藥物濃度波動的減少以意味著安全性和耐受性的改善。注射頻率的減低能使患者有更好的順應(yīng)性和生活質(zhì)量。因此具有非裂解Fc變體的HuEPO-L-vFc融合蛋白能顯著地有助于治療包括腎衰竭、癌癥化療、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、HIV感染的AZT治療和脊髓發(fā)育不良綜合征等病況導(dǎo)致的貧血。
發(fā)明簡述本發(fā)明的一方面涉及一種HuEPO-L-vFc融合蛋白。這種HuEPO-L-vFc融合蛋白含有人EPO、肽接頭(以L表示)和人IgG Fc變體(以vFc表示)。較佳地，使用約20或更小氨基酸長度的柔性肽接頭，該肽接頭含有2個或多個以下氨基酸甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。IgG Fc變體是非裂解性的，且與天然IgG Fc相比含有氨基酸突變。
本發(fā)明的另一實(shí)施例為人Ig Fc，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。這種CH2區(qū)域在228、234、235和331位(由EU編號體系確定的位置)含有氨基酸突變，從而降低Fc的效應(yīng)子功能。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，公開了一種從哺乳動物細(xì)胞系如CHO衍生的細(xì)胞系制備或生產(chǎn)這種重組融合蛋白的方法。培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，使得重組融合蛋白在其生長培養(yǎng)基中在24小時期間以超過10(較佳地為30)μg/百萬細(xì)胞的水平下表達(dá)。這些HuEPO-L-vFc融合蛋白顯示出更高的生物活性和更長的血清半衰期而無不良副作用，從而改善了藥物動力學(xué)和藥效，進(jìn)而降低了實(shí)現(xiàn)類似藥效所需的劑量和注射次數(shù)。
附圖簡述圖1顯示了人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和它們變體的絞鏈區(qū)和CH2區(qū)域的氨基酸序列的比對。比較這三個部分氨基酸區(qū)域228、234-237和330-331。用粗斜體顯示這些變體的氨基酸突變。將EU編號體系用于氨基酸殘基。
圖2顯示了分別在pEFP表達(dá)載體內(nèi)HindIII-EcoRI片段的(A)HuEPO-L-vFcγ2、(B)HuEPO-L-vFcγ4，和(C)HuEPO-L-vFcγ1的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。氨基酸殘基-27到-1是人EPO的前導(dǎo)肽。成熟蛋白含有人EPO(氨基酸殘基1到165)、肽接頭(氨基酸殘基166到181)和Fc變體(vFcγ2的氨基酸殘基182到409，vFcγ4的氨基酸殘基182到410，和vFcγ1的氨基酸殘基182到408)。在Fc區(qū)域中，粗體的核苷酸和相應(yīng)的氨基酸變體還用下劃線標(biāo)出。
發(fā)明詳述1.構(gòu)建編碼HuEPO-L-vFcγ2融合蛋白的基因融合蛋白是用數(shù)個DNA片段裝配而成的。為了獲得編碼人EPO的前導(dǎo)肽和成熟蛋白的基因，用人胎肝或腎的cDNA文庫(從Invitrogen，Carlsbad，CA獲得)作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板。為了便于克隆，將引入限制性酶內(nèi)切位點(diǎn)(HindIII)的SEQ ID NO1用作5’寡核苷酸的引物。表1列出了用于克隆HuEPO-L-vFc融合蛋白的寡核苷酸序列。3’引物(SEQ ID NO2)除去了EPO末端密碼子并引入了BamHI位點(diǎn)。將得到的長度約為600bp的DNA片段插入到接受載體(如pUC19)的HindIII和BamHI位點(diǎn)，得到pEPO質(zhì)粒。由DNA測序驗(yàn)證人EPO基因的序列。
用從人白細(xì)胞制備的RNA和合適的5’(SEQ ID NO3)和3’(SEQ ID NO4)引物，通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR得到編碼人IgG2的Fc區(qū)域(Fcγ2)的基因。將得到的含有IgG2的絞鏈、CH2和CH3區(qū)域完整序列的Fcγ2的DNA片段作為模板，產(chǎn)生Fcγ2Pro331Ser(vFcγ2)變體，其中Fcγ2中331位的Pro被Ser替代。為了引入此突變，產(chǎn)生兩個片段，然后用天然Fcγ2作為模板在重疊PCR中將它們裝配起來。用SEQ ID NO3作為5’引物并用SEQ ID NO5作為3’引物生成5’片段。用SEQ ID NO6作為5’引物并用SEQ ID NO4作為3’引物生成3’片段。然后用SEQ ID NO7作為5’引物和SEQ ID NO4作為3’引物，將這兩個片段在覆蓋Pro331Ser突變的區(qū)域連接起來。SEQ ID NO7引物含有編碼16氨基酸Gly-Ser肽接頭(包括BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))的序列。將得到的長度約為700bp的DNA片段插入接受載體(如pUC19)的BamHI和EcoRI位點(diǎn)，得到pL-vFcγ2質(zhì)粒。用DNA測序驗(yàn)證該基因的序列。
