專利名稱：以大蒜球莖提取物為基礎(chǔ)的抗肥胖組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗肥胖局部治療組合物以及該組合物和/或大蒜球莖提取物美容性地在預(yù)防或治愈性治療疏松結(jié)締組織炎(脂肪團(tuán)，cellulite)和局部皮膚脂肪過量或者治愈性地治療肥胖中的用途。
90％以上的婦女或多或少地具有疏松結(jié)締組織炎。引起疏松結(jié)締組織炎的原因很多遺傳性誘因、激素不平衡、飲食錯誤、循環(huán)問題、緊張或抑郁。簡要地說，疏松結(jié)締組織炎與體內(nèi)某些區(qū)域、特別是髖部、臀部、膝和前臂中的脂肪組織增加相對應(yīng)。該脂肪組織或體內(nèi)的脂肪塊實(shí)際上存在在整個皮膚表面下。疏松結(jié)締組織炎通常與脂肪總體過量有關(guān)，并且脂肪塊的穩(wěn)定性是控制疏松結(jié)締組織炎發(fā)展的重要點(diǎn)。
疏松結(jié)締組織炎集中在真皮內(nèi)。在皮下組織，真皮的深層中，脂細(xì)胞或脂肪細(xì)胞聚集在一起形成由隔膜(成排的膠原纖維)分界的小葉，它們是相互平行的，并且與皮膚表面垂直。脂肪細(xì)胞是大細(xì)胞，其中80％的體積由一種或多種脂質(zhì)液泡組成。其大小是可變的。如果液泡的脂肪超過負(fù)荷，則脂肪細(xì)胞的體積就會增加，并且皮膚的結(jié)締組織就會變厚。
疏松結(jié)締組織炎還取決于功能的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗彩且环N與靜脈緊張機(jī)能不全和/或淋巴系統(tǒng)損害有關(guān)的局部堆積。
首先，疏松結(jié)締組織炎組織的變形發(fā)生在脂肪細(xì)胞中。一旦脂肪細(xì)胞的體積增加，隔膜就受到深的牽張，這以某些位置凹陷的形式呈現(xiàn)在表皮表面。如果皮膚消瘦，那么這些凹陷就更可見這已知被稱作桔皮效應(yīng)。
第二，變形發(fā)生在基質(zhì)中。基質(zhì)根據(jù)其水的保留量而改變。這就解釋了為什么在疏松結(jié)締組織炎區(qū)域皮膚柔軟性受損?；|(zhì)保留的水的壓力擠壓細(xì)胞，因此導(dǎo)致了彈性蛋白和膠原纖維的降解。
最后，基質(zhì)中過多水保留的最終結(jié)果是壓迫血管和淋巴管。這種壓迫的結(jié)果是減少靜脈血流量和淋巴流量，這在表皮和皮下組織水平均有體現(xiàn)。這就導(dǎo)致了血液平衡差以及毒素和廢物的排除不充分。
從代謝角度看，在脂肪組織中，脂肪細(xì)胞是機(jī)體用于儲備能量的。
為了確保其能量儲備功能，脂肪細(xì)胞能夠以甘油三酯脂滴的形式貯藏能量(這就是脂肪生成)，然后以脂肪酸的形式將此能量釋放到血液循環(huán)中(這就是脂肪分解)。
在這兩種代謝途徑(脂肪生成和脂肪分解)之間存在的平衡決定了肥胖。
脂肪細(xì)胞的脂肪生成功能需要脂肪酸的存在，而脂肪酸主要來自富含甘油三酯的循環(huán)脂蛋白。
在分解代謝方面，脂肪分解一方面與脂肪細(xì)胞甘油三酯組分分離形成甘油相對應(yīng)，另一方面，與形成脂肪酸相對應(yīng)。這種脂肪分解的發(fā)生是由于限制酶-一種激素敏感的脂酶的作用引起的。激素敏感性脂酶的活化取決于環(huán)AMP的含量。在人脂肪組織中，激素和各種物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，由此參與激素敏感性脂酶的控制，并因此使脂肪分解。
目前，所有已知的減肥霜均含有至少一種促進(jìn)脂肪分解和/或抑制脂肪生成的活性物質(zhì)，或試圖修復(fù)淋巴和毛細(xì)管微循環(huán)的活性物質(zhì)。
然而，盡管迄今研制出了各種各樣的減肥霜和大量與疏松結(jié)締組織炎治療有關(guān)的方法(電刺激、熱療、按摩等)，但是沒有發(fā)現(xiàn)哪種治療對于對抗疏松結(jié)締組織炎是真正有效的。
同時，近年來已經(jīng)闡明了與脂肪塊擴(kuò)張有關(guān)的機(jī)理。
脂肪物質(zhì)的過度發(fā)展通常與脂肪細(xì)胞體積的增加有關(guān)，尤其是其甘油三酯的含量，而與其數(shù)量無關(guān)這已知被稱作肥大。在某些超重情況下，肥大伴隨著增生，也就是說脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加。
目前已經(jīng)證明，在產(chǎn)期脂肪細(xì)胞的數(shù)量不是決定性的，因?yàn)橹炯?xì)胞的形成可以發(fā)生在生命過程的始終。它們由前體細(xì)胞，即原脂肪細(xì)胞(preadipocyte)產(chǎn)生。原脂肪細(xì)胞是薄的成纖維細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞它是能夠增殖的細(xì)胞，而不是脂肪細(xì)胞。
簡要地說，最終的脂肪細(xì)胞分化發(fā)生在原脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的兩個步驟中，后者能夠蓄積甘油三酯。
然而，盡管該發(fā)現(xiàn)提供了新的和令人感興趣的治療疏松結(jié)締組織炎的途徑，但是沒有產(chǎn)生任何實(shí)際的效果，因?yàn)椴荒馨l(fā)現(xiàn)使其可能通過局部應(yīng)用實(shí)現(xiàn)抑制原脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的活性原理。
