專利名稱：改良型豬肺炎支原體菌苗疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請要求2000年12月19日申請的共同未決臨時申請序號60/256,637的優(yōu)先權(quán)，所述臨時申請的完整公開內(nèi)容特此通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)針對豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)的保護性免疫的改良方法，具體地說，在一個劑量內(nèi)使用有效免疫接受動物對抗豬肺炎支原體感染的滅活豬肺炎支原體菌苗。
背景技術(shù)：
豬肺炎支原體是豬支原體肺炎的病原體。該疾病導(dǎo)致重量增量降低和喂養(yǎng)效率降低，是養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟損失的重要原因。該疾病導(dǎo)致持續(xù)幾周的持續(xù)性咳嗽、被毛失去光澤、生長遲緩和外觀不壯實。在感染動物尤其是在腹頂端和心葉觀察到特征性病變紫色到灰色實變區(qū)。雖然該疾病的死亡率低，但受感染的豬常常易于受到機會病原體的二次感染，從而導(dǎo)致死亡或應(yīng)激。每年的經(jīng)濟損失估計在2億到2.5億美元之間。
豬肺炎支原體是生長緩慢、沒有細胞壁、難培養(yǎng)的細菌。由于呼吸道內(nèi)還存在一種常見的第二種病原體豬鼻支原體(Myoplasmahyorhinis)，因此常常難以從呼吸道中分離豬肺炎支原體。該疾病通過咳嗽產(chǎn)生的飛沫以及與感染或恢復(fù)期的病原攜帶豬直接接觸而傳播。感染動物和未感染動物混居導(dǎo)致早期和頻繁的再感染。感染通常開始于攜帶病原的母豬下仔時感染小豬。由于豬群集中管理技術(shù)的影響，感染在生命后期用才變得明顯。當斷乳后把豬集中起來時，通常發(fā)生其它感染。在六周齡或更大的豬常常觀察到明顯的疾病。感染豬的生長率和飼料轉(zhuǎn)化率顯著降低。使用抗生素治療昂貴并且需要長期使用。再感染也是一個問題。目前疫苗是避免感染及其影響的最有效方法。
Fort Dodge Animal Health(FDAH)銷售豬肺炎支原體菌苗，名為SuvaxynRespifendMH，用作保護健康的豬對抗豬肺炎支原體引起的臨床體征的疫苗。該疫苗含有佐劑Carbopol，推薦作為兩劑疫苗用于至少一周齡大的豬，在第一次免疫后兩到三周給予第二劑。然而，兩劑量疫苗有明顯的缺陷，即為了提供對抗疾病的完全保護，需要第二次處理動物。
因此，本發(fā)明的一個目標是提供對抗豬肺炎支原體的有效疫苗，該疫苗通過單劑量給予，引發(fā)保護性免疫，預(yù)防其引起的疾病。
本發(fā)明的另一個目標是提供適用于豬的對抗豬肺炎支原體所引起的感染和疾病的疫苗組合物，所述疫苗組合物可以與其它菌苗和/或類毒素聯(lián)合使用。
本發(fā)明的再一個目標是提供預(yù)防或緩解其致病微生物是豬肺炎支原體的疾病的方法，該方法利用增強所述菌苗的免疫原性的佐劑制劑，以便在給予一劑所述疫苗后引發(fā)保護性免疫。
本發(fā)明的其它目的和特點將由下面的詳細描述而變得明顯。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及用于免疫動物以對抗豬肺炎支原體感染的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含免疫量的滅活豬肺炎支原體菌苗；佐劑混合物，所述佐劑混合物包括丙烯酸聚合物以及可代謝油和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物；藥學上可接受的載體，所述疫苗組合物在單劑給予后，引發(fā)針對豬肺炎支原體的保護性免疫。
另一方面，本發(fā)明提供用于免疫動物以對抗豬肺炎支原體感染的免疫原性組合物，所述組合物包含滅活豬肺炎支原體菌苗和上述佐劑混合物以及藥學上可接受的穩(wěn)定劑、載體或稀釋劑劑。所述佐劑在該疫苗組合物內(nèi)的最終濃度通常約1-25％(v/v)，優(yōu)選約5-12％(iv/v)。所述組合物也可以包括其它疫苗成分，包括來自一種或多種病原體的滅活菌苗或純化類毒素，所述病原體例如副豬嗜血菌(Haemonphilus parasuis)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multiocida)、豬鏈球菌(Streptococcum suis)、大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)和鉤端螺旋體(leptospira)，可以通過肌內(nèi)途徑、皮下途徑、口服途徑、噴霧劑途徑或鼻內(nèi)途徑給予所述組合物。
又一方面，本發(fā)明提供保護動物以對抗豬肺炎支原體所引起的疾病的方法，該方法給予單劑包含滅活豬肺炎支原體菌苗和所述佐劑混合物的上述疫苗。
發(fā)明詳述本文引用的所有專利、專利申請和其它文獻特此通過引用完整地結(jié)合到本文中。如有不一致，以本公開內(nèi)容為準。
本文所用“菌苗”是這樣一種細菌收獲物所述細菌收獲物已經(jīng)被滅活，當其與某種佐劑組合后給予動物時，能夠引發(fā)保護性免疫以對抗疾病或感染。