為了制備HuEPO-L-vFcγ2融合基因，用HindIII和BamHI從pEPO質(zhì)粒上切下EPO片段，然后用瓊脂糖凝膠電泳純化。然后將純化的片段插入pL-vFcγ2質(zhì)粒肽接頭的5’末端，得到pEPO-L-vFcγ2質(zhì)粒。該融合基因含有HuEPO、Gly-Ser肽接頭和Fcγ2變體基因。
在EPO和Fc部分間存在的肽接頭，增加了EPO區(qū)域的柔性，因而提高了其生物活性(見例如Sytkowski等，J.Biol.Chem.27424773-8，1999)。對本發(fā)明而言，優(yōu)選的是長度為約20個或更少氨基酸的肽接頭。可使用含有2個或更多選自以下氨基酸的肽接頭甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。一種肽接頭的例子含有Gly-Ser肽構(gòu)件，如GlyGlyGlyGlySer。圖2A顯示了融合基因，它含有編碼HuEPO序列、16個氨基酸的肽接頭(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly GlySerGLyGlyGlyGlySer)和Fcγ2Pro331Ser變體的序列。
然后將編碼HuEPO-L-vFc融合蛋白的完整基因插入哺乳動物表達(dá)載體如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位點(diǎn)。最終的表達(dá)載體質(zhì)粒(稱為pEFP2)含有在哺乳動物細(xì)胞中高水平表達(dá)所需的巨細(xì)胞病毒早期基因啟動子-增強(qiáng)子。該質(zhì)粒還含有可選擇性標(biāo)記基因，從而在細(xì)菌中賦予氨芐青霉素抗性，而在哺乳動物細(xì)胞中賦予G418抗性。另外，當(dāng)宿主細(xì)胞DHFR基因表達(dá)缺陷時，pEFP2表達(dá)載體含有二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，從而能在氨甲蝶呤(MTX)存在下共擴(kuò)增HuEPO-L-vFγ2融合基因和DHFR基因(見例如美國專利No.4,399,216)。
2.編碼HuEPO-L-vFcγ4融合蛋白的基因的構(gòu)建由于絞鏈區(qū)域中重鏈間二硫鍵的解離，人IgG4部分會形成被視為半抗體的分子。而這種情況在其它三種人IgG同種型中卻沒有觀察到。用Pro(在IgG1和IgG2中的該位置發(fā)現(xiàn)的殘基)替代Ser228的單氨基酸取代，導(dǎo)致IgG4完整的抗體分子(參見，如Angal等人，Molec.Immunol.，30105-108，1993；Owens等人，Immunotechnology，3107-116，1997；美國專利No.6,204,007)。含有Leu235Ala突變以降FcR結(jié)合的Fcγ4變體，加上Ser228Pro突變，也會產(chǎn)生這種同型的融合蛋白制備物。
用從人白細(xì)胞制備的RNA和合適的5’引物(SEQ ID NO8)和3’引物(SEQID NO9)，通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR得到編碼人IgG4的Fc區(qū)域(Fcγ4)的基因。將得到的含有IgG4的絞鏈、CH2和CH3區(qū)域完整序列的Fcγ4的DNA片段作為模板，產(chǎn)生Ser228Pro和Leu235Ala突變的Fcγ4變體(vFcγ4)，其中Ser228和Leu235分別被Pro和Ala替代。用3’引物(SEQ ID NO9)和含有Leu235Ala突變的5’引物(SEQ ID NO10)擴(kuò)增CH2和CH3區(qū)域。用SEQ ID NO12作為5’引物和SEQ ID NO9作為3’引物，在PCR中將這種擴(kuò)增的片段與合成的長度為60個堿基且含Ser228Pro和Leu235Ala突變的寡核苷酸(SEQ ID NO11)連接起來。SEQ ID NO12引物含有編碼16氨基酸Gly-Ser肽接頭(包括BamHI位點(diǎn))的序列。將得到的長度約為700bp的DNA片段插入接受載體(如pUC19)的BamHI和EcoRI位點(diǎn)，得到pL-vFcγ4質(zhì)粒。用DNA測序驗(yàn)證該基因的序列。