本發(fā)明涉及彌補(bǔ)該缺陷，其主要目的是提供治療或美容組合物，該組合物用于通過局部外用(于皮膚)進(jìn)行抗肥胖治療，該組合物對于阻斷原脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化尤其有效。
尤其是，本發(fā)明涉及提供一種改進(jìn)的美容或治愈性治療疏松結(jié)締組織炎、局部皮膚脂肪過量和肥胖的方法。
本發(fā)明還涉及提供大蒜(Allium sativum(garlic))球莖提取物-特別是非水性提取物的新的美容或治療用途。
在本文中，術(shù)語″球莖″應(yīng)理解為包括完整的實(shí)際的植物(蒜瓣組)球莖和去皮或未去皮的分離的蒜瓣。
本發(fā)明還涉及提供新的以大蒜球莖提取物為基礎(chǔ)的組合物及其用途，特別是美容或治療目的的用途。
本發(fā)明另一目的是提供在肥胖治療中作用于成熟肥大脂肪細(xì)胞的治療組合物。
在本文全文中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NF T 75-006(1998年2月)定義的命名法，使用定義提取物的術(shù)語(提取物、精油、提純物(absolute)、凝結(jié)物(concrete)、油樹脂等)。
因此，本發(fā)明涉及外用的局部治療組合物，其特征在于該組合物由以下組分組成·有效量的至少一種抗肥胖活性物質(zhì)，選自大蒜球莖提取物，其中不包括用己烷提取的油樹脂，·任選地，一種或多種其它附加活性物質(zhì)，其中不包括睡蓮(Nymphaceae)提取物，·適于外用的-特別是在皮膚上局部使用的美容或藥物可接受的賦形劑。
有利的是，本發(fā)明組合物含有適于至少基本上抑制原脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化、而基本上不引起任何皮膚刺激或致敏的量的至少一種抗肥胖活性物質(zhì)。
按照本發(fā)明，有利的是，該組合物含有有效量的至少一種抗肥胖活性物質(zhì)，該物質(zhì)選自大蒜球莖的非水性提取物。
按照本發(fā)明，有利的是，一種或多種大蒜球莖提取物的量介于3ppm至20ppm之間，尤其是約10ppm。
在本發(fā)明第一個實(shí)施方案中，該組合物含有作為抗肥胖活性物質(zhì)的大蒜球莖精油和乳化劑。
此外，為了制備可局部使用的霜劑，有利的是，將精油/乳化劑混合物摻入凝膠和液體賦形劑如水中。
在本發(fā)明第二個實(shí)施方案中，該組合物含有作為抗肥胖活性物質(zhì)的至少一種大蒜球莖在水溶液中的提純物。按照本發(fā)明，有利的是，該組合物含有至少一種從大蒜球莖萃取得到的凝結(jié)物獲得的提純物。按照本發(fā)明，有利的是，該組合物也含有至少一種從大蒜球莖萃取得到的油樹脂獲得的提純物。
尤其有利的是，本發(fā)明組合物的特征在于，該組合物含有作為抗肥胖活性物質(zhì)的至少一種大蒜球莖提取物，選自精油、從己烷萃取的凝結(jié)物獲得的提純物、從乙酸乙酯萃取的凝結(jié)物獲得的提純物和用丙酮萃取的油樹脂獲得的提純物。
按照本發(fā)明，對于含有從己烷萃取的凝結(jié)物獲得的提純物的組合物來說，提純物的量優(yōu)選3ppm至20ppm，特別是約10ppm。
按照本發(fā)明，對于含有至少一種選自精油、從乙酸乙酯萃取的凝結(jié)物獲得的提純物和用丙酮萃取的油樹脂獲得的提純物的大蒜球莖提取物的組合物來說，提純物的量優(yōu)選5ppm至20ppm，特別是約10ppm。
在本發(fā)明的實(shí)踐中應(yīng)當(dāng)注意，不同的提純物在乙醇中稀釋至25％。但是，提純物在本發(fā)明不同組合物中的比例(ppm)則是指“純的”提純物的量，所謂“純的”提純物是指在提純物中殘留乙醇的含量小于2％。
本發(fā)明以如下非常令人驚訝的和出人意料的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，即大蒜球莖提取物在阻斷脂肪細(xì)胞分化方面顯示出非常有效的活性。
應(yīng)當(dāng)注意的是，大蒜因其抗菌、抗病毒、心臟保護(hù)、滋補(bǔ)、利尿等活性而享譽(yù)許多世紀(jì)。
EP-0 923 937描述了用于治療皮膚病如變應(yīng)性、除色素、海真菌病、皸裂、角化過度、切傷和灼傷的組合物，該組合物含有至少兩種油狀或粉末形式的植物提取物，所述提取物是用干的植物經(jīng)溶劑萃取得到的。因此，這些是油樹脂(或類樹脂)。在各種提取物中，該組合物含有1-3％用己烷萃取得到的大蒜油樹脂，該組合物沒有顯示具有抗肥胖活性。
GB-1 106 551描述了睡蓮屬植物提取物作為治療腫瘤和疏松結(jié)締組織炎的活性物質(zhì)的用途。所述組合物還另外包括一種或多種其它物種植物、特別是十字花科(Cruciferaceae)植物的精油(例如芥子油或辣根油)或者百合科(Liliaceae)植物的精油(例如大蒜油)，這些附加的精油對睡蓮提取物產(chǎn)生了穩(wěn)定作用，并與這些提取物產(chǎn)生了協(xié)同作用。對于疏松結(jié)締組織炎的局部治療，將精油溶解在橄欖油中。所述文獻(xiàn)表明，所述各附加的精油單獨(dú)地沒有內(nèi)在的作用。