“佐劑”指包含一種或多種物質(zhì)的組合物，所述物質(zhì)增強疫苗組合物內(nèi)豬肺炎支原體菌苗的免疫原性和功效。
本說明書和權(quán)利要求內(nèi)使用的術(shù)語MHDCE指豬肺炎支原體DNA細胞等同物。
“免疫量”指提供針對豬肺炎支原體的免疫的菌苗量。“免疫量”取決于物種、品種、年齡、大小、健康狀態(tài)以及動物之前是否接受過對抗同樣病原體的疫苗。
本發(fā)明提供適于單劑接種的對抗豬肺炎支原體的疫苗。本發(fā)明的疫苗包括增強所述菌苗的免疫原性的佐劑混合物，因此一次給予就引發(fā)保護性免疫。
可以通過本領(lǐng)域內(nèi)的標準方法從新鮮收獲的培養(yǎng)物制備所述疫苗(例如，見美國專利5,338,543或美國專利5,565,205，以及下面的實施例2)。也就是說，可以在例如PPLO(胸膜肺炎樣生物)完全培養(yǎng)基[Difco].Laboratories]的培養(yǎng)基內(nèi)繁殖豬肺炎支原體。通過標準技術(shù)如測定色度變化單位(CCU)監(jiān)測所述豬肺炎支原體的生長，當達到足夠高的滴度后收獲。所述貯液在用于配制疫苗前，可以通過常規(guī)方法進一步濃縮或凍干?？梢允褂闷渌椒ǎ缭赥homas等，Agri-Practice，第7卷No.5，第26-30頁描述的那些方法。
本發(fā)明的疫苗包含滅活豬肺炎支原體菌苗、佐劑混合物以及一種或多種藥學上可接受的載體。適用的載體包括水性媒介，例如鹽水、磷酸鹽緩沖液、基本必需培養(yǎng)基(MEM)或用HEPES緩沖劑配制的MEM。
在本發(fā)明疫苗組合物中使用的佐劑混合物增強免疫反應(yīng)，所述佐劑混合物包括丙烯酸聚合物以及可代謝油和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物，所述可代謝油例如不飽和萜烯烴或其氫化產(chǎn)物，最好是角鯊?fù)?2，3，10，15，19，23-六甲基二十四烷)或角鯊烯。所述丙烯酸聚合物可以是均聚物或共聚物。所述丙烯酸聚合物最好是卡波姆?？ú房梢再I到，商品名為Carbopol。丙烯酸聚合物在例如美國專利2,909,462和3,790,665有介紹，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是表面活性劑，最好是液體表面活性劑，幫助懸浮固體和液體成分。所述表面活性劑可以作為聚合物買到，商品名為Pluronic。優(yōu)選表面活性劑是泊洛沙姆401，可以買到，商品名為PluronicL121。
本發(fā)明疫苗組合物中存在的免疫原性刺激佐劑混合物量(v/v)通常約1％到25％，優(yōu)選約2％到15％，更優(yōu)選約5％到12％。所述佐劑混合物的使用量以及所述佐劑內(nèi)兩種成分的比例將根據(jù)其它菌苗或純化類毒素的加入而變化。所述佐劑混合物一般包含可代謝油、丙烯酸聚合物以及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，在水性媒介內(nèi)配制成乳濁液。
在該佐劑混合物中，可代謝油的量約10到150ml/L，丙烯酸聚合物的量約0.5到10g/L。在所述佐劑混合物的優(yōu)選實施方案中，所述可代謝油以及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物是角鯊?fù)楹蚉luronicL121(泊洛沙姆401)的混合物，其量為約50到100ml/L，羧亞甲基聚合物是Carbopol 934P(Carbamer 934P)，其量為約2ml/L。一般所述佐劑混合物中丙烯酸聚合物與可代謝油/聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物混合物的比例是約1∶25到1∶50。
優(yōu)選丙烯酸聚合物是B.F Goodrich銷售的Carbopol 934 P NF和941 NF，它們是丙烯酸與聚烯丙基蔗糖的交聯(lián)聚合物，化學式為(CH2CHOOOH)n。這些聚合物形成水凝膠，適合用水性載體配制。優(yōu)選聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是BASF銷售的非離子表面活性劑PluronicL121、L61、L81或L101。
可以通過肌內(nèi)途徑、皮下途徑、鼻內(nèi)途徑、腹膜內(nèi)途徑或口服途徑給予本發(fā)明的疫苗，最好通過肌內(nèi)途徑或皮下途徑。
本發(fā)明的疫苗一般采取水包油乳劑的形式，包含滅活豬肺炎支原體、可代謝油、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物以及丙烯酸聚合物。所述疫苗最好包含濃度范圍0.5到10g/L的丙烯酸聚合物。所述疫苗最好包含濃度范圍2到6ml/L的可代謝油。所述疫苗最好包含濃度范圍1到3ml/L的聚氧乙烯-丙烯嵌段共聚物。
為用于單劑給予，所述疫苗應(yīng)當最好包含相當于約1×108到3×1011MHDCE/ml量的豬肺炎支原體菌苗，最好約1×109到3×109MHDCE/ml。肌內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)給予每只動物約1-5mL，最好2mL?？诜虮莾?nèi)給予1-10mL，最好2-5mL。