為了制備HuEPO-L-vFcγ4融合基因，用HindIII和BamHI從pEPO質(zhì)粒上切下HuEPO片段，然后插入pL-vFcγ4質(zhì)粒肽接頭的5’末端，得到pEPO-L-vFcγ4質(zhì)粒。此融合基因含有HuEPO、16個氨基酸的Gly-Ser肽接頭和Fcγ4變體基因，然后將其插入哺乳動物表達(dá)載體如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位點(diǎn)(如HuEPO-L-vFcγ2融合蛋白所述)。將這種最終表達(dá)的載體質(zhì)粒命名為pEFP4。圖2B顯示了融合基因，它含有編碼HuEPO、16個氨基酸的肽接頭(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)、和具有Ser228Pro和Leu235Ala突變的Fcγ4變體的融合基因。
3.構(gòu)建編碼HuEPO-L-vFcγ1融合蛋白的基因人IgG1重鏈的絞鏈區(qū)域含有包括3個半胱氨酸的15個氨基酸殘基(GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysPro)。在這3個半胱氨酸殘基中，第2和第3個參與兩個重鏈間二硫鍵的形成。第1個半胱氨酸殘基參與與IgG輕鏈的二硫鍵結(jié)合。由于Fc融合蛋白分子中不存在輕鏈，該半胱氨酸殘基可能與其它半胱氨酸殘基配對，而導(dǎo)致非特異性二硫鍵合?？梢詫cγ1的絞鏈區(qū)域切短，以消除第1個半胱氨酸殘基(AspLysThrHisThrCysProProCysPro)。用從人白細(xì)胞制備的RNA和合適的5’引物(SEQ ID NO13)和3’引物(SEQID NO4)，通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR得到編碼Fcγ1區(qū)域的基因。將得到的含有Fcγ1截短的絞鏈區(qū)域和CH2及CH3完整序列的DNA片段用作模板，產(chǎn)生具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的Fcγ1變體(vFcγ1)。
一種引入這些突變的方法如下產(chǎn)生兩個片段，然后用天然Fcγ1作為模板在重疊PCR中將它們裝配起來。用SEQ ID NO14作為5’引物并用SEQ IDNO5作為3’引物生成5’片段。此5’引物含有Leu234Val、Leu235Ala突變，3’引物含有Pro331Ser突變。用SEQ ID NO6作為5’引物并用SEQ ID NO4作為3’引物生成3’片段。然后用SEQ ID NO14作為5’引物和SEQ ID NO4作為3’引物，將5’和3’片段在覆蓋Pro331Ser突變的區(qū)域連接起來。用SEQ IDNO16作為5’引物、SEQ ID NO4作為3’引物，通過PCR將此擴(kuò)增的長度約650bp的片段和合成的55堿基的寡核苷酸(SEQ ID NO15)(含有Leu234Val和Leu235Ala)連接起來。SEQ ID NO16引物含有編碼16個氨基酸Gly-Ser肽接頭(包括BamHI位點(diǎn))的序列。將得到的長度約為700bp的DNA片段插入接受載體(如pUC19)的BamHI和EcoRI位點(diǎn)，得到pL-vFcγ1質(zhì)粒。用DNA測序驗(yàn)證該基因的序列。
為了制備HuEPO-L-vFcγ1融合基因，用HindIII和BamHI從pEPO質(zhì)粒上切下EPO片段，然后插入pL-vFcγ1質(zhì)粒肽接頭的5’末端，得到pEPO-L-vFcγ1質(zhì)粒。此融合基因含有HuEPO，16個氨基酸Gly-Ser肽接頭和Fcγ1變體基因，然后將其插入哺乳動物表達(dá)載體如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位點(diǎn)(如對HuEPO-L-vFcγ2融合蛋白所述)。將這種最終表達(dá)的載體質(zhì)粒命名為pEFP1。圖2C顯示了融合基因，它含有編碼HuEPO、16個氨基酸肽接頭(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)、和具有Ser234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的Fcγ1變體的融合基因。