EP-0-333 548描述了桔子精油的穩(wěn)定水乳液，其中含有1-45重量份的精油；0.01-1重量份的選自甘油蔗糖酯和蔗糖酯的非離子乳化劑；0.2-1.5重量份的黃原膠，和剩余重量的水。這些乳液可用于制備食物、特別是非酒精飲料和糖果調(diào)味用的濃縮物，或者用于制備化妝品用濃縮物。所述文獻(xiàn)表明，原則上，任何植物“油”(實(shí)際上是任何提取物)可用于該乳液，因此其中特別提及“大蒜油”。然而，其中僅僅給出了橙油的具體實(shí)例。無論如何，具有所述比例的穩(wěn)定的精油乳液不能用任何已知的精油、尤其是大蒜精油獲得。因此，所述文獻(xiàn)沒有提供任何現(xiàn)實(shí)的有關(guān)以大蒜精油為基礎(chǔ)的組合物的指導(dǎo)。
JP-04 338 336描述了口服治療肥胖的片劑，其中含有從干的大蒜以及水或乙醇提取得到的大蒜提取物。因此，所述文獻(xiàn)涉及某些大蒜提取物在循環(huán)血液中公知降血脂作用的開發(fā)。
2001年8月3日公布的FR-2 804 319描述了美容減肥組合物，該組合物含有含ANP的植物提取物，這是用水萃取植物的莖、葉和花瓣必然獲得的。所述文獻(xiàn)提及可以使用的各種植物，包括大蒜，但是沒有描述含有大蒜球莖提取物的組合物。該組合物的作用機(jī)理是促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂肪分解，而非作用于原脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
因此，目前沒有這方面的知識，使得人們預(yù)見到使用大蒜球莖提取物可以導(dǎo)致新一代減肥霜的出現(xiàn)，該減肥霜不僅僅作用于貯藏/解除貯藏脂肪(因此作用于脂肪生成/脂肪分解)，尤其是作用于原脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的過程。
本發(fā)明的大蒜提取物局部作用于脂肪細(xì)胞，而不使其某些脂肪酸向血液循環(huán)中釋放，否則，因脂肪酸沒有被燃燒可以轉(zhuǎn)而危害健康(沉積在動脈壁上或者腹內(nèi)組織中)。
因此，本發(fā)明的大蒜提取物通過新的途徑對抗疏松結(jié)締組織炎限制休眠原脂肪細(xì)胞的募集，它們限制了脂肪組織的擴(kuò)張。
然而，其功效不止于此，因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)，僅僅一種本發(fā)明的抗肥胖活性物質(zhì)就提供了對抗疏松結(jié)締組織炎的幾個關(guān)鍵。這是因?yàn)楸景l(fā)明的抗肥胖物質(zhì)還通過減少血管加壓劑(vasopressors)的水平確保脂肪組織的良好血管形成。
因此，本發(fā)明的大蒜提取物構(gòu)成了具有最大功效的抗肥胖活性物質(zhì)，使得不必在美容或治療減肥制劑中將活性物質(zhì)組合使用。
其它實(shí)驗(yàn)也使得能夠出人意料地觀察到本發(fā)明抗肥胖活性物質(zhì)對于成熟的肥大脂肪細(xì)胞也有活性。因此，它們作用于脂肪細(xì)胞生長的兩個過程，增生和肥大，這使得它們成功地用于肥胖的治療領(lǐng)域。
所觀察到的本發(fā)明抗肥胖活性物質(zhì)的另一優(yōu)點(diǎn)是，所獲得的現(xiàn)象可以逆轉(zhuǎn)，因此不會導(dǎo)致阻斷生理學(xué)的機(jī)理。
此外，由于本發(fā)明抗肥胖活性物質(zhì)的功效特別是以減少休眠原脂肪細(xì)胞的聚集為基礎(chǔ)，因此本發(fā)明的治療或美容組合物構(gòu)成了身體護(hù)理療法，該療法主要適用于皮膚區(qū)域的外部治療，治療至少每天一次，每年的每天進(jìn)行。
在這種情況下，本發(fā)明組合物不需要任何除本發(fā)明活性物質(zhì)之外的任何活性物質(zhì)，因此一種或多種大蒜提取物可以在所述組合物中構(gòu)成唯一的抗肥胖活性物質(zhì)。結(jié)果是，本發(fā)明組合物不含附加的活性物質(zhì)。特別優(yōu)選的是一種或多種大蒜球莖提取物是本發(fā)明組合物中唯一的植物提取物。
當(dāng)然，本發(fā)明組合物也可以用于“快速”治療，這是為期兩或三個月的治療，尤其是在夏季之前。在這種情況下，它優(yōu)選含有附加的活性物質(zhì)，該活性物質(zhì)由任何類型已知的分解脂肪物質(zhì)組成。有利的是，本發(fā)明組合物含有至少一種選自天然來源的分解脂肪物質(zhì)(例如咖啡因和脂肪分解劑)或合成的分解脂肪物質(zhì)(黃嘌呤基的化合物)，它們能夠刺激cAMP的合成。
其它附加的活性物質(zhì)、特別是具有美容效果的，可以與本發(fā)明的抗肥胖活性物質(zhì)組合。
本發(fā)明的組合物可以含有一定數(shù)量的能夠產(chǎn)生以下作用的物質(zhì)穩(wěn)定彈性網(wǎng)狀構(gòu)造(例如硅衍生物)；和/或提供即時的繃緊效果(摻入合成聚合物或植物蛋白(來源于大豆或小麥胚芽))；和/或確保最佳水合作用(摻入潤濕劑和/或重構(gòu)劑(restructuring agents))。
有利的是，本發(fā)明組合物不需要摻入能夠改善其滲透力的物質(zhì)(例如表皮剝脫劑(exfoliants))。
類似地，不需要向本發(fā)明組合物中摻入能夠改善皮膚微循環(huán)的物質(zhì)。
本發(fā)明組合物可以含有任何可藥用或美容可接受的賦形劑，這些賦形劑與本發(fā)明的抗肥胖活性物質(zhì)可相容，并且可以包括任何適宜的輔劑，包括膠凝劑、香料、防腐劑、穩(wěn)定劑、著色劑等，以獲得所需的和適宜的藥物形式。本發(fā)明組合物可以例如不合黃原膠。