下面的實施例將進一步舉例說明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1疫苗組合物的豬肺炎支原體菌苗制備物病毒貯液描述?？梢詮亩喾N容易獲得的來源獲得豬肺炎支原體。在一個實施方案中，可以使用豬肺炎支原體P-5722-3株。所述培養(yǎng)物得自C.Armstrong，Purdue University，West Lafayette，Indiana。收到豬肺炎支原體培養(yǎng)物后，在豬肺炎支原體肉湯上傳代七次，建立母種。
細胞培養(yǎng)物。在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)豬肺炎支原體18-144小時，培養(yǎng)基含Bacto PPLO粉末、酵母提取物、葡萄糖、L-半胱氨酸鹽酸鹽、氨芐青霉素、乙酸鉈、酚紅、消泡劑、正常無菌豬血清和水。為進行滅活，將二吖丙啶(BEI)直接加入發(fā)酵容器內(nèi)的生產(chǎn)培養(yǎng)物。將pH調(diào)到7.4，然后按照常規(guī)程序收獲，獲得豬肺炎支原體菌苗。
制備疫苗組合物。
防腐劑組合物和使用的比例。加入不超過0.01％的硫柳汞和不超過0.07％的乙二胺四乙酸四鈉(EDTA)，保存所收獲的菌苗。所述生長培養(yǎng)基內(nèi)氨芐青霉素U.S.P.的濃度是0.250克/升。根據(jù)收獲液體的體積，最終產(chǎn)品中的殘余氨芐青霉素濃度將有變化，成品內(nèi)的殘余氨芐青霉素濃度不超過30ug/mL。
產(chǎn)品的標準化。通過DNA熒光測定定量支原體(Mycoplasma)濃縮物。
如下制備可代謝油(包含一種或多種萜烯烴)和聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物(如Squalane/Pluronic L121混合物)在900mL純化水內(nèi)溶解10g氯化鈉、0.25g氯化鉀、2.72磷酸氫二鈉、0.25磷酸二氫鉀、20mL Pluronic L121(BASF Corporation)、40mL Squalane(Kodak)、3.2mL Tween 80，然后定容到1000ml?；旌虾?，對所述成分進行高壓蒸汽滅菌。然后勻漿所述混合物，直到形成穩(wěn)定的乳濁液?？梢约尤敫栺R林達到0.2％的終濃度，或加入硫柳汞達到1∶10,000的終濃度。
組裝各個單位形成系列。無菌操作，將滿意的豬肺炎支原體濃縮物與所述佐劑、防腐劑和稀釋劑混合加入裝備有攪拌器的無菌容器，混合時間不少于30分鐘。
1,000,000個劑量(每劑量2mL)的量 ％v/v
該系列的pH調(diào)到7.0±0.2。
MHDCE＝豬肺炎支原體DNA細胞等同物裝瓶和封口最終容器的方法和技術(shù)。所述產(chǎn)物通過無菌200-500微米濾器元件總體過濾，在用于裝瓶操作的房間里按照9 CFR 114.6規(guī)定條件裝瓶進無菌的最終容器。用橡膠塞子封閉所述玻璃或塑料容器，并用鋁封條(aluminum seal)壓折封口。每個2.0mL劑量包含不少于2×109豬肺炎支原體DNA細胞等同物。
測試效力。如下測試成品的大量生產(chǎn)或最終容器樣品的效力效力測定方法使用Harlan Sprague Dawley或其它可接受供應(yīng)商的同批六到七周齡ICR雌性小鼠。用每種未知和參考菌苗接種需要至少20只小鼠。保留至少五只小鼠作為未接種對照。測試菌苗和參考菌苗各自完全混合。使用配有25號5/8英寸針頭的無菌一次性注射器，在小鼠腹股溝區(qū)皮下接種1/10宿主動物劑量(0.2mL)。每組小鼠在單獨的單位內(nèi)飼養(yǎng)，自由進食和飲水14天。然后麻醉每只小鼠。將麻醉的小鼠仰面放置。用一只手壓住小鼠頭部，使一只前腿從身體伸出。使用解剖刀在伸出的前腿和胸之間制造一個長約1/2英寸長的皮膚切口，切斷肱動脈。使用不帶針頭的3.0mL注射器，收集在切口匯集的血。將血排放入標記的試管，使其凝結(jié)。凝結(jié)的試管在1,000×g離心，從結(jié)塊分離血清。各個血清保存在-20℃或更冷，等待測試。
血清學測試使用ELISA程序測量小鼠對參考菌苗和/或未知菌苗的抗體反應(yīng)。使用得自Dynatech的Disposable Immulon II平底微量滴定板或其等同物以及ELISA讀板器進行所述ELISA程序。
測試試劑磷酸鹽緩沖鹽溶液-Tween(PBST)(用5N NaOH或5N HCl將pH調(diào)到7.2到7.4)。
每升含量
甘氨酸緩沖溶液(GBS)(用5N NaOH或5N HCl將pH調(diào)到9.5到9.7)
陽性對照血清陽性對照血清是來自用豬肺炎支原體菌苗接種的小鼠的血清的匯總。
綴合物和底物從Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.獲得親和純化的抗小鼠IgG過氧化物酶標記的綴合物(目錄號074-1802)。確定綴合物最佳稀釋度的程序如下。從Kirkegaard and Perry，Inc.獲得過氧化物酶底物溶液(ABTS)。