4.在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中融合蛋白的表達(dá)將重組pEFP1、pEFP2或pEFP4表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入哺乳動物宿主細(xì)胞系，以表達(dá)HuEPO-L-vFc融合蛋白。為了穩(wěn)定高水平的表達(dá)，優(yōu)選的宿主細(xì)胞系是DHFR酶缺陷的CHO細(xì)胞(參見，例如美國專利No.4,818,679)。一種優(yōu)選的轉(zhuǎn)染方法是電穿孔。也可以使用其它方法，包括磷酸鈣共沉淀、脂轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)融合。在電穿孔中，用設(shè)置為250V電場和960μFd電容的Gene PulserElectroporator(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，在比色杯內(nèi)的2-5×107個細(xì)胞中加入10μg用BspCI線性化的質(zhì)粒DNA。在轉(zhuǎn)染2天后，將培養(yǎng)基改成含0.18mg/ml G418的生長培養(yǎng)基。用抗人IgG Fc ELISA，測試對選定藥物具有抗性的轉(zhuǎn)染子是否分泌融合蛋白。也可用抗-HuEPO試驗(yàn)，通過ELISA進(jìn)行表達(dá)的融合蛋白的定量分析。通過在96孔板上極限稀釋，亞克隆產(chǎn)生高水平Fc融合蛋白的孔。
為了實(shí)現(xiàn)融合蛋白較高水平的表達(dá)，宜用受MTX藥物抑制的DHFR基因進(jìn)行共擴(kuò)增。在含有遞增濃度MTX的生長培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染的融合蛋白基因與DHFR基因共擴(kuò)增。能在高達(dá)1μg/ml MTX培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)染子，再次通過極限稀釋法進(jìn)行亞克隆。通過測定分泌率，對亞克隆的細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步的分析。分泌率水平超過約10(較佳地約30)μg/106(即百萬)個細(xì)胞/24小時的細(xì)胞系，適合使用無血清生長培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)。然后用條件培養(yǎng)基純化融合蛋白。
糖側(cè)鏈結(jié)構(gòu)對于EPO的體內(nèi)活性是關(guān)鍵的。Asn-連接的碳水化合物的末端糖鏈含有唾液酸，重復(fù)的聚-N-乙酰乳糖酰胺和半乳糖。已知在一些哺乳動物細(xì)胞，例如NS0細(xì)胞中表達(dá)的重組HuEPO，得到的是具有低唾液酸含量的蛋白質(zhì)。除去唾液酸會導(dǎo)致暴露次末的半乳糖殘基，這提高了肝脫唾液酸糖蛋白結(jié)合性凝集素的親和力。該捕獲途徑導(dǎo)致在整個動物內(nèi)測量的體內(nèi)生物活性下降。在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的重組HuEPO顯示與天然EPO中發(fā)現(xiàn)的非常相似的糖基化模式(見例如Takeuchi等，Proc.Nat l.Acad.Sci.USA867819-22，1989)。根據(jù)本發(fā)明表達(dá)和生產(chǎn)的HuEPO-L-vFc融合蛋白，當(dāng)與rHuEPO基于摩爾比較時，顯示出更高的生物活性。
5.融合蛋白的純化和定性用1N NaOH將含有融合蛋白的條件培養(yǎng)基滴定到pH7到8，然后用0.45微米的硝酸纖維素過濾器過濾。將濾液加樣到磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)平衡的Prosep A柱上。待融合蛋白結(jié)合于Prosep A后，棄去流穿組分。用PBS洗滌該柱，直到280nm處的OD值低于0.01。然后用0.1M pH3.75的檸檬酸緩沖液洗脫結(jié)合的融合蛋白。用0.4體積的1M K2HPO4中和，合并含有純化蛋白的組分，并用PBS透析。然后溶液用0.22微米的硝酸纖維素過濾器過濾，并存儲在4℃。在非還原條件下，由SDS-PAGE測得純化的HuEPO-L-vFc蛋白質(zhì)的分子量范圍為110到130kDa。在還原條件下，純化的蛋白遷移至約60kDa。用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)，通過BCA蛋白質(zhì)分析定量該融合蛋白。