對于大蒜球莖精油，尤其可能將其用作已知的由Siegen公司(Geneva，Switzerland)出售的產(chǎn)品Liposol的乳化劑，或者任何其它乳化劑，尤其是任何既非甘油蔗糖酯又非蔗糖酯的乳化劑。
所用乳化劑的量適于獲得所需的乳液。在實(shí)踐中，其用量非常大-通常是精油的50倍。
對于提純物的水溶液，本發(fā)明組合物優(yōu)選為簡單的洗液形式。
本發(fā)明組合物的制備實(shí)例如下。
為了制備局部用的霜劑，首先將大蒜精油摻入乳化劑如Liposol(Siegen，Switzerland)中，其各自的體積比是例如0.001％精油、0.05％Liposol和余量至100％的賦形劑。
可以例如用提純物制備洗液。例如，以體積濃度計(jì)算各組分的用量可以如下-組合物1·由己烷萃取的凝結(jié)物獲得的大蒜球莖提純物0.0003％-0.002％·賦形劑適當(dāng)?shù)臐舛戎?00％-組合物2·由乙酸乙酯萃取的凝結(jié)物獲得的大蒜球莖提純物0.0005％-0.002％·賦形劑適當(dāng)?shù)臐舛戎?00％-組合物3·由丙酮萃取的油樹脂獲得的大蒜球莖提純物0.0005％ to0.002％·賦形劑適當(dāng)?shù)臐舛戎?00％。
本發(fā)明組合物非常簡單并且便宜。
本發(fā)明包括用于治療疏松結(jié)締組織炎、局部皮膚(和皮下組織)脂肪過量或肥胖的預(yù)防或治愈性美容和/或治療方法，其特征在于將至少一種大蒜球莖提取物用作局部治療皮膚區(qū)域的抗肥胖活性物質(zhì)。術(shù)語“治療皮膚脂肪過量”是指治療位于真皮或真皮下的脂肪塊。
本發(fā)明還涉及用本發(fā)明組合物進(jìn)行治療的方法。
本發(fā)明還涉及至少一種大蒜球莖提取物作為抗肥胖活性物質(zhì)通過局部應(yīng)用在待治療的皮膚區(qū)域來預(yù)防性或治愈性美容治療疏松結(jié)締組織炎和局部皮膚脂肪過量的用途。
本發(fā)明還涉及至少一種大蒜球莖提取物作為抗肥胖活性物質(zhì)在制備通過局部應(yīng)用在待治療的皮膚區(qū)域(腹部、大腿、髖部、臀部、關(guān)節(jié)、四肢等)來預(yù)防或治愈性治療肥胖的組合物中的用途。本發(fā)明還涉及通過局部應(yīng)用在待治療的皮膚區(qū)域來預(yù)防或治愈性治療肥胖的治療組合物的制備方法，其特征在于將有效量的至少一種大蒜球莖提取物作為抗肥胖活性物質(zhì)摻入組合物中。
有利的是，在本發(fā)明的方法或用途中，所用至少一種大蒜球莖提取物的用量是這樣的用量，即該用量適于至少基本上抑制原脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化和/或至少基本上限制或抑制成熟脂肪細(xì)胞肥大、而不引起任何皮膚刺激或致敏。
本發(fā)明還包括體外抑制原脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞進(jìn)行脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于使有效量的至少一種大蒜球莖提取物與原脂肪細(xì)胞或包含它們的生物組織接觸。
有利的是，在本發(fā)明方法或用途中，僅僅使用一種或多種非水性大蒜球莖提取物作為抗肥胖活性物質(zhì)。
按照本發(fā)明，有利的是，大蒜球莖提取物的用量介于3ppm至20ppm之間。
按照本發(fā)明，有利的是，使用至少一種精油和至少一種乳化劑作為抗肥胖活性物質(zhì)。作為變化的形式，按照本發(fā)明，有利的是，使用至少一種提純物的水溶液作為抗肥胖活性物質(zhì)。按照本發(fā)明，有利的是，使用選自下列的至少一種大蒜球莖提取物作為抗肥胖(nonadipose)活性物質(zhì)精油；由己烷萃取的凝結(jié)物得到的提純物；由乙酸乙酯萃取的凝結(jié)物得到的提純物；和由丙酮萃取油樹脂得到的提純物。
有利的是，在本發(fā)明方法或用途中，使用本發(fā)明組合物。本發(fā)明還更一般地涉及適于實(shí)施本發(fā)明的(美容和/或治愈性)治療方法或抑制方法的組合物。
本發(fā)明還涉及一種組合物、治療方法-特別是美容方法、治療組合物的制備方法或用途，其特征在于將上下文中提及的所有或某些特征組合。
發(fā)明的效果由下面實(shí)施例1-4描述并參照附

圖1A到1F、2A和2B以及3A和3B進(jìn)行說明。
-圖1A至1F、2A和2B是脂肪細(xì)胞的顯微照片。
-圖3A和3B是電泳膠體的顯微照片。
實(shí)施例1、2、3和4舉例說明大蒜球莖精油(稱作EO)、己烷萃取的凝結(jié)物獲得的大蒜球莖提純物(稱作ACH)、從乙酸乙酯萃取的凝結(jié)物獲得的大蒜球莖提純物(稱作ACEA)和用丙酮萃取的油樹脂獲得的大蒜球莖提純物(稱作AOA)對于脂肪細(xì)胞增生和肥大進(jìn)程的生物學(xué)影響。制備EO、ACH、ACEA和AOA溶液的方法，使用的細(xì)胞模型和治療的方法在下面詳細(xì)說明。
制備EO、ACH、ACEA和AOA溶液的方法-制備EO溶液如下制備于培養(yǎng)基中的EO溶液將EO儲備液(SIGMA-ALDRICH FINE CHEMICALS銷售的“Garlic oil，Chinese”，參考文獻(xiàn)WO250309)十倍稀釋于用于細(xì)胞培養(yǎng)的水(Eurobio，法國)中，其中EO儲備液包含18.4μl的EO和981.6μl Liposol(基于從植物細(xì)胞膜萃取的物質(zhì)的天然乳化劑，瑞士Siegen銷售)。如下制備于培養(yǎng)基中的對照溶液將由18.4μl供細(xì)胞培養(yǎng)用的水(Eurobio，法國)和981.6μl Liposol組成的對照儲備液用供細(xì)胞培養(yǎng)用的水(Eurobio，法國)十倍稀釋。