滴定綴合物用每孔100ul包被液包被Immulon II平底板，所述包被液每mL含20ug溶解于10mM GBS的豬肺炎支原體全細胞抗原。該板在37℃±2℃溫育一小時以上，然后轉(zhuǎn)移到2-7℃放置18小時以上、一周以下。使用前，該板用PBST洗滌三次，每次洗滌之間浸泡一分鐘，然后輕扣甩干。制備陽性對照血清在PBST中1∶40的稀釋物，將所述稀釋的陽性血清加入板上的一半孔中(100uL/孔)。在另一半孔內(nèi)加入PBST。該板在室溫下溫育一小時，然后洗滌三次。所述綴合的血清順序用PBST兩倍稀釋，從1∶100稀釋開始，直到1∶10,240稀釋度。在陽性血清的四個孔和PBST的四個孔內(nèi)加入各個綴合物稀釋度100ul，在室溫下反應(yīng)半小時。洗板四次，每孔加入100ul過氧化物酶底物溶液(abts)。在Tλ＝450的雙波長設(shè)置下讀板。從陽性對照血清值減去PBST對照的值，并選出陽性對照血清讀數(shù)在0.850到1.050之間的綴合物稀釋度。
測試抗原豬肺炎支原體抗原是全細胞制備物，由Fort Dodge Animal Health提供。
如下進行ELISA使用Dynatech Immulon II平底微量滴定板。用甘氨酸緩沖鹽溶液(GBS)重建一小管凍干的豬肺炎支原體全細胞抗原至10ml。重建的支原體蛋白濃度是20μg/mL。然后在板上的所有孔內(nèi)加入100μl(2μg)稀釋抗原。所述板在37℃±2℃溫育一小時以上，然后轉(zhuǎn)移到2-7℃放置18小時以上、一周以下。所述板用PBST洗滌三次，每次洗滌之間浸泡一分鐘，然后輕扣甩干。血清用PBST以1∶40稀釋。每塊板包括一式四份的陽性對照血清。每孔的樣品體積是100μl。在同一塊板上一式兩份地測定順序測試血清樣品和參考血清樣品。所述板在室溫溫育一小時，然后用PBST洗滌三次。所有孔內(nèi)加入100μl用PBST稀釋的抗鼠IgG過氧化物酶標記的綴合物(Kirkegaard and Perry)，所述孔在室溫下溫育30分鐘。用PBST洗滌板四次。在所有孔內(nèi)加入100μl過氧化物酶底物溶液(ABTS)，使機器針對PBST對照孔調(diào)空白，溫育板直到陽性血清對照達到0.850到1.050之間的OD405(450)。針對PBST孔調(diào)空白，讀板。為使測試有效，接種參考菌苗的小鼠的血清的平均值必須最小為0.500，未接種對照小鼠的血清的平均值必須最大不超過0.100?；蛘呓臃N參考菌苗的小鼠的血清的平均值與未接種對照小鼠的血清的平均值之間的差異必須大于或等于0.400。
如下計算和評價系列接種物、參考接種物和對照的平均值判定結(jié)果滿意的前提條件是測試菌苗必須顯示等于或大于參考的平均平均光密度值?；蛘撸鶕?jù)單側(cè)斯氏T檢驗，測試菌苗不能顯著低于參考菌苗(置信水平p≤0.05)。計算得到的任何等于或大于1.686的T值將指出參考和測試菌苗之間的顯著差異，從而導(dǎo)致拒絕測試菌苗。計算得到的任何小于1.686的T值將指出滿意的系列。由于任何與產(chǎn)品效力無關(guān)的原因被所述測試認為不滿意的任何測試菌苗都接受再測試，并認為最初的測試無效。
實施例2測試疫苗根據(jù)實施例1中詳細描述的程序制備用于測試的疫苗，每個劑量包含2×109豬肺炎支原體DNA細胞等同物(MHDCE)，使用5％的可代謝油(包括一種或多種萜烯烴)與聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物(角鯊?fù)?Pluronic L121混合物)以及0.2％丙烯酸聚合物(Carbopol)作為佐劑。
實施例3本研究設(shè)計用于證明用實施例2所述疫苗在三周齡單劑接種豬誘導(dǎo)四個月的免疫期(duration of immunity，DOI)。
本研究包括兩個獨立的動物試驗。兩個試驗內(nèi)所有的豬在接種時都是血清學陰性(抗體滴度＜10)，表明所有豬對豬肺炎支原體敏感。對照組內(nèi)的所有豬在攻擊前都保持血清學陰性。這表明在接受接種的豬體內(nèi)的免疫反應(yīng)是由所述疫苗引起，而不是由于任何環(huán)境暴露引起。
在第一個試驗中，通過高水平強毒豬肺炎支原體(4×106支原體)攻擊評估實施例2所述疫苗以及一種商業(yè)化產(chǎn)品Ingelvac M.hyo(由Boehringer Ingelheim(BI)生產(chǎn))。用實施例2所述疫苗肌內(nèi)(IM)接種18-21日齡的二十二(22)只豬，用Ingelvac M.hyo[serial 271 032]接種八(8)只豬。使用二十二(22)只豬作為攻擊對照，10只豬作為未攻擊對照。接種后四個月用強毒豬肺炎支原體攻擊接種組和攻擊對照組的豬。用實施例2所述疫苗接種的豬的平均肺病變是15.9％，攻擊對照組的平均肺病變是19.6％。盡管用比Iowa State University(ISU)推薦劑量更高的劑量攻擊豬，但用實施例2所述疫苗接種組的平均肺病變少于對照組，然而，該差異并不顯著(p＝0.19)。同樣的，當用相同攻擊劑量在同一組豬中評價商業(yè)化產(chǎn)品Ingelvac M.hyo時，也觀察到相似水平的肺病變(14.6％)。在Ingelvac M.hyo接種組和對照組之間(p＝0.27)，以及在Ingelvac M.hyo接種組和用實施例2所述疫苗接種的組之間，也沒有顯著差異。