6.體外生物分析可測定轉(zhuǎn)染子的上清液或純化蛋白質(zhì)刺激TF-1細(xì)胞的增殖能力(Kitamura等，J.Cell.Physiol.，140323-334，1989)。TF-1細(xì)胞天然在細(xì)胞表面表達(dá)EPO-Rc，并對EPO反應(yīng)。將細(xì)胞維持在生長培養(yǎng)基(RPMI-1640培養(yǎng)基，含有10％FCS和1-5ng/ml人IL-5)。收集對數(shù)期的TF-1細(xì)胞，并用分析培養(yǎng)基洗滌(不含人IL-5的生長培養(yǎng)基)。將每份共1×104個細(xì)胞的TF-1樣品(50μl)加到96孔組織培育板的各孔中。用50μl含有0.01-100nM各種濃度HuEPO-L-vFc融合蛋白或rHuEPO對照的分析培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細(xì)胞。在37℃、5％CO2濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)該平板4天，然后在各孔中添加10μl MTT(用PBS配制成2.5mg/ml)。然后在各孔中添加10μl MTT(用PBS配制成2.5g/ml)。4小時后，在每孔中加入100μl 10％SDS的0.01N HCl，以溶解細(xì)胞和Formazan。然后在550nm對該平板進(jìn)行讀數(shù)，其中參考光束設(shè)為690nm。OD讀數(shù)相對于rHuEPO或融合蛋白的濃度作圖。S形曲線的拐點(diǎn)表示產(chǎn)生50％最大效果(ED50)的濃度。因此可定量地比較HuEPO-L-vFc相對于rHuEPO的生物活性。較佳地，按摩爾計，重組融合蛋白應(yīng)表現(xiàn)出比rHuEPO高至少2倍的活性。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，HuEPO-L-vFc融合蛋白的比活力范圍約為6-8×106單位/μmol，而rHuEPO約為3-4×106單位/μmol。
也可測試轉(zhuǎn)染子上清液或純化蛋白懸浮液刺激人骨髓祖細(xì)胞增生和分化形成紅血細(xì)胞集落(集落形成單位-紅細(xì)胞樣細(xì)胞(CFU-E))的能力。方法如下。洗滌用Ficoll-Pague離心的人骨髓的低密度細(xì)胞，并以1×106細(xì)胞/ml懸浮在含有5％FCS的Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)中。在37℃和5％CO2下，將這些細(xì)胞在組織培育皿中培養(yǎng)過夜，以除去所有粘附的細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)。然后將懸浮液中的細(xì)胞調(diào)節(jié)成1×105細(xì)胞/ml含5％FCS的IMDM?；旌?.3ml細(xì)胞、15微升20μg/ml干細(xì)胞因子、2.4ml甲基纖維素和0.3ml含數(shù)種濃度HuEPO-L-vFc(或rHuEPO對照)的培養(yǎng)基，以便分析。將1ml這種細(xì)胞混合物置于35-mm培養(yǎng)皿上。然后將此培養(yǎng)皿置于37℃、5％CO2中保持10-14天，然后計數(shù)集落量。與rHuEPO的濃度相對，可以對HuEPO-L-vFc濃度作劑量反應(yīng)曲線圖。
7.大鼠中體內(nèi)藥物動力學(xué)研究通過尾靜脈進(jìn)行靜脈注射或通過皮下注射，將100單位的rHuEPO或HuEPO-L-vFc融合蛋白注射入平均體重約為500g的Fisher大鼠(HarlanBioproducts for Science，Indianapolis，IN)。注射相同體積的PBS作為對照。注射后，在不同時間點(diǎn)(0、0.2、1、4、24、48、96和168小時)通過眶后放血法采集一系列0.5ml的樣品。每個時間點(diǎn)3只大鼠。將全血收集在含有抗凝劑的試管中，除去細(xì)胞，并在-70℃冷凍血漿直到進(jìn)行分析。
將血漿樣品用于TF-1細(xì)胞分析，測定EPO-介導(dǎo)的細(xì)胞增殖的活性。在96孔培育板的各孔中加入每50μl總計為1×104細(xì)胞的樣品。用50μl含有各種濃度滴定過的血液樣品的分析培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細(xì)胞。將平板在37℃、5％CO2濕潤培養(yǎng)箱中放置4天。用10μl MTT(用PBS配的2.5mg/ml溶液)染色活細(xì)胞。4小時后，每孔加入100μl 10％SDS的0.01N HCl溶液以溶解細(xì)胞和Formazan。然后在550nm讀取該平板(參考光束是690nm)。將血清樣品的活性對時間點(diǎn)作圖，以計算循環(huán)時間。HuEPO-L-vFc的活性比rHuEPO對照的降低慢許多，表明大鼠中融合蛋白的半衰期更長。
以上實(shí)施例僅起說明的作用。不能也不應(yīng)將它們視為對本發(fā)明范圍或精神的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解對于本發(fā)明的目的而言，可使用其它變化或替代形式，而本發(fā)明的目的僅由本說明書和所附權(quán)利要求書定義。