制備ACH、ACEA和AOA提純物水溶液按照其標(biāo)準(zhǔn)的、公知的和在香料工業(yè)中充分定義的方法制備本發(fā)明的提純物。簡要地說，提純物是由至少兩個萃取步驟得到的提取物。第一步是使用非水性-特別是非苯類-揮發(fā)性萃取溶劑進(jìn)行，得到凝結(jié)物(如果開始時植物是新鮮或解凍的(經(jīng)冷凍保存后))或油樹脂(如果開始時植物材料是干的)。第二個萃取步驟是使用乙醇為溶劑。ACH，ACEA和AOA提純物通過加工大蒜球莖獲得。
為獲得ACH提純物，掰下新鮮大蒜瓣皮，通過機(jī)械研磨。然后用己烷萃取。適度加熱，無需煮沸，待己烷完全蒸發(fā)后，收集凝結(jié)物。該凝結(jié)物包含蠟和芳香產(chǎn)物。在室溫，它呈現(xiàn)黃色糊狀外觀。
經(jīng)洗滌將凝結(jié)物溶解在乙醇中后，將溶液過濾，然后在-10℃冷凍，以去蠟。蒸餾掉乙醇后，得到ACH提純物。在乙醇中稀釋至25％時，呈清澈透明的淡黃色溶液，帶有強(qiáng)烈氣味。
按照與制備ACH類似的方案制備ACEA提純物。第一步是用乙酸乙酯萃取。
ACEA提純物在乙醇中稀釋至25％時，呈清澈透明的淡棕色溶液，帶有適中氣味。
按照與制備ACH提純物類似的方案制備AOA提純物，第一步是使用預(yù)先干燥的大蒜瓣用丙酮萃取。經(jīng)第一步萃取后，得到油樹脂。在室溫，它呈非常深的棕色糊狀。
接下來，使用乙醇蒸餾該糊狀物，最后獲得AOA提純物。
AOA提純物在乙醇中稀釋至25％時，呈清澈透明的棕色溶液，帶有微弱氣味。
如下制備于培養(yǎng)基中的ACH、ACEA和AOA溶液將各(ACH，ACEA和AOA)儲備液10倍稀釋于用于細(xì)胞培養(yǎng)的水(Eurobio，F(xiàn)rance)中，其中儲備液組成為18.4μl的各(ACH，ACEA或AOA)的提純物和981.6μl用于細(xì)胞培養(yǎng)的水(Eurobio，法國)。
使用的細(xì)胞模型已經(jīng)對脂肪細(xì)胞分化過程涉及的機(jī)理進(jìn)行了多年體外研究(綜述Klaus S.，BioEssays，19215-223，1997)。
EO、ACH、ACEA和AOA的生物活性是使用3T3-F442A細(xì)胞培養(yǎng)物(小鼠細(xì)胞系，用于研究其蓄積脂類的能力)證明的，并且隨后在初級人原脂肪細(xì)胞培養(yǎng)物上得到證明。
將細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板中(接種密度每孔15000個細(xì)胞)并且在DMEM培養(yǎng)基-10％DCS加抗生素中保持至融合點(diǎn)。在融合時，將原脂肪細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基-10％FCS加胰島素中培養(yǎng)。處理過的細(xì)胞保持在培養(yǎng)基中，最終向每毫升培養(yǎng)基中加入25μl試驗(yàn)溶液之一(EO、ACH、ACEA或AOA)。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3T3-F442A原脂肪細(xì)胞，每毫升培養(yǎng)基中加入25μl對照溶液。培養(yǎng)介質(zhì)每48小時進(jìn)行更新。
人原脂肪細(xì)胞的初級培養(yǎng)按照供貨商的教導(dǎo)培養(yǎng)人原脂肪細(xì)胞(ZenBio，USA)。根據(jù)配方，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)人原脂肪細(xì)胞，最后向每毫升培養(yǎng)基中加入3μl至10μl的EO、ACH、ACEA中AOA其中一種試驗(yàn)溶液。對照原脂肪細(xì)胞僅保持在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每3天更新。
實(shí)施例1EO、ACH、ACEA或AOA溶液對于脂肪細(xì)胞形態(tài)的影響(附圖1A-1F)經(jīng)7天(3T3-F442A細(xì)胞)和9天(人類原脂肪細(xì)胞)處理后，以形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，通過顯微觀察處理過的培養(yǎng)物和對照培養(yǎng)物，對EO、ACH、ACEA和AOA溶液對分化過程的影響進(jìn)行研究。當(dāng)細(xì)胞獲得一個圓型輪廓、并且當(dāng)細(xì)胞質(zhì)完全地充滿了油脂小滴時，通過形態(tài)分析和連有CCD照相機(jī)的反轉(zhuǎn)定相顯微鏡觀察，認(rèn)為細(xì)胞發(fā)生了變化。發(fā)現(xiàn)EO、ACH、ACEA或AOA溶液抑制小鼠3T3-F442A原脂肪細(xì)胞的細(xì)胞的分化(附圖1A-1C)。
經(jīng)過7天的長期處理，EO溶液(附圖1A)或ACH溶液(附圖1B)導(dǎo)致明顯的成熟脂肪細(xì)胞數(shù)目減少。絕大多數(shù)的細(xì)胞保持了原脂肪細(xì)胞的成纖維細(xì)胞形態(tài)，非常明顯地抑制了脂質(zhì)聚集。盡管在附圖中沒有示出，ACEA和AOA溶液可以獲得同樣的結(jié)果。按照普通的最終分化方法處理對照3T3-F442A細(xì)胞(附圖1C)，得到具有成熟形態(tài)學(xué)特征的脂肪細(xì)胞，如其強(qiáng)折射率所證明的，細(xì)胞質(zhì)中充滿甘油三酯的小滴。