在第二個試驗中，接種后四個月用ISU建議水平(1.0×106生物)的強毒豬肺炎支原體攻擊評價實施例2所述疫苗。在21日齡用一劑量所述疫苗接種二十三(23)只豬，25只豬作為攻擊對照，7只豬作為未攻擊對照。接種后四個月用強毒豬肺炎支原體攻擊在接種組和攻擊對照組內(nèi)的豬。對照組的平均肺病變是10.4％，接種組的平均肺病變是5.5％。在接種組和對照組之間有顯著差異(p＝0.031)。這表明實施例2所述疫苗有效刺激保護性免疫，這種保護性免疫在單劑量接種三周齡的豬后能夠持續(xù)至少四個月。
當合并并分析這兩個試驗中與實施例2所述疫苗有關(guān)的數(shù)據(jù)后，接種組的平均肺病變顯著低于對照組的平均肺病變。
總之，用實施例2所述疫苗單劑量接種三周齡豬四個月后誘導(dǎo)針對強毒豬肺炎支原體攻擊的保護性免疫。
實驗數(shù)據(jù)在本研究中進行兩個單獨的試驗。在試驗一，使用Microsoft Excel隨機化程序?qū)⒘?67)只豬分配為四個組。二十四(24)只豬在18-21日齡接受按照實施例2制備的一劑量疫苗的肌內(nèi)(IM)接種。二十四(24)只豬用作攻擊對照，10只豬用作未攻擊對照。用商業(yè)化產(chǎn)品Ingelvac M.hyo[serial 271 032，Boehringer Ingelheim(BI)]按照說明書的指導(dǎo)肌內(nèi)接種九只豬。五只豬(兩只豬用實施例2所述疫苗接種，一只豬用BI疫苗接種，兩只豬是對照)在接種保持期內(nèi)由于與接種無關(guān)的原因死亡。接種組和攻擊對照組的其它豬在接種后四個月接受14mL強毒豬肺炎支原體(1.4×106生物)的攻擊。攻擊后30天無痛苦處死所有四個組的豬，計數(shù)該試驗中每只豬的肺病變。
在第二個試驗中，二十五(25)只豬在21日齡接受一劑量按照實施例2制備的疫苗的肌內(nèi)接種。二十五(25)只豬用作攻擊對照，10只豬用作未攻擊對照。兩只豬由于與接種無關(guān)的原因死亡，一只豬在接種保持期內(nèi)被錯誤地賣掉。接種組和攻擊對照組內(nèi)剩余的豬在接種后四個月接受10mL強毒豬肺炎支原體(1.0×106生物)的攻擊。兩只豬在攻擊后的觀察期內(nèi)由于與接種/攻擊無關(guān)的原因死亡。攻擊后30天無痛苦處死所有所有三個組內(nèi)剩余的豬，計數(shù)該試驗中每只豬的肺病變。
接種接種組的每只豬在頸側(cè)肌內(nèi)接受一劑量2mL所述測試疫苗。
攻擊和尸體剖檢強毒豬肺炎支原體攻擊貯液是冰凍(-70℃)的肺勻漿物，由IowaState University(ISU)的Dr.Eileen Thacker制備。所述攻擊貯液經(jīng)證實是純的，每mL含約107豬肺炎支原體生物。推薦的攻擊劑量是10mL以1∶100稀釋的貯液(即1.0×106生物)。
第一個試驗中接種組和攻擊對照組內(nèi)的豬接受14ml以1∶100稀釋的貯液(即1.4×106生物)的攻擊。第二個試驗中的豬根據(jù)推薦接受10ml以1∶100稀釋的貯液(即1.0×106生物)的攻擊。
在攻擊的當天，在溫水中快速融化所述勻漿物，按照ISU的推薦用無菌豬肺炎支原體生長培養(yǎng)基稀釋。給予豬鎮(zhèn)靜劑，所述鎮(zhèn)靜劑是含50mg/mL Xylazine、50mg/mL Ketamine和100mg/mL Telazol的Xylazine-Ketamine-TelazolTM混合物。按照0.01-0.02mL/磅體重給予所述麻醉混合物。每只豬氣管內(nèi)接受一劑量14mL(第一個試驗)或10mL(第二個試驗)所述攻擊材料。為保證針頭位置正確，在給予攻擊劑量前用注射器抽氣。未接種的未攻擊對照豬飼養(yǎng)在單獨的房間內(nèi)，不進行攻擊。
攻擊后(DPC)30天，無痛苦處死所有豬。取出肺，由不了解試驗組的人員計數(shù)總肺病變。
樣品收集和測試在接種當天(0 DPV)、接種后一個月(1 MPV)、4 MPV/0 DPC和30 DPC，從所有豬收集血液樣品，使用競爭性ELISA試劑盒(由DAKOCo.制造)檢測抗豬肺炎支原體的血清抗體。所述血清樣品保存在-20℃直到測試。
數(shù)據(jù)分析通過方差分析(ANOVA)比較接種組和未接種組間的肺病變計數(shù)。將肺計數(shù)用反正弦函數(shù)轉(zhuǎn)化，以改善殘差分布(distribution ofresidual)。
結(jié)果和討論血清學使用商業(yè)化競爭性ELISA試劑盒測試兩個試驗中所有豬體內(nèi)抗豬肺炎支原體的血清抗體，其中所有測定使用1∶10的血清稀釋度。所有豬在接種時都是血清學陰性(抗體滴度＜10)，這表明所有豬都對豬肺炎支原體敏感。對照組的所有豬在攻擊前保持血清學陰性。這表明接種豬體內(nèi)的免疫反應(yīng)是由所述疫苗引起的，而不是任何環(huán)境暴露引起的。接種組內(nèi)所有的豬和攻擊對照組內(nèi)大部分豬(試驗一22只豬中的18只，試驗二25只豬中的15只)在攻擊后都轉(zhuǎn)化為對豬肺炎支原體呈血清學陽性，而所有未受攻擊的豬保持血清學陰性。這提示所述攻擊是豬肺炎支原體特異性的。測試豬的血清學狀態(tài)綜述于表1。
第一個試驗中的免疫原性測試進行第一個試驗以確定實施例2所述疫苗是否能夠刺激強的免疫性，所述免疫性能夠在接種后四個月保護豬，抵抗比ISU推薦水平更高水平的攻擊。本試驗還比較實施例2所述疫苗以及商業(yè)化Ingelvac M.hyo在接種后四個月刺激保護性免疫的能力。