表1.寡核苷酸序列SEQ ID NO15′-cccaagcttggcgcggagatgggggtgca-3′SEQ ID NO25′-cggatccgtcccctgtcctgcaggcct-3′SEQ ID NO35′-gagcgcaaatgttgtgtcga-3′SEQ ID NO45′-ggaattctcatttacccggagacaggga-3′SEQ ID NO55′-tggttttctcgatggaggctgggaggcct-3′SEQ ID NO65′-aggcctcccagcctccatcgagaaaacca-3′SEQ ID NO75′-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagagcgcaaatgttgtgtcga-3′SEQ ID NO85′-gagtccaaatatggtccccca-3′SEQ ID NO9
5′-ggaattctcatttacccagagacaggga-3′SEQ ID NO105′-cctgagttcgcggggggacca-3′SEQ ID NO115′-gagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcgcggggggacca-3′SEQ ID NO125′-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagagtccaaatatggtccccca-3′SEQ ID NO135′-gacaaaactcacacatgccca-3′SEQ ID NO145′-acctgaagtcgcggggggaccgt-3′SEQ ID NO155′-gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagtcgcggggggaccgt-3′SEQ ID NO165′-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagacaaaactcacacatgccca-3′
權(quán)利要求
1.一種重組HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白含有人EPO、肽接頭和人IgG Fc變體。
2.如權(quán)利要求1所述的重組HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的肽接頭含有約20個或更少的氨基酸，該肽接頭存在于人EPO和人IgG Fc變體之間；且所述的肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的重組HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgG Fc變體為含有Pro331Ser突變的人IgG2的絞鏈、CH2和CH3區(qū)域。
4.如權(quán)利要求1或2所述的重組HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgG Fc變體為含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4的絞鏈、CH2和CH3區(qū)域。
5.如權(quán)利要求1或2所述的重組HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgG Fc變體為含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgG1的絞鏈、CH2和CH3區(qū)域。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述的重組HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的HuEPO-L-vFc融合蛋白顯示在摩爾基礎(chǔ)上比rHuEPO高至少2倍的體外生物活性。
7.一種CHO衍生的細(xì)胞系，其特征在于，所述的細(xì)胞系在其生長培養(yǎng)基中在每24小時期間內(nèi)，產(chǎn)生超過10μg/百萬個細(xì)胞的如權(quán)利要求1-6任一所述的HuEPO-L-vFc融合蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的CHO-衍生的細(xì)胞系，其特征在于，在生長培養(yǎng)基中，在每24小時期間內(nèi)，產(chǎn)生超過30μg/百萬個細(xì)胞的HuEPO-L-vFc融合蛋白。