也發(fā)現(xiàn)EO、ACH、ACEA或AOA溶液抑制人原脂肪細(xì)胞的最終分化。
在EO溶液(附圖1D)或ACH溶液(附圖1E)存在下培養(yǎng)的人原脂肪細(xì)胞保持原脂肪細(xì)胞的形態(tài)人細(xì)胞保持紡錘型，其中可察覺的胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)小滴非常少。盡管未示于附圖中，使用ACEA和AOA溶液有同樣結(jié)果。作為比較，用作對比的人原脂肪細(xì)胞(附圖1F)失去了它們的成纖維細(xì)胞的形態(tài)，變?yōu)榍驙畈⑶掖嬖跒閿?shù)眾多的胞質(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)小滴，其可通過強(qiáng)折射率確定。
使用大蒜球莖精油(EO)、從己烷萃取的凝結(jié)物獲得的大蒜球莖提純物(ACH)、從乙酸乙酯萃取的凝結(jié)物獲得的大蒜球莖提純物(ACEA)或用丙酮萃取的油樹脂獲得的大蒜球莖提純物(AOA)的長期治療，限制了脂肪細(xì)胞分化形態(tài)上和生物化學(xué)上的性質(zhì)變化。一旦接觸EO、ACH、ACEA和AOA，原脂肪細(xì)胞對于激素環(huán)境不再敏感，激素環(huán)境是控制脂肪新陳代謝并且通常允許原脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的分化脂肪細(xì)胞。
實(shí)施例2EO、ACH、ACEA或AOA溶液對于成熟肥大脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)作用(附圖2A和2B)在融合時，將3T3-F442A原脂肪細(xì)胞在分化培養(yǎng)介質(zhì)(DMEM-10％FCS和胰島素)中培養(yǎng)4天。這些條件下，細(xì)胞到達(dá)“成熟脂肪細(xì)胞”階段，其體積和甘油三酯的含量已經(jīng)增加。此時對細(xì)胞進(jìn)行如前處理。
與具有大體積球形形狀并且胞質(zhì)內(nèi)脂泡大量蓄積的對照成熟脂肪細(xì)胞相比(附圖2B)，使用EO溶液處理的成熟脂肪細(xì)胞(附圖2A)具有減小的圓形細(xì)胞形態(tài)并且胞質(zhì)內(nèi)脂泡數(shù)量大大減少，因此發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的EO溶液通過逆轉(zhuǎn)分化作用，有效地限制脂肪細(xì)胞過度膨脹。本發(fā)明的ACH、ACEA或AOA溶液得到了同樣的效果。
實(shí)施例3EO、ACH、ACEA或AOA溶液對PPARγ2mRNA表達(dá)的影響(附圖3A和3B)脂肪細(xì)胞分化是脂肪組織發(fā)展和肥胖的一個重要因素。在體外，脂肪細(xì)胞分化的過程特點(diǎn)在于其由多種調(diào)節(jié)脂蛋白脂解作用、由細(xì)胞攝取脂肪酸以及合成脂肪酸和甘油三酯的基因編程誘導(dǎo)。簡單地講，這些基因可以歸類于不同的分化標(biāo)記物，它們是非常早期(例如脂肪酶脂蛋白mRNA表達(dá))，早期(例如PPARγ2mRNA表達(dá))，或晚期(萊普亭(leptin)表達(dá))(綜述Morrison R.F.，F(xiàn)armer S.R.，J.Cell.Biochem.Suppl.32/3359-67，1999)。脂肪細(xì)胞的分化期也因此可以通過研究相關(guān)mRNA(PPARγ2mRNA)的表達(dá)或通過萊普亭的表達(dá)水平準(zhǔn)確確定。
PPAR核受體族(″Peroxisomal Proliferator-Activated Receptor″過氧化物酶增生活性受體)的類型有3種亞型PPARα、PPARδ、PPARγ。PPARα在肝臟強(qiáng)烈表達(dá)，在那里它調(diào)控脂類代謝有關(guān)的基因表達(dá)。PPARδ在身體里無所不在，這種受體的功能仍在繼續(xù)研究中。PPARγ存在兩種同工型，PPARγ1和PPARγ2。PPARγ2在哺乳動物脂肪組織中強(qiáng)烈表達(dá)。當(dāng)PPARγ2活化時，它引起編碼蛋白質(zhì)和酶的、與產(chǎn)生和維持脂肪細(xì)胞形態(tài)有關(guān)的幾種脂肪細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄。它因此在脂肪細(xì)胞的分化和代謝中扮演一個基礎(chǔ)角色。
經(jīng)過3天(附圖3A，3T3-F442A細(xì)胞)或6天(附圖3B，人原脂肪細(xì)胞)的處理后，測定EO、ACH、ACEA或AOA溶液對PPARγ2mRNA表達(dá)的影響。通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))分析PPARγ2mRNA的含量，此前按照Rneasy Total RNA系統(tǒng)測試盒(Qiagen)的方法純化RNA，通過測量260和280nm的吸光度及其比率對試樣中RNA的含量進(jìn)行定量，移入瓊脂糖凝膠中后，測定RNA的量。