二十二只豬用FDAH Suvaxyn MH-One接種，八只豬用注冊產(chǎn)品Ingelvac M.hyoserial 271,032接種，然后用每只豬1.4×106生物(ISU推薦每只豬1.0×106生物，見5.5小節(jié))的所述攻擊材料攻擊這些豬。二十二只豬用作攻擊對照，10只豬用作未攻擊對照。肺病變百分率綜述于表2。用實施例2所述疫苗接種的豬的平均肺病變是15.9％，攻擊對照組的平均肺病變是19.6％。甚至當用更高劑量豬肺炎支原體攻擊豬時，用實施例2所述疫苗接種的組的平均肺病變?nèi)陨儆趯φ战M。然而，該差異并不顯著(p＝0.19)。同樣的，當用相同攻擊劑量在同一組豬中評價商業(yè)化產(chǎn)品Ingelvac M.hyo時，也獲得相似水平的肺病變(14.6％)。在Ingelvac M.hyo接種組和對照組之間(p＝0.27)以及在Ingelvac M.hyo接種組和實施例2所述疫苗接種組之間(p＝0.88)沒有顯著差異。
雖然在接受實施例2的組中記錄到并不顯著的病變數(shù)量減少，但本試驗獲得的數(shù)據(jù)提示在本試驗中使用的更高攻擊劑量(1.4×106生物)可能太高，甚至對于商業(yè)化Ingelvac產(chǎn)品刺激的豬免疫也是如此。該攻擊水平可能并不適合于使用20-25只豬的組規(guī)模進行的接種/攻擊研究評價，雖然使用更大的組大小可能證明該顯著性。
第二個試驗中的免疫原性測試試驗二中接種組和攻擊對照組內(nèi)的豬在接種后四個月用ISU推薦的攻擊劑量(1.0×106生物)進行評價，以證明四個月的DOI。肺病變百分率綜述于表3。對照組的平均肺病變是10.4％。接種組的平均肺病變是5.5％。在接種組和對照組之間有顯著差異(p＝0.031)。這指出實施例2所述疫苗有效刺激保護性免疫，所述保護性免疫在用單劑量接種三周齡的豬后持續(xù)至少四個月。
評價兩個試驗的綜合結(jié)果雖然兩個試驗顯著不同，但組的試驗效應(yīng)不是顯著的。兩個試驗間組效應(yīng)的幅度相似。因此，可以在不考慮試驗的情況下評價組效應(yīng)。由于對完整模型的分析顯示組和試驗之間的相互作用不顯著，因此這支持兩個試驗中組效應(yīng)相同的觀點，并支持將兩個試驗的數(shù)據(jù)組合成單一分析。如此，當組合兩個試驗中與實施例2所述疫苗有關(guān)的數(shù)據(jù)，將組和試驗作為獨立變量，分析肺病變的反正弦轉(zhuǎn)化變量時(約化模式，reduced model)，組在統(tǒng)計學上是有意義的(p＝0.013)。
表1對照組和接種組的豬對豬肺炎支原體的血清學狀態(tài)小結(jié)試驗一陽性/陰性(1∶10)
試驗二陽性/陰性(1∶10)在
表2試驗一肺病變百分率小結(jié)(超劑量)*
*按每只豬1.4×106生物的劑量攻擊豬(ISU推薦的劑量是每只豬1.0×106生物)**FDAH疫苗組和對照之間的比較***BI疫苗組和對照組之間的比較****BI疫苗組和FDAH疫苗組之間的比較表3試驗二肺病變百分率小結(jié)(推薦劑量)
*按ISU推薦劑量攻擊豬(每只豬1.0×106生物)**FDAH疫苗組和對照之間的比較實施例4評價本發(fā)明疫苗組合物在單劑給予后六個月對毒力攻擊誘導(dǎo)的長期免疫性使用實施例1和2內(nèi)所述的基本相同的程序以及使用下面顯示的量，制備測試疫苗A。
測試疫苗A1,000,000劑的量(每劑量2mL) ％v/v
該系列的pH調(diào)到7.0±0.2。
MHDCE＝豬肺炎支原體DNA細胞等同物小結(jié)本評價包括三十三只21日齡的豬。二十只豬在三周齡接受一劑量疫苗A的肌內(nèi)接種。十只豬作為未接種對照，三只豬作為未攻擊環(huán)境對照。
所有豬在接種時都是血清學陰性(抗體滴度＜10)，這表明這些豬對豬肺炎支原體敏感。對照組內(nèi)所有的豬在攻擊前保持血清學陰性。這表明接受接種的豬體內(nèi)的免疫反應(yīng)是由疫苗引起的，而不是由于任何環(huán)境暴露引起的。
接種后六個月，用強毒豬肺炎支原體(每只豬1.0×106生物)攻擊20只接種的豬和10只未接種的對照豬。三只豬作為未攻擊對照。接種豬的平均肺病變評分是3.6％，攻擊對照豬的平均肺病變評分是14.6％。接種組的肺病變顯著少于對照組(p＝0.0215)。
本評價中獲得的數(shù)據(jù)證明測試疫苗A在單劑接種后誘導(dǎo)六個月的針對強毒豬肺炎支原體攻擊的長期保護性免疫。
試驗設(shè)計使用Microsoft Excel隨機化程序，將三十三只21日齡的豬隨機分配到三個組(接種組、攻擊對照組和未攻擊環(huán)境對照組)。二十只豬在三周齡接受一劑量測試疫苗A的肌內(nèi)接種。十只豬作為攻擊對照，三只豬作為未攻擊環(huán)境對照。接種后六個月按每只豬10mL強毒豬肺炎支原體(1.0×106生物)培養(yǎng)物攻擊接種組和攻擊對照組的豬。三只未接種的豬用作未攻擊對照。攻擊后26天無痛苦處死接受攻擊的豬和未接受攻擊的對照，計算每只豬的肺病變。
接種組的每只豬在頸側(cè)肌內(nèi)接受一劑量2mL所述測試疫苗。
攻擊和尸體剖檢強毒豬肺炎支原體攻擊貯液是冰凍(≤-70℃)的肺勻漿物，由IowaState University(ISU)的Dr.Eileen Thacker制備。所述攻擊貯液經(jīng)證實是純的，每mL含約107豬肺炎支原體生物。