9.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的HuEPO-L-vFc融合蛋白的CHO-衍生的細(xì)胞系的方法，其特征在于，其中人IgG Fc變體含有選自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的絞鏈、CH2和CH3區(qū)域，且IgG Fc含有降低效應(yīng)子功能的氨基酸突變。在人EPO和人IgG Fc變體間存在含有約20個或更少氨基酸的柔性肽接頭，且HuEPO-L-vFc融合蛋白的特性為且表現(xiàn)出在摩爾基礎(chǔ)上比rHuEPO高至少兩倍的體外生物活性。
10.一種制備含有人EPO、柔性肽接頭和人IgG Fc變體的重組融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)生成CHO衍生的細(xì)胞系；(b)在重組融合蛋白在其生長培養(yǎng)基中在每24小時期間內(nèi)表達(dá)超過10μg/百萬個細(xì)胞的條件下，培養(yǎng)這種細(xì)胞系；和(c)純化步驟(b)表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中重組融合蛋白顯示體外生物活性在摩爾基礎(chǔ)上至少比rHuEPO提高2倍。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，在人EPO和人IgG Fc變體間存在含有約20或更少個氨基酸的柔性肽；且所述的柔性肽接頭含有2個或多個選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的人IgG Fc變體為含有包括Pro331Ser突變的人IgG2的絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的人IgG Fc變體為含有包括Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4的絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的人IgG Fc變體為含有包括Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgG1的絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。
15.如權(quán)利要求10、11、12、13和14任一所述的方法，其特征在于，在所述的步驟(b)中每24小時期間內(nèi)每百萬細(xì)胞表達(dá)超過30μg蛋白。
16.一種制備含有人EPO、柔性肽接頭和人IgG Fc變體的重組融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)生成CHO衍生的細(xì)胞系；(b)用讓重組融合蛋白在其生長培養(yǎng)基中在每24小時期間內(nèi)表達(dá)超過10μg/百萬個細(xì)胞的條件下，培養(yǎng)這種細(xì)胞系；和(c)純化步驟中(b)表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中重組融合蛋白的特征為且表現(xiàn)出提高的體外生物活性，其體外生物活性在摩爾基礎(chǔ)至少是rHuEPO的2倍；其中在人EPO和人IgG Fc變體間存在含有約20個或更少氨基酸的柔性肽接頭；和柔性肽接頭含有2個或多個選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸；和其中人IgG Fc變體含有選自以下的人IgG的絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域Pro331Ser突變的人IgG2；Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4；和Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgG1。
全文摘要
本文公開了一類在摩爾基礎(chǔ)上，生物活性比rHuEPO更高的人EPO的Fc融合蛋白。這類HuEPO－L－vFc融合蛋白含有人EPO、約20個或更少氨基酸的柔性肽接頭、和人IgG Fc變體。這種Fc變體無裂解性，且顯示極小的不良Fc－介導(dǎo)的副作用。本文還公開了一種高表達(dá)水平制備或產(chǎn)生這類融合蛋白的方法。這類HuEPO－L－vFc融合蛋白表現(xiàn)出血清半衰期延長，且生物活性增加，從而改善藥物動力學(xué)和藥效，因此在一段時間內(nèi)所需的注射次數(shù)較少。
文檔編號A61K38/00GK1403483SQ02126838
公開日2003年3月19日 申請日期2002年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月17日
發(fā)明者金宜慧, 孫乃超, 周若蕓 申請人:旭華(上海)生物研發(fā)中心有限公司