在RT步驟，由1μg總RNA(3T3-F442A)或0.2μg總RNA(人原類脂肪細(xì)胞)合成互補(bǔ)DNA(cDNA)。在合適的有義和反義引物(Genset，參見表1)存在下，獲得編碼PPARγ2的cDNA擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物的大小是307個堿基對(3T3-F442A細(xì)胞)和582個堿基對(人原脂肪細(xì)胞)。給予適當(dāng)控制(反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增步驟)。通過變性(2分鐘，94℃)、雜化作用(1分鐘，60℃)和延伸(6分鐘，72℃)，使PCR混合物進(jìn)行22個周期(3T3-F442A細(xì)胞)或35個周期(人原脂肪細(xì)胞)的擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳和溴乙非啶顯像分析PCR產(chǎn)物。
表1
與對照細(xì)胞相比，當(dāng)3T3-F442A細(xì)胞接觸EO溶液(附圖3A，結(jié)果2)，ACH溶液(附圖3A結(jié)果3)后，PPARγ2脂肪產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平大大減少，正如帶的強(qiáng)度所證明的(附圖3A結(jié)果1)。由ACEA和AOA溶液也獲得同樣的結(jié)果。
類似地，與對照人原脂肪細(xì)胞相比(附圖3B，結(jié)果4)，本發(fā)明EO、ACH、ACEA或AOA溶液顯著抑制人原脂肪細(xì)胞的PPARγ2mRNA的表達(dá)(附圖3B，結(jié)果5說明使用EO溶液的治療，結(jié)果6說明了使用ACH溶液治療)。
大蒜球莖精油(EO)、從己烷萃取的凝結(jié)物獲得的大蒜球莖提純物(ACH)、從乙酸乙酯萃取的凝結(jié)物獲得的大蒜球莖提純物(ACEA)和從丙酮萃取的油樹脂獲得的大蒜球莖提純物(AOA)，通過減少PPARγ2信使的表達(dá)，作用于分化程序。
實(shí)施例4EO、ACH、ACEA和AOA溶液對萊普亭分泌的影響通過對在各種不同試驗(yàn)的培養(yǎng)基中萊普亭的分泌量進(jìn)行定量測定，測定EO、ACH、ACEA和AOA溶液抑制人原脂肪細(xì)胞分化過程的能力。特別是，編碼ob基因并通過脂肪細(xì)胞合成分泌的萊普亭，被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞分化過程后期標(biāo)記物。在體外，萊普亭基礎(chǔ)分泌物隨著原脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化而逐漸增多(MacDougald，O.A.等，Proc.Natl Acad.Sci.，USA，929034-9037，1995)。
經(jīng)過為期9天的治療對EO、ACH、ACEA和AOA溶液對于萊普亭分泌的影響進(jìn)行研究(人原脂肪細(xì)胞)。在3天、6天、9天(更新培養(yǎng)介質(zhì)日)取樣，測量在不同培養(yǎng)基中由對照細(xì)胞和經(jīng)處理的細(xì)胞分泌的萊普亭的量。按照供貨商的指導(dǎo)，通過酶聯(lián)免疫吸附定量法(ELISA)(R&D Systems歐洲)，對釋放的萊普亭的量進(jìn)行定量測定。結(jié)果以平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。通過Student T試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的比較((p＜0.05是顯著性閾值)。
下面的結(jié)果經(jīng)過了標(biāo)準(zhǔn)化經(jīng)過為期9天的處理，對在第3、6、9天測定的每一處理的定量萊普亭值進(jìn)行了匯總，并以由對照細(xì)胞得到的值的百分?jǐn)?shù)表示(表2)。
表2-EO、ACH、ACEA或AOA溶液對萊普亭分泌的影響
在EO、ACH、ACEA和AOA存在下培養(yǎng)的人原脂肪細(xì)胞分泌進(jìn)入培養(yǎng)基中的萊普亭量明顯小于未處理對照人原脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測到的量。所得結(jié)果表明EO、ACH、ACEA或AOA溶液不僅在分化過程中產(chǎn)生作用并且可以抑制脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程。
權(quán)利要求
1.外用局部治療組合物，其特征在于該組合物由以下組分組成·有效量的至少一種抗肥胖活性物質(zhì)，選自大蒜球莖提取物，其中不包括用己烷提取的油樹脂，·任選地，一種或多種其它附加活性物質(zhì)，其中不包括睡蓮(Nymphaceae)提取物，·適于外用的-特別是在皮膚上局部使用的美容或藥物可接受的賦形劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其特征在于該組合物含有適于至少基本上抑制原脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化而不引起任何皮膚刺激或致敏的量的至少一種抗肥胖活性物質(zhì)。
3.權(quán)利要求1和2的組合物，其特征在于該組合物含有有效量的至少一種抗肥胖活性物質(zhì)，該物質(zhì)選自非水性大蒜球莖提取物。