用10mL以1∶100稀釋的貯液(即1.0×106生物)攻擊豬。
在攻擊的當天，在溫水中快速融化所述勻漿物，按照ISU的推薦用無菌豬肺炎支原體生長培養(yǎng)基稀釋。給予豬鎮(zhèn)靜劑，所述鎮(zhèn)靜劑是含50mg/mL Xylazine、50mg/mL Ketamine和100mg/mL Telazol的Xylazine-Ketamine-TelazolTM混合物。按照0.01-0.02mL/磅體重給予所述麻醉混合物。每只豬氣管內(nèi)接受一劑量10mL(第二個試驗)所述攻擊材料。為保證針頭位置正確，在給予攻擊劑量前用注射器抽氣。未接種的未攻擊對照豬飼養(yǎng)在單獨的房間內(nèi)，不進行攻擊。
攻擊后(DPC)26天，無痛苦處死所有豬。取出肺，如實施例3所述計數(shù)總肺病變。
樣品收集和測試在接種當天(0 DPV)、35 DPC、-1 DPC和26 DPC，從所有豬收集血液樣品，使用競爭性ELISA試劑盒(由DAKO Co.制造)檢測抗豬肺炎支原體的血清抗體。所述血清樣品保存在-20℃直到測試。
數(shù)據(jù)分析通過單因素方差分析(ANOVA)比較接種組和對照組間的肺病變計數(shù)。將肺計數(shù)用反正弦函數(shù)轉(zhuǎn)化，以改善殘差分布。由于所述肺病變評分的正態(tài)假設(shè)是有問題的，因此使用Wilcoxon秩和檢驗分析肺病變評分以及肺病變評分的反正弦轉(zhuǎn)化值。顯著性水平設(shè)為p＜0.05。報告來自非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗結(jié)果。
結(jié)果和討論血清學使用商業(yè)化競爭性ELISA試劑盒測試兩個試驗中所有豬體內(nèi)抗豬肺炎支原體的血清抗體，其中所有測定使用1∶10的血清稀釋度。按照試劑盒說明書測試結(jié)果存在懷疑的樣品在數(shù)據(jù)分析中作為陽性處理。所有豬在接種時都是血清學陰性(抗體滴度＜10)，這表明所有豬都對豬肺炎支原體敏感。對照組的所有豬在攻擊前保持血清學陰性。接種后，二十只接種豬中的十五只(15/20)變?yōu)閷ωi肺炎支原體血清學陽性至少一次(在35 DPV和-1 DPC收集的樣品)。這表明接種豬體內(nèi)的免疫反應(yīng)是由所述疫苗引起的，而不是任何環(huán)境暴露引起的。所有接種豬和攻擊對照組內(nèi)的十只豬有四只豬在攻擊后都轉(zhuǎn)化為對豬肺炎支原體呈血清學陽性，而所有未受攻擊的豬保持血清學陰性。測試豬的血清學狀態(tài)綜述于表4。
肺病變評分接種后六個月用強毒豬肺炎支原體(每只豬1.0×106生物)攻擊用測試疫苗A接種的二十只豬和十只未接種對照豬。三只豬用作未攻擊對照。二十只接種豬中有八只(40％)在攻擊后沒有出現(xiàn)肺病變，而對照組的10只豬中僅一只豬(10％)沒有肺病變。肺病變的百分率綜述于表5。接種豬的平均肺病變評分是3.6％，攻擊對照豬的平均肺病變評分是14.6％。接種組內(nèi)的肺病變顯著少于對照(p＝0.0215)。
表4本研究中豬對豬肺炎支原體的血清學狀態(tài)*陽性數(shù)量(1∶10)/總數(shù)組處理豬的數(shù)量0 DPV**35 DPV-1 DPC***26 DPC1 疫苗/攻擊20 0/20 9/20 12/2020/202 對照/攻擊10 0/10 0/10 0/10 4/103 對照/未攻擊 30/30/3 0/3 0/3*使用商業(yè)化試劑盒，通過ELISA測定所述血清學樣品中的抗豬肺炎支原體血清抗體。
所有樣品在血清稀釋度1∶10測試。按照試劑盒說明書解釋結(jié)果。
在1∶10存在懷疑的樣品認為是陽性。
**DPV＝接種后天數(shù)***DPC＝攻擊后天數(shù)表5在用豬肺炎支原體攻擊的豬和未攻擊對照中肺病變評分(％)小結(jié)平均值的平均值的豬的數(shù) 平均肺病 95％CL*下 95％CL上組 處理 量 變評分(％) 標準差限 限P值**1疫苗/攻擊 20 3.67.6 0.077.19 0.02152對照/攻擊 10 14.6 20.0 0.3328.943對照/未攻擊3 1.81.8 -2.67 6.27*CL＝置信度**P值來自于組1和組2的比較。
如表4和表5的數(shù)據(jù)所示，在用測試疫苗A單劑給予三周齡的豬后，測試疫苗A誘導(dǎo)六個月的針對強毒豬肺炎支原體攻擊的保護性免疫。
權(quán)利要求
1.一種疫苗組合物，所述疫苗組合物用于免疫動物以對抗由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的感染，所述疫苗組合物包含免疫量的豬肺炎支原體菌苗；一種佐劑混合物，所述佐劑混合物包含丙烯酸聚合物以及可代謝油和聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物；藥學上可接受的載體，所述疫苗組合物在單劑給予后引發(fā)針對豬肺炎支原體的保護性免疫。
2.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述佐劑混合物的組成為丙烯酸聚合物以及可代謝油和聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物，所述可代謝油包括一種或多種萜烯烴，其中丙烯酸聚合物與可代謝油/聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物混合物的比例為約1∶25到1∶50。