4.權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的組合物，其特征在于該組合物含有3ppm至20ppm之間的大蒜球莖提取物。
5.權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的組合物，其特征在于該組合物含有作為抗肥胖活性物質(zhì)的大蒜球莖精油和乳化劑。
6.權(quán)利要求5的組合物，其特征在于將精油/乳化劑混合物摻入凝膠和液體如水中。
7.權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的組合物，其特征在于該組合物含有作為抗肥胖活性物質(zhì)的至少一種大蒜球莖提純物的水溶液。
8.權(quán)利要求7的組合物，其特征在于該組合物含有至少一種由大蒜球莖萃取的凝結(jié)物得到的提純物。
9.權(quán)利要求8的組合物，其特征在于該組合物還含有至少一種由大蒜球莖萃取的油樹脂得到的提純物。
10.權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的組合物，其特征在于該組合物含有作為抗肥胖活性物質(zhì)的至少一種大蒜球莖提取物，選自精油、從己烷萃取的凝結(jié)物獲得的提純物、從乙酸乙酯萃取的凝結(jié)物獲得的提純物和用丙酮萃取的油樹脂獲得的提純物。
11.權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的組合物，其特征在于一種或多種大蒜球莖提取物構(gòu)成了唯一的抗肥胖活性物質(zhì)。
12.權(quán)利要求1-11中任何一項(xiàng)的組合物，其特征在于其中不含附加性物質(zhì)。
13.權(quán)利要求1-12中任何一項(xiàng)的組合物，其特征在于該組合物含有至少一種分解脂肪物質(zhì)作為附加活性物質(zhì)。
14.用于治療疏松結(jié)締組織炎和局部皮膚脂肪過量的預(yù)防或治愈性美容方法，其特征在于將至少一種大蒜球莖提取物用作活性物質(zhì)局部施用于待治療的皮膚區(qū)域。
15.治療疏松結(jié)締組織炎和局部皮膚脂肪過量的預(yù)防或治愈性美容方法，其特征在于使用權(quán)利要求1-13中任何一項(xiàng)的組合物。
16.至少一種大蒜球莖提取物作為抗肥胖活性物質(zhì)通過局部應(yīng)用至待治療的皮膚區(qū)域來預(yù)防或治愈性美容治療疏松結(jié)締組織炎和局部脂肪過量的用途。
17.至少一種大蒜球莖提取物作為抗肥胖活性物質(zhì)在制備通過局部應(yīng)用至待治療的皮膚區(qū)域來預(yù)防或治愈性治療肥胖的治療組合物中的用途。
18.制備通過局部應(yīng)用至待治療的皮膚區(qū)域來預(yù)防或治愈性治療肥胖的治療組合物的方法，其特征在于將有效量的至少一種大蒜球莖提取物作為抗肥胖活性物質(zhì)摻入組合物中。
19.權(quán)利要求14-18中任何一項(xiàng)的用途或方法，其特征在于使用適于至少基本上抑制原脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化和/或至少基本上限制或抑制成熟脂肪細(xì)胞肥大而不引起任何皮膚刺激或致敏的量的至少一種大蒜球莖提取物。
20.體外抑制原脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞進(jìn)行脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于使有效量的至少一種大蒜球莖提取物與原脂肪細(xì)胞或包含它們的生物組織接觸。
21.權(quán)利要求14-20中任何一項(xiàng)的用途或方法，其特征在于僅僅使用一種或多種非水性大蒜球莖提取物作為抗肥胖活性物質(zhì)。
22.權(quán)利要求14-21中任何一項(xiàng)的用途或方法，其特征在于使用3ppm至20ppm之間的大蒜球莖提取物。
23.權(quán)利要求14-22中任何一項(xiàng)的用途或方法，其特征在于使用至少一種精油和至少一種乳化劑作為抗肥胖活性物質(zhì)。
24.權(quán)利要求14-22中任何一項(xiàng)的用途或方法，其特征在于使用至少一種提純物水溶液作為抗肥胖活性物質(zhì)。
25.權(quán)利要求14-24中任何一項(xiàng)的用途或方法，其特征在于使用至少一種大蒜球莖提取物作為抗肥胖活性物質(zhì)，所述大蒜球莖提取物選自精油；從己烷萃取的凝結(jié)物獲得的提純物；從乙酸乙酯萃取的凝結(jié)物獲得的提純物；和用丙酮萃取的油樹脂獲得的提純物。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗肥胖局部治療組合物，該組合物含有有效量的至少一種抗肥胖活性物質(zhì)，選自大蒜球莖提取物，其中不包括用己烷提取的油樹脂，和美容或藥物可接受的賦形劑，該組合物適于局部外用－特別是用于皮膚。本發(fā)明也包括該組合物及其提取物在美容性地治療疏松結(jié)締組織炎和局部皮膚脂肪過量以及作為治療劑治療肥胖的用途。
文檔編號A61K8/96GK1487822SQ0182161
公開日2004年4月7日 申請日期2001年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月31日
發(fā)明者I·托馬蒂斯, I 托馬蒂斯 申請人:創(chuàng)新維生素有限公司