3.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述佐劑混合物為所述疫苗組合物的約1-25％(v/v)。
4.權(quán)利要求3的疫苗組合物，其中所述丙烯酸聚合物的終濃度為約1％(v/v)，所述萜烯烴/聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物混合物的終濃度為約5％到10％(v/v)。
5.權(quán)利要求3的疫苗組合物，其中所述佐劑混合物為所述疫苗組合物的約2％到15％(v/v)。
6.權(quán)利要求5的疫苗組合物，其中所述佐劑混合物為所述疫苗組合物的約5％到12％(v/v)。
7.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述可代謝油是角鯊?fù)榛蚪酋徬?br> 8.權(quán)利要求6或7的疫苗組合物，其中所述丙烯酸聚合物是Carbopol。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物還包含至少一種選自以下的菌苗副豬嗜血菌(Haemonphilus parasuis)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multiocida)、豬鏈球菌(Streptococcum suis)、大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)和鉤端螺旋體(leptospira)細菌。
10.一種保護動物免患豬肺炎支原體所引起的疾病的方法，所述方法包括給予所述動物一種疫苗組合物的步驟，所述疫苗組合物包含免疫量的豬肺炎支原體菌苗；一種佐劑混合物，所述佐劑混合物包含丙烯酸聚合物以及可代謝油和聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物；藥學上可接受的載體，所述疫苗組合物在單劑給予后引發(fā)針對豬肺炎支原體感染的保護性免疫。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述細菌的免疫量是約1×108到3×1011MHDCE/ml。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述細菌的免疫量是約1×109到3×109MHDCE/ml。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述給予步驟的給藥方式是肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、氣溶膠、口服或鼻內(nèi)給藥。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述佐劑混合物的組成為丙烯酸聚合物以及可代謝油和聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物，所述可代謝油包括一種或多種萜烯烴，所述佐劑混合物的終濃度是約1-25％(v/v)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述佐劑混合物中的丙烯酸聚合物是Carbopol。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述佐劑混合物內(nèi)的可代謝油是選自角鯊烯和角鯊?fù)榈妮葡N。
17.權(quán)利要求10-16中任一項的方法，所述方法還包括同時給予至少一種選自以下的其它菌苗副豬嗜血菌、多殺巴斯德氏菌、豬鏈球菌、大葉性肺炎放線桿菌、支氣管炎博德特氏菌、豬霍亂沙門氏菌和鉤端螺旋體細菌。
18.一種疫苗，所述疫苗為水包油乳劑形式，包含滅活豬肺炎支原體、可代謝油、聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物和丙烯酸聚合物。
全文摘要
本發(fā)明提供改良豬肺炎支原體(Myccoplasmahyopneumoniae)菌苗疫苗組合物，所述疫苗組合物在單劑給予后有利地提供針對感染的免疫。所述組合物包含滅活豬肺炎支原體菌苗和佐劑混合物，所述疫苗在單劑給予后提供對抗豬肺炎支原體感染的免疫，引發(fā)特異性針對豬肺炎支原體菌苗的免疫反應(yīng)，其中包括細胞介導(dǎo)的免疫和局部(分泌性IgA)免疫。在優(yōu)選實施方案中，所述佐劑混合物包含丙烯酸聚合物(最優(yōu)選Carbopol)以及可代謝油(如一種或多種不飽和萜烯烴，優(yōu)選角鯊烯或角鯊?fù)?和聚氧乙烯－聚丙烯嵌段共聚物(如Pluronic
文檔編號A61K39/04GK1489472SQ01822634
公開日2004年4月14日 申請日期2001年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月19日
發(fā)明者H·-J·楚, H -J 楚, W·李, Z·徐 申請人:惠氏公司